CZ289039B6 - Izolovaná nukleová kyselina obsahující gen kódující intracelulární jednořetězcovou protilátku, vektory a defektní rekombinantní viry tuto sekvenci obsahující afarmaceutické kompozice s jejich obsahem k léčbě rakoviny - Google Patents
Izolovaná nukleová kyselina obsahující gen kódující intracelulární jednořetězcovou protilátku, vektory a defektní rekombinantní viry tuto sekvenci obsahující afarmaceutické kompozice s jejich obsahem k léčbě rakoviny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289039B6 CZ289039B6 CZ19953295A CZ329595A CZ289039B6 CZ 289039 B6 CZ289039 B6 CZ 289039B6 CZ 19953295 A CZ19953295 A CZ 19953295A CZ 329595 A CZ329595 A CZ 329595A CZ 289039 B6 CZ289039 B6 CZ 289039B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- antibody
- intracellular
- isolated nucleic
- protein
- Prior art date
Links
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 57
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 20
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 16
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 6
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010027920 GTPase-Activating Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 26
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 15
- 102100022709 Putative alpha-1-antitrypsin-related protein Human genes 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 13
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 7
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 6
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 6
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 6
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 6
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 235000015047 pilsener Nutrition 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- -1 jun Proteins 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 4,7,7-trimethylbicyclo[4.1.0]heptan-5-one Chemical compound O=C1C(C)CCC2C(C)(C)C12 CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101000891649 Homo sapiens Transcription elongation factor A protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700003968 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (49-57) Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100247323 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ras-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000002072 anti-mutant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002389 anti-papilloma Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000009841 epithelial lesion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1072—Regulatory proteins, e.g. tat, rev, vpt
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
e en se t²k nukleov²ch sekvenc , obsahuj c ch gen k duj c vazebn² intracelul rn protein (PIL), a jejich pou it v genov terapii, p°i em uveden nukleov sekvence jsou p° padn zabudov ny do p° slu n²ch expresn ch vektor .\
Description
Izolovaná nukleová kyselina obsahující gen kódující intracelulární jednořetězcovou protilátku, vektory a defektní rekombinantní viry tuto sekvenci obsahující a farmaceutické kompozice s jejich obsahem k léčbě rakoviny
Oblast techniky
Vynález se týká nukleových sekvencí, vektorů tyto nukleové sekvence obsahující a jejich terapeutických použití, zejména v genové terapii. Specificky se vynález týká nukleových sekvencí obsahujících gen kódující intracelulární vazebný protein (PIL - protéine intracellulaire de liaison) a jejich použití v genové terapii, přičemž tyto nukleové sekvence jsou případně zabudovány do příslušných expresních vektorů.
Dosavadní stav techniky
Genová terapie spočívá v korekci nedostatečnosti nebo abnormality (mutace, aberační exprese a podobně) zavedením do nesprávně fungující buňky nebo do nesprávně fungujícího orgánu genetické informace. Tato genetická informace může být zavedena buď in vitro do buňky extrahované z uvedeného orgánu, přičemž takto korigovaná buňka je potom opětovně zavedena do organismu, nebo in vivo přímo do příslušné tkáně. V tomto ohledu jsou v příslušné odborné literatuře popsány různé transfekční techniky a techniky přenosu genů (viz Roemer a Friedman, Eur.J.Biochem.208 (1992)211). Až do současné doby spočívají všechny takové dosud známé techniky genové terapie vtransfekci genů kódujících aktivní polypeptidy implikované v genetických chorobách (hormony, růstové faktory, atd.), antimediátorových genů nebo antigenních peptidů pro realizaci vakcín.
Vynález se týká nového metodického přístupu genové terapie, spočívajícího vtransfekci a v expresi v cílové buňce (nebo tkáni) intracelulámího peptidu schopného interakce s buněčnými složkami a takto interference s buněčnými funkcemi. Vynález spočívá zejména ve zjištění, že je možné exprimovat in vivo modifikované protilátky, které zůstávají v intracelulární oblasti a které mohou regulovat některé buněčné funkce. Vynález rovněž spočívá ve zjištění, že je možné klonovat DNA sekvence kódující intracelulární protilátky ve vektorech, zejména virových vektorech, pro použití v genové terapii.
Použití protilátek v humánní terapii obecně umožňuje zaměřit a neutralizovat biologické komplexy cirkulující nebo/a lokalizované na povrchu buněk spuštěním kaskády jevů řízených imunitním systémem, což má za následek eliminaci uvedených komplexů. Nicméně v mnoha případech, a to například v případě rakovin nebo nemocí způsobených například viry, je takovýto postup sterilní, neboť antigen, který je zodpovědný za deregulaci zasažených buněk, je pro injikované protilátky nedosažitelný. Vynález nabízí nový obzvláště výhodný terapeutický metodický postup spočívající v tom, že se kontinuálně a intracelulámě produkují protilátky nebo terapeutická činidla, jejichž vazba na jejich epitop redukuje nebo/a anuluje uvedenou deregulaci.
Možnost exprimovat protilátky rekombinantním způsobem již byla v literatuře popsána. Takto v evropském patentu EP 88994 je popsána exprese in vitro a purifikace variabilních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců protilátek. Stejně tak se v patentu ÚS 4 946 778 popisuje exprese in vitro DNA sekvencí kódujících modifikované protilátky tvořené variabilními oblastmi těžkého a lehkého řetězce protilátky spojené spojovníkem (linkerem). Nicméně protilátky popsané v tomto patentu jsou inaktivní a obecně syntetitované ve formě nerozpustných inkluzních tělísek. Tyto protilátky musí být tedy purifikovány a potom podrobeny chemickým zásahům (denaturace, renaturace, atd.) za účelem opětovného nabytí účinnosti.
Tento vynález demonstruje možnost použití takových DNA sekvencí pro přímou expresi in vivo aktivních intracelulámích protilátek. Tento vynález takto prokazuje možnost použití takových
-1 CZ 289039 B6
DNA sekvencí kódujících intracelulámí protilátky pod kontrolou oblastí umožňujících expresi v savčích buňkách pro genovou terapii, zejména u člověka. Tato nová metodika umožňuje tudíž zacílit buněčné složky, které až dosud nebyly zasažitelné klasickými očkovacími postupy. Kromě toho tento postup nevyvolává rozvoj imunitní odezvy, nýbrž působí intracelulámě.
Podstata vynálezu
Prvním předmětem vynálezu je tedy sekvence nukleových kyselin obsahující gen kódující vazebný intracelulámí protein (PIL) pod kontrolou oblasti umožňující jeho expresi v savčích buňkách.
Vynález se rovněž týká vektorů obsahujících sekvenci nukleových kyselin, která byla definována výše. Vektory podle vynálezu jsou zejména vektoiy virového původu, jakými jsou retroviry, adenoviry, adenovirům přidružené viry, vir herpes, vir nešťovic, vir HSV, atd.
Vynález se rovněž týká použití těchto sekvencí nukleových kyselin nebo těchto vektorů pro přípravu farmaceutických kompozic určených pro chirurgické nebo/a kurativní léčení lidského nebo zvířecího těla.
Vynález se rovněž týká každé farmaceutické kompozice obsahující výše definovaný vektor, zejména virový, nebo výše uvedenou sekvenci nukleových kyselin.
V rámci tohoto vynálezu označuje výraz vazebný intracelulámí protein (PIL) každý protein nebo fragment proteinu, který je schopný poznat složku buňky, ve které je exprimován, a vstoupit selektivně v interakci s touto složkou. Může se jednat o kovalentní nebo nekovalentní chemickou interakci. Tato interakce s buněčnou složkou (proteiny, lipidy, aminokyseliny, RNAm, RNAt, RNAr, DNA, atd.) umožňuje působit na buněčnou funkci, při které se uplatňuje uvedená složka, a takto regulovat (stimulovat, zpomalit nebo inhibovat) tuto funkci.
Výhodně jsou PIL podle vynálezu tvořeny molekulami odvozenými od protilátek nebo molekulami, které mají vazebné vlastnosti srovnatelné s vazebnými vlastnostmi molekul protilátek. Zejména se jedná o proteiny mající selektivitu a afinitu dostatečnou k umožnění interakce in vivo mající neutralizační účinek na antigen. Tyto molekuly jsou v následujícím textu označeny vzhledem k jejich vlastnostem a jejich lokalizaci jako intracelulámí protilátky.
Protilátky, což jsou molekuly rozsáhlé skupiny imunoglobulinů, jsou syntetizovány přirozenou cestou (hlavně lymfocyty B) ve formě sekrečních proteinů. Tyto protilátky jsou tedy uvolňované do extracelulámích prostorů (oběhový systém), kde vykonávají svojí aktivitu (rozpoznání antigenů a vazba na ně). Nyní bylo prokázáno, že je možné exprimovat in vivo modifikované geny kódující intracelulámí protilátky, aniž by došlo k ovlivnění specifičnosti a afinity protilátek. Sekvence nukleových kyselin podle vynálezu, které kódují intracelulámí protilátky, tedy obsahují gen protilátky modifikovaný tak, aby tato protilátka nebyla z buněk vylučována. Zejména se jedná o gen protilátky, který je modifikován delecí nebo mutací sekvencí odpovědných za sekreci protilátky. PIL podle vynálezu mohou být zejména tvořeny fragmenty protilátky a například fragmenty Fab nebo F(ab)'2, které nesou domény vazby antigenů. Použití tohoto typu intracelulámí protilátky nicméně implikuje expresi sekvence nukleových kyselin obsahující několik genů kódujících těžké resp. lehké oblasti těchto fragmentů, přičemž uvedené použití rovněž rezultuje v tom, že se tyto řetězce přesně sdružují in vivo. Z tohoto důvodu je obzvláště výhodnou formou intracelulámích protilátek použitelných v rámci vynálezu forma tvořená peptidem odpovídajícím místu vazby variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky spojeným peptidovým íinkerem k peptidu odpovídajícímu místu vazby variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky. Použití tohoto typu intracelulámí protilátky, označené jako ScFv, je zajímavé, neboť jde o expresi jediným genem. Konstrukce sekvencí nukleových kyselin kódujících takové
-2CZ 289039 B6 modifikované protilátky podle vynálezu je ilustrována v dále zařazených příkladech provedení vynálezu.
Sekvence nukleových kyselin kódujících intracelámí protilátky podle vynálezu mohou být rovněž modifikovány chemickou, enzymatickou nebo genetickou cestou s ohledem na generování stabilizovaných intracelulámích protilátek nebo/a multifunkčních intracelulámích protilátek nebo/a protilátek s redukovanou velikostí nebo/a s cílem upřednostnit jejich lokalizování v tom, či onom intracelulámím prostoru. Takto mohou sekvence nukleových kyselin podle vynálezu zahrnovat sekvence nukleových kyselin podle vynálezu zahrnovat sekvence kódující peptidy s jádrovou lokalizací (NLS). Zejména je možné sloučit sekvence podle vynálezu se sekvencí kódující NLS viru SV40, který má následující peptidovou sekvenci: MPKKKRK (Kalderon a kol., Cell 39 (1984) 499).
Jak již bylo uvedeno výše, zahrnují sekvence nukleových kyselin podle vynálezu sekvence umožňující expresi genu nebo genů kódujících PIL v savčích buňkách. Obecně jsou geny PIL uloženy pod kontrolou promočních oblastí transkripce a translace, které jsou funkční v savčí buňce, ve které má dojít k expresi. Může se jednat o homologní sekvence vzhledem k uvedené buňce, tj. o sekvence přirozeně zodpovědné za expresi genů v uvedené buňce. Může se rovněž jednat o sekvence různého původu, tzn. sekvence zodpovědné za expresi proteinů v jiných buněčných typech, sekvence zodpovědné za expresi protilátek v přirozených podmínkách, expresní virové sekvence, například přítomné ve vektoru, ve kterém jsou zabudovány sekvence podle vynálezu, nebo také syntetické nebo polosyntetické sekvence.
V případě, že se jedná o použití u lidí, byly v příslušné odborné literatuře popsány četné funkční promotory, jakými jsou například virové promotory CMV, SV40, Ela, MLP, LTR, atd. Zajímavé jsou buněčné promotory, jakými jsou například promotor genu papilomu, neboť umožňují specifickou expresi v tkáni (omezenou na střevo v případě papilomu).
Jinak mohou být expresní sekvence rovněž modifikovány, například za účelem přizpůsobení expresi v daném typu vektoru nebo buňky, za účelem redukování velikosti, za účelem zvýšení jejich promoční aktivitity transkripce, za účelem generování indukovatelných promotorů nebo za účelem zlepšení jejich regulační hladiny nebo také za účelem změny charakteru jejich regulace. Takové modifikace mohou být provedeny například mutagenezí in vitro, zavedením dodatečných regulačních prvků nebo syntetických sekvencí nebo delecemi nebo dubstitucemi původních regulačních prvků. Může být obzvláště výhodné použít tkáňové specifické promotory za účelem cílení exprese PIL pouze do jednoho typu tkáně.
V případě, že sekvence nukleových kyselin neobsahuje expresní sekvence, potom může být tato sekvence zabudována do expresního vektoru a to za takovou sekvencí.
Za účelem přípravy vektoru podle vynálezu je především vhodné identifikovat buněčnou funkci, která je například implikována v určité patologii nebo která je zodpovědná za takovou patologii, a která má být ovlivněna. Potom je vhodné identifikovat buněčnou složku implikovanou v této funkci a potom stanovit, který PIL nejvíce odpovídá této buněčné složce (protilátky, deriváty, atd.) pokud jde o jeho lokalizaci, jeho roli, jeho charakter, atd. Jakmile byl takový PIL vybrán, může být odpovídající sekvence nukleových kyselin získána technikami molekulární biologie (chemická syntéza, klonování, enzymatická modifikace, atd.) a vložena do příslušného vektoru za použití metodiky, která je popsána v příkladech.
Dalším předmětem vynálezu jsou farmaceutické kompozice obsahující alespoň jednu sekvenci nukleových kyselin nebo vektor, které byly popsány v předcházejícím textu.
Sekvence podle vynálezu mohou být použity jako takové, například po injekci člověku nebo zvířeti, za účelem indukování intracelulámí exprese proteinu PIL pro ovlivnění dané buněčné funkce. Zejména mohou být ínjikovány v prosté DNA formě technikou popsanou v patentové
-3CZ 289039 B6 přihlášce WO 90/11092. Uvedené sekvence mohou být také podány v komplexní formě, například s DEAE-dextranem (Pagano a kol., J.Virol. 1 (1968) 891), s jádrovými proteiny (Kaneda a kol., Science 243 (1989) 375), s lipidy (Felgner a kol., PNAS 84 (1987) 7413), ve formě liposomů (Fraley a kol., J.Biol.Chem. 155 (1980) 10431), atd.
V rámci výhodné formy provedení vynálezu se výše definované nukleové sekvence zabudují do vektoru. Použití takových vektorů ve skutečnosti umožňuje upřednostnění penetrace do buněk, zvýšit rezistenci vůči enzymům a zvýšit stabilitu a intracelulámí expresní hladinu. Vektory podle vynálezu mohou být jak plazmidové, tak i virové. Nicméně se preferuje použití virového vektoru.
V rámci výhodné formy provedení vynálezu se tedy vynález týká výše definovaných sekvencí nukleových kyselin zabudovaných do virového vektoru.
Vynález se rovněž týká rekombinantního viru obsahujícího alespoň jednu sekvenci nukleových kyselin kódující protein PIL vloženou do genomu rekombinantního viru.
Jak již bylo uvedeno výše, mohou být jako vektory pro přenos a expresi in vivo genů podle vynálezu použity různé viry. Jako příklady takových virů je možné uvést retroviry (RSV, HMS, MMS, atd.), vir HSV, viry sdružené s adenoviry, adenoviry, vir neštovic, atd.
Výhodně je rekombinantním virem podle vynálezu defektní vir. Výraz „defektní vir“ označuje vir, který je neschopný replikovat se v cílové buňce. Obecně je tedy genom použitých defektních virů v rámci vynálezu zbaven alespoň sekvencí nezbytných k replikaci uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď eliminovány (a to zcela nebo částečně), nebo učiněny nefunkčními anebo nahrazeny dalšími sekvencemi a zejména nukleovými sekvencemi podle vynálezu. Výhodně si defektní vir nicméně zachová sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.
Defektní rekombinantní viry odvozené od retrovirů, virů sdružených s adenoviry, viru HSV (vir herpes simplex) nebo adenoviru již byly popsány v příslušné odborné literatuře [Roemer a Friedmann, Eer.J.Biochem.208 (1992) 211, Dobson a al., Neuron 5 (1990) 353, Chiocca a kol., New Biol. 2 (1990) 739, Miyanohara a kol., New Biol. 4 (1992) 238, W091/18088, Akli a kol., Nátuře Genetics 3 (1993) 224, Stratford-Perricaudet a kol., Human Gene Therapy 1 (1990) 241, EP 185 573, Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 243204)].
Obzvláště výhodné je použít nukleové sekvence podle vynálezu ve formě inkorporované v defektním rekombinantním adenoviru.
Ve skutečnosti existují různé sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se trochu mění a které nejsou patogenní pro člověka a zejména neimunodeprimované subjekty. Tyto viry se ostatně neintegrují do buněk, které jsou jimi infikovány, a mohou inkorporovat důležité fragmenty exogenní DNA. Z těchto různých sérotypů se přednostně v rámci vynálezu používají adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5). V případě adenoviru Ad 5 jsou sekvencemi nezbytnými pro replikaci oblasti Ε1A a Ε1B.
Malá velikost genů kódujících intracelulámí protilátky podle vynálezu dále umožňuje výhodně současně inkorporovat v jednom a téže vektoru několik genů kódujících intracelulámí protilátky řízené proti různým oblastem jedné nebo několika cílových buněčných složek. Způsob specifického provedení vynálezu spočívá tedy ve vektoru, zejména virovém, obsahujícím alespoň dvě sekvence nukleových kyselin kódujících vazebné intracelulámí proteiny řízené proti různým epitopům.
Defektní rekombinantní viry podle vynálezu mohou být připraveny homologní rekombinací mezi defektním virem a plazmidem nesoucím mezi jinými výše definovanou sekvenci nukleových kyselin (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, Geaham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). Tato
-4CZ 289039 B6 homologní rekombinace se povede po ko-transfekci uvedeného viru a plazmidů do poslušné buněčné řady. Použitá buněčná řada musí být výhodně (i) transformovatelná uvedenými prvky a (ii) musí zahrnovat sekvence schopné komplementovat část genomu defektního viru, výhodně v integrované formě za účelem eliminace rizika rekombinace. Jako příklad buněčné řady použitelné pro přípravu defektních rekombinantních adenovirů lze uvést buněčnou řadu 293 z ledviny lidského embrya (Graham a kol., J.Gen.Virol.36 (1977) 59), která obsahuje v integrované formě ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %). Jako příklad buněčné řady použitelné pro přípravu defektního rekombinantního retroviru lze uvést buněčnou řadu CRIP (Danos a Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).
Následně se multiplikované viry izolují a purifikují klasickými metodami molekulární biologie.
Vynález se tedy rovněž týká farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden defektní rekombinantní vir, který byl definován výše.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány do galenických forem vhodných pro topické, perorální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí a další podání.
Výhodně uvedené farmaceutické kompozice obsahují farmaceuticky přijatelná vehikula pro injikovatelnou formulaci. Může se zejména jednat o sterilní isotonické roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý, atd. nebo směsi těchto solí) nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované, které přidáním sterilní vody nebo fyziologického roztoku umožňují konstituci injikovatelných roztoků.
Dávky nukleových kyselin (sekvence nebo vektor) použité pro podání mohou být modifikovány v závislosti na různých parametrech a zejména v závislosti na použitém způsobu podání, léčené patologii, genu, který má být exprimován a také na požadované době léčení. Obecně pokud jde o rekombinantní víry podle vynálezu, jsou tyto viry formulovány a podány ve formě dávek činících 104 až 101 pfú/ml, výhodně 106 až 1010 pfú/ml. Výraz pfu („plaque forming unit“) odpovídá infekční potenci roztoku virů a stanoví se infikováním příslušné buněčné kultury a stanovením, obvykle po 48 hodinách, počtu oblastí infikovaných buněk. Techniky stanovení titru pfu virového roztoku jsou dobře dokumentované v odborné literatuře.
Předmětem vynálezu je rovněž každá rekombinantní buňka obsahující výše definovanou sekvenci nukleových kyselin.
Sekvence podle vynálezu, případně inkorporované do vektorů, a farmaceutické kompozice, které je obsahují mohou být použity pro léčení četných patologických stavů. Mohou být takto použity pro přenos a expresi genů in vivo do každého typu tkáně. Léčení může být ostatně cíleno podle patologického stavu, který má být léčen (přenos v úrovni specifické tkáně může být zejména stanoven volbou vektoru a expresí volbou specifického promotoru). Sekvence nebo vektory podle vynálezu jsou výhodně použity pro produkci u člověka nebo zvířete, a to in vivo a intracelulámě, proteinů schopných působit specifickým způsobem na různé buněčné funkce, jakými jsou buněčná proliferace, syntéza metabolitů, syntéza proteinů, replikace nebo/a transkripce DNA, atd. Vynález takto umožňuje léčit specificky, lokálně a účinně četné buněčné dysfunkce primárního charakteru nebo dysfunkce rezultující z různých patologií, a zejména rakoviny, virová onemocnění nebo bakteriální onemocnění, nebo obecněji definováno, umožňuje vynález léčit každou patologii, u které může být identifikován buněčný mediátor.
Použití pro léčení patologií spojených s buněčnou proliferací
V rámci obzvláště výhodné formy provedení obsahují sekvence nukleových kyselin podle vynálezu geny kódující proteiny PIL schopné vstoupit do vzájemné interakce a interferovat
-5CZ 289039 B6 s aktivitou faktorů implikovaných v buněčné proliferaci. V rámci buněčné proliferace se uplatňuje množina faktorů, jakými jsou membránové receptory (proteiny G), onkogeny, enzymy (protein-kinázy, famesyl-transferázy, fosfolipázy, atd.), nukleosidy (ATP, AMP, GDP, GTP, atd.) aktivační faktory (výměnné faktory guanosinů (GRF, GPA, atd.), transkripční faktory, atd.), atd. Intracelulámí exprese proteinů PIL podle vynálezu schopných vázat a neutralizovat takové faktory umožňuje regulovat proces buněčné proliferace. To je obzvláště zajímavé v situacích, kdy se buněčná proliferace vymyká přirozeným regulačním mechanismům a které například vedou ke vzniku nádorů. Četné faktory (produkty onkogenních genů a faktory implikované v signalizaci účinku těchto produktů) byly ve skutečnosti spojovány s těmito deregulačními jevy buněčné proliferace. Takto 90% adenokarcinomu pankreasu vykazuje onkogen Ki-ras mutovaný na dvanáctý kodon (Almoguera a kol., Cell 53 (1988) 549). Stejně tak přítomnost mutagenu ras byla prokázána v adenokarcinomech tračníku a při rakovinách štítné žlázy (50 %) nebo v karcinomech plic a myeloidních leukémiích (30 %, Bos,J.L. Cancer Res. 49 (1989) 4682). Do dneška byly identifikovány i četné další onkogeny (myc, fos, jun, myb, ras, erb, atd.), jejichž mutantní formy se zdají být zodpovědné za deregulaci buněčné proliferace.
Exprese proteinů PIL schopných vázat tyto buněčné faktory (preferenčně jejich onkogenní formu) a tedy zpomalit nebo inhibovat jejich účinky nabízí možnost nové terapeutické metodiky pro léčení rakovin.
V rámci obzvláště zajímavé formy provedení vynálezu se vynález týká vektorů obsahujících sekvence nukleových kyselin zahrnující gen kódující intracelulámí protilátku schopnost vstoupit do interakce s expresním produktem onkogenu nebo s faktorem intervenujícím při signalizačním mechanismu onkogenu.
Z cílových onkogenů lze uvést v rámci vynálezu onkogeny ras, fos, jun, myc, myb a erb.
Z faktorů intervenujících při signalizačním mechanismu onkogenu lze zejména uvést membránové receptory, které mohou být zacíleny v úrovni jejich intracelulámích domén (proteiny G (například: tyrosin-kináza), fosforylázy, famesyl-transferázy), výměnné faktory nukleosidů (faktory GAP, GRF, atd.), atd.
Výhodněji se vynález týká vektorů, zejména virového původu, obsahujících sekvenci nukleových kyselin kódující intracelulámí protilátku řízenou proti onkogenu nebo faktoru intervenujícím při signalizačním mechanismu onkogenu a tvořenou peptidem odpovídajícím vazebnému místu variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky a spojeným peptidovým linkerem s peptidem odpovídajícím vazebnému místu variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky.
Specifičtěji se vynález týká defektních rekombinantních virů exprimujících intracelulámí protilátku řízenou proti faktoru ras-dependentního signalizačního mechanismu.
Jak je to demonstrováno v dále zařazených příkladech provedení, umožňuje exprese intracelulámích protilátek anti-p21 (expresní produkt genu ras), anti-GAP nebo anti-p53 reverzi transformačního fenotypu rakovinné buňky.
Použití pro léčení virových patologií
Sekvencemi nukleových kyselin podle vynálezu mohou být také sekvence kódující intracelulámí protilátky schopné vstoupit v interakci s infekčním cyklem patogenního viru (HIV, vir papilomu, atd.).
Specifičtěji lze uvést, že v přírodě viru HIV, neumožňují antivirální činidla, která jsou v současnosti k dispozici nebo jsou již v pokročilém stadiu klinických zkoušek, blokovat multiplikaci viru, nýbrž tato činidla jen stěží brzdí rozvoj nemoci. Jeden z hlavních důvodů, proč tomu tak je, spočívá v existenci kmenů, které jsou rezistentní vůči uvedeným antivirálním
-6CZ 289039 B6 činidlům. Rozvoj účinného očkování rovněž naráží na četné překážky. Genetická variabilita viru HIV neumožňuje definovat stabilní antigenní strukturu vyvolávající humorální nebo buněčnou imunologickou odezvu proti různým existujícím kmenům. Stejně jako v případě antivirálních činidel, kde vir odolává snahám dosáhnout selektivního účinku úhybným manévrem přesných mutací, zdá se, že pokusy očkování proti HTV provedené až do dnešního dne neposilují imunitní systém v tomto ohledu.
Vynález představuje nový přístup k léčení infekcí způsobených virem HIV, přičemž tento přístup spočívá v blokování viru při jeho replikačním cyklu expresí proteinů PIL, a zejména intracelulámích protilátek. Vynález zejména umožňuje na rozdíl od očkování a použití antivirálních činidel překonat problém genetické variability viru. V případě klasického očkování působí imunitní odezva hlavně proti variabilním oblastem. Na rozdíl od toho umožňuje použití intracelulámích protilátek podle vynálezu zvolit epitop, který je nejen konzervován, ale také nezbytný pro funkci virového proteinu. Výhodně je intracelulámí protilátka řízena proti epitopu dostatečné velikosti, aby se viru zabránilo odolat a přizpůsobit se úhybným mechanismem přesně reagujících mutací. Jinak malá velikost genu kódujícího intracelulámí protilátku podle vynálezu výhodně umožňuje zacílit několik oblastí (jednoho a téhož nebo několika proteinů) za použití jediného vektoru genové terapie.
Nejdůležitějšími cíly pro realizaci vynálezu jsou dva hlavní regulační proteiny viru, sice tat a rev. Ve skutečnosti jsou oba tyto proteiny nezbytné pro virovou replikaci. Navíc exprese antimediátorové RNA nebo ribozymů zacdujících mediátorovou RNA tat nebo rev zabraňuje replikaci viru. Mechanismus účinku těchto proteinů je poměrně dobře dokumentován: tat je transaktivačním faktorem transkripce, zatímco rev zajišťuje přechod mezi rannou a pozdní fází replikačního cyklu. Oba tyto proteiny realizují svojí aktivitu tím, že se fixují na virové mediátorové RNA, přičemž peptidová oblast nezbytná pro toto fixování a nutná pro funkci uvedených mediátorových RNA je relativně dobře vymezena. Navíc bylo prokázáno, že nadexprese jejich fixačního místa na RNA (oblast TAR pro tat a oblast RRE pro rev) inhibuje jejich funkci při expresi viru.
Za těchto podmínek spočívá obzvláště výhodná forma provedení vynálezu v použití sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku řízenou proti proteinům tat nebo rev a schopnou neutralizovat aktivitu těchto proteinů. Výhodně jsou takové protilátky řízené proti oblasti tat nebo rev, která je zodpovědná za jejich fixování na RNA.
Intracelulámí protilátky podle vynálezu řízené proti těmto epitopům mohou být připraveny způsoby popsanými v dále zařazených příkladech. Jmenovitě pokud jde o protilátku anti-tat, může být tato protilátka získána genetickou modifikací z monoklonální protilátky T-B (12) (Hybridolab).
Dalším cílovým proteinem důležitým pro replikaci vím HTV, jehož funkce může být snadno inhibována intracelulámí protilátkou, je protein nukleokapsidy NCP7. Ve skutečnosti hraje tento protein důležitou roli při retrotranskripci (raná fáze), při integraci a v pozdní nicméně důležité fázi, kterou je enkapsidace. Tato mnohofunkčnost se vysvětluje tím, že uvedený protein má strukturní enzymaticky aktivní úlohu. Tento protein byl rovněž popsán jako hybridáza, která by měla umožňovat komplexování virových nukleových kyselin: RNA/DNA a DNA/DNA během tetrotranskripce, jakož i RNA/RNA a RNA/RNA-lys3 v úrovni enkapsidace. NCP7 se jeví jako nezbytný pro produkci infekčních virů.
Cytoplazmová exprese genovou terapií intracelulámích protilátek řízených proti NCP7 a inhibujících jeho funkci při dimeraci virových RNA a při enkapsidaci představuje další specifickou formu provedení vynálezu.
-7CZ 289039 B6
Intracelulámí protilátky podle vynálezu řízené proti neutralizujícím epitopům uvedeného proteinu mohou být připraveny způsoby, které jsou popsány v dále zařazených příkladech provedení.
Předmětem genové terapie podle vynálezu mohou být i další virové složky, zejména: místo fixování k molekule CD4 (příklad: obalový glykoprotein (gp 120/41)), multimerační oblast obalu, štěpící místo gpl20/gp41, proteáza, integráza a obecněji každý virový protein. Tyto domény nejsou obecně dosažitelné v případě, že je obal v nativní formě. Z tohoto důvodu jsou tyto domény velmi málo imunogenní a očkování týkající se těchto domén je nemožné. Vynález umožňuje zacílit tyto virové složky a představuje takto velmi potentní terapeutický potenciál. Kromě toho, jak již bylo uvedeno výše, umožňuje malá velikost genů kódujících intracelulámí protilátku podle vynálezu výhodně současně exprimovat v jednom a téže vektoru několik intracelámích protilátek řízených proti různým oblastem jednoho nebo několika z uvedených cílů.
Nukleové sekvence podle vynálezu mohou být rovněž sekvencemi kódujícími proteiny PEL schopné vstoupit v interakci a interferovat s aktivitou faktorů implikovaných v syntéze metabolitů, v proteinové syntéze nebo také při replikaci nebo/a transkripci DNA.
V následující části popisu bude vynález blíže popsán pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační význam a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen definicí patentových nároků.
Příklady provedení vynálezu
Na připojeném obr. 1 jsou znázorněny A) restrikční mapa ScFv-ras, B) restrikční mapa ScFv-Gap a C) neutralizační účinek tranzitní exprese intracelulámí protilátky podle vynálezu na transformační schopnost onkogenu ras nebo Her2, kde:
| Py | = kontrolní buňky, |
| ScFv | = buňky transfektované samotným plazmidem psv2.ScFv.ras, |
| VAL | = buňky transfektované vektorem exprimujícím onkogenní ras Ha-ras, |
| VAL+ScFv | = buňky kotransfektované plazmidem psv2.ScFv.ras a vektorem exprimujícím onkogenní ras Ha-ras Valí 2, |
| HER2 | = buňky transfektované vektorem exprimujícím onkogenní HER2 a |
HER2+ScFv = buňky kotransfektované plazmidem ps2.ScFv.ras a HER2.
Obecné techniky molekulární biologie
Klasické metody používané v molekulární biologii, jakými jsou preparativní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosovém gelu nebo akrylamidu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo systémem fenol-chloroform, preciptiace DNA v solném prostředí ethanolem nebo isopropanolem, transformace v Escherichia coli, atd., jsou pro odborníka velmi dobře známé a hojně popsané v literatuře (Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982, Ausubel F. M. a kol. (nakl.), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987).
-8CZ 289039 B6
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série Ml3 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratories).
Za účelem ligace mohou být fragmenty DNA separovány podle velikosti elektroforézou na agarosovém gelu nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo systémem tvořeným směsí fenolu a chloroformu, vysráženy ethanolem a potom inkubovány DNA-lgázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
Naplnění proeminentních konců 5' může být provedeno Klenowovým fragmentem DNApolymerázy I E. coli (Biolabs) podle instrukcí dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA-polymerázy fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5' se provádí řízeným působením nukleázy Sl.
Mutageneze řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena metodou vyvinutou Taylor-em a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
Enzymatická amplifikace fragmentů DNA technikou nazvanou PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K. B. a Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití činidla „DNA thermal cycler“ (Perkin Elmer Cetus) podle pokynů výrobce.
Verifikace nukleotidových sekvencí může být provedena metodou vyvinutou Sanger-em a kol. (Proč. Natr. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
Příklad 1
Klonování a exprese sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku anti-ras
Tento příklad popisuje klonování a expresi sekvence nukleových kyselin kódující intracelulámí vazebný protein reprodukcí vlastností monoklonální protilátky Y13-259. Tato protilátka Y13-259 je řízena proti proteinům Ras (ATCC CRL 1742) (J. Virol. 43, 294-304, 1982) a představuje neutralizační protilátku funkce onkogenních proteinů Ras potom, co byla injikována do buněk (Smith a kol., (1986) Nátuře, 320, 540-543, Kung a kol., Exp. Cell: res. (1986) 162,363-371).
1.1. Příprava sekvence DNA
Sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku (fragment ScFv) byla připravena technikou popsanou v patentu US 4,946,778. Tato sekvence byla potom uložena pod kontrolu funkčního promotoru v savčích buňkách.
RNA póly A jsou izolovány z buněčné kultury hybridomu, který vylučuje protilátku Y13-259, technikou popsanou S. H. Chirguin-em a kol. (Biochemistry 18, 5294 (1979)). Tyto RNA se použijí pro reakci zpětné transkripce pomocí primerů vytvořených z aleatomích hexanukleotidů. Získané DNAc slouží jako matrice pro dvě reakce PCR, z nichž:
- jedna je určena pro amplifikaci variabilního fragmentu těžkého řetězce (VH) protilátky Y13-259 se specifickými primery murinního VH a
- druhá umožňuje získat fragment VL za použití směsi 10 primerů odvozených od murinních sekvencí.
-9CZ 289039 B6
Takto se získají dva fragmenty 340 pb a 325 pb, které se potom sloučí pomocí linkeru, který umožňuje přesné polohování cDNA VH v 5' DNA fragmentu VL. Tento linker kóduje 15 aminokyselin vytvořených třemi repeticemi motivu (Gly) 4Ser (Orlandi, R. a kol., Proc-Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 (1979)). Sekvence intracelulámí protilátky je uvedena na připojeném sekvenční diagramu SEQ ID č. 1 (zbytek 28 až 270). Tato sekvence umožňuje dosti stupňů volnosti při fúzi VH-VL dovolujících sestavení fragmentů v paralelní orientaci a zajišťujících přesnou afinitu k antigenu.
Sloučená sekvence nukleových kyselin VH-linker-VL se potom inzeruje do fagemidu, který umožňuje expresi intracelulámí protilátky (fragment ScFv) na povrchu fágu M13 (obr. IA). Tato exprese snadno umožňuje identifikaci a selekci intracelámích protilátek, které přesně rozpoznávají antigen.
1.2. Funkční zhodnocení modifikované intracelulámí protilátky
Sekvence DNA, která kóduje modifikovanou intracelulámí protilátku anti-Ras (VH-linker-VL) se izoluje z fagemidu restrikcí, načež se inzeruje do vektoru sv2 pod kontrolou páru zesilovač transktipce-promotor od SV40 (Schweighoffer a kol. Science, 256, 825-827, 1992) za účelem testování její schopnosti antagonizovat účinky onkogenního Ras. Takto získaný plazmid je označen jako psv2.ScFv.ras. Funkční vyhodnocení bylo provedeno několika testy.
a) Tranzitní transfekce v savčích buňkách
Za účelem vyhodnocení transitní transfekce v savčích buňkách byl plazmid psv2.ScFv.ras kotransfektován do buněk NIH 3T3 podle protokolu popsaného v Schweighoffer a kol., Science, 256, 825-827 (1992) s vektorem, který umožňuje expresi genu Ha-ras Val 12. Aktivační stav studovaného signalizačního mechanismu byl zaznamenán měřením enzymatické aktivity získané z reportážního genu „chloramphenikol-acetyltransferáza (CAT)“ vloženého pod kontrolu promotoru obsahujícího nukleotidové prvky odpovídající v „trans“ účinku rovněž kotransfektovaných Ras (RRE): tyto prvky RRE jsou tvořeny systémem hybridní promotor TK-zesilovač transkripce polyomu (Wasylyk a kol., EMBO, J. 7, 2475 1988).
Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 1C). Analýza aktivit CAT prokazuje schopnost modifikované intracelulámí protilátky, připravené z protilátky Y13-259, antagonizovat aktivitu onkogenního Ras.
Plazmid psv2.ScFv.ras kotransfektovaný s plazmidem umožňujícím expresi onkogenu obdařeného aktivitou tyrosinkinázy, kterým je onkogen HER2 (lidský epidermální růstový faktor typu II), rovněž blokuje aktivitu na plazmidu při testu „CAT“ (obr. 1).
b) Tvorba ložisek transformovaných buněk
Rakovinové buňky mají vlastnost tvořit transformační ložiska a zejména fibroplasty NIH 3T3 exprimující onkogenní Ras (Barlat a kol., Oncogene (1993), B, 215-218).
Buňky NIH 3T3 jsou kultivovány stejně jako při předcházejícím testu v prostředí DMEM (Dulbecco-modifikované prostředí Eagle) obsahujícím 10% fetálního telecí séra při teplotě 37 °C ve vlhkém prostředí obsahujícím 5 % oxidu uhličitého. Tyto buňky jsou potom kotransfektovány s onkogenním Ras:Ha-ras Vall2, plazmid psv2.ScFv.ras (viz výše uvedený odstavec a)) a 10 násobným přebytkem genu rezistentního vůči neomycinu tranfekční technikou pro kationtové lipidy (Schweighoffer a kol., Science, 256. 825-827, 1992). Pro každou Petriho misku se transfektuje stejné celkové množství DNA.
hodin po transfekci se transfektované buňky pocházející z každé Petriho misky o průměru 100 mm rozdělí v poměru 1 až 10 a kultivují ve stejném prostředí, avšak v přítomnosti 0,4 mg
-10CZ 289039 B6
G418 (GIBCO/BRL) na mililitr prostředí. Po 14 dnech kultivace je vyčíslen počet transformačních ložisek na mikrogram transfektované DNA.
Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Tyto výsledky představují průměrné hodnoty ze čtyř nezávislých testů.
Tabulka
Transformace buněk NIH 3T3 za použití Ha-ras Vall2 v přítomnosti intracelulámí protilátky anti-ras
| Transfektované plazmidy | Počet ložisek na pg transfektované DNA |
| Ha-RasVall2 | 110 |
| psv2.ScFv.ras | 2 |
| Ha-Ras Vall2+psv2.ScFv.ras | 30 |
Získané výsledky jasně ukazují, že intracelulámí protilátka anti-ras velmi silně snižuje transformační schopnost onkogenního genu ras.
Jinak vzhledem k výsledkům získaným v odstavci a) by exprese uvedeného fragmentu ScFv protilátky Y13-159 měla rovněž inhibovat transformaci realizovanou dalšími onkogeny (HER1, HER2) usnadňujíc aktivaci buněčných proteinů Ras.
Je samozřejmé, že odborník v tomto oboru může na základě výsledků popsaných v této patentové přihlášce reprodukovat vynález za použití sekvencí nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátky (jako fragmenty ScFv) řízené i proti dalším buněčným složkám. Ty mohou být připraveny buď ze známých protilátek řízených proti buněčným složkám, nebo identifikací antigenu určeného k neutralizaci, imunizací pomocí tohoto antigenu nebo jeho preferovaného epitopu a potom přípravou intracelulámí protilátky ze získané protilátky, její RNAm nebo hybridomu. Takto mohou být cíleny i další složky implikované v procesu buněčné transformace. Tak například stejným metodickým postupem mohou být připraveny další sekvence DNA kódující vazebné intracelulámí protilátky anti-ras zhybridomů M38, M8, M70, M90 a M30 (ATCC HB 9158), jejichž protilátky jsou řízeny proti zbytkům 1 až 23, 24 až 69, 90 až 106, 107 až 130 resp. 131 až 152 proteinu Ha-Ras. Kromě toho, jak již bylo uvedeno výše, mohou být výhodně připraveny za účelem dosažení vynikající neutralizační aktivity vektory nesoucí současně několik sekvencí kódujících různé intracelulámí protilátky.
Příklad 2
Klonování a exprese sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku anti-GAP
Tento příklad popisuje klonování a expresi sekvence nukleových kyselin kódující vazebný intracelulámí protein reprodukováním vlastností monoklonální protilátky řízené proti proteinu GAP.
Protein GAP (GTPase Activating Protein) je implikován v ras-dependentním signalizačním mechanismu. Tento protein vykazuje katalyticky interakci s proteiny a 100 až 200 krát zvyšuje rychlost hydrolýzy GTP měřenou in vitro pro normální protein p21. Různé práce dokazují, že katalytická doména tohoto proteinu sasi 1044 aminokyselinami je situována vkarboxyterminální oblasti (zbytky 702 až 1044) a že tato oblast je zodpovědná za interakci proteinu GAP s proteiny ras (viz WO91/02749).
-11 CZ 289039 B6
Nyní bylo prokázáno, že monoklonální protilátka řízená proti doméně nazvané „SH3“ proteinu GAP neutralizuje funkce onkogenních proteinů Ras v „oeuf de Xénope“ (Duchesne a kol., Science, 259, 525-528, 1993).
Podle metodiky popsané v odstavci 1.1. je možné syntetizovat sekvenci DNA kódující intracelulámí protilátku (fragment ScFv) odpovídající této protilátce (sekvenční diagram SEQ ID č. 2, zbytky 11 až 250, obr. 1B)). Taková sekvence inkorporovaná do vektoru může umožnit inhibici transformační potence onkogenního genu ras v nádorových buňkách.
Ostatně přihlašovatel rovněž identifikoval přesnějším způsobem epitopy rozpoznané touto protilátkou. Tyto epitopy byly potom syntetizovány uměle a mohou být použity pro generování nových neutralizačních protilátek, které mohou sloužit k provedení vynálezu.
a) Přesnější identifikace
Uvedená identifikace byla provedena technikou „epitope scanning“. Tato technika je založena na zásadě, že daná protilátka může reagovat s peptidy o 5 až 15 aminokyselinách. Tímto způsobem může být dosaženo identifikace sekvenčních epitopů přípravou úplné sady pokrývajících peptidů o 5 až 15 aminokyselinách odpovídajících úplné sekvenci uvažovaného antigenu. Tato technika byla použita pro stanovení funkčních epitopů domény „SH3“ proteinu GAP. Za tímto účelem byla totalita této domény zkoumána sekvenčními pokryvy syntézou dekapeptidu po každých dvou aminokyselinách.
- Syntéza pokrývajících peptidů
Chemicky bylo syntetizováno 35 peptidů pokrývajících totalitu fragmentu z obr. 1. Tato syntéza byla provedena dvojmo na dvou nezávislých nosičích methodou Fmoc/t-butyl na pevné fázi (souprava distribuovaná firmou Cambridge Research Biochemicals).
- Stanovení funkčních epitopů
Funkční epitopy rozpoznané protilátkou Ac200 byly indikovány v rámci testu ELIS A králičí protilátkou antisouris kopulovanou s peroxydázou. Použitým chromogenním substrátem enzymu je amin-di-(3-ethylbenzothiazodinsulfonát (ABTS).
Získané výsledky ukazují, že epitopy rozpoznanými uvedenou protilátkou jsou:
- PVEDRRRVRAI,
- EISF a
- EDGWM.
Tyto epitopy mohou být použity klasickými postupy pro generování protilátek neutralizujících účinky proteinu ras. Tyto protilátky nebo hybridomy, které je produkují jsou potom použity pro generování sekvencí nukleových kyselin a vektorů podle vynálezu za použití výše popsané metodiky.
Příklad 3
Příprava sekvence nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátku anti-Ki-ras zRNAm extrahovaných z myších slezin imunizovaných peptidy odvozenými od hypervariabilních částí onkogenu Ki-Ras (2A a 2B).
Tento příklad popisuje přípravu sekvencí nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátky (takové jako fragmenty ScFv) podle vynálezu identifikací antigenu určeného k neutralizaci,
-12CZ 289039 B6 imunizací pomocí tohoto antigenu nebo preferovaného epitopu tohoto antigenu a potom přípravou sekvence nukleových kyselin ze získané protilátky, její RNAm neno hybridomu.
Tento příklad demonstruje možnost aplikovat vynález na libovolný požadovaný antigen nebo epitop, a to dokonce i v případě, že není k dispozici žádná monoklonální protilátka řízená proti uvedenému antigenu nebo epitopu.
Cílovým antigenem je v tomto příkladu protein Ki-ras. Přesněji specifikováno, jsou anitigeny použitými pro imunizaci peptidy s 25 a 24 aminokyselinami odpovídající terminálním koncům proteinů Ku-Ras 2A a 2B:
- Peptid 2A: QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
- Peptid 2B: KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM
Po imunizaci myší těmito peptidy klasickými postupy imunologie se extrahují sleziny a DNAc se připraví z RNAm. DNAc kódující variabilní oblasti se potom klonují, což vede k sestavení banky fágů exprimujících ScFv odpovídající totalitě repertoiru použitých myší. Intracelulámí protilátky (fragmenty ScFv) rozpoznávající peptidy 2A a 2B se potom identifikují a izolují postupnými selekčními stupni na bázi afinity na sloupci a na mikrotitrační plotně.
Tyto ScFv se potom funkčně testují podle protokolu popsaného v příkladu 1.
Strategie zvolená v tomto příkladu provedení umožňuje výhodně zvolit specifické intracelulámí protilátky onkogenů Ku-Ras, které neinterferují s ostatními protoonkogeny Ras. Selektivita těchto nástrojů je tedy nejen buněčná (s ohledem na dekopulaci transdukčních cest v buňkách transformovaných faktorem Ras), ale také molekulová.
Příklad 4
Příprava sekvence nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátku anti-mutantní p53
Tento příklad popisuje přípravu sekvencí nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátky (takové jako ScFv) řízené proti mutantním proteinům p53. Tyto intracelulámí protilátky se získají z různých monoklonálních protilátek řízených proti uvedeným mutantním proteinům p53.
Gen kódující protein p53 se alteruje ve velmi velkém počtu nádorových buněk (Caron de Fromentel et Soussi, Genes, 4, 1-15, 1992). Protein mutantní p53 nemá stejnou konformaci jako divoký protein p53 (Lané a Benchimol, Genes Dev. 4, 1-8, 1990). Tato konformační změna může být detekována monokonálními protilátkami (Milner a Cook, Virology, 154, 21-30, 1986, Milner, Nátuře, 310,143-145,1984).
Protilátky pAB 240 rozpoznávají mutantní formy proteinů p53.
Intracelulámí exprese fragmentu ScFv specifických protilátek mutantních proteinů p53 nebo proteinů vstupujících do specifické interakce s těmito mutantními proteiny p53 by tedy měla indukovat příznivý léčebný účinek v nádorech vykazujících mutantní formy proteinů p53.
Příklad 5
Klonování a exprese sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku anti-vir papilomu
Tento příklad popisuje klonování a expresi sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku (fragment ScFv) řízenou proti proteinu viru lidského papilomu (HPV).
-13CZ 289039 B6
Cílovým virovým proteinem je protein E6. Tento protein je produkován viry HPV 16 a 18, které jsou zodpovědné za 90 % rakovin děložního krčku u žen a byly identifikovány v prekarcerogenních epitheliálních lézích (Riou a kol., Lancet 335 (1990) 117). Produkt genu E6 vede k tvorbě nádorů v důsledku silného snížení množství divokého proteinu p53, tj. antionkogenu v HPV-pozitivních buňkách (Wrede a kol., Mo.Carcinog. 4 (1991) 171). V dalších nádorech je p53 inhibován odlišnými mechanismy: mutací (viz příklad 4) nebo sdružením s proteiny, jakými jsou MDM2.
Sekvence proteinu E6 byla popsána v literatuře (Hawley-Nelson a kol., EMBO J. 8 (1989) 3905, Miinger a kol., J.Virol. 63 (1989) 4417). Jednotlivé oblasti tohoto proteinu mohou být identifikovány metodou „epitope scanning“ (viz příklad 2) a potom použity pro imunizaci myší podle protokolu popsaného v příkladu 3. Sekvence DNA kódující intracelulámí protilátku (fragment ScFv) řízenou proti proteinu E6 viru lidského papilomu (HPV) se potom připraví za použití výše popsané metodiky. Funkčnost této sekvence se prokáže po expresi in vivo měřením:
- zvýšení množství divokého proteinu p53 v buňkách exprimujících E6,
- reverzní morfologie buněk transformovaných virem HPV,
- blokování účinků E6 na transaktivaci proteinu p53 a
- inhibice transformace proteinem E6 lidských keratinocytů a fibroplastů.
Příklad 6
Příprava sekvence nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátku anti-HIV z RNAm extrahovaných ze slezin myší imunizovaných peptidy odvozenými z aktivních oblastí proteinů tat, rev a NCP7.
Tento příklad popisuje přípravu sekvenci nukleových kyselin kódujících intracelulámí protilátky podle vynálezu (takové jako fragmenty ScFv) identifikací antigenu určeného k neutralizaci, imunizací pomocí tohoto antigenu nebo preferovaného epitopu tohoto antigenu a potom přípravou sekvence nukleových kyselin ze získané protilátky, její RNAm nebo hybridomu.
Tento příklad ještě demonstruje možnost aplikovat vynález na libovolný antigen nebo požadovaný epitop, a to dokonce i v případě, že v rámci dosavadního stavu techniky nebyla popsána žádná monoklonální protilátka řízená proti uvedenému antigenu nebo epitopu.
Cílovými antigeny jsou v tomto příkladu proteiny tat, rev a NCP7 viru HTV. Přesněji specifikováno, jsou antigeny použitými pro imunizaci následující peptidy s 6, 9 a 16 aminokyselinami odpovídající oblastem těchto proteinů zodpovědným za jejich interakci s RNAm (pro tat a rev) nebo za dimeraci RNA (pro NCP7):
- peptid tat: RKKRRQRRR,
- peptid rev: RQARRNRRRWRERQR a
- peptid NCP7: RAPRKK.
Po imunizaci myší těmito peptidy klasickými technikami imunologie se myším extrahují sleziny a DNAc se připraví z RNAm. DNAc kódující variabilní oblasti se potom klonují, což vede k sestavení banky fágů exprimujících ScFv odpovídající totalitě repertoiru použitých myší. Intracelulámí protilátky (fragmenty ScFv) rozpoznávající peptidy tat, rev a NCP7 se potom identifikují a izolují následnými selekčními stupni na bázi afinity na sloupci a na mikrotitrační plotně.
-14CZ 289039 B6
Tyto ScFv se potom funkčně testují za účelem stanovení jejich schopnosti blokovat replikační cyklus viru HIV.
Claims (18)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Izolovaná nukleová kyselina obsahující gen, který je pod kontrolou promotoru funkčního v savčí buňce a který kóduje intracelulámí jednořetězcovou protilátku, přičemž tato protilátka je namířena proti expresnímu produktu onkogenu ras nebo proti proteinu GAP nebo proteinu p53 nebo mutovanému proteinu p5 3.
- 2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde intracelulámí protilátka je protilátkový fragment Fab nebo F(ab)'2.
- 3. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde intracelulámí protilátka obsahuje alespoň jeden peptid odpovídající vazebnému místu variabilního úseku lehkého řetězce protilátky spojený peptidovým linkerem s peptidem odpovídajícím vazebnému místu variabilního úseku těžkého řetězce protilátky.
- 4. Izolovaná nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, která obsahuje celou sekvenci identifikačního čísla 1 (SEQ ID. No. 1) nebo její část.
- 5. Izolovaná nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, která obsahuje celou sekvenci identifikačního čísla 2 (SEQ ID. No. 2) nebo její část.
- 6. Izolovaná nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde promotor funkční v savčích buňkách je vybrán ze skupiny obsahující virové, buněčné nebo umělé promotory.
- 7. Izolovaná nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, která je vložena do vektoru.
- 8. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 7, která je vložena do virového vektoru.
- 9. Defektní rekombinantní virus, který obsahuje ve svém genomu nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.
- 10. Defektní rekombinantní virus podle nároku 9, který je vybrán ze skupiny obsahující retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, virus vakcínie a virus HSV.
- 11. Defektní rekombinantní virus podle nároku 10, kterým je adenovirus, který obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 5.
- 12. Vektor, zejména virový vektor, který obsahuje alespoň dvě nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
- 13. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 nebo rekombinantní virus nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12.
- 14. Farmaceutická kompozice podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, a to ve formě liposomu, komplexu s jádrovými proteiny, lipidy nebo dextranem, anebo v surové formě.
- 15. Farmaceutická kompozice podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu nukleovou kyselinu podle nároku 5.
- 16. Farmaceutická kompozice podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden rekombinantní virus podle nároku 10.-19CZ 289039 B6
- 17. Farmaceutická kompozice podle nároku 16, vyznačující se tím, že rekombinantní virus je vybrán ze skupiny obsahující retroviry, adenoviry nebo adeno-asociované viry.
- 18. Použití nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení rakoviny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9307241A FR2706486B1 (fr) | 1993-06-16 | 1993-06-16 | Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ329595A3 CZ329595A3 (en) | 1996-03-13 |
| CZ289039B6 true CZ289039B6 (cs) | 2001-10-17 |
Family
ID=9448183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19953295A CZ289039B6 (cs) | 1993-06-16 | 1994-06-15 | Izolovaná nukleová kyselina obsahující gen kódující intracelulární jednořetězcovou protilátku, vektory a defektní rekombinantní viry tuto sekvenci obsahující afarmaceutické kompozice s jejich obsahem k léčbě rakoviny |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6159947A (cs) |
| EP (1) | EP0703980B1 (cs) |
| JP (1) | JP4384260B2 (cs) |
| KR (1) | KR100342233B1 (cs) |
| CN (1) | CN1076052C (cs) |
| AT (1) | ATE231916T1 (cs) |
| AU (1) | AU7076394A (cs) |
| BR (1) | BR9407512A (cs) |
| CA (1) | CA2165458C (cs) |
| CZ (1) | CZ289039B6 (cs) |
| DE (1) | DE69432075T2 (cs) |
| DK (1) | DK0703980T3 (cs) |
| ES (1) | ES2191031T3 (cs) |
| FI (1) | FI120311B (cs) |
| FR (1) | FR2706486B1 (cs) |
| HU (1) | HU219138B (cs) |
| NO (1) | NO319466B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ268038A (cs) |
| PL (1) | PL180760B1 (cs) |
| RU (1) | RU2218400C2 (cs) |
| SK (1) | SK285169B6 (cs) |
| UA (1) | UA46709C2 (cs) |
| WO (1) | WO1994029446A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA944303B (cs) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6790633B1 (en) * | 1990-04-18 | 2004-09-14 | Michael S. Brown | Method of inhibiting a farnesyl transferase enzyme |
| US8003342B1 (en) | 1990-04-18 | 2011-08-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for identifying farnesyl transferase inhibitors |
| FR2724320B1 (fr) * | 1994-09-13 | 1996-12-20 | Transgene Sa | Nouvel implant pour le traitement des maladies acquises |
| US5518042A (en) * | 1994-09-16 | 1996-05-21 | Huyck Licensco, Inc. | Papermaker's forming fabric with additional cross machine direction locator and fiber supporting yarns |
| FR2738151B1 (fr) * | 1995-09-04 | 1997-09-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers |
| BR9713847A (pt) | 1996-12-06 | 2000-02-29 | Rhone Poulenc Rorer Pharma | Polipeptìdeo isolado codificado por um gene semelhante a lipase, composição, composição farmacêutica, fragmento antigênico, ácido nucleico isolado, vetor, célula recombinante, anticorpo, célula de hibridoma, processos para preparar um polipeptìdeo, para triar agonistas ou antagonistas de atividade llg, para a hidrólise enzimática de um éster de fosfatidilcolina, e para melhorar o perfil de lipìdeo no soro de um humano ou outro animal tendo um perfil de lipìdeo indesejável, e, camundongo transgênico. |
| US7008776B1 (en) | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
| FR2758569B1 (fr) * | 1997-01-20 | 1999-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Materiel biologique pour le traitement d'un mammifere par transfert de gene d'anticorps et composition pharmaceutique le concernant |
| WO2000050089A2 (en) * | 1999-02-26 | 2000-08-31 | Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Ltd. | Regulation of the stability of recombinant proteins and antiboodies |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| ATE486089T1 (de) | 2000-03-31 | 2010-11-15 | Aventis Pharma Inc | Nuklearfaktor kb induzierender faktor |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| AU2002338446A1 (en) * | 2001-01-23 | 2002-11-05 | University Of Rochester Medical Center | Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells |
| WO2012162628A2 (en) | 2011-05-25 | 2012-11-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Lipopeptide inhibitors of ras oncoproteins |
| KR101602870B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-21 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용 |
| KR101602876B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-11 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용 |
| US20180072815A1 (en) | 2014-10-23 | 2018-03-15 | Singh Biotechnology, Llc | Single Domain Antibodies Directed Against Intracellular Antigens |
| US9546211B2 (en) * | 2014-10-23 | 2017-01-17 | Singh Molecular Medicine, Llc | Single domain antibodies directed against TNF-alpha |
| TWI746473B (zh) | 2015-11-02 | 2021-11-21 | 美商辛分子醫藥有限公司 | 針對細胞內抗原之單域抗體 |
| US11155641B2 (en) | 2016-05-27 | 2021-10-26 | Orum Therapeutics Inc. | Cytosol-penetrating antibody and use thereof |
| US10787487B2 (en) | 2018-06-21 | 2020-09-29 | Orum Therapeutics Inc. | Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies |
| CN110981943B (zh) * | 2019-12-02 | 2021-08-03 | 清华大学 | 多肽及其在制备药物中的用途和药物 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| DE3915952A1 (de) * | 1989-05-12 | 1990-12-06 | Peter Werner | Wirkstoff/medikament/biotechnologisches verfahren zur behandlung von erkrankungen, die mit exo- oder endogenen intrazellulaeren proteinen (onkogene etc.) assoziert sind |
| EP0556197A4 (en) * | 1990-09-25 | 1994-05-18 | Univ Connecticut | Prolonging expression of polynucleotides introduced into a cell |
| CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
| CA2120153C (en) * | 1991-09-30 | 2006-06-06 | Ira Pastan | Recombinant immunotoxins |
| JPH08503121A (ja) * | 1991-12-10 | 1996-04-09 | デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート | 中和反応性ヒト抗−ｇｐ１２０組換え抗体、それをコードするｄｎａおよびその使用 |
| AU687010B2 (en) * | 1992-07-17 | 1998-02-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Method of intracellular binding of target molecules |
-
1993
- 1993-06-16 FR FR9307241A patent/FR2706486B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-15 WO PCT/FR1994/000714 patent/WO1994029446A2/fr active IP Right Grant
- 1994-06-15 AT AT94919711T patent/ATE231916T1/de active
- 1994-06-15 PL PL94312213A patent/PL180760B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 ES ES94919711T patent/ES2191031T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 JP JP50143495A patent/JP4384260B2/ja active Active
- 1994-06-15 UA UA95125274A patent/UA46709C2/uk unknown
- 1994-06-15 NZ NZ268038A patent/NZ268038A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 KR KR1019950705716A patent/KR100342233B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 EP EP94919711A patent/EP0703980B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 HU HU9503615A patent/HU219138B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 DE DE69432075T patent/DE69432075T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 US US08/564,164 patent/US6159947A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 AU AU70763/94A patent/AU7076394A/en not_active Abandoned
- 1994-06-15 RU RU96100240/13A patent/RU2218400C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 SK SK1568-95A patent/SK285169B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 BR BR9407512A patent/BR9407512A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-06-15 CN CN94192443A patent/CN1076052C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 CA CA2165458A patent/CA2165458C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 DK DK94919711T patent/DK0703980T3/da active
- 1994-06-15 CZ CZ19953295A patent/CZ289039B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-16 ZA ZA944303A patent/ZA944303B/xx unknown
-
1995
- 1995-12-11 NO NO19955011A patent/NO319466B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-12-15 FI FI956057A patent/FI120311B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ289039B6 (cs) | Izolovaná nukleová kyselina obsahující gen kódující intracelulární jednořetězcovou protilátku, vektory a defektní rekombinantní viry tuto sekvenci obsahující afarmaceutické kompozice s jejich obsahem k léčbě rakoviny | |
| KR101944263B1 (ko) | 에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체 | |
| JP4482054B2 (ja) | 細胞内の物質移送のための抗体から誘導されたベクター | |
| ES2213148T3 (es) | Anticuerpo monoclonal dirigido contra el vih. | |
| CS275838B6 (en) | Method for production of hybridoms used for monoclonal antigen against hiv virus producing | |
| JP2006521088A (ja) | 抗活性化ｒａｓ抗体 | |
| CN118255888A (zh) | 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用 | |
| WO2022127066A1 (zh) | 一种特异性中和辅助性T细胞TGF-β信号的双特异性抗体、其药物组合及其用途 | |
| AU722702B2 (en) | Intracellular binding proteins and use thereof | |
| JP7396992B2 (ja) | 上皮成長因子受容体に対する親和性が増加した抗体およびそれに由来するフラグメント | |
| EP2552958B1 (en) | Monoclonal antibody directed against the p17 protein of hiv, capable of neutralising the binding of p17 to the p17 receptor (p17r) | |
| ITMI950676A1 (it) | Vaccini polinucleotidici | |
| JPH03172185A (ja) | エイズ及びｂ型肝炎用のワクチン | |
| WO2023026881A1 (ja) | 抗ｐｄ－１シグナルペプチド抗体とその利用 | |
| TW201809013A (zh) | 用於藥物遞送之抗體融合蛋白 | |
| JPH06506947A (ja) | 抗ウィルスハイブリッド抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130615 |