SE460198B - Foerfarande foer framstaellning av 5'-deoxi-5'-metyltioadenosin - Google Patents

Description

460 198 2 vilken föreligger i vattenhaltig lösning, underkastas följande behandlingssteg: 1) koncentrering av den vattenhaltiga lösningen genom upphettning under vakuum till 35-40°C 5 2) upphettning av lösningen under åtcrflöde 3) neutralisering av reaktionsblandningen 4) avskiljning av bildat 5'-deoxi-5'metyltio- adenosin genom kylning till 0-5°C.

Föreningen enligt uppfinningen med formeln (I) 10 kan dessutom omvandlas till syraadditionssalterna: klorid, sulfat, fosfat, formiat, acetat, citrat, tartrat, metansulfonat eller p-toluensulfonat.

För framställning av gruppen av föreningar med formeln: 15 NH2 / |\ \\ 20 CH2-S- R (la) 25 OHH i vilken R är en linjär eller förgrenad alkylgrupp med 30 l-18 kolatomer eller fenylalkylen, där alkylenkedjan har 1-6 kolatomer; R1 är H, en alifatisk acylgrupp med 1-6 kolatomer eller en aromatisk acylgrupp; R2 är H, en alifatisk acylgrupp med l-6 kolatomer 35 eller en aromatísk acylgrupp, eller alternativt bildar grupperna R2 tillsammans en isopropylidenkedja, och n är O eller l, 10 20 25 30 Lu' (_11 460 198 3 har Legraverand-metoden (Legraverand M. Ibanez S., et al. (1977) Eur. J. Med. Chem. 12, 105-108), där adenosin omvandlas till 5'-kloro-5'~deoxiadenosin genom reaktion med tionylklorid i hexametylfosforamid, använts. 5'-kloro-5'-deoxiadenosin omvandlas sedan till erforderliga tioetern genom reaktion med motsvarande merkaptan i en 2n natriumhydroxidlösning vid 80°C.

De erhållna tioetrarna renas genom omkristallísa- tion ur vatten eller ur lägre alifatiska alkoholer.

Föreningarna (Ia) kan sedan saltbildas med den stökiometriska mängden av den erfordrade syran.

Föreningar med den allmänna formeln NH-R1 1” nu) CH -S- R (lb) OR R i vilken R, Rl förutsatt att Rl och R och R2 är samma som ovan definierats, 2 är annat än väte eller en isopropylidenkedja, har framställts genom Satom och Makinometoden (Satom K, Makino K (1951) Nature 167, 238) genom att de motsvarande föreningarna med formeln (la) bringas att reagera med den erfordrade acylklo- riden i vattenfri pyridin. Produkterna omkristalliseras företrädesvis ur en 1:1-blandning av k1oroform/petroleum- Gtêl' . 460 198 4 Föreningar med formeln Hz-S-R (IC) 10 15 \C/ / \ CHB CHB 20 i vilken R och RI är samma som ovan definierats, fram- ställs genom att motsvarande föreningar med formeln NH2 25 u/ p ' \ \ o (u)n CH2-S-R 30 ORZORZ 35 där R2 är H, och R, RI och n har ovan definierad betydel- se, bríngas att reagera med aceton i närvaro av ZnC12, 10 15 20 25 30 460 198 5 återigen enligt Satom och Makino-metoden (till vilken ovan refererats). De erhållna produkterna renas före- trädesvis genom kristallisation ur en 1:1 blandning av kloroform/petroleumeter.

Föreningar med formeln NH-R1 N/ N li» 0 CH 2-š-R (id) N) och R är samma som ovan definicrats, 1 2 framställs genom oxidation av motsvarande tioetrar, i vilken R, R vilka erhållits genom de ovan angivna metoderna, medelst brom eller väteperoxid i vattenhaltig lösning (Green Stein J.P., Winitz M. (1961)-Chemistry of the amino acids - John Wiley & Sons Inc. 2146). De erhållna produkterna renas genom omkristallisation ur vatten.

Den enligt uppfinningen framställda föreningen 5'-deoxi-5'-metyltioadenosin (MTA) med formeln 460 198 10 15 20 25 30 35 (I) OH H är en fysiologisk förening, som redan förekommer i levande organismer.

Man har nu funnit ett sätt att framställa denna produkt, vilket är särskilt enkelt och ekonomiskt ur industriell synvinkel. Det nya förfarandet består väsentligen av att hydrolys av S-adcnosylmetionin (SAME) utföres under strängt reglerade kritiska be- tingelser, vilka leder till praktiskt taget total hydrolys och fullständig kristallisation av MTA. 10 15 20 25 30 35 460 198 NH2 // t” \\ š §H2 H20 ___---.___.í__) cflz I cflz CH2 CH coon CHB on H ,/ t” cflz-s-CH3 til» + + Ho-CHZ-cnz-cH~CooH + H on H Det reglerade hydrolysförfarandet kan tillämpas NH2 på SAME som framställts pà vilket som helst sätt.

Förfarandet för framställning av SAME-lösningen är även en pâvcrkande faktor vid utförandet av det nya förfarandet på ett ekonomiskt lämpligt sätt.

Följande arbetssteg ger den mest ekonomiska ut- föringsformen av förfarandet: 460 198 10 15 20 25 30 35 8 a) Normal brödjäst berikas med SAME genom behand- ling med metionin i enlighet med Schlenk-metoden (Schlenk F. (1965) Enzymologie 29, 283). b) Jästcellerna suspenderade i vatten underkas- tas lysis genom behandling med etyl- eller metylacetat vid omgivningstemperatur (DT-OS P23 3640l.4).

Genom reglering av pH-värdet till mellan 4 och 6 samt filtrering erhålles en vattenhaltig lösning, vilken innehåller praktiskt taget all SAME, som fanns i den ursprungliga jästen. c) Lösningen koncentreras under vakuum vid 35-40°C till ca 1/10 av dess begynnelsevolym. d) Koncentratet kokas under áterflöde i ca 30 min och pH-värdet justeras till 7 med soda. e) Lösningen får stå vid 0-5°C och utfällda MTA uppsamlas praktiskt taget fullständigt och vid god renhet.

Stegen c, d och e, vilka såsom angivits är kritiskt nödvändiga för erhållande av fullständig, selektiv hydrolys av SAME till MTA utan bildning av biproduk- ter, är nya.

Framställningen av produkten enligt föreliggande uppfinning beskrives nedan.

EXEMPEL Erëæëzëllninsuëyjkéeeëtâlæstyltieëêeaeëirilßlïêl ll liter etylacetat och ll liter vatten vid omgiv- ningstemperatur, sattes till 90 kg brödjäst, som hade berikats med SAME genom tillsättning av metionin tills SAME-halten var 6,88 g/kg.

Efter omsorgsfull omröring i 30 min justerades pH-värdet till 4,5 med utspädd HZSO4. Blandningen filtrcrades och återstoden tvättades med vatten för att go 140 liter av lösning med en SAME-halt av 4,40 g/litcr, vilket motsvarar 99,5 % av SAME som fanns i begynnclscmaterialet.

Det sålunda erhållna lysatet koncentrerades under vakuum (30 mm Hg; 35-40°C) till en volym av ca 14 \\v 10 15 20 25 MTA MTA 460 198 9 liter. Den koncentrerade lösningen kokades under åter- flöde vid normalt tryck i 30 min. Den kyldes till 20°C, pH-värdet justerades till 7 med 40 % soda och den lämnades över natten i en kylrumscell (+3°C).

En vit fällning bildades, vilken filtrerades, löstes i 10 liter kokande destillerat vatten och kristal- liserades genom kylning av denna lösning. _ 410 g av kristallint MTA av hög renhetsgrad erhölls, vilket motsvarar ett utbyte av 90 % med hänsyn till SAME som underkastades hydrolys.

Den erhållna produktens karaktäristika sammanfal- ler med dem för rent MTA som erhållits på annat sätt.

Såsom inledningsvis angavs har man funnit att föreningen med formeln I besitter stark antiinflamma- torisk aktivitet, àtföljd av analgetisk och antipyre- tisk verkan.

Den antiinflammatoriska aktiviteten visades inled- ningsvis för föreningen enligt uppfinningen ooh indome- tacin genom test av experimentellt ödem förorsakat av karragen i råttor, genom bestämning av procent skydd enligt Winter-metoden (J. Pharm. Exper. Therap. 141, 369 1963)- De erhållna värdena visas i Tabell 1. ggßßrr 1 % Skydd, be- räknat på ödemutveck- ling administrerad dos, mg/kg 37 50 (oralt) 23 50 (intramusku- lärt) lndometacin 9 50 (oralt) 460 198 10 15 20 25 30 35 10 Såsom framgår ur Tabell l är ED50 för MTA 37 mg/kg, vid oral administrering.

Vid samma test var ED50 för indometacin 9 mg/kg.

Vid dessa doser förekommer allvarliga gastriska lesioner, då däremot vid EDSO-dosernaMTAinte ger upphov till några sekundära effekter på gastro~intestinalsystemet. Det bör även noteras att LD för indometacin i råttor är 12 mg/kg (Martelli A. i Aspetti di farmacologia dell'- infiammazione, sid 73, publiserad av Tamburini-Milan 1973), då däremot LD50 för MTA i råttor är > 200 mg/kg vid oral administrering.

Följande terapeutiska index erhölls sålunda: Indometacin TI 1,3 MTA TI = > 54,05 Föreningen, vilken framställts med hjälp av för- farandet enligt uppfinningen underkastades även en serie farmakologiska test i avsikt att bekräfta dess antiinflammatoriska aktivitet och Visa dess analgetiska samt antipyretiska aktivitet.

De erhållna resultaten med MTA qes nedan.

Ur industriell framställningssynpunkt är förfarandet för framställning av MTA från SAMB, såsom upptäckts, det absolut enklaste och mest ekonomiska, och gör det möjligt att marknadsföra det till ett synnerligen lågt pris.

A - Antiinflammatorisk aktivetet.

Produkterna testades genom pleurit, som inducerats i råtta medelst karragen i enlighet med Velo-metoden (Velo G.P., DUNN C.J. et al. (1973) J. Path. lll, 149).

MTA vid en dos av 75 mg/kg gav genom oral administrering ett skydd av 42,4 %, beräknat på volymen av exudatet, och 48,8 %, beräknat på totala antalet celler som fanns i exudatet. .

Ett jämförbart skydd erhölls med l0 mg/kg indometa- cin, dvs vid en dos som var mycket närmare LD50.

W 10 15 20 25 30 35 460 198 11 B - Antiinflammatorisk aktivitet Vid granulomtestet hos råtta genom bomullspelletar (Winter C.A., Riseley E.A. et al (1963) J. Pharm. Exper.

Ther. 141, 369), som är signifikant för kronisk inflam- mation, gav MTA ett skydd av 30 % vid en oral dos av 9 mg/kg, med ett terapeutiskt index av 222.

C - Den analgetiska aktiviteten hos produkterna bestäm- des genom två test, vilka ansågs vara mycket signifi- kanta.

~ Vid test av mus på het platta enligt Roberts (Roberts E. Simonsen D.G. (1966) Biochem. Pharmac. 15, 1875) gav MTA ett skydd av 50 % vid en oral dos av 37 mg/kg. Ett ungefär ekvivalent skydd av 58 % erhölls med l00 mg/kg amidopyrin vid oral administrering.

- Vid sträckningstestet med fenylkinon (Siegmund E., Cadmus R., GO-LU (1957) Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 95, 729), gav MTA ett skydd av 51 % vid en oral dos av 37 mg/kg.

Vid samma test har MTA-sulfoxid en EDSO av 10 mg/kg vid intramuskulär administrering.

D - Antipyretisk aktivitet Denna mättes för dennya produkten medelst feber, som inducerats i råtta med öljäst (Winter C.V. et al (1961) J. Pharmacol. Exp. Thet. 133, ll7).

Den antipyretiska effekten som värderades l h efter oral administrering av MTA vid en dos av 300 mg/kg, gav en temperaturminskning av 4,59 % med hänsyn till kontrollerna, vilka endast behandlats med jäst. Denna procentsats motsvarande en temperatursänkning från 3a,s°c till 37,4°c.

Jämförelsevis gav amidopyrin, som administrerades oralt vid en dos av 200 mg/kg, en temperaturminskning av 4,69 %, och intramuskulär administrering av MTA vid en dos av 80 mg/kg gav en temperaturminskning av 2,35 %.

E - Aktivitet av antiaggregation av blodplättar.

Föreningen enligt uppfinningen värderades även med hänsyn till deras eventuella kapacitet avseende antiaggregation av blodplättar. 460 198 10 15 20 25 30 35 12 Det är känt att blodplättsaggregation är ett kom- plextfenomen, som kan uppdelas i ett primärt stadium beroende på den direkta verkan av en stimulus (exempel- vis adenosindifosfat, dvs ADP, eller epinefrin) och ett sekundärt stadium beroende på aggregationen, som inducerats av blodplättarnas frigöring av ADP. I detta hänseende, när blodplättarna kommer i kontakt med subendotelt kollagen, initierar kollagenet en hel serie reaktioner, vilka leder till blodplättarnas frigöring av ADP. Det är denna ADP som förorsakar den andra vågen av blodplättsaggregation. Följande test utfördes för att utvärdera de nya föreningarnas anti- aggregationseffekt: 1) "in vitro" test på blodplättsaggregation, inducerat av ADP samt kollagen, i närvaro av dennya produkten; 2) "in vitro“ test på blodplättsaggregation, inducerat av arakidonsyra (AA); 3) "in vivo" test pá blodplättsaggregation, inducerat av ADP och kollagen i personer som behandlats med -den nya produkten. v I detta fall erhölls återigen de mest signifikanta resultalten med MTA, varför de med användning av denna produkt erhållna resultaten ges som indikation på hela klassens beteende. l) "in vitro“ test Blod tappades utan stas,ochett antikoagulationsmedel (3,8 % natriumcitrat) tillsattes för att ge ett blodz- citrat-förhållande av 9:1. Plasma rikt på blodplättar och plasma fattigt på blodplättar erhölls genom centri- fugering vid omgivningstemperatur. Blodplättsaggrega- tion uppskattades med användning av metoden enligt Born & Cross (G.V.R. Born och M.J. Coss, J. Physiol., Lond. l68, 178, 1963) på plasmafraktionen som var rik på blodplättar- Aggregeríngsmedlen användes i följande koncen- trationer: adP (Sigma) 1 UM; kollagcn (Horn) S pg/ml; arakidonsyra 4x10_4M. i ß MJ' 10 15 20 25 30 35 460 198 13 Adenosin vid en koncentration av lxl0_5M användes som referenssubstans för antiaggregationsaktivitet.

MTA minskar starkt primär blodplättsaggregation beroende pà ADP och inhiberar som en följd härav den andra aggregationsvàgen.

Samma test utförda med kollagen gav negativa resultat. Dvs MTA uppvisade ingen inhiberande verkan gentemot blodplättsaggregation som inducerats av kol- lagen, vilket var värt att notera. 2) Effekterna av olika MTA-koncentrationer pà blodplättsaggregation som inducerats av AA vid en koncentration av 4xl0_4M testades. Den blodplättsag- gregationsinhíberande effekten av MTA är proportionell mot dess koncentration. MTA:s kapacitet att öka prosta- cyklinets (PGI2) inhiberande effekt vid aggregation inducerat av AA undersöktes även. När föreningarna användes i blandning uppstår en stark ökning av anti- aggregationsverkan vid koncentrationer som i sig själva är overksamma. 3) "in vivo" test.

Tre till synes friska försökspersoner 35, 42 resp 48 år gamla, vilka inte intagit något läkemedel under minst 15 dygn, underkastades aggregatíonstest före och efter intagning av de nya produkterna vid en dos av 100 mg var 8 h i 3 dygn, varefter dessa test utvärderades.

Blodprovet för bestämning av blodplättsaggregation togs 2 h före intagning av den sista dosen av produkten som testades.

MTA inhiberar starkt blodplättsaggregation som inducerats av ADP (1 uM) "in vivo".

Samma test upprepades med tillsättníng av 5 ng/ml kollagen till blodet visade att MTA inte är verksamt vid inhibering av blodplättsaggregation som inducerats av kollagen, utan förlänger endast fenomenets latens- tid. 460 198 10 15 20 25 30 w u1 14 Det faktum att MTA (och1påettmer eller mindre jäm- förbart sätt de andra produkterna i samma klass) starkt inhiberar blodplättsaggregation som inducerats av ADP, då däremot det praktiskt taget saknar effekt på aggre- gation som inducerats av kollagen, indikerar att MTA inhiberar den första aggregationsvågen, då den däremot har en negligêrbar direkt verkan på den andra aggrega- tionsvågen.

Dess användning i association med andra kända anti- aggregationsläkemedel, vilka i allmänhet är aktiva gentemot den andra vågen och endast i ringa grad verk- samma gentemot den första vågen, är därför särskilt intressant.

Den visade aktiviteten föreslår att användningen av MTA icke endast som ett blodplättsantiaggregations- läkemedel, utan även som ett antitrombotiskt och anti- aterosklerotiskt läkemedel, ty det förändrade förhål- landet mellan blodplättar och kärlväggar spelar även en primär roll vid aterosklerotisk sjukdom förutom att det är en bas för trombogenesmekanismerna.

F - Sömninducerande aktivitet Morris-testet användes (Morris R.W. (1966) Arch. int.

Pharmacodyn 161, nr 2, 380) Vid detta test ökade MTA med 87 % varaktigheten av sömn, som induceratsmedpentobarbital i en mus, vid en intramuskulär dos av 20 mg/kg.

G - Akut toxicitet Föreningarna enligt föreliggande uppfinning är praktiskt taget fria frånakuttoxicitet när de admini- streras oralt. De är praktiskt taget fria från toxicitet vid de terapeutiska doserna för alla administrerings- sätt.

Följande värden erhölls för MTA: > 2000 mg/kg 360 m9/k9 MTA - LDSO 1 mus oralt intravenöst 10 15 20 30 460 198 Adenosinderivaten med formeln (I) kan administreras utspädda med lämpliga farmakologiskt acceptabla tillsats- medel, i varje terapeutiskt användbar form, såsom oralt, parenteralt eller på venöst eller rektalt sätt. De kan även användas i produkter för utvändigt bruk genom topisk applikation.

Vissa exempel på typiska farmaceutiska kompositioner med MTA ges nedan i belysande syfte: - 100 mg kagslar MTA Mannitol Magnesiumstearat - 50 mg kagslar MTA Mannitol Magnesiumstearat - 100 mg tabletter MTA Stärkelse Magnesiumstearat Laktos - 50 mg tabletter MTA Stärkelse Magnesiumstearat Laktos 100,2 mg 195,0 mg 5,0 mg 300,2 mg 50,1 mg 100,0 mg 3,0 mg 153,1 mg 100,2 mg 100,0 mg 15,0 mg 85,0 mg 300,2 mg 50,1 mg 120,0 mg 15,0 mg 115,0 mg 300,1 mg 460 198 lO 15 20 25 30 35 16 - 100 mg suppositoria MTA 100,2 mg Suppositoriummassa l700,0 mg l800,2 mg - 50 mg suppositoria MTA ' 50,1 mg Suppositoriummassa l450,0 mg l500,l mg - 50 mg injektionsflaska MTA _ HCl (56,l5 mg huvud- sakligen ekvivalent) 50 mg Lidokain . HCl 25 mg Vatten upp till 3 ml - 25 mg injektionsflaska MTA . HCl (28,07 mg huvud- sakligen ekvivalent) 25 mg Lidokain . HCl 20 mg Vatten upp till 2 ml - l00 mg oral dos MTA . HCl (ll2,3 mg huvud- sakligen ekvivalent) 100 mg Citrussmaktillsats 0,025 mg Socker l g Antifermenteringsmedel 50 mg Vatten upp till 5 ml - 50 mg oral dos MTA . HCl (56,l5 mg huvud- sakligen ekvivalent) 50 mg Citrussmaktillsats 0,015 mg Socker 0,5 g Antifermenteringsmedel 30 mg Vatten upp till 5 ml hf 460 198 17 - 100 g salva MTA 5 g Bas för vattenlöslig salva, upp till 100 g Antioxidationsmedel 0 , l g.

Claims (1)

1. 460 198 l8 PATENTKRAV Förfarande för framställning av 5'-deoxi-5'-me- tyltioadenosin med formeln 5 10 15 OH H k ä n n e t e c k n a t därav att S-adenosyl-metio- nin med formeln NH2 20 1/ r” 2 \“fi NH I cnz-É-cflz-cnz-CH-C005 25 CH3 3 0 on H . vilken föreligger i vattenhalLig lösning, underkas- fas följande behandlingsstegz 460 198 19 l) koncentrering av den vattenhaltiga lösningen genom upphettning under vakuum till 35-40°C 2) upphettning av lösningen under àterflöde 3) neutralisering av reaktionsblandningen 5 4) avskiljning av bildat 5'-deoxi-5'mety1tio- adenosin genom kylning till 0-5°C. 10