FI120311B - Menetelmiä solunsisäisiä sitoutumisproteiineja (PIL) koodaavien nukleiinihappojen ja niitä sisältävien virusten, vektoreiden ja farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmiä solunsisäisiä sitoutumisproteiineja (PIL) koodaavien nukleiinihappojen ja niitä sisältävien virusten, vektoreiden ja farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI120311B FI120311B FI956057A FI956057A FI120311B FI 120311 B FI120311 B FI 120311B FI 956057 A FI956057 A FI 956057A FI 956057 A FI956057 A FI 956057A FI 120311 B FI120311 B FI 120311B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid sequence
- peptide
- antibody
- virus
- Prior art date
Links
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 61
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 10
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title abstract description 8
- 235000015047 pilsener Nutrition 0.000 title description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 46
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 19
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 15
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 14
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 8
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010027920 GTPase-Activating Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 48
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 24
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 102100022709 Putative alpha-1-antitrypsin-related protein Human genes 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 11
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 10
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- -1 4-amino acids Proteins 0.000 description 5
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 3
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UNBFGVQVQGXXCK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MGDFPGCFVJFITQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SPVHQURZJCUDQC-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 2
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOUUHEHYSHWUHG-UWVGGRQHSA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VOUUHEHYSHWUHG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 4,7,7-trimethylbicyclo[4.1.0]heptan-5-one Chemical compound O=C1C(C)CCC2C(C)(C)C12 CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O YLTKNGYYPIWKHZ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- PIPTUBPKYFRLCP-NHCYSSNCSA-N Ala-Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PIPTUBPKYFRLCP-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KVWLTGNCJYDJET-LSJOCFKGSA-N Ala-Arg-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KVWLTGNCJYDJET-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- FVNAUOZKIPAYNA-BPNCWPANSA-N Ala-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FVNAUOZKIPAYNA-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N Ala-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MSWSRLGNLKHDEI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N Arg-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ISJWBVIYRBAXEB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N Asn-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical group ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 101100456896 Drosophila melanogaster metl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007317 Farnesyltranstransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010007508 Farnesyltranstransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N Glu-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HPJLZFTUUJKWAJ-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XTZDZAXYPDISRR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- ITVBKCZZLJUUHI-HTUGSXCWSA-N Glu-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ITVBKCZZLJUUHI-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N Glu-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UQHGAYSULGRWRG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DTLLNDVORUEOTM-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N Glu-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HGJREIGJLUQBTJ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N Gly-Glu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- WHKLDLQHSYAVGU-ACRUOGEOSA-N His-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O WHKLDLQHSYAVGU-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700003968 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (49-57) Proteins 0.000 description 1
- QRTVJGKXFSYJGW-KBIXCLLPSA-N Ile-Glu-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QRTVJGKXFSYJGW-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HXWALXSAVBLTPK-NUTKFTJISA-N Leu-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N HXWALXSAVBLTPK-NUTKFTJISA-N 0.000 description 1
- OGCQGUIWMSBHRZ-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OGCQGUIWMSBHRZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KPJJOZUXFOLGMQ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Asn Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N KPJJOZUXFOLGMQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N Lys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100247323 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ras-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- KAJLHCWRWDSROH-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KAJLHCWRWDSROH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RBRNEFJTEHPDSL-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N Phe-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O BSKMOCNNLNDIMU-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ILMLVTGTUJPQFP-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ILMLVTGTUJPQFP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QEWBZBLXDKIQPS-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710132594 Protein E6 Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LAFKUZYWNCHOHT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- YIUWWXVTYLANCJ-NAKRPEOUSA-N Ser-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O YIUWWXVTYLANCJ-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Lys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QPPYAWVLAVXISR-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-His Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O QPPYAWVLAVXISR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- KPNSNVTUVKSBFL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KPNSNVTUVKSBFL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- ABWNZPOIUJMNKT-IXOXFDKPSA-N Thr-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ABWNZPOIUJMNKT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N Thr-Pro-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O MXDOAJQRJBMGMO-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- TZQWJCGVCIJDMU-HEIBUPTGSA-N Thr-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O TZQWJCGVCIJDMU-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QJKMCQRFHJRIPU-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- OLYXUGBVBGSZDN-ACRUOGEOSA-N Tyr-Leu-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OLYXUGBVBGSZDN-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000002389 anti-papilloma Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000025053 regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1072—Regulatory proteins, e.g. tat, rev, vpt
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Menetelmiä soluasisäisiä sitoutumisproteiineja (PIL) koo~ daavien nukleiinihappojen ja niitä sisältävien virusten, vektoreiden ja farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi 5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä nukleiini- happosekvenssien, niitä sisältävien vektoreiden ja virusten valmistamiseksi, joita voidaan käyttää terapiassa, etenkin geeniterapiassa. Tarkemmin ottaen mainitut nukleiinihap-posekvenssit käsittävät geenin, joka koodittaa solunsisäis-10 tä sitoutumisproteiinia (PIL), ja niitä käytetään geeniterapiassa, mahdollisesti sisällytettyinä tarkoituksenmukaisiin ilmentämisvektoreihin. Keksintö koskee myös farmaseuttisen koostumuksen valmistusta.
Geeniterapia käsittää puutteen tai epänormaaliuden 15 (mutaatio, poikkeava ilmentyminen, jne,·) korjaamisen viemällä geneettistä tietoa kyseessä olevaan soluun tai elimeen.
Tämä geneettinen tieto voidaan viedä joko in vitro elimestä eristettyyn soluun, minkä jälkeen modifioitu solu viedään takaisin organismiin, tai suoraan in vivo sopivaan kudok-20 seen. Tässä suhteessa erilaisia tekniikoita geenien trans-fektoimiseksi ja siirtämiseksi on kuvattu kirjallisuudessa {.katso Roemer ja Friedman, Bur. J. Biochem. 208 (1992) 211]. Tähän päivään mennessä alan aiemman teknisen tason puitteissa ehdotetut lähestymistavat geeniterapiaan käsit-25 tävät geenien, jotka koodittavat aktiivisia, geneettisiin sairauksiin liittyviä polypeptidejä (hormonit, kasvutekijät j jne.), antisensegeenien tai antigeenisten peptidien rokotteiden saamiseksi siirtämisen. Esillä oleva keksintö kuvaa uutta lähestymistapaa geeniterapiaan, jolloin sen mukaan 30 siirretään kohdesoluun (tai kudokseen) ja ilmennetään siinä Sölunsisäinen peptidi, joka pystyy olemaan vuoröyaikutuk-sessa solukomponenttien kanssa ja täten häiritsemään solu-funktioita. Esillä oleva keksintö perustuu tarkemmin ottaen siihen, että osoitettiin olevan mahdollista ilmentää in vi-35 vp modifioituja vasta-aineita, jotka pysyvät solunsisäises-sä osastossa, ja jotka voivat kontrolloida tiettyjä solu- 2 funktioita. Keksintö· perustuu samoin sen osoittamiseen, että on mahdollista kloonata tällaisia solunsisäisiä vasta-aineita koodittavia DNA-sekvenssejä vektoreihin, etenkin virusvektoreihin, niiden käyttämiseksi geeniterapiassa.
5 Vasta-aineiden käyttäminen ihmisterapiassa tekee yleensä ottaen .mahdolliseksi kohdentaa ja neutraloida biologisia komplekseja,; jotka kiertävät ja/tai. sijaitsevat solujen pinnalla:, käynnistämällä immuuni systeemin ohjaama ta-pahtumakaskadi, joka johtaa mainittujen eliminaatioon. Kui-10 Penkin monissa tapauksissa., kuten esimerkiksi syövät tai esimerkiksi viruksista, johtuvat sairaudet, tämä lähestymistapa on tuloksia tuottamaton, koska sairastuneiden solujen epäsäännönmukaisuudesta vastuussa oleva antigeeni ei ole ruiskutettujen vasta-aineiden saatavilla. Esillä oleva kek-15 sintö tarjoaa uuden, erityisen edullisen terapeuttisen lähestymistavan, jonka mukaan tuotetaan jatkuvalla ja solun-sisäisellä tavalla vasta-aineita tai terapeuttisia aineita, joiden sitoutuminen epitooppiinsa vähentää epäsäännönmukai-suutta ja/tai peruuttaa sen.
20 Mahdollisuutta vasta-aineiden ilmentämiseksi yhdis telmä -DNA- teknis es ti on jo kuvattu kirjallisuudessa. Täten EP-patenttijulkaisussa 88 954 kuvataan vasta-aineiden raskaiden tai kevyiden ketjujen vaihtuvien alueiden ilmentämistä in vitro ja puhdistamista. Samoin US-patenttijulkai-25 sussa 4 946 778 kuvataan DNA—sekvenssien ilmentämistä in vitro, jotka koodittavat modifioituja vasta-aineita, jotka koostuvat vasta-aineiden raskaan ja kevyen ketjun vaihtuvista alueista liittosekvenssin yhdistäminä. Kuitenkin tässä patenttijulkaisussa kuvatut vasta-aineet ovat inaktiivi-30 siä, ja ne yleensä syntetisoidaan ei-liukoisten inkluusio-kappaleiden muodossa. Vasta-aineet on siten puhdistettava, minkä jälkeen niitä on käsiteltävä kemiallisesti (denatu-rointi, renaturoinnit jne.) aktiivisuuden palauttamiseksi. Esillä oleva keksintö osoittaa mahdolliseksi tällaisten 35 DNA-sekvenssien käytön solunsisäisten aktiivisten vasta-aineiden suoraksi ilmentämiseksi in vivo. Esillä oleva kek- 3 s into kuvaa tällaisten DNA-sekvenssien käytön, jotka koodit tavat solunsisäisiä vasta-aineita, alueiden kontrollissa, jotka mahdollistavat niiden ilmentämisen nisäkässoluis-sa, geeniterapiaan, etenkin ihmisellä. Tämä uusi lähesty-5 mistäpä tekee siten mahdolliseksi solukomponenttlen kohdentamisen, jotka eivät ole saatayi11a tavanomaisilla rokotus-menetelmillä. Lisäksi tähän lähestymistapaan ei liity immuunivasteen kehittyminen, vaan vaikutus on solunsisäinen.
Keksinnön ensimmäinen kohde on siten vaatimuksessa 10 1 esitetty menetelmä nukleiinihapposekvenssin valmistami seksi, joka käsittää geenin, joka koodittaä solunsisäistä sitoutumisproteiinia (PIL) alueen kontrollissa, joka tekee mahdolliseksi sen ilmentämisen nisäkässoluissa.
Keksintö koskee samoin vaatimuksessa 16 esitettyä 15 menetelmää vektoreiden valmistamiseksi, jotka sisältävät edellä määritellyn mukaisen nukleiinihapposekvenssin. Tarkemmin ottaen vektorit ovat virusalkuperää, kuten retrovi-rukset, adenovirukset:, adenoliitteiset virukset, herpes-virus, lehmänrokkövirus, HSV-virus jne.
20 Keksintö koskee myös vaatimuksessa 11 esitettyä me netelmää puutteellisen yhdistelmä-DNA-viruksen valmistamiseksi .
Keksintö koskee edelleen vaatimuksessa 17 esitettyä menetelmää farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi, 25 jotka on tarkoitettu ihmis- tai eläinruumiin kirurgiseen ja/tai terapeuttiseen käsittelyyn. Farmaseuttinen koostumus käsittää vektorin, etenkin viraalisen, tai nukleiinihapposekvenssin edellä määriteltyjen mukaisesti.
Esillä olevan keksinnön merkityksessä ilmaisulla 30 "solunsisäinen sitoutumisproteiinin (pxl) tarkoitetaan mitä tahansa proteiinia tai proteiinifragmenttia, joka kykenee tunnistamaan jonkin komponentin solusta, jossa se ilmennetään, ja olemaan selektiivisellä ja jalostetulla tavalla vuorovaikutuksessa tämän kanssa. Kyseessä voivat olla kerni-35 alliset kovalenttiset tai ei-kovalenttiset vuorovaikutuk set. Vuorovaikutus solukomponentin (proteiinit, lipidit, 4 amiinihapot, mRNA, tRNA, rKNÄ, DNA jne.) kanssa mahdollistaa vaikuttamisen salufunktioon, johon mainittu komponentti osallistuu, ja tekee siten mahdolliseksi kontrolloida (stimuloida, hidastaa:, inhiboida) tätä funktiota.
5 Edullisesti ML·: it koostuvat vasta-aineista saa duista molekyyleistä tai molekyyleistä, joilla on vasta-aineen vastaaviin verrattavia sitoutumisominaisuuksia. Erityisesti kyseessä ovat proteiinit, joilla on riittävät se-1ektiiVisyys ja affiniteetti vuorovaikutuksen in vivo mah-10 dollistamiseksi, jolla on neutraloiva vaikutus antigeeniin. Näitä molekyylejä kutsutaan seuraavansa solunsisäisiksi vasta-aineiksi niiden ominaisuuksien ja niiden sijainnin johdosta.
Vasta-aineet, jotka ovat immunoglobuliinien super-15 ryhmän molekyylejä, syntetisoidaan luonnollisesti (oleellisesti B-lymfosyyttien toimesta) erittyvien proteiinien muodossa. Ne vapautuvat siten solunulkoisiin osastoihin (verenkierto systeemi) , joissa ne harjoittavat aktiivisuuttaan {ei-itseantigeenien tunnistaminen ja sitoutuminen näihin). 2 0 Nyt on osoitettu, että on mahdollista ilmentää in vivo modifioituja geenejä, jotka koodittavat solunsisäisiä vasta-aineita, vaikuttamatta vasta-aineiden spesifisyys- ja affi-niteettiominaisuuksiin. Keksinnön mukaisesti valmistetut nukleiinihapposekvenssit, jotka koodittavat soluasisäisiä 25 vasta-aineita, käsittävät siten vasta-ainegeenin, jota on modifioitu siten, ettei vasta-aine erity. Erityisesti vas-tä-ainegeeniä on yleensä modifioitu deletoimallä tai muta-genisoimalla erityksestä vastuussa olevia sekvenssejä. ML·:it voivat etenkin koostua vasta-äinefragmenteista, ja 30 esimerkiksi F ab- tai F (ab'jr-fragmenteista, , jotka käsittävät antigeenin sitoutumisalueet. Tämäntyyppisen solunsisäi-sen vasta-aineen käyttö edellyttää kuitenkin nukleiinihap-pGsekvenssin ilmentämistä, joka käsittää useita geenejä, jotka koodittavat vastaavasti näiden fragmenttien raskaita 35 ja kevyitä alueita, ja se edellyttää samoin, että nämä ketjut yhdistyvät oikein in vivo. Tästä syystä keksinnön pii- 5 rissa käyttökelpoisten' solunsisäisten vasta-aineiden erityisen edullinen muoto koostuu peptidistä, joka -vastaa vasta-aineen kevyen, ketjun vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa, jonka peptidiliittäjä yhdistää peptidiin, joka vastaa vas-5 ta-aineen raskaan ketjun vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa. Tämäntyyppisen solunsisäisen vasta-aineen, jota kutsutaan nimellä SoFv, käyttö on kiinnostavaa, koska sen ilmentää yksi yksittäinen geeni. Nukleiinihapposekvenssien rakentamista, jotka koodittavat tämäntyyppisiä modifioituja vasta-10 aineita, havainnollistetaan esimerkeissä.
Lisäksi nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodittavat edellä kuvattuja solunsisäisiä vasta-aineita, voidaan samoin modifioida kemiallista, entsymaattista tai geneettistä tietä solunsisäisten vasta-aineiden muodostamiseksi, 15 jotka ovat stabilisoituja, ja/tai monifunktionaalisia, ja/tai kooltaan pienempiä, ja/tai päämääränä suosia niiden paikantumista johonkin tiettyyn solurxsisäiseen osastoon. Täten nukieiinihapposekvenssit voivat käsittää sekvenssejä, jotka koodittavat peptidejä, jotka sijaitsevat t lamassa 20 (NLS). Erityisesti on mahdollista fuusioida edellä kuvatut sekvenssit sekvenssiin, joka koodittaa viruksen SV40 NLS;ää, jonka peptidisekvenssi on seuraava: MPKKKRK [Kalde-ron et al^, Cell 39 (1984) 499].
Kuten edempänä mainittiin, edellä kuvatut nukle-25 iinihapposekvenssit käsittävät sekvenssejä, jotka mahdol listavat yhden tai useamman geenin ilmentämisen, joka koodittaa / jotka koodittavat PIL:ejä nisäkässoluissa. PIL-geenit on sijoitettu transkription ja translaation promoottorialueiden kontrolliin, jotka ovat funktionaalisia nisä-30 kässolussa, jossa ilmentymistä halutaan. Kyseessä voivat olla sekvenssit, jotka ovat homologisia mainittuun soluun nähden, eli sekvenssit, jotka ovat luonnollisesti vastuussa geenien ilmentymisestä mainitussa solussa. Samoin voivat kyseessä olla alkuperältään erilaiset sekvenssit, eli sek-35 yenssit, jotka ovat vastuussa proteiinien ilmentymisestä muuntyyppisissä soluissa, sekvenssit, jotka ovat vastuussa 6 vasta-aineiden ilmentymisestä luonnollisissa olosuhteissa, virus ilmentämissekyenss i t, jotka esimerkiksi esiintyvät vektorissa, johon keksinnön mukaiset sekvenssit on sisällytetty, tai edelleen synteettiset tai puolisynteettiset sek-5 venssit.
Mitä tulee käyttöön ihmisellä, lukuisia funktionaalisia promoottoreita on kuvattu kirjallisuudessa, kuten esimerkiksi viruspromoottorit CMV, SV40, Elä, MLP, LTR jne. Nämä solupromoottorit, kuten esimerkiksi nukkalisäkegeenin 10 promoottori, ovat kiinnostavia, koska ne mahdollistavat kudos spesifisen ilmentämisen (joka rajoittuu suoleen nukka-lisäkkeen kyseessä ollessa).
Lisäksi ilmentämissekvenssejä voidaan samoin modifioida, esimerkiksi niiden adaptpimiseksi ilmentämiseen 15 tietyntyyppisessä vektorissa tai solussa, niiden koon pienentämiseksi, niiden transkriptiopropmöottoriaktiivisuuden lisäämiseksi, indusoitavien promoottorien luomiseksi, niiden säätelytason parantamiseksi tai edelleen niiden säätelyn luonteen muuttamiseksi. Tällaiset modifikaatiot voidaan 20 suorittaa esimerkiksi mutagenisoimalla in vitro, liittämällä ylimääräisiä kontrollielementtejä tai synteettisiä sekvenssejä tai alkuperäisiä säätelyelementtejä deletoimalla tai substituoimalla. Voi olla erityisen edullista käyttää kudosspesifisiä promoottoreita PIL:in ilmentämiskohteina 25 yksinomaisessa kudostyypissä.
Lisäksi, silloin kun nukleiinihapposekvenssi ei käsitä ilmentämissekvenssejä,; tämä voidaan sisällyttää ilmen-tämisvektoriin tällaisesta sekvenssistä alavirtaan.
Vektorin valmistamiseksi keksinnön mukaisesti voi-30 daan ensivaiheessa identifioida solufunktio, esimerkiksi patologiaan liittyvä tai siitä vastuussa oleva, johon halutaan vaikuttaa. Sitten voidaan identifioida tähän funktioon liittyvä sopiva splukomponentti, minkä jälkeen määritetään, mikä PIL vaikuttaa sopiviiranalta tähän komponenttiin (vasta-35 aine, johdannaiset jne.) sijaintinsa, roolinsa, luonteensa jne. funktiona. Kun PIL on valittu, vastaava nukleiinihap- 7 posekvenssi voidaan saada molekyylibiologisin tekniikoin {kemiallinen synteesi, kloonaus, entsymaattinen modifiointi jne.) ja insert, o idä sopivaan vektoriin esimerkeissä kuvatulla menetelmätekniikalla.
5 Keksinnön toinen kohde koskee farmaseuttisten koos tumusten valmistusta, jotka käsittävät vähintään yhtä edellä määritellyn mukaista nukleiinihapposekvenssiä tai vektoria.
Tässä kuvattuja sekvenssejä voidaan käyttää sellai-10 senaan, esimerkiksi ruiskuttamalla ihmiseen tai eläimeen PIL:in solunsisäisen ilmentymisen indusoimiseksi määrättyyn solufunktioon vaikuttamiseksi. Erityisesti ne voidaan ruiskuttaa paljaan DMA:n muodossa tekniikan mukaan, jota kuvataan WO-hakemusjulkaisussa 90/11 092. Ne voidaan samoin an-15 taa kompleksin muodossa esimerkiksi DEAE-dekstraanin kanssa [Pägäno et ai., J. Virol. 1 (1967) 891], tumaproteiinien kanssa [Kaneda et ai., Science 243 (1989) 375], lipidien kanssa [Feigner et ai., PNAS 84 (1987) 7413], liposomien muodossa [Fraley et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431], 20 jne.
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa aiemmin määritellyn mukaiset nukleiinihapposekvenssit sisällytetään vektoriin. Tällaisten vektorien käytöllä on itse asiassa mahdollista suosia tunkeutumista soluun, lisätä vastustus-25 kykyä entsyymeille ja lisätä stabiilisuutta ja solunsisäi- siä ilmentymistasoja. Keksinnön mukaisesti vektorit voivat yhtä hyvin olla plasmidi- kuin virusluonteisia. Kuitenkin edullisesti käytetään virusvektoria.
Edullisessa suoritusmuodossa edellä määritellyn mu-30 kaisia nukleiinihapposekvenssejä on sisällytetty virusvek- toriin. Keksintö koskee myös menetelmää minkä tahansa yh~ distelmä - DNA-vi rules en valmistamiseksi, joka käsittää geno-miinsa insertoituna vähintään yhden PIL:iä koodittavan nuk-leiinihapposekvenssin.
35 Kuten edellä mainittiin, erilaisia viruksia voidaan | käyttää vektoreina tässä kuvattujen geenien siirtämiseksi 8 ja ilmentämiseksi in vivo. Esimerkiksi voidaan mainita retro virukset (RSV, HMS, MMS jne.) HSV-virus, adenoliitteiset virukset, adenqvirukset, 1ehmänrokkovirus jne.
Keksinnön mukaisesti valmistettu yhdistelmä-DNA-vi-5 rus on puutteellinen virus. Ilmaisulla ’‘puutteellinen virus" tarkoitetaan virusta, joka ei kykene rep1ikoitumaan kohdesolussa. Yleensä esillä olevan keksinnön puitteissa käytettyjen puutteellisten virusten genomi on siten vailla ainakin mainitun viruksen replikaatiolle sairastuneessa solu lussa välttämättömiä sekvenssejä. Nämä alueet on voitu joko eliminoida (kokonaan tai osittain), tai niistä on voitu tehdä epäfuriktionaalisia, tai ne on voitu substituoida muilla sekvensseillä ja etenkin keksinnön mukaisilla nukleiinihap-posekvensseillä. Edullisesti puutteellisella viruksella on 15 kuitenkin tallella genominsa ne sekvenssit, jotka ovat välttämättömät viruspartukkelien kapsidaatiolle.
Puutteellisia yhdis telinä-DNA-viruks ia, jotka on saatu retroviruksista, adenoliitteisistä viruksista, HSV-viruksesta (herpes simplex -virus) täi adenoviruksista, on jo 20 kuvattu kirjallisuudessa [Roemer ja Friedmann, Eur. J.
Biochem. 208 (1992) 211; Dodson et ai., Neuron _5 (1990) 353 ; Chiocca et ai., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et ai. , New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18 088; Akli et a3_, Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et ai., 25 Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et ai., Gene 101 (1991) 195; EP 243 204].
Erityisen edullisesti valmistetaan esitettyjä nuk-leiinihapposekvenssejä puutteelliseen yhdistelmä-DNA-adeno-virukseen sisällytetyssä muodossa.
30 Itse asiassa on olemassa erilaisia adenovirussero- tyyppejä, joiden rakenne ja ominaisuudet vaihtelevat jonkin verran, mutta jotka eivät ole ihmiselle patogeenisiä, ja etenkään immuunijärjestelmältään ei «heikentyne!Ile kohteille. Lisäksi nämä virukset eivät integroidu tartuttamiensa 35 solujen genomiin, ja ne voivat sisältää tärkeitä eksogeeni-sen DNA:n fragmentteja. Erilaisista serotyypeistä esillä 9 olevan keksinnön puitteissa. käytetään: edullisesti adenovirus tyyppiä 2 tai 5 {Ad 2 tai Ad 5) . Ädenoviruksen Ad 5 kyseessä ollessa replikaatiölle välttämättömät sekvenssit ovat. alueet ElA Ja E1B.
5 Lisäksi keksinnössä käytettävien solimsisäislä vas ta-aineita koodittavien geenien pieni koko tekee mahdolliseksi edullisella tavalla sisällyttää samanaikaisesti samaan vektoriin useita geenejä, jotka koodattavat solun-sisäisiä vasta-aineita, jotka kohdistuvat yhden tai useam-10 man solukohdekomponentin eri alueita vastaan. Keksinnön erityinen suoritusmuoto käsittää siten Vektorin valmistusta, erityisesti virusvektorin, joka käsittää vähintään kaksi nukleiinihapposekvenssiä, jotka koodittavat solunsisäi-siä sitoutumisproteiineja> jotka kohdistuvat eri epitoopp.e-15 ja vastaan.
Edellä kuvatut puutteelliset yhdistelmä-DNA-viruk~ set voidaan valmistaa homologisella DNA-yhdistymisellä puutteellisen viruksen ja plasmidin välillä, joka käsittää mm, edellä määritellyn mukaisen nukleiinihapposekvenssin [Lev-20 rero et ai., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3:12 (1984) 2917]. HomologinenDNA-yhdistyminen tapahtuu mainittujen viruksen ja plasmidin kotransfektöinnin jälkeen sopivaan soluiinjaan. Käytetyn sölulinjan tulee edullisesti (i) olla transformoitavissa mainituilla elementeillä, ja (li) 25 käsittää sekvenssejä, jotka kykenevät täydentämään virus- genomin puutteellisen osan, edullisesti integroidussa muodossa DNA-yhdfstymisvaarojen välttämiseksi. Esimerkkinä puutteellisten yhdistelmä-ENA-adenovirusten valmistamiseksi käyttökelpoisesta soluiinjasta voidaan mainita ihmisalkion mu-· 30 nuaissolulinja 293 [Graham et ai., J. Gen. Virol. 36 {1977) 59], joka sisältää etenkin genomiinsa integroituneena adeno- viruksen Ad 5 genomin vasemman puoleisen osan (12 %) . Esimerkkinä solulinjasta, joka on käyttökeIpoinen puutteellisten yhdistelmä-DNA-retrovirusten valmistamiseksi, voidaan 35 mainita soluiinja CHIP [Danos ja Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460] .
10
Sitten virukset, jotka ovat lisääntyneet, otetaan talteen ja puhdistetaan xnplekyylibiölpgian tavanomaisten tekniikoiden mukaan.
Esillä oleva keksintö koskee siten samoin farma-5 seutfcisen koostumuksen valmistusta, joka käsittää ainakin yhden edellä määritellyn mukaisen puutteellisen yhdistelmä-IMA-viruksen.
Mainitut farmaseuttiset koostumukset voidaan koostaa annettaviksi paikallista, oraalista, ruoansulatuskana-10 van ulkopuolista, nenänsisäistä, laskimonsisäistä, lihaksensisäistä, ihonalaista, silmänsisäistä jne. tietä.
Edullisesti farmaseuttiset koostumukset sisältävät ruiskeena annettavalle koostumukselle farmaseuttisesti hyväksyttäviä nestemäisiä kantajia. Kyseeseen voivat tulla 15 erityisesti suolaliuokset (mono-, dinatriumfosfaatti-, natrium-, kalium-, kalsium- tai magnesiumkloridi- jne. suolat tai tällaisten suolojen seokset), steriilit, isotoniset liuokset, tai kuivat, etenkin kylmäkuivatut koostumukset, jotka lisättäessä tapauksen mukaan steriiliä vettä tai fy-20 s x Olegista seerumia, mahdollistavat ruiskeena annettavien 1iuosten rekonstituoinnin,
Antoon käytetyt: nukleiinihappo (sekvenssi tai vektori) -annokset voidaan sovittää eri parametrien funktiona, ja etenkin käytetyn antotavan, kyseessä olevan patologian, 25 ilmennettävän geenin tai edelleen halutun hoidon keston funktiona. Yleensä ottaen, mitä tulee keksinnön mukaisiin | yhdistelmä-PNA-viruksiin, nämä koostetaan ja annetaan annoksien muodossa, jotka ovat 104 - 1014 pmy/ml, ja edullisesti 10δ - 1010 pmy/ml. Ilmaisu pmy ("pesäkkeen muodostava 30 yksikkö;''): vastaa virusliuoksen tartutuskykyä,, ja se määritetään infektoimalla sopiva soluviljelmä ja mittaamalla yleensä 48 tunnin kuluttua tartutettujen soluplakkien lukumäärä . Tekniikat virusliuoksen pmy-tiitterin määrittämiseksi on hyvin dokumentoitu kirjallisuudessa.
11
Keksintö koskee samoin menetelmää puutteellisen yhdiste liriä - DNA-vi ruks en valmistamiseksi, joka käsittää edellä määritellyn mukaisen nukleiinihapposelcvenssin.
Tässä esitettyjä sekvenssejä, mahdollisesti vekto-5 teihin sisällytettyinä, ja niitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää lukuisten patologioiden hoitamiseksi. Niitä voidaan siis käyttää geenien siirtämiseksi minkä tahansa tyyppiseen kudokseen ja geenien ilmentämiseksi minkä tahansa tyyppisessä kudoksessa in vivo. Hoito voi-10 daan sitä paitsi kohdentaa hoidettavan patologian funktiona (siirto nimenomaisen kudoksen tasolla voidaan etenkin määrätä vektorin valinnalla ja ilmentäminen valitsemalla nimenomainen promoottori). Esitettyjä sekvenssejä tai vektoreita käytetään edullisesti sellaisten proteiinien tuo.tta-15 miseksi ihmisessä tai eläimessä in vivo ja solunsisäisellä tavalla, jotka kykenevät vaikuttamaan spesifisellä, tavalla erilaisiin solufunktioihin, kuten solujen lisääntyminen, metaboliittien synteesi, proteiinien synteesi, DNA:n repii-kaatio ja/tai transkriptio jne. Esillä oleva keksintö tekee 20 täten mahdolliseksi lukuisten sellaisten solutoimintahäiri-öiden hoitamisen spesifisellä, paikallisella ja tehokkaalla tavalla, joiden alkuperänä ovat erilaiset patologiat tai jotka ovat seurausta erilaisista patologioista, ja erityisesti syöpien, virus- tai bäfcteerisairauksien tai yleisem-25 min minkä tahansa patologian, jolle voidaan identifioida soluvälittäjä.
Käyttö soluii sääntyrni seen liittyvien patologioiden hoitamiseksi
Erityisen edullisessa suoritusmuodossa tässä kuva-30 tut nukleiinihapposekvenssit käsittävät geenejä, jotka koodi ttavat PIL:ejä, jotka pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa soluiisääntymiseen liittyvien tekijöiden kanssa ja häiritsemään näiden aktiivisuutta. Solulisääntymiseen liittyy lukuisia tekijöitä, kuten membraanireseptorit (G-proteiinit), 35 onkogeenit, entsyymit (kinaas iproteiinit, f amesyy li transferees! t, fpsfolipaasit jne.), nukleosidit (AT?, AMP, Gdp, 12 GTP) jne.):, aktivaatioteki jät [guanosiinien vaihto teki jät (GRF, GAP jne.),, transkriptiotekijät jne.}, jne. Ilmentämällä solunsisäisesti edellä mainittuja PILrejä, jotka kykenevät sitoutumaan tällaisiin tekijöihin ja neutraloimaan 5 ne, on mahdollista kontrolloida solulisääntymisprosessia. Tämä On erityisen kiinnostavaa tilanteissa·, joissa solu-lisääntyminen karkaa luonnollisilta /säätelymekanismeilta,, mikä johtaa esimerkiksi kasvainten ilmaantumiseen. Lukuisia tekijöitä (onkogeenien ja tekijöiden geeni tuotteitä, jotka 10 liittyvät näiden tuotteiden vaikutuksen signälisaatioon) on itse asiassa yhdistetty näihin solujen lisääntymisen säätelyn puuttumisen ilmiöihin. Täten 90 %:ssa haima-a denosyöpiä esiintyy Ki-ras-onkogeeni, joka on mutasenisoitunut 12. ko-dönin kohdällä [Almoguera et ai., Cell 53 ¢198:8) 549] . Salt mo in mutagen is o: idun ras-geenin läsnäolo on osoitettu paksusuolen adenokarsinoomissa ja kilpirauliassyövissä {50 %) , tai keuhkosyövissä ja myeloidileukemioissa [30 %, Bos, J.L., Cancer Res. 49 (1989) 4682]. Lukuisia muita onko- geenejä on tähän mennessä Identifioitu (myc, fos, jun, ras, 2 0 myb, erb, jne.), joiden mutagenisoidut muodot vaikuttavat olevan vastuussa solulisääntymisen säätelyn häiriintymisestä .
PIL:ien ilmentäminen, jotka kykenevät sitoutumaan näihin solutekijoihin (edullisesti niiden onkogeeniseen muo-25 toon) ja siten hidastamaan tai inihiboimaan niiden vaikutuksia, tarjoaa mahdollisuuden uudelle terapeuttiselle lähes tyrnis tavalie syöpiin.
Erityisen kiinnostavassa muodossa esillä oleva keksintö koskee vektoreiden valmistusta, jotka sisältävät nuk-30 leiinihapposekvenssejä, jotka käsittävät geenin, joka koodit taa solunsisäistä vasta-ainetta, joka kykenee olemaan vuorovaikutuksessa onkogeenin ilmentymistuotteen kanssa tai tekijän kanssa, joka häiritsee onkogeenin signalIsaatiotie-tä.
35 Kohdeonkogeeneistä voidaan mainita keksinnön mie lessä gnkogeenit ras, fos, jun, myc, myb ja erb.
13
Tekijöistä, jotka häiritsevät onkogeenin signali-saatiötietä, voidaan mainita etenkin membraanireseptorit, jotka voidaan kohdentaa niiden solunsisäisten alueiden tasolla (G-proteiinit (esimerkki: tyrosiinikinaasi), fosfory-5 laasifc, farnesyylitransferääsit], nukleosidien vaihtoteki- jät (tekijät GAP, GRF jne.) jne.
Edullisemmin keksinnön mukaisesti valmistetaan vektoreita, etenkin virusperäisiä, jotka sisältävät nukleiini-happos ekvens s in, joka koodittaa sölunsisäistä västa-ainet-10 ta, joka kohdistuu vastaan onkogeeniä tai tekijää, joka häiritsee onkogeenin signalisaatiotietä, ja koostuu peptidistä, joka vastaa vasta-aineen kevyen ketjun vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa liitettynä liittopeptidillä peptidiin, joka vastaa vasta-aineen raskaan ketjun vaihtuvan alueen si-15 toutumiskohtaa.
Tarkemmin ottaen keksintö koskee puutteellisten yh-distelma-DNA-virusten valmistusta, jotka ilmentävät solun-sisäisen vasta-aineen, joka kohdistuu vastaan ras-riippu-vaisen signalisaatiotien tekijää.
20 Kuten esimerkit osoittavat, ilmentämällä solunsi- säisiä anti-p21-vasta-aineita (p21 on ras-geenin ilmenty-mistuote), anti-GAP- tai anti-p53-vasta-aineita, on mahdollista takauttaa syöpäsolun transformoitu fenotyyppi.
Käyttö viruspatologioiden hoitamiseksi 25 Edellä kuvatut nukleiinihapposekvenssit voivat edel leen olla sekvenssejä, jotka koodittavat solunsisäisiä vasta-aineita, jotka pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa patogeenisen viruksen (HIV, papilloomavirus jne.) tartuntasyk-lin kanssa.
30 Tarkemmin ottaen, HI-viruksen kyseessä ollessa, täl lä hetkellä käytettävissä olevat tai edenneiden kliinisten vaiheiden protokollissa olevat virusvastaiset aineet eivät tee mahdolliseksi viruksen lisääntymisen salpaamista, vaan kykenevät ainoastaan jarruttamaan sairauden etenemistä. Yk-35 si pääasiallisista syistä tähän on kantojen ilmaantuminen, jotka ovat resistenttejä näille virusvastaisiIle aineille.
14
Tehokkaan rokotteen kehittäminen törmää samoin lukuisiin vastuksiin: HIV m geneettinen vaihtelevuus ei salli määritellä stabiilia antigeenistä rakennetta immunologisen neste- tai soluvasteen saamiseksi vastaan olemassa olevia eri 5 kantoja. Kuten virusvastäisten aineiden tapauksessa, jossa virus vastustaa valikointipainetta pistemutaatioilla, tähän päivään mennessä yritetyissä rokotuskokeissa HIV vaikuttaa Välttävän immuuni j ärj estelmän.
Esillä oleva keksintö muodostaa uuden lähestymistä-10 van HIV-tartunnan hoitamiseksi, jonka mukaan virus salvataan sen replikaatiQSyklin aikana ilmentämällä F il, ja etenkin solunsisäisiä vasta-aineita. Esillä oleva keksintö tekee erityisesti mahdolliseksi vapautua viruksen geneettisen vaihtelevuuden ongelmasta vastoin kuin rokote- ja vi-15 rusvastaisissa lähestymistavoissa. Tavanomaisen rokotuksen j tapauksessa osoitetut immuunivasteet tapahtuvat pääasiassa j vastaan vaihtuvia alueita. Sitä vastoin, käyttämällä tässä kuvattuja solunsisäisiä vasta-aineita, on mahdpllista väli- j
X
ta ei ainoastaan säilyvä epitoöppi, vaan myös sellainen, j 20 joka on välttämätön Vlrusproteiinin funktiolle. Edullisesti j solunsisäinen vasta-aine kohdistuu epitooppia vastaan, joka on riittävän kokoinen estääkseen viruksen vastustuksen ja ] kyvyn adaptoitua pistemutaatioilla. Lisäksi solunsisälstä vasta-ainetta koodittavan geenin pieni koko tekee malidolli-25 seksi edullisella tavalla kohdentaa useita alueita (yksi ainoa tai useampia proteiineja) lähtien samasta geeniterä- j
Penttisestä Vektorista. }
Viruksen kaksi pääasiallista säätelyproteiinia, tat | ja rev, ovat ensisijaisen tärkeitä kohteita esillä olevan | 30 keksinnön suorittamiseksi. Itse asiassa nämä .kaksi proteii- | nia ovat välttämättömät, viruksen replikaatiolle. Lisäksi j ilmentämällä antisense-lähettl-RNÄ;, ta tai ribotsyymejä, jot- | ka kodentuvat lähetti-RNäthan tat tai rev, estetään viruk- | sen replikaatio. Näiden, proteiinien vaikutusmekanismi on j 35 suhteellisen, hyvin dokumentoitu: tat on transkription trans- | aktlvaatiotekijä, kun taas rev varmistaa siirtymisen: repii- j ä ] 15 kaatiosyklin varhaisten ja myöhäisten vaiheiden välillä.
Nämä kaksi proteiinia harjoittavat aktiivisuuttaan kiinnittymällä viruksen lähetti -RNA:hän, ja tälle kiinnitykselle, joka on edellytys niiden funktiolle, välttämätön peptidi-5 alue on suhteellisen hyvin rajattu. Lisäksi on osoitettu, että niiden kiinnittyrniskohdan RNA:hän (alue TAR tatille ja RRE revrille) hyvin runsas ilmentyminen inhiboi niiden funktion viruksen ilmentymisessä.
Näissä olosuhteissa keksinnön erityisen edullinen 10 muoto perustuu DNA-sekvenss in valmistukseen, joka koodittaa solunsisäista vasta-ainetta, joka kohdistuu vastaan tat-tai rev-proteiineja ja kykenee neutraloimaan niiden aktiivisuuden. Edullisesti tällaiset vasta-aineet kohdistuvat vastaan tat— tai rev-aluetta, joka on vastuussa niiden kiinnit— 15 tynvisestä RNA:hän.
Tässä esitetyt solunsisäiset vasta-aineet, jotka kohdistuvat vastaan näitä epitooppeja, voidaan valmistaa esimerkeissä kuvatun menettelytapatekniikan mukaan. Erityisesti .· mitä tulee anti-tat“Vasta-aineeseen, se voidaan saa-20 da geneettisellä modifikaatiolla lähtien monoklonaalisesta vasta-aineesta T-B (12) (Hybridolab).
Toinen tärkeä kohdeproteiini HIV:n replikaatiossa, jonka funktio voidaan helposti inhiboida solunsisäisellä vasta-aineella, on nukleokapsidiproteiini NGP7. Itse asias-25 sa tämä proteiini esittää merkittävää osaa retrotranskrip-tiossa (varhaisvaihe), integraatiossa ja myöhäisessä, mutta kuitenkin tärkeässä vaiheessa: kapsidaatiössa. Tämän moni-funktionaali s uuden selittää se, että sillä on entsymaattisesti aktiivinen rakenteellinen osa. Sitä on kuvattu hyöri-30 daasiksi, joka mahdollistaisi viraalisten nukleiinihappojen kömpieksinmuodostuksen: RNA/DNA ja DNA/ DNA retrotranskrip-tion aikana sekä RNA/'RNA ja RNA/ iys 3 - tRNA kapsidaation tasolla . NCF7 vaikuttaa välttämättömältä tartuttavan viruksen tuotannolle.
35 Tässä esitetään edelleen edullinen suoritusmuoto, jossa NCP7:ää vastaan kohdennettua solunsisäistä vasta-ai- | 16 net ta sytoplasma ilmennetään geeniterapialla, joka inhiboi sen funktion virus-RNA-sekvenssien dimerisaatiossa ja kap~ sidaatiossa.
Edellä kuvattuja solunsisäisia vasta-aineita, jotka 5 kohdistuvat vastaan tämän proteiinin neutraloivia epitoop-peja, voidaan valmistaa esimerkeissä kuvatun menettelytapa-tekniikan mukaan.
Muutkin viruskomponentit voivat samoin olla kohteena tässä kuvatulle geeniterapialle, ja etenkin: molekyylin 10 CD4 kiinnittymiskohta [esimerkki: kuoriglykoproteiini (gpl20/41)] , kuoren multimerisäatioalue, pilkkomiskohta gpl20/gp41, proteaasi, integraasi ja yleisemmin mikä tahansa virusproteiini. Näille alueille ei yleensä päästä kuoren ollessa natiivissa muodossa. Tästä syystä ne ovat vain hy-15 vin vähän immunogeenisiä ja rokote niitä käyttäen on mahdoton. Esillä oleva keksintö tekee mahdolliseksi näiden vi-ruskomponenttien kohdentamisen, ja sillä on täten hyvin ylivertainen terapeuttinen potentiaali. Lisäksi, kuten edellä mainittiin, tässä kuvattua soluneisäistä vasta-ainetta köp-20 dittavien geenien pieni koko tekee mahdolliseksi ilmentää edullisella tavalla samanaikaisesti samassa vektorissa useita solunsisäisiä vasta-aineita, jotka kohdistuvat yhden tai useamman näistä kohteista eri alueita vastaan.
Edellä kuvatut nukleiinihapposekvenssit voivat myös 25 olla sekvenssejä, jotka koodattavat PILrejä, jotka kykenevät olemaan vuorovaikutuksessa tekijöiden kanssa ja häiritsemään tekijöiden aktiivisuutta, jotka liittyvät metabö-liittien synteesiin, proteiinisynteesiin tai edelleen DNA:n replikaatioon ja/tai transkriptioon.
30 Esillä olevaa keksintöä kuvataan tarkemmin seuraa- vien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havainnollistaviksi eikä rajoittaviksi.
Piirustusten, selitykset
Kuvio 1: (A) ScFv-ras:in restriktiokartta. (b) 35 ScFv-Gap:in restriktiokartta. (C) Keksinnön mukaisen soluu si sai s en vasta-aineen tilapäisen ilmentämisen neutraloiva 17 vaikutus onkogeenin ras tai Her2 transformaatiokykyyn, Py = verrokkisolut; ScFv = vain plasmidilla psv2,ScFv.ras trans-fektoidut solut, VAL - solut, jotka on transfektoitu vektorilla, joka ilmentää onkogeenisen ras:in Ha-ras Vall2; VAL 5 + ScFv = solu, jotka on ko transfektoitu plasmidilla psv2.ScFv.ras ja Ha-ras Vall2; HER2 = solut, jotka on transfektoitu vektorilla, joka ilmentää onkogeenisen Her2:n; HER2 + ScPv = solut, jotka on kotransfektoitu plasmidilla psv2. ScFv-ras ja Her2:lla.
10 Molekyylibiologian yleiset tekniikat
Menetelmät,, joita tavanomaisesti käytetään molekyylibiologiassa, kuten plasmidi-DNA: n preparatiiviset uutot, plasmidi-DNA:n sentrifugointi ceesiumkloridigradienttia käyttäen, elektroforeesi agaroosi- tai akryyliamidigeeleissä,
15 DNA-fragmenttien puhdistaminen elektroeluutiolla, proteiinien uuttaminen fenolilla tai fenoli-kloroformilla, DNA:n seostaminen suolaliuoksessa etanolilla tai isopropanolilla, I
} transfdrmointi Escherichia coliin jne., ovat alan ammatti- ] laiselle tuttuja ja niitä kuvataan runsaasti kirjallisuu-20 dessa [Maniatis, T., et ai., "Molecular Cloning -A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory,: Cold Spring Harbor , N.Y. , 1982; Ausubel, F.M., et al., (toim.) , "Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons,
New York, 1987].
25 Tyypin pBR322, pUC plasmidit ja sarjan Ml3 faagit ovat kaupallista alkuperää (Bethesda Research Laboratories ) .
Ligatointeja varten DNA.-fragment it voidaan erottaa kokonsa mukaan elektroforeesilla agaroosi- tai akryyliami- ] 30 digeeleissä, ne voidaan uuttaa fenolilla tai fenoli/kloro- ] formiseoksella, saostaa etanolilla ja inkuboida sitten f aa ;j gin T4 DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa toimittajan suo-
situsten mukaan. I
Esiintyöntyvien 5'-päiden täyttäminen voidaan suo- j 35 rittaa E. coli -DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmentilla j ! (Biolabs) toimittajan, spesifikaatioiden mukaan. Esiin työn- 18 tyvien 3'-päiden tuhoaminen suoritetaan faagin T4 DNA-poly-meraasin (Biolabs) läsnä ollessa, jota käytetään valmistajan suositusten mukaan. Esiintyöntyvien 51-päiden tuhoaminen suoritetaan käsittelemällä varovaisesti Sl-nukleaasil-5 la*
Kohdennettu mutagenisointi in vitro synteettisillä oiigodeoksinukleotideillä voidaan suorittaa menetelmän mukaan, jonka ovat kehittäneet Taylor et ai. [Nucl. Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764] käyttäen Amershamin markkinoi-.10 maa pakkaus ta .
DMA-fragmenttien entsymaattinen monistaminen PCR:ksi (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki, R.K. , et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354; Mull is, K.B. , ja
Faloona, F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350] kutsutul-15 la tekniikalla voidaan suorittaa käyttäen "DNA-lämpökierrä- tintä" {Perkin Elmer Cetus) valmistajan spesifikaatioiden mukaan.
Nukleotidisekvenssien todentaminen voidaan suorittaa menetelmän mukaan, jonka ovat kehittäneet Sanger et ai. 20 [Proc. Natl. Acad. Soi. USA 74 (1977) 5463 - 5467] käyttäen Amershamin markkinoimaa pakkausta.
Esimerkki 1
Soitinsi säistä anti-ras-vasta-ainetta koodittahan dna-sekvenssin kloonaus ja ilmentäminen 25 Tässä esimerkissä kuvataan nukleiinihapposekvenssin kloonausta ja ilmentämistä, joka koodittaa solunsisäistä sitdutumispröteiinia, joka toistaa monoklonaalisen vasta-aineen Y13-259 ominaisuudet. Vasta-aine ¥13-259 kohdistuu vastaan RäS-prDtelineja (vrt. ATCC CRL 1742) [J. Vlrol, 43 30 (1982) 294 - 304], ja se on vasta-aine, joka neutraloi on- kogeenisten Ras-proteiinien funktion soluihin ruiskutettuna [Smith et ai., Mature 320 (1986) 540 - 543; Kung et ai.,
Exp. Cell. Res. 162 (1986) 363 - 371].
1.1. DNA-sekvenssin valmistaminen 35 Solunsisäistä vasta-ainetta (ScFv-fragmentti) koo dattava dna-sekvenssi valmistetaan tekniikan mukaan, jota 19 kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 946 778. Tämä sekvenssi sijoitettiin sitten nisäkässoluissa funktionaalisen promoottorin kontrolliin.
Poly-Ά- RNA-sekvenssit eristetään hybridoomasoluvil-5 jelmästä, joka erittää vasta-ainetta Y13-259, tekniikan mukaan, jota kuvaavat Chirguin, S.H., et ai. [Biochemistry 18 (1979) 5294]. Näitä RNA-sekvenssejä käytetään käänteistran-skriptioreaktiossa käyttäen satunnaisheksanukleotideistä muodostettuja alukkeita. Saadut cDNA-s ekvens s i t toimivat 10 matriisina kahdelle PCR-reaktiolle: yhden on määrä monistaa Yl3-259:n raskaan ketjun vaihtuva fragmentti (VH) spesifisillä hiiri-VH-alukkeilla; toisella voidaan saada Vh-fragmentti käyttäen hiiri s ekvens seistä saatujen 10 alukkeen seosta.
15 Näin saadaan kaksi, 340 ep:n ja 325 ep:n, fragment tia, jotka yhdistetään sitten liittäjällä, joka mahdollistaa VH-cDNA:n oikean sijoituksen 5' VL:n asemaan nähden. Tämä liittajä koodittaa 15 aminohappoa, jotka muodostuvat motiivin {Gly)4Ser kolmesta toistosta [Orlandi, R,, et ai., 20 Proc. Natl.Acad. Sei. USA 86 (1979) 3833 - 3837] . Solun- sisäisen vasta-aineen sekvenssi esitetään sekvenssinä tun-nusnro 1 (tähteet 28 - 270)· Tämä sekvenssi tuottaa tarpeeksi vapausasteita fuusiolle VH-VL mahdollistaakseen niiden yhdistymisen rinnan suuntautuneina, ja takaa oikeanlai-25 sen affiniteetin antigeenin suhteen.
Fuusioitu VH-liittäjä-VL-nukleiinihapposekvenssi in-sertoidaan sitten faagimidiin, joka tekee mahdolliseksi so-lunsisäisen vasta-aineen ilmentymisen (ScFv-fragmentti) faa-gin Ml3 pinnalla (kuvio IA). Tämä ilmentäminen mahdollistaa 30 helposti antigeenin oikein tunnistavien solunsisäisten vasta-aineiden tunnistuksen ja valikoinnin.
1.2, Modifioidun solunslsäisen vasta-aineen funktionaalinen arviointi DNA-s ekvenss i, joka koodittaa solunsisäistä modifi-35 oitua anti-Ras-vasta-ainetta (VH-liittäjä-VL), eristetään faagimidistä restriktiolla, ja insertoidaan sitten vekto- 20 riin sv2 parin tehostin ja SV40 :n varhaispromoottori [Schweighoffer et ai., Science 256 (1992) 825 - 827] kontrolliin sen kyvyn vastustaa onkogeenisen Rastin vaikutuksia testaamiseksi. Nain saatu plasmidi nimetään 5 psv2.ScFv.ras:iksi. Funktionaalinen arviointi suoritetaan usean testin mukaan: a) Tilapäinen transfektio nisäkässoluihin
Tilapäisen transfektion arvioimiseksi nisäkässoluis-sa plasmidi psv2.ScFv.ras kotransfektoitiin NIH 3T3 -solui-10 hin protokollan mukaan, jota kuvataan julkaisussa Schweighof f er et ai,, Science 256 (1992) 825 - 027, vektorin kanssa, joka mahdo11i s taa geenin Ha-ras Vai 12 ilmentymisen.
Tutkitun signalisaatiotien aktivaatiotila rekisteröitiin mittaamalla saatu entsymaattinen aktiivisuus reportterigee-15 nin "kloramfenikoliasetyylitransferääsi (CAT)" perusteella, joka oli sijoitettu promoottorin kontrolliin, joka sisältää nukleotidielementtejä, jotka vastaavat "trans" Ras:in (RRE) vaikutusta, joka samoin kotransfektoitiin: nämä RRE-elemen-tit muodostavat hybridipromoottori TK - polyoomatehostin j 20 [Wasylyk et ai., EMBQ J, 7 (1988) 2475].
Saadut tulokset esitetään kaviossa 1C. Saatujen CAT-aktiivisuuksien analyysi osoittaa modifioidun solun-sisäisen vasta-aineen, joka on valmistettu lähtien vasta-aineesta Y13-259, kyvyn vastustaa onkogeenisen Ras:in ak-25 tiivisuutta.
Plasmidi psv2.ScFv.ras, joka kotransfektoidaan plas-midin kanssa, joka mahdollistaa tyrosiinikinaasiaktiivi- | suutta omaavan onkogeenin, onkogeenin HER2 (ihmisen orvas- j keden kasvutekijä tyyppi II) , ilmentymisen, salpaa samoin j 30 sen aktiivisuuden plasmidi-"CAT"-testissä {kuvio 1). j b) Transformoitujen solujen pesäkkeiden muodostami- j nen j
Syöpäsoluilla on ominaisuus, jonka puitteissa ne muodostavat transformointipesäkkeitä ja etenkin fibroblas- i| 35 te ja NIK 3T3, jotka ilmentävät onkogeenisen Ras:in (Barlat j et ai..,, Oncogene B (1993) 215 - 218] . j 21 MIH 3T3 -soluja viljellään, kuten edellisessä testissä, Dulbeccon modifioidussa Eagle (DMEM) -kasvualustassa, joka sisältää 10 % vasikansikiöseerumia, 37 °C:ssa kosteassa ympäristössä, joka sisältää 5 % CC>2:ta, Nämä solut 5 kotransfektpidaan sitten onkogeenisellä Ras:in kanssa: Haras yali2:lla, plasmidilla psv2.ScFv.ras [vrt. kohta a) edellä] ja 10-kertaisena ylimäärällä neomysiiniresistens-sigeeniä kationisten lipidien transfektointitekniikalla [Schweighoffer et ai., Science 256 {1992) 825 - 827] . Sama 10 kokonaismäärä DNA:ta transfektoidaan kutakin maljaa kohden.
24 tunnin kuluttua transfektoinnista kustakin 100 mm: n petrimaljasta peräisin olevat transfektoidut solut jaetaan suhteessa 1:10 ja viljellään samassa kasvualustassa, mutta G418:n (Gibco/BRL) läsnä ollessa pitoisuutena 0,4 15 mg/ml kasvualusi taa. Mikrogrammaa (gg) kohden transf ektoitua DNA:ta saatujen transformointipesäkkeiden lukumäärä lasketaan 14 päivän kasvatuksen jälkeen.
Saadut tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.
Ne esittävät neljän riippumattoman kokeen keskiarvoa.
20
Taulukko NXH 3T3 -solujen transformoinfci Ha-ras Vai12:11a soluusi-säisen anti~ras-vasta-aineen läsnä ollessa 25 Transfektoidut plasmidit Pesäkkeiden lukumäärä/ pg transfektoitua DNAs ta
Ha-Räs Vai12 110 psv2.ScFv,ras 2
Ha-Ras Vai12 + psv2.ScFv.ras 30 30
Saadut tulokset osoittavat selvästi, että solun-sisäinen anti-ras-vasta-aine vähentää hyvin voimakkaasti onkogeenisen ras-geenin transfprmointikykyä.
Lisäksi, ottaen huomioon kohdassa a) saadut tulok-35 set, vasta-aineen Y13-159 tämän ScFv-fragmentin ilmentymisen tulisi samoin estää transformaatio muilla onkogeeneil- | 22 lä, kuten HERl, HER2, jotka helpottavat solu-Ras-proteiinien aktivaatiota,:
Huomattakoon:, että alan ammattilainen kykenee esillä olevassa hakemuksessa kuvattujen tulosten nojalla tois-5 tamaan keksinnön nukleiinihapposekvensseillä, jotka koodattavat solunsisäisiä: vasta-aineita (kuten SeFv-fragmentit), jotka kohdistuvat muita solukomponentteja vastaan. Nämä voidaan valmistaa joko lähtien tunnetuista vasta-aineista, jotka kohdistuvat solukomponentteja vastaan, tai identifi-10 oimalla neutraloitava antigeeni, imiuunoimalla tällä antigeenillä tai sen ensisijaisella epitoopillä, ja sitten valmistamalla solunsisäinen vasta-aine lähtien vasta-aineesta, sen mRNA: s ta tai saaduista hybridoomista. Muita solutrans-formaatiomeneteimässä mainittuja komponentteja voidaan tä~ 15 ten kohdentaa. Esimerkiksi muita DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat solunsisäisiä anti-ras-sit.out\imisvasta-aineita, voidaan valmistaa saman menettelytapa tekniikan mukaan lähtien hybr i do omi s ta M38, M8, M70, M90 ja M30 (ATCC HB 9158), joiden vasta-aineet kohdentuvat vastaavasti vastaan tähtei-20 ta 1 - 23, 24 - 69, 90 - 106, 107 - 130 ja 131 - 152 proteiinissa Ha-Ras. Lisäksi, kuten edellä mainittiin, edullisesti voidaan valmistaa vektoreita, jotka käsittävät samanaikaisesti lukuisia sekvenssejä, jotka .koodittavat erilaisia solunsisäisiä vasta-aiheita, paremman neutraloivan äk-25 tiivisuuden tuottamiseksi.
Esimerkki 2
Soluusisäistä anfci-GAP-vasta-ainetta koodattavan DKtA-sekvenssin kloonaus ja ilmentäminen Tämä esimerkki kuvaa nukleiinihapposekvenssin kloo-30 nausta ja ilmentämistä, joka koodittaa solunsisäistä sitou- tumisproteiinia, joka toistaa proteiinia GAP vastaan kohdentuvan monoklonaälisen vasta-aineen ominaisuudet.
GAP-proteiini (GTP-aasiaktivaatioproteiini) liittyy ras-riippuvaiseen signalisaatiotiehen:. Se on vuorovaikutuk-35 sessa ras-proteiinien kanssa katalyyttisellä tavalla ja moninkertaistaa tekijällä 100 - 200 GTP:n hydrolyysinopeuden 23 mitattuna in vitro normaalille p21-proteiinille. Eri tutkimukset ovat osoittaneet, että tämän proteiinin noin 1 044 aminohapon katalyyttinen alue sijaitsee karboksipään alueella (tähteet 702 - 1 044) , ja että tämä alue: on vastuussa 5 GAF-pröteiinin vuorovaikutuksesta ras-proteiinien kanssa (vrt. WO 91/02 749).
Nyt on osoitettu, että monoklonaalinen vasta-aine, joka kohdistuu vastaan "SH3":ksi kutsuttua aluetta GAP-proteiinissa, neutraloi onkogeenisten Ras-proteiinien funk-10 tiot Xenopen munassa [Duchesne et ai., Science 259 (1993 ) 525 - 528].
Kohdassa 1.1. kuvatun menettelytapatekniikan mukaan on mahdollista syntetisoida DNA-sekvenssi, joka koodithan solunsisäistä vasta-ainetta (ScFv-fragmentti) , joka vastaa 15 tätä vasta-ainetta (sekvenssi tunnusnro 2, tähteet 11 -250, kuvio IB), Tällainen sekvenssi vektoriin sisällytettynä: voi tehdä mahdolliseksi inhiboida onkogeenisen ras-· geenin transformointikyky kasvainsoluissa.
Lisäksi hakija on samoin identifioinut tarkemmin 20 tämän vasta-aineen tunnistamat epitoopit. Nämä epitoopit on sitten syntetisoitu keinotekoisesti, ja niitä voidaan käyttää uusien neutraloivien vasta-aineiden muodostamiseksi, jotka voivat toimia keksinnön toteuttamisessa.
a) Täsmällisempi identifiointi 25 Identifiointi toteutettiin ,'epitooppipyyhkäisy,'- tekniikalla. Tämä tekniikka perustuu siihen periaatteeseen, että tietty vasta-aine voi reagoida 5 - 15 aminohapon peptidien kanssa. Tämän johdosta sarjassa sijaitsevien epi-töoppien identifikaatio voidaan saada valmistamalla täydel-30 linen sarja 5 - 15 aminohapon (alueen) peittäviä peptidejä, j jotka vastaavat kyseessä olevan antigeenin täydellistä sek- j venssiä. Tätä tekniikkaa on käytetty GAP: in "SH3"-alueen f funktionaalisten epitooppien määrittämiseksi. Tässä tarkoi- ij taksassa tämä alue kokonaisuudessaan tutkittiin sargapei- ) 35 töillä syntetisoimalla joka 2. aminohapon dekapeptidi. j .¾ j j 24
Peittävien peptidien synteesi: 35 peptidiä/ jotka peittävät kokonaisuudessaan kuvion 1 mukaisen fragmentin, syntetisoitiin kemiallisesti.
Synteesi suoritettiin kaksinkertaisena kahdella riippumat-5 tomalla tuella Fmoc/t-butyylimenetäimällä kiinteässä faasissa (pakkaus Cambridge Research Biochemicais).
Funktionaalisten epitooppien osoittaminen:
Vasta-aineen Ac200 tunnistamat funktionaaliset epi-toöpit paljastettiin ELISA-kokeessa peroksidaasiin kytke-1:0 tyllä kaniinin anti-hiirivasta-Hineslla. Käytetty entsyymin kromogeeninen substraatti on aminodi(3-etyylibentsotiatso-diinisulfonaatti) (ABTS).
Saadut tulokset osoittavat, että tämän vasta-aineen tunnistamat; epitoopit ovat seuraayat:
15 PVEDRRRVRAI
EISF EDGWM.
Näitä epitooppeja voidaan käyttää alan ammattilaisen tavanomaisten tekniikoiden mukaan ras:in vaikutukset 20 neutraloivien vasta-aineiden muodostamiseksi. Näitä yasta-aineita tai niitä tuottavia nybridoomia käytetään sitten keksinnön mukaisten nukleiinihapposekvenssien ja vektorien muodostamiseksi edellä kuvatun menettelytapatekniikan mukaan.
25 Esimerkki 3
Nukleiinihapposekvenssin valmistaminen, joka koodit taa anti-Ki-ras~vasta-ainetta, lähtien naaras-hiirien mRNA-uufcfceista, jotka hiiret on immunoitu peptideillä, jotka on saatu Ki-rasiin runsaasti 30 muuttuvista osista (2A ja 2B) Tässä esimerkissä kuvataan nukleiiilihapposekverissi-en valmistusta, jotka koodattavat keksinnön mukaisia solun-sisäisiä vasta-aineita (kuten ScFv-fragmentteja), identifioimalla neutraloitava antigeeni, immunoimalla tätä anti-35 geeniä tai sen ensisijaista epituoppia käyttäen ja sitten i i 25 valmistamalla nukleiinihapposekvenssi lähtien vasta-aineesta, sen mRNAista tai saaduista hybridoomista.
Tämä esimerkki osoittaa mahdollisuuden soveltaa esillä olevaa keksintöä mihin tahansa haluttuun antigeeniin 5 tai epitooppiin, silloinkin kun monoklonaalista vasta-ainetta, joka kohdistuu vastaan mainittua antigeeniä, ei ole saatavilla,
Kohdeantigeeni tässä esimerkissä on Ki-ras-proteiini . Tarkemmin ottaen immunoinnissa käytetyt antigeenit 10 ovat 25 ja 24 aminohapon peptidit, joiden päät vastaavat seuraavia Ki-Ras-2A ja -2B proteiineja: peptidi 2ä: QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM peptidi 2B: KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM.
Hiiren näillä peptideillä immunoinnin jälkeen immu-15 nologian tavanomaisten tekniikoiden mukaan naarashiiriä uutetaan ja cDNA:t valmistetaan mRNA:sta lähtien. Sitten vaihtuvia alueita koodittavat cDNA- s elevens s t i kloonataan, mikä johtaa ScFv:n ilmentävien faagien pankin muodostumi- j seen, joka vastaa käytettyjen hiirten kokonaisvalikoimaa.
20 Solunsisäiset vasta-aineet (ScFv-fragmentit5, jotka tunnistavat peptidit 2ä ja 2B, identifioidaan sitten ja eristetään peräkkäisissä valikointivaiheissa affiniteetista kolonniin ja mikrotiitterdlevyyn.
Näiden ScFv-fragmenttien funktionaalisuus testataan 25 sitten esimerkissä 1 kuvatun protokollan mukaan.
Tässä esimerkissä kehitetyllä strategialla on mahdollista edullisesti valikoida onkogeenei1ie Ki-Ras spesifisiä solunsisäisiä vasta-aineita, jotka eivät siis vaikuta muihin Ras-proto-onkogeeneihin. Tällaisten työvälineiden 30 selektiivisyys ei siten ole pelkästään soluun kohdistuvaa (transduktioteiden irtikytkeytyrnisen johdosta Rastilla trans- 1 formoiduissa soluissa), vaan myös molekyylitasoista. 1 | j § | 26
Esimerkki 4
Nukleiinihapposekvenssin valmistus, joka koodittaa mutagenisoitua solunsisäistä anfci-p53-vasta-ainetta Tässä esimerkissä kuvataan nukleiinihapposekvenssi-5 en valmistusta, jotka kooditt-avat solunsisäisiä vasta-aineita {kuten ScFv-fragmentit) , jotka kohdistuvat mutageni-soituja p53-proteiineja vastaan. Nämä solunsisäiset vasta-aineet saadaan lähtien erilaisista monoklonaalisista vasta-aineista, jotka kohdistuvat mutagenisoituja p53-proteiineja 10 vastaan.
Proteiinia pS3 koodittava geeni on muuttunut hyvin suuressa lukumäärässä kasvainsoluja [Caron de Fromentel ja Soussi, Genes 4 {1992) 1 - 15] . Mutagenisoidun p53-prote iinin konformaatio ei ole samanlainen kuin villi-p53:n [La-15 ne ja Benchimol, Genes Dev. 4 81990) 1 - 8] . Tämä konfor-maation muutos voidaan todeta monoklonaalisilla vasta-aineilla [Milner ja Cook, Virology 154 (1986) 21 - 30; Milner .. Nature 310 81984) 143 - 145] .
Vasta-aineet pAB 240 tunnistavat p53-proteiinien 20 mutagenisoidut muodot,
Mutagenisoidulle p53:lle spesifisten vasta-aineiden ScFv-fragmentin tai proteiinien, jotka ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa mutagenisoitujen p53-proteiinien kanssa, solunsisäisen ilmentämisen olettaisi indusoivan edullisen 25 vaikutuksen mutagenosoidun p53:n käsittävissä kasvaimissa.
Esimerkki 5 DNA-sekvenssin kloonaus ja ilmentäminen, joka koo-dittaa solunsisäistä anti-papilloomavirusvasta-ai-netta 30 Tässä esimerkissä kuvataan DNA-sekvenssin kloonaus- ta ja ilmentämistä, joka koodittaa solunsisäistä vasta-ainetta (ScFv-fragmentti), joka kohdistuu ihmisen papillooma-viruksen (HPV) proteiinia vastaan.
Viruksen kohdeproteiini on proteiini E6. Tätä pro-35 teiinia tuottavat virukset HPV 16 ja 18, jotka ovat vastuussa 90 %:sta kohdunkaulasyövistä naisilla, ja jotka on 27 identifioitu epiteelin esisyöpävaurloissa [Rion et a 1-.,.,.
Lancet 335 (199Q) 111]. E6-geenin tuote johtaa kasvainten muodostumiseen vähentämällä voimakkaasti villi-p53:n, joka on anti-onkogeeni, määrää HPV-positiivisissa soluissa [Wre-5 de et ai., Mol. Carcinog. 4 (1991) 171]. Muissa kasvaimissa p53 inhiboituu eri mekanismeilla: mutaatio (vrt. esimerkki 4} tai liittyminen MDM2:n kaltaisiin proteiineihin.
Ξ6-proteiinin sekvenssiä on kuvattu kirjallisuudessa [Hawley-Nelson et ai., EMBO J. 8^ {1989) 3905; Miinger et 10 ai. , J. Virol. 63 (1989) 4417]. Tämän proteiinin erityisiä alueita voidaan identifioida nepitooppipyyhkäisyllä" (vrt. esimerkki 2), minkä jälkeen niitä voidaan käyttää hiirien immunoimiseksi protokollan mukaan, jota kuvataan esimerkissä 3'.,. DNA-sekvenssi, joka koodittaa solunsisäistä vasta- f 15 ainetta {ScFv-fragmentli), joka kohdistuu vastaan ihmisen f papilloomaviruksen (HPV) E6-proteiinia, valmistetaan sitten edellä kuvatun menettelytapatekniikan mukaan. Tämän sekvenssin funktionaalisuus osoitetaan ilmentämisen in vivo j älkeen mittaamalla: 20 villi-p:53-tason nousu E6*n ilmentävissä soluissa; HPV:n transformoimien solujen morfologian palautuminen; E6;:n vaikutusten p53:n transaktivaatioon salpaus; ihmisen keratinosyyttien ja fibroblastien transfor- ; 25 maatiön E6:llä inhibitio. |
Esimerkki 6 :j
Nukleiinihappo sekvenssin, joka koodittaa soitinsi- j säistä anti-Hiv-vasta-ainetta, valmistus lähtien | mRNA:sta, joka on uutettu hiirinaaraista, jotka on j 30 immunoitu peptideillä, jotka on saatu proteiinien j tat, rev ja WCP7 aktiivisilta alueilta ] Tässä esimerkissä kuvataan nukleiinihapposekvenssi- . j
en valmistusta, jotka koodattavat keksinnön mukaisia solun- I
sisäisiä vasta-aineita (kuten ScFv-fragmentteja), identifi- j 35 oimalla neutraloitava antigeeni, immunoimalla tällä anti- j geenillä tai sen ensisijaisella epitoopilla, ja sitten vai- j | | 28 luistamalla nukleiinihapposekvenssi lähtien: vasta-aineesta, sen mRNArsta tai saaduista hybridoömistä.
Tämä esimerkki osoittaa edelleen mahdollisuuden soveltaa esillä olevaa keksintöä mihin tahansa haluttuun an-5 tigeeniin tai epitooppiin, siiloinkin kun mitään mainittua antigeeniä tai epitooppia vastaan kohdistuvaa monoklonaa-lista vasta-ainetta ei ole alan teknisen tason puitteissa kuvattu.
Kohdeantigeenit tässä esimerkissä ovat HlV-viruksen 10 proteiinit tat, rav ja NCP7. Tarkemmin ottaen immunoinnissa käytetyt antigeenit ovat seuraavat 6, 9 ja 16 aminohapon peptidit, jotka vastaavat näiden proteiinien alueita, jotka ovat vastuussa niiden vuorovaikutuksesta mRNAm kanssa (tat ja rev} tai RNA:n dimerisaatiosta (NCP7):
15 peptidi tat: RKKRRQRRR
peptidi rev: RQARRKRRRRWRERQR peptidi NCP7: RÄPRKK.
Hiirien näillä peptideillä immunoinnin jälkeen immunologian tavanomaisin tekniikoin hiirinaaraista valmiste-20 taan uutteet ja cDNA-sekvenssit valmistetaan lähtien ; mKNA:sta. Sitten vaihtuvia alueita koodittavat cDNA-sek- j venssit kloonataan, mikä johtaa faagipankin muodostumiseen, joka ilmentää ScFv-fragmentit, jotka vastaavat käytettyjen hiirten kokonaisvalikoimaa. Solunsisäiset vasta-aineet 25 (ScFv-fragmentit) , jotka tunnistavat peptidit tat, rev ja NCP7, identifioidaan sitten ja eristetään peräkkäisillä vä-liköintivaiheilla affiniteetista kolonniin ja mikrotiitte-ri levyyn,
Sitten näiden ScFv-fragmenttien funktionaalisuus 30 testataan niiden kyvyn suhteen salvata Hiv-viruksen repli-kaatiösykli.
29
Sekvenssi timnusnr© 1 i/t 31/11 «jib iwdirt
tCA AGG AGA CAG TCT ATA AGA AAT ÄCC TAT TCG ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TT A CTC
ser arg arg gin ser ile arg asn thr tyr ser thr ala ala aja gly leu leu leu leu 01/21 Sfr; _ 91/31^,
CcO jCC CAG CGS -epe atg_ cct Jcag gtg aaa ctg. CAG cag tca gga gga ggc TTA GTG CAG
ala ala gin pro ala met ala gin vai lys ien gin gin ser gly gly gly leu vai gin ,12:1/41 " 151/51
CCT GGA AGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GTA GTC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAT GGA
pro gly arg ser leu lys leu set cys vai vai ser gly phe thr phe ser asn tyr gly m/si mm ' " ' ATGAÄij TGG ATT CGC CAG ACT CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG GTT GCA TAC AT7 AGT AG f met es n trp lie arg gin thr pro gly lys gly leu glu trp vai »la tyr ile säe ser: 241/61_ 271/91
GGT AGC AGT TAC CTC TAC TAT GCA O AA ACG GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA G AC
gly ser ser tyr leu tyr tyr ala glu thr vai lys gly arg phe thr ile ser atg asp 301/101 ' 331/111
AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG ACC AGT CTG AGO TCT GAA GAC ACT GCc TTQ
asn ala ly? asn the leu tyr leu gin wet thr ser leu arg ser glu asp thr ala leu 301/121 _ C-3-4 ^1/131_______ 5C,r
TAT TAC TGT GCA AGA CAT GAG GGT ACG GGT JV5C GAC TTC TTT GAT TAc] TGG GGC.dAA GQG
tyr tyr cys ala arg his glu gly thr gly thr asp phe phe asp tyrj trp- gly gin gly 421/141 ____451/151 C. JrsKtSrj____________
ACC ACG_GTC_ ACC GTC TCC TCA (GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC
thr thr vai thr vai ser ser gly gly gly gly ser gly gly gly gly ser gly gly gly 481/161 511/171
GGA TCGj GAC GTT GAG_CTC ACC CAG TCT CCA CAT TCC CTG TCT GCA TCT CTG GGA GAA ACT
g lv ser I asp vai glu leu thr gin ser pro his ser leu ser ala set leu gly glu thr 541/101 __ Ca-ti 571/191 j GTC TCC ATC GAA TGT jCTA GCA AGT GAG GGC ATT TCG AAT TAT TTA GCG TGG TAT CAG CAD \ vai set ile glu cys leu ala ser glu qjy Ile aer asn tvr leu ala trp tyr gin gin Ϊ
6:01/201 S31/311_e-Da.2- I
AAG CCA GQG AM TcT CCT CAG CTC CTG ATC ItAT TAT GCA AGT AGC TTG CAG GAT; GGG GTC j lys pro gly lys ser pro gin leu leu Ile ItVr tvr ala ser ser leu gin asp gly vai 661/221 691/231 | CCA TCA CGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGC ÄCA CAG TTT TCT CTC AAG ATC AGC AAC ATG \
pro ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr gin phe ser leu lye ile ser asn met I
721/241 751/251 _emy*_ j
CAA CCT GAA GAT GAA GQG GTT TAT TAC TGT CAA CAG GCT TAC: AAG TAT CCT TCC ACG I TTT
gin pro glu asp glu gly vai tyr tyr cys gin gin ala tyr lys tyr Pro ser thri t>he j 731/261 0U/2:n,v„rf ____ '
GGA GCT GGC ACC AAG CTG GM ΑΤΑ ΑΑΛ CGG j GCG .GCC _GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA
gly ala gly thr lys leu glu Ile lys argfala ala ala glu gin lys leu ile ser glu j 841/201 __ iiJte J 1 GAG GAT CTG AAT TAA TAA GAA TTC ACT GGC ; glu asp leu asn GCH pc H glu phe thr gly
•J
;j ] . | | : ] il il j 30
Sekvenssi tunnusnro 2 1/1 if.iei-ir Jf'1 **'·* 31/11 esti
TTA TTA CTC GCG GCC CAG CTG GCC^ÄTG _GCC f?AG GTC CAA CTG CAG GAG TCA GGA CCT GGC
leu leu leu «ia ala gin pro ala met ala win vai gin leu gin glu ser g ly pro g ly 61/21 »1/31
CTA GGG CAG CCC GCA CAG AGC ATT TCC ATA ACC TGC ACA GTC TCT GGT TTC TCA TTA AGT
leu gly gin pro ala gin ser lie ser lie thr cys thr vai set gly phe ser leu s sr 121/41 CJ3A-1 151/51 _
j AGC TAT GGT GTA CACjTGG GTT CGC CAG TCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GGAIgTG
Let tyr gly vai his trp vai arg gin ser pro gly lys gly leu glu trp leu glyjvai lai/fil· , . . , ΟΜΑ_211/71____ ' "
ΑΤΑ TGG AGA GGT GGA ÖGC ACA.GAC TAC AAT GCA GCC TTC ATGf TCC AGA CTG AGC ATC ACC
lie tm arg alv g lv glY.thr asti tyg aan ala ala Phe metl ser arg leu ser lie thr 241/81 271/91
AAG GAC AAC TCC AAG AGC CAA GTT TTC TTT AAA TTG AAC ACT CTG CAA CCT GAT GAC ACT
lys asp asn set lys sar gin vai phe phe lys leu asn ser leu gin pro asp asp thr 301/101 __ 331/111 t‘M\: GCC ATG TAC TAC TGT GCC ΑΑΛ |ÄGG~GGT GGC~CCC‘GGG'TAT TTC GAT GTC j TGG GGC CAA GGG ala met tyr tyr cys a la lys |arg gly gly pro gly tyr phe asp vai] trp gly gin gly 361/121 fartu _ 391/131 L*"L.r-__‘
ACC ACG JSTC_ ACC GTC TCC TCA joGT GGAGGCGGT~TCA GGC GGA GGT GGC TCT AGC GGT GGC
thr thr vai thr Vai ser ser gly gly gly o ly ser gly gly gly gly ser ser gly gly 421/141 yk-» ;.e.% 451/151
GGA TCGjjGAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA GAA ACT
gly ser {asp il e glu leu thr gin ser pro ala ser leu ser ala ser vai gly glu thr 491/161 ___i.UA -) 511/171
GTC ACC ATG ACA TGT J.CGA GCA AGT GAC AAT~ATT TAG AGT ΑΛΤ TTA GCAi TGG TAT CAG CAG
vai thr met thr cys arg ala ser glu asp lie tvr see asn 1 pu ala! trp tyr gin gin 541/191 571/191 ,fe
ΑΛΑ CAG GGA AAG TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT jGCT GCA ACA ÄAA GCA GGA ’ AATj GGT GTG
lys gin gly lys ser pro gin leu leu vai tyr |ala ala tht lys pro gly asn] gly vai 601/201 631/211 ‘ ‘ ' ' CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGC ACA CAA TTT TCT CTG AAG ATC AAC AGC CTQ.
pro ser arg phe ser gly ser gly ser gly thr gin phe ser leu lys ilo asn ser leu 661/221 691/231 t-OAV , ....
CAG CCT GAA GAT CTT GGG AAC TAT TAC TGT |CTA CAT TTT TAT GGG ACT CCG TAT AGgJ TTC
gin pro glu asp leu gly asn tyr tyr cys Jleu his phe tyr gly thr pro tyr argjphe mmi 751/25M-tT .»vt.· >
GGC GGG GGC ACC AAG CTG GAA ACG AAA CGGi GCG GCC GCA GAA CAA MA CTC ATC TCA GAA
gly gly gly thr lys leu glu thr lys fitglala’alTala glu öin lvs leu lie ser glu JMHB_ ---”-- ! GAG GAT CTG AAT TAA TAA GAA TTC ACT GGC glu asp leu asn ÖCH OCH gfu^phe thr gly
Claims (18)
1. Menetelmä nukleiinihapposekvenssin valmistamia seksi, joka käsittää geenin, joka koodittaa solunsisäistä 5 sitoutumisproteiinia (P.XL) nisäkässoluissa toimivan promoottorin kontrollin alaisena,, jolloin PIL on a] peptidi, joka käsittää vähintään yhden peptidin, joka vastaa vasta-aineen kevyen ketjun vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa yhdistettynä peptidiliittäjän välityksellä 10 peptidiin,: joka vastaa vasta-aineen raskaan ketjun: vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa·,·. to) peptidi, joka on kohdistettu onkogeeniä tai op-kogeenin signalisaatiotien tekijää vastaan, tunnettu siitä, että mainittu nukeliihihappo kloonataan sopivassa 1.5 isännässä, minkä jälkeen sekvenssi eristetään,
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa peptidiä, joka on kohdistettu ras-onkogeenin ilmentymiätuotetta vastaan. I
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan nukleiinihapposekvenssi, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssin tunnusnro 1.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun-25 n e 11 u siitä, että valmistetaan nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa GAP-proteiinia vastaan kohdistettua peptidiä .
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- j nettu siitä, että valmistetaan nukleiinihapposekvenssi, j 30 joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssin ij tunnusnro 2. |
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- I s nettu siitä, että valmistetaan nukleiinihappo-sekvenssi, j joka koodittaa peptidiä, joka on kohdistetu p53-proteiinia 35 vastaan. ) i
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan nukleiinihappösekYenssi, joka koodittaa peptidiä, joka on kohdistettu mu tagen i s o i tua p53~proteiinia vastaan.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen mene telmä, tunnettu siltä, että nisäkässöluissa toimiva promoottori valitaan virus-, solu- tai keinotekoisista promoottoreista ,
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 7 mukainen mene-10 telrnä, tunnettu siitä, että nukeliinihappQsekyenssi sisällytetään vektoriin,
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihapposekvenssi sisällytetään virusvektoriin.
11. Menetelmä puutteellisen yhdistelmä-DNA-·viruksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viruksen genomiin viedään jonkin patenttivaatimuksen 1 ~ 8 mukaisella menetelmällä valmistettu nukleiinihapposekvenssi.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, t u n -20 nettu siitä, että puutteellinen yhdistelmä-DNA-virus valitaan retroviruksista, adenovirukslsta, adenoliltfceisistä viruksista, lehmänrokkoviruksesta ja HSV-viruksesta.
13. Patenttivaatimuksen H mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan puutteellinen yhdistelmä-
25 DNA-virus, joka käsittää genomissaan nukleiinihapposekvens-sin, joka käsittää vähintään yhden geenin, joka koodittaa solunsisäistä vasta-ainetta, joka on kohdistettu ohkogeeniä tai onkogeenin signaallsaatiotien tekijää vastan ja joka käsittää vähintään yhden peptidin, joka vastaa vasta-aineen 30 kevyen ketjun vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa yhdistettynä peptidililttäjän välityksellä peptidiin, joka vastaa vasta-aineen raskaan ketjun vaihtuvan alueen sitoutumiskohtaa .
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, t u n -35 nettu siitä, että onkogeeni valitaan onkogeeneistä rayc, myb, ras, fos, jun ja erb.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puutteellinen yhdistelmä-DNA-virus valitaan retroviruksista, adenoviruksista, adenoliit-teisistä viruksista, lehmänrokkoviruksesta ja HSV-virukses- 5 ta.
16, Menetelmä, vektorin, etenkin virusvektorin valmistamiseksi, joka käsittää vähintään kaksi patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettua nukleiinihapposekvenssiä, jotka kpodittavat solunsisäisiä sltautumisproteiineja,: jot- 10 ka kohdistuvat yhden tai useamman antigeenin eri epitooppe-ja vastaan, tunnettu siitä, että Vektoriin viedään mainitut nukleiinihapposekvenssit.
17, Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan nukleiini- 15 happosekvenssi jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukaisesti tai yhdistelmä-DNA-virus jonkin patenttivaatimuksen 11 - 16 mukaisesti ja muodostetaan siitä farmaseuttinen koostumus.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan farmaseuttinen koostumus, 20 joka käsittää vähintään yhtä jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisesti valmistettua nukleiinihapposekvenssiä li-posomien, tai kompleksin tumaproteiinien, lipidien tai dek-straanin kanssa muodossa tai raakamuodossa. t j
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9307241A FR2706486B1 (fr) | 1993-06-16 | 1993-06-16 | Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques. |
| FR9307241 | 1993-06-16 | ||
| PCT/FR1994/000714 WO1994029446A2 (fr) | 1993-06-16 | 1994-06-15 | Proteines intracellulaires de liaison (pil) et leurs utilisations |
| FR9400714 | 1994-06-15 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI956057A0 FI956057A0 (fi) | 1995-12-15 |
| FI956057A FI956057A (fi) | 1995-12-15 |
| FI120311B true FI120311B (fi) | 2009-09-15 |
Family
ID=9448183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI956057A FI120311B (fi) | 1993-06-16 | 1995-12-15 | Menetelmiä solunsisäisiä sitoutumisproteiineja (PIL) koodaavien nukleiinihappojen ja niitä sisältävien virusten, vektoreiden ja farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6159947A (fi) |
| EP (1) | EP0703980B1 (fi) |
| JP (1) | JP4384260B2 (fi) |
| KR (1) | KR100342233B1 (fi) |
| CN (1) | CN1076052C (fi) |
| AT (1) | ATE231916T1 (fi) |
| AU (1) | AU7076394A (fi) |
| BR (1) | BR9407512A (fi) |
| CA (1) | CA2165458C (fi) |
| CZ (1) | CZ289039B6 (fi) |
| DE (1) | DE69432075T2 (fi) |
| DK (1) | DK0703980T3 (fi) |
| ES (1) | ES2191031T3 (fi) |
| FI (1) | FI120311B (fi) |
| FR (1) | FR2706486B1 (fi) |
| HU (1) | HU219138B (fi) |
| NO (1) | NO319466B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ268038A (fi) |
| PL (1) | PL180760B1 (fi) |
| RU (1) | RU2218400C2 (fi) |
| SK (1) | SK285169B6 (fi) |
| UA (1) | UA46709C2 (fi) |
| WO (1) | WO1994029446A2 (fi) |
| ZA (1) | ZA944303B (fi) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8003342B1 (en) | 1990-04-18 | 2011-08-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for identifying farnesyl transferase inhibitors |
| US6790633B1 (en) * | 1990-04-18 | 2004-09-14 | Michael S. Brown | Method of inhibiting a farnesyl transferase enzyme |
| FR2724320B1 (fr) * | 1994-09-13 | 1996-12-20 | Transgene Sa | Nouvel implant pour le traitement des maladies acquises |
| US5518042A (en) * | 1994-09-16 | 1996-05-21 | Huyck Licensco, Inc. | Papermaker's forming fabric with additional cross machine direction locator and fiber supporting yarns |
| FR2738151B1 (fr) * | 1995-09-04 | 1997-09-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers |
| US7008776B1 (en) | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
| CN1167793C (zh) * | 1996-12-06 | 2004-09-22 | 阿温蒂斯药物公司 | 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法 |
| FR2758569B1 (fr) * | 1997-01-20 | 1999-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Materiel biologique pour le traitement d'un mammifere par transfert de gene d'anticorps et composition pharmaceutique le concernant |
| WO2000050089A2 (en) * | 1999-02-26 | 2000-08-31 | Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Ltd. | Regulation of the stability of recombinant proteins and antiboodies |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| CA2404688C (en) | 2000-03-31 | 2012-07-31 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc. | Nuclear factor .kappa.b inducing factor |
| AU2002338446A1 (en) * | 2001-01-23 | 2002-11-05 | University Of Rochester Medical Center | Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells |
| US9328142B2 (en) | 2011-05-25 | 2016-05-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Lipopeptide inhibitors of RAS oncoproteins |
| KR101602870B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-21 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용 |
| KR101602876B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-11 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용 |
| DK3209685T3 (da) * | 2014-10-23 | 2019-07-29 | Singh Molecular Medicine Llc | Enkeltdomæneantistoffer rettet mod intracellulære antigener |
| US20180072815A1 (en) | 2014-10-23 | 2018-03-15 | Singh Biotechnology, Llc | Single Domain Antibodies Directed Against Intracellular Antigens |
| TWI746473B (zh) | 2015-11-02 | 2021-11-21 | 美商辛分子醫藥有限公司 | 針對細胞內抗原之單域抗體 |
| BR112018074275A2 (pt) | 2016-05-27 | 2019-10-01 | Orum Therapeutics Inc | anticorpo de penetração no citosol e método de produção do mesmo |
| US10787487B2 (en) | 2018-06-21 | 2020-09-29 | Orum Therapeutics Inc. | Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies |
| CN110981943B (zh) * | 2019-12-02 | 2021-08-03 | 清华大学 | 多肽及其在制备药物中的用途和药物 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| DE3915952A1 (de) * | 1989-05-12 | 1990-12-06 | Peter Werner | Wirkstoff/medikament/biotechnologisches verfahren zur behandlung von erkrankungen, die mit exo- oder endogenen intrazellulaeren proteinen (onkogene etc.) assoziert sind |
| WO1992005250A1 (en) * | 1990-09-25 | 1992-04-02 | University Of Connecticut | Prolonging expression of polynucleotides introduced into a cell |
| CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
| CA2120153C (en) * | 1991-09-30 | 2006-06-06 | Ira Pastan | Recombinant immunotoxins |
| AU668374B2 (en) * | 1991-12-10 | 1996-05-02 | Dana-Farber Cancer Institute | Reactive neutralizing human anti-GP120 recombinant antibody, DNA coding the same and use thereof |
| CA2137558A1 (en) * | 1992-07-17 | 1994-02-03 | Wayne A. Marasco | Method of intracellular binding of target molecules |
-
1993
- 1993-06-16 FR FR9307241A patent/FR2706486B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-15 CA CA2165458A patent/CA2165458C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 NZ NZ268038A patent/NZ268038A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 DE DE69432075T patent/DE69432075T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 RU RU96100240/13A patent/RU2218400C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 ES ES94919711T patent/ES2191031T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 EP EP94919711A patent/EP0703980B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 AT AT94919711T patent/ATE231916T1/de active
- 1994-06-15 UA UA95125274A patent/UA46709C2/uk unknown
- 1994-06-15 CN CN94192443A patent/CN1076052C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 DK DK94919711T patent/DK0703980T3/da active
- 1994-06-15 BR BR9407512A patent/BR9407512A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-06-15 SK SK1568-95A patent/SK285169B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 AU AU70763/94A patent/AU7076394A/en not_active Abandoned
- 1994-06-15 PL PL94312213A patent/PL180760B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 HU HU9503615A patent/HU219138B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 JP JP50143495A patent/JP4384260B2/ja active Active
- 1994-06-15 US US08/564,164 patent/US6159947A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 KR KR1019950705716A patent/KR100342233B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 WO PCT/FR1994/000714 patent/WO1994029446A2/fr active IP Right Grant
- 1994-06-15 CZ CZ19953295A patent/CZ289039B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-16 ZA ZA944303A patent/ZA944303B/xx unknown
-
1995
- 1995-12-11 NO NO19955011A patent/NO319466B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-12-15 FI FI956057A patent/FI120311B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120311B (fi) | Menetelmiä solunsisäisiä sitoutumisproteiineja (PIL) koodaavien nukleiinihappojen ja niitä sisältävien virusten, vektoreiden ja farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi | |
| JP7374995B2 (ja) | 抗ｐｄ－１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用 | |
| US7186697B2 (en) | Nucleic acid delivery system, methods of synthesis and use thereof | |
| KR102017396B1 (ko) | 항-ctla4 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 제약 조성물 및 용도 | |
| KR101944263B1 (ko) | 에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체 | |
| KR100337069B1 (ko) | 항-hiv모노클로날항체 | |
| KR20170110681A (ko) | Pcsk9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도 | |
| JP2006523086A (ja) | 発癌性形態のｒａｓに対する細胞内発現抗体 | |
| JP2024514246A (ja) | Ｃｌｄｎ１８．２抗原結合タンパク質およびその使用 | |
| EP0865490A1 (en) | Dna sequence encoding the tumor suppressor ing1 | |
| Giovane et al. | Targetting of the N‐terminal domain of the human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein with monomeric scFvs blocks the E6‐mediated degradation of cellular p53 | |
| JP4371178B2 (ja) | 抗ｐ５３一本鎖抗体フラグメント及びその使用 | |
| EP1002864A1 (en) | HIgR and related V domain for the manufacture of a medicament for preventing or treating HSV-1, HSV-2 and BHV infections | |
| EP0846761A1 (en) | A novel transcription factor expressed in cycling cells, nucleic acid molecules encoding said transcription factor and its promoter region and uses thereof | |
| AU722702B2 (en) | Intracellular binding proteins and use thereof | |
| US5776727A (en) | DNA, polypeptides, monoclonal antibody and methods thereof | |
| ITMI950676A1 (it) | Vaccini polinucleotidici | |
| CN111978393A (zh) | 抗乙肝病毒新型抗体及其用途 | |
| Curiel | Intracellular Antibody-Mediated Knockout of the ErbB-2 Oncoprotein as a Cancer Gene Therapy Approach |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: AVENTIS PHARMA S.A. |
|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120311 Country of ref document: FI |
|
| MM | Patent lapsed |