JP2000510708A - アデノウイルスの細胞レセプターとしてのポリペプチドの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の主題は、アデノウイルスの細胞レセプターおよび／またはコレセプターとして配列表１〜５に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの使用である。本発明は、このようなポリペプチドを発現することができる細胞の使用、並びにアデノウイルスの宿主細胞への付着および／または前記宿主細胞へのその侵入に影響を及ぼすことができるリガンドの使用にも関する。最後に、本発明は、その細胞レセプターへのウイルスの付着を決定するウイルスまたはウイルスタンパク質の部分に対する細胞レセプターの選択または同定法、並びに前記アデノウイルスに対する天然の細胞レセプター以外の表面タンパク質を表面に有する宿主細胞へアデノウイルスをターゲットとするための二官能性リガンドの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノウイルスの細胞レセプターとしてのポリペプチドの使用 本発明の主題は、クラスＩの主要組織適合複合体および／またはフィブロネク チンのタイプIIIモジュールの抗原の全部または一部を用いて、アデノウイルス が宿主細胞への付着および／または宿主細胞への侵入を許可しまたは促進するこ とである。本発明は、上記のポリペプチドのいずれかによって介在されるアデノ ウイルスの宿主細胞に対する感染性を調節することができるリガンドの使用にも 関する。最後に、本発明は、アデノウイルスの細胞レセプター、または特にウイ ルス性のこれらのリガンドを同定または選択するバイオパンニング法に関する。 アデノウイルスは、広汎な宿主スペクトルを有するＤＮＡウイルスである。そ れらは多くの動物種で検出されており、様々な細胞型に感染することができる。 ゲノム形成(genomic organization)および匹敵する感染サイクルを示す多数の血 清型が、各種で特定されている。一般に、アデノウイルスゲノムは、ウイルスタ ンパク質をコードする遺伝子と、その両末端での、複製に関与する２個の逆方向 末端反復配列（ＩＴＲと表示される）とキャプシド形成領域(encapsidation reg ion)を含む約３６ｋｂの二本鎖の線状ＤＮＡ分子からなっている。 アデノウイルスは、感染した細胞の核で複製する。感染サイクルは、２段階で 起きる。初期相は、複製の開始に先行し、ウイルスＤＮＡの複製および転写を制 御する初期タンパク質を産生することができる。これらの段階に後期相が続き、 ウイルス粒子を構成する構造タンパク質が合成される。新たなビリオンの集合は 、核で起こる。最初にウイルスタンパク質が集って二十面体構造を有する中空キ ャプシドを形成し、その中にアデノウイルスＤＮＡがキャプシド形成される。ウ イルス粒子が放出されて、他の任意の細胞に感染することができる。これに関し て、 キャプシドの表面に存在する線維およびペントン塩基が、ビリオンの細胞への付 着とそのインターナリゼーションに重要な役割を果たしている。 アデノウイルスは、三量体状線維とこれまで同定されていない細胞レセプター の仲介により任意の細胞に結合する。次に、この粒子が、細胞インテグリンαｖ β３およびαｖβ５へのペントン塩基の結合によるエンドサイトーシスによって インターナリゼーションされる(Belin and Boulanger，1993，J．Gen．Virol.， 74，1485-1497;Mathias et al.，1994，J．Virol.，68，6811-6814;Nemerow eta l.，1994，Trends Cell Biol，4，52-55;Wickham et al.，1993，Cell，73，309 -319;Wickman et al.，1994，J．Cell Biol.，127，257-264)。Ａｄ２線維は、 ５８０個のアミノ酸（ａａ）を含んでなり、その配列はHerisse et al.，1981， Nucleic Acid Res.，9，4023-4042に開示されている。Ａｄ５の線維は５８２個 のアミノ酸を有する(Chroboczek and Jocrot，1987，Virology，161，549-554) 。その分子量は６２ｋＤａであるが、天然の線維は１６０〜１８０ｋＤａの分子 のように行動するので、集合により三量体の形態となっていることを示している 。この線維は、３個のドメインを有している(Chroboczek et al.，1995，Curren t Top．Microbiol．Immunol．199，165-200)： （1）Ｎ末端における、「尾」であり、血清型毎に高度に保存され、ペントン塩 基と相互作用し、キャプシドにおける分子の足場を確保する。 （2）「幹」は、血清型によって様々な長さを有する棹状の構造である。例えば 、Ａｄ５の幹は、βシート配座を採用できる１５残基のモチーフの２２個の反復 配列を含む。これらの反復配列の数は血清型毎に異なり、これが長さの変動の理 由になっている。 （3）最後に、幹の末端には、「頭」または末端球面は、三量体化シグナルを含 む球形構造である(Hong and Engler，1996，J．Virol.，70，7071-7078;Novelli and Boulanger，1991，J．Biol．Chem.，266，9299-9303;Novelli and Boulang er，1991，Virology，185，365-376)。実験データのほとんどは、任意の細胞へ の結合に関与しているのは頭ドメインであることを示している(Krasnykh et al. ，1996，J．Virol.，70，6839-6846)。 （4）アデノウイルス付着の複雑さは、これが血清型によって変化することがあ りかつ数種類の細胞タンパク質がそれに関与していることを示唆している。Ａｄ ２については、Hong and Boulanger(1995，EMBO J．14，4714-4727)は、キャプ シドタンパク質（ペントン塩基および線維）、特にヒトフィブロネクチンのタイ プIII５および１４モジュールと相互作用することができる数種類の細胞表面タ ンパク質に見出だされている多数のペプチドモチーフを同定している。本発明者 らは、これに続いて不活性支持体上でペントン塩基または線維（リガンド）を固 定し、ランダムヘキサペプチド（ファゴトープ(phagotopes)と呼ぶ）を発現する ファージのライブラリーをこれと反応させた。吸着したファージは、理論的には アデノウイルスタンパク質によって支持されているモチーフと相互作用するファ ゴトープを発現するが、これを次に、従来の方法で酸性ｐＨでまたは他の固定さ れていない方のキャプシドパートナー溶離剤と競合させることによって溶出する 。しかしながら、アデノウイルスの細胞レセプターおよびレセプターへの結合に 精確な意味で関与した頭の領域は、これまでのところは明確に同定されてはいな かった。 固定されたリガンドがＡｄ５線維の頭ドメインからなり、溶離剤が後者と用い る抗体によって変化する単離されたファゴトープの２つのクラスとに対して指定 された中和抗体からなる「バイオパンニング(biopanning)」の新技術を行なった 。第一のものは、クラスＩの主要な組織適合複合体（α−２ ＭＨＣ−Ｉ）の抗 原のα−２ドメイン内の保存配列に相当し、第二のものは、ヒトフィブロネクチ ンのIIIモジュールＦＮIIIに見出だされる配列に相当する。下記の実施例に示さ れるデータは、α−２ ＭＨＣ−Ｉが、血清型Ｃアデノウイルスの主要なレセプ タ ーを構成していることを支持しており、ＦＮIIIのコレセプターまたは補助因子 としての関与を明らかにする。これらの２つのレセプターおよび線維の領域であ って、互いに相互作用している領域も同定した。更に、アデノウイルスの付着を 中和するα−２ ＭＨＣ−Ｉドメインのモチーフを再生する拮抗剤ペプチドおよ び付着を刺激するＦＮIIIモチーフを再生する作動薬ペプチドも生成した。 従って、本発明の主題は、 （a）１位のロイシン残基から出発して、２５位のグルタミン残基で終る配列 番号：１、 （b）１位のアスパラギン残基から出発して、２６位のアスパラギン残基で終 る配列番号：２、 （c）１位のバリン残基から出発して、２５位のアスパラギン残基で終る配列 番号：３、 （d）１位のセリン残基から出発して、２５位のアルギニン残基で終る配列番 号４、 （e）１位のアスパラギン残基から出発して、２５位のセリン残基で終る配列番 号：５ に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同なまたは同一のアミ ノ酸配列を含んでなるポリペプチドの使用であって、 アデノウイルスの宿主細胞への付着および／または前記アデノウイルスの前記 宿主細胞への侵入を行なうことができるようにしまたは促進するための使用であ る。 本発明の目的について、「ポリペプチド」とは、少なくとも６個の、好ましく は少なくとも８個のアミノ酸の連続からなる任意の分子を意味すると理解される 。ポリペプチドという用語は、短鎖のペプチド分子（６〜数１０個の残基）と、 敢えて使用しようとする場合には一層長い（数百までの残基）の分子の両方を包 含 する。本発明の構成の範囲内で用いるポリペプチドは、天然に存在する、特にヒ トの天然ポリペプチドまたはその部分から誘導することができるといえる。また 、これはキメラ体であってもよく、またＮ−および／またはＣ−末端で融合され および／または挿入されてオープン・リーディング・フレームを形成させる任意 の起源の追加の残基を含むこともできる。また、配列リスト（ＳＥＱ ＩＤ）に 開示されている配列に対して１個以上のアミノ酸の突然変異、欠失、挿入および ／または置換によって得られる突然変異体を用いることもできる。 本発明の構成内の好ましいポリペプチドは、細胞膜での足場または細胞の表面 における出現を確実にするための適当な要素も含んでいる。このような要素は、 当業者に知られている。例えば、−般にＮ末端位置で結合したシグナルペプチド および高度の疎水性を示すトランスメンブラン領域の存在が挙げられる。しかし ながら、ポリペプチドを膜または細胞表面に固定または結合するため、化学的手 法などの他の手法を用いることもできる。 「相同アミノ酸配列」は、前記配列の一つの少なくとも６個の連続したアミノ 酸が少なくとも７０％、好都合には少なくとも８０％、好ましい少なくとも９０ ％の相同性の程度を有する配列を意味すると理解される。同一という用語は、１ ００％の相同性を指す。当業者は、２つの配列の間の相同性の程度を計算するこ とができる一般的規則を知っている。この手続きは、通常は、可能ならば専門家 のコンピュータープログラムを用いて配列を整列することによって行なわれる。 人為的に空位置を導入することが必要なことがある。最適の整列を行なったなら ば、２個の配列のアミノ酸が位置の総数に対して同一であると見られる総ての位 置を数えることによって、相同性の程度を確定する。 「アデノウイルスの宿主細胞への付着」は、ウイルス粒子の細胞への結合を意 味する。「アデノウイルスの宿主細胞への侵入」は、ウイルスの宿主細胞への浸 透を表す。付着および／または侵入は、好ましくは少なくとも部分的には、アデ ノウイルスキャプシドとの相互作用によって本発明の構成内で用いられる（複数 の）ポリペプチドによって行なわれる。勿論、他のポリペプチドや非ポリペプチ ド分子が、当該技術分野で複雑かつ多元的であることが認められているこれらの 過程に関与することもある。これらは、任意の先行技術、例えば任意の細胞系お よび放射能標識されまたはリポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子を発 現する粒子を用いる下記の手法によって評価することができる。０℃では、付着 だけが起こり、ウイルスの浸透には３７℃の温度が必要である。 本発明の目的には、アデノウイルスは、ヒトまたは動物（イヌ、トリ、ウシな ど）のもの、またはゲノム断片を含んでなるハイブリッド起源のものであること ができる。これらのウイルスおよびそのゲノムは、文献に記載されている（例え ば、Graham and Prevec，分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)， 第７巻，遺伝子導入と発現プロトコール(Gene Transfer and Expression Protoc ols)，E.J．Murray監修，１９９１年，The Human Press Inc.，クリントン，ニ ュージャージーを参照されたい）。特に治療上興味深い遺伝子を発現する複製欠 損組換えアデノウイルスが好ましい。アデノウイルスゲノムは、複製に本質的で ありかつ特にＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＬ１−Ｌ５領域に含まれる配列の 欠失または突然変異によって修飾するのが有利である（例えば、国際出願ＷＯ９ ４／２８１５２号公報を参照されたい）。 第一の変更によれば、本発明の主題は、１位のロイシン残基から出発して２５ 位のグルタミン残基で終る配列番号：１に示される配列の少なくとも６個の連続 したアミノ酸配列と相同なまたは同一のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチ ドの使用である。 本発明の構成内で使用されるポリペプチドは、クラスＩの主要な組織適合複合 体（ＭＨＣ−Ｉ）の抗原、および好ましくはこのＭＨＣ−Ｉの重鎖の全部または 一部と相同なまたは同一のアミノ酸配列を含んでなるのが有利である。 生態の総ての細胞は、膜分子の上にそれぞれの個体を確定するいわゆる組織適 合抗原を有する。ヒトの染色体６には、約１０を上回る相当する遺伝子が配置さ れ、高度の多型を示し、これらの同定マーカーの高度の多様性を確保することが できる。これらの組織適合抗原には２つの異なる種類があり、それぞれクラスＩ およびＩＩであり、これらの構造および機能は異なっている。クラスＩ分子は、 ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）と呼ばれ、細胞表面で抗原性ペプチドの提供に関与し 、細胞毒性Ｔリンパ球によって示される抗ウイルス免疫応答に重要な役割を演じ ている。 ＭＨＣ−Ｉ分子は、β２−マイクログロブリン（β２ｍ）と呼ばれる非−ＭＨ Ｃ軽鎖と、非共有的に結合しているＭＨＣ遺伝子によってコードされる重鎖とか らなっている。重鎖は、Ｎ末端部分が細胞の外側に配置されており、一方Ｃ末端 部分は細胞質性である膜タンパク質である。前者は、α１、α２およびα３と呼 ばれ、それぞれ約９０個のアミノ酸を有する３個のドメインを含んでなる。これ に続いて約２５個のアミノ酸のトランスメンブラン領域があり、次に約３０個の アミノ酸のＣ末端領域が続く。異なる対立遺伝子の生成物の変異の大半は、α１ およびα２ドメインに位置しており、α３ドメインは比較的保存されており、ま たβ２ｍは不変である（総説およびＭＨＣ−Ｉのメンバーの配列比較については 、Bjorkman and Parham，1990，Annu．Rev．Biochem.，59，253-288を参照され たい）。 本発明の目的に適するポリペプチドとしては、更に具体的にはＨＬＡ Ａ、Ｂ 、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ抗原、またはそれらから誘導されるポリペプチドが挙げら れる。 特に有利な方法では、本発明の構成内で用いられるポリペプチドは、ＭＨＣ− Ｉ重鎖のα２ドメインのＣ末端領域の全部または一部、更に具体的には、１６７ 位のトリプトファン残基を中心とする部分、特に残基１５６〜１８０と相同また は同一の配列を含んでなる（配列番号：１）。言及する付番は、例えばBjorkman and Parham(1990,上記引用)で用いられたものに準じている。 もう一つの変更によれば、本発明の構成内で用いられるポリペプチドは、 １位のアスパラギン残基から出発して、２６位のアスパラギン残基で終る配列 番号：２、 １位のバリン残基から出発して、２５位のアスパラギン残基で終る配列番号： ３、 １位のセリン残基から出発して、２５位のアルギニン残基で終る配列番号：４ 、 １位のアスパラギン残基から出発して、２５位のセリン残基で終る配列番号： ５ に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同なまたは同一のアミ ノ酸配列を含んでなる。 好ましいポリペプチドは、フィブロネクチン、特にそのタイプIIIモジュール の少なくとも１個、特にモジュールＦＮIII １、４、５および／または１４に 相同なまたは同一のアミノ酸配列を含んでなる。勿論のことであるが、それらの 数個を含んでなることもある。ヒトフィブロネクチンまたは例えば突然変異また は断片化によってそれから誘導されたペプチドを用いようとすることも可能であ る。例えば、単一遺伝子によってコードされたフィブロネクチンは、接着および 細胞接触現象に関与する分子である。その配列とその特徴は、当業者に入手可能 な文献に記載されている（特に、Bork and Doolittle，1992，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，89，8990-8994およびDickinson et al.，1994，236，1079-1092を 参照されたい）。これは、１４個のいわゆるタイプIIIモジュール（１から１４ まで番号が付けられている）からなり、その主要配列は変化することがあるが、 β−シート配座は保存される。 特に有利な態様によれば、前記のようなポリペプチドは、更に具体的には血清 型Ｃのアデノウイルスの宿主細胞への付着および／または後者へのアデノウイル スの侵入を行なうことができるようにしまたは促進しようとするものである。考 えられるアデノウイルスには、更に具体的には、血清型２および５が挙げられる 。 本発明は、本発明の構成内で用いられるポリペプチドを発現することができる 宿主細胞、およびその表面へのアデノウイルスの付着および／またはこのアデノ ウイルスの侵入を行なうことができるようにするまたは促進するためのその使用 にも関する。様々なタイプの宿主細胞が考えられる。それらは、任意の起源、例 えば微生物、酵母、昆虫、植物または動物の細胞であることができる。哺乳類細 胞、特に一次または腫瘍タイプのまたはイン・ビトロで培養できる細胞系から誘 導されるヒト細胞が特に好ましい。それは、造血（全能幹細胞、白血球、リンパ 球、単球、マクロファージなど）、血液または腎起源、中枢神経系、線維芽細胞 、上皮、肺または筋肉（筋細胞、筋原細胞、衛星細胞、心筋細胞など）起源のも のであることができる。特に好ましい細胞は、アデノウイルスＥ１領域の組み込 みによって胎児腎細胞から得られた２９３系であるか、またはこれから誘導され る(Graham et al.，1977，J．Gen．Virol.，36，59-72)。通常はＭＨＣ−Ｉおよ び／またはフィブロネクチンを発現しない宿主細胞の表面での本発明の構成内で 用いられる１種類以上のポリペプチドの発現は、アデノウイルスによる感染性が 付与されることを示している。これは、新たな細胞産生アデノウイルスベクター として用いることができる。前記ポリペプチドを天然で発現する細胞での過剰発 現の場合を考えることも可能である。２９３系由来の過剰発現系は、目的とする アデノウイルスの産生率の向上を可能としてくれる。勿論、本発明の構成内で用 いられるポリペプチドは、化学的手段によってまたは細胞表面タンパク質を認識 するリガンドによって細胞と結合させることができる。しかしながら、組換えＤ ＮＡ技術による発現を考えることも可能である。このような態様は、当業者にと っては実現可能である。例えば、問題となっているポリペプチドをコードするヌ ク レオチド配列を（標準的なＰＣＲまたはクローニング技術によって）単離しまた は化学的に合成した後、適当な制御要素の制御下で通常の発現ベクターに挿入し 、このベクターを任意の先行技術の手法により宿主細胞に導入することができる 。本発明の構成内で用いる宿主細胞を修飾して、アデノウイルスゲノムの（複数 の）適当な断片をトランスフェクションすることによって欠陥を有するアデノウ イルスを補足することもできる。 本発明の主題は、前記のポリペプチドによって行なわれるアデノウイルスの宿 主細胞への付着および／またはアデノウイルスの宿主細胞への侵入に影響を及ぼ すためのリガンドの使用でもある。本発明で用いられるリガンドは、任意のタイ プのものであることができる。例えば、ペプチド、ホルモン、抗体またはそれら の誘導体、特にｓｃＦｖ（可変一本鎖断片）型の一本鎖抗体、およびトランスメ ンブラン領域を欠く可溶性レセプターが挙げられる。特に、このようなリガンド は、本発明で用いられるポリペプチドから誘導することができる。本発明が達成 しようとする目的によれば、このリガンドは負の効果（拮抗薬）または正の効果 （作動薬）を有することがある。好ましくは、好ましいリガンドは、アデノウイ ルスに対する解離定数が０．０１〜１００ｎＭであり、有利には０．１〜５０ｎ Ｍであり、最も好ましくは０．５〜１０ｎＭである。 拮抗薬の場合には、リガンドど線維との相互作用により、アデノウイルスの付 着および／または侵入の過程を減少させまたは阻害することができる。これに関 して、特に好ましいリガンドは、配列番号：１に定義されているポリペプチドに 基づいている。例えば、１位のアルギニン残基から出発して、２０位のアルギニ ン残基で終る配列番号：６に示される配列に含まれる少なくとも６個の連続した アミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを挙げるこ とができる。下記の実施例におけるＭＨ２０と呼ばれるペプチドの使用が、好ま しい。 正の効果の場合には、本発明の構成内で用いられるリガンドは、アデノウイル スの付着および／または侵入を行なうことができるようにしまたは促進するため に使用される。本発明の目的に適当なリガンドは、１位のアルギニン残基から出 発して、２０位のアルギニン残基で終る配列番号：７に示される配列の少なくと も６個の連続したアミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなる。好ま しい例は、下記においてＦＮ２０と呼ばれるペプチドからなっている。 本発明は、配列番号：６または７に示される配列の少なくとも６個の連続した アミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなるリガンドにも関する。 しかしながら、それはアデノウイルス起源のリガンドでもよい。この態様によ れば、好ましいリガンドは、アデノウイルスの線維、特に前記のポリペプチドと 相互作用する頭の部分に由来する。従って、この領域において選択されるペプチ ドモチーフは、ポリペプチドを発現する宿主細胞に関してアデノウイルスの感染 性に影響を及ぼすべきものである。有利なことには、アデノウイルスの線維の残 基４３８〜４８６をカバーするリガンドが用いられる。更に具体的には、配列番 号：１によって定義されるポリペプチドのリガンドは、Ａｄ５から好ましく誘導 され、１位のアミノ酸であるロイシンから出発して、１８位のアミノ酸であるア スパラギン酸で終る配列番号：８に示される配列の少なくとも６個の連続したア ミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなる。考えられるリガンドは、 血清型２のアデノウイルスの線維から誘導することもでき、また１位のトレオニ ン残基から出発して、１６位のバリン残基で終る配列番号：９に示される配列の 少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでな ることもできる。 配列番号：２〜５によって定義されるポリペプチドのリガンドは、更に具体的 には１位のロイシン残基から出発して、１４位のトレオニン残基で終る配列番号 ：１０に示される配列（Ａｄ５）、または１位のアスパラギン残基から出発して 、 １３位のアスパラギン残基で終る配列番号：１１に示される配列（Ａｄ２）の少 なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を特徴とする 。 本発明の主題は、アデノウイルスの感染を抑制しまたは減少することを目的と する医薬の製造のための本発明によるリガンドの使用でもある。これに関しては 、治療または予防目的での拮抗薬リガンドの使用が、好ましい。本発明によるリ ガンド、好ましくは作動薬リガンドの使用は、アデノウイルス、特に遺伝子（治 療用）または抗ウイルス（ＡＩＤＳ）または抗癌治療を目的とする治療遺伝子を 有する組換えアデノウイルスによる感染の促進または助長を目的とする医薬の製 造に適している。このような医薬は、例えば遺伝子療法による治療に関連して用 いられ、組換えアデノウイルスで治療される患者におけるウイルス感染を向上さ せる。非経口または経口投与、あるいはエーロゾルによる投与を考えることが可 能である。投与は、単回投与で、または所定の期間の後１回または数回繰り返し 投与を行なうことができる。適当な用量および処方は、様々なパラメーター、例 えば患者個人、治療を行なう疾患、所望な効果、投与経路または問題となるアデ ノウイルスによって変化する。 本発明は、適当な試料のウイルスに対する細胞レセプターを選択しまたは同定 する方法であって、 （a）前記ウイルスの前記細胞レセプターへの付着を決定する前記ウイルスの 表面タンパク質の全部または一部を含んでなるウイルス起源の試薬の不活性支持 体への固定、 （b）前記試料の所定時間のインキュベーション、 （c）前記ウイルス起源の試薬に対して指定された抗体の全部または一部によ る工程(b)で保持された試料の溶出、 （d）工程(c)で溶出された試料の分析 を含んでなる、方法にも関する。 不活性支持体は、制限なしで、任意の形態（円錐形、管、ウェル、ビーズなど ）でよく、任意の材料（天然物、合成物、例えば化学修飾などを受けたポリマー など）から作成することができる。試薬の不活性支持体への付着は、直接的また は間接的方法で行なうことができる。直接的方法では、この手順は、吸着、すな わち非共有結合的に行なわれるのが好ましいが、共有結合の形成を考えることも できる。間接的方法では、試薬と相互作用できる抗試薬化合物を予め付着させて 、不活性支持体に対して全体を固定することができる。有利な態様によれば、試 料は、いわゆるランダムライブラリー、特に発現ライブラリー（ゲノム断片、ｃ ＤＮＡ）またはペプチドライブラリー、または好ましくはペプチドモチーフを発 現するファージライブラリー（ファゴトープ）からなっている。このようなライ ブラリーは文献に記載されているか、または市販されている。アデノウイルスに 対する細胞レセプターを選択または同定するため、ウイルス起源の試薬として、 線維、特にアデノウイルスの頭の線維の全部または一部、および溶離剤として、 抗線維中和抗体（ウイルスの宿主細胞の表面への付着の阻害剤）を用いるのが好 ましい。線維またはその断片は、組換え経路によって生成させることができ、ま た抗体は、ハイブリドーマ法によってまたは遺伝子工学によって（一本鎖抗体ｓ ｃＦｖ、Ｆａｂなどの生成）生成させることができる。ほとんどの抗線維抗体は 、中和していることが示されている。分析は、溶出試料の配列をデータバンクと 比較することによって行なう。このような分析は、当業者にとっては実現可能で ある。 最後に、本発明は、適当な試料の細胞レセプターへのウイルスの付着を決定す るウイルスタンパク質の部分を選択しまたは同定する方法であって、 （a）前記ウイルスタンパク質に対して指定された抗体の全部または一部を不 活性支持体への固定、 （b）前記試料の所定時間のインキュベーション、 （c）前記ウイルスタンパク質の全部または一部を含んでなるウイルス起源の 試薬による工程(b)で保持された試料の溶出、および （d）工程(c)で溶出された試料の分析 を含んでなる、方法にも関する。 前記引用の具体的態様は、これに関しても当てはまる。 本発明の主題は、アデノウイルスの天然の細胞レセプター以外の細胞表面タン パク質へ前記アデノウイルスをターゲッティングするための二官能性リガンドの 使用であって、前記二官能性リガンドが前記アデノウイルスの線維と相互作用可 能な第一のリガンド部分と、前記細胞表面タンパク質と相互作用可能な第二のリ ガンド部分と、場合によっては第一および第二のリガンド部分の間にスペーサー を含んでなる、使用でもある。 本発明の目的に対して、二官能性リガンドは、２種類の異なる種であって、一 方はアデノウイルスの表面に好ましく配置され、他方は宿主細胞の表面に配置さ れているものと、アデノウイルスに対する天然の細胞レセプター以外の細胞表面 タンパク質の水準で相互作用することができる。更に、２個のリガンド部分は、 場合によっては１〜約１５個のアミノ酸を含んでなり、好ましくは帯電していな いスペーサーによって分離することができる。勿論、種の順序は重要ではなく、 アデノウイルスタンパク質と相互作用するドメインが二官能性リガンドのＮまた はＣ末端になるようにすることができ、Ｃ末端が好ましい。このような二官能性 リガンドの使用により、アデノウイルスを対象とする宿主細胞、例えば腫瘍細胞 、感染細胞、特定の細胞型、または特異的表面マーカーを有する細胞の種類に標 的設定することができる。この二官能性リガンドが細胞表面タンパク質に結合し た後、アデノウイルスタンパク質を認識する種が露出し、これが一次レセプター （ＭＨＣ−Ｉのα２ドメイン）と同じタイプのウイルスレセプターの「ルアー」 を生成し、宿主細胞の表面におけるアデノウイルスの一次レセプター数を生成す る。 好ましくは、アデノウイルス線維と相互作用するリガンド部分は、前記のリガ ンドの特徴を有しており、特にＭＨＣ−Ｉのα２ドメインから誘導され、好まし くは配列番号:６に含まれる少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同 一のアミノ酸配列を含んでなる。更に好ましくは、これはペプチドＭＨ２０（配 列番号：６）からなっている。 細胞表面タンパク質と相互作用するリガンド部分については、これは標的とし ようとする宿主細胞に適用される。ＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全症ウイルス） に感染した細胞の場合には、リガンドは、ＣＤ４レセプターであるフジン(fusin )に対するまたは露出したウイルスタンパク質（エンベロープ糖タンパク質）に 対する抗体断片であるか、または残基３７から７２へ伸びているＨＩＶウイルス のＴＡＴタンパク質の部分であることができる(Fawell et al.，1994，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，91，664-668)。腫瘍細胞の場合には、腫瘍特異的抗原を認 識するリガンド（乳癌の場合のＭＵＣ−１、パピローマウイルスＨＰＶの抗原な ど）、または過剰発現するもの（ある種のリンパ様腫瘍で過剰発現したＩＬ−２ レセプター）が選択される。Ｔリンパ球を標的としようとするときには、Ｔ細胞 レセプターリガンドを用いることが可能である。更に、トランスフェリンは、肝 ターゲッティングの良好な候補である。ＥＧＦ（表皮成長因子の略号）レセプタ ーを発現する細胞に標的設定することができるペプチドＥＧＦ、またはＧＲＰ細 胞レセプターに結合する配列ＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ(Michael et al.，1995，Gen e Ther.，2，660-668)を有するＧＲＰペプチド（ガストリン放出ペプチド）を挙 げることもできる。一般に、本発明に関して用いることができるリガンドは、文 献に詳細に記載されている。 本発明の構成内で用いられる二官能性リガンドは、組換えＤＮＡ技術、合成ま たは問題とするリガンドの２つの部分の化学的カップリングによって得ることが できる。好ましくは、標的とするアデノウイルスは、組換え体であり、細胞毒性 遺伝子を有し、または細胞アポトーシスを誘導することができる。このような遺 伝子は、完全に知られている。特に、ＨＳＶ−１ウイルス（単純ヘルペスウイル スタイプ１）のチミジンキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。 好ましい例としては、ペプチドＭＨ２０およびＧＲＰを含んでなる二官能性リ ガンドが挙げられる。ＭＨ２０とＧＲＰペプチドドメインは、逆方向に配向して おり、それぞれのＭＨ２０がＮ末端位置にあるときはＭＨ２０−ＧＲＰであり、 ＭＨ２０がＣ末端位置にある時はＧＲＰ−ＭＨ２０である。もう一つの態様では 、ＭＨ２０種とＳｃＦｖ（一本鎖ＦＶ断片）の抗体種を有するリガンドが用いら れる。特に好ましい態様によれば、この二官能性リガンドは、 (i)１位のアルギニン残基から出発し、３５位のメチオニン残基で終る配列番号 ：２２、または (ii)１位のリシン残基から出発し、３５位のアルギニン残基で終る配列番号：２ ３ に示される配列の全部または一部と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなる 。 本発明は、前記の二官能性リガンド、特にリガンドＧＲＰ−ＭＨ２０またはＭ Ｈ２０−ＧＲＰにも関する。リガンドＧＲＰ−ＭＨ２０が特に好ましい。 本発明の主題は、このような二官能性リガンドを表面に有する細胞にも関する 。このような細胞の利点は、ＭＨＣＩ−α２タイプの一次レセプターの数を増加 することである。この細胞は、任意の起源（前記を参照されたい）の哺乳類細胞 であることが有利である。これは、Ｅ１機能および場合によっては他の機能（Ｅ ２、Ｅ４、Ｅ２およびＥ４など、出願ＷＯ９４／２８１５２号公報を参照された い）を欠くアデノウイルスの補足のための細胞が好ましい。好ましい例は、２９ ３系である。これは、組換えＤＮＡ技術（細胞表面で、シグナル配列および／ま たはトランスメンブラン領域などを発現することができる要素を含んでなる適当 なベ クターによる二官能性リガンドの発現）により、共有または非共有的化学結合に よって、または細胞とリガンドとの単純な相互作用によって生成することができ る。 本発明を、下記の図について説明する。 第１図は、抗体１Ｄ６．３（a）または７Ａ２．７（b）をリガンドとして用い るバイオパンニングによって得られたファゴトープを表す。このファゴトープの ペプチドモチーフは、Ａｄ５の配列に対して整列されている（線維のイニシエー ターメチオニン残基を＋１とする）。βシート構造(Xia et al.，1994,上記引用 )を形成させる領域に下線を施し、（D）、（E）および(F)で示している。配列同 士で同一または保存されている残基を太線で示している。 第２図は、（a）抗体７Ａ２．７または(c)１Ｄ６．３を溶離剤として用いるバ イオパンニングによって得られたファゴトープ、（b）および(d)それぞれファゴ トープ(a)および(c)から決定されたコンセンサス配列、並びにSWISS PROTデータ バンクを分析することによって見出された相同配列を表す。同様な部位で保存さ れた残基を太線で示す。 第３図は、一定ＭＯＩ（０．１６ｐｆｕ／１０５細胞数）でＡｄ５Ｌｕｃ３ウ イルスに感染したＨｅＬａ細胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発現を表す。（（○ ）Ａｄ５Ｌｕｃ３を、増加モル数のペプチド(a)ＦＮ２０（０〜５００μＭ）ま たは(b)ＭＨ２０（０〜５０μＭ）の存在下で０℃まで冷却した細胞に加える。 コントロールは、Ａｄ５Ｌｕｃ３（△）の付着の後またはエンドサイトーシス（ □）の後のペプチドのインキュベーションに相当する。 第４図は、増加濃度のＡｄ５Ｌｕｃ３（０．３〜１５０ｐｆｕ／１０５細胞数 ）に感染したＤａｕｄｉ−ＨＬＡ−（●）またはＤａｕｄｉ−ＨＬＡ＋（○）細 胞でのルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す。Ａｄ５Ｌｕｃ３を、０℃に予備冷却 した細胞と１時間接触させ、ウイルス付着を行なわせるが、侵入は起こさせない 。 ルシフェラーゼ活性は、３７℃で１８時間培養した後に評価する。ＲＬＵ値は、 ３つの別個の実験の平均値を表す。 第５図は、アデノウイルスの一次レセプターを模する二官能性リガンド法の原 理を示している。 第６図は、ＮＩＨ細胞(a)、SWISS 3T3細胞、(b)ＨｅＬａ細胞でのＡｄ５Ｌｕ ｃ３のＭＯＩの関数としてのルシフェラーゼ酵素活性を表す。 実施例 ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）を、先行技術の手法に準じて単層で培養 する。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン、および通常 の抗生物質を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改良イーグル培地、Gibco）を用い るのが好ましい。Ｄａｕｄｉ ＨＬＡ−（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）およびＨＬ Ａ＋(Quillet et al.，1988，J．Immunol.，141，17-20)細胞を、１５％ＦＣＳ を補足したＲＰＭＩ１６４０培地(Gibco)に保持する。 野生型Ａｄ５および組換えＡｄＬｕｃ３を、標準的手法によってＨｅＬａ細胞 間で増殖させる。例えば、Ａｄ５ｕｃ３は、アデノウイルスゲノムのＥ３領域中 に挿入されたＳＶ４０ウイルス（シミアンウイルス４０）初期プロモーターの制 御下に置かれたルシフェラーゼ遺伝子を含む(Mittal et al.，1993，Virus Rese arch，28，67-90)。実施例１ Ａｄ５の任意の細胞への付着を阻害することができるモノクローナル 抗体（ｍＡｂ）の産生 ネズミｍＡｂ １Ｄ６．３および７Ａ２．７を、組換え法(Henry et al.，199 4，J．Virol.，68，5239-5246;Douglas et al.，1996，Nature Biotech.，14，1 574-1578)によって細菌に産生されたＡｄ５線維の頭をＢａｌｂ／ｃマウスに注 射することによる通常の方法によって生成した。ハイブリドーマクローンの融合 および産生は、当業者であれば実現できる通常の技術である。分泌クローンは、 ＥＬＩＳＡで免疫感作の働きを行う抗原の認識によって選別する。それらは、ビ リオンに対して中和活性を示す(Michael et al.,作成中)。 モノクローナル抗体１Ｄ６．３および７Ａ２．７の血清反応性 抗体の反応性を、組換え法で調製した３種類の血清型（Ａｄ２、Ａｄ５および Ａｄ３）の線維の頭のドメインについて試験した。相当する配列を、ＰＣＲ（ポ リメラーゼ連鎖反応）によりウイルスゲノムＤＮＡから単離した後、ポリヘドリ ンプロモーターの制御下にＡｃＮＰＶウイルス(Autographa califomica Nuclear Polyhedrosis Virus)に導入する(Luckow and Summer，1989，Virology，170，3 1-39)。組換えタンパク質をＳｆ９(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞で発現させ る。一般的手法は、Karayan et al.(1994，Virology，202，782-796)およびNove lli and Boulanger(1991，Virology，185，365-376)に詳細に記載されている。 更に精確には、幹の最後の反復モチーフに続いて線維の頭を有するＡｄ５配列を 、配列番号：１２および１３で表されたプライマーを用いてクローニングする。 センスプライマーはＡｄ５ゲノムのヌクレオチド３２１６４〜３２２０５に相当 し(Chroboczek and Jacrot，1987，Virology，161，549-554)、４個のミスマッ チを含み、ＢａｍＨＩ部位を創設し、天然の線維の３８８位のトレオニンをイニ シエーターＡＴＧコドンで置換するようにする。アンチセンスプライマーは、Ａ ｄ５ゲノムのヌクレオチド３２９１９〜３２８８３に相当し、ＫｐｎＩ部位を創 設して、次のクローニング工程を促進することができる。Ｓｆ９細胞上清に集め た組換えタンパク質をＦ５−ＡＴ３８６と呼ぶ。Ａｄ頭は、Louis et al．(1994 ，J．Virol.，68，4104-4106)に記載のバキュロウイルスベクターから産生する 。Ｆ２−ＡＴ３８８と命名した発現生成物は、（元の配列のＡｌａをＭｅｔで置 換することにより）３８８位から始まり、頭ドメインの他に、幹の最後の反復モ チーフを有している。最後に、Ａｄ３の相当する配列については、ＮｃｏＩクロ ーニング部位を導入しかつ１２４および１２５位のＡｓｎおよびＳｅ ｒコドンをそれぞれＭｅｔおよびＡｌａコドンで置換するようにデザインしたセ ンスプライマー（配列番号：１４）を用いる。アンチセンスプライマー（配列番 号：１５）は、ＫｐｎＩ部位を導入する。発現生成物をＦ３−ＡＴ１２４と呼ぶ 。 ＥＬＩＳＡプレートのウェルを組換えタンパク質Ｆ５−ＡＴ３８６、Ｆ２−Ａ Ｔ３８８またはＦ３−ＡＴ１２４でコーティングし、ｍＡｂ １Ｄ６．３または ７Ａ２．７に続いて標識した抗マウス抗体（例えば、ホスファターゼまたはペル オキシダーゼ）と反応させる。元の組換えタンパク質F５−ＡＴ３８６に対して は、陽性反応が見られる。ＳＤSで変性したタンパク質F５−ＡＴ３８６を含むウ ェル、または元のまたは変性生成物Ｆ２−ＡＴ３８８およびＦ３−ＡＴ１２４を 含むものでは、反応は見られない。これらのデータは、抗体が血清型Ｃに特異的 な配座のエピトープを認識することを示唆している。 Ａｄ５の細胞付着に対するモノクローナル抗体１ｄ６．３および７Ａ２．７の阻 害剤効果 培養しているＨｅＬａ細胞への微量結合の試験を、［¹⁴Ｃ］バリン（比活性２ ２００〜２５００ｃｐｍ／１０８ビリオン）で標識したＡｄ５ビリオンを用い、 続いてその場で（inインシトゥでのオートラジオグラフィ（Silver and Anderso n，1988，Virology，165，377-387)によって行なう。これを行なうため、半コン フルエント状態の細胞を、一定量の放射活性ビリオン（１０³ｃｐｍ／５×１０⁴ 個）の存在下、ｍＡｂ１Ｄ６．３または７Ａ２．７の存在下（それぞれのハイブ リドーマ上清の１：１０、１：８、１：４および１：２の希釈度で、ｍＡｂ濃度 は０．１〜０．２μｇ／ｍｌで計算され、これは、接種物に含まれるビリオンに 対するｍＡｂの過剰量のそれぞれの１００、２５０、５００および１０００に相 当する）に置く。次いで、細胞をＰＢＳの存在下で洗浄し、０．１％パラホルム アルデヒド／ＰＢＳで固定し、ゲル状のＫ４エマルションで被覆する(Ilford Nu clear Research)。１週間暴露し、現像した後（現像剤Ｄ１９Ｂ、Kodak）、試 料を０．５％トルイジンブルーで簡単に染色し、Ｈ₂Ｏに入れ、顕微鏡下で検査 する。細胞の輪郭の周囲の還元銀結晶の密度は、細胞表面に結合した［¹⁴Ｃ］ビ リオンの数を表している。 アンチ−頭ｍＡｂの非存在下または低濃度では（１：１０希釈）、還元銀結晶 の暗いハロ（helo）が結晶の周囲に見られ、ビリオンが細胞の表面に吸着したこ とを示している。ｍＡｂ濃度によって変化するハロの減少が、１：８、１：４お よび１：２希釈で見られる。これらの結果は、線維のこの部分に対して指定した ＩＤ６．３および７Ａ２．７により一次細胞レセプターへのアデノウイルスの頭 の結合がブロックされることを反映している。同じ希釈度についてのハロの表面 積を比較すると、１Ｄ６．３抗体は、ｍＡｂ ７Ａ２．７よりもＨｅＬａ細胞レ セプターへのＡｄ５の付着を強く阻害することを示している。実施例２ ｍＡｂ １Ｄ６．３および７Ａ２．７に対するエピトープの同定 線維のエピトープは、配座的であると仮定されているが(Fender et al.，1995 ，Virology，214，110-117)、ペプチドのスキャンニングによるエピトープの同 定の通常の方法は、適当でない。手順は、Smith and Scott(1933，Methods Enzy mol.，217，228-257)およびHong and Boulanger(1995，EMBo J.，14，4714-4727 )に記載の方法から誘導されたバイオパンニング法に準じて行なう。この場合、 ｍＡｂ １Ｄ６．３または７Ａ２．７を、１μｇ／ウェルの濃度で０．１Ｍ炭酸 ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中でマイクロタイタープレート(Nunc Immunomodule MaxiSorp F8)上で４℃で一晩吸着させる。固定した抗体を、ヘキサペプチドを 発現するファージライブラリーと接触させる(FUSE5ファージ、Scott and Smith ，1990，Science，249，386-390)。第二工程では、保持されたファージを通常の 酸性溶出緩衝液で、または更に選択的には、組換えタンパク質Ｆ５−ＡＴ３８６ の過剰量の存在下で競合により、溶出する。溶出したファージが付いたヘキサペ プチドモチーフ（ファゴトープ）を、Sanger et al．(1977，Proc．Natl．Acad ．S ci．USA，74，5463-5467)の方法によってタンパク質ＰiiiｆＵＳＥ５を配列決定 することによって測定する。ファゴトープと配列の相同体を、Swiss Protデータ バンクおよびFASTA 1.6プログラム(Pearson and Lipman，1988，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，85，2444-2448)で探索し、配列をClustalプログラム(higgins an d Sharp，1988，Gene，73，237-244)のバージョンＷ（１；４）を用いて整列す る。 第１図に示されるように、ｍＡｂ １Ｄ６．３は、配列が重複している様々な ファゴトープを保持しており、４３８位のＶａｌ残基と４６２位のＡｓｐ残基の 間に伸びているＡｄ５頭と相同である。縮重および分散の程度に拘らず、４４５ 〜４６２位のアミノ酸に相当する配列ＬＡＰＩＳＧＴＶＱＳＡＨＬＩＩＲＦＤの 中心モチーフを決定することができた（配列番号：８）。このモチーフは、４５ ６位のＨｉｓ残基に中心があり、これにより数種の独立したファゴトープにヒス チジンが存在することが確かめられる。更に、３種類のファゴトープは、セリン の近くにヒスチジンを含み（ＧＩＳＨＴＧおよびＧＡＳＨＴＶ）、相同配列が頭 に見られる（⁴⁵³ＱＳＡＨＬＩ458）。Ｎ末端側では、配列ＬＡＰＩＳが、Ｌ−Ｐ 、ＶＰＡ−ＰおよびＬＩＰＦＮＳの形態で数種のファゴトープに現れる。 ｍＡｂ ７Ａ２．７によって保持された１５種類のファゴトープの配列分析で は、４件についてプロリン、トリプトファンとヒスチジンが８倍で存在すること を示し、２個の芳香族残基の同じファゴトープでの会合は５倍で見られる。従っ て、ｍＡｂ ７Ａ２．７のエピトープは、例えば⁴⁷⁷ＹＷＮＦ⁴⁸⁰のように芳香族 残基の基近くに線維の４７５位におけるようなプロリン残基を含む。更に、２個 のファゴトープＦＷＬＡＶＲおよびＷＡＬＦＲＳは、モチーフ⁴⁷⁷ＹＷＮＦＲ⁴⁸¹ に相同である。これらのデータに基づいて、ｍＡｂ ７Ａ２．７のエピトープを 、Ａｄ５線維の残基４７３と４８６との間にマッピングした（配列番号：１０） 。 簡単にいえば、ｍＡｂ １Ｄ６．３および７Ａ２．７は、Ａｄ５頭の線状配列 の１５〜２０ａａの隣接セグメントを認識し、これらの残基はそれぞれ４４５〜 ４６２および４７３〜４８６位に伸びている。Xia et al.(1994，Curr．Biol．S tructure，2，1259-1270)によって提案された三次元モデルによれば、２個のエ ピトープは空間的観点から連続な領域を占めている。ｍＡｂ １Ｄ６．３のエピ トープは、ＣＤループおよびβシートＤの部分をカバーし、ｍＡｂ ７ａ２．７ のエピトープは、隣接セグメントおよび２個のβシートＥおよびＦのレベルで配 置されている。１Ｄ６．３エピトープは、シートＲの内部に配置され、７Ａ２． ７エピトープはシートＲに対して一層脇側に配向している。実施例３ 逆バイオパンニング法によるＡｄ５の細胞レセプターの同定 この手法は、線維をリガンドとして用い、ｍＡｂを溶離剤として用いるので、 先行する方法に対して逆と呼ばれる。従って、この手順は、ヘキサペプチドファ ゴトープを発現するファージライブラリーと反応するＡｄ５線維の頭を固定する ことによって行なわれる。吸着したファージは、通常の酸性緩衝液でもまたはｍ Ａｂ １Ｄ６．３または７Ａ２．７で溶出することもでき、それぞれのファゴト ープを有する組換えタンパク質ｐIIIが配列決定される。データバンクでの探索 は、上記と同様に行なう。同定したヘキサペプチドモチーフを、第２図に示す。 ｍＡｂ ７Ａ２．７との競合によって産生したファゴトープを、第２ａ図に示 す。それらの分析によって、ヒトフィブロネクチンのタイプIIIモジュールのモ チーフ１，３，５および１４（配列番号：２〜５）と相同性を示すコンセンサス 配列（第２ｂ図）を誘導することができる(Main et al.，1992，Cell，71，671- 678)。それらは、βシートＢおよびＦＮIIIモジュールの隣接ＢＣループのレベ ルで配置される(Dickinson et al.，1994，J．Mol．Biol.，236，1079-1092)。 ｍＡｂ １Ｄ６．３の作用の後に溶出されたファゴトープを第２ｃ図に示す。 総ての配列が重複しており、コンセンサス配列を決定することも可能である（第 ２ｄ図）。データバンクに記載されている配列との相同性の探索の結果、クラス Ｉ ＭＨＣ分子（ＭＨＣ−１α−２）の重鎖のα−２ドメインのＣ末端領域との 相同性が明らかである（１５６〜１８０位）（配列番号：１）。実施例４ ＦＮIIIモデルおよびＭＨＣ−１α−２ドメインとのアデノウイルス 線維の相互作用 相互作用を、イン・ビトロで、βシートＢおよびＦＮIIIのＢＣループに相同 なコンセンサス配列を再生するペンタデカペプチドＲＨＩＬＷＴＰＡＮＴＰＡＭ ＧＹに対するＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）のＣ末端融合から 誘導されるキメラ体タンパク質を用いて検討した（前例および第２ｂ図を参照さ れたい）。これを行なうため、配列リスト１６および１７に示したオリゴヌクレ オチドをハイブリダイゼーションし、プラスミドｐＧＥＸ−ＫＧのＸｈｏＩ部位 に導入する(Guan and Dixon，1991，Anal．Biochem.，192，262-267)。このオリ ゴヌクレオチドは、一旦再ハイブリダイゼーションしたら、インサートが正確な 配向でクローニングされる場合には、５’末端のＸｈｏＩ部位で生成することに 留意すべきである。これにより、単一コピーまたは複数コピーを再構成されたＸ ｈｏＩ部位のレベルで一列に組み込むことができる。ペンタデカペプチド（ＧＳ Ｔ−ＦＮｘ１）のコピーを含んでなる融合生成物の配列を、下記の方法で模式的 に表すことができる。ＧＳＴ−（トロンビン−ＰＧＩＳ−ＧＧＧＧＧ−ＩＬＤＳ ＭＧＲＬＥ−ＲＨＩＬＷＴＰＡＮＴＰＡＭＧＹ（Ｖ）−ＥＬＫＬＮＳ−ストップ 。構造体ＧＳＴ−ＦＮｘ２およびＧＳＴ−ＦＮｘ３は、それぞれクローニングカ セットの残基ＬＥとＥＬとの間にペンタデカペプチドの２および３個の反復を含 んでなる。 ｍＡｂ １Ｄ６．３との競合によって得られたコンセンサス配列をコードする センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１８および１９）を 、前記と同じ方法によってＧＳＴのＣ末端に挿入して、存在するモチーフの数に よって構造体ＧＳＴ−ＭＨＣ×１、ＧＳＴ−ＭＨＣ×２およびＧＳＴ−ＭＨＣ× ３ を得る。キメラタンパク質ＧＳＴ−ＦＮおよびＧＳＴ−ＭＨＣは、E．coliで産 生され、抽出し、通常の方法でアガロースーグルタチオンビーズ(Sigma)上でア フィニティー精製する(Smith and Johnson，1988，Gene，67，31-40)。 平行して、血清型２，３および５の完全な線維を、すでに用いたバキュロウイ ルス／Ｓｆ９細胞法によって組換え法によって産生する。Ａｄ２線維に対する遺 伝子を有する構造体Ｆ２−ＦＬ５８２は、NovelliおよびBoulanger(1991，Virol ogy，185，365-376)に記載されている。Ａｄ５およびＡｄ３をコードする配列を 、ウイルスＤＮＡを鋳型として、配列番号：２０および１３、および２１および １５に記載されているような適当なセンスおよびアンチセンスプライマーを用い るＰＣＲによって単離する。増幅したセグメントを、ポリヘドリンプロモーター の制御下でバキュロウイルスベクターに導入し、発現生成物を培養液上清で回収 する。Ａｄ５およびＡｄ３線維に相当するＦ５−ＦＬ５８１およびＦ３−ＦＬ３ ２０を、それぞれ得る。 ＦＮIIIモジュールおよび組換えα−２ＭＨＣ−１ドメインのアデノウイルス 線維に結合する容量を、融合タンパク質ＧＳＴ−ＦＮおよびＧＳＴ−ＭＨＣおよ び組換え線維Ｆ２−ＦＬ５８２、Ｆ５−ＦＬ５８１およびＦ３−ＦＬ３２０のイ ン・ビトロインキュベーションの後イムノトランスファーによって評価する。形 成した複合体を、Johnson et al．(1995，J．Biol．Chem.，270，24352-24360) によって記載された条件かでアガロースグルタチオンビーズ上で単離した後、不 連続緩衝液系を用いて１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 上で分析した(Laemmli，1970，Nature，227，680-685)。タンパク質を、２０％ メタノールを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１９２ｍＭグリシン緩衝液，ｐ Ｈ８．３中でニトロセルロース膜（０．８ｍＡ／ｃｍ²，Cambridge Electrophor esis system，英国）に移す。ブロッキィング溶液（５％脱脂乳、１％ウシ血清 ／ＴＢＳ−Ｔ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％Tween 20）で処理した後、膜を抗体４Ｄ２．５と接触させ (Hong and Engler，1991，Virology，185，758-767)、次に西洋ワサビペルオキ シダーゼ標識抗−ＩｇＧ接合体と接触させる。化学発光ペルオキシダーゼ物質に よる観察(SuperSignal，Pierce Chemials)を、Carriere et al.(1995，J．Virol ．，69，2366-2377)に準じて行ない、ルミノグラム(Hyperfilm β-max，Amersha m)を自動化デンシトメーターを用いて６１０ｎｍで分析した(REP-EDC，Helena L aboratories，ビューモント，テキサス)。例えば、抗体４Ｄ２．５は、ほとんど の哺乳類アデノウイルスで保存されている尾のドメインのＦＮＰＶＹＰエピトー プを認識する。 ＧＳＴ−ＦＮ×１，ＧＳＴ−ＦＮ×２およびＧＳＴ−ＦＮ×３は、ＦＲ−ＡＴ ３８６およびＦ２−ＡＴ３８８に高効率で結合し、Ｆ３−ＡＴ１２４はこれより 少ない程度で保持される。同様な挙動は、キメラタンパク質ＧＳＴ−ＭＨＣ×１ ，ＧＳＴ−ＭＨＣ×２およびＧＳＴ−ＭＨＣ×３で観察され、これらはＦ５−Ａ Ｔ３８６およびＦ２−ＡＴ３８８をＦ３−ＡＴ１２４より高効率で保持する。 Ａｄ５線維は、融合タンパク質ＧＳＴ−ＦＮおよびＦＳＴ−ＭＨＣに、Ａｄ２ 線維と比較して２〜３倍の親和性で、またＡｄ３線維と比較して１０〜１５倍の 親和性で結合する。更に、結合効率は、融合タンパク質に含まれるモチーフの数 によって変化せず、強度は、共通であり、ＧＳＴ−ＦＮ×１およびＧＳＴ−ＦＮ ×３、およびＧＳＴ−ＭＨＣ×１およびＧＳＴ−ＭＨＣ×３の間で低くなること もある。これは、一列になっているモチーフが結合を妨げる配座を採ることがで きることによって説明することができる。実施例５： ウイルスの細胞表面への付着に対するＦＮIIIおよびＭＨＣ−１α ２由来の合成ペプチドの影響 ＦＮIIIおよびＭＨＣ−Ｉα２モチーフを再生産する２種類の合成ペプチドを 化学的に合成し、先行技術の手法で精製した。ＦＮ２０（配列番号：７）は、抗 体７Ａ２．７によって溶出されるファゴトープのコンセンサス配列を再生産し、 ＭＨ２０（配列番号：６）はｍＡｂ １Ｄ６．３によって溶出されたファゴトー プに相当する。 ペプチドＦＮ２０およびＭＨ２０を、イン・ビトロで培養したＨｅＬａ細胞へ のリポーターアデノウイルスＡｄ５Ｌｕｃ３の付着のついて試験する。試験は、 一部を、ウイルスが任意の細胞の表面に付着することはできるが、ウイルスの侵 入およびレセプターのリサイクリングはブロックされる温度の０℃で行なう。Ａ ｄ５Ｌｕｃ３（ＭＯＩ ０．１６ｐｆｕ／１０⁵個）を増加濃度のペプチド（０ ．０１〜５００ｎＭ）と共に室温で２時間予備インキュベーションした後、混合 物を氷上に置いた細胞培養物に加える。０℃で１時間後、吸着しなかったウイル スとペプチドを洗浄によって除去した後、予備加熱培地を加えた後３７℃で１８ 時間培養を継続する。細胞溶解物は、通常の方法で調製し、ＲＬＵ（相対的光単 位）で発現したルシフェラーゼ活性を測定する(Promega substrate，マジソン， ウィスコンシン；Lumat LB-9501ルミノメーター，Brethold Bioanalytical，ビ ルトバルト，ドイツ国)。 ペプチドＦＮ２０との競合の結果を、第３ａ図に示す。１０μＭのモル数まで は、有意な結果は得られないが、２５μＭ以上ではルシフェラーゼ活性は徐々に 増加する。特に、２５〜１００μＭでは、活性は１００倍に増加する。従って、 ペプチドＦＮ２０は、ウイルスの付着に対し促進効果を有する。これは、明らか な細胞毒性を示さず、またウイルスが予備付着した（０℃でのウイルス付着の工 程の後、細胞培養物に添加されたペプチド）または予備エンドサイトーシスした （ウイルスの付着および浸透の工程の後、細胞培養物に添加したペプチド）場合 には、ルシフェラーゼ遺伝子の発現に対して負の効果を示さない。 ペプチドＭＨ２０（第３ｂ図）の場合には、ルシフェラーゼ遺伝子の発現に若 干の増加が、０．０５〜２．５μＭのモル数に対して見られる（２．５μＭでは 、 活性は５〜６倍）。この現象に続いて、モル数を５μＭ以上用いると、ルシフェ ラーゼ活性は急激に減少し、２５μＭではコントロールと比較して１００倍まで 減少し、５０μＭではほぼ４桁間で減少し、ウイルスに結合していることを示し ており、細胞レセプターへの付着がブロックされていることを示している。取り 分け、５０μＭの濃度のペプチドＭＨ２０は、細胞毒性効果を示さず、ＡｄＬｕ ｃ３の予備付着または予備エンドサイトーシスの後は、リポーター遺伝子の発現 に影響を与えない。５０μＭのＭＨ２０の存在下でルシフェラーゼ活性が実際上 完全に阻害されることは、ウイルスが完全に中和されたことを反映している。実施例６： 合成ペプチドによるウイルス中和の血清特異性 野生型のアデノウイルスＡｄ５，Ａｄ２，Ａｄ３を、ＭＯＩを０．２〜２ｐｆ ｕ／細胞で変化させ、一定モル数（２５μＭ）の阻害ペプチドＭＨ２０と共に室 温で２時間予備インキュベーションする。混合物を、ＨｅＬａ細胞の存在下で０ ℃で１時間置き、吸着しなかったウイルスを上記と同じ条件下で除去した後、培 養を３７℃で継続する。ヘキソン、１００ｋタンパク質、ペントン、または線維 の合成の濃度を、感染の４８時間後に収集した細胞エキスについて免疫滴定(Woh lfart，1988，J．Virol.，62，2321-2328)によって計算する。 ウイルス付着相での２５μＭのＭＨ２０の存在下でＭＯＩが０．２〜２ｐｆｕ ／細胞でのＡｄ５またはＡｄ２によるＨｅＬａ細胞の感染を行った後、感染から ４８時間後にウイルスキャプシドヘキソン、１００ｋタンパク質、ペントン塩基 および線維のタンパク質の合成の阻害を行なった（１５〜３０倍）。一方、野生 型Ａｄ３を用いて、感染を同じ条件下で行なうときには、構造タンパク質の合成 は、１．５〜２倍の減少に止まり、これはＭＨ２０によるアデノウイルスの中和 が血清型依存性であることを示している。実施例７： ペプチドＦＮ２０およびＭＨ２０に対するＡｄ５線維のアフィニテ ィー 合成ペプチドＦＮ２０またはＭＨ２０の５，１０および２５μＭを、９６穴マ イクロタイタープレート(Nunc，Maxisorb)のポリスチレン表面に４℃で一晩固定 する。洗浄を行ない、ＰＢＳ緩衝液中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３％溶液 でブロックした後、ＰＢＳ緩衝液に採取され、標識された（［³⁵Ｓ］メチオニン および［³⁵Ｓ］システインで標識；比活性５０，０００〜６５，０００ｃｐｍ／ μｇタンパク質）Ｆ５−ＦＬ５８１の増加濃度により反応が生じる。ペプチドの いずれかに吸着された線維を、適当な溶液（ＩＭ尿素、ＩＭ ＮａＯＨおよび１ ％ＳＤＳ）で溶出した後、トリクロロ酢酸の存在下で沈澱させる。ＧＦ／Ｃフィ ルターに回収される沈澱の放射能量を液体シンチレーション分光計(Beckman LS- 6500)で計数し、解離定数（Ｋｄ）をScatchard（1949，Annls NY Acad．Sci.，5 1，660-672)によって決定する。 標識したＡｄ５のペプチドＭＨ２０に対するＫｄは、３．０±０．６ｎＭと評 価され、ペプチドＦＮ２０に対する実測値は８．０±１．９ｎＭである（いずれ の場合にもｎ＝３）。実施例８： Ａｄ５の感染性は、任意の細胞の表面におけるＭＨＣ−Ｉの発現に 依存する Ｂｕｒｋｉｔｔのリンパ腫から生成したＤａｕｄｉ系のＢリンパ芽球細胞は、 天然ではβ２−マイクログロブリンの発現を欠き、その結果、その表面にはクラ スＩ ＨＬＡ分子を持たない（Ｄａｕｄｉ ＨＬＡ−）。このＤａｕｄｉから誘 導した細胞系Ｅ８．１は、β２−マイクログロブリンをコードする遺伝子のトラ ンスフェクションにより生成し、その表面にクラスＩ ＨＬＡ分子の発現を回復 する(Ｄａｕｄｉ−ＨＬＡ＋；Quillet et al.，1988，J．Immunol.，141，17-20 )。 ＡｄＬｕｃ３の０℃での付着の実験は、Ｄａｕｄｉ ＨＬＡ−およびＤａｕｄ ｉ−ＨＬＡ＋細胞について、ＨｅＬａ細胞の場合に用いた量より３桁以上高い量 のＭＯＩで行なった（０．３〜１５０；ｆｕ／１０⁵細胞数）。感染後１８時間 の細胞溶解液で測定したルシフェラーゼ活性を、第４図に示す。感染がＤａｕｄ ｉ−ＨＬＡ＋細胞に関するときには、ルシフェラーゼ活性はＭＯＩに比例して規 則的増加し、５ｐｆｕ／１０⁵細胞数以上でプラトーに達する。Ｄａｕｄｉ−Ｈ ＬＡ−細胞に関しては、発光シグナルは、機能的ＨＬＡ分子が表面にある細胞で 見られたものと比較して極めて低い（３〜４桁の大きさ）。これらの実験は、細 胞表面でのＭＨＣ−Ｉの発現がＡｄ５の感染に必要であることを示している。実施例９： アデノウイルスの一次レセプターを模する二官能性リガンド この実施例では、２つのドメインであって、１個がアデノウイルス線維の頭を 認識し、他方が細胞表面タンパク質を認識するものを含む二官能性ペプチドの構 築を説明する。ペプチドを下記で用い、ＭＨ２０をＧＲＰ（ガストリン放出ペプ チド）に融合させる。２つの構造体が可能であり、２つのペプチドがＮ−対Ｃ− 末端の逆向きになっており、ペプチドＭＨ２０−ＧＲＰ（配列番号：２０）およ び逆配向のペプチドＧＲＰ−ＭＨ２０（配列番号：２３）を生じる。 第５図に示すように、このペプチドの細胞表面ＧＲＰレセプターへの結合には 、一次レセプターと同じタイプのウイルスレセプターの「ルアー」、すなわちＭ ＨＣクラスＩ分子のα２ドメインを作成する必要がある。明らかな結果は、ＧＲ Ｐレセプターを有する細胞の表面でのアデノウイルスの一次ウイルスレセプター の数を創製しまたは増加することである。 ヒト細胞（ＨｅＬａ）またはネズミ細胞（Ｓｗｉｓｓ−３Ｔ３またはＮＩＨ− ３Ｔ３，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）を濯いで、ペプチド５００マイクロＭを 含む等張液（ＰＢＳ）で０〜４℃でインキュベーションする。１時間後、溶液を 除き、すでに報告されているプロトコール（上記またはHong et al.，1997，EMB O J.，16，2294-2306を参照されたい）に準じて、ウイルス接種物（Ａｄ５Ｌｕ ｃ３）に替えた。ウイルスを０〜４℃で１時間インキュベーションして付着させ た後、過剰の吸着していないウイルスを４℃に予備冷却した培地で濯ぎ、細胞を 再度３７℃に予備加熱した培地の存在下で３７℃にする。ウイルスを３７℃でエ ンドサイトーシスし、次いでウイルスサイクルを３７℃で１８〜２０時間継続す る。 第６図に示されるように、ペプチドの非存在下で得られた曲線（コントロール 曲線：−ペプチドで表す）とＭＨ２０配向Ｎ末端側にペプチドが存在し、Ｃ末端 でＧＲＰに結合したもの（ＭＨ２０−ＧＲＰ）は、同一の傾斜を有することが観 察される。 一方、逆配向の、Ｎ末端側にＧＲＰが、Ｃ末端側にＭＨ２０がある場合には、 吸着したウイルスの数の増加は、ルシフェラーゼ活性の増加で示されるように、 有意であり、ＮＩＨ−３Ｔ３の８〜１０倍、ＨｅＬａ細胞の５〜６倍、およびＳ ｗｉｓｓ−３Ｔ３の２〜３倍である。ＧＲＰレセプターのリガンドである二官能 性ペプチドのＧＲＰ部分の結合により、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣ Ｉ−α２ ）のα２ドメインタイプのＡｄ５線維のレセプターの見掛けの数を増加すること ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/569 Ｌ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｓ Ｇ，ＵＳ (72)発明者 リュシ、カラヤン フランス国ポワティエ、リュ、デ、ザレー ヌ、ロメーヌ、11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（a）１位のロイシン残基から出発して、２５位のグルタミン残基で終る 配列番号：１、 （b）１位のアスパラギン残基から出発して、２６位のアスパラギン残基で終 る配列番号：２、 （c）１位のバリン残基から出発して、２５位のアスパラギン残基で終る配列 番号：３、 （d）１位のセリン残基から出発して、２５位のアルギニン残基で終る配列番 号：４、 （e）１位のアスパラギン残基から出発して、２５位のセリン残基で終る配列 番号:５ に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同なまたは同一のアミ ノ酸配列を含んでなるポリペプチドの使用であって、 アデノウイルスの宿主細胞への付着および／または前記アデノウイルスの前記 宿主細胞への侵入を行なうことができるようにしまたは促進するための使用。 ２． ポリペプチドが、１位のロイシン残基から出発して２５位のグルタミン 残基で終る配列番号：１に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸配 列と相同なまたは同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の使用。 ３． ポリペプチドが、クラスＩの主要な組織適合複合体（ＭＨＣ−Ｉ）の抗 原、および好ましくはこのＭＨＣ−Ｉの重鎖の全部または一部と相同なまたは同 一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２に記載の使用。 ４． ポリペプチドが、前記重鎖のα２ドメインの全部または一部と相同なま たは同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３に記載の使用。 ５． ポリペプチドが、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ抗原の全部また は一部と相同または同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３または４に 記載の使用。 ６． ポリペプチドが、 １位のアスパラギン残基から出発して、２６位のアスパラギン残基で終る配列 番号：２、 １位のバリン残基から出発して、２５位のアスパラギン残基で終る配列番号： ３、 １位のセリン残基から出発して、２５位のアルギニン残基で終る配列番号：４ 、 １位のアスパラギン残基から出発して、２５位のセリン残基で終る配列番号： ５ に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同なまたは同一のアミ ノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の使用。 ７． 前記ポリペプチドが、フィブロネクチンの全部または一部と相同または 同一なアミノ酸配列を含んでなる、請求項６に記載の使用。 ８． 前記ポリペプチドが、フィブロネクチンの少なくとも１つのタイプIII モジュールの全部または一部と相同または同一なアミノ酸配列を含んでなる、請 求項７に記載の使用。 ９． 前記アデノウイルスが血清型Ｃである、請求項１〜８のいずれか１項に 記載の使用。 １０． 前記アデノウイルスが血清型２または５である、請求項９に記載の使 用。 １１． 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現すること ができる細胞。 １２． 前記細胞が、前記ポリペプチドを過剰発現する、請求項１１に記載の 細胞。 １３． アデノウイルスの前記細胞への付着および／または前記アデノウイル スの前記細胞への侵入を行なうことができるようにしまたは促進するための、請 求項１１または１２に記載の細胞の使用。 １４． 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドによって行なわ れるアデノウイルスの宿主細胞への付着および／または前記アデノウイルスの前 記宿主細胞への侵入に影響を及ぼすためのリガンドの使用。 １５． 請求項１〜５、９および１０のいずれか１項に記載のポリペプチドに よって行なわれるアデノウイルスの前記宿主細胞への付着および／または前記ア デノウイルスの前記宿主細胞への侵入に負の影響を及ぼすための、請求項１４に 記載のリガンドの使用。 １６． リガンドが、１位のアルギニン残基から出発して、２０位のアルギニ ン残基で終る配列番号：６に示される配列に含まれる少なくとも６個の連続した アミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載のリ ガンドの使用。 １７． 請求項１および６〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドによっ て行なわれるアデノウイルスの前記宿主細胞への付着および／または前記アデノ ウイルスの前記宿主細胞への侵入に正の影響を及ぼすための、請求項１４に記載 のリガンドの使用。 １８． リガンドが、１位のアルギニン残基から出発して、２０位のセリン残 基で終る配列番号：７に示される配列に含まれる少なくとも６個の連続したアミ ノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載のリガン ドの使用。 １９． リガンドが、前記アデノウイルスに対する解離定数（ｋｄ）が０．０ １〜１００ｎＭであり、特に０．１〜５０ｎＭである、請求項１４〜１８のいず れか１項に記載のリガンドの使用。 ２０． 請求項１６、１８または１９に記載のリガンド。 ２１． リガンドが、アデノウイルス起源である、請求項１４に記載のリガン ドの使用。 ２２． 前記リガンドが、アデノウイルスの線維、特に頭ドメインに由来する 、請求項２１に記載の使用。 ２３． 前記リガンドが、血清型５のアデノウイルスの線維から誘導され、１ 位のロイシン残基から出発して、１８位のアスパラギン酸残基で終る配列番号： ８に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同一のアミ ノ酸配列を含んでなる、請求項１〜５、９または１０のいずれか１項に記載のポ リペプチドと相互作用するための、請求項２２に記載の使用。 ２４． 前記リガンドが、血清型２のアデノウイルスの線維から誘導され、１ 位のトレオニン残基から出発して、１６位のバリン残基で終る配列番号：９に示 される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同一のアミノ酸配 列を含んでなる、請求項１〜５、９または１０のいずれか１項に記載のポリペプ チドと相互作用するための、請求項２２に記載の使用。 ２５． 前記リガンドが、血清型５のアデノウイルスの線維から誘導され、１ 位のロイシン残基から出発して、１４位のトレオニン残基で終る配列番号：１０ に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同一のアミノ 酸配列を含んでなる、請求項１または６〜１０のいずれか１項に記載のポリペプ チドと相互作用するための、請求項２２に記載の使用。 ２６． 前記リガンドが、血清型２のアデノウイルスの線維から誘導され、１ 位のアスパラギン残基から出発して、１３位のアスパラギン残基で終る配列番号 ：１１に示される配列の少なくとも６個の連続したアミノ酸と相同または同一の アミノ酸配列を含んでなる、請求項１または６〜１０のいずれか１項に記載のポ リペプチドと相互作用するための、請求項２２に記載の使用。 ２７． アデノウイルスの感染を抑制しまたは減少させることを目的とする医 薬の製造のための、請求項１４〜２６のいずれか１項に記載のリガンドの使用。 ２８． アデノウイルス、特に組換えアデノウイルスの感染を促進しまたは助 成することを目的とする医薬の製造のための請求項１４〜２６のいずれか１項に 記載のリガンドの使用。 ２９． 適当な試料のウイルスに対する細胞レセプターを選択しまたは同定す る方法であって、 （a）前記ウイルスの前記細胞レセプターへの付着を決定する前記ウイルスの 表面タンパク質の全部または一部を含んでなるウイルス起源の試薬の不活性支持 体への固定、 （b）前記試料の所定時間のインキュベーション、 （c）前記ウイルス起源の試薬に対して指定された抗体の全部または一部によ る工程(b)で保持された試料の溶出、 （d）工程(c)で溶出された試料の分析 を含んでなる、方法。 ３０． 適当な試料の細胞レセプターへのウイルスの付着を決定するウイルス タンパク質の部分を選択しまたは同定する方法であって、 （a）前記ウイルスタンパク質に対して指定された抗体の全部または一部を不 活性支持体への固定、 （b）前記試料の所定時間のインキュベーション、 （c）前記ウイルスタンパク質の全部または一部を含んでなるウイルス起源の 試薬による工程(b)で保持された試料の溶出、および （d）工程(c)で溶出された試料の分析 を含んでなる、方法。 ３１． 前記試料が、ペプチドモチーフを発現するペプチドライブラリーまた はファージライブラリーである、請求項２９または３０に記載の方法。 ３２． 前記ウイルスがアデノウイルス、特に血清型Ｃであり、ウイルス起源 の試薬が、繊維の、特にアデノウイルスのヘッドの線維の全部または一部であり 、抗体が、ウイルスの宿主細胞の表面への付着の阻害剤である、請求項２９〜３ １のいずれか１項に記載の方法。 ３３． アデノウイルスの天然の細胞レセプター以外の細胞表面タンパク質へ 前記アデノウイルスをターゲッティングするための二官能性リガンドの使用であ って、前記二官能性リガンドが前記アデノウイルスの線維と相互作用可能な第一 のリガンド部分と、前記細胞表面タンパク質と相互作用可能な第二のリガンド部 分と、場合によっては第一および第二のリガンド部分の間にスペーサーを含んで なり、前記第一のリガンド部分が請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のリガ ンドの特徴を有する、使用。 ３４． 前記第一のリガンド部分が配列番号：６に含まれる少なくとも６個の 連続したアミノ酸と相同または同一のアミノ酸配列を含んでなり、更に具体的に は１位のアルギニン残基から出発し、２０位のアルギニン残基で終る配列番号： ６と同一のアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載の使用。 ３５． 前記二官能性リガンドが、 （i）１位のアルギニン残基から出発し、３５位のメチオニン残基で終る配列 番号：２２、または （ii）１位のリシン残基から出発し、３５位のアルギニン残基で終る配列番号 ：２３ に示されている配列の全部または一部と相同または同一のアミノ酸配列を含んで なる、請求項３３または３４に記載の使用。 ３６． 請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の二官能性リガンド。 ３７. 表面に請求項３６に記載の二官能性リガンドを有する細胞。