UA46709C2 - Фрагмент нуклеїнової кислоти, рекомбінантний дефектний вірус, плазмідний вектор, фармацевтична композиція (варіанти) - Google Patents

Abstract

Винахід відноситься до нуклеїнових послідовностей, векторів, що їх містять, та фармацевтичним композиціям. Більш детально, цей винахід відноситься до нуклеїнових послідовностей, які містять в собі ген, що кодує внутрішньоклітинний зв'язуючий протеїн (PIL), і їх застосування в генній терапії, у разі потреби включеними у відповідні вектори експресії.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к нуклейиновьім последовательностям, содержащим их векторам, и их 2 терапевтическим применениям, особенно в генной терапии. Более конкретно, настоящее изобретение относится Кк нуклейновьім последовательностям, которье включают ген, кодирующий внутриклеточньй связьвающий протеин (РІЇ), и их применению в генной терапии, в случае необходимости включенньми в соответствующие векторьї зкспрессии.

Генная терапия состоит в исправленийи дефекта или аномальности (мутаций, аберрантная зкспрессия, и т.д.) путем введения генетической информации в клетку или пораженньій орган. Зта генетическая информация может бьіть введена либо ин витро в извлеченную из органа клетку, причем модифицированную клетку затем снова вводят в организм, либо непосредственно ин витро в соответствующую ткань. В зтом отношений различнье методь трансфекции и переноса генов описьваются в литературе (см. Коетег и Егпедтап,

Ешиг.9У.Віоспет. 208 (1992) 211). Вплоть до настоящего времени, предлагаемье в уровне техники способь 19 (подходьї) генной терапии состоят в переносе генов, кодирующих активнье полипептидь!, которне принимают участие в генетических заболеваниях (гормонь!і, факторь! роста и т.д.), антисмьісловьїх генов, или антигенньйх пептидов для реализации вакцин. Настоящее изобретение относится к новому способу (подходу) генной терапии, состоящему в переносе и зкспрессии в целевой клетке (или ткани) внутриклеточного пептида, способного взаймодействовать с составляющими клеток и таким образом интерферировать с клеточньми функциями. Настоящее изобретение прейимущественно базируется на демонстрирований того, что можно зкспрессировать ин виво модифицированньсе антитела, которье остаются во внутриклеточном пространстве и которье могут контролировать некоторье клеточнье функции. Мзобретение также базируется на демонстрирований того, что можно клонировать последовательности ДНК (дезоксирибонуклейновой кислоть!), кодирующие такие внутриклеточнье антитела в векторах, особенно вирусньїх, для применения в генной с терапии. Ге) использование антител в терапийи человека, вообще, позволяет вьіявлять и нейтрализовать циркулирующие и/или локализованнье биологические комплексьї на поверхности клеток, вьізьівая серию явлений, управляемьтмх иммунной системой, которая приводит к их устранению. Однако, во многих случаях, как раковніе заболевания или заболевания, вьізьіваемье, например, вирусами, зтот способ бесполезен, так как антиген, ответственньй за о дерегуляцию ожидаемьїх клеток, недоступен вводимьм антителам. В настоящем изобретении предлагается Га») новій, особенно предпочтительньй, терапевтический способ (подход) , состоящий в непрерьвном и внутриклеточном продуцирований антител или терапевтических агентов, связьивание которьїх с их зпитопом - уменьшает и/или аннулирует дерегуляцию. Ге)

Возможность зкспрессировать рекомбинантньм образом антитела уже описана в литературе. Так, в

Зо европейском патенте ЕР 99994 описьівается зкспрессия ин витро и очистка переменньїх участков тяжельх или М легких цепей антител. Точно также, в патенте США 4 946 778 описьюваеєтся зкспрессия ин витро последовательностей ДНК, кодирующих модифицированнье антитела, образованнье переменньіми участками тяжельх и легких цепей антител, связьіваемьх линкерами. Однако, описаннье в зтом патенте антитела « неактивньї и обьчно синтезируются в виде нерастворимьїх соединений (тел)-включений. Следовательно, З 70 антитела должнь бьть очищень, затем подвергнуть! химическим обработкам (денатурация, ренатурация и т.д.) с для восстановления активности. В настоящем изобретении демонстрируется возможность использования таких з» последовательностей ДНК для зкспрессии прямо ин виво активньїх внутриклеточньїх антител. Таким образом, в настоящем изобретений демонстрируется возможность использования таких последовательностей ДНК, кодирующих внутриклеточнье антитела, под контролем участков, позволяющих осуществлять их зкспрессию в клетках млекопитающих, для генной терапии, особенно в случае человека. Зтот новьій способ, следовательно, е позволяет подходить Кк составляющим клеток, недоступньмм при помощи классических методов вакцинации.

Ге»! Более того, зтот способ не заключает в себе проявление иммунного ответа, а воздействует внутриклеточно.

Первьій предмет изобретения, следовательно, заключаєтся в последовательности нуклеиновьх кислот, 7 включающей ген, которьій кодирует внутриклеточньій связьвающий протеин (РІЇ) под контролем участков, о 20 позволяющих осуществлять его зкспрессию в клетках млекопитающих.

Изобретение также относится к векторам, содержащим последовательность нуклеиновьїх кислот, такую, как с описанная вьіше. Преимущественно, векторьї изобретения вирусного происхождения, такие, как ретровирусь, аденовирусьї, аденоассоциированньсе вирусь, вирусь! герпеса, вирусь! осповакцинь, вирусь! герпеса человека и т.д. 25 Изобретение относится также к применению зтих последовательностей нуклеийновьх кислот или зтих

ГФ) векторов для приготовления фармацевтических композиций, предназначенньїх для хирургического и/или терапевтического лечения организма человека или животного. Оно также относится к любой фармацевтической о композиции, включающей вектор, особенно вирусньій вектор, или к последовательности нуклеиновьх кислот, таких, как указаннье вьіше. 60 В смьісле настоящего изобретения, термин "внутриклеточньій связьівающий протеин" (РІЇ) обозначает любой протейн или Фрагмент протеина, способньй распознавать составляющую клетки, в которой он зкспрессирован, и взаймодействовать с ней селективньм и родственньм образом. Речь может идти о химических ковалентньїх или нековалентньїх взаймодействиях. Взаймодействие с клеточной составляющей (протейиньї, липидьії, аминокислотьї, ИРНК, тРНК, рРНК, ДНК и т.д.) позволяет воздействовать на клеточную бо функцию, в которой содержится вьшеуказанная составляющая, и таким образом контролировать

(стимулировать, ингибировать, замедлять) зту функцию.

Предпочтительно, РІЇ согласно изобретению образованьі молекулами, пройисходящими от антител или обладающими -связьівающими свойствами, сравнимьми с таковьми антител. В особенности, речь идет о Ппротеинах, обладающих селективностью и сродством, достаточньми для возможности протекания взаймодействия ин виво, оказьвающим нейтрализующее воздействие на антиген. Зти молекуль в нижеследующем тексте обозначаются как внутриклеточнье антитела, в соответствии с их свойствами и их локализацией.

Антитела, молекульй надсемейства иммуноглобулинов, синтезируются естественно (главньм образом 7/0 лимфоцитами В) в форме секретированньх (вьіделенньх) протеинов. Они, следовательно, вьісвобождаются во внеклеточньїх пространствах (кровеносная система), где они проявляют свою активность (распознавание и связьвание не самих антигенов). В настоящее время показано, что можно зкспресдировать ин виво модифицированнье геньії, кодирующие внутриклеточнье антитела, не затрагивая свойства специфичности и сродства антител. Последовательности нуклеийновьїх кислот согласно изобретению, которье кодируют /5 Внутриклеточнье антитела, следовательно, включают ген антитела, модифицированньій таким образом, что антитело не секретируется. В особенности, ген антитела оббічно модифицируют путем делеции или мутации последовательностей, ответственньїх за его секрецию. РіЇ согласно изобретению особенно могут бьть образовань! фрагментами антител, и, например, фрагментами Раб или К(аб)2, которне содержат домень! связи антигена. Мспользование зтого типа внутриклеточного антитела, однако, заключаєт зкспрессию го последовательности нуклеиновьхх кислот, включающей несколько генов, кодирующих, соответственно, тяжелье и легкие участки зтих фрагментов, и также заключает то, что зти цепи точно соединяются ин виво. На зтом оснований, особенно предпочтительная форма внутриклеточньїх антител, используемьїх в рамках изобретения, образована пептидом, соответствующим сайту связьвания переменного участка легкой Ццепи антитела, связанньїм за счет пептидного линкера с пептидом, соответствующим сайту связьівания вариабельного участка с ге тяжелой цепи антитела. МИспользование зтого типа внутриклеточного антитела, обозначаємого ЗсегУ, представляет интерес, так как зти антитела зкспрессируются единственньм геном. Конструкция і) последовательностей нуклеийновьїх кислот, кодирующих такие, модифицированнье согласно изобретению антитела, иллюстрируется в примерах.

Кроме того, последовательности нуклеийновьїх кислот, кодирующие внутриклеточнье антитела согласно ду зо Мзобретению, также могут бить модифицированьї химическим путем, ферментативнь/м путем или генньїм путем, с целью генерирования внутриклеточньїх стабилизированньх антител и/или внутриклеточньх о многофункциональньїх антител, и/или уменьшенного размера, и/или для того, чтобь! благоприятствовать их ї- локализации в таком внутриклеточном пространстве. Так, последовательности нуклеиновьїх кислот изобретения могут включать последовательности, кодирующие пептидь! ядерной локализации /МІ 5). В особенности, можно ісе)

Зз5 подвергать слиянию последовательности изобретения с последовательностью, кодирующей МІ 5 вируса ЗМ40, «Е пептидная последовательность которого следующая: МРКККНЕК (Каїдегоп и др., СеїІ. 39 (1984) 499).

Как указано вьіше, последовательности нуклеийновьх кислот согласно изобретению включают последовательности, позволяющие осуществлять зкспрессию гена или генов, кодирующих РіЇ, в клетках млекопитающих. Обьічно, геньі РІЇ, следовательно, находятся под контролем промоторньїх участков « транскрипции и трансляции, функциональньйхх в клетке млекопитающего, в которой достигнута зкспрессия. Речь 7-2) с может идти о гомологичньЬїх по отношению ок вьшеуказанной клетке последовательностях, т.е. о последовательностях, естественно ответственньїх за зкспрессию генов в вьішеуказанной клетке. Речь также ;» может идти о последовательностях различного происхождения/ т.е. последовательностях, ответственньїх за зкспрессию протеийнов в других типах клеток; последовательностях, ответственньїх за зкспрессию антител в природньх условиях; вирусньїх последовательностях зкспрессии, например, присутствующих в векторе, в ї5» которьій включеньії последовательности согласно изобретению; или еще синтетических или полусинтетических последовательностях.

Ме. В случае применения для человека, в литературе описаньї многочисленнье функциональнье промоторь -І такие, как, например, вируснье промоторьі СММ, 5М40, ЕЇІа, МІ Р, І ТК и т.д. Клеточнье промоторье такие, как, например, промотор гена виллина, представляют интерес, так как позволяют осуществлять специфическую о тканевую зкспрессию (ограниченную в кишечнике в случае виллина).

Ге Кроме того, последовательности зкспрессии также могут бьіть модифицировань), например, для их адаптации к зкспрессии в особьй тип вектора или клетки, для уменьшения их размера, для повьішения активности их промотора транскрепции, для генерирования индуцируемьїх промоторов, улучшения их уровня регуляции, или еще для изменения природь их регуляции. Такие модификации можно осуществлять, например, путем мутагенеза ин витро, путем введения дополнительньїх злементов контроля или синтетических (Ф, последовательностей, или путем делеций или замещений оригинальньх злементов контроля. Особенно ка предпочтительньм может бьть использование специфических тканевьх промоторов, чтобьї осуществлять зкспрессию РІЇ. только в один тип ткани. 60 Кроме того, когда последовательность нуклеийновьїх кислот не содержит последовательности зкспрессии, то она может бьіть включена в вектор зкспрессии, ниже такой последовательности.

Для получения вектора согласно изобретению, во-первьїх, следует идентифицировать клеточную функцию, например, принимающую участие или ответственную за патологию, на которую хотят воздействовать. Затем, следует идентифицировать соответствующую клеточную составляющую, принимающую участие в зтой 65 функции, после чего нужно определить, какой подобньій РІЇ найболее адаптирован к зтой составляющей (антитела, производньсе и т.д.), в зависимости от его локализации, его роли, его природь и т.д. Вьібрав РІЇ,

соответствующая последовательность нуклеийновьїх кислот может бьіть получена методами молекулярной биологии (химический синтез, клонирование, ферментативная модификация и т.д.) и вставлена в соответствующий вектор согласно описанной в примерах методологии.

Другой предмет изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим по крайней мере одну последовательность нуклеиновьїх кислот или вектор, такие, как описанньсе вьіше.

Последовательности согласно изобретению могут бьіть использовань! такими, какие есть, например, после введения человеку или животному, для индуцирования внутриклеточной зкспрессии РІЇ. с целью затрагивания определенной клеточной функции. В особенности, они могут бьїть введень в форме "голой" ДНК согласно 70 способу, описанному в заявке ВОИЙС 90/11092. Их также можно вводить в закомплексованной форме, например, с ОСЕАЕ-декстраном (Радапо и др., ).Міго!.,! (1967), 891), с ядерньіми протеинами (Капеада и др., Зсіепсе, 243 (1989) 375), с липидами (РаІдпег и др. РМАБ 8 4 (1987) 7413), в форме ли-посом (Ргаїеу и др., У.ВіоЇ.Спет. 255 (1980) 10431) и т.д.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, нуклейиновье последовательности, такие, как /5 указаннье вьіше, включают в вектор. Применение таких векторов позволяет на деле благоприятствовать пенетрации в клетки, повьішать резистентность к ферментам и увеличивать стабильность и внутриклеточнье уровни зкспрессии. Векторь! согласно изобретению могут бьть как плазмидньіми, так и вирусньіми. Однако, предпочитают использовать вирусньй вектор.

В предпочтительном варианте реализации, следовательно, изобретение относится к последовательностям 2ор Нуклейновьх кислот, таким, как указаннье вьіше, включенньм в вирусньй вектор. Изобретение также относится к любому рекомбинантному вирусу, включающему, встроенную в его геном, по крайней мере одну последовательность нуклеийновьїх кислот, кодирующую РІЇ.

Как указано вьше, различнье вирусьі могут бьїть использованьій в качестве векторов для переноса и зкспрессии ин витрогенов согласно изобретению. В качестве примера можно назвать ретровирусьі (К5М, НМ5, сч

ММЗ и т.д.), вирус герпеса человека, аденоассоциированньєе вирусь, аденовирусь, вирус осповакцинь! и т.д.

Предпочтительно, рекомбинантньм вирусом согласно изобретению является дефектньй вирус. Термин і) "дефектньйй вирус" обозначает вирус, неспособньій реплицироваться в целевой клетке.

Обьічно, геном дефектньїх вирусов, используемьїх в рамках настоящего изобретения, следовательно, лишен по крайней мере последовательностей, необходимьїх для репликации вьішеуказанного вируса в зараженной б зо клетке. Зти участки могут бьіть либо удалень! (полностью или частично), либо сделаньї нефункциональньми, либо замененьі! другими последовательностями и особенно нуклейновь!ми последовательностями изобретения. о

Предпочтительно, дефектньій вирус тем не менее сохраняет последовательности своего генома, которье ї- необходимь! для инкапсуляции вирусньх частиц.

Дефектнье рекомбинантнье вирусьі!, производнье ретровирусов, аденоассоциированньїх вирусов, вируса ісе)

Зз5 Человеческого герпеса и аденовирусов, уже описань! в литературе (Коетег и Егіедтапп, Еиг.).Віоспет. 208 «Е (1992) 211? Борзоп и др., Мейгоп, 5 (1990) 353; Спіосса и др., Мем.Віої. 2 (1990) 739; Міуапо-Ннага и др.,

Мем Віої. 4 (1992) 238; ВОМС 91/18088; АКІї и др., Маїшге Сепейсв З (1993) 224; 5іганога-Регтісацдег и др., Нитап Сепе Тпегару, ІЙ (1990) 241; европейский патент ЕР 185 573; І емгего и др., Сепе, 101 (1991) 195; европейский патент ЕР 243204). «

Особенно предпочтительно использовать нуклеийновье последовательности изобретения в форме, в с включенной в рекомбинантньій дефектньїй аденовирус.

В действительности существуют различнье серотипьі аденовирусов, структура и свойства которьх ;» изменяются немного, но которне непатогеннь!ї для человека, и особенно иммунонеугнетенньїх субьектов. Кроме того, зти вирусь! не интегрируются в геном клеток, которне они инфицируют, и могут включать значительнье Фрагменть! зкзогенной ДНК. Из различньїх серотипов предпочитают использовать, в рамках г настоя-щего їх изобретения", аденовирусьі типа 2 или 5 (Ай 2 или Ай 5). В случае аденовирусов Ад5, необходимье для репликации последовательности представляют собой участки ЕТА и Е18В.

Ме. Кроме того, незначительньій размер генов, коюдирующих внутриклеточнье антитела согласно изобретению, -І позволяет предпочтительньмм образом включать одновременно, в один и тот же вектор, несколько генов, Кодирующих внутриклеточнье антитела, направленнье против различньх участков одной или нескольких о клеточньїх целевьїх составляющих. Особьій вариант реализации изобретения, следовательно, состоит в

Ге векторе, особенно вирусном, включающем по крайней мере две последовательности нуклеиновьх кислот, кодирующих внутриклеточнье связьивающие протеиньї, направленнье против различньїх зпитопов.

Дефектнье рекомбинантнье вирусьй согласно изобретению могут бьть полученьі путем гомологичной ов рекомбинации между дефектньм вирусом и плазмидой, несущей, между прочим, последовательность нуклеиновьїх кислот, такую, как указанная вьіше (І емгего и др., Сепе, 101 (1991) 195; сгапат., ЕМВО У). З (12)

Ф) (1984) 2917). Гомологичная рекомбинация производится после котрансфекции вьішеуказанньми вирусом и ка плазмидой соответствующей линии клеток. Используемая линия клеток предпочтительно должна бьїть (І) трансформируемая вьішеуказанньми злементами и (Ії) содержать последовательности, способньіе дополнять бо часть генома дефектного вируса, предпочтительно в интегрированной форме, для того, чтобь! избежать опасностей рекомбинации. В качестве примера линии, используемой для получения дефектньх рекомбинантньїх аденовирусов, можно указать линию почки змбриона человека 293 (сгапат и др., уУ.Сеп.Мігої. 36 (1977) 59), которая содержит особенно, интегрированной в ее геном, левую часть генома аденовируса Аа (12965). В качестве примера линии, используемой для получения дефектньїх рекомбинантньїх ретровирусов, 65 Можно указать линию СКІР(Оапоз и Миїйїдап, РМАБ, 85 (1988) 6460).

Затем, вирусь, которне размножились, извлекают и очищают согласно классическим способам молекулярной биологии.

Настоящее изобретение, следовательно, также относится к фармацевтической композиции, включающей по крайней мере один дефектньїй рекомбинантньй вирус, такой, как указанньй вьіше.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут бьіть сформулировань для введения топически, орально, парентерально, через нос, внутривенно, внутримьішечно, подкожно, внутриглазньїм путем и т.д.

Предпочтительно, фармацевтические композиции содержат фармацевтически приемлемье зксципиенть! для вводимой путем иньекции формулировки. Речь может идти в особенности о солевьїх (мононатрийфосфат, динатрийфосфат, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция или хлорид магния и т.д., или смеси таких 7/0 солей), стерильньїх, изотонических растворах или о сухих композициях, особенно лиофилизированньмх, которье, путем добавления, в зависимости от случая, стерилизованной водь! или физиологической сьіворотки, позволяют получать растворь! для иньекций.

Используемье для введения дозьі нуклейновьїх кислот (последовательность или вектор) могут бьть адаптировань! в зависимости от различньїх параметров, и особенно в зависимости от используемого способа /5 введения, соответствующей патологии, зкспрессируемого гена, или еще от продолжительности искомого лечения. Обьічно, что касается рекомбинантньїх вирусов согласно изобретению, их формулируют и вводят в виде доз 107 -1017 ріцш/мл и предпочтительно 105 - 1019 ргц/мл. Термин "ри" ("бСляшкообразующая единица") соответствует инфекционной способности раствора вируса и определяется путем инфекции соответствующей культурьі клеток и измеряется, обьічно спустя 48 часов, числом бляшек инфицированньїх клеток. Способь определения титра рі вирусного раствора хорошо освещень в литературе.

Предметом изобретения также является любая рекомбинантная клетка, содержащая последовательность нуклеиновьїх кислот, такую, как определенная вьіше.

Последовательности согласно изобретению, в случае необходимости включенньсе в векторьі, и содержащие их фармацевтические композиции могут бьіть использованьі! для лечения многочисленньїх патологий. Так, они с Могут бьіть использованьі для переноса и зкспрессии генов ин виво в любой тип ткани. Течение, кроме того, может бьїть целенаправленньїм в зависимости от излечиваемой патологии (перенос на уровне индивидуальной і) ткани особенно может бьть определен вьібором вектора, а зкспрессия - вьібором особого промотора).

Последовательности или векторь! согласно изобретению предпочтительно используют для продуцирования у человека или животного, ин виво и внутриклеточно, протеинов, способньїх специфически воздействовать на дб) различньюе клеточнье функции, такие, как клеточная пролиферация, синтез метаболитов, синтез протеинов, репликация и/или транскрипция ДНК и т.д. Таким образом, настоящее изобретение позволяет специфически, о локально и зффективно лечить многочисленнье дисфункции клеток (естественного) происхождения или - возникающие в результате различньїх патологий, и в особенности раковье заболевания, вирусньюе или бактериальнье заболевания, или, вообще, любую патологию, в которой может бьіть идентифицирован о клеточньій медиатор. «І

Применение для лечения патологий, связанньїх с пролиферацией клеток

В особенно предпочтительном варианте реализации, последовательности нуклеийновьх кислот согласно изобретению включают геньї), кодирующие Рі!, способнье взаймодействовать и интерферировать с « активностью факторов, принимающих участие в пролиферации клеток. Пролиферация клеток возбуждается 70 множеством факторов, таких, как мембранньсе рецепторь (протеинь! - с б), онкогеньії, ферменть (протеиньї киназ/ фарнезилтрансфераз, фосфолипаз и т.д.), нуклеозидь (АТР, АМР, ц СОР, СТР и т.д.), факторьї активации (|факторьї обмена гуанозинов (ОКЕ, САР и т. д.), транскрипционнье "» факторь и т.д.) и т.д. Внутриклеточная зкспрессия РіЇ согласно изобретению, способньїх связьівать и нейтрализовать такие факторьії, позволяет контролировать процесс пролиферации клеток. Зто представляет мнтерес в особенности в той ситуации, где пролиферация клеток не поддается естественньмм механизмам «» регуляции, приводя, например, к появлению опухолей. Многочисленнье факторь (продукть! онкогенньїх генов и факторьї, принимающие участие в сигнализации зффекта зтих продуктов) на деле ассоциируются с зтими б явлениями дерегуляции пролиферации клеток. Так, 9095 аденокарцином поджелудочной железьі! содержат -І мутированньій онкоген Кі-газ на двенадцатом кодоне (АІтодицега и сотр., Сеїї, 53 (1988) 549). Точно также, наличие мутированного газ-гена обращаєт на себя внимание в аденокарциномах ободочной кишки и раковьсмх о заболеваниях щитовидной железьі (5096) или в карциномах легких и миелоидньїх лейкемиях (3090; Вов .І., (Че) Сапсег Кез., 49, (1989) 4682) . На сегодняшний день идентифицировань другие многочисленньсе онкогень (тус,

Тто5, |шп, газ, тур, его и т.д.), мутированнье формь! которьїх представляются ответственньми за дерегуляцию пролиферации клеток.

Зкспрессия РІЇ, способньїх связьівать зти клеточнье факторьі (предпочтительно их онкогенную форму) и, следовательно, замедлять или ингибировать их воздействия, дает возможность нового терапевтического о подхода к раковьім заболеваниям. ко В особенно представляющем интерес варианте, настоящее изобретение относится к векторам, содержащим последовательности нуклеийновьх кислот, включающих ген, которьій кодирует внутриклеточное антитело, бо способное взаймодействовать с продуктом зкспрессии онкогена или с фактором, принимющим участие в пути сигнализации онкогена.

Из целевьїх онкогенов в смьісле изобретения можно назвать онкогень! гав, То5, |Мп, тус, туб и егр.

Из факторов, принимающих участие в пути сигнализации онкогена, особенно можно назвать мембраннье рецепторь, которье могут бьіть вніявленьї на уровне их внутриклеточньїх доменов |протейнь! б, киназь (пример: 65 тирозинкиназа), фосфорилазьі, фарнезилтрансферазь!), факторьї обмена нуклеозидов (факторьї САР, ОКЕ и т.д) и т.д.

Преимущественно, настоящее изобретение относится к векторам, особенно вирусного происхождения, содержащим последовательность нуклеиновьїх кислот, коюодирующую внутриклеточнье антитела, направленнье против онкогена или фактора, принимающего участие в пути сигнализации онкогена, образованную пептидом, боответствующим сайту связьшвания вариабельного участка легкой цепи антитела, связанньм за счет пептидного линкера с пептидом, соответствующим сайту связьівания вариабельного участка тяжелой цепи антитела.

Преимущественно, изобретение относится к дефектньм рекомбинантньм вирусам, зкспрессирующим внутриклеточное антитело, направленное против фактора пути газ-зависимой сигнализации. 70 Как зто показьівают примерьї, зкспрессия внутриклеточньїх антител апіі-р21 (продукт, зкспрессии гав-гена), анти-САР или апіі-р53, позволяет ревертировать трансформирующий раковую клетку фенотип.

Применение для лечения вирусньїх патологий

Нуклеиновье последовательности согласно изобретению могут еще представлять собой последовательности, кодирующие внутриклеточнье антитела, способнье взаймодействовать с патогенньім /5 Вирусом (БИЧ, вирус папилломьі и т.д.) в инфекционном цикле.

Преимущественно, в случае вируса БИЧ, антивирусньсе агентьї, имеющиеся в распоряжений на сегодняшний день или вьідвигаемье на передний план в протоколах клинических испьітаний, не позволяют блокировать вирус в его размножений, но в меру задерживают прогрессирование заболевания. Один из основньїх доводов в зтом отношений заключается в появлении штаммов, резистентньїх к зтим антивирусньім агентам. Расширение 2о Ззффективной вакцинации также наталкивается на многочисленнье препятствия: генетическая изменяемость

ВИЧ не позволяет точно определять антигенную стабильную структуру для иммунологического, гуморального или целлюлярного, ответа против различньїх существующих штаммов.

Как в случае антивирусньїх агентов, где вирус резистен-тен к воздействию селекции за счет смещения точечньїх мутаций, в опьтах по вакцинации, проводимьїх до настоящего времени, ВИЧ, по-видимому, не с об поддаєтся иммунной (ітгацпіїаіге) системе.

Настоящее изобретение состоит в новом подходе к лечению инфекции ВИЧ, заключающемся в і) блокированиий вируса во время его репликативного цикла путем зкспрессии РІЇ, и особенно внутриклеточньйх антител. Настоящее изобретение в особенности позволяет избавиться от проблемь! генетической изменяемости вируса в противоположность антивирусньім и при использований вакцин способам. В случає б зо классической вакцинации, проявляющиеся иммунньюе ответьі в принципе возникают против изменяемьсх участков. Напротив, использование внутриклеточньїх антител согласно изобретению позволяет вьібрать зпитоп, о не только сохранившийся, но и также необходимьй, с функцией вирусного протеина. Предпочтительно, ї- внутриклеточное антитело направлено против зпитопа достаточного размера для препятствования резистентности и адаптируемости вируса за счет смещения точечньїх мутаций. Кроме того, незначительная ісе) з5 Величина кодирующего внутриклеточное антитело согласно изобретению гена позволяет предпочтительньм «г образом иметь несколько участков (одного или нескольких протейнов) из одного и того же вектора генной терапии.

Два основньїх протеина регуляции вируса, їаї и геу, представляют собой цели первой важности для осуществления настоящего изобретения. В самом деле, зти два протеина необходимь! для вирусной « 70 репликации. Более того, зкспрессия антисмьісловьїх информационньїх рибонуклеиновьх кислот или рибозимов 7-3) с (прогутевз), нацеленная на информационную РНК їаї или гем, противодействует вирусной репликации.

Механизм воздействия зтих протеинов относительно хорошо подтвержден документальньмми данньіми: "Чаї" ;» представляет собой фактор трансактивации транскрипции, тогда как "геу" обеспечиваєт транзицию (переход) между ранней и поздней фазами репликативного цикла. Зти два протеина подвергают испьмтанию на их активность путем фиксации на вирусньїх информационньх РНК, и относительно хорошо устанавливают ї5» предель! необходимого для зтой фиксации пептидного участка, необходимого для их функции. Кроме того, показано, что суперзкспрессия их места фиксации на РНК (участок ТАК для "аг и ККЕ для "геу") ингибирует их

Ме. функцию в вирусной зкспрессии. -І В зтих условиях, особенно предпочтительньй о вариант изобретения осостоит в использований 5р последовательности ДНК, кодирующей внутриклеточное антитело, направленное против протеинов "Чаї и "тем" о и способной нейтрализовать их активность. Предпочтительно, такие антитела направлень! против участка "Чаї"

Ге) или "теу", ответственного за их фиксацию на РНК.

Внутриклеточнье антитела согласно изобретению, направленнье против зтих зпитопов, могут бьть полученьі согласно описанной в примерах методологии. В особенности, что касается антитела апії-їаї, то оно дв Может бьїть получено путем генетической модификации из моноклонального антитела Т-В(12) (Нубгідоїаб).

Другой целевой протеин, важньій в репликаций БИЧ, функция которого легко может бьіть ингибирована (Ф, внутриклеточньім антителом, представляет собой протеин нуклеокапсида МСР7. В самом деле, зтот протеин ка играет важную роль в ретротранс-крипции (ранняя фаза), в интеграции и поздней, но тем не менее важной фазе: инксапсидации. Зта многофункциональность вьіражаєется в том, что он вьіполняет структурную, бо ферментатив-но активную роль. Он описьвается как гибридаза, которая позволяет осуществлять комплексацию вирусньїх нуклеийновьїх кислот: РНК/ДНК и ДНК/ДНК во время ретротранскрипции, также, как РНЮ/РНК и

РНК/Ьув3-тРНК на уровне инкапсидации. МСР7 является необходимь!м для продуцирования инфекционньх вирусов.

Цитоплазматическая зкспрессия путем генной терапии внутриклеточньїх антител, направленньїх против 65 МОСР7, ингибирующих его функцию в димеризации вирусньїх РНК и в инкапсидации, составляет другой особьй вариант осуществления изобретения.

Внутриклеточнье антитела, согласно изобретению, направленнье против нейтрализующих зпитопов зтого протейина, могут бьіть получень! согласно описанной в примерах методологии.

Другие вируснье составляющие также могут составлять обьект генной терапиий согласно изобретению, а именно: место фиксации молекуль! СО4 (пример: гликопротеин оболочки (др120/41), участок мультимеризации оболочки, место расщепления др120/ др41, протеаза, интеграза и вообще любой вирусньій протеин. Зти домень! обьічно недоступньї, когда оболочка находится в естественной (нативнои) форме. В связи с зтим, они очень мало иммуногенньї и инициирующая их вакцинация невозможна. Настоящее изобретение позволяет вьявить как цель зти вируснье составляющие, и таким образом обладает очень вьісоким терапевтическим /о потенциалом. Кроме того, как указано вьіше, небольшая величина генов, кодирующих внутриклеточное антитело, согласно изобретению, позволяет предпочтительньім образом зкспрессировать одновременно, в тот же самьй вектор, несколько внутри- , клеточньїх антител, направленньїх против различньїх участков одной или нескольких из зтих составляющих.

Нуклеиновье последовательности согласно изобретению также могут представлять собой /5 последовательности, кодирующие РІГ., которне способнь! взаймодействовать и интерферировать с активностью факторов, принимающих участие в синтезе метаболитов, в синтезе протеинов или еще в репликации и/или транскрипции ДНК.

Настоящее изобретение более полно описьівается с помощью нижеследующих примеров, которье нужно рассматривать как иллюстративньсе и не ограничивающие обьема охраньї изобретения.

Подписи под рисунками

Рис.1: (А) Карта рестрикции Зсгу-гав (В) Карта рестрикции ЗсЕу-Сар с (С) Нейтрализующее воздействие транзисторной зкспрессии внутриклеточного антитела изобретения на трансформирующую способность онкогена "тав' или "Нег2" Ге)

Ру - контрольнье клетки;

ЗСУ - трансфектированнье одной плазмидой реу2.5сЕм. гав клетки

МАГ. - клетки, трансфектированнье вектором зкспрессирующим онкогенньй гав, На-газ Ма/ 1 2;

МАГ. к сг - клетки, контрансфектированнье плазмидой рзм2. Зсгм.газ и На-газ Ма! 12; Ф 3о НЕК? - клетки, трансфектированнье зкспрессирующим онкогенньй Нег2 вектором; (ав)

НЕКЗ? - клетки, контрансфектированнье плазмидой рем2. зЗсгм.гав и Нега. їм

ЗсгУ . (Се)

Общие методьі молекулярной биологий

Зо Классически используемье в молекулярной биологии методь), такие, как препаративнье зкстракции « плазмидной ДНК, центрифугирование плазмидной ДНК по градиенту хлорида цезия, злектрофорез на агарозогелях или акриламидогелях, очистка фрагментов ДНК путем злектрозлюирования, зкстракция протеинов фенолом или смесью фенола с хлороформом, преципитация (осаждениєе) ДНК в солевой среде зтанолом или « изопропанолом, трансформация в ЕзспПегіспіа соїї и т.д., хорошо известньії специалисту и широко описань! в литературе |Мапіайв Т. и др., "МоіІесціаг Сіопіпд, а І арогаїгу Мапиа!", Сої4 Зргіпд Нагброг Іарогайогу, Соїд З с Зргіпд Нагброг, М.У., 1982; А!йзибеї Р.М. и др. (едв.) "Ситепі Ргоїосоїв іп МоІесшціаг Віоіоду", доїт УМПеу апа «»опв, "» Мем ХогкК, 1987. " Плазмидь типа рВК322, рус и фаги серии М13 имеются в продаже (Веїпезаа Кезеагсі І арогайгієв).

Для лигатур, фрагменть! ДНК могут бьіть разделеньі! по их величине путем злектрофореза в гелях агарозь или акриламида, прозкстрагированьї фенолом или смесью фенола с хлороформом, осаждень в зтаноле, затем ве инкубировань в присутствиий ДНК-ли-газьї фага ТА (Віоіарв), согласно рекомендациям поставщика.

Ф Заполнение вьіступающих 5-концов может бьіть осуществлено с помощью фрагмента Кленова

ДНК-полимеразь І! Е.соїї (Віоїарв) , согласно инструкциям изготовителя. Деструкцию вьіступающих 3'-концов і осуществляют в присутствий ДНК-полимеразьі фага Т4 (Віоіарв), используемой согласно рекомендациям о 20 изготовителя. Деструкцию вьіступающих 5'-концов осуществляют путем осторожной обработки с помощью нуклеазь 51.

Ме) Направленньй мутагенез ин витро с помощью синтетических олигодезоксинуклеотидов может бьть осуществлен по методу, разработанному Тауїог и др. (Мисієїс Асідз Кев., 13 (1985) 8749 - 8764), используя набор, вьіпускаемьій фирмой Атегепат.

Ферментативная амплификация фрагментов ДНК по так назьіваемому способу РОК |Роїутегазе - саіаІулеа

ГФ! Спаіп Кеасіюп (катализируемая полимеразой цепная реакция), Заїкі К.К. и др., Зсіепсе, 230 (1985) 1350 - 1354; Мийв К.В. и Раісопа Б.А., Меїфй.Еплут., 155 (1987) 335 - З350| может бьть осуществлена при о использований "концевой циклической ДНК" (Регкіп ЕІтег Сейв5) согласно указаниям изготовителя.

Проверка (контроль) нуклеотидньїх последовательностей может бьть оосуществлена по методу, 60 разработанному Заподег и др. ІРгос.Май.Асад.Зеї. ОБА, 7 4 (1977) 5463 - 5467), используя набор, вьіпускаємьй фирмой Атегепат.

Пример 1; Клонирование и зкспрессия последовательности ДНК, клонирующей внутриклеточное антитело апіі-газ

Зтот пример описьівает клонирование и зкспрессию последовательности нуклеиновьїх кислот, кодирующей бо внутриклеточньій связьвающий протеин, воспроизводящий свойства моноклонального антитела У13-259.

Антитело У13-259 направлено против протеинов Каз (АТСС СКІ 1742) (9О.Мігої. 43, 294 - 304, 1982) и представляет собой антитело, нейтрализующее функцию онкогенньїх протейинов Каз, сразу иньецируемое в клетки |(Зтійй и сотр., (1986), Майшге, 320, 540 - 543; Кипо и сотр., Ехр. СеїІ.Кез. (1986), 162, 363 - 3711. 1.1. Получение последовательности ДНК

ДНК-последовательность, коюодирующую внутриклеточное антитело (фрагмент ЗсЕм), получают по способу, описанному в патенте США 4 946 778. Зту последовательность затем, под контролем функционального промотора, вводят в клетки млекопитающих .

РНК-роту-А изолируют из культурьі клеток гибридомь!, которая вьіделяет антитело М13-259 согласно способу, описанному СпПігдціп 5.Н. и др. ІВіоспетівігу, 18, 5294 (1979)). Зти РНК используют для реакции 70 реверсия - транскрипция " с помощью праймеров, образованньїх случайньми гексануклеотидами. Полученнье

КДНК служат матрицей двух реакций РОК: - одна, предназначенная для амплификации переменного фрагмента тяжелой цепи (УН) У13-259 с помощью специфических праймеров мьішиньїх УН; - вторая, позволяющая получать фрагмент МІ, используя смесь 10 праймеров, производимьїх от мьІШИНЬХ 75 последовательностей .

Два фрагмента длиной 340 п.о. и 325 п.о. получают таким образом и затем обьединяют благодаря линкеру, которьій позволяет осуществлять точное расположение КДНК МН в виде 5' зтой МІ. Зтот линкер кодирует 15 аминокислот, образованньїх тремя повторениями звена (Сіу"Зег (Опіапайїй К. и др., Ргос.Маїй). Асайд.Зсі. ОА, 86, 3833 - 3837 (19793). Последовательность внутриклеточного антитела представлена на 5ЕО ІЮ Мо 1 (остатки 28 - 270). Зта последовательность придает достаточно степеней свободьії для слияния МН-МІ, чтобь! могло произойти их обьединение в параллельной ориентации и обеспечить корректное сродство для антигена.

Слитую последовательность нуклеийновьїх кислот МН-линкер-МІ затем вставляют в фагомиду (п рпадетіаде), которьій делает возможной зкспрессию внутриклеточного антитела (фрагмент ЗсЕм) на поверхность фага М13 (рис.ІА). Зта зкспрессия позволяет легко осуществлять идентификацию и селекцию внутриклеточньх Га антител, которне точно распознают антиген. 1.2. Функциональная оценка модифицированного внутриклеточного антитела і)

ДНК-последовательность, которая кодирует внутриклеточное модифицированное апіі-Каз антитело (МН-линкер-МІ) , вьіделяется из фагомидь! путем рестрикции, затем ее вставляют в вектор 5м2 под контролем знхансерной парьі раннего промотора 5М40 (ЗспмеідпоПйег и др., Зсіепсе, 256, 825 - 827, 1992) чтобьі Фу исследовать ее способность антагонизировать воздействия онкогенного Каз. Таким образом полученную плазмиду обозначают как резм2.5сЕм.газ. Функциональную оценку осуществляют согласно нескольким тестам: о а). Транзиторная трансфекция в клетки млекопитающих рч-

Для оценки путем транзиторной трансфекции в клетки млекопитающих, плазмиду рзм2.5сгЕм.гав котрансфектируют в клетки МІН ЗТЗ согласно протоколу, описанному Зспугеідпогег и др. ІЗсіепсе, 256, 825 - 827 о (1992)) с помощью вектора, которьій позволяєт осуществлять зкспрессию гена На-газ МаЇІ2. Состояние «Її активации пути изучаемой сигнализации регистрируют путем измерения ферментной активности, получаемой от гена-носителя "хлорамфеникол-ацетил-трансферазьі (САТ), находящегося под контролем промотора, содержащего нуклеотиднье злементь, отвечающие в виде "транс" воздействию Каз (ККЕ), также « котрансфектированнье: зти злементьї ККЕ образованьй гибридньм ТК-знхансерньм промотором полиомь (МазуукК и сотр., ЕМВО, ., | , 2475, 1988). - с Полученнье результатьі представлень на рис.1С. Анализ достигаемьх активностей САТ показьіваеєет ц способность модифицированного внутриклеточного антитела, полученного из антитела У13-259, "» антагонизировать активность онкогенного Казв.

Плазмида реу2.5сЕм.газ, котрансфектированная плазмидой, допускающей зкспрессию онкогена, наделенного активностью тирозинкиназьі, онкогена НЕК2 (человеческий зпидермальньй фактор роста типа І), «г» также блокирует его активность в тесте с плазмидой "САТ" (рис.1). б). Образование центров трансформированньх клеток б Концерогеннье (раковьіе) клетки обладают свойством образовьвать центрь! (очаги) трансформации и -І особенно фибробласть! МІН З3Т3, зкспрессирующие онкогенньій Каз (Вага! и сотр., Опсодепз (1993), В, 215 - 218). о Клетки МІН ЗТЗ культивируют, как в предьідущем тесте, в среде ОшШрессо, модифицированной Еадіє (ОМЕМ), (Че) содержащей 1095 змбриональной телячьей сьворотки, при 37"С при влажности окружающей средь, содержащей 595 СО». Зти клетки затем ко-трансфецируют с онкогенньім Кавг: На-газ Ма|І2, плазмида рем2.5сгУ. газ (см. п. а). вьіше), и 10-кратньм избьтком резистентного к неомицину гена, путем метода трансфекции

Ккатионньми липидами (Зспугеідпойег и сотр., Зсіепсе, 256, 825 - 827, 1992). Одинаковое полное количество ДНК трансфецируют в каждой чашке.

Ф, Спустя 24 часа после трансфекции, трансфецированньюе клетки, происходящие из каждой чашки Петри ко диаметром 100 мм, разделяют в соотношениий 1 - 10 и культивируют в той же самой среде, но в присутствий 5418 (СІВСО/ВКІ) в количестве 0.4 мг на мл средь. Число центров трансформации, полученное на мкг бо трансфецированной ДНК, подсчитьівают после 14 дней культивирования.

Полученнье результать! представленьі в нижеприводимой таблице. Они представляют собой среднее из четьірех независимьїх опьітов. енинтнттншннннншшшшЕ дв

Трансфецированнье плазмидь! Число центров на мкг трансфецированной ДНК й

Полученнье результать! ясно показьівают, что внутриклеточное апіі-газ антитело очень сильно уменьшает трансформирующую способность онкогенного гав-гена.

Кроме того, при рассмотрений полученньх в п. а). результатов, зкспрессия зтого фрагмента 5сЕм антитела

У13-І59 также должна противодействовать трансформации за счет других онкогенов, как НЕК1, НЕК2, облегчая /0 дктивацию клеточньіх протеинов Каз.

Разумеется, специалист, на оснований описанньїх в настоящей заявке результатов, может воспроизводить изобретение с последовательностями нуклеийновьїх кислот, коюодирующими внутриклеточньсе антитела (такие, как фрагментьі су), направленнье против других клеточньїх составляющих. Их можно получать либо из известньїх антител, направленньх против клеточньїх составляющих, либо путем идентификации нейтрализующего антигена, иммунизации посредством зтого антигена или его предпочтительного зпитопа, затем получения внутриклеточного антитела из полученньїх антитела, его МРНК или гибридомь!ї. Также могут бьть использованьь другие составляющие, принимающие участие в процессах трансформации клеток.

Например, другие последовательности ДНК, кодирующие внутриклеточнье антитела апіїі-газ связи, могут бьіть полученьї по той же самой методологии, из гибридом М38, М8, МОО и МЗО (АТСС НВ 9158), антитела которьх направлень, соответственно, против остатков 1-23, 24 - 69, 90- 106, 107 - 130 и 131 - 152 протеина На-газ.

Более того, как указано вьіше, векторьї, несущие одновременно несколько последовательностей, кодирующих различнье внутриклеточнье антитела, предпочтительно могут бьть полученьь для придания лучшей нейтрализующей активности.

Пример 2: Клонирование и зкспрессия последовательности ДНК, кодирующей внутриклеточное антитело сч апіі-САР

В зтом примере описьваєтся клонирование и зкспрессия последовательности нуклеиновьх кислот, (о) кодирующей внутриклеточньій связьівающий протеин, репродуцирующий свойства моноклонального антитела, направленного против протеина САР.

Протеин САР (активирующий СТРазе протеин) принимаєт участие в газ-зависимом пути сигнализации. Он Фу взаиймодействует с протеинами газ каталитически и с увеличенной в 100 - 200 раз скоростью гидролиза -СТ.Р, ,измеряемой ин витро для нормального протеина р21. В различньїх исследовательских работах показано, что (ав) каталитический домен зтого протеина примерно из 1044 аминокислот расположен на карбокси-концевом М участке (остатки 702 - 1044) и зтот участок является ответственньмм за взаймодействие протеина САР с протеинами газ (см. ВОМС 91/ 02749). В настоящее время показано, что моноклональное антитело, (Се) направленное против так назьшаемого "ЗНЗ" домена протеина САР, нейтрализует функции онкогенньйх 35 . « протеинов Кавз в зиготе Хепоре (Юиспезпе и сотр., Зсіепсе, 259, 525 - 528, 1993).

Согласно описанной.в п.1.1. методологии, можно синтезировать последовательность ДНК, кодирующую внутриклеточное антитело (фрагмент ЗсЕм), соответствующую зтому антителу (5ЕО ІЮ Мо 2, остатки 11 - 250, рис.18). Такая последовательность, включенная в вектор, может позволять ингибирование трансформирующей « 20 способности онкогенного газ-гена в опухолевьїх клетках. -в

Кроме того, заявитель также более точно идентифицировал распознаваемье зтим антителом зпитопь. Зти с зпитопь! затем бьли синтезированьй искусственно, и их можно использовать для генерирования новьїх :з» нейтрализующих антител, которне могут служить для осуществления изобретения. а). Более точная идентификация 45 Идентификацию реализуют по методу "идентификации антигенньїх детерминант секвенциального типа в ї» пределах белкового антигена". Зтот метод базируется на том принципе, что данное антитело может реагировать с пептидами из 5 - 15 аминокислот. В силу зтого, идентификация последовательньїх зпито-пов б» может бьіть получена путем приготовления полного набора регенерируемьїх пептидов, из 5 - 15 аминокислот, -1 соответствующих полной последовательности рассматриваемого антигена. Зтот метод используют для 5р определения функциональньх зпитопов домена "ЗНЗ" СЗАР. Для зтого, всю совокупность зтого домена («в исследуют путем последовательньїх (регенераций) восстановлений, путем синтеза декапептида из любьїх 2-- с аминокислот.

Синтез регенерируемьх пептидов пептидов, составляющих всю совокупность фрагмента рис.1, синтезируют химическим путем. Синтез вв Осуществляют по 2 раза, на 2-х независимьїх носителях, по методу Егаос/трет.-бутил на твердой фазе (набор

Сатргідде Кезеагсіп Віоспетіса!в8). (Ф) Вьіделение функциональньїх зпитопов г Функциональнье зпитопьі, распознаваемье антителом Ас200, обнаруживают путем ферментного иммуносорбентного анализа (тест ЕПІЗА) с помощью кроличьего анти-мьішиного (І Оріп апіїі-зошгіз) антитела, бо боединенного с пероксидазой. Хромогенньй субстрат используемого фермента представляет собой амино-ди-(3-зтилбензотиазодин-сульфонат) (АВТ).

Полученнье результатьі показьивают, что распознаваемье зтим оантителом зпитопьі следующие:

РМЕОРРЕРМРАЇ; ЕІЗЕ; ЕОСУУМ.

Зти зпитопь! могут бьіть использованьі! специалистом, согласно классическим способам, для генерирования дь антител, нейтрализующих воздействия газ. Зти антитела или гибридомьі, подуцирующие их, затем используют для генерирования последовательностей нуклеийновьх кислот и векторов изобретения, согласно вьішеописанной методологии.

Пример 3; Получение последовательности нуклеийновьїх кислот, кодирующей внутриклеточное антитело апіі-Кі--аз, из ИРНК, вьіделенньїх из селезенок мьішей, иммунизированньїх пептидами, проийсходящими из пиперпеременньх частей Кі-Каз (2А и 28)

В зтом опримере описьвается получение последовательностей нуклеиновьх кислот, кодирующих внутриклеточнье антитела (такие, как фрагментьь ЗсЕм) согласно изобретению путем идентификации нейтрализующего антигена, иммунизации посредством зтого антигена или его предпочтительного зпитопа, затем получения последовательности нуклеиновьїх кислот из полученньх антитела, его МРНК или гибридомь!. 70 Зтот пример демонстрирует возможность применения настоящего изобретения к любому антигену или желательному зпитопу, даже когда не располагают никаким моноклональньм антите- лом, направленньїм против вьішеуказанного антигена или зпитопа.

Используемь!м в зтом примере антигеном является протеин Кі-Каз. Более конкретно, используемь!ми для иммунизации антигенами являются пептидь из 25 и 24 аминокислот, соответствующие концам следующих /5 протеинов Кі-Каз 2А и 28: пептид 2А: ОУКІ ККІЗКЕЕКТРОСУКІККСІМ пептид 28: КУКЕКМЗКОСККККККЗКТКСІМ.

После иммунизации мьшей зтими пептидами, согласно классическим методам иммунологии, извлекают селезенки и кКДНК получают из мРНК, кДНК, кодирующие переменньєе участки, затем клонируют, что приводит к 2о составу банка фагов, зкспрессирующих ЗсЕм, соответствующие совокупности реестра используемьх мьшей.

Внутриклеточнье антитела І(фрагменть! ЗсЕм), распознающие пептидьй 2А и 2В, затем идентифицируют и вьіделяют путем последовательньх стадий селекции по сродству на колонке и на микротитрационном планшете.

Зти 5сЕм затем испьітьївают на функциональность согласно описанной в примере 1 методике. с

Мзложенная в зтом примере стратегия позволяет предпочтительньм образом селекционировать внутриклеточнье антитела, специфические к онкогенньм Кі-Каз, которье, следовательно, не затрагивают і) других протоонкогенньїх Каз. Селективность таких "инструментов", следовательно, не только клеточная (вследствие прерьшвания путей трансдукции в трансформированнье за счет Каз клетки), но и также молекулярная. б зо Пример 4: Получение последовательности нуклеийновьїх кислот, кодирующей внутриклеточное антитело, направленное против мутированньїх протеинов роізЗ . (анти-ро3-) о

В зтом опримере описьвается получение последовательностей нуклеиновьх кислот, кодирующих ї- внутриклеточнье антитела (такие, как фрагменть! ЗсЕму), направленньюе против мутированньїх протеинов роб.

Зти внутриклеточнье антитела получают из различньїх моноклональньїх антител, направленньїх против ісе) з5 Вьішеуказанньїхх, мутированньхх протеинов роз. «г

Кодирующий протеийн р53 ген изменен в очень большом числе опухолевьїх клеток (Сагоп де Еготепієвї! и

Зоизвзі, (епевз, 4, 1-15, 1992). Мутированньй протеин р53 не имеет такой же конформации, что и исходньй (дикий) р5З (Іапе и Вепспітої, Сепез Мем. , 4,1 - 8, 1990). Зто изменение конформации может бьть определено с помощью моноклональньїх антител (Мііпег и СооК, Мігоіоду, 154, 21 - ЗО, 1986; МіІпег, Маїиге, « 40...310, 143-145, 1984). в с Антитела рАВ240 распознают мутированнье формь! протеинов роз.

Внутриклеточная зкспрессия фрагмента 5сЕм специфических антител мутированного р53 или протеинов, ;» специфически взаймодействующих с озтими мутированньми протеинами ро53, должна индуцировать благоприятньій зффект в содержащих мутированньй роз опухолях. ї5» Пример 5: Клонирование и зкспрессия последовательности ДНК, кодирующей внутриклеточное антитело, направленное против вируса папилломь!

Ме. В зтом примере описьшвается клонирование и зкспрессия ДНК-последовательности, кодирующей -І внутриклеточное антитело (фрагмент ЗсЕм), направленное против вируса папилломь!ї человека (НРУ).

Используемьм вирусньім протеином является протеин Еб. Зтот протеин продуцируется вирусом НРМ16 и о вирусом НРМ18, которье ответственньі за 9095 раковьїх заболеваний головного мозга у женщин и

Ге) идентифицированьі в предканцерозньхх зпителиальньїх поражениях (Кіои и др., Гапсеї, 335 (1990) 117).

Продуцирование гена Еб приводит к образованию опухолей при сильном уменьшений количества дикого роз, анти-онкогена, в положительньхх клетках НРМ (УУгеде и др., МоїЇ.Сагсіпод. 4 (1991) 171). В случає других ов опухолей, роЗ ингибируется различньми механизмами: мутация (см. пример 4) или ассоциация с такими протеинами, как МОМ2.

Ф) Последовательность протеина Еб описана в литературе (Нам/-Іеу-Меіївоп и др. ЕМВО 4). 9 (1989) 3905; ка Ниподег и др., у). Міго!., 63 (1989) 4417). Особне участки зтого протеина могут бьіть идентифицировань! путем "идентификации антигенньїх детерминант секвенциального типа в пределах белкового антигена" 60 (см. пример 2), затем использованьї для иммунизации мьішей согласно методике, описанной в примере 3.

ДНК-последовательность, кодирующая внутриклеточное антитело (фрагмент ЗсЕм), направленное против протеина Еб вируса папилломь!й человека (НРМ), затем получают по вьшеописанной методологии.

Функциональность зтой последовательности доказьвается после зкспрессии ин виво путем измерения: - увеличения содержания дикого ро3 в зкспрессирующих Еб клетках; 65 - морфологической реверсии трансформированньх за счет НРМ клеток; - блокирования воздействий Еб на трансактивацию роз; и

- ингибирования трансформации с помощью Еб человеческих кератиноцитов и фибробластов.

ПРИМЕР б: Получение последовательности нуклеийновьїх кислот, коюодирующей внутриклеточное анти-ВИЧ антитело из мРНК, вьіделенньїх из селезенок мьішей, иммунизированньіїх с помощью пептидов, пройсходящих из активированньх участков протеинов їаї, гем и МСР7

В зтом опримере описьвается получение последовательностей нуклеиновьх кислот, кодирующих внутриклеточнье антитела согласно изобретению (таких, как фрагментьіь ЗсЕм) путем идентификации нейтрализующего антигена, иммунизации посредством зтого антигена или его предпочтительного зпитопа, затем получения последовательности нуклеиновьїх кислот из полученньх антитела, его МРНК или гибридомь!. 70 Зтот пример демонстрирует еще возможность применения настоящего изобретения к любому антигену или желательному зпитопу, даже когда никакое моноклональное антитело, направленное против вьішеуказанного антигена или зпитопа, не бьіло описано в уровне техники.

Используемьми (целевьми) антигенами в зтом примере являются протеийнь (аї, гем и МСР7 вируса БИЧ.

Более конкретно, используемьіми для иммунизации антигенами являются следующие пептидь из б, 9 к 16 /5 аминокислот, соответствующие участкам зтих протеинов, ответственньїм за их взайимодействие с мРНК (для іа! и геу) или димеризацию РНК (для МОР?) ; пептид Їа КККАККОККК пептид геу: КОАККМАККАККУУКЕКОК пептид

МСР7: КАРЕКК

После иммунизации мьшей с помощью зтих пептидов, согласно классическим методам иммунологий/ извлекают селезенки и из мРНК получают кКДНК. кКДНК, кодирующие переменньсе участки, затем клонируют, что го приводит ок осоставу банка фагов, зко-прессирующих ЗоГу, соответствующему совокупности реестра используемьїх мьішей. Внутриклеточнье антитела (фрагменть! 5сЕму), распознающие пептидь їаї, гем и МСР7, затем идентифицируют и вьіделяют путем последовательньїх стадий селекции по сродству на колонке или на микротитрационном планшете.

Зти ЗсЕм затем исследуют на функциональность по их способности блокировать репликативньй цикл вируса с

ВИЧ. о

Claims (1)

1. Формула винаходу (о) зо 1. Нуклеиновая кислота, включающая ген под контролем функционального промотора в клетках млекопитающих и кодирующая внутриклеточное антитело или фрагмент и/или производное такого антитела, о причем указанное антитело направлено против продукта зкспрессии онкогена газ, причем указанная їч- нуклеиновая кислота включает последовательность ЗЕО ІЮ Мо1 (Се) «

   - . и? щ» (о) -і («в) іЧе) іме) 60 б5

   1/1 31/11 ДЛ ікалдег- ЕСА АС АСА САС ОТСТ АТА АСА ААТ АСС ОТАТ ТСО АСО ОСА ССС ОСТ ОСА ТТОо ТТА ТТА сте зек аг агу діп зег о і1є агудр азп СПг о Сук зек Спг о а1їа аїа аїа дчіу 1ез 1еп 16 1єец 61/21 5: Мет - 91/312вт себ УСС САС Ссо бсс АТО остіСАС СТО ААА СТО САС САС ТСА ОСА ОСА СОС ТТА Сто САС аїа аїа діп рго аїіїй тес азїасдіп чаї 1уз 1і16езч 91п 91п 5ек 91у дчіу 91у 1сєч ма1ї 9іп 121/41 Щ 151/51 - І тя ССТ ОСА АССОТоС СТО ААА Сто тТоС ТСТ СТА СТО ТСТ оба ттс Аст тс вег|асп ТАТ ОСА рго 9іу аку зек 1ец 1у5 1єш зек суз уаї маї зек діу ре Св о ріпе зегіазп Сук д1іу 181761 211/71 Й АТО ААС|ТСС АТТ СОС САС АСТ о ССА Сб ААС о ССА СТО САб ТоС СТТ ССА ТАС АТТ АСТ АСТ теє авп|Скр і1е аку д1іп сг орго діу 1у5 у1іу іє біз сгроуаї аїа сук і1е зег зег 241781 шт. 271/91 ОСТ АбС АСТ ТАС Сто ТАС ТАТ ССА САЛА АС СТО ААС ССС СбА ТТС АСС АТС ТС АСА САС Чіу век зег сут 1іец сук сук аїа 91ч спгома! 1уз діу агу рпе СБг о і1е 5зег акд азр 301/101 ще 331/111 ААТ ОСС ААС о ААС о АСС О СТО ТАС СТО САА АТО АСС АСТ СТО АСС ТСТ САА САС о АСстТ осос тто азп аїа 1уз азп Бк о1еш суг 1іеч діп мес свбгозег о 1еч агуд зег ді азр сг оаїа 1еч 361/121 800 бот уу/131 ИН 5гу/х ТАТ ТАС ТСТ бСА АСА|САТ САС ССТ АС ССТ АСС САС ТТС ТТТ САТ шк ТСС ССС о сАА обо сут сук суз аїа агоа|піз дчіч діу ЄПг діу сБгоазр рпе рпе азр сугі сгр 91у 91п 91уУ 421/141 досьє 04517151 сімкет рег АСс сте Ас СТ ТоС ТСА ОСТ ССА СОС ССТ ТСА сбС сбА ост сосС ТстТ бос ост бос с СВпЕ ЇБЕг ма1ї сБгомуа1ї зег зекг Їлу чіУ чіу чіу зекх д91у 91у ч91у 91іу зек чіу 9іу чЧчіу о 481/161 Ху 511/171 ОСА то) Ас СТТ САС СТО АСС САС ТСТ ССА САТ ТСС Сто ТСТ ССА ТСТ СТО ОСА САА АСТ чіу векіазр маії дії 1єч сг сіп зек ркго із зек 1еч зек аїа зек |1еч дЧіу діч сиг 541/181 сої 571/191 я Ф СТО тес АТС САА тот йсе ССА АСТ САС СОС АТТ ТС ДАТ ТАТ ТТА сс (гос ТАТ САС САС о маї зехт і1е 910 суз Деу аїа зек діш діу і1е6 5зег азп сук 1еч аїа|скр суг д1іп сіп 601/201 631/211 -023- - в АМО ССА боб ААА Тест сстТ сьо Сто Сто АТС |т ТАТ ОСА АСТ АбС ТТо САб САТІіобо оте с 1уз рго діу 1ув вег рко діп 1еч 1єеш і1е|сує сук аїа зег век 1єч діп сьт| со уаї 6617221 691/231 - ССА ТСА соб ТТС АСтТ ССС АСТ ССА ТСТ СОС АСА САС ТтТ ТСТ СТ ААС АТС АС ААС АТО рго зек аку рпе хек діу зег дЧіу зек діу єЄпк 91п ріе зек Те 1уз і1є зек ахп тес 1721/241 751/251 со : « САА ССТ САА САТ САА бос СТТ ТАТ ТАС ТсТ|САА САС ОСТ ТАС ААС ТАТ сст Тос Асс| ТТ чіп рко чіч азр діц діу маї сук сук суз діп чіп аїа сук 1їуз буг ркго зек спсі! рпе З с 781/261 811/271х40с1 діт . ССА ОСТ СОС АСС АС СТО САА АТА АНА СоСІССо ССС ССА|САА САА ААА СТО АТС ТСА САА я іу аїа діу снк 1уз 1ец чЧчіч і1е 1у5 аго|аїа аіїіа ота» Чіп 1уз іеч і1е 5ег дій 841/281 «соКт иилиВничччччсттннтчччТчнннинни САС САТ СТО ДАТІ ТАА ТАА СдА ТТС СТ бос чї» чіч авр 1ечп азп|ОосСн ОСН діч рпе сг діу Ф или 5ЕО ІЮ Мо2 -І о (32)

   Ф) го 60 65

   1/1 баб іскдес Зб меж 31/11 5 ТТА ТТА СТО ОСС ссс САС дес ССС АТб бос йо СТО САА сто САС САС ТСА сСсА сстТ сосс 1ез Іеч 1їєч аїа аїа діп ркго аїа тес аїа Чіп хаї діп 1 9діп дії век д1у рго чіу 617;21 1/31 СТА боб САС ССС ОСА СаО АОС АТТ ТСС АТА АС ТоС АСА сто ТСТ ост ТТ ТСА ТТА Ат іем діу діп рхго аїа діп зек і31е 5ек і1еє Сніг суз спгомаї зег діу рбе зег 1єч 5ег 121/41 га . 151/51 ШИ хос ТАТ ССТ СТА САС гос СТІ СОС САС тТСтТ СсСА ОбА АС ОСТ Сто САС о Тосо сто СА сто 5ех сук діу уаі1 пів сгр маї агуд 9і1іп зех рго діу 1у5 діу 1ем дім сгр 1еч пух 181761 сь 2111 то. АТА тоб АСА ОСТ ОСА оС АСА САС ТАС ААТ ССА бос ТТ ща ТСС АСА СТО АОС АТС АСс іїє єгр акч Ччіу чіу чіу ЄПг азр Сук азп аїа аїа рпе тесізек агу 1і1єц 5ек і1є Сснг 241/81 2171791 19 КАС САС ААС ТСС АС АСС САА СтТТ ТТС ТТТ ОААА ТТ ААС АСТ СТО САА ССТ САТ САС СТ 1уз азр азп век 1уз зек діп ма1ї рібе ріе 1у5 1еч азп зек 1еч діп рго азр азр СЬг 301/101 и --3ММ1 сга3 ССС АТО ТАС ТАС ТСТ ОСС ДАЛА ЧАСо сстТ ССС ССО бо ТАТ ГТС САТ сте То СОС сСАА бос аїіїа тес сук сух суз аїа 1уз Ге чЧіу Ччіу рто Чіу сук рпе азр Му ких Ччіу чів д9діу

   20. 361/121 дре а 3917131 Авт АСС АСсо то сс СоТС ТОС ТСА ОСТ ОбА соС ОСТ ТСА СОС ббА ССстТ Гететоі ТСТ Асс состТ сос ЄВЕ Ек маї СЄйг о уаї 5ег зегідіу чіу чіу Ч1іу зек чіу 91іу Ччіу чіу зек зег 9іу сіу 421/141 ик-к Тад-ї 451/151 ОСА вецесь АТТ САС СТО АСС САС ТСТ ССА ССС ТоС СТА ТТ ОСА тот СТО ОСА сАА АсСтТ сч В81іу Бекразр і1е 915 1єеєм СВІ діп век рго аїа ет 1їец 5ег аїа зег маії діу діч сг (о) 481/161 са 511/171 СТО ДСС АТО ДСА тот ссА ССА АСТ САС ААТ АТТ ТАС АСТ ААТ ТТА ОСА ТС ТАТ САС САС маї сві тес сБг суб аку аїа зег діч аб5п і1е суг 5ег ап 1ем аа) Скр суг біп чіп. ду зо 541/181 571/191 сода. ни АДА САС СбА ДАС ТСТ о ССТ САС Сто сто СбТС ТАТіССТ ОСА АСА ААА ССА ССА ААТІіОоСТ сто | «в) 1уз аїп діу 1ї1уз зек ро діп ем 1ец уаї сук 81 аїа БЕ 1у5 рго чіу мовну чаї м 601/201 631/211 Рит ССА ТСА АСОо ТТ АсСтТ ОбС АСТ оСА ТСА бос АСА САА ТТТ о ТСТ СТО ДАб АТС ААС АОС СТО, (Се) рго зег агуд рпе зег діу 5егк діу зек Ччіу спр одіп рпе зег 1еч 1у5 і1е азп 5ек 1Теє"ч - 661/221 691/231 ОА й САС ССТ САА САТ СТТ бо ААС ТАТ ТАС ТСтТ не САТ ТТ ТАТ соб АСТ ССО ТАТ лосі тто 9іп о рго 913 азр Т1ем д91у азп бук сук суз Ш1еч Біз рбе сус діу сБг о рго Сук ако|рпе 721/241 4751/25140кт пІш Те) с « СбС соб оС АСС АДОо СТО ОАА АСО АВА ач 815 іх БСА Івта САД ААА СТО АТО ТСА САА -о с У1іу діу діу сбт 1у5 1езм 91 сбк о 1уз акд|аїа аїа аїа|діч діп 1у5 1ем і1їе зех іч 181/261 - ч яння - ДА а САС САТ СТО ААТІТАА ТАА САА ТТ АСстТ сс - чі азр 1еч зві осн осн чЧіч рве сне а1їу ї» 15 2. Нуклеиновая кислота по п. 1, отличающаяся тем, что предназначена для лечения раковьїх заболеваний.

   3. Нуклеиновая кислота по п. 1, отличающаяся тем, что функциональньй промотор в клетках Ге») млекопитающих вьібирают среди вирусньїх, целлюлярньхх или искусственньїх промоторов. -І 4. Нуклеиновая кислота по одному из пп. 1, 3, отличающаяся тем, что она включена в вектор.

   5. Нуклеиновая кислота по п. 4, отличающаяся тем, что она включена в вирусньй вектор. є ШИ 6. Рекомбинантньій дефектньій вирус, включающий в свой геном нуклейиновую кислоту по одному из пп. 1, (Зо) 35. - - -

   7. Рекомбинантньій дефектньій вирус по п. б, отличающийся тем, что его вьібирают среди ретровирусов, аденовирусов, адено-ассоциированньїх вирусов, вируса осповакцинь и вируса герпеса человека.

   8. Плазмидньй вектор, включающий по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по одному из пп. 1, 3-5.

   9. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по одному из пп. ГФ) 1, 3-5. т 10. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантньй вирус по одному из пп. 6 или 7.

   11. Фармацевтическая композиция, содержащая плазмидньй вектор по п. 8.

   12. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере одну 60 нуклеиновую кислоту по одному из пп. 1, 3-5 в форме липосомьї, комплекса с ядерньми протеинами, липидами или декстраном, или в неочищенной форме. б5