CA2251036A1 - Utilisation d'un polypeptide a titre de recepteur cellulaire des adenovirus - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans les identificateurs de séquence 1 à 5 à titre de récepteur et/ou co-récepteur cellulaire des adénovirus. Elle concerne également l'utilisation d'une cellule capable d'exprimer un tel polypeptide ainsi que celle d'un ligand capable d'influencer l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou son entrée au sein de ladite cellule hôte. Enfin, elle a également trait à une méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus ou la partie d'une protéine virale déterminant l'attachement du virus à son récepteur cellulaire ainsi qu'à l'utilisation d'un ligand bifonctionnel pour cibler un adénovirus vers une cellule hôte portant à sa surface une protéine de surface autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adénovirus.

Description

CA 022~l036 l998-09-28 WO 98133929 PCT~R98tO0184 UTILISATION D'UN POLYPI~PTIDI~ A TITRI~ DE
RI~CI~PTEUI~ CELLUI.AIRI~ DES ADENOVIRUS

La présente invention a pour objet l'utilisation de tout ou partie d'un antigenedu complexe majeur d'histocompatibilite de classe I et/ou d'un module de type III de la fibronectine pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus sur une cellule hôte et/ou son entrée au sein de celle-ci. L'invention vise également l'utilisation d'un ligand capable de moduler l'infectivité d'un adénovirus vis à vis d'une cellule hôte, médiée par l'un ou l'autre des polypeptides cités ci-dessus. Enfin, I'invention concerne une méthode de biorp~illage pour identifier ou sélectionner un récepteur cellulaire d'un adénovirus ou un de ces ligands, notarnment d'origine virale.
Les adénovims sont des virus à ADN d'un large spectre d'hôte. Ils ont été
mis en évidence dans de nombreuses espèces animales et peuvent infecter divers types cellulaires. De nonlbreux sérotypes ont été caracterisés au sein de chaqueespèce qui présentent une organisation génomique et un cycle infectieux comparables. D'une manière genérale, le génome adénoviral est constitué d'une molécule d'ADN linéaire, bicaténaire et d'environ 361;b contenant les gènes codant pour les proteines virales et à ses extrémités deux répétitions inversées (désignées ITR) intervenant dans la réplication et la région d'encapsidation.
Les adénovirus se répliquent dans les noyaux des cellules infectées. Le cycle infectieux se déroule en 2 étapes. La phase précoce précède l'initiation de la réplication et permet de produire les protéines précoces régulant la réplication et la transcription de l'ADN viral. Ces étapes sont sui~r,es de la phase tardive au cours de laquelle sont synthétisées les proteines structurales qui constituent les particules virales. L'assemblage des nouveaux virions prend place dans le noyau. Dans un premier temps, les protéines virales s'assemblent de manière à former des capsides vides de structure icosaédrique. dans lesquelles l'ADN adénoviral est encapside. Les particules virales sont libérees et susceptibles d'infecter d'autres cellules perrnissives.
A cet égard, la fibre et le penton base présents à la surface des capsides jouent un CA 022~1036 1998-09-28 W098/33929 PCr/FR98/00 rôle critique dans l'attachement cellulaire des virions et leur internalisation.L'adénovirus se lie à la surface des cellules permissives par l'intermédiaire dela fibre trimérique et d'un recepteur cellulaire jusqu'à présent, non identifié. Puis, la particule est internalisée par endocytose par liaison du penton base aux intégrines S cellulaires av~3 et av,B~ (Belin et Boulanger, 1993, J. Gen. Virol. 7it, 1485-1497, Mathias et al., 1994, J. Virol. 6~, 6gl 1-6814; Nemerow et al., 1994, Trends Cell.
Biol. ~, 52-55; Wickham et al., 1993, Cell 73, 309-319; Wickham et al., 1994, J.Cell Biol. 127, 257-264). La fibre d'Ad2 comporte 580 acides amines (aa) dont lasequence est divulguée dans Herissé et al. (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042).
Celle d'Ad j présente 5~2 acides arninés (Chroboczel~ et Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554). Sa masse moléculaire est de 67 kDa, mais la fibre native se comporte comme une molécule de 160- 1 ~0 kDa confirmant son assemblage sous forme d'un trimère.
La fibre est composée de 3 domaines (Chroboczek et al., 1995, Current Top.
Microbiol. Immunol. 199, 165-200):
( I ) En N-terminal, la "queue" très conservée d'un sérotype à l'autre, interagit avec le penton base et assure l'ancrage de la molécule dans la capside.

(2) La "tige" est une structure en bâtonnet de longueur variable selon les sérotypes. Par exemple, la tige de la fibre d'AdS contient 22 répétitions d'un motif de 15 résidus qui pourraient adopter une conformation en feuillet ~. Le nombre de ces répétitions diffère d'un sérotype à l'autre, ce ~lui explique les variations de longueur.

(3) Enfin, à l'e~L,el"i~é distale de la tige, la "tête" ou sphéricle terminale est une structure globulaire contenant les signaux de trimérisation (Hong et Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078; Novelli et Bol~ ger~ 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303 ; Novelli et Boulanger, 1991, Virology J8~, 365-376). La plupart des données expérimentales montrent que c'est le domaine de la tête qui est responsable de la liaison aux cellules permissives (Krasnykh et al., 1996, J. Virol. 70, 6~39-6846)

(4) La comple~ité de l'attachement adénoviral laisse supposer qu'il serait sérotype CA 022~1036 1998-09-28 W O 98/33929 P~l/r~5h/00184 dépendant et que plusieurs proteines cellulaires pourraient y participer. En ce qui concerne l'Ad2, Hong et Boulanger (1995, EMBO J. 14, 4714-4727) ont identifié
un certain nombre de motifs peptidiques trouvés dans plusieurs protéines cellulaires de surface susceptibles d'interagir avec les protéines capsidaires (penton base et

5 fibre), en particulier les modules de type III S et 14 de la fibronectine humaine. Les auteurs ont opéré par immobilisation sur un support inerte du penton base ou de la fibre (ligand) sur laquelle ils ont fait réagir une bibliothèque de phages exprimant des hexapeptides aléatoires (désignés phagotopes). Les phages adsorbés, qui en théorie expriment des phagotopes interagissant avec un motif porté par la protéine 10 adénovirale, sont ensuite élués soit classiquement à pH acide ou par compétition avec l'autre partenaire capsidaire non immobilise (éluant). Cependant, le récepteur cellulaire des adénovirus et la région de la tête précisément impliquée dans la liaison au récepteur n'ont à ce jour pas encore été clairement identifiés.
On a maintenant procédé à une nouvelle technique de "biorpaillage" (pour I S biopanning en anglais) dans laquelle le ligand immobilisé est constitue par le domaine de la tête de la fibre d'Ad5 et l'éluant par un anticorps neutralisant dirigé contre cette derniere et isolé deux classes de phagotopes selon l'anticorps mis en oeuvre. Lapremière correspond à une séquence conservée au sein du domaine a-2 des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (a-2 MHC-I) et la 20 seconde à une séquence retrouvée dans les modules III de la fibronectine humaine (FNIII). Les données reportées dans les exemples qui suivent, soutiennent l'hypothèse que le a-2 MHC-I constitue le recepteur primaire des adénovirus de sérotypes C et confirment la participation des FNIII à titre de co-récepteur ou co-facteur. On a également mis en évidence les régions de ces deux récepteurs et de la 2~ fibre interagissant l'une avec l'autre. En outre, on a généré un peptide antagorliste reproduisant le motif du domaine a-2 M~C-I qui neutralise l'attachement des adénovirus et un peptide agoniste reproduisant les motifs FNI~I qui stimule l'attachement.
C'est pourquoi la presente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide CA 022~1036 1998-09-28 wo 98/33929 PCT/FR98/00184 comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique a au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée:
(a) dans la SEQ ID NO: 1 commençant avec le résidu leucine en position I et finissant avec le résidu glutamine en position 25, 5 (b) dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position I et finissant avec le résidu asparagine en position 26, (c) dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position I et finissant avec le résidu asparagine en position 25, (d) dans la SEQ ID NO: 4 commen,cant avec le residu sérine en position I et 10 finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou (e) dans la SEQ ID NO: 5 commenc,ant avec le résidu asparagine en position I et finissant avec le résidu sérine en position 25;
pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule hôte.
Aux termes de la présente invention, on entend par "polypeptide" toute molécule constituée par un enchâînement d'au moins 6 et, de préférence d'au moins 8, acides aminés. Le terme polypeptide comprend aussi bien des molécules peptidiques de courte longueur (de 6 à quelques dizaines de résidus) que des molécules de longueur plus importante (jusqu'à plusieurs centaines de résidus), à la 20 condition toutefois de permettre l'utilisation envisagée. On précise qu'un polypeptide en usage dans le cadre de la présente inventioll peut dériver d'un polypeptide natif tel que trouvé dans la nature, en particulier chez l'homme, ou d'une partie de celui-ci Il peut également être chimère et comprendre des résidus supplémentaires d'une origine quelconque fusionnés en N et/ou C-terminal et/ou insérés de manière à
25 former un cadre de lecture ouvert. On peut également mettre en oeuvre un mutant obtenu par mutation, délétion, insertion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés par rapport aux séquences divulguées dans les identificateurs de séquence(SEQ ID).
Un polypeptide préféré dans le cadre de la présente invention comprend en CA 022~1036 1998-09-28 wo 98/33929 PcT/FRs8too184 outre des éléments appropriés pour assurer son ancrage dans une membrane cellulaire ou sa présentation à la surface d'une cellule. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art. A titre indicatif, on mentionne la présence d'un peptide signal généralement associé en position N-terminale et d'une région transmembranaire S présentant un degré d'hydrophobicité élevé. Mais on peut également avoir recours à d'autres techniques, par exemple chimiques, pour ancrer ou lier un polypeptide à
une membrane ou une surface cellulaire.
Par "séquence d'acides amines homologue", on entend une séquence présentant un degré d'homologie d'au moins 70 %, de manière avantageuse, d'au mohls 80 %, l O de manière préférée, d'au moins 90 % avec au moins 6 acides aminés continus d'une des séquences citées. Le terme identique fait référence à 100 % d'homologie.
L'homme du métier connaît les règles générales qui permettent de calculer le degré
d'homolo~,ie entre deux séquences. On procède généralement par alignement des séquences éventuellement à l'aide de programmes d'ordinateur spécialisés. Il peut l 5 être nécessaire d'introduire artificiellement des emplacements vacants. Une fois que l'alignement optimal est réalisé, le degré d'homologie est établi en comptabilisant toutes les positions dans lesquelles les acides aminés des deux séquences se retrouvent à l'identique, par rappolt au nombre total de positions.
Par "attachement d'un adénovirus à une cellule hôte", on entend la liaison de 20 la particule virale à la cellule. Par "entrée d'un adénovirus au sein d'une cellule hôte", on désigne la pénétration du virus à l'intérieur de la cellule hôte. L'attachement et/ou l'entrée sont de préfel-ellce medié(s) au moins en partie par le(s) polypeptide(s) en usage dans le cadre de la présente invention par interaction avec la capside adénovirale. Bien entendu, d'autres molécules polypeptidiques ou non peuvent 25 également participer à ces processus reconnus dans le domaine de l'art comme comple~es et multifactoriels. Ils peuvent être évalués par toute technique de l'art, telles que celles décrites ci-après mettant en oeuvre une lignée cellulaire permissive et des particules marquées radioactivement ou exprimant un gene reporter par exemple le gène de la luciférase. A 0~C, seul l'attachement peut avoir lieu, la CA 022~1036 1998-09-28 W O 98/33929 PCTA~R98/00184 pénétration virale nécessitant une température de 37~C.
Aux fins de la présente invention, un adénovirus peut être d'origine humaine ou animale (canine, aviaire, bovine...) ou hybride comprenant des fragments de génome. Ces virus et leur génome sont décrits dans la littérature (voir par exemple 5 Graham et Prevec, Methods in Molecular Biology, Vol 7; Gene Transfer and Expression Protocols; Ed: E.J. Murray, 1991, The Human Press lnc., Clinton, NJ).On préfère mettre en oeuvre un adénovirus recombinant défectif pour la réplication et exprimant notamment un gène d'intérêt thérapeutique. Avantageusement, le génome adénoviral est modifié par délétion ou mutation de séquences essentielles10 a la réplication et, en particulier, comprises dans les régions El, E2, E4 et/ou Ll-L5 (voir par exemple la demande internationale WO 94/28152).
Selon une prernière variante, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant une sequence en acides aminés homologue ou identique à
au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID
15 NO: I commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25.
De manière avantageuse, un polypeptide en usage dans le cadre de 1a présente invention comprend une séquence en acide aminé homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I)20 et, de préférence, de la chaîne lourde de ce dernier.
Toutes les cellules d'un organisme présentent sur leur membrane des molécules appelées antigènes d'histocompatibilité qui définissent chaque individu. Les gènes correspondants, plus d'une dizaine, sont localisés sur le chromosome 6 chez l'homme et présentent un polymorphisme important, ce qui permet d'assurer une grande 25 variabilité de ces marqueurs d'identité. l! existe deux catégories différentes de ces antigenes d'histocompatibilité, respectivement de classe I et Il, dont la structure et les fonctions sont distinctes. Les molécules de classe 1, appelées HLA (pour Human Leukocyte Antigen en anglais) interviennent pour présenter les peptides antigéniques à la surface cellulaire et jouent un rôle essentiel dans les réponses immunitaires CA 022~1036 1998 - 09 - 28 wo 98/33929 antivirales exercées par les Iymphocytes T cytotoxiques.
Les molécules ~vlHC-I sont des hétérodimères composés d'une chaîne légère non M~C désignée ~2-microglobuline (,B2m) et d'une châîne lourde codée par les Oènes M~IC, liées de manière non covalente. La châîne lourde est une protéine 5 membranaire dont la partie N-terminale est orientée à l'extérieur de la cellule alors que la portion C-terminale est cytoplasmique. La première comprend 3 domaines désignés ~1, a2 et a3 d'environ 90 acides aminés chacun. Elle est suivie d'une région transmembranaire d'environ 25 acides aminés puis de la région C-terminale d'une trentaine d'acides aminés. La plupart des variations entre les produits des différents 10 allèles sont localisées dans les domaines c~l et a2, le domaine c~3 étant relativement conservé et la ,~2m invariable (pour une revL e et la comparaison de séquence entre les membres des MHC-I, voir Bjorkman et Parham, 1990, Annu. Rev Biochem. 59, 253-288).
Parmi les polypeptides convenant aux fins de la présente invention, on peut 15 citer plus particulièrement les antigènes ~A A, B, C, D, E et F ou des polypeptides en dérivant.
D'une manière particulièrement avanta~euse, le polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention comprend une séquence homologue ou identique à
tout ou partie de la région C-terrninale du doma~ne c~2 de la châîne lourde des M~IC-20 I et, plus particulièrement, à la partie centrée sur le résidu t~ptophane en position 167, notamment celle s'étendant des résidus 156 à 180 (SEQ ID N0: 1). Lanumérotation à laquelle il est fait référence est conforme à celle utilisée par exemple dans Bjorkman et Parham (1990, sl~pra).
Selon une autre variante, un polypeptide en usage dans le cadre de la présente 25 invention comprend une sequence en acides aminés homologue ou identiclue a au moins 6 acides aminés continus de la sequence telle que montrée:
- dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, - dans la SEQ ID N0: 3 commençant avec le résidu valh1e en position 1 et CA 022~1036 1998-09-28 PCT~R98/00184 filli.cc~nt avec le résidu asparagine en position 25, - dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu sérine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou - dans la SEQ ID NO: S commen,cant avec le résidu asparagine en position I et 5 finissant avec le résidu sérine en position 25. .
Un polypeptide préféré comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à la fibronectine et, en particulier, à l'un au moins de ses modules de type III et, notamment, aux modules FNIII 1, 4, 5 et/ou 14. Bien entendu, il peut en comprendre plusieurs. On peut également envisager l'utilisation de la fibronectine 10 humaine ou d'un peptide en derivant, par exemple par mutation ou fragmentation.
A titre d'information, la fibronectine codée par Ull gène unique est une molécule intervenant dans les phenomènes d'adhésion et de contact cellulaire. Sa séquence et ses caractéristiques sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier (voir en particulier Bork et Doolittle, 19~2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ~9, 8990-8994 et Dickinson et ai., 1994, 236, 1079-1092). Elle est composée de 14 modulesdits de type III (numérotés de I à 14) dont la séquence primaire peut varier mais dont la conformation en feuillet ,B est conservée.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, un polypeptide tel que défini ci-dessus est plus particulièrement destiné à permettre ou faciliter 20 l'attachement d'un adénovirus de sérotype C à une ceilule hôte et/ou son entrée dans cette dernière. Parmi les adénovirus envisageables, on peut citer plus particulièrement les sérotypes 2 et 5.
La présente invention concen1e égaiement une cellule hôte capable d'exprimer un polypeptide en usage dans le cadre de la présente invention et son utilisation pour 25 permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus à sa surface ettou l'entrée dudit adénovirus. Divers types de cellules hôtes peuvent être considérés. Il peut s'agir de cellules d'une origine quelconque, par exemple de microorganismes, levures, insectes, plantes, animales. On préférera notamment une cellule de lllall''''irère et, en particulier, une cellule humaine de type primaire, tumorale ou issue d'une lignée CA 022~1036 1998-09-28 W 098133929 PCTA~R98/00184 cultivable ill vitro. Elle peut avoir une origine hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, Iymphocyte, monocyte, macrophage...), hépatique, rénale, du système nerveux central, ffbroblaste, épithéliale, pulmonaire ou musculaire (myocyte, myoblaste, cellule satellite, cardiomyocyte...). Une cellule particulièrement préférée 5 est ou dérive de la lignée 293 établie à partir de cellules de rein embryonnaire par intégration de la région adénovirale El (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). On indique que l'expression d'un ou plusieurs polypeptides en usage dans lecadre de la présente invention à la surface d'une cellule hôte n'exprimant pas habituellement les M~IC-I etlou la fibronectine devrait permettre son infectivité par 10 un adénovirus. Elle pourrait être utilisée comme nouvelle cellule productrice de vecteurs adénoviraux. On peut également envisager le cas d'une surexpression dans une cellule exprimant naturellement ledit polypeptide. Une lignée de surexpression dérivant de la lignée 293 devrait permettre d'améliorer les rendements de production d'un adénovirus d'intérêt. Bien entendu, le polypeptide en usage dans le cadre de la 15 présente invention peut être associé à la cellule par des moyens chimiques ou par l'intermédiaire d'un ligand reconnaissant une protéine de surface cellulaire. Mais, on peut egalement envisager une expression par les techniques de l'ADN recombinan[.Un tel mode de réalisation est à la portée de l'homme de l'art. A titre indicatif, la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide en question peut être isolée (par 20 les techniques standards de PCR ou clonage) ou synthétisée chimiquement avantd'être insérée dans un vecteur d'expression conventionnel sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés, le vecteur étant introduit dans la cellule hôte par toute technique de l'art. La cellule hôte en usage dans le cadre de la présente invention peut également être modifiée de manière à complémenter un adénovirus défectif par 25 transfection de fragment(s) approprié(s) de génome adénoviral.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand capable d'influencer l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou son entrée au sein de cette dernière médiés par un polypeptide tel que défini ci-dessus. Le ligand en usage dans l'invention peut être de nature quelconque. On peut citer par exemple les CA 022~1036 1998-09-28 WO 98/33929 PCT/FRg8/00184 peptides, les hormones, les anticorps ou leurs dérivés et, notamment, les anticorps simple chaîne de type scFv (pour single chain fragment variable en anglais) et les récepteurs solubles dépourvus de leur région transmembranaire. En particulier, un tel ligand peut dériver d'un polypeptide en usage dans la présente invention~
5 Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, le ligand peut avoir une influence négative (antagoniste) ou positive (agoniste). De préférence, un ligand préféré présente une constante de dissociation à l'égard de l'adénovirus comprise entre 0,01 et l00 nM, avantageusement entre 0,1 et 50 nM et, de manière tout à fai~
préférée, entre 0,5 et l0 nM.
Dans le cas d'un antagoniste, l'interaction du ligand avec la ~lbre permettra dediminuer ou inhiber Ies processus d'attachement et/ou d'entrée d'un adénovirus. Dans ce contexte, un ligand particulièrement préféré est basé sur un polypeptide tel que défini dans la SEQ ID NO: l. A titre d'exemple, on peut citer un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 15 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID
NO: 6 commenc,ant avec le résidu arginine en position l et finissant avec le résidu arginine en position 20. On preférera avoir recours au peptide désigné MH20 dansles exemples qui suivent.
Dans le cas d'une influence positive, le ligand en usage dans le cadre de la 20 présente invention est utilisé pour pennettre ou stimuler l'attachement et/ou l'entree des adénovirus. Un ligand convenant aux fins de l'invention comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 7 commençant avec le residu arginine en position l et finissant avec le résidu sérine en position 20. Un exemple 25 préféré consiste en le peptide désigné ci-après FN20.
La présente invention a également trait à un ligand comprenant une séquence en acides aminés homogue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ lD NO: 6 ou 7.
Mais, il peut également s'agir d'un ligand d'origine adénovirale. Selon ce mode CA 022~l036 l998-09-28 W O 98/33929 PCT~R98/00184 de réalisation, un ligand préferé dérive de la fibre d'un adénovirus, en particulier, de la partie de la tête interagissant avec les polypeptides précités. Un motif peptidique choisi dans cette région devrait donc influencer l'infectivité des adénovirus à l'égard d'une cellule hôte exprimant le polypeptide. Avantageusement, on a recours à un 5 ligand recouvrant les résidus 43~ à 486 de la fibre d'un adénovirus. Plus particulièrement, un ligand d'un polypeptide tel que défini par la SEQ ID NO: I
dérive de préférence d'un Ad5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: ~, débutant à l'acide aminé leucine en position 110 et se terrninant à l'acide aminé acide aspartique en position 18. Un ligand également envisageable peut dériver de la fibre d'un adénovirus de sérotype 2 et comprendre une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides arninésde la séquence telle que montree dans la SEQ ID NO: 9 débutant au résidu thréonine en position 1 et se terminant au résidu valine en position 16.
Le ligand d'un polypeptide tel que défini par les SEQ ID NO: 2 a 5 est plus particulièrement caractérisé par une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés de la sequence telle que montrée dans la SEQ
ID NO: 10 débutant au résidu leucine en position I et se terminant au résidu thréonine en position 14 (Ad5) ou dans la SEQ ID NO: 11 débutant au résidu 20 asparagine en position I et se terrninant: au résidu asparagine en position 13 (Ad2).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand selon l'invention, pour la préparation d'un medicament destine à inhiber ou diminuer une infection par un adénovirus. Dans ce contexte, on préférera l'usage d'un ligand antagoniste dans un but thérapeutique ou prophylactique. L'utilisation d'un ligand 25 selon l'invention, de préférence agoniste, convient à la préparation d'un medicament destiné à favoriser ou faciliter une infection par un adénovirus, et, en particulier, d'un adénovirus recombinant porteur d'un gène thérapeutique à visée de thérapie génique (curative) ou anti-virale (SIDA) ou anti-cancéreuse. Un tel médicament trouve son utilite par exemple en association avec les traitements de thérapie génique afin CA 022~l036 l998-09-28 W 098/33929 PCTA~R98/00184 d'améliorer l'infection virale chez un patient traité par un adénovirus recombinant.
On peut envisager une voie d'administration parentérale, orale ou encore par aérosol.
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs foisaprès un certain délai d'intervalle. Le dosage et la formulation appropriés varient en 5 fonction de différents paramètres, par exemple de l'individu, de la maladie à traiter, de l'effet désiré, de la voie d'administration ou encore de l'adénovirus en cause.
La présente invention concerne également une méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus dans un échantillon approprié, comprenant:
10 (a) I'immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus déterminant son attachement au récepteur cellulaire, (b) I'incubation pendant un temps déterminé avec l'échantillon, (c) I'élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un anticorps 15 dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et (d) I'analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).
Le support inerte peut être sans limitation sous une forme quelconque (cône, tube, puits, billes ou analogues) et d'un matériau quelconque (naturel, de synthèse tels que les polymères, modifié chimiquement ou non...). La fixation du réactif sur 20 le support inerte peut être realisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, on procédera de préférence par adsorption c'est à dire de manière non covalente bien que l'établissement de liaisons covalentes puisse également être considéré. De manière indirecte, on peut fixer préalablement un composé anti-réactif capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support 25 inerte. Selon un mode de réalisation avantageux, I'échantillon est constitué par une bibliothèque dite aléatoire et, en particulier d'expression (fragments génomiques, cADN) ou peptidique ou, de manière préférée, de phages exprimant des motifs peptidiques (phagotopes). De telles bibliothèques sont décrites dans la littérature ou accessibles commercialement. Dans le but de sélectionner ou identifier un récepteur W Og8/33929 PCTA~R98/00184 cellulaire d'un adénovirus, on met de préférence en oeuvre à titre de réactif d'origine virale, tout ou partie de la fibre et, notamment, de la tête d'un adénovirus et, à titre d'éluant, un anticorps anti-fibre neutralisant (inhibiteur de l'attachement du virus à
la surface de la cellule hôte) La fibre ou ses fragments peuvent être produits par S voie recombinante et les anticorps par la technique d'hybridome ou par génie génétique (production d'anticorps simple chaîne scFv, ~ab...) On indique que la plupart des anticorps anti-fibre sont neutralisants. L'analyse est réalisée par comparaison de la séquence de l'échantillon élué avec les banques de données. Une telle analyse est à la portée de l'homme de l'art.
Enfin, la présente invention vise également une methode pour sélectionner ou identifier la partie d'une protéine viraie déterminant l'attachement d'un virus à un récepteur cellulaire dans un échantillon approprié, comprenant:
(a) I'immobilisation sur un support inerte de tout ou partie d'un anticorps dirigé
contre ladite protéine virale, 15 (b) llincubation pendant un temps determiné avec ledit échantillon, (c) I'élution de l'echantillon retenu a l'étape (b) avec un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie de ladite protéine virale, et (d) I'analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).
Les modes de réalisation spécifiques cités précédemment peuvent également 20 s'appliquer dans ce contexte.
La présente invention a egalement pour objet l'utilisation d'un ligand bifonctionnel pour le ciblage d'un adénovirus vers une protéine de surface cellulaire autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adénovims, ledit ligand bifonctionnel comportant une première partie ligand capable d'interagir avec la fibre dudit 2~ adénovirus, une deuxieme partie ligand capable d'interagir avec ladite proteine de surface cellulaire et, éventuellement, Ull espaceur entre lesdites première et deu~ième parties ligand.
Au sens de la présente invention, un ligand bifonctionneJ est capable d'interagir avec deux entités différentes l'une de préference située à la surface d'un adénovirus *rB

CA 022~1036 1998-09-28 wo 98/33929 PCT/FRg8/001 et l'autre à la surface d'une cellule hôte, au niveau d'une protéine de surface cellulaire autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adénovirus. Par ailleurs, les deux parties ligands peuvent être éventuellement séparées par un espaceur comprenant de I à une quinzaine d'acides aminés, de préférences non chargés. Bien entendu, I'ordre 5 des entités n'a pas d'importance, le domaine interagissant avec la protéine adénovirale pouvant être en N ou en C-terminal du ligand bifonctionnel, la position C-terrninale étant préférée. ~'utilisation d'un tel ligand bifonctionnel perrnet de cibler Ull adénovirus vers une cellule hôte d'interêt, par exemple une cellule tumorale, une cellule infectée, un type cellulaire particulier ou une catégorie de cellules portant un 10 marqueur de surface spécifique. Après liaison dudit ligand bifonctionnel à la protéine de surface cellulaire, I'entité reconn~ics~nt la protéine adénovirale est exposée, ce qui devrait créer des ~<leurres~ de récepteurs viraux du même type que les récepteurs primaires (domaine a2 des MHC-I) et créer ou augmenter le nombre de récepteurs primaires d'adénovirus à la surface de la cellule hôte.
De préférence, la partie ligand interagissant avec la fibre adenovirale présenteles caractéristiques du ligand défini précédemment, elle est notamment dérivée du domaine o~2 du MHCI et comprend de préférence une séquence en acides aminés llotnologue ou identique à All moins 6 acides aminés continus compris dans la SEQ.
ID NO: 6. De manière encore plus préférée, elle est constituée par le peptide MH20 20 (SEQ ID NO: 6).
Pour ce qui est de la partie ligand interagissant avec la protéine de surface cellulaire, celle-ci est adaptée à la cellule hôte que l'on désire cibler. S'agissant d'une cellule infectée par le virus HIV (Human Immunodeficiency Virus), le ligand peutêtre un fragment d'anticorps contre la fusine, le récepteur CD4 ou contre une 25 protéine virale exyosée (glycoprotéine d'enveloppe) ou encore la partie de laprotéine TAT du virus HIV s'étendant des résidus 37 à 72; (Fawell et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-66~). S'agissant d'une cellule tumorale, le choix se portera sur un ligand reconnaissant un antigène spécifique de tumeur (MIJC-I
dans le cas du cancer du sein, antigènes du papilloma virus HPV ... etc) ou CA 022~1036 1998-09-28 W O 98133929 PCT~R98/00184 surexprimé (récepteur à l'IL-2 surexprin-lé dans certaines tumeurs Iymphoïdes). Si l'on désire cibler les Iymphocytes T, on peut employer un ligand du récepteur decellule T. Par ailleurs, la transferrine est un bon candidat pour un ciblage hépatique.
On peut également citer le peptide EGF (abréviation de Epidermal Growth Factor) 5 permettant le ciblage vers les cellules exprimant le récepteur à l'EGF ou le peptide GRP (pour Gastrin Releasing Peptide) de séquence GNHWAVGHLM (Michael et al., 1995, Gene Ther. 2, 660-668) se liant au récepteur cellulaire GRP. D'une manière générale, les ligands qui peuvent être utilisés dans le contexte de l'invention sont largement décrits dans la littérature.
Un ligand bifonctionnel en usage dans le cadre de la présente invention peut être obtenu par les techniques de l'ADN recombinant, par synthèse ou par couplage chimique des deux parties ligands en question. De préférence, I'adénovirus à cibler est recombinant et porte un gène cytotoxique ou capabl~ d'induire l'apoptose cellulaire. De tels gènes sont parfaitement connus. On peut citer en particulier le 15 gène codant pour la thymidine kinase du virus HSV-I (Virus de l'herpès simplex de type 1).
A titre d'exemples préférés, on peut citer un ligand bifonctionnel comprenant le peptide MH20 et le GRP. I,es domaines peptides MH20 et GRP peuvent être orientés de façon inversée: respectivement MH20-GRP lorsque le MH20 est en 20 position N-terminale et GRP-MH20 lorsque le M~20 est en position C-terminale.Un autre mode de réalisation met en oeuvre un. Iigand ayant une entité MH20 et une entité antic.orps de type ScFv (Single Chain Fv fragment). Selon un mode de realisation particulièrement préféré, ledit ligand bifonctionnel comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie de la séquence25 telle que montrée:
(i) dans la SEQ ID NO: 22 débutant au résidu arginine en position 1 et finissantavec !e résidu methionine en position 35, ou (ii) (ii) dans la SEQ ID NO: 23 débutant au résidu Iysine en position I et finics~nt avec le résidu arginine en position 35.

CA 022~l036 l998-09-28 La présente invention concerne également un ligand bifonctionnel tel que défini ci-avant et, en particulier, les ligands GRP-MH20 ou MH20-GRP. Le ligand GRP-MH20 est particulièrement préféré.
La présente invention a également pour objet une cellule portant à sa surface 5 un tel ligand bifonctionnel. L'avantage d'une telle cellule est d'augmenter le nombre de récepteurs primaires de type MHCl-a2. Ladite cellule est avantageusement une cellule de mammifère d'une origine quelconque (voir ci-dessus). Il s'agit de préference d'une cellule de complémentation d'un adénovirus défectif de la fonction E1 et éventuellement d'une autre fonction (E2, E4, E2 et E4, etc..., voir la demande 10W094/28152). Un exemple préféré est la lignée 293. Elle peut être générée par les techniques de l'ADN recombinant (expression du ligand bifonctionnel au moyen d'un vecteur approprié comportant les éléments perrnettant l'expression à la surface cellulaire, par exemple séquence signal et/ou région transmembranaire), par liaison chimique covalente ou non ou par simple interaction entre la cellule et le ligand.
15La présente invention est illustrée par référence aux figures suivantes:
La Figure I présente les phagotopes obtenus après biorpaillage utilisant l'anticorps lD6.3 (a) ou 7A2.7 (b) à titre de !igand. Les motifs peptidiques desphagotopes sont alignés par rapport à la séquence de la tête d'AdS (le résidu méthionine initiateur de la fibre représentant le +1. Les régions formant des 20 structures feuillets ~ (Xia et al., 1994, sllp~n~ sont soulignées et indiquées par (D), (E) et (~). Les résidus identiques ou conservés dans les séquences sont indiqués en gras.
La Figure 2 présente les phagotopes obtenus après biorpaillage utilisant (a) I'anticorps 7A2.7 ou (c) ID6.3 à titre d'éluant, (b) et (d) les séquences consensus 25 déterrninées à partir des phagotopes (a) et (c) respectivement ainsi que les séquences homologues trouvées par analyse de la banque de données SWISS PROT. Les residus conserves à des pOSitiOllS analogues sont indiqués en gras.
La Figure 3 illustre l'expression du gène luciférase dans les cellules HeLa infectées avec le virus AdSLuc3 à une MOI constante (0,16 ffu/105 cellules).

W 098133929 PCTn~R98/00184 (O) l'Ad5Luc3 est ajouté aux cellules refioidies à 0~C en présence de mo~arit'escroissantes de peptide (a) FN20 (0 à 500 ,~IM) ou (b) MH20 (0 a 50 ~LM). Les témoins correspondent à l'incubation des peptides après l'attachement de l'AdSLuc3 (~) ou après l'endocytose (O).
La ~igure 4 illustre l'expression du gène luciférase dans les cellules Daudi-~LA- (-) ou ~audi-HLA+ (O) infectées avec des concentrations croissantes d'Ad5Luc3 (0,3 à 15û ffu/105 cellules). LlAdSLuc3 est mis en contact des cellules pré-refroidies à 0~C pendant 1 h afin de permettre l'attachement viral mais pas l'entrée. L'activité luciférase est évaluée après ~ 8 h de culture à 37~C. Les valeurs RLU représentent la moyenne de trois experiences séparées.
La Figure S illustre le principe de la méthode du ligand bifonctionnel mimant les récepteurs primaires de l'adénovirus.
La Figure 6 rep-i;se"le l'activité enzymatique luciférase en fonction de la MOI
d'Ad5Luc3 sur les cellules NIH (a), ~wiss 3T3 (b) et HeLa (c).
EXEMPLES
Les cellules HeLa (ATCC CCI,2) sont cultivées en monocouches selon les techniques de l'art. On utilise de préference un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco) contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) inactivé a la chaleur, de la L-glutarnine et des antibiotiques habituels. Les cellules Daudi HLA-(ATCC CCL213) et HLA+ (Quillel et al., 19~8, J. Immunol. 141, 17-20) sont maintenues dans du milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémenté avec 15 % de FCS.
L'AdS sauvage et l'AdSLuc3 recombinant sont propagés dans les cellules HeLa par les teçhniques standards. A titre indicatif, AdSLuc3 est un adénovirus compétent pour la réplication qui contient le gène luciférase placé sous le contrôle du promoteur précoce du virus SV40 (Virus simien 40) inséré dans la région E3 du génome adénoviral (Ivlittal et al., 1993, Virus Research 28, 67-90).

E~EMPLE 1: Production d'anticorps monoclonaux (mAb) capable d'inhiber CA 022~1036 1998-09-28 W 098/33929 rcTn~Rg8/00184 I'attachement de l'AdS aux cellules permissives.

Les mAbs murins ID6.3 et 7A2.7 ont été générés par les techniques classiques en injectant la tête de la fibre d'Ad5 produite dans les bacteries par voie recombinante (Henry et al., 1994, J. Virol. 6S, 5239-5246; Douglas et al., 1996,Nature Biotech 1~, 1574-1578) à des souris Balb/C. La fusion et l'obtention de clones d'hybridomes sont des techniques conventionnelles à la portée de l'homme de l'art. Les clones sécretant sont selectionnés par leur reconnaissance de l'antigène qui a servi à l'immunisation en ELISA. On indigue qu'ils présentent une activité
10 neutralisante à l'égard des virions (Michael et al., en préparation).

Séro-réac~ é des a~7ticorps mo~10clo~1Qllx lD6.3 et 7~2. 7.
La ré~ctivité des anticorps est testée à l'égard du domaine de la tête de la fibre de 3 sérotypes différents (Ad2, AdS et Ad3) préparé par voie recombinante. Les 15 séquences correspondantes sont isolées par PCR (Polymérase Chain Reaction) à
partir d'ADN génomique viral puis introduites dans le virus AcNPV (A~llogra~ha califortlica Nuclear Polyhedrosis Virus) sous le contrôle du promoteur polyhedrine (~uckow et Summer, 1989, Virology 170, 31-39). Les protéines recombinantes sont exprimées dans les cellules d'insecte Sf9 (Spodop~erafr1~gi~erdQ). La technologie 20 générale est détaillée dans Karayan et al. (1994, Virology 202, 782-796) et Novelli et Boulanger (1991, Virology 1~5, 365-3 76). P!us précisément, les séquences Ad5portant le dernier motif répété de la tige suivi de la tête de la fibre, sont clonées à
l'aide des amorces représentées aux SEQ ID NO: 12 et 13. L'amorce sens correspond aux nuciéotides 32164 à 32205 du génome AdS (Chroboczek et Jacrot, 1987, Virology 161, 549-554), inclut 4 mismatch de manière à créer un site BamHIet à remplacer la thréonine en position 388 de la fibre native par un codon ATG
initiateur. L'amorce antisens correspond aux nucléotides 32919 à 32883 du génomeAd5 et permet de creer un site K~ I pour faciliter les étapes ultérieures de clonage.
La protéine recombinante récoltée dans les surn~ge~nt~ de cellules Sfg est désignée CA 022~1036 1998-09-28 Wo 98/33929 PCT/FR98/00184 F5-AT386. La tete de l'Ad2 est produite à partir du vecteur baculovirus décrit dans Louis et al. (1994, J. Virol. 6~1 4104-4106). Le produit d'expression désigné F2-AT388 débute en position 388 (par remplacement de l'Ala de la séquence native par une Met) et porte, outre le domaine de la tête, le dernier motif répété de la tige.
Enfin, pour les séquences correspondantes de l'Ad3, on utilise une amorce sens (SEQ ID NO: 14) conçue pour introduire un site de clonage NcoI et remplacer les codons Asn et Ser en position 124 et 12S par des codons Met et Ala respectivement.
L'amorce antisens (SEQ ID NO: 15) introduit un site Ky~1I. Le produit d'expression est désigné F3-AT124.
Les cupules d'une plaque ELISA sont recouvertes par la protéine recombinante F5-AT386, F2-AT388 ou F3-AT124 sur laquelle on fait réagir le mAb ID6.3 ou 7A2.7 puis un anticorps anti-souris marqué (par exemple à la phosphatase ou la péroxidase). Une réaction positive est observée à l'égard de la protéine recombinante FS-AT386 native. Aucune réaction n'est détectée dans les puits contenant la protéine F5-AT386 dénaturée au SDS ni ceux contenant les produits F2-AT388 et F3-AT124 natifs ou dénaturés. Ces données suggèrent que ces anticorps reconnaissent un épitope conformationnel spécifique du serotype C.

Lffet i~7hibite11~ des a~7tico~ps n10~70clo~7allx ld6.3 et 7A2.7 s1lr l'attacheme~t celllllaire de l'AdS.
On procède à un test de microliaison sur cellules HeLa en culture à l'aide de virions AdS marqués à la valine [14C] (activité spécifique de 2200 à 2500 cpm/ I o8 virions) suivi d'une autoradiographie i~75itll (Silver et Anderson, 1988, Virology 16~, 377-387). Pour ce faire, les cellules à l'état de semi confluence sont mises en présence d'une quantité constante de virions radioactifs (103 cpm pour Sx 104 cellules) à une multiplicité d'infection (MOI) de 1000 virions par cellule pendant I
h à 0~C en présence de mAb ID6.3 ou 7A2.7 (dilutions au 1: 10, 1 :~, 1 :4 et 1 :2 des suln~ge~nts d'hybridomes respectifs dont la concentration en mAb est estimée à 0,1 0,2 ~lg/ml~ ce qui correspond à un excès en mAb par rapport aux virions présents CA 022~1036 1998-09-28 wo 98/33929 PCT/FR98/00184 dans l'innoculum de 100, 250, 500 et 1000 respectivement). Les cellules sont ensuite lavées en présence de PBS, fixées par 0,1 % de paraformaldéhyde dans du PBS, séchées et recouvertes par l'émulsion K4 sous forme de gel (Ilford Nuclear Research). Après une exposition d'une semaine et développement (agent de développement D19B, Kodak), les échalltillons sont colorés brièvement par 0,5 %
de bleu de toluidine repris dans H~O et examinés sous microscope. La densité desgrains d'argent réduit autour du contour des cellules est représentatif du nombre de virions [14C~ liés à la surface cellulaire.
En l'absence de mAb anti-tête ou à une concentration faible (dilution 1: 10), unhalo sombre de grains d'argent réduit est visible autour des cellules indiquant une adsorption des virions à leur surface. Une réduction du halo dépendante de la concentration en mAb est observée pour les dilutions 1 :8, 1 :4 et I :2. Ces résultats traduisent un blocage de la liaison de la tête adénovirale au récepteur cellulaire primaire dû aux mAb ID6.3 et 7A2.7 dirigés contre cette partie de la fibre. Une comparaison de la surface des halos pour les mêmes dilutions montre que l'anticorps 1 D6.3 est plus inhibiteur de l'attachement de 1'Ad5 au récepteur cellulaire des HeLa que le mAb 7A2.7.

EXE~PLE 2: Identification des épitopes des mAb ID6.3 et 7A2.7.
Les épitopes de la fibre étant présumés être conformationnels (Fender et al 1995, Virology 21i(, 110-117), la méthode classique d'identification des épitopes par balayage de peptides n'est pas appropriée. On procède selon une technique de biorpaillage dérivée de celles décrites par Smith et Scott (1993, Methods Enzymol 217, 228-257) et Hong et Boulanger (1995, EMBO J. 1~, 4714-4727). Dans ce cas, le mAb ID6.3 ou 7~!.7 est adsorbé une nuit à 4~C sur une plaque de microtitration (Nunc Immunomodule MaxiSorp F8) à une concentration de 1 ~lg/pUitS dans un tampon carbonate de sodium 0, I M pH9,6. Les anticorps immobilisés sont mis en contact d'une bibliothèque de phages exprimant des hexapeptides (phages flJSE5 CA 022~1036 1998-09-28 W O 98/33929 PCTn~R98/00184 Scott et Smith, 1990, Science 2~9, 386-3gO). Dans une seconde étape les phages retenus sont élués soit par un tampon d'élution acide conventionnel soit, plus sélectivement, par compétition en présence d'un excès de protéine recombinante F5-AT386. Les motifs hexapeptidiques (phagotopes) portés par les phages élués sont S déterminés par séquencage de la protéine pIII ~JSE5 par la méthode de Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7~, 5463-5467). Les homologies de séquences avec les phagotopes sont recherchées dans la banque de donnees Swiss Prot et le programme FASTA 1.6 (Pearson et Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448) et les alignements de séquences réalisées en utilisant la version W(1;4) du programme Clustal (Higgins et Sharp, 1988, Gene 73, 237-244).
Comme le montre la Figure 1, le mAb lD6.3 retient dirré~e,l~s phagotopes dont les séquences se chevauchent, et sont homologues à la tête d'Ad5 s'étendant entre les résidus Val en position 438 et Asp en position 462. En dépit d'un certain degré
de dégénération et de dispersion, on a pu déterminer un motif central de séquence LAPlSGTVQSAHLIIRFD correspondant aux acides aminés en positions 445 à 462 (SEQ ID NO: 8). Ce motif est centre sur le résidu His en position 456, ce ~ui corrobore la présence d'histidine dans plusieurs phagotopes indépendants. De plus, trois phagotopes contiennent une histidine proche d'une sérine (GISHTG e~
GASHTV) et une séquence homologue est trouvee dans la tête (453QSAHL14s~). Du 20 côté N-terminal, la séquence LAPIS est représentée dans plusieurs phagotopes sous la forme L-P, VAP-S et LIPFNS.
Les analyses de séquence des 15 phagotopes retenus par le mAb 7A2.7, ont mises en évidence la présence d'une proline à 4 reprises, de tryptophane et histidine 8 fois et l'association dans le même phagotope de deux résidus aromatiques est 25 trouvée 5 fois. Il semble donc que l'épitope du mAb 7A2.7 contienne un résiduproline, tel que celui en position 475 de la fibre, à proximité d'un groupe de résidus aromatiques, tel que 477YWNF480. En outre, deux phagotopes FWLAVR et WALFRS sont homologues au motif 477YWNFR481. Sur la base de ces données, l'épitope du mAb 7A2.7 a été cartographié entre les résidus 473 et 486 de la fibre WO 98/339t9 PCT/FR98/00184 Ad5 (SEQ ID NO: 10).
En résumé, les mAb ID6.3 et 7A2.7 reconnaissent des segments adjacents de 15 à 20 aa dans la séquence linéaire de la tête d'Ad5, les résidus s'étendant des positions 445 à 462 et 473 à 486 respectivement. Selon le modèle tridimensionnelde la tête proposé par Xia et al. (1994, Glrr. Biol. Structure 2, 1259-1270), les deux épitopes occupent des régions continues d'un point de vue spatial. L'épitope du mAb ID6.3 recouvre une partie de la boucle CD et du feuillet ,B D, alors que l'épitope du mAb 7A2.7 est localisé au niveau du segment adjacent I)E et des deux feuillets ,B E
et F. L'épitope ID6.3 se situe à l'intérieur d'un feuillet R alors que l'épitope 7A2.7 est orienté plus latéralement par rapport au feuillet R.

EXEMPLE 3: Identification des récepteurs cellulaires de l'AdS par la tech~ique de biorpaillage réverse.

Cette technique est dîte réverse par rapport à la précédente puisqu'on utilise la fibre comme ligand et le mAb comme éluant. On procède donc par immobilisationde la tête de la fibre de l'Ad5 sur laquelle on fait réagir la bibliothèque de phages exprimant des phagotopes hexapeptidiques. Les phages adsorbés peuvent être éluéssoit par un tampon acide conventionnel soit par le mAb ID6.3 o~ 7A2.7 et la protéine pIII recombinante portant leurs phagotopes respectifs est séquencée. Larecherche dans les banques de données est effectuée comme ci-dessus. Les motifs hexapeptidiques identifiés sont présentes à la Figure 2.
Les phagotopes produits par compétition avec le mAb 7A2.7 sont présentés à la Figure 2a. Leur analyse perrnet de dériver une séquence consensus (Figure 2b) qui présente une homologie avec les motifs 1, 3, 5 et 14 du module de type III de la fibronectine humaine (SEQ ID NO: :2 à 5) (Main et al., 1992, Cell 7l, 671-678).
Ces derniers se situent au niveau du feuillet ~ B et de la boucle adjacente BC du module ~NIII (Dickinson et al., 1994, J. Mol. Biol. 236, 1079-1092).
Les phagotopes élués après action du mAb lD6.3 sont décrits à la Figure 2c.

CA 022~1036 1998-09-28 W O 98/33929 PCT~R98100184 L'ensemble des séquences se chevauchent et permettent de déterminer également une séquence consensus (Figure 2d). La recherche d'homologie avec les séquences répertoriées dans les banques de donnees révèle une homologie avec la région C-terminale du domaine a-2 de la chaîne lourde des molécules ~vIHC de classe I
(MHC-Ia-2) (position 156 à 180) (SEQ ID NO: 1).

EXEMPLE 4: Interactions de la fibre adénovirale avec le module FNlII et le domaine ~fHC-Ia-2 L'interaction est étudiée i~ vil~o à l'aide d'une protéine chimère issue de la fusion C-terminale de la protéine GST (Glutathion S-transférase) à un pentadécapeptide RHILWTPANTPAMGY reproduisant la séquence consensus homologue au feuillet ,~ B et la boucle BC de FNIII (voir exemple précedent et Figure 2b). Pour ce faire, les oligonucléotides présentés aux identificateurs delS séquences 16 et 17 sont hybridés et introduits dans le siteXhoI du plasmide pGEX-KG (Guan et Dixon, 1991, Anal. Biochem. 192, 262-2~7). Il est à noter que les oligonucléotides une fois réhybridés génèrent un site XhoI à l'e~ll émilé 5' si l'insert est cloné dans l'orientation correcte. Ceci permet d'intégrer une seule copie ou de multiples copies en tandem au niveau du site XhoI reconstitué. La séquence du produit de fusion comprenant une copie du pentadécapeptide (désigné GST-FNxl ) nellt etrP .~(~.h~m~tic.o.~ m~ni.orP clliv~nt~ ('TCT ~CitP tl,o ~ r Iz~

CA 022~1036 1998-09-28 W O 98~3929 PCT~Rg8/00184 Carrière et al. (1995, J. Virol. 69, 2366-2377) et les luminogrammes (Hypelfilm ,~-max, Amersham) sont analysés à 610 nm à l'aide d'un densitomètre automatique (REP-EDC, Helena Laboratories, Beaumont, TX). A titre indicatif, l'anticorps 4D2.5 reconnâît l'épitope FNPVYP du domaine de la queue conservé chez la plupart des adénovirus mammifères. .
GST-FNxl, GST-FNx2 et GST-FNx3 se lient à F5-AT386 et F2-AT388 avec une grande efficacité alors que F3-AT124 est retenu à un moindre niveau. Un comportement similaire est observé avec les protéines chimères GST-MHCxl, GST-MHCx2 et GST-MHCx3 qui retiennent FS-AT386 et F2-AT388 avec une efficacité
10 supérieure à F3-AT124.
La fibre Ad5 se lie aux protéines de fusion GST-FN et GST-MHC et ceci avec une affinité 2 à 3 fois supérieure par rapport à la fibre Ad2 et 10 à 15 fois supérieure par rapport à la fibre Ad3. De plus, l'efficacité de liaison n'est pas dépendante du nombre de motifs ~,ésent~ dans la protéine de fusion, l'intensité étant comparable et 15 même parfois plus faible entre GST-FNxl et GST-FNx3 et GST-MHCx1 et GST-MI~Cx3. Ceci peut être expliqué par le fait que les motifs en tandem peuven~ adopter une conformation ~lui nuit à la liaison.

EXEMPLE 5: Influence des peptides synthétiques dérivés de FNlII et MHC-Ia2 sur l'attachement des virus à la surface cellulaire.

Deux peptides synthétiques reproduisant les motifs FNIIl et MHC-Ia2 ont été
synthétisés chimiquement et purifiés selon les techniques de l'art. FN20 (SEQ IDNO: 7) reproduit la séquence consensus des phagotopes élués par l'anticorps 7A2.7 25 et MII20 (SEQ ID NO: 6) correspond a celle des phagotopes élués par le mAb ID6.3.
Les peptides FN20 et MH20 sont testés vis a vis de l'attachement de l'adénovirus rapporteur Ad5Luc3 à des cellules HeLa cultivées it~ ro. L,e test est réalise en partie à 0~C, une température qui perr~et l'attachement des virus à la CA 022=.1036 1998-09-28 W O 98/33929 PCT~FR98/00184 surface des cellules permissives mais, en revanche, bloque l'entrée des virus et le recyclage des récepteurs. L'AdSLuc3 (MOI 0,16 pfu/10 cellules) est préalablementincubé avec des quantités croissantes de peptides (0,01 à 500 nM) à température ambiante pendant 2 heures puis le mélange est ajoute à une culture cellulaire placée sur glace. Après I h à 0~C, les virus non adsorbes et les peptides sont éliminés par lavage et la culture est poursuivie pendant 18 h à 37~C après ajout d'un milieu préchauffé. Les Iysats cellulaires sont préparés de manière conventionnelle et l'activité luciférase exprimée en RLU (pour Relative Light Units en anglais) estdéterminée (substrat Promega, Madison~ WI; luminomètre Lumat LB-9501, 10 Brethold Bioanalytical, Wildbad, Allemagne).
Les résultats de compétition avec le peptide FN20 sont présentés à la Figure 3a. Aucun effet significatif n'est obtenu jusqu'à une molarité de 10 ~lM puis une augmentation progressive de l'activité luciférase apparâît au delà de 25 ~LM. Enparticulier, l'activité croît d'un facteur 100 entre 25 et 100 IlM. Le peptide FN20 a 15 donc un effet stimul~teur de l'attachement viral. Il ne confère aucune cytotoxicité
apparente et n'a pas d'effet négatif sur l'expression du gène luciférase une fois le virus préattaché (peptide ajouté à la culture cellulaire après l'étape d'attachement viral à
0~C) ou préendocytosé (peptide ajouté à la culture cellulaire après l'etape d'attachement et de pénétration du virus~.
Dans le cas du peptide MH20 (Figure 3b), on observe une légère augmentation de l'expression du gène luciférase pour les molarités comprises entre 0,05 et 2,5 ~M
(activité 5 à 6 fois plus élevée à 2,5 IlM). Ce phénomène est suivi d'une diminution rapide des niveaux de luciférase lorsque les molarités utilisées sont supérieures à 5 ~lM, avec une diminution d'un facteur 100 par rapport au contrôle à 25 ,uM et depresque quatre ordres de magnitude à 50 ,uM, montrant que lié au virus, il bloque la fixation au récepteur cellulaire. Comme précédemment, le peptide MH20 à des concentrations de 50 ,uM ne présente aucun effet cytotoxique et n'influence pas l'expression du gène reporter après le préattachement ou la préendocytose de l'Ad5Luc3. L'inhibition presque totale de l'activité luciférase en présence de 50 ~M

CA 022~1036 1998-09-28 WO g8/33929 rCT/FR98/00184 de MH20 est le reflet d'une neutralisation complète du virus.

EXEMPLE 6: Séro-spécificité de la neutralisation virale par les peptides synthétiques.
s Les adénovirus sauvages Ad5, Ad2 Ad3 sont préincubés pendant 2 h à
température ambiante avec le peptide inhibiteur MH20 à une molarité constante (25 ,uM), la MOI variant de 0,2 à 2 pfu/cellule. Le mélange est mis en présence des cellules HeLa pendant I h à 0~C et la culture poursuivie à 37~C après élimination des 10 virus non adsorbés dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Le niveau de synthèse de l'hexon, de la protéîne 100k, du penton base est de la fibre est estimé par immunotitration (Wohlfart, 1988, J. Virol. 62, 2321-2328) sur les extraits cellulaires recueillis 48 h après l'infection.
L'infection des cellules HeLa par l'Ad5 ou 1'Ad2 à une MOI de 0,2 à 2 15 pfu/cellule en présence de 25 ~M de MH20 pendant la phase d'attachement du virus~
est suivie d'une inhibition de la synthèse des protéines de la capside virale hexon, proteine 100 k, penton base et fibre 4~ h après l'infection (facteur ~5 à 30). Par contre, lorsque l'infection est réalisée dans les mêmes conditions par l'Ad3 sauvage, la synthèse des protéines structurales n'est réduite ~lue d'un facteur 1,5 à 2, ce qui 20 suggère que la neutralisation adénovirale par MH20 est serotype dépendante.

EXEMPLE 7: Affinité de la fibre Ad5 pour les peptides FN20 et M1~2G.

5, 10 et 25 !lM de peptides synthétiques FN20 ou MH20 sont immobilisés sur 25 la surface polystyrène d'une plaque de microtitration à 96 puits (Nunc, Maxisorb) pendant une nuit à 4~C. Après lavage puis blocage avec une solution d'albumine sérique bovine (BSA) 3 % dans du tampon PBS, on fait réagir des concentrations croissantes de fibres F5-FL581 reprises dans du tampon PBS et marquées radioactivement (marquage à la [35S] méthionine et la [35S] cystéine; activité

CA 022~1036 1998-09-28 Wo 98/33929 PCT/FR98100184 spécifique de 50000 à 65000 cpm/~g de protéine). La fibre adsorbée sur l'un ou l'autre des peptides est éluée avec une solution adéquate (urée IM, NaOH 1 M et SDS 1 %) puis précipitée en présence d'acide trichloroacétique. La radioactivitécontenue dans le précipité récupéré sur filtre GF/C est comptée à l'aide d'un 5 spectromètre à scintillation liquide (Beckman LS-6500) et les constantes de dissociation (Kd) déterminées selon Scatchard (1949, Annls NY Acad. Sci. 51, 660-672).
Le Kd de la fibre Ad5 marquée à l'égard du peptide MH20 est évalué à 3,0+
0,6 nM et celui trouvé pour le peptide FN20 est de 8,0~ 1,9 nM (n=3 dans les deux 1 0 cas).

EXEMlPLE 8: L'infectivité de l'Ad5 est dépendante de l'expression des MHC-I
à la surface des cellules permissives.

La lignée Daudi de Iymphoblastoides B, établie à partir d'un Iymphome de Burkitt, est naturellement déficiente en l'expression de la ~-2 microglobuline et, de ce fait, ne possède pas à sa surface les molécules HLA de classe I (Daudi HLA-). La lignée cellulaire E8.1 dérivée des Daudi a été générée par transfection d'un gène codant pour la ~-2 microglobuline afin de restaurer l'expression de molécules ~A20de classe I à leur surface (Daudi-HLA+; Quillet et al., 1988, J. Immunol. 1~1, 17-20) Les expériences d'attachement de l'AdSLuc3 à 0~C ont été menées sur les cellules Daudi HLA- et Daudi-HLA+ avec une MOI de trois ordres de magnitude plus forte que celle employée dans le cas des cellules HeLa (0,3 à 150 pfu/105 25cellules). L'activité luciférase mesurée dans les Iysats cellulaires 18 h post-infection est representée à la Figure 4. Lorsque l'infection concerne les cellules Daudi-IILA+, l'activité luciférase augmente régulièrement d'une manière MOI dépendante jusqu'à
atteindre un plateau au delà de 5 pfu/105 cellules. Pour ce qui est des cellules Daudi HLA-, le signal luminescent est très faible ~3 à 4 ordres de magnitude) par rapport CA 022~1036 1998-09-28 W O 98/33929 PCT~R98/00184 à celui observé avec les cellules pourvues de molécules HLA fonctionnelles à leur surface. Ces expériences montrent que l'expression du MHC-I à la surface cellulaire est nécessaire à l'infection Ad5.
~ EXEMPLE 9: Li~and bifonctionnel mimant les récepteurs primaires de l'adénovirus.

Ce exemple décrit la construction d'un peptide bifonctionnel qui contient deux domaines, l'un reconn~iss~nt la tête de la fibre adénovirale et l'autre une protéine 10 cellulaire de surface. On utilise ci-après un peptide dans lequel le MH20 est fusionné
au GRP (Gastrin Releasing Peptide). Deux constructions sont possibles, orientantles deux domaines peptidiques de facon inversée, N- versus C-terrninal, donnant lieu au peptide MH20-GRP (SEQ ID No: 22) et au peptide à orientation inverse GRP-MH20 (SEQ ID No: 23).
Comme illustré à la Figure 5, la liaison de ce peptide aux récepteurs GRP de la surface cellulaire devrait créer des <deurres~ de récepteurs viraux du même type que les récepteurs primaires, c'est a dire le domaine a2 des molécules de classe I du MHC. Le résultat apparent est de créer ou d'augmenter le nombre de récepteurs viraux primaires de l'adénovirus à la surface de cellules possédant des récepteurs au GRP.
Les cellules humaines (HeLa) ou murines (S~iss-3T3 ou NIH-3T3, ATCC
CRL-1658) sont rincées et incubées entre 0 et 4~C avec une solution isotonique (PBS) à 500 ~M en peptide. Après 1 h, la solution est enlevée et remplacée par l'inoculum viral (AdSLuc3) selon un protocole déjà décrit (voir ci-avant ou Honget al., 1997, EMBO ~. 16, 2294-2306). Le virus est incubé 1 heure entre 0 et 4~Cpour permettre son attachement, puis l'excès de virus non adsorbé est rincé avec du milieu de culture pré-refroidi à 4~C et les cellules sont replacées à 37~C en présence de milieu de culture pré-chauffé à 37~C. Le virus est endocytosé à 37~C et le cycle viral se déroule alors pendant 18 à 20 h à 37~C.

CA 022~l036 l998-09-28 W 098/33929 PCTn~R98/00184 Comme montré à la Figure 6, on constate que les courbes obtenues en absence de tout peptide (courbes témoin indiquées: - peptide) et celles en présence de peptide dans l'orientation MH20 côté N-terminal - lié au GRP en C-terminal (MH:20 - GRP) présentent une pente identique.
Par contre, dans le cas de l'orientation inverse, GRP du côté N-terminal, et MH20 du côté C-terminal, l'augmentation du nombre de virus adsorbés est significative, comme le montre l'augmentation de l'activité luciférase: ~ à lO fois pour le NIH-3T3, 5 à 6 fois pour les cellules HeLa et 2 à 3 fois pour les Swiss-3T3.
La liaison de la portion GRP du peptide bifonctionnel, ligand des récepteurs GRP, lO a permis d'accroître le nombre apparent de récepteurs de la fibre d'AdS, de type domaine alpha 2 des molécules de classe I du MHC (MHC 1-c~2).

CA 022~1036 1998-09-28 W 0 98/33929 PCT~R98/00184 LISTE DE SEQUENCES

~l) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Centre Natioral de la Recherche Scientifique (CNRS) (B) RUE: 3 rue Michel Ange (C) VILLE: Paris IE) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 75794 Cedex 16 (G) TELEPHONE: (33) 0l 44 9G 40 00 (H) TELECOPIE: (33) 01 ~4 96 50 00 (i~) TITRE DE L' INVENTION: Récepteurs cellulalres des adénovirus.
(iii) NOMBRE DE S QUENCES: 23 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATE~R:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IE~M PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release ~l.0, Version #l.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides am.inés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: pept~de (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: domaine alpha 2 des antigenes MHC-I
(positions 156 a 130) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: l:
Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr l 5 l0 15 Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln (2) INE'ORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

CA 022~1036 1998-09-28 W 098/33929 PCT~R98100184 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 acides aminés ~B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: modul.e de type III 1 de la fibronectine humaine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Asn Ser His Pro Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés (~) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: module de type III 4 de la fibronectine humaine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr Pro Pro Glu Ser Ala Val Thr Gly Tyr Arg Val Asp Val Ile Pro Val Asn (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acid~s aminés W O 98/33929 PCTn~R98/00184 (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGUP~ATION: linéaire (li) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
~v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapien:s (C) INDIVIDUEL ISOLE: modu.le de type III 5 de la fibronectine humaine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Ser Thr Val Leu Val Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ala Gln Ile Thr Gly l 5 l0 15 Tyr Arg Leu Thr Val Gly Leu Thr Arg (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 acides aminés ~B) TYPE: acide aminé
~D) CONFIGURATION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: peptide ~ii.i) HYPOTHETIQUE: NON
~v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
~A) ORGANISME: homo sapiens ~C) INDIVIDUEL ISOLE: modu:Le de type III l~ de la fibronectine humaine ~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly l 5 l0 15 Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Ser ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6.
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 20 acides aminés ~B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide CA 022~1036 1998-09-28 (lii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: peptide de synthese MH20 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Arg Ala Ile VaL Gly Phe Arg Va:L Gln Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val Asn Gly Ser Arg (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (lii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: peptide de synthese FN20 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
Arg His Ile Leu Trp Thr Pro Ala Asn Thr Pro Ala Met Gly Tyr Leu Ala Arg Val Ser (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne ~vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (C) INDIVIDUEL ISOLE: serotype 5 (xi) DESCRI~TION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Leu Ala Pro Ile Ser Gly Thr Val Gln Ser Ala His Leu Ile Ile Arg CA 022~1036 1998-09-28 W 098/33929 PCT~R98/00184 Phe Asp (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (ili) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (C) INDIVIDUEL ISOLE: serotype 2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Val Ala Ser Val Ser Ile Phe Leu Arg Phe Asp Gln Asn Gly Val 1 5 l0 15 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l0:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (C) INDIVIDUEL ISOLE: serotype 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Leu Asp Pro Glu Tyr Trp Asn Phe Arg Asn Gly Asp Leu Thr l 5 l0 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: ll:
(i; CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYEE DE MOI,ECULE: peptide .

CA 022~1036 1998-09-28 W 098/33929 PCT/~h58~ 84 (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: interne (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (B) SOUCHE: serotype 2 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Asn Ser Ser Leu Lys Lys His Tyr Trp Asn Phe Arg Asn (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: acide nuclélque (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: li.néaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANI-~ME: Mastadenovirus (B) SOUCHE: serotype 5 (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (nt32164 32205 Ad5) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: linéalre ~ii) TYPE DE MOLSCULE: ADN ~génomique) ~iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus . .

CA 0225l036 l998-09-28 W 098/33929 PCTA~R98/00184 ~37-(B) SOUCHE: serotype 5 (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (nt-32919 32883 Ad5) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g~nomique) (iil) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (B~ SOUCHE: serotype 3 (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (Ad3) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomiqu,e~
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (B) SOUCHE: serotype 3 (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (Ad3) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:

CA 022~l036 l998-09-28 W 098/33929 PCT~R98/00184 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D~ CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ~génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (sequence consensus FNIII) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(lii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (sequence consensus FNIII) (~i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases (B) T''PE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON

CA 022~1036 1998-09-28 W O 98/33929 PCT~R98/00184 (vi) ORIGINE;
(A) ORGANISME: homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese codant pour la séquence consensus MHC-I

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:

CGAGG . 65 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: linéalre (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: homo sapiens (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese codant pour aa 157-176 du MHC-I

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovirus (B) SOUCHE: serotype 5 (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (nt 31021-31050 Ad5) *rB

CA 022~l036 l998-09-28 W 098/33929 PCTrFR98/00184 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Mastadenovlrus (B) SOUCHE: serotype 3 (C) INDIVIDUEL ISOLE: oligonucleotide de synthese (Ad3) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: N-terminal i) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: MH20/GRP

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
Arg Ala Ile Val Gly Phe Arg Val Gln Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val l 5 10 15 Asn Gly Ser Arg Lys Met Tyr Pro Ary Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23:

W O 98/33929 PCTn~R98/00184 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 acides aminés (B) TYPE: aclde aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(v) TYPE DU FRAGMENT: N-terminal (vi) ORIGINE:
(C) INDIVIDUEL ISOLE: GRP/MH20 (Xl) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
Lys Met Tyr Pro Arg Gly Asn His Trp Ala Val Gly His Leu Met Arg Ala Ile Val Gly Phe Arg Val Gln Trp Leu Arg Arg Tyr Phe Val Asn Gly Ser Arg .

Claims (37)

Revendications

1. Utilisation d'un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée (a) dans la SEQ ID NO. 1 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25, (b) dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, (c) dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 25, (d) dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu sérine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou (e) dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu sérine en position 25;
pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule hôte.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides amines homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 1 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu glutamine en position 25.

3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I(MHC-I) et, de préférence, de la chaîne lourde dudit MHC-I.

4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie du domaine .alpha.2 de ladite chaîne lourde.

5. Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie d'un antigène HLA A, B, C, D, E ou F.

6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée:
- dans la SEQ ID NO: 2 commençant avec le résidu asparagine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 26, - dans la SEQ ID NO: 3 commençant avec le résidu valine en position 1 et finissant avec le résidu asparagine en position 25, - dans la SEQ ID NO: 4 commençant avec le résidu sérine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 25, et/ou - dans la SEQ ID NO: 5 commençant avec le résidu asparagine en position I et finissant avec le résidu sérine en position 25.

7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie de la fibronectine.

8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit polypeptide comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à tout ou partie d'au moins un module de type III de la fibronectine.

9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit adénovirus est de sérotype C.

10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit adénovirus est de sérotype 2 ou 5.

11. Cellule capable d'exprimer un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 10.

12. Cellule selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite cellule surexprime ledit polypeptide.

13. Utilisation d'une cellule selon la revendication 11 ou 12, pour permettre ou faciliter l'attachement d'un adénovirus à ladite cellule et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule.

14. Utilisation d'un ligand pour influencer l'attachement d'un adénovirus à une cellule hôte et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule hôte médiés par un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 10.

15. Utilisation d'un ligand selon la revendication 14, pour influencer de façon négative l'attachement d'un adénovirus à ladite cellule hôte et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule hôte médiés par un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 et 10.

16. Utilisation d'un ligand selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit ligand comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 6 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 20.

17. Utilisation d'un ligand selon la revendication 14, pour influencer de façon positive l'attachement d'un adénovirus à ladite cellule hôte et/ou l'entrée dudit adénovirus au sein de ladite cellule hôte médiés par un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 et 6 à 10.

18. Utilisation d'un ligand selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit ligand comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 7 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu serine en position 20.

19. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que ledit ligand a une constante de dissociation (kd) à l'égard dudit adénovirusde 0,01 à 100 nM, et notamment de 0,1 à 50 nM.

20. Ligand tel que défini dans la revendication 16, 18 ou 19.

21. Utilisation d'un ligand selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit ligand est d'origine adénovirale.

22. Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adénovirus et, notamment, du domaine de la tête.

23. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 et 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adénovirus de sérotype 5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 8 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu acide aspartique en position 18.

24. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 et 9 et 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adénovirus de sérotype 2 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 9, commençant avec le résidu thréonine en position 1 et finissant avec le résidu valine en position 16..

25. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 et 6 à 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adénovirus de sérotype 5 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 10 commençant avec le résidu leucine en position 1 et finissant avec le résidu thréonine en position 14.

26. Utilisation selon la revendication 22 pour interagir avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 et 6 à 10, caractérisée en ce que ledit ligand dérive de la fibre d'un adénovirus de sérotype 2 et comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus de la séquence telle que montrée dans la SEQ ID NO: 11 commençant par le résidu asparagine en position 1 et se terminant au résidu asparagine en position 13.

27. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 14 à 26, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber ou diminuer une infection par un adénovirus.

28. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 14 à 26, pour la préparation d'un médicament destiné à favoriser ou faciliter une infection par un adénoviruset, en particulier, un adénovirus recombinant.

29. Méthode pour sélectionner ou identifier un récepteur cellulaire d'un virus dans un échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes:
(a) immobilisation sur un support inerte d'un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie d'une protéine de surface dudit virus déterminant l'attachement dudit virus audit récepteur cellulaire, (b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon, (c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec tout ou partie d'un anticorps dirigé contre ledit réactif d'origine virale, et (d) analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).

30. Méthode pour sélectionner ou identifier la partie d'une protéine virale déterminant l'attachement d'un virus à un récepteur cellulaire dans un échantillon approprié, comprenant les étapes suivantes:
(a) immobilisation sur un support inerte de tout ou partie d'un anticorps dirigécontre ladite protéine virale, (b) incubation pendant un temps déterminé avec ledit échantillon, (c) élution de l'échantillon retenu à l'étape (b) avec un réactif d'origine virale comprenant tout ou partie de ladite protéine virale, et (d) analyse de l'échantillon élué à l'étape (c).

31. Méthode selon la revendication 29 ou 30, caractérisée en ce que ledit échantillon est une bibliothèque peptidique ou une bibliothèque de phages exprimant des motifs peptidiques.

32. Méthode selon l'une des revendications 29 à 31, caractérisée en ce que ledit virus est un adénovirus, notamment de sérotype C, le réactif d'origine virale comprend à tout ou partie de la fibre et, notamment, de la tête d'un adénovirus et l'anticorps est inhibiteur de l'attachement du virus à la surface de la cellule hôte.

33. Utilisation d'un ligand bifonctionnel pour le ciblage d'un adénovirus vers une protéine de surface cellulaire autre que le récepteur cellulaire naturel dudit adénovirus, ledit ligand bifonctionnel comportant une première partie ligand capable d'interagir avec la fibre dudit adénovirus, une deuxième partie ligand capable d'interagir avec ladite protéine de surface cellulaire et, éventuellement, un espaceur entre lesdites première et deuxième parties ligands ; ladite première partie ligand ayant les caractéristiques du ligand tel que défini aux revendications 14 à 20.

34. Utilisation selon la revendication 33, selon laquelle ladite première partie ligand comprend une séquence en acides aminés homologue ou identique à au moins 6 acides aminés continus compris dans la SEQ ID NO: 6 et plus particulièrement a une séquence en acides aminés identique à la SEQ ID NO:
6 commençant avec le résidu arginine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 20.

35. Utilisation selon la revendication 33 ou 34, selon laquelle ledit ligand bifonctionnel comprend une séquence en acides amines homologue ou identique à tout ou partie de la séquence telle que montrée:
(i) dans la SEQ ID NO: 22 débutant au résidu arganine en position 1 et finissant avec le résidu methionine en position 35, ou (ii) dans la SEQ ID NO: 23 débutant au résidu lysine en position 1 et finissant avec le résidu arginine en position 35.

36. Ligand bifonctionnel tel que défini dans l'une des revendications 33 à 35.

37. Cellule portant à sa surface un ligand bifonctionnel selon la revendication 36.