NO319466B1 - Nukleinsyresekvens kodende intracellulaere bindingsproteiner og defekt, rekombinant virus, vektor, farmasoytisk preparat og anvendelse derav. - Google Patents

Abstract

Nukleinsekvenser og vektorer inneholdende sekvensene samt deres terapeutiske anvendelse, særlig ved genterapi. Mer spesielt beskrives nukleinsekvenser omfattende et gen som koder for et intracellulært bindingsprotein, PIL, samt dens anvendelse ved genterapi, eventuelt innarbeidet i egnede ekspresj onevektorer.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nukleinsekvenser, vektorer som inneholder disse, samt deres anvendelse, særlig innen det genterapeutiske området.

Mer spesielt angår oppfinnelsen nukleinsekvenser omfattende et gen som koder for et intracellulært bindingsprotein, PIL, og deres anvendelse, eventuelt innarbeidet i egnede ekspresjonsvektorer.

Genterapi omfatter å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilekspresjon og så videre) ved innføring av en genetisk informasjon i cellen eller det påvirkede organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som er trukket ut fra organet hvoretter denne celle modifiseres før den gjeninnføres i organismen, eller den kan innføres direkte in vivo i det egnede vev. I denne forbindelse er det beskrevet forskjellige teknikker for transfeksjon og overføring av gener i litteraturen, se Roemer et Friedmann, "EurJ.Biochem." 208 (1992) 211). Inntil idag har de løsninger som er foreslått i den kjente teknikk for genterapi omfattet å overføre gener som koder for aktive polypeptider som er implikert i genetiske sykdommer (hormoner, vekstfaktorer og så videre), antiretningsgener eller anti-geniske peptider for realisering av vaksiner. Foreliggende oppfinnelse er basert på en ny tilnærmelse i genterapien og som omfatter å overføre og i en målcelle (eller målvev) å uttrykke et intracellulært peptid som er i stand til å interagere med cellulære komponenter og således interferere med de cellulære funksjoner. Foreliggende oppfinnelse hviler delvis på påvisningen at det er mulig in vivo å uttrykke modifiserte antistoffer som forblir i det intracellulære rom, og som kan kontrollere visse cellulære funksjoner. Oppfinnelsen hviler også på den påvisning at det er mulig å klone DNA-sekvenser som koder for slike intracellulære antistoffer i vektorer, særlig virale vektorer, for anvendelse i genterapi.

Anvendelsen av antistoffer i humanterapi tillater generelt å sikte seg inn på og å nøytralisere biologiske komplekser som sirkulerer og/eller er lokalisert på overflaten av cellene, og å medføre en kaskade av evenementer, iverksatt av immunsystemet, som fører til deres eliminering. I mange tilfeller og deriblant cancere eller sykdommer som for eksempel skyldes virus, er denne mulighet steril for antigenet som er ansvarlig for dereguleringen av cellene er utilgjengelig for injiserte antistoffer. Foreliggende oppfinnelse tilbyr en ny terapeutisk mulighet som er spesielt fordelaktig og som omfatter på kontinuerlig og intracellulær måte å produsere antistoffer eller terapeutiske midler hvis binding til deres epitop reduserer og/eller annullerer dereguleringen. Muligheten for på rekombinant måte å uttrykke antistoffer er allerede beskrevet i litteraturen. Således beskriver EP 88994 ekspresjon in vitro og rensing av forskjellige områder av tunge eller lette antistoffkjeder. På samme måte beskriver US 4.946.778 ekspresjon in vitro av DNA-sekvenser som koder for modifiserte antistoffer bestående av variable områder av tunge og lette kjeder av et antistoff forbundet med en linker. Imidlertid er antistoffene som beskrives i dette patent inaktive og generelt syntetisert i form av uoppløselige inklusjonslegemer. Antistoffene må således renses og deretter underkastes kjemiske behandlinger (denaturering, renatureringer) for å få en aktivitet. Foreliggende oppfinnelse viser muligheten for å anvende slike DNA-sekvenser for direkte ekspresjon in vivo av aktive, intracellulære antistoffer. Foreliggende oppfinnelse viser således muligheten for å benytte en slik DNA-sekvens som koder for intracellulære antistoffer under kontroll av områder som tillater deres ekspresjon i mammalske celler, for en genetisk terapi, særlig i mennesker. Denne nye mulighet tillater således å sikte seg inn på cellulære komponenter som ikke er tilgjengelige ved de klassiske vaksinasjonsmetoder. Videre implikerer denne tilnærmelse ikke utvikling av noen immunrespons, virkningen er intracellulær.

En første gjenstand for foreliggende oppfinnelse ligger således i en sekvens av nukleinsyrer omfattende et gen som koder for et intracellulært bindingsprotein, PIL, under kontroll av områder som tillater dets ekspresjon i mammalske celler.

Oppfinnelsen angår likeledes vektorer inneholdende en nukleinsyresekvens som definert ovenfor.

Mer spesielt er vektorene ifølge oppfinnelsen av viral opprinnelse, for eksempel retroviruser, adenoviruser, adenoassosierte vimser, herpesvirus, virus fra vaksiner, HSV-virus og så videre.

Oppfinnelsen angår likeledes anvendelsen av disse nukleinsyresekvenser eller vektorene for fremstilling av farmasøytiske preparater ment for kirurgisk og/eller terapeutisk behandling av det menneskelige eller animalske legeme. Oppfinnelsen angår videre ethvert farmasøytisk preparat omfattende en vektor og særlig viral vektor, eller en sekvens av nukleinsyrer som definert ovenfor.

Innenfor rammen av oppfinnelsen angir uttrykket "intracellulært bindingsprotein, PIL, ethvert protein eller proteinfragment som er i stand til å erkjenne en komponent i cellen i hvilken den uttrykkes, og på selektiv og med affinitet å interagere med denne. Det kan dreie seg om kovalente eller ikke-kovalente, kjemiske interaksjoner. Interaksjonen med cellulærkomponenten (proteiner, lipider, aminosyrer, mRNA, tRNA, rRNA, DNA og så videre) tillater å innvirke på en cellulær funksjon i hvilken komponenten er implikert og således å kontrollere (stimulere, forsinke, inhibere) denne funksjon.

Fortrinnsvis består PIL'ene ifølge oppfinnelsen av molekyler avledet fra et antistoff eller med bindingsegenskaper sammenlignbare med de til et antistoff. Særlig dreier det seg om proteiner med en selektivitet og en affinitet som er tilstrekkelig til å tillate en interaksjon in vitro med en nøytraliserende effekt på antigenet. Disse molekyler kalles i det følgende intracellulære antistoffer på grunn av deres egenskaper og deres lokalisering.

Antistoffene, molekyler fra immunoglobulin-superfamilien, syntetiseres naturlig (i det vesentlige av B-lymfocytter) i form av utskilte proteiner. De er således fri i de ekstra-cellulære områder (sirkulatorisk system) der de utøver sin aktivitet (erkjennelse og binding til ikke-egne antigener). Det er imidlertid vist at det er mulig in vivo å uttrykke modifiserte gener som koder for intracellulære antistoffer, uten å påvirke egenskapene med henblikk på spesifisitet og affinitet, hos antistoffene. Nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen, som koder for intracellulære antistoffer, omfatter således et antistoff-gen som er modifisert på en slik måte at antistoffet ikke utskilles. Særlig er antistoff-genet generelt modifisert ved delesjon eller mutasjon av sekvensene som er ansvarlige for utskillingen. Oppfinnelsens PIL kan særlig bestå av antistoff-fragmenter, for eksempel fragmentene F(ab) eller F(ab)'2, som bærer bindingsområdene av antigenet. Anvendelsen av denne type intracellulære antistoffer implikerer imidlertid ekspresjon av en nukleinsyresekvens som omfatter flere gener som respektivt koder for tunge og lette områder av disse fragmenter, og implikerer likeledes at kjedene korrekt settes sammen in vivo. Av denne grunn består en spesielt fordelaktig form av det intracellulære antistoff som kan benyttes innenfor oppfinnelsens ramme, av et peptid som tilsvarer bindingssetet til det variable området av den lette kjede av et antistoff, forbundet via en peptidisk linker til et peptid som tilsvarer bindingssetet til det variable området av den tunge kjede av et antistoff. Anvendelsen av denne type intracellulære antistoffer, kalt ScFv, er interessant da de uttrykkes av et eneste gen. Konstruksjonen av nukleinsyresekvenser som koder for slike modifiserte antistoffer ifølge oppfinnelsen, er vist i eksemplene.

Videre kan nukleinsyresekvensene som koder for de intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen likeledes være modifisert på kjemisk, enzymatisk eller genetisk måte, med henblikk på å generere stabiliserte, intracellulære antistoffer, og/eller multifunksjonelle slike, og/eller slike med redusert størrelse, og/eller med det formål å favorisere deres lokalisering i et eller annet intracellulært område. Videre kan oppfinnelsens nukleinsyresekvenser omfatte sekvenser som koder for peptider for nukleær lokalisering, NLS. Særlig er det mulig å fusjonere oppfinnelsens sekvens med sekvensen som koder for NLS av virus SV40 hvis peptidsekvens er den følgende: MPKKKRK (Kalderon et al., "Cell" 39 (1984)499).

Som antydet ovenfor omfatter nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsens sekvenser som tillater uttrykk av det eller de gener som koder for PIL i de mammalske celler. Generelt er PIL-genene anbragt under kontroll av promoter-områder for transkripsjon og translasjon, funksjonelle i den mammalske celle i hvilken ekspresjonen er tilsiktet. Det kan dreie seg om sekvenser som er homologe vis-å-vis cellen, det vil si sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av genene i cellen. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse, det vil si sekvenser som er ansvarlig for ekspresjonen av proteiner i andre typer celler, sekvenser som er ansvarlige for antistoff-ekspresjonen under naturlige betingelser, virale ekspresjonssekvenser, for eksempel tilstede i en vektor der oppfinnelsens sekvenser er innarbeidet, eller også syntetiske eller semi-syntetiske sekvenser.

Når det dreier seg om anvendelse for mennesker, er det beskrevet tallrike funksjonelle promotere i litteraturen, for eksempel de virale promotere CMV, SV40, Ela, MLP, LTR og så videre. Cellulære promotere som for eksempel villin-genet, er av interesse fordi dette tillater en spesifikk vev-ekspresjon (begrenset til innvollene når det gjelder villin).

Videre kan også ekspresjonssekvensene være modifisert, for eksempel for tilpasning til ekspresjon i en spesiell type vektor eller celle, for å redusere deres størrelse, for å øke deres promoter-aktivitet for transkripsjon, for å generere induserbare promotere, forbedre deres reguleringsnivå eller også for å endre arten av deres regulering. Slike modifikasjoner kan gjennomføres for eksempel ved mutagenese in vitro, ved innføring av ytterligere kontrollelementer eller syntetiske sekvenser, eller ved delesjoner eller substitusjoner av de opprinnelige kontrollelementer. Det kan være særlig fordelaktig å benytte vevspesifikke promotere for å styre ekspresjonen av PIL i kun én vevtype.

Når videre nukleinsyresekvensen ikke omfatter ekspresjonssekvensene, kan disse innarbeides i en ekspresjonsvektor, nedstrøms en slik sekvens.

For å fremstille en vektor ifølge oppfinnelsen er det i et første trinn hensiktsmessig å identifisere en cellulær funksjon, for eksempel implikert i eller ansvarlig for en patologi mot hvilken man ønsker å virke. Deretter må man identifisere en egnet cellulær komponent som er implikert i denne funksjon for å bestemme hvilken PIL som synes å være den mest egnede for denne komponent (antistoff, derivat og så videre) som funksjon av dens lokalisering, rolle, art og så videre. Når denne PIL er seleksjonert kan en tilsvarende nukleinsyresekvens oppnås ved molekylærbiologiske teknikker som kjemisk syntese, kloning, enzymatisk modifisering og så videre, og innføres i en egnet vektor i henhold til den metodologi som er beskrevet i eksemplene.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen angår farmasøytiske preparater omfattende minst en nukleinsyresekvens eller en vektor som definert ovenfor.

Sekvensene ifølge oppfinnelsen kan benyttes som sådanne, for eksempel etter injeksjon i mennesker eller dyr, for å indusere intracellulær ekspresjon av en PIL med henblikk på å påvirke en bestemt cellulær funksjon. Særlig kan de injiseres i form av nakent DNA i henhold til den teknikk som er beskrevet i WO 90/11092. De kan likeledes ministreres i kompleksdannet form, for eksempel med DEAE-dekstran (Pagano et al., "J.Virol." 1

(1967) 891), med nukleærproteiner (Kaneda et al., "Science" 243 (1989) 375), med lipider (Felgner et al, "PNAS" 84 (1987) 7413), i form av liposomer (Fraley et al., "J.Biol.Chem." 255 (1980) 10431), etc.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir nukleinsekvensene som definert ovenfor innarbeidet i en vektor. Anvendelsen av slike vektorer tillater å favorisere penetrering inn i cellene, å øke resistensen mot enzymer og å øke stabiliteten og de intracellulære ekspresjonsnivåer. Vektorene ifølge oppfinnelsen kan like gjerne være plasmidiske som virale. Imidlertid foretrekker man å benytte en viral vektor.

I en foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen således nukleinsyresekvenser som definert ovenfor, innarbeidet i en viral vektor. Oppfinnelsen angår likeledes enhver rekombinant virus som, innskutt i sitt genom, inneholder minst en nukleinsyresekvens som koder for en PIL.

Som antydet ovenfor er forskjellige vimser egnet for å kunne benyttes som vektorer for overføring og ekspresjon in vivo i genene ifølge oppfinnelsen. Som et eksempel kan nevnes retrovirusene (RSV, HMS, MMS, og så videre), HSV-viruset, adeno-assosierte vimser, adenovirusene, vaksinevirus og så videre.

Fortrinnsvis er den rekombinante virus ifølge oppfinnelsen et defekt virus. Uttrykket "defekt virus" angir et virus som ikke er i stand til replikering i målcellen. Generelt er således genomet av de defekte vimser som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen, berøvet for i det minste de sekvenser som er nødvendig for replikering av vimsen i den infiserte celle. Disse områder kan enten være eliminert (heller eller delvis), gjort ikke-funksjonelle eller være erstattet med andre sekvenser og særlig med oppfinnelsens nukleinsekvenser. Fortrinnsvis har imidlertid de defekte vimser bevart de sekvenser i sitt genom som er nødvendig for kapsid-dannelse av de virale partikler.

Defekte, rekombinante viruser som er avledet fra retrovirus, adenoassosiert virus, HSV-virus (herpes simplex-virus) eller adenovimser, er allerede beskrevet i litteraturen [Roemer et Friedmann, "Eur.J.Biochem." 208 (1992) 211; Dobson et al., "Neuron" 5

(1990) 353; Chiocca et al., "New Biol." 2 (1990) 739; Miyanohara et al., "New Biol." 4

(1992) 238; WO91/18088; Akli et al., "Nature Genetics" 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., "Human Gene Therapy" 1 (1990) 241; EP 185 573, Levera et al., "Gene" 101 (1991) 195; EP 243204)].

Det er spesielt fordelaktig å benytte nukleinsekvenser ifølge oppfinnelsen i en form innarbeidet i et defekt, rekombinant adenovims.

Det eksisterer forskjellige serotyper av adenovimser hvis struktur og egenskaper varierer noe, men som ikke er patogene for mennesker, og særlig ikke for ikke-immunodeprimerte personer. Videre integreres disse vimser ikke i genomet i cellene de infiserer og kan innarbeide betydelige eksogene DNA-fragmenter. Blant disse forskjellige serotyper foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte adenoviruset av type 2 eller 5, 2 eller 5. Når det gjelder adenovims 5 er de sekvenser som er nødvendig for replikeringen, områdene El A og El B.

Videre tillater den lille størrelse for genene som koder for de intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen på fordelaktig måte samtidig, i en og samme vektor, å innarbeide flere gener som koder for intracellulære antistoffer som er rettet mot forskjellige områder av en eller flere komponenter i målcellen. En særlig utførelsesform av oppfinnelsen ligger således i en vektor, særlig viral, som omfatter minst to nukleinsyresekvenser som koder for intracellulære bindingsproteiner rettet mot forskjellige epitoper.

De defekte, rekombinante vimser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved homolog rekombinering mellom et defekt vims og et plasmid som blant annet bærer nukleinsyresekvensen som definert ovenfor (Levero et al., "Gene" 101 (1991) 195; Graham, "EMBO J." 3(12) (1984) 2917). Den homologe rekombinering skjer etter ko-transfektering av vimsene og plasmidet i en egnet cellelinje. Cellelinjen som benyttes må fortrinnsvis (i) være transformerbar med disse elementer, og (ii) bære sekvensene som er i stand til å komplementere delen av genomet av det defekte vims, fortrinnsvis i integrert form, for å unngå rekombineirngsrisiki. Som eksempel på en linje som kan benyttes for fremstilling av de defekte, rekombinante adenovimser skal nevnes human-embryo nyrelinjen 293 (Graham et al., "J.Gen.Virol." 36 (1977) 59), som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en adenovims 5 (12 %). Som et eksempel på en linje som kan benyttes for fremstilling av defekte, rekombinante retroviruser, skal nevnes linjen CRIP (Danos et Mulligan, "PNAS" 85 (1988) 6460).

Til slutt blir de multiplikerte vimser gjenvunnet og renset t henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien.

Oppfinnelsen angår også et farmasøytisk preparat inneholdende minst et defekt, rekombinant vims som definert ovenfor.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan formuleres med henblikk på topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokkulær eller annen administrering.

Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater også farmasøytisk akseptable bærere for en injiserbar formulering. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske saltoppløsninger (mono- eller dinatriumfosfat, natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumklorid og så videre, eller blandinger av slike salter), eller tørkede preparater, særlig lyofiliserte preparater, som, ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk semm, tillater konstituering av injiserbare oppløsninger.

Nukleinsyredosene (sekvens eller vektor) som benyttes for administreringen kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametere og særlig som funksjon av den benyttede administreringsvei, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlingsvarighet. Generelt blir, når det gjelder de rekombinante vimser ifølge oppfinnelsen, disse formulert og ministrert i form av doser på mellom IO2* og 10<14> pfu/ml og fortrinnsvis 10^ til lO1^ pfu/ml. Uttrykket pfu eller "plaque forming unit" tilsvarer infeksjonskraften for en virusoppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellulær kultur og, generelt etter 48 timer, å måle antallet infekterte celleområder. Bestemmelsesteknikkene for pfu-gren av en viral oppløsning er velkjent i litteraturen.

Foreliggende oppfinnelse angår likeledes enhver rekombinant celle omfattende en nukleinsyresekvens som definert ovenfor.

Sekvensene ifølge oppfinnelsen, eventuelt innarbeidet i vektorer, og de farmasøytiske preparater som inneholder dem, kan benyttes for behandling av tallrike patologien De kan således benyttes for overføring og ekspresjon av gener in vivo i enhver type vev. Behandlingen kan videre være styrt som funksjon av patologien som skal behandles (overføring på nivå med et spesielt vev kan særlig bestemmes av valget av vektor og ekspresjonen av valget av spesiell promoter). Sekvensene eller vektorene ifølge oppfinnelsen benyttes fortrinnsvis for produksjon i mennesker eller dyr, in vivo og på intracellulær måte, av proteiner som er i stand til å virke spesifikt på forskjellige cellulære funksjoner som den cellulære proliferering, metabolittsyntesen, proteinsyntesen, replikasjonen og/eller DNA-transkripsjonen og så videre. Oppfinnelsen tillater videre på spesifikk måte, lokalt og effektivt, å behandle tallrike cellulære dysfunksjoner med opprinnelse i eller som et resultat av forskjellige patologier, og særlig cancere, virale eller bakterielle sykdommer eller generelt, enhver patologi der en cellulær mediator kan identifiseres.

I en spesielt fordelaktig utførelsesform omfatter nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen gener som koder for PIL som er i stand til å interagere og å interferere med aktiviteten til faktorer som er implikert i den cellulære proliferering. Den cellulære proliferering avhenger av et antall faktorer som membranære reseptorer (protein G), onkogener, enzymer (kinaseproteiner, farnésyl-transferaser, fosfolipaser og så videre), nukleosider (ATP, AMP, GDP, GTP, og så videre), aktiveringsfaktorer [faktorer for utbytting av guanosiner (GRF, GAP, og så videre), transkripsjonene faktorer og så videre] og så videre. Den intracellulære ekspresjon av oppfinnelsens PIL som er i stand til å binde seg til og å nøytralisere slike faktorer tillater å kontrollere prosessen med cellulær proliferering. Dette er særlig interessant i de situasjoner der den cellulære proliferering unnslipper de naturlige reguleringsmekanismer, noe som for eksempel fører til opptreden av tumorer. Tallrike faktorer (produkter av onkogener og faktorer implikert i signaleringen av virkningen av disse produkter) er forbundet med disse fenomener ved deregulering av den cellulære proliferering. Således oppviser 90 % av pankreas adenocarcinomene et Ki-ras-onkogen som er mutert på det tolvte kodon (Almoguera et al., "Cell" 53 (1988) 549). På samme måte har nærværet av et mutert RAS-gen vært påvist i adenocarcinomer i kolon og tyroTd-cancere (50 %) eller i lungecarcinomet og myélolde leukemier (30 %, Bos, J.L. "Cancer Res." 49 (1989) 4682). Tallrike andre onkogener er i dag identifisert (mye, fos, jun, ras, myb, erb, etc), der de muterte former synes ansvarlig for en deregulering av den cellulære proliferering.

Ekspresjonen av PIL som er i stand til å binde seg til cellulære faktorer (fortrinnsvis i deres onkogeniske form) og således til å forsinke eller inhibere deres virkning, tilbyr muligheten for en ny tilnærming til terapi av cancere.

I en spesielt interessant utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse vektorer som inneholder nukleinsyresekvenser omfattende et gen som koder for et intracellulært antistoff som er i stand til å interagere med ekspresjonsproduktet av et onkogen eller med en faktor som intervenerer i signaliseringsveien for et onkogen.

Blant målonkogenene kan innenfor oppfinnelsens ramme nevnes onkogenene ras, fos, jun, mye, myb og erb.

Blant de faktorer som intervenerer i signaliseringsveien for et onkogen kan særlig nevnes de membrane reseptorer som kan oppsøkes på nivå for deres intracellulære områder [G-proteiner, kinaser (for eksempel tyrosin-kinase), fosforylaser, farnésyl-transferaser], nukleosidutbyttingsfaktorer (faktorene GAP, GRF og så videre), og så videre.

Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse vektorer, særlig av viral opprinnelse, som inneholder en nukleinsekvens som koder for et intracellulært antistoff rettet mot et onkogen eller en faktor som intervenerer i signaliseringsveien for et onkogen, bestående av et peptid som tilsvarer bindingssetet for det variable området av den lette kjede av et antistoff, via en peptid-linker forbundet med et peptid tilsvarende bindingssetet for det variable området av den tunge kjede av et antistoff.

Mer spesielt angår oppfinnelsen defekte, rekombinante vimser som uttrykker et intracellulært antistoff rettet mot en faktor for den ras-avhengige signaliseirngsvei.

Som vist i eksemplene tillater ekspresjonen av det intracellulære antistoff anti-P21 (ekspresjonsproduktet av genet ras), anti-GAP, eller anti-p53, å revertere den

transformante fenotype av en cancercelle.

Nukleinsekvensene ifølge oppfinnelsen kan også være sekvenser som koder for intracellulære antistoffer i stand til å interagere med den infeksiøse syklus for en patogen virus (HIV, papillom-virus og så videre).

Mer spesielt tillater, når det gjelder HIV-virus, de i dag disponible anti-virale midler eller i protokollene for de avanserte kliniske faser, ikke å blokkere viruset i sin multiplikering men så vidt å bremse sykdommens progresjon. En av hovedgrunnene for dette ligger i opptredenen av stammer som er resistente mot disse antivirale midler. Utviklingen av en effektiv vaksine støter likeledes på tallrike hindringer: den genetiske variabilitet for HIV tillater ikke å definere en stabil, antigenisk struktur som gir opphav til en humoral eller cellulær immunologisk respons mot de forskjellige eksisterende stammer. På samme måte som tilfellet er for anti-virale midler der viruset motstår et seleksjonstrykk på grunn av punktmutasjoner i de vaksinasjonsprøver som er gjennomført til i dag, synes HIV å unnslippe immunsystemet.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør en ny tilnærmelse for behandling av HIV-infeksjon som består i å blokkere viruset i dets replikasjonssyklus ved ekspresjon av PIL og særlig med cellulært antistoff. Foreliggende oppfinnelse tillater spesielt å bøte på problemet med genetisk variabilitet for viruset helt i motsetning til det som oppnås ved vaksinale og antivirale tilnærmelser. Når det gjelder klassisk vaksinasjon, har de påviste immunitære responser hovedsaklig funnet sted mot variable områder. I motsetning til dette tillater anvendelsen av intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen å velge en epitop som ikke bare er bevart men som likeledes er uomgjengelig for funksjonen til et viralt protein. Fortrinnsvis rettes det intracellulære antistoff mot en epitop med tilstrekkelig størrelse til å forhindre viruset fra resistens og tilpasning ved punktmutasjoner. Videre tillater den lille størrelse av genet som koder for de intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen på fordelaktig måte å sikte mot tallrike områder (av et enkelt eller flere proteiner) fra den samme genterapi-vektor.

De to prinsipale reguleringsproteiner for virus, tat og rev, er mål av høyeste betydning for gjennomføring av oppfinnelsen. Disse to proteiner er uomgjengelige for den virale replikering. Videre motvirker ekspresjon av antiretnings-mRNA eller ribozymer som sikter på tat- eller rev-mRNA, den virale replikering. Virkningsmekanismen for disse proteiner er relativt godt dokumentert: tat er en transaktiveirngsfaktor for transkripsjon, mens rev sikrer transisjonen mot de tidlige og sene faser av den replikative syklus. Disse to proteiner utøver sin aktivitet idet de fester seg til viral mRNA, og det peptidiske området som er nødvendig for denne fiksering, uomgjengelig for deres funksjon, er relativt godt avgrenset. Videre har det vært vist at overekspresjonen av deres fikseringssete til RNA (området TAR for tat og RRE for rev) inhiberer deres funksjon på den virale ekspresjon.

Under disse betingelser ligger et særlig fordelaktig formål med oppfinnelsen i anvendelsen av en DNA-sekvens som koder for et intracellulært antistoff rettet mot proteinene tat eller rev og i stand til å nøytralisere deres aktivitet. Fortrinnsvis blir slike antistoffer rettet mot det området av tat eller rev som er ansvarlig for deres fiksering til

RNA.

De intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen, rettet mot sine epitoper, kan fremstilles i henhold til den metodologi som er beskrevet i eksemplene. Særlig, hva angår antistoffet anti-tat, kan de oppnås ved genetisk modifisering fra det monoklonale antistoff T-B (12) (Hybridolab).

Et annet viktig målprotein ved replikeringen av HIV hvis funksjon lett kan inhiberes ved hjelp av et intracellulært antistoff er proteinet til nukleokapsidet NCP7. Således spiller dette protein en viktig rolle ved retrotranskripsjonen (tidlig fase), i integrasjonen og i en sen, men ikke desto mindre viktig fase: enkapsideringen. Denne multi-funksjonalitet forklares ved det faktum at den har en enzymatisk aktiv, strukturell rolle. Det er beskrevet som en hybridase som tillater kompleksdannelse av virale nukleinsyrer: RNA/DNA og DNA/DNA under retro-transkripsjonen samt RNA/RNA og RNA/tRNA-lys3 under enkapsideringen. NCP7 synes uomgjengelig for produksjon av infeksiøse viruser.

Den cytoplasmiske ekspresjon ved genetisk terapi med intracellulære antistoffer rettet mot NCP7 som inhiberer dets funksjon under dimeriseringen av viral RNA og ved enkapsideringen, utgjør en ytterligere spesiell utførelsesform av oppfinnelsen.

De intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen, rettet mot epitopene som nøytraliserer dette protein, kan fremstilles i henhold til den metodologi som er beskrevet i eksemplene.

Andre virale komponenter kan likeledes gjøres til gjenstand for genterapi, særlig: fikseringssetet til molekylet CD4 (eksempel: omhyllingsglykoproteinet (gp 120/41)), multimeriseirngsområdet for omhyllingen, spaltingssetet gpl20/gp41, proteasen, integrasen og helt generelt ethvert viralt protein. Disse områder er ikke generelt tilgjengelige når omhyllingen er i nativ form. Av denne grunn er meget lite immunogene og en tilsvarende vaksine er umulig. Foreliggende oppfinnelse tillater å sikte på disse virale komponenter og har således et helt overlegent, terapeutisk potensiale. Som antydet ovenfor tillater videre den lille størrelse for genene som koder for det anticellulære antistoff ifølge oppfinnelsen på fordelaktig måte samtidig, i en og samme vektor, å uttrykke flere intracellulære antistoffer rettet mot forskjellige områder av et eller flere mål.

Nukleinsekvensene ifølge oppfinnelsen kan likeledes være sekvenser som koder for PIL som er i stand til å interagere og interferere med aktiviteten til faktorer som er implikert i metabolittsyntesen, i proteinsyntesen eller også i replikeringen og/eller transkripsjonen av DNA.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en nukleinsyresekvens, omfattende et gen som koder for et intracellulært bindingsprotein (IBP) under kontroll av en promoter som er funksjonell i pattedyrceller, kjennetegnet ved at

a) denne IBP er et peptid omfattende minst et peptid tilsvarende bindingssetet for det lettkjedevariable området av et antistoff forbundet via en peptidlinker til et peptid tilsvarende bindingssetet for det tungkjedevariable området av et antistoff; b) denne IBP er et peptid rettet mot et onkogen eller med en faktor i signalveien til et onkogen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et defekt, rekombinant virus, kjennetegnet ved at den i sitt genom omfatter en nukleinsyresekvens tilsvarende et av kravene 1 til 8.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en vektor, særlig en viral vektor kjennetegnet ved at den omfatter minst to nukleinsyresekvenser ifølge krav 1, som koder for intracellulære bindingsproteiner rettet mot forskjellige epitoper av et eller flere antigener.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter minst en nukleinsyresekvens i henhold til et av kravene 1 til 8 eller et

rekombinant virus ifølge et av kravene 11 til 16.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av cancere.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av de følgende illustrerende eksempler.

Figurforklaring.

Figur 1: (A) Restriksjonskart for ScFv-ras. (B) Restriksjonskart for ScFv-Gap. (C) Nøytraliserende virkning av den transitoriske ekspresjon av et intracellulært antistoff ifølge oppfinnelsen på transformeringskraften til et onkogen ras eller Her2. Py = kontrollceller; ScFv = celler som er transektert av kun plasmidet psv2.ScFv.ras; VAL = celler som er transektert med vektoren som uttrykker onkogenisk HA-ras Val 12; VAL+ScFv = celler som er kotransektert av plasmidet psv2.ScFv.ras og Ha-ras Vall2; HER2 = celler som er transektert av vektoren som uttrykker det onkogeniske Her2; HER2+ScFv = celler som er kotransektert av plasmidet psv2.ScFv.rav og av Her2.

Generelle molekylærbiologiske teknikker.

De klassiske metoder som benyttes i molekylærbiologien som preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumkloridgrient, elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmenter ved elektroeluering, ekstrahering av proteiner i fenol eller fenol-kloroform, precipitering av DNA i saltmedium med metanol eller isopropanol, transformering i Escherichia coli, osv., er velkjente for fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al., (red.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plasmidene av typen pBR322, pUV og fagene fra serie M13 er av kommersiell opprinnelse (Bethesda Research Laboratories).

For ligering kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse ved elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, ekstrahering med fenol eller med fenol rkloroform, precipitering i etanol og deretter inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Oppfyllingen av 5'-ender kan gjennomføres med Klenow-fragmentet av polymerase I

DNA av E. coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Destrueringen av 3'-ender gjennomføres i nærvær av polymerase DNA av fagen T4 (Biolabs), anvendt i henhold til fabrikantens anbefalinger. Destrueringen av 5'-ender gjennomføres ved en behandling utført ved hjelp av nuklease Sl.

Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligodeoksynukleotider kan gjennomføres i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al., ["Nulceic Acids Res.", 13, (1985) 8749-8764] under anvendelse av det kit som er tilgjengelig fra Amersham.

Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene ved den teknikk som kalles PCR ["Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et a., "Science", 320 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. og Faloona F.A., "Meth. Enzym.", 155 (1987) 335-350] kan gjennomføres ved bruk av en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrikantens spesifikasjoner.

Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utviklet av Sanger et al. ["Proe. Nati. Ac. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467] under anvendelse av det kit som er tilgjengelig fra Amersham.

Eksempel 1: Kloning og ekspresjon av en DNA- sekvens som koder for et anti- ras

intracellulært antistoff.

Dette eksempel beskriver kloningen og ekspresjonen av en nukleinsyresekvens som koder for et intracellulært bindingsprotein som reproduserer egenskapene til det monoklonale antistoff Y13-259. Antistoffet Y13-259 er rettet mot Ras-proteinene (ref. ATCC CLR 1742) ("J. Virol., 43, 294-304,1982), og er et antistoff som virker nøytraliserende på funksjonen til de onkogeniske Ras-proteiner når de først er injisert i cellene [Smith et al., "Nature", (1986), 320, 540-543; Kung et al., "Exp. Cell. Res.",

(1986), 162, 363-371].

1.1 Fremstilling av DNA- sekvensen.

En DNA-sekvens som koder for et intracellulært antistoff (fragment ScFv) fremstilles i henhold til den teknikk som er beskrevet i US 4 946 778 A. Denne sekvens bringes deretter under kontroll av en funksjonell promoter i de mammalske celler.

Poly A RNA isoleres fra en hybridomcellekultur som skiller ut antistoffet Yl3-259 i henhold til den teknikk som er beskrevet av S.H. Chirguin et al. ["Biochemistry", 18, 5294 (1979)]. Disse RNA benyttes for en reverstranskripsjonsreaksjon ved hjelp av primere som er dannet av vilkårlige heksanukleotider. De oppnådde cDNAer tjener som matrise for to PCR-reaksjoner: den ene ment for forsterkning av det variable fragment av den tunge kjede (VH) av

Yl3-259 med primere som er spesifikke for VH-muriner,

den andre som tillater å oppnå fragmentet VL under anvendelse av en blanding av

10 primere avledet fra murinsekvenser.

På denne måte oppnås to fragmenter på 340 pb og 325 pb og disse settes så sammen ved hjelp av en linker som tillater korrekt posisjonering av cDNA av VH ved 5' til den til VL. Denne linker koder for 15 aminosyrer dannet av tre repetisjoner av delen (Gly^Ser [R. Orlandi et al., "Proe. Nati. Ac. Sei. USA", 86, 3833-3837 (1979)]. Sekvensen for det intracellulære antistoff er vist i SEQ ID nr. 1 (restene 28 til 270). Denne sekvens gir tilstrekkelige frihetsgrer for fusjonen VH-VL til å tillate deres sammenføyning i parallelloirentering og sikrer en korrekt affinitet for antigenet.

Den fusjonerte nukleinsyresekvens VH-linker-VL skytes deretter inn i et fagmid som tillater å uttrykke det intracellulære antistoff (fragment ScFv) på overflaten av en fag M13 (figur IA). Denne ekspresjon tillater lett identifisering og seleksjon av de intracellulære antistoffer som korrekt erkjenner antigenet.

1.2 Funksjonell evaluering av det modifisert, intracellulære antistoff. DNA-sekvensen som koder for det modifiserte, intracellulære antistoff anti-Ras (VH-linker-VL) isoleres fra fagmidet ved restriksjon, skytes inn i vektoren sv2 under kontroll av det tidlige promoterforsterker par av SV40 (Schweighoffer et al., "Science", 256, 825-827, 1992) for å teste dets kapasitet til å antagonisere virkningene av et onkogenisk Ras. Det således oppnådde plasmid kalles psv2.ScFv.ras. Den funksjonelle bedømmelse gjennomføres i henhold til diverse tester:

a) Transitorisk transfeksjon i mammifære celler.

For bedømmelse ved transitorisk transfeksjon i mammalske celler blir plasmidet

psv2.ScFv.ras kotransfektert i cellene NIH 3T3 i henhold til den protokoll som er beskrevet av Schweighoffer et al. ["Science", 256, 825-827, (1992)] med en vektor som tillater ekspresjon av et gen Ha-ras Vall2. Aktiveringstitstanden for den studerte signalvei registreres ved å måle den enzymatiske aktivitet som oppnås fra rap-portørgenet "kloramfenikol-acetyltransferase (CAT)", anbragt under kontroll av en

promoter inneholdende nukleotidiske elementer som svarer i "trans" på det likeledes kotransfekterte Ras (RRE): disse RRE-elementer består av en TK-forsterker hybridpromoter av polyom (Wasylyk et al., "EMBO", J. 7,2475,1988).

De oppnådde resultater er vist i figur 1C. Analysen av de oppnådde CAT-aktiviteter viser kapasiteten til det modifiserte, intracellulære antistoff, fremstilt fra antistoffet Yl3-259, til å antagonisere aktiviteten til onkogenisk Ras.

Plasmidet psv2.ScFv.ras som ble kotransfektert med et plasmid, tillater ekspresjon av et onkogen med evne til tyrosinkinase-aktivitet, onkogenet HER2 (human epidermal vekstfaktor, type II) blokkerer likeledes sin aktivitet på plasmid "CAT"-testen (figur 1).

b) Dannelse av områder av transformerte celler.

De cancerøse celler har egenskapen til å danne transformasjonsområder og særlig

fibroblastene NIH 3T3 som uttrykker et onkogenisk Ras (Barlat et al., "Oncogene"

(1993), B. 215-218).

Cellene NIH 3T3 dyrkes som under den foregående prøve i et Dulbecco modifisert Eagle-medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt kalveserum, ved 37°C, i en fuktig omgivelse inneholdende 5% CO2. Cellene kotransfekteres deretter med en onkogenisk Ras: Ha-ras Vall2, plasmidet psv2.ScFv.ras (jfr. a) ovenfor), og et overskudd på 10 ganger resistensgenet mot neomycin, ved en transfeksjonsteknikk mot kationiske lipider (Schweighoffer et al., "Science", 256, 825-827,1992). Den samme totale mengde DNA transfekteres for hver skål. 24 timer etter transfeksjon blir de transfekterte celler fra hver petri-skål på 100 mm, delt i et forhold på 1 til 10 og dyrket i det samme medium, men i nærvær av G418 (GIBCO/BRL) i en mengde av 0,4 mg pr. ml medium. Antallet transformasjonsområder som oppnås pr. fig transfektert DNA kan telles etter 14 dagers dyrking.

De oppnådde resultater er vist i tabellen. Resultatene utgjør et gjennomsnitt av fire uavhengige forsøk.

De oppnådde resultater viser klart at de intracellulære antistoffer anti-ras meget sterkt reduserer transformasjonskraften til et onkogenisk ras-gen.

I lys av de resultater som ble oppnådd under a) vil ekspresjonen av dette fragment ScFv av antistoffet Yl3-159 likeledes forhindre transformasjon av andre onkogener som HERI, HER2, noe som letter aktiveringen av de cellulære Ras-proteiner.

For fagmannen vil det, på basis av de resultater som er beskrevet her, være enkelt å reprodusere oppfinnelsen med nukleinsyresekvenser som koder for intracellulære antistoffer (som ScFv-fragmentene), rettet mot andre cellulære komponenter. Disse kan fremstilles enten ut fra kjente antistoffer rettet mot cellulære komponenter eller ved identifisering av et antigen som skal nøytraliseres, immunisering ved hjelp av dette antigen eller en foretrukket epitop av dette, og deretter fremstilling av intracellulært antistoff fra antistoffet, av dets mRNA, eller oppnådd hybridom. Andre komponenter som er implikert i prosessene for cellulær transformasjon kan også være mål. For eksempel kan andre DNA-sekvenser som koder for intracellulære anti-ras-bindingsanti-stoffer fremstilles i henhold til den samme metodologi fra hybridomene M38, M8, M70, M90 og M30 (ATCC HB 9158), der antistoffet rettes respektivt mot restene 1 til 23, 24 til 69, 90 til 106, 107 til 130 og 131 til 152 av Ha-Ras-proteinet. Som antydet ovenfor kan videre vektorer som samtidig bærer flere sekvenser som koder for forskjellige intracellulære antistoffer med fordel fremstilles for å gi en høyere nøytraliserende virkning.

Eksempel 2: Kloning og ekspresjon av en DNA- sekvens som koder for et

intracellulært anti- GAP- antistoff.

Dette eksempel beskriver kloning og ekspresjon av en nukleinsyresekvens som koder for et intracellulært bindingsprotein som reproduserer egenskapene til et monoklonalt antistoff rettet mot proteinet GAP.

Proteinet GAP (for GTPase aktiveringsprotein) er implikert i den ras-avhengige signaliseringsvei. Det interagerer med rasproteinene på katalytisk måte og multipliserer med en faktor 100 til 200 hydrolysehastigheten for GTP målt in vitro for det normale p21-protein. Forskjellige arbeider har vist at det katalytiske området for dette protein på ca. 1044 aminosyrer befinner seg i det karboksydterminale området (restene 702-1044), og at dette området er ansvarlig for interaksjonene for proteinet GAP med ras-proteinene (jfr. WO/91/02749).

Det er nu vist at et monoklonalt antistoff rettet mot området kalt "SH3" av GAP-proteinet nøytraliserer funksjonene til de onkogeniske Ras-proteiner i egg av Xenopus (Duchesne et al., "Science", 259, 525-528,1993).

I henhold til den metodologi som er beskrevet under 1.1, er det mulig å syntetisere en DNA-sekvens som koder for et intracellulært antistoff (fragment ScFv) som tilsvarer dette antistoff (SEQ ID nr. 2, restene 11 til 250, figur IB). En slik sekvens, innarbeidet i en vektor, kan tillate å inhibere transformeirngskraften til onkogenisk ras-gen i tumorale celler.

Videre har foreliggende søkere også mer nøyaktig identifisert de epitoper som erkjennes av dette antistoff. Disse epitoper er deretter syntetisert kunstig og kan benyttes for å generere nye nøytraliserende antistoffer som kan tjene ved gjennomføring av oppfinnelsen.

a) Mer nøyaktig identifisering:

Oppfinnelsen er realisert ved den teknikk som kalles "epitop scanning". Denne teknikk

er basert på det prinsipp at et gitt antistoff kan reagere med peptider på 5 til 15 aminosyrer. Av denne grunn kan identifiseringen av sekvensielle epitoper oppnås ved å fremstille et komplett sett av "deknings"-peptider på 5 til 15 aminosyrer, som tilsvarer den komplette sekvens av det angjeldende antigen. Denne teknikk har vært benyttet for å bestemme funksjonelle epitoper i området "SH3" av GAP. For dette formål er

totaliteten av området undersøkt ved sekvensiell tildekning ved syntese av et decapeptid for hver annen aminosyre.

Syntese av dekningspeptider.

35 peptider som dekker hele fragmentet i figur 1 ble syntetisert kjemisk. Syntesen ble gjennomført i dobbel, på to uavhengige bærere, ved Fmoc/t-butyl-metoden på fast fase (kit fra Cambridge Research Biochemicals).

Påvisning av de funksjonelle epitoper.

De funksjonelle epitoper, erkjent av antistoffet Ac200, ble påvist ved en ELISA-test med et anti-mus-kanin-antistoff koblet til peroksydase. Det kromogene substrat for det benyttede enzym er amino-di-(3-etylbenzotiazodinsulfonat) (ABTS).

De oppnådde resultater viser at epitopene som ble erkjent av dette antistoffer de følgende:

-PVEDRRRVRAI

-EISF

-EDGWM

Disse epitoper kan av fagmannen benyttes ved de klassiske teknikker for å danne antistoffer som nøytraliserer virkningene av ras. Disse antistoffer, eller hybridomene de produserer, benyttes deretter for å danne nukleinsyresekvenser og vektorer ifølge oppfinnelsen i henhold til den tidligere beskrevne metodologi.

Eksempel 3: Fremstilling av en nukleinsyresekvens som koder for et anti- Ki- ras-intracellulært antistoff fra mRNA ekstrahert fra musemilt. immunisert med peptider avledet fra de hypervariable deler av Ki- Ras ( 2A og 2B).

Dette eksempel beskriver fremstillingen av nukleinsyresekvenser som koder for intracellulære antistoffer (som fragmentene ScFv) ifølge oppfinnelsen ved identifisering av et antigen som skal nøytraliseres, immunisering ved hjelp av dette antigen eller en foretrukket epitop derav, deretter fremstilling av nukleinsyresekvensen fra antistoffet, dets mRNA eller det oppnådde hybridom.

Dette eksempel viser muligheten for å anvende foreliggende oppfinnelse på ethvert, ønsket antigen eller epitop, selv når et monoklonalt antistoff rettet mot antigenet eller epitopen, ikke er til disposisjon.

Mål-antigenet i dette eksempel er proteinet Ki-ras. Mer nøyaktig er antigenene som benyttes for immunisering peptider på 25 og 24 aminosyrer tilsvarende de terminale ekstremiteter av proteinene Ki-Ras 2A og 2B som følger:

- Peptid 2A: QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM

- Peptid 2B: KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM

Etter immunisering av mus med disse peptider i henhold til klassiske immunologiteknikker blir miltene ekstrahert og cDNA preparert fra mRNA. Disse cDNA som koder for de variable områder blir deretter klonet, noe som fører til konsti-tueringen av en fagbank som uttrykker de tilsvarende ScFv til totaliteten av repertoaret av de benyttede mus. De intracellulære antistoffer (ScFv-fragmenter) som erkjenner peptidene 2A og 2B blir deretter identifisert og isolert ved suksessive seleksjonstrinn ved affinitet på kolonne og på mikrotitreirngsplater.

Disse ScFv blir deretter prøvet funksjonelt i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 1.

Den strategi som er utviklet i dette eksempel tillater på fordelaktig måte å seleksjonere spesifikke intracellulære antistoffer mot onkogene Ki-Ras som ikke påvirker de andre Ras-protoonkogener. Selektiviteten for slike verktøy er således ikke kun cellulær (på grunn av koblingen av transduksjonsveiene i cellene som er transformert av Ras), men også molekylær.

Eksempel 4: Fremstilling av en nukleinsyresekvens som koder for et mutert,

intracellulært anti- p53- antistoff.

Dette eksempel beskriver fremstillingen av nukleinsyresekvenser som koder for intracellulære antistoffer (som fragmentene ScFv) rettet mot muterte p53-proteiner. Disse intracellulære antistoffer oppnås fra forskjellige monoklonale antistoffer rettet mot de nevnte muterte p53-proteiner.

Genet som koder for protein p53 endrer i et stort antall tumorale celler (Caron de Fromentel og Soussi, "Genes", 4, 1-15,1992). Det muterte protein p53 har ikke den samme konformasjon som det ville p53 (Lane og Benchimol, "Genes Dev.", 4,1-8, 1990). Konformasjonsendringen kan detekteres ved hjelp av de monoklonale antistoffer (Milner og Cook, "Virology", 154, 21-30, 1986; Milner, "Nature", 310, 143-145, 1984).

Antistoffene pAB 240 erkjenner de muterte former av proteinene p53.

Den intracellulære ekspresjon av ScFv-fragmentet av antistoffer som er spesifikke for mutert p53 eller proteiner som spesifikt interagerer med muterte p53-proteiner kan indusere en fordelaktig virkning på tumorer som oppviser en mutert p53.

Eksempel 5: Kloning og ekspresjon av en DNA- sekvens som koder for et

intracellulært papillom- anti- virus- antistoff.

Dette eksempel beskriver kloning og ekspresjon av en DNA-sekvens som koder for et intracellulært antistoff (fragment ScFv) rettet mot et protein av virus av humanpapillom

(HPV).

Det virale målprotein er proteinet E6. Dette protein produseres av HPV-virusene 16 og 18 som er ansvarlige for 90% av cervix-cancer hos kvinner og som er identifisert i de pre-cancerøse epiteliale lesjoner (Riou et al., "Lancet", 335 (1990) 117). Produktet av genet E6 fører til dannelsen av tumorer ved sterkt å redusere mengden vill p53, et anti-onkogen, i de HPV-positive celler (Wrede et al., "Mol. Carcinog.", 4 (1991) 171). 1 andre tumorer blir p53 inhibert ved forskjellige mekanismer, mutasjon (jfr. eksempel 4) eller assosiasjon med proteiner som MDM2.

Sekvensen til proteinet E6 er beskrevet i litteraturen (Hawley-Nelson et al., "EMBO J.", 8 (1989) 3905; Mtinger et al., "J. Virol.", 63 (1989) 4417). De spesielle områder for dette protein kan identifiseres ved epitop-scanning (jfr. eksempel 2) og deretter benyttes for å immunisere mus i henhold til den protokoll som er beskrevet i eksempel 3. DNA-sekvensen som koder for de intracellulære antistoffer (fragment ScFv) rettet mot proteinet E6 av humanpapillomvirus (HPV) fremstilles deretter i henhold til den ovenfor beskrevne metodologi. Funksjonaliteten for denne sekvens vises etter ekspresjon in vivo ved å måle:

økning av mengden av vill p53 i cellene som uttrykker E6,

morfologisk reversjon av celler som er transformert med HPV,

blokkering av virkningene av E6 på transaktiveiingen av p53, og inhibering av transformeringen på grunn av E6 av humane keratinocytter og fibroblaster.

Eksempel 6: Fremstilling av en nukleins<y>resekvens som koder for et intracellulært anti- HIV- antistoff fra mRNA ekstrahert fra musemilt som er immunisert med peptider avledet fra aktive områder av proteinene tat, rev og NCP7.

Dette eksempel beskriver fremstillingen av nukleinsyresekvenser som koder for intracellulære antistoffer ifølge oppfinnelsen (som fragmentene ScFv) ved identifisering av et antigen som skal nøytraliseres, immunisering ved hjelp av dette antigen eller en foretrukket epitop derav, deretter fremstilling av nukleinsyresekvensen fra antistoffet, dets mRNA eller det oppnådde hybridom.

Dette eksempel viser videre muligheten for å anvende foreliggende oppfinnelse på ethvert, ønsket antigen eller epitop selv om intet monoklonalt antistoff som er rettet mot antigenet eller epitopen har vært beskrevet i den kjente teknikk.

Mål-antigenene i dette eksempel er proteinene tat, rev og NCP7 av HIV-virusen. Mer spesielt er antigenene som benyttes for immunisering de følgende peptider på 6, 9 og 16 aminosyrer tilsvarende områdene for disse proteiner som er ansvarlige for deres interaksjon med mRNA'ene (for tat og rev) eller dimeriseringen av RNA (for NCP7):

- Peptid tat: RKKRRQRRR

- Peptid rev: RQARRNRRRRWRERQR

- Peptid NCP7: RAPRKK

Etter immunisering av mus med disse peptider i henhold til klassiske immunologiteknikker, blir miltene ekstrahert og cDNAene fremstilt fra mRNA'ene. cDNAene som koder for de variable områder blir deretter klonet, noe som fører tii opprettelsen av en bank av fager som uttrykker de tilsvarende ScFv for totaliteten av repertoaret av benyttede mus. De intracellulære antistoffer (fragmentene ScFv) som erkjenner peptidene tat, rev og NCP7 blir deretter identifisert og isolert i suksessive seleksjonstrinn ved kolonneaffinitet og på mikrotitreringsplater.

Disse ScFv prøves deretter funksjonelt på sin evne til å blokkere replikasjonssyklusen for HTV-virusen.

Claims (19)

1. Nukleinsyresekvens, omfattende et gen som koder for et intracellulært bindingsprotein (IBP) under kontroll av en promoter som er funksjonell i pattedyrceller, karakterisert ved at a) denne IBP er et peptid omfattende minst et peptid tilsvarende bindingssetet for det lettkjedevariable området av et antistoff forbundet via en peptidlinker til et peptid tilsvarende bindingssetet for det tungkjedevariable området av et antistoff; b) denne IBP er et peptid rettet mot et onkogen eller med en faktor i signalveien til et onkogen.

2. Nukleinsyresekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et peptid rettet mot ekspresjonsproduktet av et ras onkogen.

3. Nukleinsyresekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter hele eller en del av SEQ ID nr. 1.

4. Nukleinsyresekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et peptid rettet mot GAP proteinet.

5. Nukleinsyresekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter hele eller en del av sekvensen SEQ ID nr. 2.

6. Nukleinsyresekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et peptid rettet mot et p53 protein.

7. Nukleinsyresekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et peptid rettet mot et mutant p53 protein.

8. Nukleinsyresekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at promoteren som er funksjonell i pattedyrceller er valgt blant virale, cellulære eller kunstige promotere.

9. Nukleinsyresekvens ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at den er innarbeidet i en vektor.

10. Nukleinsyresekvens ifølge krav 9, karakterisert ved at den er innarbeidet i en viral vektor.

11. Defekt, rekombinant virus, karakterisert ved at den i sitt genom omfatter en nukleinsyresekvens tilsvarende et av kravene 1 til 8.

12. Defekt, rekombinant virus ifølge krav 11, karakterisert v e d at den er valgt blant retroviruser, adenovimser, adeno-assosierte vimser, vaksinevimser og HI V-vims.

13. Defekt, rekombinant vims, karakterisert ved at den i sitt genom inneholder en nukleinsyresekvens omfattende et gen som i det minste koder for et intracellulært antistoff rettet mot et onkogen eller mot en faktor i signalveien for et onkogen, og omfatter minst et peptid tilsvarende bindingssetet av det lettkjedevariable området av et antistoff forbundet via en peptidlinker til et peptid tilsvarende bindingssetet av det tungkjedevariable området av et antistoff.

14. Defekt, rekombinant vims ifølge krav 13, karakterisert ved at onkogenet er valgt blant mye-, myb-, ras-, fos-, jun-og erb-onkogener.

15. Defekt, rekombinant virus ifølge krav 13 eller 14, karakterisert ved at den er valgt blant retroviruser, adenovimser, adeno-assosierte vimser, vaksineviruser og HIV-vimser.

16. Vektor, særlig en viral vektor, karakterisert ved at den omfatter minst to nukleinsyresekvenser ifølge krav 1, som koder for intracellulære bindingsproteiner rettet mot forskjellige epitoper av ett eller flere antigener.

17. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter minst en nukleinsyresekvens i henhold til et av kravene 1 til 8 eller et rekombinant vims ifølge et av kravene 11 til 16.

18. Farmasøytisk preparat ifølge krav 17, karakterisert v e d at det omfatter minst en nukleinsyresekvens ifølge et av kravene 1 til 7 i form av liposomer eller i form av et kompleks med nukleærproteiner, lipider eller dekstran, eller i ikke-behandlet form.

19. Anvendelse av en nukleinsyresekvens ifølge krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av cancere.