HU219138B - Intracelluláris kötő proteineket kódoló nukleinsav-szekvenciák, ezeket tartalmazó vektorok, vírusok, gyógyszerkészítmények és előállításuk - Google Patents
Intracelluláris kötő proteineket kódoló nukleinsav-szekvenciák, ezeket tartalmazó vektorok, vírusok, gyógyszerkészítmények és előállításuk Download PDFInfo
- Publication number
- HU219138B HU219138B HU9503615A HU9503615A HU219138B HU 219138 B HU219138 B HU 219138B HU 9503615 A HU9503615 A HU 9503615A HU 9503615 A HU9503615 A HU 9503615A HU 219138 B HU219138 B HU 219138B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid sequence
- virus
- intracellular
- protein
- Prior art date
Links
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 85
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 66
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 35
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 6
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010027920 GTPase-Activating Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 46
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 24
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 102100022709 Putative alpha-1-antitrypsin-related protein Human genes 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 12
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 10
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 5
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 4
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 2
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 108010042663 guanosine phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 235000015047 pilsener Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 101150066838 12 gene Proteins 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 4,7,7-trimethylbicyclo[4.1.0]heptan-5-one Chemical compound O=C1C(C)CCC2C(C)(C)C12 CNJLMVZFWLNOEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 1
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 1
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700003968 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (49-57) Proteins 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100247323 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ras-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000002389 anti-papilloma Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 230000009841 epithelial lesion Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000006712 oncogenic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150054672 pil gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 108090000195 villin Proteins 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1072—Regulatory proteins, e.g. tat, rev, vpt
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány intracelluláris kötőproteineket kódolónukleinsavszekvenciákra, ezeket tartalmazó vektorokra és re- kombinánsvírusokra, továbbá ezeket tartalmazó, génterápiában felhasználhatógyógyszerkészítményekre vonat- kozik. A találmány tárgyát képeziktovábbá mindezek előállítására szolgáló eljárások. ŕ
Description
A találmány nukleinsavszekvenciákra, ezeket tartalmazó rekombináns vírusokra, vektorokra és gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyek alkalmazhatók a génterápiában. Pontosabban a találmány intracelluláris kötőproteint (PIL=protéine intracellulaire de liaison) kódoló gént tartalmazó, esetleg alkalmas expressziós vektorokba beépített nukleinsavszekvenciákra és ezeknek génterápiában való felhasználására vonatkozik. A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiek előállítására szolgáló eljárások is.
A génterápia arra szolgál, hogy segítségével hiányosságot vagy rendellenességet (mutációt, eltérő expressziót stb.) egy genetikus információnak a sejtbe vagy a károsodott szervbe való bevezetése révén kiigazítsunk. Ezt a genetikus információt akár egy szervből kivont sejtbe vezethetjük be in vitro, és a módosított sejtet visszavisszük a szervezetbe, akár közvetlenül a megfelelő szövetbe vihetjük be in vivő. Ebben a vonatkozásban különböző transzfekciós és génátviteli technikákat írt le a szakirodalom [Lásd: Roemer and Friedman, Eur. J. Biochem., 208, 211 (1992)]. Ezen a szakterületen a génterápia céljára javasolt próbálkozások mostanáig a genetikai betegségekben szerepet játszó aktív polipeptideket (hormonokat, növekedési faktorokat stb.) kódoló gének, antiszensz gének vagy vakcinákat eredményező antigénhatású peptideket kódoló gének átviteléből álltak. A találmány a génterápia új megközelítésére vonatkozik, amely abból áll, hogy beviszünk egy célsejtbe vagy szövetbe, és abban kifejezünk egy olyan intracelluláris peptidet, amely a sejtalkotó részekkel kölcsönhatást képes létesíteni, és így a sejtfunkciók befolyásolására képes. A találmány legfőképpen azon a megállapításon alapul, hogy olyan módosított antitesteket lehetséges in vivő kifejezni, amelyek az intracelluláris kompartmentumokban maradnak, és amelyek bizonyos sejtfunkciókat tudnak szabályozni. Ugyancsak a találmány alapját képezi az a megállapítás, hogy az ilyen intracelluláris antitesteket kódoló DNS-szekvenciákat be lehet klónozni vektorokba, például vírusvektorokba génterápiában való felhasználás céljából.
Az antitestek felhasználása a humán terápiában általában lehetővé teszi a keringésben lévő és/vagy a sejtek felületén elhelyezkedő biológiai komplexek célbavételét és neutralizálását, megindítva egy, az immunrendszer által kiváltott eseménykaszkádot, amely ezeknek az eltávolításához vezet. Sok esetben azonban ilyenek a rákos vagy például a vírusok okozta betegségek, ez a próbálkozás hiábavaló, mivel a megtámadott sejtek károsodásáért felelős antigén nem hozzáférhető az injekcióban beadott antitestek számára. A találmány egy új, különösen előnyös terápiás eljárást bocsát rendelkezésre, amely az antitestek vagy terápiás szerek folyamatos és sejten belüli termeltetéséből áll, és ezeknek epitopjukhoz való kötődése csökkenti és/vagy megszünteti a károsodást.
Az antitestek rekombináns technikával való kifejezésének lehetőségét a szakirodalom már leírta. Például az EP 88994 számú európai szabadalmi leírás az antitestek nehéz és könnyű láncai variábilis szakaszainak in vitro expresszióját és tisztítását ismerteti. Ezenkívül a
4,946,778 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan módosított antitesteket kódoló DNSszekvenciák in vitro expresszióját írja le, amelyekben egy antitest nehéz és könnyű láncának variábilis szakaszai linkerrel vannak összekapcsolva. Az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett antitestek azonban inaktívak, és általában oldhatatlan zárványtestek formájában vannak szintetizálva. Az antitesteket tehát meg kell tisztítani, majd kémiai kezeléseknek (denaturálás, renaturálás stb.) alávetni, hogy visszanyeljék aktivitásukat. A jelen találmányi leírásban bemutatjuk, hogy az ilyen DNS-szekvenciákat fel lehet használni aktív, intracelluláris antitestek közvetlen in vivő kifejezésére. A találmány tehát bemutatja az intracelluláris antitesteket kódoló ilyen DNS-szekvenciák használatának lehetőségét - olyan szakaszok szabályozása alatt, amelyek lehetővé teszik emlőssejtekben való kifejeződésüket - génterápia céljára, mégpedig embernél. Ez az új megközelítés ennélfogva lehetővé teszi, hogy a klasszikus vakcinálási módszerekkel nem hozzáférhető sejtalkotó részeket célba vegyünk. Ezenfelül ez a megoldás nem jár immunválasz kialakulásával, hanem sejten belüli hatással.
A találmány tárgyát elsősorban tehát egy olyan nukleinsavszekvencia képezi, amely egy 1. számú vagy 2. számú a aminosavszekvenciával rendelkező intracelluláris kötőproteint (PIL-t) kódoló gént tartalmaz olyan szakaszok szabályozása alatt, amelyek lehetővé teszik expreszióját az emlőssejtekben. A találmány szerinti nukleinsavszekvencia az 1. számú vagy 2. számú szekvenciában leírt nukleotidszekvenciát vagy ennek egy részét tartalmazza.
A találmány azokra a vektorokra is vonatkozik, amelyek a fent meghatározott nukleinsavszekvenciát tartalmazzák. Pontosabban a találmány szerinti vektorok virális eredetűek, ilyenek például a retrovírusok, adenovírusok, az adenoasszociált vírusok, a herpeszvírus, a vacciniavírus, a HSV-vírus (herpes simplex vírus) stb.
Vonatkozik továbbá a találmány e nukleinsavszekvenciáknak és e vektoroknak olyan gyógyszerkészítmények előállításában való felhasználására, amelyek emberi vagy állati szervezetek sebészeti kezelésére és/vagy gyógykezelésére szolgálnak. Minden olyan gyógyszerkészítményre is vonatkozik, amelyek egy fent meghatározott vektort, nevezetesen virális vektort vagy nukleinsavszekvenciát tartalmaznak.
A találmány értelmében az intracelluláris kötőprotein (PIL) kifejezés minden olyan, az 1. számú vagy 2. számú szekvenciában leírt aminosavszekvenciával rendelkező proteinre vagy proteinfragmentumra vonatkozik, amelyek képesek annak a sejtnek az alkotórészét felismerni, amelyben kifejeződtek, és képesek ezzel szelektív módon és megfelelő affinitással reagálni. Itt szó lehet kovalens vagy nem kovalens kémiai reakciókról. A sejt alkotórészeivel (proteinek, lipidek, aminosavak, mRNS, tRNS, rRNS, DNS stb.) létesített kölcsönhatás révén lehetőség nyílik arra a sejtfunkcióra hatást gyakorolni, amelyben a szóban forgó alkotórész szerepet játszik, és ennek révén ennek a funkciónak a szabályozására (stimulálására, lassítására, gátlására).
HU 219 138 Β
A találmány szerinti PIL előnyösen antitesteredetű molekulákból áll, vagy olyanokból, amelyeknek a kötőtulajdonságai egy antitest kötőtulajdonságaihoz hasonlíthatók. Pontosabban olyan proteinekről van szó, amelyeknek szelektivitása és affinitása elégséges ahhoz, hogy in vivő kölcsönhatást létesítsen az antigénre gyakorolt neutralizálóhatása következtében. Ezeket a molekulákat ennélfogva, tulajdonságaikra és elhelyezkedésükre való tekintettel, intracelluláris antitesteknek nevezzük.
Az antitestek, az immunglobulin szupercsaládhoz tartozó molekulák a természetben szekretált proteinek formájában szintetizálódnak (elsősorban a B-limfociták szintetizálják). Ennélfogva az extracelluláris kompartmentumokban szabadulnak fel (keringési rendszer), és itt fejtik ki hatásukat (a felismerés és az antigénekhez való kötődés itt jön létre). Nemrég kimutatták, hogy az intracelluláris antitesteket kódoló módosított gének kifejezhetők In vivő anélkül, hogy ez az antitestek sajátosságait, így specificitásukat és affinitásukat befolyásolná. A találmány szerinti intracelluláris antitesteket kódoló nukleinsavszekvenciák tehát olyan módon módosított antitestgént tartalmaznak, hogy az antitest ne szekretálódjék. Az antitestgént általában főként a szekrécióért felelős szekvenciák deléciójával vagy mutációjával módosítjuk. A találmány szerinti PIL-ek olyan antitestfragmentumokból, például Fab vagy F(ab’)2 fragmentumokból állhatnak, amelyek az antigénkötő doméneket hordozzák. Az ilyen típusú intracelluláris antitestek alkalmazása több gént tartalmazó olyan nukleinsavszekvencia expresszióját biztosítja, amely e fragmentumok nehéz, illetve könnyű láncait kódolja, továbbá ugyancsak lehetővé teszi, hogy ezek a láncok in vivő hibátlanul szerelődjenek össze. Ezért a találmányban való felhasználásra egy különösen előnyös intracelluláris antitestformát állítottunk elő, amelyben egy antitest könnyű lánca variábilis szakasza kötőhelyének megfelelő peptid peptidlinker révén kapcsolódik egy antitest nehéz lánca variábilis szakasza kötőhelyének megfelelő peptidhez. Az ilyen típusú intracelluláris antitestek - jelük ScFv - használata azért előnyös, mivel ezeket egyetlen gén fejezi ki. A találmány szerint módosított ilyen antitesteket kódoló nukleinsavszekvenciák szerkesztését a példákban ismertetjük.
Egyébként a találmány szerinti intracelluláris antitesteket kódoló nukleinsavszekvenciák kémiai, enzimes vagy genetikai úton is módosíthatók abból a célból, hogy stabil és/vagy többfunkciós, és/vagy kisebb méretű intracelluláris antitesteket állítsunk elő, és/vagy abból a célból, hogy elhelyezkedésüket ebben vagy abban az intracelluláris kompartmentumban segítsük elő. Ennélfogva a találmány szerinti nukleinsavszekvenciák olyan szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek sejtmagban elhelyezkedő peptideket (NLS) kódolnak. Pontosabban a találmány szerinti szekvenciákat olyan szekvenciával fuzionálhatjuk, amely az SV40 vírus NLS-t kódolja, amelynek a peptidszekvenciája a következő: MPKKKRK [Kalderon et al., Cell, 39, 499 (1984)].
Mint fentebb rámutattunk, a találmány szerinti nukleinsavszekvenciák olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik a PIL-eket kódoló gén vagy gének expresszióját emlőssejtekben. Általában a PIL-géne két tehát olyan transzkripciós és transzlációs promoterszakaszok szabályozása alá helyezzük, amelyek abban az emlőssejtben működőképesek, amelyben az expreszszióra törekszünk. Olyan szekvenciákról van szó, amelyek az említett sejtre nézve homológok, azaz olyan szekvenciákról, amelyek az említett sejtben a gének expressziójáért a természetben felelősek. Más eredetű szekvenciák ugyancsak használhatók, azaz olyan szekvenciák, amelyek más sejttípusokban felelősek a proteinek expressziójáért, amelyek az antitestek kifejeződéséért természetes feltételek mellett felelősek, a virális expressziós szekvenciák, például amelyek olyan vektorban vannak jelen, amelyek a találmány szerinti szekvenciákat tartalmazzák, vagy lehetnek még szintetikus vagy félszintetikus szekvenciák is.
Emberben való felhasználáshoz számos működőképes promotert írt le a szakirodalom, ilyenek például a CMV, SV40, Ela, MLP, LTR stb. víruspromoterek. A sejtpromoterek - ilyen például a villingén promotere - jelentősek, mivel lehetővé teszik a specifikus szöveti expressziót (a viliin esetében ez a bélre korlátozódik).
Másfelől az expressziós szekvenciák módosíthatók is például abból a célból, hogy ezeket egy sajátos típusú vektorban vagy sejtben való kifejeződéshez igazítsuk úgy, hogy csökkentjük a méretet, növeljük transzkripciós promotereinek aktivitását, hogy indukálható promotereket szerkesszünk, javítsuk szabályozási színvonalukat, vagy tovább változtassuk szabályozási tulajdonságaikat. Ezeket a módosításokat például in vitro mutagenizálással végezhetjük el további szabályozóelemek vagy szintetikus szekvenciák beiktatásával, vagy az eredeti szabályozóelemek deléciójával vagy szubsztitúciójával. Különösen előnyös, ha szövetspecifikus promotereket használunk, hogy a PIL expresszióját csupán egyetlen szövettípusban éljük el.
Egyébként ha a nukleinsavszekvencia nem tartalmaz expressziós szekvenciákat, ezeket beépíthetjük egy expressziós vektorba egy ilyen szekvenciától 3’irányban. Egy találmány szerinti vektor előállításához előnyösen először egy sejtfunkciót azonosítunk. Például egy olyan funkciót, amely olyan betegségben szerepel vagy egy olyan betegségért felelős, amire hatni kívánunk. Ezután előnyösen egy olyan megfelelő sejtalkotó részt azonosítunk, amely részt vesz ebben a funkcióban, ezután meghatározzuk, hogy melyik PIL a legmegfelelőbb ehhez az alkotórészhez (antitestek, származékok stb.) ennek elhelyezkedésétől, szerepétől, tulajdonságától stb. függően. Miután kiválasztottuk a PIL-t, a megfelelő nukleinsavszekvenciát molekuláris biológiai technikákkal (kémiai szintézis, klónozás, enzimes módosítás stb.) állíthatjuk elő, és beépíthetjük egy alkalmas vektorba a példákban leírt metodológia szerint.
A találmány másik tárgyát olyan gyógyszerkészítmények képezik, amelyek legalább egy olyan nukleinsavszekvenciát vagy vektort tartalmaznak, amelyet előzőleg meghatároztunk.
A találmány szerinti szekvenciákat felhasználhatjuk - például embernek vagy állatnak injekcióban való be3
HU 219 138 Β adása után - egy PIL intracelluláris expressziójának megindítására abból a célból, hogy ez egy meghatározott sejtfunkcióra hasson. Ezek a szekvenciák egyszerű DNS alakjában injektálhatok a WO 90/11092 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt technika szerint. E szekvenciák komplexek formájában is alkalmazhatók, például DEAE-dextránnal [Pagano et al., J. Virol., 1, 891 (1967)], radioaktív proteinekkel [Kaneda et al., Science, 243, 375 (1989)], lipidekkel [Felgner et al., PNAS, 84, 7413 (1987)], liposzómák alakjában [Fraley et al., J. Bioi. Chem., 255, 10 431 (1980)] stb.
A találmány egyik előnyös megvalósítása szerint az előzőekben meghatározott nukleinsavszekvenciákat vektor tartalmazza. Az ilyen vektorok alkalmazása ténylegesen előmozdítja a sejtekbe való behatolást, az enzimekkel szembeni rezisztencia megnövekedését, a stabilitás és az intracelluláris expresszió szintjének növelését. A találmány szerinti vektorok mind plazmid-, mind vírusvektorok lehetnek. Mindazonáltal előnyben részesítjük a virális vektorok használatát.
Egy előnyös kiviteli alakban a találmány olyan előzőekben meghatározott nukleinsavszekvenciákra vonatkozik, amelyeket virális vektor tartalmaz. A találmány minden olyan rekombináns vírusra is vonatkozik, amelyek genomjukba beépítve legalább egy olyan nukleinsavszekvenciát tartalmaznak, amely egy PIL-t kódol.
Mint fentebb említettük, különböző vírusok alkalmasak arra, hogy vektorként használjuk fel a találmány szerinti gének in vivő átviteléhez és expressziójához. Megemlíthetők példaként a retrovírusok (RSV, HMS, MMS stb.), a HSV-vírus, az „adenoasszociált” vírusok (AAV), az adenovírusok, a vacciniavírus stb.
A találmány szerinti rekombináns vírus előnyösen fogyatékos (hiányos funkciójú) vírus. A „fogyatékos vírus” kifejezés egy olyan vírusra vonatkozik, amely a célsejtben nem képes replikálódni. Általánosságban a találmány keretében használt fogyatékos vírusok genomja tehát legalábbis azoktól a szekvenciáktól van megfosztva, amelyek a szóban forgó vírusnak a fertőzött sejtben való replikációjához szükségesek. Ezeket a szakaszokat vagy eltávolítjuk (teljesen vagy részben), vagy működésképtelenné tesszük, vagy más szekvenciákkal helyettesítjük, mégpedig találmány szerinti szekvenciákkal. A fogyatékos vírus mindamellett előnyösen megőrzi genomjának azokat a szekvenciáit, amelyek a vírusrészecskék kapszidképzéséhez szükségesek.
A retrovírust, „adenoasszociált” vírust, HSV-vírust (herpes simplex vírus) vagy adenovírus-eredetű rekombináns fogyatékos vírusokat a szakirodalom már leírta: [Roemer and Friedmann, Eur. J. Biochem., 208, 211 (1992); Dobson et al., Neuron, 5, 353 (1990); Chiocca et al., New Bioi., 2, 739 (1990); Miyanohara et al., New Bioi., 4, 238 (1992); WO 91/18088; Akii et al., Natúré Genetics, 3, 224 (1993); Stratford-Perricaudet et al., Humán Gene Therapy, 1, 241 (1990); Levrero et al., Gene, 101, 195 (1991); EP 243204],
Különösen előnyös a találmány szerinti nukleinsavszekvenciák rekombináns fogyatékos adenovírusba beépített formájának használata.
Valójában különböző szerotípusú adenovírusok különíthetők el. Szerkezetükben és tulajdonságaikban kevéssé különböznek, de emberre nem patogének, és így a betegeket immunológiailag nem veszélyeztetik. Másfelől ezek a vírusok nem integrálódnak az általuk megfertőzött sejt genomjába, és be tudnak fogadni exogén DNS-ből származó fontos fragmentumokat. A találmány szerint a különböző szerotípusok közül előnyben részesítjük a 2 vagy 5 típusú adenovírus (Ad 2 vagy Ad 5) használatát. Az Ad 5 adenovírus esetében a replikációhoz szükséges szekvenciák az E1A és E1B szakaszoknak felelnek meg.
Egyébként a találmány szerinti intracelluláris antitesteket kódoló gének kis mérete lehetővé teszi, hogy előnyös módon több olyan gént vigyünk be egyidejűleg ugyanabba a vektorba, amelyek egy vagy több megcélzott sejtalkotó rész különböző szakaszai ellen ható intracelluláris antitestet kódolnak. A találmány egy jellemző megvalósítási formájában tehát egy olyan vektort mégpedig virális vektort - használunk, amely legalább két olyan nukleinsavszekvenciát tartalmaz, amelyek különböző epitopok elleni intracelluláris kötőproteineket kódolnak.
A találmány szerinti rekombináns fogyatékos vírusokat homológ rekombináció segítségével állítjuk elő. A rekombináció egy fogyatékos vírus és egy olyan plazmid között megy végbe, amely többek között az előbbiekben meghatározott nukleinsavszekvenciát hordozza [Levrero et al., Gene, 101, 195 (1991); Graham, EMBO J., 3, 2917 (1984)]. A homológ rekombináció az említett vírus és plazmid kotranszfekciója után jön létre egy megfelelő sejtvonalban. A használt sejtvonal előnyösen (i) legyen transzformálható az említett elemekkel, és (ii) hordoznia kell olyan szekvenciákat, amelyek képesek kiegészíteni a fogyatékos vírus genomrészét - előnyösen integrált formában - a rekombináció kockázatának elkerülése érdekében. Rekombináns fogyatékos adenovírusok előállításához használt sejtvonalak közül megemlíthetjük például a „293” humán embrionális vesesejtvonalat [Graham et al., J. Gén. Virol., 36, 59 (1977)], amely genomjába integrálva tartalmazza egy Ad 5 adenovírus genomjának bal oldali részét (12%). Rekombináns fogyatékos retrovírus előállításához használt sejtvonalak közül megemlíthetjük például a CRIP-vonalat [Dános and Mulligan, PNAS, 85, 6460 (1988)].
Végül az elszaporított vírust összegyűjtjük, majd a molekuláris biológia klasszikus technikái szerint tisztítjuk.
A találmány vonatkozik még egy olyan gyógyszerkészítményre is, amely legalább egy előbbiekben meghatározott rekombináns fogyatékos vírust tartalmaz.
A találmány szerinti gyógyszerkészítményt a következő alkalmazásoknak megfelelően formulázhatjuk. Az alkalmazás lehet helyi, orális, parenterális, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris stb.
Injekcióformulálás esetén a gyógyszerkészítmények előnyösen gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyagokat tartalmaznak. Itt főként sóoldatokról lehet szó (nátriumdihidrogén-foszfát, dinátrium-hidrogén-foszfát, nát4
HU 219 138 Β rium-, kálium-, kalcium- vagy magnézium-klorid stb. vagy e sók keverékei), amelyek sterilek, izotóniásak, vagy száraz készítményekről, nevezetesen liofilizált készítményekről, amelyekből, az adott eset szerint, steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injekciós oldatokat készíthetünk.
A beadáshoz használt nukleinsavak (szekvencia vagy vektor) dózisait különböző paraméterektől függően állapíthatjuk meg, éspedig az alkalmazás módjától, az illető betegségtől, a kifejezendő géntől vagy még a kezelés kísérleti időtartamától függően. Általánosságban, ami a találmány szerinti rekombináns vírusokat illeti, ezeket KB-IO14 pfü/ml-t, előnyösen ΙΟ6—1010 pfü/ml-t tartalmazó adagok formájában formuláljuk és alkalmazzuk. A pfü („plaque forming unit”) kifejezés alatt egy vírustartalmú oldat fertőzőképessége értendő, amelyet úgy határozunk meg, hogy egy alkalmas sejttenyészetet megfertőzünk, és általában 48 óra múlva megszámoljuk a fertőzött sejtek által létrehozott plakkokat. A vírusoldatok pfü titerének meghatározási technikáit a szakirodalom jól dokumentálja.
A találmány tárgyát képezi minden olyan rekombináns sejt is, amelyek az előzőekben meghatározott nukleinsavszekvenciákat tartalmazzák.
A találmány szerinti szekvenciák - adott esetben vektorokba beépítve - és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények számos betegség kezelésére használhatók. Ezeket tehát felhasználhatjuk gének in vivő átvitelére és expressziójára minden szövettípusban. A kezelés egyébként a kezelendő betegségtől függően célzott lehet (speciális szöveti szinten az átvitelt vektor kiválasztásával határozhatjuk meg, az expressziót pedig speciális promoter kiválasztásával). A találmány szerinti szekvenciákat vagy vektorokat embernél vagy állatnál előnyösen használhatjuk olyan proteinek in vivő intracelluláris termelésére, amelyek specifikusan képesek hatni a különböző sejtfünkciókra, mint a sejtproliferáció, a metabolitszintézis, a DNS replikációja és/vagy transzkripciója stb. A találmány tehát lehetővé teszi számos sejteredetű vagy különböző betegségek által okozott sejtes diszfünkció specifikus, helyi és hatékony kezelését, főként rákos megbetegedések, vírusos vagy bakteriális betegségek, vagy még általánosabban, minden olyan betegség kezelését, amelyekben egy sejtközvetítő azonosítható.
Alkalmazás sejtproliferációval kapcsolatos betegségek kezelésére
Egy különösen előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti nukleinsavszekvenciák olyan PIL-kódoló géneket tartalmaznak, amelyek képesek kölcsönhatást létesíteni a sejtproliferációban részt vevő faktorok aktivitásával, és képesek ezeket befolyásolni. A sejtproliferáció nagyszámú faktort vesz igénybe, ilyenek a membránreceptorok (G-proteinek), az onkogének, enzimek (proteinkinázok, fameziltranszferázok, foszfolipázok stb.), nukleozidok (ATP, AMP, GDP, GTP stb.), aktiválófaktorok [guanozinok cserefaktorai (GRF, GAP stb.), transzkripciós faktorok stb.] stb. Az ilyen faktorok megkötésére és neutralizálására képes találmány szerinti intracelluláris PIL-expressziója következtében lehetővé válik a sejtproliferációs folyamat szabályozása. Ez különösen olyan helyzetekben hasznos, ahol a sejtproliferáció kicsúszik a természetes szabályozómechanizmusok alól, ami például a tumorok megjelenéséhez vezet. Számos faktor (onkogén gének termékei és e termékek hatásának jelzésében részt vevő faktorok) valóban kapcsolatban van a sejtproliferáció rendellenes jelenségével. Például a hasnyálmirigy-adenokarcinómák 90%-ában a tizenkettedik kodonon egy mutált Ki-ras onkogén mutatható ki [Almoguera et al., Cell, 53, 549 (1988)]. Ezenkívül megállapították, hogy mutált ras gén van jelen a vastagbél-adenokarcinómákban és a pajzsmirigyrákokban (50%) is, vagy a tüdőkarcinómákban és a mieloid leukémiákban [30%; J. L. Bős, Cancer Rés., 49, 4682 (1989)]. Ma már több olyan onkogént azonosítottak (myc, fos, jun, ras, myb, erb stb.), amelyeknek a mutált formái - úgy tűnik - felelősek a sejtproliferáció rendellenessé tételéért. A PIL, amely kötődni képes ezekhez a celluláris faktorokhoz (előnyösen ezek onkogén formájához), és így lassítani vagy gátolni képes a hatásukat, a rákterápia új megközelítésének lehetőségét kínálja.
Egy különösen előnyös kiviteli alakban a találmány olyan nukleinsavszekvenciákat tartalmazó vektorokra vonatkozik, amelyek olyan intracelluláris antitestet kódoló gént foglalnak magukban, amely egy onkogén expressziós termékével vagy egy onkogén jelátviteli útjában előforduló faktorral képes reagálni.
A célonkogének közül, a találmány értelmében, a következő onkogéneket említhetjük meg: ras, fos, jun, myc, myb és erb.
Egy onkogén jelátvivő útjában szereplő közvetítőfaktorok közül megemlíthetjük a membránreceptorokat, amelyeket intracelluláris doménjeik szintjén célozhatunk meg [G-proteinek, kinázok (például: tirozin-kináz), foszforilázok, fameziltranszferázok], a nukleozid cserefaktorokat (GAP, GRF stb. faktorok) stb.
Még előnyösebben, a találmány olyan vektorokra, éspedig víruseredetű vektorokra vonatkozik, amelyeknek a nukleinsavszekvenciája egy olyan onkogén vagy faktor elleni intracelluláris antitestet kódol, amely egy onkogén jelátviteli útjában fordul elő. Az említett antitestet a következő peptidek alkotják: egy antitest könynyű láncának variábilis szakasza kötőhelyének megfelelő peptid, amelyet peptidlinker köt össze egy antitest nehéz láncának variábilis szakasza kötőhelyének megfelelő peptiddel.
Még pontosabban, a találmány fogyatékos rekombináns vírusokra vonatkozik, amelyek a ras-függő jelátvivő út egy faktora elleni intracelluláris antitestet fejeznek ki.
Mint a példákban bemutatjuk, az anti-p21 (a p21 a ras gén expressziós terméke), az anti-GAP vagy antip53 intracelluláris antitestek kifejeződése által lehetővé válik egy rákos sejt transzformált fenotípusának visszaalakítása (reverziója).
Alkalmazás vírusbetegségek kezelésére
A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák lehetnek még olyan intracelluláris antitesteket kódoló szekvenciák, amelyek egy patogén vírus (HÍV, papillomavírus stb.) fertőző ciklusával képesek reagálni.
HU 219 138 Β
Pontosabban a HIV-vírus esetében, vagyis az előrehaladott klinikai fázisok kezelésében a jelenleg hozzáférhető antivirális szerek nem képesek blokkolni a vírus szaporodását, hanem éppen csak fékezik a betegség progresszióját. Ennek egyik fő okát ezen antivirális szerekkel szemben rezisztens törzsek megjelenése képezi. A hatékony vakcinálás kifejlesztése ugyancsak számos akadályba ütközik: a HIV-genetikai változékonysága következtében nem lehetséges olyan stabil antigénszerkezetet megállapítani, ami a meglévő különböző törzsek elleni humorális vagy celluláris immunológiai válaszhoz alapul szolgálna. Mint az antivirális szerek esetében, ahol a vírus pontmutációk révén áll ellen egy szelekciós nyomásnak, a jelenleg kipróbált vakcinációs vizsgálatokban úgy tűnik, hogy a HÍV kicsúszik az immunrendszer alól.
A találmány a HIV-fertőzés kezelésére egy olyan új megoldást bocsát rendelkezésre, amely PIL, azaz intracelluláris antitestek kifejeződése révén a vírus blokkolásából áll annak replikációs ciklusa idején. A találmány révén lehetővé válik, hogy főként a vírus genetikai változékonyságának problémájától függetlenítsük magunkat, ellentétben a vakcinálással és az antivirális szerekkel végzett megoldásokkal. A klasszikus vakcinálás esetében kapott immunválaszok elsősorban a variábilis szakaszok ellen keletkeznek. Ezzel szemben a találmány szerinti intracelluláris antitestek használata esetén nemcsak állandó epitóp kiválasztására van lehetőség, hanem olyan epitopot is választhatunk, amely elengedhetetlen a virális proteinfunkcióhoz. Előnyös, ha az intracelluláris antitest olyan méretű epitóp ellen irányul, amely elégséges a vírus ellenállásának kivédéséhez és pontmutációk révén való alkalmazkodásának megakadályozásához. Másfelől a találmány szerinti intracelluláris antitestet kódoló gén kis mérete előnyös módon a génterápia ugyanazon vektorából több szakasz (egy vagy több proteinszakasz) megcélzására ad lehetőséget.
A találmány elsőrendű fontosságú célja, hogy a vírus két fő proteinjét - tat és rév - vegye munkába. Ez a két protein valóban nélkülözhetetlen a virális replikáció számára. Ezenkívül az antiszensz messenger RNS-ek kifejeződése vagy pedig a tat vagy rév messenger RNS-t célzó ribozimek kifejeződése akadályozza a virális replikációt. E proteinek hatásmechanizmusa viszonylag jól dokumentált: a tat a transzkripció transzaktivációjának egy faktora, míg a rév biztosítja a replikációs ciklus korai és késői fázisai közti átmenetet. Ez a két protein a virális messenger RNS-hez kötötten fejti ki hatását, és az ehhez a kapcsolódáshoz szükséges peptidszakasz, amely nélkülözhetetlen a működőképességükhöz, viszonylag eléggé behatárolt. Ezenkívül kimutatták, hogy az RNS-en való megtapadási helyük (a tatnál a TAR szakasz és a rev-nél az RRE szakasz) túlzott expressziója gátolja a virális expresszióra gyakorolt hatásukat.
Ilyen körülmények mellett a találmány egy különösen előnyös elemét képezi egy olyan DNS-szekvencia használata, amely egy tat vagy rév protein elleni intracelluláris antitestet kódol, és amely ezek hatásait semlegesíteni képes. Előnyös, ha ezek az antitestek a tat vagy rév azon szakaszai ellen irányulnak, amelyek az RNShez való kapcsolódásukért felelősek.
Ezen epitopok elleni találmány szerinti intracelluláris antitesteket a példákban leírt metodológiával állíthatjuk elő. Az anti-tat antitestet a T-B monoklonális antitestből (Hybridolab) kiindulva, genetikai módosításokkal állíthatjuk elő.
A HÍV replikációjában egy másik fontos célprotein, amelynek a funkciója könnyen gátolható egy intracelluláris antitesttel, az NCP7 nukleokapszid protein. Ez a protein valóban fontos szerepet játszik a retrotranszkripcióban (korai fázis), az integrációban és egy késői fázisban, és mindemellett fontos a kapszidképzésben. Ez a többfunkciós tulajdonság azzal magyarázható, hogy szerkezetileg enzimes aktivitással rendelkezik. Mint hibridázenzimet írták le, amely a virális nukleinsavak komplexeinek - RNS/DNS és DNS/DNS - kialakulását teszi lehetővé a retrotranszkripció folyamán, mint RNS/RNS és RNS/tRNS-lys3 a kapszidképzés szintjén. Az NCP7 - úgy tűnik - nélkülözhetetlen a fertőző vírus képződése szempontjából.
Génterápiában az NCP7 elleni intracelluláris antitestek citoplazmatikus expressziója, amely gátolja az NCP7 részvételét a virális RNS-ek dimerizációjában és a kapszidképzésen, alkotja a találmány felhasználásának egy másik speciális területét.
Az epitopok elleni, találmány szerinti intracelluláris antitesteket, amelyek ezt a proteint neutralizálják, a példákban leírt metodológia szerint állíthatjuk elő.
A találmány szerint más vírusalkotó részek is bevonhatók a génterápiába, éspedig a CD4 molekulához való kapcsolódás helye [például: a burokglikoprotein (gpl20/41)], a burok multimerizációs szakasza, a gpl20/41 hasítási helye, a proteáz, integráz és általában minden virális protein. Ezek a domének általában nem hozzáférhetők, ha a burok natív formában van jelen. Ezért nagyon kevés az immunogén, és így lehetetlen hozzáférkőzni ezekhez egy vakcinálással. A találmány lehetővé teszi, hogy megcélozzuk ezeket a virális alkotórészeket is, és így gyógykezelésre potenciálisan igen kiválóan alkalmazhatók. Ezenkívül, mint előbb említettük, a találmány szerinti intracelluláris antitesteket kódoló gének kis mérete lehetővé teszi, hogy előnyös módon, ugyanabban a vektorban egy vagy több célba vett alkotórész különböző szakaszai ellen irányuló több intracelluláris antitest egyidejűleg kifejeződhessen.
A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák olyan PIL-t kódoló szekvenciák is lehetnek, amelyek képesek a metabolitok szintézisében, a proteinszintézisben vagy még a replikációban és/vagy a DNS transzkripciójában részt vevő faktorok aktivitásával kölcsönhatást létesíteni, és ezeket megzavarni.
A találmányt részletesebben ismertetjük a következő példák segítségével, amelyeket úgy kell tekinteni, hogy céljuk a szemléltetés és nem a korlátozás.
Az alábbiakban az ábrákat ismertetjük.
1. ábra: (A) Az ScFv-ras restrikciós térképe.
(B) Az ScFv-GAP restrikciós térképe.
(C) Egy találmány szerinti intracelluláris
HU 219 138 Β antitest átmeneti (tranziens) expressziójának neutralizálóhatása a ras vagy Her2 onkogén transzformálóképességére.
Py= kontrollsejtek;
ScFv= a csak psv2.ScFv.ras plazmiddal transzfektált sejtek;
VAL= onkogén ras-t kifejező Ha-ras Val 12 vektorral transzfektált sejtek;
VAL+ScFv= a psv2.ScFv.ras és Ha-ras Val 12 plazmiddal kotranszfektált sejtek;
HER2= onkogén Her2-t kifejező vektorral transzfektált sejtek;
HER2+ScFv= a psv2.ScFv.ras és pár Her2 plazmiddal kotranszfektált sejtek.
Általános molekuláris biológiai technikák
A molekuláris biológiában használt klasszikus módszereket, mint a plazmid-DNS preparatív extrakciója, a plazmid-DNS centrifugálása cézium-klorid gradiensben, elektroforézis agarózgélben vagy akrilamid-gélben, a DNS-fragmentumok tisztítása elektroelúcióval, a proteinek fenolos vagy fenol-kloroformos extrakciója, a DNS kicsapása sós közegben etanollal vagy izopropilalkohollal, transzformálás Escherichia coliban stb., jól ismerik a szakemberek, és e módszerekről bőségesen ír a szakirodalom [T. Maniatis et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982); F. M. Ausubel et al. (a szerkesztő) „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, New York (1987)].
A BR322 és pUC típusú plazmidok, valamint az M13 sorozatbéli fágok a kereskedelemből beszerezhetők.
Ligáláshoz a DNS-fragmentumok agarózgél vagy akrilamid-gélelektroforézissel választhatók el méret szerint. Ezután fenollal vagy fenol-kloroform elegyével való extrahálás, majd etanolos kicsapás következik, végül a T4 fág DNS-ligáz (Biolabs) jelenlétében való inkubálás a szállító cég ajánlásai szerint.
A túlnyúló 5’-végek betöltését E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentje (Biolabs) segítségével végezhetjük a szállító cég előírásai szerint. A túlnyúló 3’végek megsemmisítését T4 fág eredetű DNS-polimeráz jelenlétében végezzük a gyártók ajánlásai szerint. A túlnyúló 5’-végek megsemmisítése SÍ nukleázzal végzett kíméletes kezeléssel történik.
A szintetikus oligodezoxinukleotidokkal in vitro végrehajtott mutagenizálás a Taylor és munkatársai [Nucl. Acids Rés., 13, 8749-8764 (1985)] által kidolgozott módszer szerint végezhető egy Amersham által forgalmazott készlet (kit) használatával.
A DNS-fragmentumok sokszorozását az úgynevezett PCR-technikával [R. K. Saiki et al., Plymerase-Catalyzed Chain Reaction, Science, 230, 1350-1354 (1985); K. B. Mullis, F. A. Faloona, Meth. Enzymol., 755, 335-350 (1987)] végezzük, egy „DNA thermal cycler” (Perkin-Elmer Cetus) készülék használatával, a gyártó cég előírásai szerint.
A nukleinsavszekvenciák ellenőrző vizsgálata Sanger és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] módszerével végezhető, egy Amersham által forgalmazott kit használatával.
1. példa
Anti-ras intracelluláris antitestet kódoló DNS-szekvencia klónozása és kifejezése Ebben a példában egy, az Y13-259 monoklonális antitest tulajdonságait felmutató intracelluláris kötőproteint kódoló nukleinsavszekvencia klónozását és kifejezését írjuk le. Az Y13-259 antitestet (ATCC CRL-1742) [J. Virol., 43, 294-304 (1982)] a Ras protein ellen termelték. Ez az antitest - egyszer injektálva a sejtekbe - neutralizálja az onkogén Ras proteinek funkcióját [Smith et al., Natúré, 320, 540-543 (1986); Kung et al., Exp. Cell. Rés., 162, 363-371 (1986)].
1.1. A DNS-szekvencia előállítása
Készítettünk egy intracelluláris antitestet (ScFv fragmentum) kódoló DNS-szekvenciát a 4,496,778 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett technika szerint. Ezt a szekvenciát ezután emlőssejtekben működő promoter szabályozása alá helyeztük.
A poliA RNS-eket egy olyan hibridómasejt tenyészetéből izoláltuk, amely az Y13-259 antitestet szekretálja. Az izolálást S. H. Chirgwin és munkatársai által leírt [Biochemistry, 18, 5294 (1979)] technikával végeztük. Ezeket az RNS-eket véletlenszerűen képződött hexanukleotid primerek segítségével végzett reverz transzkripciós reakcióban használtuk fel. A kapott cDNS-eket használtuk templátok gyanánt két PCRreakcióban:
- az elsőben az Y13-259 nehéz lánc variábilis fragmentumát (VH) sokszoroztuk, egér VH-specifikus primerekkel;
- a másikban kaptuk a VL-fragmentumot, amikor is egérszekvenciákból származó 10 primer keverékét használtuk.
Ilyen módon egy 340 bp méretű és egy 325 bp méretű fragmentum képződött, amelyek ezután egy olyan linker segítségével kapcsolódtak össze, amely lehetővé tette 5’-nél a VH cDNS helyes elhelyezkedését a VL cDNS-hez képest. Ez a linker 15 aminosavat kódol, és ez háromszor ismételt (Gly)4Ser elemből áll [R. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 3833-3837 (1979)]. Az intracelluláris antitest szekvenciáját az
1. számú szekvencia írja le (28-270 aminosavmaradék). Ez a szekvencia elég szabadságfokot ad a VH-VL fúziójához, ez lehetőséget ad párhuzamos összekapcsolódásukhoz, és megfelelő affinitást biztosít az antigénhez.
A VH-linker-VL fuzionált nukleinsavszekvenciát ezután beépítjük egy fágmidba, amely lehetővé teszi az intracelluláris antitest (ScFv fragmentum) expresszióját egy M13 fág felszínén (1A. ábra). Az expresszió révén könnyen elvégezhető azoknak az intracelluláris antitesteknek az azonosítása és szelektálása, amelyek megfelelő módon ismerik fel az antigént.
1.2. A módosított intracelluláris antitest működőképességének kiértékelése
A módosított anti-Ras intracelluláris antitestet kódoló DNS-szekvenciát (VH-linker-VL) restrikciós eljárással izoláltuk a fágmidból, majd beépítettük az sv2 vektorba az SV40 korai enhancer promoterpár sza7
HU 219 138 Β bályozása alá [Schweighoffer et al., Science, 256, 825-827 (1992)] abból a célból, hogy megvizsgáljuk, mennyire képes egy onkogén ras hatását ellensúlyozni. Az így kapott plazmid psv2.ScFv.ras elnevezést kapott. A funkció kiértékelésére számos vizsgálatot végeztünk.
a) Emlőssejtek átmeneti transzfekciója
Emlőssejtek átmeneti transzfekciójával végzett kiértékelés céljából a psv2.ScFv.ras plazmidot NIH 3T3 sejtekbe (ATCC CRL-1658) kotranszfektáltuk Schweighoffer és munkatársai által leírt [Science, 256, 825-827 (1992)] technológia szerint - egy olyan vektorral, amely biztosítja a Ha-ras Val 12 gén expreszszióját. A tanulmányozott jelátvivő út aktiválásának helyzetét a „klóramfenikol-acetil-transzferáz (CAT)” riportergéntől származó enzimaktivitás mértékével határoztuk meg. Az említett riportergént olyan, ugyancsak kotranszfektált nukleotidelemeket tartalmazó promoter szabályozása alá helyeztük, amelyek „trans” választ adnak ras (RRE) hatására: ezeket a RRE elemeket egy polióma TK-enhancer hibrid promoter alkotja [Wasylyk et al., EMBO J., 7, 2475 (1988)]. (TK=Limidin Kináz.)
A kapott eredményeket az IC. ábrán mutatjuk be. A kapott CAT-aktivitások analízise mutatja, hogy az Y13-259 antitestből előállított módosított intracelluláris antitest képes az onkogén ras aktivitását antagonizálni.
A psv2.ScFv.ras plazmid, egy olyan plazmiddal kotranszfektálva, amely egy tirozinkináz-aktivitással rendelkező onkogén expresszióját teszi lehetővé - HER2 onkogén (humán epidermal growth factor type 2) -, ugyancsak blokkolja ennek aktivitását a „CAT” tesztplazmidon (1. ábra).
b) A transzformált sejtek góc (foyer)-képzése: a rákos sejteknek az a tulajdonsága, hogy transzformációs gócokat képeznek, például a NIH 3T3 fibroblasztok is, amelyek egy ras onkogént fejeznek ki [Barlat et al., Oncogene, B, 215-218 (1993)].
A NIH 3T3 sejteket ugyanúgy tenyésztettük, mint az előző vizsgálatban, 10% fetális borjúszérumot tartalmazó, Dulbecco által módosított Eagle-táptalajban (DMEM), 37 °C-on 5% szén-dioxid-tartalmú nedves légtérben. A sejteket ezután egy ras onkogénnel - Haras Val 12 - a psv2.ScFv.ras plazmiddal (lásd fentebb) és a neomicin rezisztenciagén tízszeres feleslegével kotranszfektáltuk kationos lipidtranszfekciós technikával [Schweighoffer et al., Science, 256, 825-827 (1992)]. Azonos mennyiségű össz-DNS-sel transzfektáltunk minden csészénél.
A transzfekció után 24 óra múlva a 100 mm-es Petri-csészékből származó transzfektált sejteket 1/10 arányban szétosztottuk, és ugyanebben a táptalajban tenyésztettük, de 0,4 g G418 (GIBCO/BRL)/ml táptalaj jelenlétében. Tizennégy napos tenyésztés után az 1 pg transzfektált DNS-re kapott transzformációs gócok számát feljegyeztük.
A kapott eredményeket, amelyek négy független kísérlet középértékének felelnek meg, az alábbi 1. táblázatban ismertetjük.
7. táblázat
NIH 3T3 sejtek transzfektálása Ha-ras Val 12-vel anti-ras intracelluláris antitest jelenlétében
Transzfektált Gócok száma transzfektált plazmid DNS pg-onként
Ha-ras Val 12 110 psv2.ScFv.ras 2
Ha-ras Val 12+psv2.ScFv.ras 30
A kapott eredmények világosan mutatják, hogy az anti-ras intracelluláris antitest nagyon erősen csökkenti egy onkogén ras géntranszformáló képességét.
Másfelől figyelembe véve az a) alatt kapott eredményeket, az Y13-259 antitest ScFv fragmentuma expressziójának ugyancsak meg kell gátolnia a más onkogének által előidézett transzformációt. Ilyen a HER1 és HER2, amelyek megkönnyítik a sejt ras proteinjeinek aktiválását.
Magától értetődik, hogy az ezen bejelentésben leírt eredmények alapján egy szakember kivitelezheti a találmányt más sejtalkotó részek elleni intracelluláris antitesteket (mint az ScFv fragmentumok) kódoló nukleinsavak felhasználásával. Ezeket vagy a sejt alkotórészei ellen termelt ismert antitestekből kiindulva lehet előállítani, vagy pedig úgy, hogy azonosítjuk a neutralizálandó antigént, ezzel az antigénnel, vagy ennek egy előnyös epitopjával immunizálunk, majd a kapott antitestből vagy mRNS-éből vagy hibridomából előállítjuk az intracelluláris antitestet. Ugyanígy célozhatok meg a sejt transzformálása folyamatában részt vevő más alkotórészek is. Például anti-ras intracelluláris kötőproteineket kódoló más DNS-szekvenciákat is ugyanezen módszerekkel állíthatunk elő a következő hibridomák segítségével: M38, M8, M70, M90 és M30 (ATCC HB 9158). A kapott antitestek a Ha-ras protein 1-23, 24-69, 90-106, 107-130, illetve 131-152 aminosavmaradékai ellen hatnak. Ezenfelül, mint az előbbiekben rámutattunk, előnyös, ha olyan vektorokat állítunk elő, amelyek egyidejűleg különböző intracelluláris antitesteket kódoló szekvenciákat hordoznak, a jobb neutralizálóhatás érdekében.
2. példa
Anti-GAP intracelluláris antitestet kódoló DNS klónozása és kifejezése
Ebben a példában egy olyan nukleinsavszekvencia klónozását és kifejezését írjuk le, amely a GAP protein ellen termelt monoklonális antitest tulajdonságait felmutató intracelluláris kötőproteint kódol.
A GAP protein (GPTáz aktiválóprotein) (GPTáz= =guanozin-trifoszfatáz) részt vesz a ras-függő jelátvivő útban. Kölcsönhatásba lép katalitikusán a ras proteinekkel, és megsokszorozza a GTP hidrolízisének sebességét 100-200-szorosra, amelyet in vitro a p21 normál proteinnel mérünk. Különböző vizsgálatok kimutatták, hogy ezen körülbelül 1044 aminosavból álló protein katalitikus doménje a karboxiterminális szakaszban helyezkedik el (704-1044 aminosavmaradék), és hogy ez
HU 219 138 Β a szakasz felelős a GAP protein és a ras proteinek kölcsönhatásáért (lásd WO 91/02749 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentést.
Kimutatták azt is, hogy a GAP protein úgynevezett „SH3” doménje elleni monoklonális antitest neutralizálja az onkogén ras proteinek funkcióit Xanopus-petében [Duchesne et al., Science, 259, 525-528 (1993)].
Az 1.1. pont alatt leírt módszerek szerint egy olyan intracelluláris antitestet (scFv fragmentum) kódoló DNS-szekvencia szintetizálható, amely megfelel ennek az antitestnek (2. számú szekvencia, 11-250 aminosavmaradék, 1B. ábra). Ha egy ilyen szekvenciát beépítünk egy vektorba, ez meg tudja gátolni egy onkogén ras gén transzformálóképességét tumorsejtekben.
Egyébként bejelentésünkben pontosabban azonosítottuk az ezen antitestek által felismert, mesterségesen szintetizált epitopokat, amelyeket fel lehet használni új neutralizáló antitestek előállítására, a találmány kivitelezése céljára.
a) Pontosabb azonosítás
Az azonosítást „epitope scanning” technikával végeztük. Ez a technika azon az elven alapul, hogy egy adott antitest 5-15 aminosavból álló peptiddel képes reagálni. Ennélfogva az epitopok egymás utáni azonosítását úgy végezzük, hogy a szóban forgó antigén teljes szekvenciájának megfelelő, 5-15 aminosav méretű peptidekből egymást átfedő teljes készletet állítunk elő. Ezt a technikát használtuk a GAP „SH3” dómén működő epitopjai meghatározásához. Ezért az egész domént egymás utáni átfedéssel két aminosavanként dekapeptidszintézis révén letapogattuk.
- Átfedő peptidek szintézise
Kémiai szintézissel 35 olyan peptidet állítottunk elő, amelyek az 1. ábra szerinti fragmentum egészét átfedték. Két párhuzamos szintézist végeztünk 2 független hordozón Fmoc/t-butil-módszerrel, szilárd fázisban (Cambridge Research Biochemicals kit).
- Funkcionáló epitopok vizsgálata
Az Ac200 antitest által felismert funkcionáló epitopokat ELISA-tesztben mutattuk ki, peroxidázzal konjugált nyúl-antiegér-antitest használatával. Az enzim kromogén szubsztrátuma amino-di-(3-etil-benzotiazodinszulfonát) [ABTS=2,2 ’-azino-bisz(3-etil-benztiazolinszulfonsav)] volt.
A kapott eredmények szerint az ezen antitest által felismert epitopok a következők:
- PVEDRRRVRAI
- EISF
- EDGWM
A szakemberek ezeket az epitopokat használhatják a ras hatásainak neutralizálására szolgáló antitestek klasszikus technikákkal való előállításához.
3. példa
Anti-Ki-ras intracelluláris antitestet kódoló nukleinsavszekvencia előállítása a Ki-ras (2A és 2B) hipervariábilis szakaszaiból származó peptidekkel immunizált egerek lépéből készített mRNS-kivonatokból Ebben a példában a találmány szerinti intracelluláris antitesteket (ilyenek az ScFv fragmentumok) kódoló nukleinsavszekvenciák előállítását írjuk le. Úgy járunk el, hogy azonosítunk egy neutralizálandó antigént, ezzel az antigénnel vagy ennek egy előnyös epitopjával immunizálunk, majd az antitestből, vagy az mRNS-ből, vagy a kapott hibridomákból kiindulva előállítjuk a nukleinsavszekvenciát.
Ezzel a példával mutatjuk be, hogy a találmány minden kívánt antigénre vagy epitopra alkalmazható, még akkor is, ha a szóban forgó antigén vagy epitop elleni antitest nem áll rendelkezésre.
Ebben a példában a megcélzott antigén a Ki-ras protein. Pontosabban az immunizáláshoz használt antigének a Ki-ras 2A és 2B proteinvégeinek megfelelő 24, illetve 25 aminosavból álló peptidek:
- 2A peptid:
QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
- 2B peptid:
KYREKNSKDGKKKKKKSKTKCIIM
Klasszikus immunológiai technikákkal egereket immunizáltunk ezekkel a peptidekkel, ezután a lépeket extraháltuk, és cDNS-eket állítottunk elő az mRNS-ekből kiindulva. A variábilis szakaszokat kódoló cDNS-eket ezután klónoztuk. így egy fágbankot képeztünk, amelyben a fágok a használt egerek összességének megfelelő ScFv-t fejezték ki. Ezután azonosítottuk a 2A és 2B peptidet felismerő intracelluláris antitesteket (ScFv fragmentumok), amelyeket egymást követő lépésben affinitásoszlopon való elválasztással és mikrotitráló lemezeken izoláltunk.
A kapott ScFv fragmentumokat ezután funkciójuk szerint teszteltük az 1. példában leírt technológia szerint.
Az ebben a példában kidolgozott stratégia lehetővé teszi, hogy előnyös módon szelektáljuk a Ki-ras onkogénekre specifikus intracelluláris antitesteket, amelyek tehát nem hatnak a ras protoonkogénekre. Ennélfogva az ilyen eszközök nemcsak sejtszinten (valójában a ras által transzformált sejtekben a jelátviteli utak felbontásával), hanem molekuláris szinten is működnek.
4. példa
Anti-p53 intracelluláris antitestet kódoló mutáns nukleinsavszekvencia előállítása
Ez a példa mutáns p53 proteinek elleni intracelluláris antitesteket (például ilyenek az ScFv fragmentumok) kódoló nukleinsavszekvenciák előállítását írja le. Ezeket az intracelluláris antitesteket az említett mutáns p53 proteinek elleni különböző monoklonális antitestekből kapjuk.
A p53 proteint kódoló gént nagy számban változtatják meg a tumorsejtek [Cáron de Fromentel et Soussi, Genes, 4, 1-15 (1992)]. A mutáns p53 protein konformációja más, mint a vad p53 proteiné [Lane and Banchimol. Genes Dev., 4, 1-8 (1990)]. Ez a konformációváltozás monoklonális antitestekkel kimutatható [Milner and Cook, Virology, 154, 21-30 (1986); Milner, Natúré, 310, 143-145 (1984)].
A pAB 240 antitestek felismerik a p53 proteinek mutáns formáit.
A mutáns p53-ra specifikus antitest ScFv fragmentumának intracelluláris expressziója vagy pedig a mutáns
I
HU 219 138 Β proteinekkel specifikus kölcsönhatásba lépő proteinek, jótékony hatást kell gyakoroljanak olyan tumoroknál, amelyekben mutált p53 van jelen.
5. példa
Antipapilloma-virus intracelluláris antitestet kódoló DNS-szekvencia klónozása és kifejezése Ebben a példában egy humán papillomavírus (HPV) protein elleni intracelluláris antitestet (ScFv fragmentum) kódoló DNS-szekvencia klónozását és kifejezését írjuk le.
A célba vett virális protein az E6 protein. Ezt a proteint a HPV16 és 18 vírus állítja elő. Ezek a vírusok 90%-ban felelősek nőknél a méhnyakrákért, és ezeket azonosították prekarcinómás epiteliális léziókban is [Riou et al., Láncét, 335, 117 (1990)]. Az E6 géntermék tumorok képződését eredményezi, miközben erősen csökkenti az antionkogén p53 mennyiségét a HPVpozitív sejtekben [Wrede et al., Mól. Carcinog., 4, 171 (1991)]. Más tumorokban más mechanizmusok - mutáció (lásd a 4. példát) - vagy proteinekkel mint MDM2-vel - való asszociáció gátolják a p53-at.
Az E6 protein szekvenciáját közölte a szakirodalom [Hawley-Nelson et al., EMBO J., 8, 3905 (1989); Münger et al., J. Virol., 63, 4417 (1989)]. Ennek a proteinnek a speciális szakaszai „epitope scanning” (lásd a
2. példát) segítségével azonosíthatók. Ezeket azután egerek immunizálására használjuk a 3. példában leírt technológia szerint. A humán papillomavírus (HPV) E6 proteinje elleni intracelluláris antitestet (ScFv fragmentum) kódoló DNS-szekvenciát ezután az előzőekben leírt módszer szerint állítjuk elő. Ennek a szekvenciának a működőképességét in vivő expressziója után mutatjuk ki úgy, hogy mérjük
- a vad p53 értékének növekedését az E6-ot kifejező sejtekben;
- a HPV által transzformált sejtek morfológiájának reverzióját;
- az E6-hatás blokkolását a p53 transzaktiválására;
- a humán keratinociták és fibroblasztok E6 által véghezvitt transzformációjának gátlását.
6. példa
Anti-HIV intracelluláris antitestet kódoló nukleinsavszekvencia előállítása a tat, rév és NCP7 proteinek aktív szakaszaiból származó peptidekkel immunizált egerek lépéből készített mRNS-kivonatokból Ebben a példában a találmány szerinti intracelluláris antitesteket (ilyenek az ScFv fragmentumok) kódoló nukleinsavszekvenciák előállítását írjuk le. Úgy járunk el, hogy a neutralizálandó antigént azonosítjuk, ezzel az antigénnel immunizálunk vagy ennek egy előnyös epitopjával, majd előállítjuk a nukleinsavszekvenciát az antitestből, az mRNS-ből vagy a kapott hibridomából.
Ezzel a példával annak lehetőségét is bemutatjuk, hogy a találmány minden kívánt antigénre vagy epitopra alkalmazható, még ha az említett antigén vagy epitop ellen semmilyen monoklonális antitestet sem írt le eddig a szakirodalom.
A példában megcélzott antigének a HIV-vírus tat, rév és NCP7 proteinjei. Pontosabban az immunizáláshoz használt antigének a 6, 9 és 16 aminosavból álló alábbi peptidek, amelyek e proteinek azon szakaszainak felelnek meg, amelyek az mRNS-sel való kölcsönhatásukért (tat-nál és rev-nél) vagy az RNS-ek dimerizációjáért (NCP7-nél) felelősek:
- tat peptid: RKKRRQRRR
-révpeptid: RQARRNRRRRWRERQR
- NCP7 peptid: RAPRKK
Miután ezekkel a peptidekkel a klasszikus immunológiai technikák szerint immunizáltunk egereket, a lépeket extraháltuk, és az mRNS-ekből cDNS-eket készítettünk. A variábilis szakaszokat kódoló cDNS-eket azután klónoztuk, és így egy fágbankhoz jutottunk. A tagok olyan ScFv fragmentumokat fejeztek ki, amelyek a használt egerek teljes készletének megfeleltek. A tat, rév és NCP7 peptideket felismerő intracelluláris antitesteket (ScFv fragmentumok) azután azonosítottuk, majd egymás utáni lépésekben affinitásoszlopon és mikrotitráló lemezeken szelektáltuk.
Ezeket az ScFv fragmentumokat ezután fünkciójukra nézve, a HIV-vírus replikációs ciklusának blokkolására való képességükre teszteltük.
Claims (25)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Nukleinsavszekvencia, amely egy, 1. számú vagy
- 2. számú szekvenciában leírt aminosavszekvenciával rendelkező intracelluláris kötőproteint kódoló gént tartalmaz.2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy az 1. számú vagy 2. számú szekvenciában leírt nukleotidszekvenciát vagy ennek egy részét tartalmazza.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy p21 protein, a ras gén expressziós terméke elleni intracelluláris antitestet kódol.
- 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy GAP protein elleni intracelluláris antitestet kódol.
- 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy p53 protein vagy egy mutáns p53 protein elleni intracelluláris antitestet kódol.
- 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy NCP7 protein elleni intracelluláris antitestet kódol.
- 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy emlőssejtekben működőképes promoter szabályozása alatt áll.
- 8. A 7. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy CMV, SV40, Ela, MLP, LTR vagy villinpromoter szabályozása alatt áll.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy be van építve egy vektorba.HU 219 138 Β
- 10. A 9. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy virális vektorba van beépítve.
- 11. Vektor, amely legalább egy, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
- 12. A 11. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy egy virális vektor.
- 13. Rekombináns hiányos vírus, amely a genomjában egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
- 14. A 13. igénypont szerinti rekombináns hiányos vírus, azzal jellemezve, hogy egy retrovírus, adenovírus, adenoasszociált vírus, vacciniavírus vagy HSVvírus.
- 15. Gyógyszerkészítmény, amely legalább egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvenciát vagy egy, a 13. vagy 14. igénypont szerinti rekombináns vírust tartalmaz a gyógyszerészeiben szokásosan alkalmazott hordozó- és/vagy segédanyagokkal együtt.
- 16. A 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy rekombináns vírusként egy adenovírust, retrovírust vagy adenoasszociált vírust tartalmaz.
- 17. A 16. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzaljellemezve, hogy a vírust 104 és 1014 pfu/ml menynyiségben tartalmazza.
- 18. Egy 1. igénypont szerinti nukleinsav alkalmazása rákbetegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 19. Egy 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia alkalmazása vírusbetegségek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
- 20. Eljárás az 1. vagy 2. számú szekvenciában bemutatott nukleinsavszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a szekvenciát egy intracelluláris antitestből önmagában ismert módon izoláljuk vagy szintetikusan előállítjuk.
- 21. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerint előállított nukleinsavszekvenciát egy megfelelő vektorba, előnyösen virális vektorba egy emlőssejtben működő promoter szabályozása alatt működőképesen beépítjük.
- 22. Eljárás rekombináns hiányos vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy a 20. igénypont szerint előállított nukleinsavszekvenciát a vírus genomjába stabilan bevisszük.
- 23. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 20. igénypont szerint előállított nukleinsavszekvenciát vagy egy 22. igénypont szerint előállított vírust a gyógyszerkészítésben szokásos hordozóval és/vagy segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.
- 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rákbetegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
- 25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírusbetegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9307241A FR2706486B1 (fr) | 1993-06-16 | 1993-06-16 | Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques. |
| PCT/FR1994/000714 WO1994029446A2 (fr) | 1993-06-16 | 1994-06-15 | Proteines intracellulaires de liaison (pil) et leurs utilisations |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9503615D0 HU9503615D0 (en) | 1996-02-28 |
| HUT74266A HUT74266A (en) | 1996-11-28 |
| HU219138B true HU219138B (hu) | 2001-02-28 |
Family
ID=9448183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9503615A HU219138B (hu) | 1993-06-16 | 1994-06-15 | Intracelluláris kötő proteineket kódoló nukleinsav-szekvenciák, ezeket tartalmazó vektorok, vírusok, gyógyszerkészítmények és előállításuk |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6159947A (hu) |
| EP (1) | EP0703980B1 (hu) |
| JP (1) | JP4384260B2 (hu) |
| KR (1) | KR100342233B1 (hu) |
| CN (1) | CN1076052C (hu) |
| AT (1) | ATE231916T1 (hu) |
| AU (1) | AU7076394A (hu) |
| BR (1) | BR9407512A (hu) |
| CA (1) | CA2165458C (hu) |
| CZ (1) | CZ289039B6 (hu) |
| DE (1) | DE69432075T2 (hu) |
| DK (1) | DK0703980T3 (hu) |
| ES (1) | ES2191031T3 (hu) |
| FI (1) | FI120311B (hu) |
| FR (1) | FR2706486B1 (hu) |
| HU (1) | HU219138B (hu) |
| NO (1) | NO319466B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ268038A (hu) |
| PL (1) | PL180760B1 (hu) |
| RU (1) | RU2218400C2 (hu) |
| SK (1) | SK285169B6 (hu) |
| UA (1) | UA46709C2 (hu) |
| WO (1) | WO1994029446A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA944303B (hu) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6790633B1 (en) * | 1990-04-18 | 2004-09-14 | Michael S. Brown | Method of inhibiting a farnesyl transferase enzyme |
| US8003342B1 (en) | 1990-04-18 | 2011-08-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for identifying farnesyl transferase inhibitors |
| FR2724320B1 (fr) * | 1994-09-13 | 1996-12-20 | Transgene Sa | Nouvel implant pour le traitement des maladies acquises |
| US5518042A (en) * | 1994-09-16 | 1996-05-21 | Huyck Licensco, Inc. | Papermaker's forming fabric with additional cross machine direction locator and fiber supporting yarns |
| FR2738151B1 (fr) * | 1995-09-04 | 1997-09-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers |
| BR9713847A (pt) | 1996-12-06 | 2000-02-29 | Rhone Poulenc Rorer Pharma | Polipeptìdeo isolado codificado por um gene semelhante a lipase, composição, composição farmacêutica, fragmento antigênico, ácido nucleico isolado, vetor, célula recombinante, anticorpo, célula de hibridoma, processos para preparar um polipeptìdeo, para triar agonistas ou antagonistas de atividade llg, para a hidrólise enzimática de um éster de fosfatidilcolina, e para melhorar o perfil de lipìdeo no soro de um humano ou outro animal tendo um perfil de lipìdeo indesejável, e, camundongo transgênico. |
| US7008776B1 (en) | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
| FR2758569B1 (fr) * | 1997-01-20 | 1999-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Materiel biologique pour le traitement d'un mammifere par transfert de gene d'anticorps et composition pharmaceutique le concernant |
| WO2000050089A2 (en) * | 1999-02-26 | 2000-08-31 | Mindset Biopharmaceuticals (Usa) Ltd. | Regulation of the stability of recombinant proteins and antiboodies |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| ATE486089T1 (de) | 2000-03-31 | 2010-11-15 | Aventis Pharma Inc | Nuklearfaktor kb induzierender faktor |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| AU2002338446A1 (en) * | 2001-01-23 | 2002-11-05 | University Of Rochester Medical Center | Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryotic cells |
| WO2012162628A2 (en) | 2011-05-25 | 2012-11-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Lipopeptide inhibitors of ras oncoproteins |
| KR101602870B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-21 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용 |
| KR101602876B1 (ko) | 2014-07-22 | 2016-03-11 | 아주대학교산학협력단 | 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용 |
| US20180072815A1 (en) | 2014-10-23 | 2018-03-15 | Singh Biotechnology, Llc | Single Domain Antibodies Directed Against Intracellular Antigens |
| US9546211B2 (en) * | 2014-10-23 | 2017-01-17 | Singh Molecular Medicine, Llc | Single domain antibodies directed against TNF-alpha |
| TWI746473B (zh) | 2015-11-02 | 2021-11-21 | 美商辛分子醫藥有限公司 | 針對細胞內抗原之單域抗體 |
| US11155641B2 (en) | 2016-05-27 | 2021-10-26 | Orum Therapeutics Inc. | Cytosol-penetrating antibody and use thereof |
| US10787487B2 (en) | 2018-06-21 | 2020-09-29 | Orum Therapeutics Inc. | Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies |
| CN110981943B (zh) * | 2019-12-02 | 2021-08-03 | 清华大学 | 多肽及其在制备药物中的用途和药物 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| DE3915952A1 (de) * | 1989-05-12 | 1990-12-06 | Peter Werner | Wirkstoff/medikament/biotechnologisches verfahren zur behandlung von erkrankungen, die mit exo- oder endogenen intrazellulaeren proteinen (onkogene etc.) assoziert sind |
| EP0556197A4 (en) * | 1990-09-25 | 1994-05-18 | Univ Connecticut | Prolonging expression of polynucleotides introduced into a cell |
| CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
| CA2120153C (en) * | 1991-09-30 | 2006-06-06 | Ira Pastan | Recombinant immunotoxins |
| JPH08503121A (ja) * | 1991-12-10 | 1996-04-09 | デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート | 中和反応性ヒト抗−ｇｐ１２０組換え抗体、それをコードするｄｎａおよびその使用 |
| AU687010B2 (en) * | 1992-07-17 | 1998-02-19 | Dana-Farber Cancer Institute | Method of intracellular binding of target molecules |
-
1993
- 1993-06-16 FR FR9307241A patent/FR2706486B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-06-15 WO PCT/FR1994/000714 patent/WO1994029446A2/fr active IP Right Grant
- 1994-06-15 AT AT94919711T patent/ATE231916T1/de active
- 1994-06-15 PL PL94312213A patent/PL180760B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 ES ES94919711T patent/ES2191031T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 JP JP50143495A patent/JP4384260B2/ja active Active
- 1994-06-15 UA UA95125274A patent/UA46709C2/uk unknown
- 1994-06-15 NZ NZ268038A patent/NZ268038A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 KR KR1019950705716A patent/KR100342233B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 EP EP94919711A patent/EP0703980B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 HU HU9503615A patent/HU219138B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 DE DE69432075T patent/DE69432075T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 US US08/564,164 patent/US6159947A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-15 AU AU70763/94A patent/AU7076394A/en not_active Abandoned
- 1994-06-15 RU RU96100240/13A patent/RU2218400C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 SK SK1568-95A patent/SK285169B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-06-15 BR BR9407512A patent/BR9407512A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-06-15 CN CN94192443A patent/CN1076052C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 CA CA2165458A patent/CA2165458C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-15 DK DK94919711T patent/DK0703980T3/da active
- 1994-06-15 CZ CZ19953295A patent/CZ289039B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-16 ZA ZA944303A patent/ZA944303B/xx unknown
-
1995
- 1995-12-11 NO NO19955011A patent/NO319466B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-12-15 FI FI956057A patent/FI120311B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU219138B (hu) | Intracelluláris kötő proteineket kódoló nukleinsav-szekvenciák, ezeket tartalmazó vektorok, vírusok, gyógyszerkészítmények és előállításuk | |
| JP3855071B2 (ja) | 抗ｈｉｖモノクローナル抗体 | |
| KR101944263B1 (ko) | 에이치비브이 감염 및 관련 질병의 치료를 위한 폴리펩타이드 및 항체 | |
| KR101633520B1 (ko) | Ｃｓｆ－１ｒ에 대한 항체 | |
| CA2223033A1 (en) | High affinity human monoclonal antibodies specific for rsv f-protein | |
| US6238918B1 (en) | DNA sequence encoding the tumor suppressor gene ING1 | |
| GB2273099A (en) | Glycoprotein encoded by a human endogenous retrovirus K envelope gene | |
| JP4371178B2 (ja) | 抗ｐ５３一本鎖抗体フラグメント及びその使用 | |
| JPH11514864A (ja) | ヘルペスウイルスのｒｆｈｖ／ｋｓｈｖ亜科の糖タンパク質ｂ | |
| CN102176922A (zh) | 包含结合于EBV(Epstein-Barr病毒)蛋白BARF1的抗体的药物组合物 | |
| EP0846761A1 (en) | A novel transcription factor expressed in cycling cells, nucleic acid molecules encoding said transcription factor and its promoter region and uses thereof | |
| ITMI950676A1 (it) | Vaccini polinucleotidici | |
| AU722702B2 (en) | Intracellular binding proteins and use thereof | |
| US6451979B1 (en) | Methods of treatment using NBS-1, antibodies and proteins thereto, and uses of the antibodies | |
| JPH06125783A (ja) | 組換え抗ｈｉｖ抗体およびその調製方法 | |
| US6747133B1 (en) | Antibodies against the tumor suppressor gene ING1 | |
| WO2007023189A2 (en) | Pharmaceutical composition and its use for the prophylactic or therapeutic treatment of retroviral diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU Representative=s name: DANUBIA SZABADALMI ES JOGI IRODA KFT., HU |
|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI I, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |