FR2758885A1 - Methode pour selectionner ou identifier un recepteur cellulaire d'un virus dans un echantillon approprie - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet une méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus dans un échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes: (a) immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus déterminant l'attachement dudit virus audit récepteur cellulaire (b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon, (c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un anticorps dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et (d) analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).par.

Description

La présente invention a pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et/ou d'un module de type III de la fibronectine pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus sur une cellule hote et/ou son entrée au sein de celle-ci. L'invention vise également l'utilisation d'un ligand capable de moduler l'infectivité d'un adénovirus vis à vis d'une cellule hôte, médiée par l'un ou l'autre des polypeptides cités ci-dessus. Enfin, I'invention concerne une méthode de biorpaillage pour identifier ou sélectionner un récepteur cellulaire d'un adénovirus ou un de ces ligands, notamment d'origine virale.

Les adénovirus sont des virus à ADN d'un large spectre d'hôte. Ils ont été mis en évidence dans de nombreuses espèces animales et peuvent infecter divers types cellulaires. De nombreux sérotypes ont été caractérisés au sein de chaque espèce qui présentent une organisation génomique et un cycle infectieux comparables. D'une manière générale, le génome adénoviral est constitué d'une molécule d'ADN linéaire, bicaténaire et d'environ 36kb contenant les gènes codant pour les protéines virales et à ses extrémités deux répétitions inversées (désignées ITR) intervenant dans la réplication et la région d'encapsidation.

Les adénovirus se répliquent dans les noyaux des cellules infectées. Le cycle infectieux se déroule en 2 étapes. La phase précoce précéde l'initiation de la réplication et permet de produire les protéines précoces régulant la réplication et la transcription de l'ADN viral. Ces étapes sont suivies de la phase tardive au cours de laquelle sont synthétisées les protéines structurales qui constituent les particules virales. L'assemblage des nouveaux virions prend place dans le noyau.

Dans un premier temps, les protéines virales s'assemblent de manière à former des capsides vides de structure icosaédrique, dans lesquelles l'ADN adénoviral est encapsidé. Les particules virales sont libérées et susceptibles d'infecter d'autres cellules permissives. A cet égard, la fibre et le penton base présents à la surface des capsides jouent un rôle critique dans l'attachement cellulaire des virions et leur internalisation.

L'adénovirus se lie à la surface des cellules permissives par l'intermédiaire de la fibre trimérique et d'un récepteur cellulaire jusqu'à présent, non identifié.

Puis, la particule est internalisée par endocytose par liaison du penton base aux intégrines cellulaires avss3 et avss5 (Belin et Boulanger, 1993, J. Gen. Virol. 7d, 1485-1497, Mathias et al., 1994, J. Virol. 68, 6811-6814 , Nemerow et al., 1994, Trends Cell. Biol. 4, 52-55 , Wickham et al., 1993, Cell 73, 309-319
Wickham et al., 1994, J. Cell Biol. 127, 257-264). La fibre d'Ad2 comporte 580 acides aminés (aa) dont la séquence est divulguée dans Herissé et al. (1981,
Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042). Celle d'Ad 5 présente 582 acides aminés (Chroboczek et Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554). Sa masse moléculaire est de 62 kDa, mais la fibre native se comporte comme une molécule de 160-180 kDa confirmant son assemblage sous forme d'un trimère.

La fibre est composée de 3 domaines (Chroboczek et al., 1995, Current
Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200) (1) En N-terminal, la "queue" très conservée d'un sérotype à l'autre, interagit
avec le penton base et assure l'ancrage de la molécule dans la capside.

(2) La "tige" est une structure en bâtonnet de longueur variable selon les
sérotypes. Par exemple, la tige de la fibre d'Ad5 contient 22 répétitions
d'un motif de 15 résidus qui pourraient adopter une conformation en
feuillet p. Le nombre de ces répétitions diffère d'un sérotype à l'autre, ce
qui explique les variations de longueur.

(3) Enfin, à l'extrémité distale de la tige, la "tête" ou sphéricle terminale est
une structure globulaire contenant les signaux de trimérisation (Hong et
Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078 , Novelli et Boulanger, 1991, J.

Biol. Chem. 266, 9299-9303 , Novelli et Boulanger, 1991, Virology 1 < S'5,
365-376). La plupart des données expérimentales montrent que c'est le
domaine de la tête qui est responsable de la liaison aux cellules
permissives.

La complexité de l'attachement adénoviral laisse supposer qu'il serait sérotype dépendant et que plusieurs protéines cellulaires pourraient y participer.

En ce qui concerne l'Ad2, Hong et Boulanger (1995, EMBO J. 14, 4714-4727) ont identifié un certain nombre de motifs peptidiques trouvés dans plusieurs protéines cellulaires de surface susceptibles d'interagir avec les protéines capsidaires (penton base et fibre), en particulier les modules de type III 5 et 14 de la fibronectine humaine. Les auteurs ont opéré par immobilisation sur un support inerte du penton base ou de la fibre (ligand) sur laquelle ils Ont fait réagir une bibliothèque de phages exprimant des hexapeptides aléatoires (désignés phagotopes). Les phages adsorbés, qui en théorie expriment des phagotopes interagissant avec un motif porté par la protéine adénovirale, sont ensuite élués soit classiquement à pH acide ou par compétition avec l'autre partenaire capsidaire non immobilisé (éluant). Cependant, le récepteur cellulaire des adénovirus et la région de la tête précisément impliquée dans la liaison au récepteur n'ont à ce jour pas encore été clairement identifiés.

On a maintenant procédé à une nouvelle technique de "biorpaillage" (pour biopanning en anglais) dans laquelle le ligand immobilisé est constitué par le domaine de la tête de la fibre d'Ad5 et l'éluant par un anticorps neutralisant dirigé contre cette dernière et isolé deux classes de phagotopes selon l'anticorps mis en oeuvre. La première correspond à une séquence conservée au sein du domaine a-2 des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (a-2 MHC-I) et la seconde à une séquence retrouvée dans les modules III de la fibronectine humaine (FNIII). Les données reportées dans les exemples qui suivent, soutiennent l'hypothèse que le a-2 MHC-I constitue le récepteur primaire des adénovirus de sérotypes C et confirment la participation des FNIII à titre de co-récepteur ou co-facteur. On a également mis en évidence les régions de ces deux récepteurs et de la fibre interagissant l'une avec l'autre. En outre, on a généré un peptide antagoniste reproduisant le motif du domaine ct-2
MHC-I qui neutralise l'attachement des adénovirus et un peptide agoniste reproduisant les motifs FNIII qui stimule l'attachement.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée (a) dans la SEQ 1D NO: I commençant avec le résidu leucine en position I et
finissant avec le résidu glutamine en position 25, (b) dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position
1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, (c) dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position I et
finissant avec le résidu asparagine en position 25, (d) dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu sérine en position 1 et
finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou (e) dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position
I et finissant avec le résidu sérine en position 25 pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule hôte.

Aux termes de la présente invention, on entend par "polypeptide" toute molécule constituée par un enchaînement d'au moins 6 et, de préférence d'au moins 8, acides aminés. Le terme polypeptide comprend aussi bien des molécules peptidiques de courte longueur (de 6 à quelques dizaines de résidus) que des molécules de longueur plus importante (jusqu'à plusieurs centaines de résidus), à la condition toutefois de permettre l'utilisation envisagée. On précise qu'un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention peut dériver d'un polypeptide natif tel que trouvé dans la nature, en particulier chez l'homme, ou d'une partie de celui-ci. Il peut également être chimère et comprendre des résidus supplémentaires d'une origine quelconque fusionnés en N et/ou Cterminal et/ou insérés de manière à former un cadre de lecture ouvert. On peut également mettre en oeuvre un mutant obtenu par mutation, délétion, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés par rapport aux séquences divulguées dans les identificateurs de séquence (SEQ ID).

Un polypeptide préféré dans le cadre de la présente invention comprend en outre des éléments appropriés pour assurer son ancrage dans une membrane cellulaire ou sa présentation à la surface d'une cellule. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. A titre vindicatif, on mentionne la présence d'un peptide signal généralement associé en position N-terminale et d'une région transmembranaire présentant un degré d'hydrophobicité élevé. Mais on peut également avoir recours à d'autres techniques, par exemple chimiques, pour ancrer ou lier un polypeptide à une membrane ou une surface cellulaire.

Par "séquence d'acides aminés homologue", on entend une séquence présentant un degré d'homologie d'au moins 70 %, de manière avantageuse, d'au moins 80 %, de manière préférée, d'au moins 90 % avec au moins 6 acides aminés continus d'une des séquences citées. Le terme identique fait référence à 100 % d'homologie. L'homme du métier connaît les règles générales qui permettent de calculer le degré d'homologie entre deux séquences. On procède généralement par alignement des séquences éventuellement à l'aide de programmes d'ordinateur spécialisés. II peut être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants. Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rapport au nombre total de positions.

Par "attachement d'un adénovirus à une cellule hôte", on entend la liaison de la particule virale à la cellule. Par "entrée d'un adénovirus au sein d'une cellule hôte", on désigne la pénétration du virus à l'intérieur de la cellule hôte.

L'attachement et/ou l'entrée sont de préférence médié(s) au moins en partie par le(s) polypeptide(s) en usage dans le cadre de la présente invention par interaction avec la capside adénovirale. Bien entendu, d'autres molécules polypeptidiques ou non peuvent également participer à ces processus reconnus dans le domaine de l'art comme complexes et multifactoriels. Ils peuvent être évalués par toute technique de l'art, telles que celles décrites ci-après mettant en oeuvre une lignée cellulaire permissive et des particules marquées radioactivement ou exprimant un gène reporter par exemple le gène de la luciférase. A 0 C, seul l'attachement peut avoir lieu, la pénétration virale nécessitant une température de 37"C.

Aux fins de la présente invention, un adénovirus peut être d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine...) ou hybride comprenant des fragments de génome. Ces virus et leur génome sont décrits dans la littérature (voir par exemple Graham et Prevec, Methods in Molecular Biology, Vol 7
Gene Transfer and Expression Protocols; Ed E.J. Murray, 1991, The Human
Press Inc., Clinton, NJ). On préfère mettre en oeuvre un adénovirus recombinant défectif pour la réplication et exprimant notamment un gène d'intérêt thérapeutique. Avantageusement, le génome adénoviral est modifié par délétion ou mutation de séquences essentielles à la réplication et, en particulier, comprises dans les régions El, E2, E4 et/ou Ll-L5 (voir par exemple la demande internationale WO 94/28152).

Selon une première variante, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ 1D NO: 1 commençant avec le résidu alanine en position I et finissant avec le résidu isoleucine en position 24.

De manière avantageuse, un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence en acide aminé homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I) et, de préférence, de la chaîne lourde de ce dernier.

Toutes les cellules d'un organisme présentent sur leur membrane des molécules appelées antigènes d'histocompatibilité qui définissent chaque individu. Les gènes correspondants, plus d'une dizaine, sont localisés sur le chromosome 6 chez l'homme et présentent un polymorphisme important, ce qui permet d'assurer une grande variabilité de ces marqueurs d'identité. II existe deux catégories différentes de ces antigènes d'histocompatibilité, respectivement de classe I et Il, dont la structure et les fonctions sont distinctes. Les molécules de classe I, appelées HLA (pour Human Leukocyte Antigen en anglais) interviennent pour présenter les peptides antigéniques à la surface cellulaire et jouent un rôle essentiel dans les réponses immunitaires antivirales exercées par les lymphocytes T cytotoxiques.

Les molécules MHC-I sont des hètérodimères composés d'une chaîne légère non MRC désignée Q2-microglobuline (ss2m) et d'une chaîne lourde codée par les gènes MHC, liées de manière non covalente. La chaîne lourde est une protéine membranaire dont la partie N-terminale est orientée à l'extérieur de la cellule alors que la portion C-terminale est cytoplasmique. La première comprend 3 domaines désignés ccl, a2 et a3 d'environ 90 acides aminés chacun.

Elle est suivie d'une région transmembranaire d'environ 25 acides aminés puis de la région C-terminale d'une trentaine d'acides aminés. La plupart des variations entre les produits des différents allèles sont localisées dans les domaines Ct 1 et a2, le domaine a3 étant relativement conservé et la ss2m invariable (pour une revue et la comparaison de séquence entre les membres des MHC-I, voir
Bjorkman et Parham, 1990, Annu. Rev. Biochem. 59, 253-288).

Parmi les polypeptides convenant aux fins de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les antigènes HLA A, B, C, D, E et F ou des polypeptides en dérivant.

D'une manière particulièrement avantageuse, le polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence homologue ou identique à tout ou partie de la région C-terminale du domaine a2 de la chaîne lourde des MHC-I et, plus particulièrement, à la partie centrée sur le résidu tryptophane en position 167, notamment celle s'étendant des résidus 156 à 180 (SEQ ID NO: 1). La numérotation à laquelle il est fait référence est conforme à celle utilisée par exemple dans Bjorkman et Parham (1990, .,q)ra).

Selon une autre variante, un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée - dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position
1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, - dans la SEQ LD NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et
finissant avec le résidu asparagine en position 25, - dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu sérine en position 1 et
finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou - dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position
I et finissant avec le résidu sérine en position 25.

Un polypeptide préféré comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à la fibronectine et, en particulier, à l'un au moins de ses modules de type III et, notamment, aux modules FNIII 1, 4, 5 et/ou 14.

Bien entendu, il peut en comprendre plusieurs. On peut également envisager l'utilisation de la fibronectine humaine ou d'un peptide en dérivant, par exemple par mutation ou fragmentation. A titre d'information, la fibronectine codée par un gène unique est une molécule intervenant dans les phénomènes d'adhésion et de contact cellulaire. Sa séquence et ses caractéristiques sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier (voir en particulier Bork et Doolittle, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8990-8994 et Dickinson et al., 1994, 23xi, 1079-1092). Elle est composée de 14 modules dits de type 111 (numérotés de 1 à 14) dont la séquence primaire peut varier mais dont la conformation en feuillet ss est conservée.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, un polypeptide tel que défini ci-dessus est plus particulièrement destiné à permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus de sérotype C à une cellule hôte et/ou son entrée dans cette dernière. Parmi les adénovirus envisageables, on peut citer plus particulièrement les sérotypes 2 et 5.

La présente invention concerne également une cellule hôte capable d'exprimer un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention et son utilisation pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus à sa surface et/ou l'entrée dudit adénovirus. Divers types de cellules hôtes peuvent être considérés. II peut s'agir de cellules d'une origine quelconque, par exemple de microorganismes, levures, insectes, plantes, animales. On préférera notamment une cellule de mammifère et, en particulier, une cellule humaine de type primaire, tumorale ou issue d'une lignée cultivabie iii vilro. Elle peut avoir une origine hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage...), hépatique, rénale, du système nerveux central, fibroblaste, épithéliale, pulmonaire ou musculaire (myocyte, myoblaste, cellule satellite, cardiomyocyte...). Une cellule particulièrement préférée est ou dérive de la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire par intégration de la région adénovirale El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). On indique que l'expression d'un ou plusieurs polypeptides en usage dans le cadre de la présente invention à la surface d'une cellule hôte n'exprimant pas habituellement les MHC-I et/ou la fibronectine devrait permettre son infectivité par un adénovirus. Elle pourrait être utilisée comme nouvelle cellule productrice de vecteurs adénoviraux. On peut également envisager le cas d'une surexpression dans une cellule exprimant naturellement ledit polypeptide. Une lignée de surexpression dérivant de la lignée 293 devrait permettre d'améliorer les rendements de production d'un adénovirus d'intérêt. Bien entendu, le polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention peut être associé à la cellule par des moyens chimiques ou par l'intermédiaire d'un ligand reconnaissant une protéine de surface cellulaire. Mais, on peut également envisager une expression par les techniques de l'ADN recombinant. Un tel mode de réalisation est à la portée de l'homme de l'art. A titre indicatif, la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide en question peut être isolée (par les techniques standards de PCR ou clonage) ou synthétisée chimiquement avant d'être insérée dans un vecteur d'expression conventionnel sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés, le vecteur étant introduit dans la cellule hôte par toute technique de l'art. La cellule hôte en usage dans le cadre de la présente invention peut également être modifiée de manière à complémenter un adénovirus défectif par transfection de fragment(s) approprié(s) de génome adénoviral.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand capable d'influencer l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou son entrée au sein de cette dernière médiés par un polypeptide tel que défini cidessus. Le ligand en usage dans l'invention peut être de nature quelconque. On peut citer par exemple les peptides, les hormones, les anticorps ou leurs dérivés et, notamment, les anticorps simple chaîne de type scFv (pour single chain fragment variable en anglais) et les récepteurs solubles dépourvus de leur région transmembranaire. En particulier, un tel ligand peut dériver d'un polypeptide en usage dans la présente invention. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, le ligand peut avoir une influence négative (antagoniste) ou positive (agoniste). De préférence, un ligand préféré présente une constante de dissociation à l'égard de l'adénovims comprise entre 0,01 et 100 nM, avantageusement entre 0, 1 et 50 nM et, de manière tout à fait préférée, entre 0,5 et 10 nM.

Dans le cas d'un antagoniste, l'interaction du ligand avec la fibre permettra de diminuer ou inhiber les processus d'attachement et/ou d'entrée d'un adénovirus. Dans ce contexte, un ligand particulièrement préféré est basé sur un polypeptide tel que défini dans la SEQ ID NO: I. A titre d'exemple, on peut citer un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 6 commençant avec le résidu arginine en position I et finissant avec le résidu arginine en position 20. On préférera avoir recours au peptide désigné MH20 dans les exemples qui suivent.

Dans le cas d'une influence positive, le ligand en usage dans le cadre de la présente invention est utilisé pour permettre ou stimuler l'attachement et/ou l'entrée des adénovirus. Un ligand convenant aux fins de l'invention comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 7 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu sérine en position 20. Un exemple préféré consiste en le peptide désigné ci-après FN20.

La présente invention a également trait à un ligand comprenant une séquence en acides aminés homogue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 6 ou 7.

Mais, il peut également s'agir d'un ligand d'origine adénovirale. Selon ce mode de réalisation, un ligand préféré dérive de la fibre d'un adénovirus, en particulier, de la partie de la tête interagissant avec les polypeptides précités. Un motif peptidique choisi dans cette région devrait donc influencer l'infectivité des adénovirus à l'égard d'une cellule hôte exprimant le polypeptide.

Avantageusement, on a recours à un ligand recouvrant les résidus 438 à 486 de la fibre d'un adénovirus. Plus particulièrement, un ligand d'un polypeptide tel que défini par la SEQ ID NO: I dérive de préférence d'un Ad5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 8, débutant à l'acide aminé leucine en position I et se terminant à l'acide aminé acide aspartique en position 18. Un ligand également envisageable peut dériver de la fibre d'un adénovirus de sérotype 2 et comprendre une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 9 débutant au résidu thréonine en position I et se terminant au résidu valine en position 16.

Le ligand d'un polypeptide tel que défini par les SEQ ID NO: 2 à 5 est plus particulièrement caractérisé par une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés de la séquence telle que montrée dans la
SEQ ID NO: 10 débutant au résidu leucine en position 1 et se terminant au résidu thréonine en position 14 (Ad5) ou dans la SEQ ID NO: 11 débutant au résidu asparagine en position 1 et se terminant au résidu asparagine en position 13 (Ad2).

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber ou diminuer une infection par un adénovirus. Dans ce contexte, on préférera l'usage d'un ligand antagoniste dans un but thérapeutique ou prophylactique. L'utilisation d'un ligand selon l'invention, de préférence agoniste, convient à la préparation d'un médicament destiné à favoriser ou faciliter une infection par un adénovirus, et, en particulier, d'un adénovirus recombinant porteur d'un gène thérapeutique à visée de thérapie génique (curative) ou anti-virale (SIDA) ou anti-cancéreuse.

Un tel médicament trouve son utilité par exemple en association avec les traitements de thérapie génique afin d'améliorer l'infection virale chez un patient traité par un adénovirus recombinant. On peut envisager une voie d'administration parentérale, orale ou encore par aérosol. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage et la formulation appropriés varient en fonction de différents paramètres, par exemple de l'individu, de la maladie à traiter, de l'effet désiré, de la voie d'administration ou encore de l'adénovirus en cause.

La présente invention concerne également une méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus dans un échantillon approprié, comprenant (a) I'immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale
comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus
déterminant son attachement au récepteur cellulaire, (b) I'incubation pendant un temps déterminé avec l'échantillon, (c) I'élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un
anticorps dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et (d) I'analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).

Le support inerte peut être sans limitation sous une forme quelconque (cône, tube, puits, billes ou analogues) et d'un matériau quelconque (naturel, de synthèse tels que les polymères, modifié chimiquement ou non...). La fixation du réactif sur le support inerte peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, on procédera de préférence par adsorption c'est à dire de manière non covalente bien que l'établissement de liaisons covalentes puisse également être considéré. De manière indirecte, on peut fixer préalablement un composé anti-réactif capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support inerte. Selon un mode de réalisation avantageux,
I'échantillon est constitué par une bibliothèque dite aléatoire et, en particulier d'expression (fragments génomiques, cADN) ou peptidique ou, de manière préférée, de phages exprimant des motifs peptidiques (phagotopes). De telles bibliothèques sont décrites dans la littérature ou accessibles commercialement.

Dans le but de sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un adénovirus, on met de préférence en oeuvre à titre de réactif d'origine virale, tout ou partie de la fibre et, notamment, de la tête d'un adénovirus et, à titre d'éluant, un anticorps anti-fibre neutralisant (inhibiteur de l'attachement du virus à la surface de la cellule hôte). La fibre ou ses fragments peuvent être produits par voie recombinante et les anticorps par la technique d'hybridome ou par génie génétique (production d'anticorps simple chaîne scFv, Fab...). On indique que la plupart des anticorps anti-fibre sont neutralisants. L'analyse est réalisée par comparaison de la séquence de l'échantillon élué avec les banques de données.

Une telle analyse est à la portée de l'homme de l'art.

Enfin, la présente invention vise également une méthode pour sélectionner ou identifier la partie d'une protéine virale déterminant l'attachement d'un virus à un récepteur cellulaire dans un échantillon approprié, comprenant (a) I'immobilisation sur un support inerte de tout ou partie d'un anticorps
dirigé contre ladite protéine virale, (b) I'incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon, (c) I'élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec un réactif d'origine virale
comprenant tout ou partie de ladite protéine virale, et (d) I'analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).

Les modes de réalisation spécifiques cités précédemment peuvent également s'appliquer dans ce contexte.

La Figure 1 présente les phagotopes obtenus après biorpaillage utilisant l'anticorps lu6.3 (a) ou 7A2.7 (b) à titre de ligand. Les motifs peptidiques des phagotopes sont alignés par rapport à la séquence de la tête d'Ad5 (le résidu méthionine initiateur de la fibre représentant le +1. Les régions formant des structures feuillets (Xia et al., 1994, supra) sont soulignées et indiquées par (D), (E) et (F). Les résidus identiques ou conservés dans les séquences sont indiqués en gras.

La Figure 2 présente les phagotopes obtenus après biorpaillage utilis mais pas l'entrée. L'activité luciférase est évaluée après 18 h de culture à 37"C.

Les valeurs RLU représentent la moyenne de trois expériences séparées.

EXEMPLES
Les cellules HeLa (ATCC CCL2) sont cultivées en monocouches selon les techniques de l'art. On utilise de préférence un milieu DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's Medium , Gibco) contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) inactivé à la chaleur, de la L-glutamine et des antibiotiques habituels. Les cellules Daudi HLA- (ATCC CCL213) et HLA+ (Quillet et al., 1988, J.

Immunol. 141, 17-20) sont maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémenté avec 15 % de FCS.

L'AdS sauvage et l'Ad5Luc3 recombinant sont propagés dans les cellules
HeLa par les techniques standards. A titre indicatif, Ad5Luc3 est un adénovirus compétent pour la réplication qui contient le gène luciférase placé sous le contrôle du promoteur précoce du virus SV40 (Virus simien 40) inséré dans la région E3 du génome adénoviral (Mittal et al., 1993, Virus Research 2S, 6790).

EXEMPLE 1 Production d'anticorps monoclonaux (mAb! capable
d'inhiber l'attachement de l'Ad5 aux cellules permissives.

Les mAbs murins 1D6.3 et 7A2.7 ont été générés par les techniques classiques en injectant la tête de la fibre d'Ad5 produite dans les bactéries par voie recombinante (Henry et al., 1994, J. Virol. , 5239-5246) à des souris
Balb/C. La fusion et l'obtention de clones d'hybridomes sont des techniques conventionnelles à la portée de l'homme de l'art. Les clones sécretant sont selectionnés par leur reconnaissance de l'antigène qui a servi à l'immunisation en
ELISA. On indique qu'ils présentent une activité neutralisante à l'égard des virions (Michael et al., en préparation).

Séro-réacti vi lé des anlicorl,s monock,rmltx IDu. 3 ci 7A 2. 7.

La réactivité des anticorps est testée à l'égard du domaine de la tête de la fibre de 3 sérotypes différents (Ad2, Ad5 et Ad3) préparé par voie recombinante. Les séquences correspondantes sont isolées par PCR (Polymérase Chain Reaction) à partir d'ADN génomique viral puis introduites dans le virus AcNPV (Aulographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus) sous le contrôle du promoteur polyhedrine (Luckow et Summer, 1989, Virology 170, 31-39). Les protéines recombinantes sont exprimées dans les cellules d'insecte
Sf9 (Spodoplera fillgiluerda). La technologie générale est détaillée dans
Karayan et al. (1994, Virology 202, 782-796) et Novelli et Boulanger (1991,
Virology 185, 365-376). Plus précisément, les séquences Ad5 portant le dernier motif répété de la tige suivi de la tête de la fibre, sont clonées à l'aide des amorces représentées aux SEQ ID NO: 12 et 13. L'amorce sens correspond aux nucléotides 32164 à 32205 du génome Ad5 (Chroboczek et Jacrot, 1987,
Virology 161, 549-554), inclut 4 mismatch de manière à créer un site BamH1 et à remplacer la thréonine en position 388 de la fibre native par un codon ATG initiateur. L'amorce antisens correspond aux nucléotides 32919 à 32883 du génome Ad5 et permet de créer un site Kptîî pour faciliter les étapes ultérieures de clonage. La protéine recombinante récoltée dans les surnageants de cellules
Sf9 est désignée F5-AT386. La tête de 1'Ad2 est produite à partir du vecteur baculovirus décrit dans Louis et al. (1994, J. Virol. 68, 4104-4106). Le produit d'expression désigné F2-AT388 débute en position 388 (par remplacement de l'Ala de la séquence native par une Met) et porte, outre le domaine de la tête, le dernier motif répété de la tige. Enfin, pour les séquences correspondantes de l'Ad3, on utilise une amorce sens (SEQ ID NO: 14) conçue pour introduire un site de clonage Neol et remplacer les codons Asn et Ser en position 124 et 125 par des codons Met et Ala respectivement. L'amorce antisens (SEQ ID NO: 15) introduit un site KynI. Le produit d'expression est désigné F3-AT124.

Les cupules d'une plaque ELISA sont recouvertes par la protéine recombinante F5-AT386, F2-AT388 ou F3-AT124 sur laquelle on fait réagir le mAb 1D6.3 ou 7A2.7 puis un anticorps anti-souris marqué (par exemple à la phosphatase ou la péroxidase). Une réaction positive est observée à l'égard de la protéine recombinante F5-AT386 native. Aucune réaction n'est détectée dans les puits contenant la protéine F5-AT386 dénaturée au SDS ni ceux contenant les produits F2-AT388 et F3-AT124 natifs ou dénaturés. Ces données suggèrent que ces anticorps reconnaissent un épitope conformationnel spécifique du sérotype C.

Effet itihibiteur des atzJicorps monoclonaux ld6.3 et 7A 2. 7 sir Iattachemenl ce liii laire de !'Ad5.

On procède à un test de microliaison sur cellules HeLa en culture à l'aide de virions Ad5 marqués à la valine [14C] (activité spécifique de 2200 à 2500 cpm/ 108 virions) suivi d'une autoradiographie in sitti (Silver et Anderson, 1988,
Virology 165, 377-387). Pour ce faire, les cellules à l'état de semi confluence sont mises en présence d'une quantité constante de virions radioactifs (103 cpm pour 5x 104 cellules) à une multiplicité d'infection (MOI) de 1000 virions par cellule pendant 1 h à 0 C en présence de mAb 1D6.3 ou 7A2.7 (dilutions au 1:10, 1:8, 1:4 et 1:2 des surnageants d'hybridomes respectifs dont la concentration en mAb est estimée à 0,1-0,2 tg/ml, ce qui correspond à un excès en mAb par rapport aux virions présents dans l'innoculum de 100, 250, 500 et 1000 respectivement). Les cellules sont ensuite lavées en présence de PBS, fixées par 0, i % de paraformaldéhyde dans du PBS, séchées et recouvertes par l'émulsion K4 sous forme de gel (lîford Nuclear Research). Après une exposition d'une semaine et développement (agent de développement D19B,
Kodak), les échantillons sont colorés brièvement par 0,5 % de bleu de toluidine repris dans H2O et examinés sous microscope. La densité des grains d'argent réduit autour du contour des cellules est représentatif du nombre de virions [14C] liés à la surface cellulaire.

En l'absence de mAb anti-tête ou à une concentration faible (dilution 1:10), un halo sombre de grains d'argent réduit est visible autour des cellules indiquant une adsorption des virions à leur surface. Une réduction du halo dépendante de la concentration en mAb est observée pour les dilutions 1:8, 1:4 et 1:2. Ces résultats traduisent un blocage de la liaison de la tête adénovirale au récepteur cellulaire primaire dû aux mAb 1D6.3 et 7A2.7 dirigés contre cette partie de la fibre. Une comparaison de la surface des halos pour les mêmes dilutions montre que l'anticorps 1D6.3 est plus inhibiteur de l'attachement de l'Ad5 au récepteur cellulaire des HeLa que le mAb 7A2.7.

EXEMPLE 2 : Identification des épitopes des mAb 1D6.3 et 7A2.7.

Les épitopes de la fibre étant présumés etre conformationnels (Fender et al., 1995, Virology 214, 110-117), la méthode classique d'identification des épitopes par balayage de peptides n'est pas appropriée. On procède selon une technique de biorpaillage dérivée de celles décrites par Smith et Scott (1993,
Methods Enzymol. 217, 228-257) et Hong et Boulanger (1995, EMBO J. 14, 4714-4727). Dans ce cas, le mAb 1D6.3 ou 7A2.7 est adsorbé une nuit à 40C sur une plaque de microtitration (Nunc Immunomodule MaxiSorp F8) à une concentration de 1 pg/puits dans un tampon carbonate de sodium 0, 1 M pH9,6.

Les anticorps immobilisés sont mis en contact d'une bibliothèque de phages exprimant des hexapeptides (phages fUSES , Scott et Smith, 1990, Science 24 386-390). Dans une seconde étape les phages retenus sont élués soit par un tampon d'élution acide conventionnel soit, plus sélectivement, par compétition en présence d'un excès de protéine recombinante F5-AT386. Les motifs hexapeptidiques (phagotopes) portés par les phages élués sont déterminés par séquençage de la protéine plîl fUSES par la méthode de Sanger et al. (1977,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7V, 5463-5467). Les homologies de séquences avec les phagotopes sont recherchées dans la banque de données Swiss Prot et le programme FASTA 1.6 (Pearson et Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448) et les alignements de séquences réalisées en utilisant la version
W(1;4) du programme Clustal (Higgins et Sharp, 1988, Gene 73, 237-244).

Comme le montre la Figure 1, le mAb lu6.3 retient différents phagotopes dont les séquences se chevauchent, et sont homologues à la tête d'Ad5 s'étendant entre les résidus Val en position 438 et Asp en position 462. En dépit d'un certain degré de dégénération et de dispersion, on a pu déterminer un motif central de séquence LAPISGTVQSAHLIIRFD correspondant aux acides aminés en positions 445 à 462 (SEQ 1D NO: 8). Ce motif est centré sur le résidu His en position 456, ce qui corrobore la présence d'histidine dans plusieurs phagotopes indépendants. De plus, trois phagotopes contiennent une histidine proche d'une sérine (GISHTG et GASHTV) et une séquence homologue est trouvée dans la tête (453QSAHLI458). Du côté N-terminal, la séquence LAPIS est représentée dans plusieurs phagotopes sous la forme L-P,
VAP-S et LIPFNS.

Les analyses de séquence des 15 phagotopes retenus par le mAb 7A2.7, ont mises en évidence la présence d'une proline à 4 reprises, de tryptophane et histidine 8 fois et l'association dans le même phagotope de deux résidus aromatiques est trouvée 5 fois. Il semble donc que l'épitope du mAb 7A2.7 contienne un résidu proline, tel que celui en position 475 de la fibre, à proximité d'un groupe de résidus aromatiques, tel que 477YWNF48() En outre, deux phagotopes FWLAVR et WALFRS sont homologues au motif 477YWNFR4X1
Sur la base de ces données, l'épitope du mAb 7A2 7 a été cartographié entre les résidus 473 et 486 de la fibre Ad5 (SEQ ID NO: 10).

En résumé, les mAb lu6.3 et 7A2.7 reconnaissent des segments adjacents de 15 à 20 aa dans la séquence linéaire de la tete d'AdS, les résidus s'étendant des positions 445 à 462 et 473 à 486 respectivement. Selon le modèle tridimensionnel de la tête proposé par Xia et al. (1994, Curr. Biol. Structure 2, 1259-1270), les deux épitopes occupent des régions continues d'un point de vue spatial. L'épitope du mAb lu6.3 recouvre une partie de la boucle CD et du feuillet Q D, alors que l'épitope du mAb 7A2.7 est localisé au niveau du segment adjacent DE et des deux feuillets Q E et F. L'épitope 1D6.3 se situe à l'intérieur d'un feuillet R alors que l'épitope 7A2.7 est orienté plus latéralement par rapport au feuillet R.

EXEMPLE 3 . Identification des récepteurs cellulaires de l'AdS par la
technique de biorpaillae réverse.

Cette technique est dîte réverse par rapport à la précédente puisqu'on utilise la fibre comme ligand et le mAb comme éluant. On procède donc par immobilisation de la tête de la fibre de l'Ad5 sur laquelle on fait réagir la bibliothèque de phages exprimant des phagotopes hexapeptidiques. Les phages adsorbés peuvent être élués soit par un tampon acide conventionnel soit par le mAb 1D6.3 ou 7A2.7 et la protéine plil recombinante portant leurs phagotopes respectifs est séquencée. La recherche dans les banques de données est effectuée comme ci-dessus. Les motifs hexapeptidiques identifiés sont présentés à la Figure 2.

Les phagotopes produits par compétition avec le mAb 7A2.7 sont présentés à la Figure 2a. Leur analyse permet de dériver une séquence consensus (Figure 2b) qui présente une homologie avec les motifs 1, 3, 5 et 14 du module de type III de la fibronectine humaine (SEQ ID NO: 2 à 5) (Main et al., 1992, Cell 71, 671-678). Ces derniers se situent au niveau du feuillet Q B et de la boucle adjacente BC du module FNIII (Dickinson et al., 1994, J. Mol.

Biol. 236, 1079-1092).

Les phagotopes élués après action du mAb in6.3 sont décrits à la Figure 2c. L'ensemble des séquences se chevauchent et permettent de déterminer également une séquence consensus (Figure 2d). La recherche d'homologie avec les séquences répertoriées dans les banques de données révèle une homologie avec la région C-terminale du domaine a-2 de la chaîne lourde des molécules MMC de classe I (MHC-ICt-2) (position 156 à 180) (SEQ ID NO: 1).

EXEMPLE 4 : Interactions de la fibre adénovirale avec le module FN1II et
le domaine MHC-la-2
L'interaction est étudiée in vitro à l'aide d'une protéine chimère issue de la fusion C-terminale de la protéine GST (Glutathion S-transférase) à un pentadécapeptide RHILWTPANTPAMGY reproduisant la séquence consensus homologue au feuillet Q B et la boucle BC de FNIII (voir exemple précédent et
Figure 2b). Pour ce faire, les oligonucléotides présentés aux identificateurs de séquences 16 et 17 sont hybridés et introduits dans le site XhoI du plasmide pGEX-KG (Guan et Dixon, 1991, Anal. Biochem. 192, 262-267). Il est à noter que les oligonucléotides une fois réhybridés génèrent un site ol à l'extrémité 5' si l'insert est cloné dans l'orientation correcte. Ceci permet d'intégrer une seule copie ou de multiples copies en tandem au niveau du site A71ol reconstitué.

La séquence du produit de fusion comprenant une copie du pentadécapeptide (désigné GST-FNxl) peut être schématisée de la manière suivante : GST- (site de clivage par la thrombine-PGIS-GGGGG-ILDSMGRLE-
RHILWTPANTPAMGY(V)-ELKLNS-stop. Les constructions GST-FNx2 et
GST-FNx3 comportent respectivement 2 et 3 répétitions du pentadécapeptide entre les résidus LE et EL de la cassette de clonage.

Les oligonucléotides sens et antisens (SEQ ID NO: 1 8 et 1 9) codant pour la séquence consensus obtenue par compétition avec le mAb 1D6.3 (Figure 2d) sont insérés selon la meme stratégie que précédemment à l'extrémité Cterminale de la GST pour donner les constructions GST-MHCx 1, GST-MHCx2 et GST-MHCx3 selon le nombre de motifs présents. Les protéines chimères
GST-FN et GST-MHC sont produites dans E. coli, extraites et purifiées par affinité sur des billes d'agarose-glutathion (Sigma) selon les méthodes conventionnelles (Smith et Johnson, 1988, Gene 67, 31-40).

En parallèle, les fibres complètes des sérotypes 2, 3 et 5 sont produites par voie recombinante selon la technologie baculovims/cellules Sf9 déjà employée.

La construction F2-FL582 portant le gène de la fibre Ad2 est décrite dans
Novelli et Boulanger (1991,Virology 185, 365-376). Les séquences codant pour les fibres Ad5 et Ad3 sont isolées par PCR en utilisant l'ADN viral à titre de matrice et des amorces sens et antisens appropriées telles que celles reportées aux SEQ ID NO: 20 et 13 et 21 et 15. Le segment amplifié est introduit dans un vecteur baculovirus sous le contrôle du promoteur polyhédrine et le produit d'expression récupéré dans les surnageants de culture. On obtient F5-FL58 1 et
F3-FL320 correspondant aux fibres Ad5 et Ad3 respectivement.

La capacité du module FNIII et du domaine c(-2 MHC-I recombinant à lier la fibre adénovirale est évaluée par immunotransfert après incubation in vitro des protéines de fusion GST-FN et GST-MHC et des fibres recombinantes
F2-FL582, F5-FL581 et F3-FL320. Les complexes formés sont isolés sur billes d'agarose glutathion dans les conditions décrites par Johnson et al. (1995, J.

Biol. Chem. 270, 24352-24360) puis analysés sur gel de polyacrylamide de 12,5 % (SDS-PAGE) en utilisant un système de tampon discontinu (Laemmli, 1970,
Nature 227, 680-685). Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (0,8 mA/cm2 , système Cambridge Electrophoresis , UK) dans un tampon Tris-HCI 25 mM, glycine 192 mM, pH8,3 contenant 20 % de méthanol.

Après traitement avec une solution de blocage (lait écrémé 5 %, sérum de veau
I % dans du tampon TBS-T 20 mM Tris-HCI pH7,8, 0,1 5 NI NaCI, 0,05 %
Tween 20), la membrane est mise en contact avec l'anticorps 4D2.5 (Hong et
Engler, 1991,Virology I < \'5, 758-767) puis un conjugué anti IgG marqué à la péroxydase de raifort. La révélation par le substrat chimiluminescent peroxydase (SuperSignal, Pierce Chemicals) est réalisée selon Carrière et al. (1995, J. Virol.

69, 2366-2377) et les luminogrammes (Hyperfilm ss-max, Amersham) sont analysés à 610 nm à l'aide d'un densitomètre automatique (REP-EDC, Helena
Laboratories, Beaumont, TX). A titre indicatif, I'anticorps 4D2.5 reconnaît l'épitope FNPVYP du domaine de la queue conservé chez la plupart des adénovirus mammifères.

GST-FNxl, GST-FNx2 et GST-FNx3 se lient à F5-AT386 et F2-AT388 avec une grande efficacité alors que F3-AT124 est retenu à un moindre niveau.

Un comportement similaire est observé avec les protéines chimères GST
MHCxl, GST-MHCx2 et GST-MHCx3 qui retiennent F5-AT386 et F2-AT388 avec une efficacité supérieure à F3-AT 124.

La fibre Ad5 se lie aux protéines de fusion GST-FN et GST-MHC et ceci avec une affinité 2 à 3 fois supérieure par rapport à la fibre Ad2 et 10 à 15 fois supérieure par rapport à la fibre Ad3. De plus, I'efficacité de liaison n'est pas dépendante du nombre de motifs présents dans la protéine de fusion, l'intensité étant comparable et même parfois plus faible entre GST-FNxl et GST-FNx3 et GST-MHCxl et GST-MHCx3. Ceci peut être expliqué par le fait que les motifs en tandem peuvent adopter une conformation qui nuit à la liaison
EXEMPLE 5 . Influence des peptides svnthétiaues dérivés de FNIII et
MHC-la2 sur l'attachement des virus à la surface cellulaire.

Deux peptides synthétiques reproduisant les motifs FNIII et MHC-la2 ont été synthétisés chimiquement et purifiés selon les techniques de l'art. FN20 (SEQ ID NO: 7) reproduit la séquence consensus des phagotopes élués par l'anticorps 7A2.7 et MH20 (SEQ ID NO: 6) correspond à celle des phagotopes élués par le mAb lu6.3.

Les peptides FN20 et MH20 sont testés vis à vis de l'attachement de l'adénovirus rapporteur Ad5Luc3 à des cellules HeLa cultivées il) wtro. Le test est réalisé en partie à 0 C, une température qui permet l'attachement des virus à la surface des cellules permissives mais, en revanche, bloque l'entrée des virus et le recyclage des récepteurs. L'Ad5Luc3 (MOI 0,16 plu/10' cellules) est préalablement incubé avec des quantités croissantes de peptides (0,01 à 500 nM) à température ambiante pendant 2 heures puis le mélange est ajouté à une culture cellulaire placée sur glace. Après 1 h à OOC, les virus non adsorbés et les peptides sont éliminés par lavage et la culture est poursuivie pendant 18 h à 37"C après ajout d'un milieu préchauffé. Les lysats cellulaires sont préparés de manière conventionnelle et l'activité luciférase exprimée en RLU (pour Relative
Light Units en anglais) est déterminée (substrat Promega, Madison, Wl luminomètre Lumat LB-9501, Brethold Bioanalytical, Wildbad, Allemagne).

Les résultats de compétition avec le peptide FN20 sont présentés à la
Figure 3a. Aucun effet significatif n'est obtenu jusqu'à une molarité de 10 zM puis une augmentation progressive de l'activité luciférase apparaît au delà de 25 CLAM. En particulier, I'activité croît d'un facteur 100 entre 25 et 100 HM. L,e peptide FN20 a donc un effet stimulateur de l'attachement viral. II ne confère aucune cytotoxicité apparente et n'a pas d'effet négatif sur l'expression du gène luciférase une fois le virus préattaché (peptide ajouté à la culture cellulaire après l'étape d'attachement viral à 0 C) ou préendocytosé (peptide ajouté à la culture cellulaire après l'étape d'attachement et de pénétration du virus).

Dans le cas du peptide MH20 (Figure 3b), on observe une légère augmentation de l'expression du gène luciférase pour les molarités comprises entre 0,05 et 2,5 1M (activité 5 à 6 fois plus élevée à 2,5 1M). Ce phénomène est suivi d'une diminution rapide des niveaux de luciférase lorsque les molarités utilisées sont supérieures à 5 KLM, avec une diminution d'un facteur 100 par rapport au contrôle à 25 M et de presque quatre ordres de magnitude à 50 ssM, montrant que lié au virus, il bloque la fixation au récepteur cellulaire.

Comme précédemment, le peptide MH20 à des concentrations de 50 pM ne présente aucun effet cytotoxique et n'influence pas l'expression du gène reporter après le préattachement ou la préendocytose de l'Ad5Luc3. L'inhibition presque totale de l'activité luciférase en présence de 50 UM de MH20 est le reflet d'une neutralisation complète du virus.

EXEMPLE 6 Séro-spécificité de la neutralisation virale par les peptides
synthétiques.

Les adénovirus sauvages Ad5, Ad2 Ad3 sont préincubés pendant 2 h à température ambiante avec le peptide inhibiteur MH20 à une molarité constante (25 MM), la MOI variant de 0,2 à 2 pfu/cellule. Le mélange est mis en présence des cellules HeLa pendant 1 h à 0 C et la culture poursuivie à 37"C après élimination des virus non adsorbés dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Le niveau de synthèse de l'hexon, de la protéine 100k, du penton base est de la fibre est estimé par immunotitration (Wohlfart, 1988, J. Virol. 62, 2321-2328) sur les extraits cellulaires recueillis 48 h après l'infection.

L'infection des cellules HeLa par l'Ad5 ou l'Ad2 à une MOI de 0,2 à 2 pfu/cellule en présence de 25 MM de MH20 pendant la phase d'attachement du virus, est suivie d'une inhibition de la synthèse des protéines de la capside virale hexon, protéine 100 k, penton base et fibre 48 h après l'infection (facteur 15 à 30). Par contre, lorsque l'infection est réalisée dans les mêmes conditions par l'Ad3 sauvage, la synthèse des protéines structurales n'est réduite que d'un facteur 1,5 à 2, ce qui suggère que la neutralisation adénovirale par MH20 est sérotype dépendante.

EXEMPLE 7. Affinité de la fibre Ad5 pour les peptides FN20 et MH20.

5, 10 et 25 1M de peptides synthétiques FN20 ou N1.H20 sont immobilisés sur la surface polystyrène d'une plaque de microtitration à 96 puits (Nunc,
Maxisorb) pendant une nuit à 40C. Après lavage puis blocage avec une solution d'albumine sérique bovine (BSA) 3 % dans du tampon PBS, on fait réagir des concentrations croissantes de fibres F5-FL58l reprises dans du tampon PBS et marquées radioactivement (marquage à la [35S] méthionine et la [35S] cystéine activité spécifique de 50000 à 65000 cpm/,ug de protéine). La fibre adsorbée sur l'un ou l'autre des peptides est éluée avec une solution adéquate (urée 1M,
NaOH 1 M et SDS 1 %) puis précipitée en présence d'acide trichloroacétique.

La radioactivité contenue dans le précipité récupéré sur filtre GF/C est comptée à l'aide d'un spectromètre à scintillation liquide (Beckman LS-6500) et les constantes de dissociation (Kd) déterminées selon Scatchard (1949, Zannis NY
Acad. Sci. 51, 660-672).

Le Kd de la fibre Ad5 marquée à l'égard du peptide MH20 est évalué à 3,0+ 0,6 nM et celui trouvé pour le peptide FN20 est de 8,0s 1,9 nM (n=3 dans les deux cas).

EXEMPLE 8 : L'infectivité de l'Ad5 est dépendante de l'expression des
MHC-I à la surface des cellules permissives.

La lignée Daudi de lymphoblastoides B, établie à partir d'un lymphome de
Burkitt, est naturellement déficiente en l'expression de la Q-2 microglobuline et, de ce fait, ne possède pas à sa surface les molécules HLA de classe I (Daudi
HLA-). La lignée cellulaire E8.1 dérivée des Daudi a été générée par transfection d'un gène codant pour la ss-2 microglobuline afin de restaurer l'expression de molécules HLA de classe I à leur surface (Daudi-HLA+, Quillet et al., 1988, J. Immunol. Ils, 17-20).

Les expériences d'attachement de l'Ad5Luc3 à 0 C ont été menées sur les cellules Daudi HLA- et Daudi-HLA+ avec une NIOl de trois ordres de magnitude plus forte que celle employée dans le cas des cellules HeLa (0,3 à 150 pfu/105 cellules). L'activité luciférase mesurée dans les lysats cellulaires 18 h post-infection est représentée à la Figure 4. Lorsque l'infection concerne les cellules Daudi-HLA+, l'activité luciférase augmente régulièrement d'une manière
MOI dépendante jusqu'à atteindre un plateau au delà de 5 pfu/105 cellules. Pour ce qui est des cellules Daudi HLA-, le signal luminescent est très faible (3 à 4 ordres de magnitude) par rapport à celui observé avec les cellules pourvues de molécules HLA fonctionnelles à leur surface. Ces expériences montrent que l'expression du MHC-I à la surface cellulaire est nécessaire à l'infection Ad5.

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Centre National de la Recherche Scientifique
(CNRS)
(B) RUE: 3 rue Michel Ange
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75794 Cedex 16
(G) TELEPHONE: (33) 01 44 96 40 00
(H) TELECOPIE: (33) 01 44 96 50 00
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Récepteurs cellulaires des adénovirus.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 21
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: domaine alpha 2 des antigenes MHC-I
(positions 156 a 180)
(1) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln
20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 1 de la
fibronectine humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asn Ser His Pro Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser
1 5 10 15
Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn
20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 4 de la
fibronectine humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr Pro Pro Glu Ser Ala Val Thr Gly
1 5 10 15
Tyr Arg Val Asp Val Ile Pro Val Asn
20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 5 de la
fibronectine humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ser Thr Val Leu Val Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ala Gln Ile Thr Gly
1 5 10 15
Tyr Arg Leu Thr Val Gly Leu Thr Arg
20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 14 de la
fibronectine humaine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly
ï 5 10 15
Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Ser
20 25 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: G:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: peptide de synthese MH20
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Arg Ala Ile Val Gly Phe Arg Val Gln Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val
1 5 10 15
Asn Gly Ser Arg
20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: peptide de synthese FN20
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Arg His Ile Leu Trp Thr Pro Ala Asn Thr Pro Ala Met Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Arg Val Ser
20 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(C) INDIVIDUEL ISOLE: serotype 5
(si) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Leu Ala Pro Ile Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg
1 5 10 15
Phe Asp (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(C) INDIVIDUEL ISOLE: serotype 2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Val Ala Ser Val Ser Ile Phe Leu Arg Phe Asp Gln Asn Gly Val
1 5 10 15 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(C) INDIVIDUEL ISOLE: serotype 5
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Phe Arg Asn Gi Asp Leu Thr
1 5 10 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 2
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Asn Ser Ser Leu Lys Lys His Tyr Trp Asn Phe Arg Asn
1 5 10 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 5
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (nt32164
32205 Ad5)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
CCTAAACTAG GATCCGGCCT TAGTTTTGAC AGCATGGGTG CC 42 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 5
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (nt
32919 32883 Ad5)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
CTGTGAGTTT GATTAAGGTA CCGTGATCTG TATAAGC (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 3
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (Ad3)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
GGTCTTACAT TTGACTCTTC CATGGCTATT GCACTG 36 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(iij TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 3
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotlde de synthese (Ad3)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ iD NO: 15: CAATAAAAA TGTGGTACCT TATTTTTGTT GTCAG 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese
(sequence consensus FNIII)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
TCGAGAGGCA TATACTTTGG ACTCCTGCTA ATACACCGGC AATGGGGTAT G 51
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese
(sequence consensus FNIII)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
TCGACATACC CCATTGCCGG TGTATTAGCA GGAGTCCAAA GTATATGCCT G 51 (2 > INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese codant
pour la séquence consensus MHC-I
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
TCGAGAGGGC TATAGTTGGG TTTAGGGTGC AATGGCTTAG GCGGTATTTT GTGAATGGGT 60
CGAGG 65 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese codant
pour aa 157-176 du MHC-I
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
TCGACCTCGA CCCATTCACA AAATACCGCC TAAGCCATTG CACCCTAAAC CCAACTATAG 60
CCCTC 65 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 5
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (nt
31021-31050 Ad5)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
CCATCCGCAC CCACTATGAT CACGTTGTTG 30 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus
(B) SOUCHE: serotype 3
(C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (Ad3)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
CTTCATTTCT TTATCCCCCC ATGGCCA

Claims (4)

1. (d) analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).

   anticorps dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et

   (c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un

   (b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon,

   déterminant l'attachement dudit virus audit récepteur cellulaire,

   comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus

   (a) immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale

   dans un échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes

   Revendications I. Méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus
2. 2. Méthode pour sélectionner ou identifier la partie d'une protéine virale

   déterminant l'attachement d'un virus à un récepteur cellulaire dans un

   échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes

   (a) immobilisation sur un support inerte de tout ou partie d'un anticorps

   dirigé contre ladite protéine virale,

   (b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon,

   (c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec un réactif d'origine

   virale comprenant tout ou partie de ladite protéine virale, et

   (d) analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).
3. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit

   échantillon est une bibliothèque peptidique ou une bibliothèque de phages

   exprimant des motifs peptidiques.
4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit

   virus est un adénovirus, notamment de sérotype C, le réactif d'origine virale

   comprend à tout ou partie de la fibre et, notamment, de la tête d'un

   adénovirus et l'anticorps est inhibiteur de l'attachement du virus à la surface

   de la cellule hôte.