SE442016B - Klorambucilderivat, antitumormedel samt forfarande for framstellning av klorambucilderivat - Google Patents

Description

79.06761-7 Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning är nya föreningar med formeln (I) 0 O g u / \ /czïzcfïzcí oqcnånoccnzcnzcnz N\ H3C “" cnzcnzcß (1) RO vari R betecknar O O 3 'HI 'g“<:> ; -ö-CH3 ,-ä-CZH5 eller - -C3H7, och n är l eller 2.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning kan fram- ställas genom att man binder klorambucil till hydroxvlgruppen i 17-ställning av östradiol eller dess derivat i närvaro av ett bindemedel bestående av föreningar med formeln X(CH ) COOH eller 2 n X(CH2)nCOX vari n är l eller 2 och X betecknar en halogenatom.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning är konjugat av klorambucil och östradiol eller dess derivat med ett binde- medel. Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning har speciell affinitet till cancerceller och en speciell effekt för selektivt angrepp av cancerceller.

De specifika cancercellerna har receptorer för steroidhormoner, speciellt östradiolderivat som komponent av klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning.

Receptorerna kan bli målen (targets) för klorambucilderivaten enligt uppfinningen. Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning angriper sålunda cancerceller med receptorer för östradiol och dess derivat.

Sådan cancer innefattar bröstcancer, prostatakarcinom, hepatoma, tyreoid (goiter) och endometritiskarcinom. Produkterna enligt föreliggande uppfinning är speciellt effektiva mot bröstcancer, endometritiskarcinom och prostatakarcinom.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning distribue- ras selektivt till cancercellerna i en organism och angriper cancercellerna utan sidoeffekter.

Ett speciellt kännetecken för föreliggande uppfinning är att östradiol eller dess derivat bindes till klorambucil utan för- lust av östradiolens eller dess derivats aktivitet och utan för~ lust av klorambucilens antitumöraktivitet.

Man föredrar att överföra OH-gruppen i 3-ställning av östradio- len till en acyloxigrunn såsom Q C? 9 š? n-t-(D -dt-crn ~o-c-C2Hs eller -oc-cgrn.

I I Acyloxigruppen överföres lätt till en OH~grupp i en organism i en kropp och binder receptorerna i cellerna.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning kan framstäl- las genom att man binder klorambucil till hydroxylgruppen i l7-ställningznröstradiol eller dess derivat i närvaro av ett bindemedel. 79Û6761'7 Bindemedlet skall inte förorsaka toxicitet genom bindningen.

Optimala bindemedel för bindning av östradiol eller dess derivat med klorambucil innefattar monobromacetylbromid, monokloracetyl- klorid, monoklorättiksyra, monobromättiksyra, etc.

Klorambucilen och östradiolen eller dess derivat kan bindas med bindemedlet enligt lämpliga förfaranden.

'Vid ett förfarande får exempelvis bindemedlet först reagera med östradiol eller en acylerad östradiol och därefter får den modifierade östradiolen eller dess acylerade derivat rea- gera med klorambucil. Enligt ett annat förfarande får binde- 'medlet först reagera med klorambucil och därefter får den modi- fierade klorambucilen reagera med östradiol eller en acylerad östradiol.

Vid det förstnämnda förfarandet får bindemedlet reagera med en icke aktiv position av östradiol eller en acylerad östradiol till bildning av en ester med formeln X(CH2)nCOOB vari B betecknar en del av östradiol eller acylerad östradiol utan OH-grupp i 17-ställning och X betecknar en halogenatom.

Därefter får halogenen av estern reagera med klorambucil för att ge klorambucilderivatet enligt föreliggande uppfinning.

Reaktionerna kommer att ytterligare åskådliggöras.

Bindemedlet, såsom monobromacetylbromid, reagerar med OH-gruppen i 17-ställningen av östradiolen eller den acylerade östradiolen med en acylgrupp i 3-ställning i ett lösningsmedel, såsom kol- tetraklorid, kloroform, tetrahydrofuran, dimet§lsulfoxid(DMSO), dimetylformamid(DMT), pyridin eller aceton. Reaktionsprodukten reagerar ytterligare med klorambucil i ett lösningsmedel såsom dimetylsulfoxid, dimetylformamid, pyridin, toluen, koltetra- klorid, kloroform, tetrahydrofuran(THF). Klorambucil kan användas ?906?6í-7 i form av en syra eller dess metallsalt såsom ett silversalt eller ett alxalimetallsalt.

Temperaturen för varje reaktion är i allmänhet från -3000 till 1oo°c, företrädesvis från -1o°c till so°c. neaktionstiaen är vanligtvis från 0,5 till 74 timmar. Reaktionsprodukten renas genom lämpliga reningsmetoder till framställning av klorambu- cilderivaten enligt föreliggande uppfinning.

Vid det senare förfarandet får bindemedlet reagera med karboxyl- gruppen i klorambucilen till framställning av en förening med formeln ACOO(CH2)nCOX vari A betecknar en del av klorambucil utan COOH-grupp i l-ställ- ning. Därefter får halogenatomen (X) i föreningen reagera med OH-gruppen i 17-ställning av östradiolen eller den acylerade östradiolen med en acylgrupp i 3-ställning till framställning av klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning.

Lösningsmedlen som användes vid dessa reaktioner är samma som de som användes för reaktionen av klorambucil eller östradiol eller acylerad östradiol.

Reaktionstemperaturen och reaktionstiden kan väljas inom samma områden.

OH-gruppen i 3-ställning av östradiolkomponenten i klorambucil- derivatet enligt föreliggande uppfinningkanacyleras före eller efter bindningen av klorambucil till östradiol i närvaro av ett bindemedel, även om acylering av östradiolen före bindningen föredrages.

Reaktionerna för de acylerade produkterna åskådliggöres ytter- ligare.

OH-gruppen i 3-ställning av östradiolen reagerar med alkali- ...m ...i u. _ f _ . 7906761-7 metallhydroxid i ett lösningsmedel såsom THF för att överföra Z den till en ONa-grupp eller OK-grupp, varefter reaktionspro- _dukten får ytterligare reagera med en acylklorid, såsom bensoyl- klorid, acetylklorid eller propionylklorid, till framställning av den acylerade östradiolen. Därefter får bindemedlet, såsom monobromacetylbromid, reagera med OH-gruppen i 17-ställning av den acylerade östradiolen i ett lösningsmedel, såsom DMSO, DMF, pyridin, aceton eller THF. Den modifierade acylerade östradiolen får därefter reagera med klorambucil i ett lösningsmedel, såsom DMSO, DMF, pyridin, toluen, koltetraklorid, kloroform eller THF.

Reaktionstemperaturen är vanligtvis från -30°C till lO0oC, företrädesvis -l0OC till 80°C. Reaktionstiden är vanligtvis från 0,5 till 74 timmar. Den erhållna produkten renas genom lämpliga lreningsmetoder för framställning av klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning.

Vissa förfaranden för framställning av klorambucilderivaten I enligt föreliggande uppfinning beskrives i vissa exempel som endast åskådliggör uppfinningen, och reaktionsbetingelserna kan _väljas enligt önskan. I Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning har formeln (I) som konjugat av klorambucil och östradiol eller acylerad östradiol. Detta bekräftas av IR-spektrum, UV-spektrum, NMR, TLC, mass-spektrum, elementaranalys och smältpunkt för produk- terna.

Enligt testen beträffande akut toxicitet, införandet av före- ningen i östrogen-sensitiva celler och antitumöreffekt har klor- ambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning en anmärknings- värt låg toxicitet och anmärkningsvärt hög bindningsförmåga till östrogen-sensitiva celler samt hög antitumöreffekt.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning är speciellt effektiva för att angripa cancervävnader och eeller med östradi- ol-sensitivitet och kan därför användas mot bröstcancer, prosta- takarcinom, hepatoma, tyreoid och endometritis-karcinom. Klor- ?9Ü6761~7 ambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning är även effektiva mot magsäckscancer, tarmcancer, laryngealcancer, esophagus-karci- nom, lungcancer, hudcancer och leukosarkom och har anmärknings- värt låg toxicitet i jämförelse med kända anticancerläkemedel eller antitumörläkemedel, såsom klorambucil i sig själv. Klor- ambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning har inte den speciella sexualfunktionen hos östradiol, även om de är östra- djoldcrivat. Orsaken härtill är inte he1L klargjord för närvarande.

Man antar att sådana effekter understödes av vissa okända mekanis- mer vid sidan av den medicinska effekten som baserar sig på det vanliga receptorbegreppet.

När klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning användes som terapeutisk medicin, kan läkemedelskompositioner för admini- stration framställas enligt konventionella metoder för kända antitumörläkemedel.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning kan beredas till önskad form för injektion, oral administration, supposito- rier eller pastor. När de beredes i fast form för oral administra- tion såsom tabletter, piller, granulat, pulver eller kapslar, är det möjligt att blanda ett bindemedel, ett utspädningsmedel, ett fyllnadsmedel, ett smörjmedel, en olja, ett ytaktivt medel eller ett desintegreringsmedel i beredningen. När de beredes i flytande form för oral administration, kan beredningen vara en vattensuspension, en oljesuspension, en lösning, en sirap eller en skakblandning. När de beredes i form av suppositorier, kan beredningen framställas med användning av hydrofoba eller hydro- fila baser ocn ett stabiliseringsmedel, ett desintegreringsmedel eller ett färgämne. När de beredes i form för injektion, kan en vattenlösning, ett solubiliseringsmedel, ett näríngsämno, ett stabiliseringsmedel eller ett ytaktivt medel tillsättas.

För att bibehålla eller förbättra den medicinska effekten kan en bas, en syra eller ett salt införlivas, om så önskas. Mängden av den aktiva beståndsdelen som ingår i kompositionen (preparatet) är i allmänhet från 0,001 till 90 viktprocent, företrädesvis 0,01-60 viktprocent. 906761-7 De beredda klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning kan administreras genom oral administration, perkutan adsorption, intramuskulär injektion, intraperitoneal injektion, subkutan injektion, intravenös injektion, intrarektal injektion eller lokal administration.

Dosen klorambucilderivat enligt föreliggande uppfinning är från ungefär 0,01 till 50 mg/kg/dag/vuxen vid oral administration och från ungefär 0,001 till 20 mg/kg/dag/vuxen vid intravenös injek- tion.

Klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning har följande karaktäristika. il) När cancer bildas i en vävnad med dess receptor, angriper produkten selektivt cancercellerna i vävnaden för att förstöra dessa. Produkten är sålunda effektiv i endast små doser. (2) Produkten har lägre bieffekter jämfört med de som uppkommer vid administration av klorambucil. Produkten kan sålunda admi- nistreras under en lång tidsperiod och följaktligen kan cancer- *cellerna förstöras helt. (3) Östradiolen eller den acylerade östradiolen som användes. som bärarkomponent för klorambucilderivatet har_en enkel struk- tursammansättning, och dess fysiologiska aktivitet är välkänd.

Sålunda kan produkten administreras utan några risker. (4) Strukturen och aktiviteten för antitumörkomponenten i klorambucilderivatet är tidigare kända. Produkten kan sålunda administreras utan några risker. (5) Cancercellernas receptor kan studeras. Den motsvarande steroidhormonen eller dess derivat kan utväljas som bärarkompo- nent för klorambucilderivatet.

Terapin för oliga slags cancer kan beaktas genom val av bärar- komponent. 7906751-7 (6) Klorambucilderivatet kan administreras i konventionell beredningsform, såsom genom oral administration, injektion eller suppositorier.

Produkterna enligt föreliggande uppfinning besitter utmärkta egenskaper som i hög grad bidrager till såväl människans som läkekonstens utveckling. Klorambucilderivaten enligt förelig- gande uppfinning kan även användas som stabiliseringsmedel för högpolymerer, speciellt polyolefiner.

Föreliggande uppfinning åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari temperaturen avser Celsiusgrader.

Exempel l.

Framstäiininq av s-nyarøxi-i, 3 , s (10) -östratrien-np -- [4- {p-,¿ï5:.s- (2-kloretyl)aminQ7fenyl}butyryloxiIacetat.

I) Framställning av 3-hydroxi-l,3,5(10)-östratrien-l7A-mono- bromaoetat. 1 10 g l,3,5(10)-östratrien-3,l7@-diol upplöstes i 400 ml vatten- fri tetrahydrofuran (THF), varefter 8,8 g pyridin tillsattes.

En lösning av 22,5 g monobromacetylbromid i 74 g koltetraklorid sattes droppvis till den erhållna lösningen vid ungefär -50 till -70. Blandningen fick stå över natten. Efter reaktionen avskildes den erhållna fällningen genom filtrering. Lösnings- medlet avdestillerades från filtratet. Återstoden upplöstes i eter och omkristalliserades ur eter och gav l,3,5(10)-östra- trien-3,l7ß-bis(monobromacetat). 2 g av produkten upplöstes i 900 ml metanol och lösningen kyldes till -50. En lösning av 0,24 g KZCO3 i 20 ml vatten sattes droppvis till den erhållna lösningen. Efter reaktion i 30 minuter tillsattes 1000 ml vatten och den erhållna fällningen separerades och torkades. Genom elemontaranalys och IR-spektrum bekräftades att produkten var 3-hydroxi-1,3,5(10)~östratrien~l¶ß-monobromacetat. .w f79Û6761~7 10 II) Framställning av 3-hydroxi-1,3,5(10)-östratrien-l75-[4{p- - bis(2-kloretyl)amino7fenyl¶butyryloxi]acetat (klorambu- cil-östradiolkonjugat). 200 mg silver [ß-fp-1Eis(2-kloretyl)aminq]fenyl}butyrat3(silver- salt av klorambucil) tillsattes i 10 ml DMSO till bildning av en vit kolloidal lösning.

Därefter tillsuLLcs l90,8 mg 3-hydroxí~l,3,5(l0)-östratrien- ~l7@-monobromacetat och blandningen omrördes vid rumstemperatur dunder 64 timmar i mörker. Fällningen övergick till en gulaktigt grön färg. En liten mängd aceton tillsattes och fällningen sepa- rerades genom filtrering genom G-4 filter. Fällningen ändrade färg från gulaktigt grönt till svartgrönt genom ljusbestrâl- ning. Filtratet var färglöst och transparent. DMSO avdestille- rades under reducerat tryck på vattenbad vid 800 och 100 ml vatten tillsattes för utfällning av vita kristaller.

Kristallerna bevarades i en timme för att avlägsna DMSO och _ avskildes genom G-4 filter samt tvättades noggrant med destil- lerat vatten och torkades under reducerat tryck i en exsickator.

Det orena utbytet var 330,5 mg. a. Rening av produkten. 330,5 mg orena kristaller upplöstes i ett blandat lösnings- medel av 50 volymdelar cyklohexan och l0 volymdelar etylacetat.

Lösningen fick sakta passera genom en kolonn fylld med 40 g silikagel och produkten separerades gradvis och gav 188,2 mg (utbyte: 62,86 %) ren produkt.

Resultaten av elementaranalys, smältpunkt och IR~spektrum för produkten var följande: Elementaranalys: C H N Cl Funnet (%) 66,0 7,0 2,3 ll,0 Beräknat (%) 66,22 6,98 2,27 11,52 smälupunkt: uaivsmäit vid 25°.

'N 7906'í61*7 ll VIR-spektrum (cm_l): 3420, 2920, 2840, 1750, 1740, 1612, 1582, 1516, 1450, 1380, 1350, 1280, 1250, 1210, 1175, 1142, 1070, 1000, 960, 917, 867, 810, 800, 740, 655.

Exemgel 2: _ Framställning av 3-bensoyloxi-l,3,5(l0)-östratrien-l¶6-f4-(p- , _ -¿Bis(2~klorety1)aminqffenyllbutyryloxilacetat. 10 g l,3,5(10)-östratrien-3,17?-diol upplöstes i 100 ml THF och 10 ml av en vattenlösning innehållande l,47 g NaOH tillsattes.

Blandningen omrördes vid rumstemperatur i 30 minuter. Därefter koncentrerades reaktionsblandninqen till torrhet under reduce- _rat tryck på vattenbad vid 800 för att avlägsna vattnet. Återstoden upplöstes i vattenfri THF och 50 ml etyleterlösning innehållande 5,5 g bensoylklorid tillsattes droppvis till den erhållna lösningen och reaktionen genomfördes vid rumstempera- tur i 16 timmar. Efter reaktionen avskildes den erhållna natri- umkloriden enligt konventionella metoder. Filtratet indunsta- des till torrhet under reducerat tryck. För att avlägsna icke reagerad bensoylklorid tillsattes 200 ml 0,1 N NaOH-vattenlös~ ning och blandningen omrördes vid rumstemperatur i 15 minuter.

De erhållna vita kristallerna separerades genom G~3 filter och tvättades noggrant med destillerat vatten samt torkades under reducerat tryck i en exsickator.

Produkten analyserades genom tunnskiktskromatografi på silika- gel med ett blandat framkallningslösningsmedel (etylacetat och cyklohexan i förhållandet 50:30, beräknat på volymen) och gav en huvudfläck med Rf: 0,34.

De orena kristallerna omkristalliserades ur utylacetat och man erhöll 8,6 g vita kristaller.

Med hjälp av smältpunkt, elementaranalys och IR-spektrum bekräf- tades att produkten var 170-hydroxi~l,3,5(l0)-östratrien-3-ben- soat. 7906761-7 12 7.0 g av den erhållna produkten upplöstes i THF och 2,0 g pyri- din tillsattes och blandningen kyldes till -50. _En lösning-innehållande 15,5 g 30 %ig monobromacetylbromid- .koltetraklorid i 50 ml THF sattes droppvis till den erhållna blandningen. Efter tillsatsen omrördes blandningen vid -50 i 2 timmar och därefter på isbad i 4 timmar och hölls i kylskåp i 16 timmar. Efter reaktionen avskildes den erhållna vita fäll- ningen genom G-4 filter och torkades under reducerat tryck på vattenbad vid 300, och 200 ml etyleter tillsattes och bland- ningen omrördes och gav 5,3 g vita kristaller.

Resultaten av elementaranalysen och smältpunkten var följande.

Elementaranalys: C H Br Funnet (%) 64,3 5,8 15,7 Beräknat (%) 64,23 5,78 15,8 smä1tpunkt= 145-146°.

.Produkten analyserades genom tunnskiktskromatografi på silika- gel med ett blandat framkallningslösningsmedel (etylacetat och cyklohexan i förhållandet 50:30, beräknat på volymen) och gav en enkel fläck med Rf= o,77. 0 1 IR-spektrumet fanns ingen absorption baserad på OH-gruppen och det bekräftades sålunda att produkten var 3-bensoyloXi~ -l,3,5(10)-östratrien-17g-monobromacetat.

IR-spektrum (cm_l): 2020, 1735, 1728, 1595, 1579, 1490, 1448, 1412, 1382, 1286, 1280, 1260, 1210, 1200, 1170, 1145, 1095, 1075, 1019, 1004, 897, 780, 700, 680. -w 7906761-'7 13 ^l82,3 mg 3-bensoyloxi-l,3,5(10)-östratrien-17?-mcnobromacetat och 148,5 mg 0,6 silver-4-[p¿Eis(2-kloretyl)aming7fenyl]butyrat sattes till 5 ml DMSO och reaktion fick ske vid rumstemperatur i 3 dagar i mörker. Efter reaktionen avskildes silverbromid- fällningen genom filtrering och 400 ml vatten sattes till fil- tratet. Den erhållna Vita fällningen separerades genom centri- fugalseparation. Fällningen upplöstes i 50 ml aceton och det olösliga materialet separerades genom filtrering genom G-4 fil- ter.

Filtratet indunstades till torrhet under reducerat tryck och gav 165 mg av en oljig produkt.

Produkten analyserades genom tunnskiktskromatografi på silika- gel med ett blandat framkallningslösningsmedel (etylacetat och _cyklohexan i förhållandet 10:50, beräknat på volymen) och gav en huvudfläck med Rf: 0,44.

Eftersom det icke reagerade materialet kvarblev, kromatoqrafe- rades reaktionsprodukten på silikagel med ett blandat lösnings- medel (etylacetat och cyklohexan i förhållandet 10:50, beräknat på volymen) och gav en renad produkt. Den renade produkten var en vit kristallin förening vid 200. Resultaten av elementar- analys och IR-spektrum för produkten var de följande. Det bekräftades att produkten var 3-bensoyloxi-1,3,5(l0)-östratrien- ;17É-(4-{p-[his(2-kloretyl)amingffenylšbutyryloxi]acetat.

Elementaranalys: C H N Cl Funnet (%) 68,5 6,60 1,99 9,79 Beräknat (%) 68,33 6,53 1,94 0,86 smä1Lpunkt= 110-111”.

IR-spektrum (cm_l): -- 2920, 2860, 1755, 1735, 1612, 1582, 1516, 1491, 1450, 1420, 1380, 1355, 1260, 1224, 1210, 1174, 1145, 1079, 1022, 1005, 960, 915, 890, 600, 740, 705. 7906761-7. 14 Exemgel 3. 1 Framställning av 3-propionyloxi-l,3,5(l0)~östratrien-l7ß-[4-§n- . -[bis(2-kloretyl)aminQ7fenyl}butyryloxi]acetat. K l0 g l,3,5(10)-östratrien-3,l7@-diol upplöstcsi.l00 ml THF och 10 ml av en vattenlösning innehållande 1,47 g NaOH i 10 ml vatten ltillsattes och blandningen omrördes vid rumstemperatur i 30 mi- -nuter. Reaktionsprodukten koncentrerades till torrhet under freducerat tryck på vattenbad vid 800 för att avlägsna vattnet. Återstoden upplöstes i vattenfri THF och en lösning innehållande 3,40 g propionylklorid i 50 ml vattenfri THF tillsattes dropp- vis och reaktionen genomfördes vid rumstemperatur i 16 timmar.

Efter reaktionen avskildes natriumkloridfällningen och filtratet indunstades till torrhet under reducerat tryck och återstoden omkristalliserades ur etanol och gav 9 g vita kristaller.

Det bekräftades genom elementaranalys och IR-spektrum att pro- dukten var l7@-hydroxi-l,3,5(10)-östratrien-3~propionat. 7,0 q av produkten upplöstes i 70 ml vattenfri THF och 3,0 g =pyridin tillsattes och blandningen kyldes til -50. En lösning innehållande 17,3 g 30 % monobromacetylbromid-koltetraklorid i 50 ml THF sattes droppvis till den erhållna blandningen. Efter tillsatsen hölls blandningen vid -50 under 2 timmar och därefter i kylskåp under 16 timmar för reaktion. Efter reaktionen avskil* des den erhållna fällningen genom filtrering. Filtratet indun- stades till torrhet under reducerat tryck på vattenbad vid 300, och därefter tillsattes 200 ml etyleter och blandningen omrör- des och gav 6,0 g vita kristaller. Filtratet koncentrerades ytterligare och gav 3,5 g vita kristaller. Kristallerna omkris- talliserades ur ett blandat lösningsmedel av eter och etanol.

Resultatet av elementaranalysen var följande.

,Elementaranalys: " c H Br Funnet (%) 61,5 6,5 17,9 seräknat (s) 61,43 6,45 17,78 ¿ l7906761~'7 15 Absorption baserad på OH-gruppen fanns inte i IR-spektrum och följaktligen bekräftades att produkten var 3-propionyloxi- -l,3,5(10)-östratrien-17?-monobromacetat_ 1,0 g av produkten och 0,91 g silver-4-ip-[his(2-k1orety1)amin97- fenyl}butyrat dispergerades och upplöstes i 50 mg DMSO och reak- ttionen skedde vid rumstemperatur under 3 dagar i mörker. Efter reaktionen avskildes silverbromidfällningen genom filtrering loch 4 l vatten tillsattes. Fällningen separerades genom centri- fugering och den vita fällningen upplöstes i 50 ml aceton och 'det olösliga materialet separerades genom filtrering genom G-4 filter. Filtratet indunstades till torrhet under reducerat tryck och gav 1,3 g av en oljig produkt.

Produkten kromatograferades på silikagel med ett blandat lös- ningsmedel av etylacetat och cyklohexan i förhållandet 10:50, beräknat på volymen, för att rena denna. Den renade produkten .var en viskös oljeprodukt vid 200.

Resultaten av elementaranalysen och IR-spektrum var följande.

Elementaranalys: C H N Cl Funnet (%) 67,1 7,0 2,1 11,0 Beräknat (%) 66,0 6,99 2,08 10,56 IR-spektrum (cm_l): 2916, 2840, 1750, 1740, 1610, 1512, 1488, 1441, 1415, 1379, 1068, 1004, 1361, 1270, 1210, 1200, 1170, 1140, 956, 931, 885, 817, 793, 735.

Det bekräftades att produkten var 3-propionyloxi-1,3,5(10)-östra- trien-170-[4-Åp-[his(2-kloretyl)aminqffenylšbutyryloxi]acetat. -w 7906761-7 _16 Exemgel 4.

Framställning av 3-acetoxi-l,3,5(10)-östratrien-l7ß-I4-{p-Zbis- -(2-kloretyl)aminQ]fenyl}butyryloxi]acetat. I -1.0 g 3-acetoxi-l,3,5(10)-östratrien-l7§-monobromacetat erhållet enligt förfarandet i exempel 2, och 0,9 g silver-4-{p-[bis(2- -kloretyl)aminq7fenyl}butyrat tillsattes i 50 ml DMSO och reaktionen genomfördes vid 250 under 3 dagar i mörker. Efter reaktionen avskildes silverbromidfällningen och 4 l vatten sat- tes till filtratet. Den erhållna vita fällningen separerades genom centrifugering. Fällningen upplöstes i 50 ml aceton. Det olösliga materialet avskildes genom G-4 filter och filtratet indunstades till torrhet under reducerat tryck och gav 1,2 g av en oljig produkt. Produkten kromatograferades på silikagel med ett blandat lösningsmedel av etylacetat och cyklohexan i förhållandet 10:50, beräknat på volymen. Den renade produkten var ett visköst oljigt material vid 200.

»Resultatet av elementaranalysen var följande: Élementaranalys: C H N Cl Funnet (%) 66,0 6,9 2,0_ 10,9 Beräknat (%) 65,64 6,84 2,13 10,79 I IR-spektrumet fanns ingen absorption baserad på OH-gruppen och följaktligen bekräftades att produkten var 3-acetoxi-l,3,5- 1(l0)-östratrien-l7ß-L4-{p-[bis(2-kloretyl)aminqffenylšbutyryl- oxi acetat. l ) IR-spektrum.(cm_ I 2915, 2840, l750, l740, 1610, l5l2, 1488, 1442, l4l5, 1378, 1360, 1270, 1210, l2ÛÛ, ll7Û, 1140, 1068, 1005, 956, S31, 885, 817, 793, 735. -v 7906761~7 l7 Exemgel 5. l g 3-acetoxi-l,3,5(10)-östratrien-l7ß-monobromacetat och 0,8 g natrium-4-{p-[his(2-kloretyl)aminq2fenyl}butyrat sattes till 50 ml THF för reaktion vid 600 i 24 timmar. Efter reaktionen avskildes fällningen genom filtrering och filtratet koncentre- rades och torkades. Produkten avskildes och renades genom en silikagelkolonn med ett blandat lösningsmedel av etylacetat och cyklohexan och gav 0,9 g av den renade produkten. Produkten var 3-acetoxi-1,3,s(10)-östratrien-lvp-{4-lp-¿Eis(2-kioretyi)am1nq7- -fenyl]butyryloxi§acetat_ ' Exemgel 6.

Framställning av 3-acetoxi-l,3,5(l0)-östratrien-ljâ-f4-{p-¿Éis- ' -(2-kloretyl)aminQ]fenyl}butyryloxi]acetat. 200 mg silver-4-(p-[his(2-kloretyl)aminQ]fenyl}butyrat (silver- salt av klorambucil) sattes till 10 ml DMSO till bildning av en vit kolloidal lösning. Därefter tillsattes 190,8 mg 3-hydroxi- -l,3,5(10)-östratrien-l7ß-monobromacetat till den kolloidala lösningen och blandningen omrördes vid rumstemperatur i 64 tim- mar i mörker. Efter 64 timmar hade fällningen blivit gulaktigt grön. En liten mängd aceton sattes till fällningen och fällningen separerades genom filtrering genom G-4 filter. Filtratet var färglöst och transparent DMSO avdestillerades på vattenbad vid _80O, varefter 100 ml vatten tillsattes för utfällning av vita kristaller. Blandningen fick stå i en timme och därefter av- destillerades DMSO. De vita kristallerna avskildes genom filtre- ring genom G-4 filter och tvättades därefter med destillerat vatten och torkades vid reducerat tryck i en exsickator. Det orena utbytet var 330,5 mg. 330,5 mg av den orena produkten upplöstes i ett blandat lösnings- medel av cyklohexan och etylacetat i förhållandet 00:10, beräknat på volymen. Lösningen fick sakta passera genom en kolonn fylld 'med 40 g silikagel, varvid produkten gradvis avskildes och 188,2 mg (utbyte 62,86 %) av en ren produkt erhölls.

Resultaten av elementaranalysen och smältpunkten för produkten var följande. ?9Û6761-7 18 'Elementaranalys: C H N Cl Funnet (%) 66,0 7,0 2,3 ll,0 Vßeräknat (%) 66,22 6,98 2,27 11,52 Smältpunkt: Halvsmält vid 250.

Det bekräftades att produkten var 3-hydroxi-l,3,5(l0)-östra- trien-17?-[4-{p-[bis(2-kloretyl)aming7fenyl}butyryloxi]acetat. 50 mg av produkten upplöstes i l ml vattenfri pyridin och l ml gättiksyraanhydrid tillsattes och blandningen fick reagera i kylskåp under 16 timmar. Efter reaktionen koncentrerades reak- tionsblandningen och torkades under reducerat tryck på_vatten- bad vid 300. Återstoden blandades med destillerat vatten och blandningen fick stå i en timme, varvid en oljig produkt utfäll- des som ett vitt koiioidait skum. Pyridin och ättiksyra avlägs- Knades med destillerat vatten och produkten tvättades med vatten för att bli neutral. Den oljiga produkten avskildes från vatten- lösningen och koncentrerades och torkades i en exsickator under 'reducerat tryck och gav 45 mg av en oljig produkt.

Produkten-analyserades genom tunnskiktskromatografi på silika- gel med ett blandat framkallningslösningsmedel av etylacetat och cyklohexan i förhållandet 30:50, beräknat på volymen, och gav en enkel fläCk med Rf: 0,78.

.Produkten kromatograferades på silikagel med ett blandat lös- ningsmedel av etylacetat och cyklohexan i förhållandet l0:50, beräknat på volymen, för att rena produkten. Den renade produk- ten var en viskös oljig förening vid 200.

:Resultatet av elementaranalysen var följande. _Elementaranalys: -~ D c H N cl Funnet (%) 66,0 6,5 2,0 10,9 Beräknat (%) 065,64 6,84 i2,13 10,79 7906761~7 19 -I IR-spektrumet fanns ingen absorption baserad på OH-gruppen och följaktligen bekräftades att produkten var 3-acetoxi-l,3,5- -(10)-östratrien-l7§-[4-{p-/bis(2-kloretyl)amino/fenyl}butyryl- oxi]acetat.

IR-spektrum (cm_l): 2915, 2840, 1750, 1740, 1610, 1512, 1488, l442, 1415, 1378, 1360, 1270, 1210, 1200, 1170, 1140, 1068, 1005, 956, 931, 885, 817, 793, 735.

Exempel 7.

KFramställning av 3-propionyloxi-l,3,5(l0)-östratrien-l7B-fÄ-{p- -¿bis(2-kloretyl)aminQ7fenyl}butyryloxiJacetat. so mg 3-hydroxi-1,3,5(1o>-östratrien-17p-[4-{p-/bis(2-k10rety1)- amino/fenyl}butyryloxi]acetat upplöstes i l ml vattenfri pyridin och 1,5 ml propionsyraanhydrid tillsattes och blandningen hölls i kylskåp i en dag. Reaktionsblandningen indunstades till torr- het under reducerat tryck på vattenbad vid 300. Återstoden blan- dades med destillerat vatten och blandningen fick stå i 2 timmar till bildning av en kolloidal oljig produkt. Pyridin och ättik- syra avlägsnades med destillerat vatten och produkten tvättades med vatten för att bli neutral. Vattenfasen avskildes och olje- fasen torkades under reducerat tryck i en exsickator och gav 40 mg av en oljig produkt.

Produkten kromatograferades på silikagel med ett blandat lös- ningsmedel av etylacetat och cyklohexan i förhållandet 10:50, beräknat på volymen, för att rena denna. Den renadc produkten var en viskös oljig förening. I IR-spektrum fanns inte absorp- tion vid 3600-3200 cm*l. Resultatet bekräftade att produkten var 3-propionyloxi-l,3,5(10)~östratrien-l7ß-[4-(p-[bis(2-klor- etyl)aming7fenyl}butyryloxiJacetat.

Exempel 8. '* Framställning av 3-bensoyloxi-l,3,5(10)-östratrien-l7B-Y4-Åp- \ -Åbis(2-kloretyl)aminQ]fenyl}butyryloxi1acetat. 50 mg 3-hydroxi-l,3,5(l0)-östratrien-l7p-L4-íp-[bis(2-klorctyl)- aminq/fenyl}butyryloxi]acetat upplöstes i l ml vattenfri pyridin 7906761 -7l 20 och 2 g bensoesyraanhydrid tillsattes och blandningen fick stå i kylskåp i en dag. Reaktionsblandningen indunstades till torrhet under reducerat tryck på vattenbad vid 300. Återstoden blandades med destillerat vatten och blandningen fick stå i 1,5 timmar, varvid en kolloidal oljig produkt bildades. Pyridin och ättiksyra avlägsnades med destillerat vatten och produkten tvättades med vatten för att bli neutral. Vattenfasen separera~ _ des och oljefasen indunstades till torrhet under reducerat tryck i en exsickator och gav 45 mg av en oljig produkt.

Produkten kromatograferades på silikagel med ett blandat lös- ningsmedel av etylacetat och cyklohexan i förhållandet 10:50, beräknat på volymen, för att rena produkten_ Den renade pro- dukten var en viskös oljig förening.

I IRfspektrum fanns inte absorptionsbandet vid 3600-3200 cm_l.

Det bekräftades därigenom att produkten var 3-bensoyloxi-l,3,5- (io)-östratrien-17§-[g-(P-¿Bis(2-kioretyi)aminqjfenylfibutyryi- l oxi] acetat.

Test l.

Akut toxicitet och antitumöraktivitet (in vivo) för klorambu- cilderivaten enligt föreliggande uppfinning. :(1) Akut toxicitet (LD50¿ Vid mätning av LDSO användes åtta ICR-JCL möss av honkön (5 veckor gamla) som en grupp och uppföddes i en transparent polybur. Varje läkemedel upplöstes i olivolja och administre- rades till mössen i. en dos genom intraperitoneal injektion (i.p.), oral administration (p.c.) och subkutan injektion (s.c.), varefter LD50 bestämdes enligt Litchfield-Wilcoxon *diagram-metoden efter 7 dagar. Resultaten var följande: LD50 för klorambucil var i.p. 20 mg/kg, p.o. 80 mg/kg och s.c. 26 mg/kg.-LD50 för prov nr 2 i tabell l enligt uppfin- lningen var i.p. större än3000 mg/kg, p.o. större än 6000 mg/kg och s.c. större än 3000 mg/kg. 7906761~7 21 (2) Antitumörtest (in vivo) En bit mänsklig vävnad med bröstcancerceller med steroidhormon- receptor implanterades subkutant under frambenen på möss (BALB/C-nu/nu, 5 veckor gamla) till bildning av fasta tumörer.

Tjugofyra timmar efter implantationen administrerades varje olivoljedispersion eller lösning av den aktiva beståndsdelen subkutant eller oralt 10 gånger varannan dag. Tjugofem dagar efter implantationen skars tumörerna bort. Effektiviteten med avseende på tumörinhiberingen mättes genom (A) medelvikten för bortskurna tumörer för tio möss (till vilka den aktiva beståndsdelen hade administrerats) och (B) medelvikten för bort- rskurna tumörer för tio kontrollmöss.

Effektivitet för inhibering _ (1 _ _ê_) av tumör (=) _ B Både vid subkutan och oral administration av klorambucil vid en dos av 15 mg/kg var inhiberingseffektiviteten ungefär 50 till 70 %, under det att vid administration av kloranbucilderi- vaten enligt föreliggande uppfinning inhiberingseffektiviteten var mer än 90 %. När klorambucilderivaten enligt uppfinningen administrerades överlevde alla möss.

Vid autopsiobservation iakttogs allvarliga förändringar av mjälte, uterus och tymus efter administration av klorambucil, under det att inga förändringar kunde iakttagas efter admini- _stration av prov enligt föreliggande uppfinning. 7906761-v 22 vooom voäm ¶ v33 å. EofimfimÉfisflïwxmwfiïflxwfiww vooâ vošë vmoå om :Hofimupmdïïnfifiwvfifiwwv flmmmwvh w m m fi n: >oum mmmm jflflmm 7906761~7 23 \.||l..||l|||||Lv.| H uyw O OO NO OO OO OO OO HH Om HJO Oxw lmwcfluvnwn2H OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\> OH\O x Ho>w|wmn>mwmwwm OH OH O O OH O OH O OH O HmmwmaO.mmm floflumuwwflflflëwm _ ømpøxnsm o Oo ma mo Hm æm Nm oß mm Hwv uxwmwm |mmcfiHwnflsQH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\OH OH\O OH\O x po>xmOms>wHHw>m OH OHO OH OH OH OH OH OH OH HmH\msO mom m H O! Pi nofiumuumflcflëwm flmno flmwflußšduflwflå us >OHm # Hwmwmuwsøpflpcm.

N HHwnmw 7906761-7 24 Anmärkning: Prov nr l: klorambucil Prov nr 2: 3-bensoyloxi-l,3,5(l0)-östratrien-l7ß-íÃ-{p-¿Eis- f -(2-kloretylaminq7fenyl}butyryloxi]acetat Prov nr 3: 3-acetoxi-l,3,5(l0)-östratrien-l7ß-[4-{p-¿Bis(2- -kloretyl)aminq7fenyl}butyryloxi]acetat Prov nr 4: 3-propionyloxi-l,3,5(lO)-östratrien-l7ß-{Ä-{p-¿Bis- -(2-kloretyl)aminqffenylšbutyryloxijacetat Prov nr 5: olivolja (kontroll) Test 2.

Detta test skedde enligt test 1, förutom att de aktiva bestånds- delarna adninistrerades i form av en dispersion dispergerad i Polysolvate 80 (emulgermedel) genom intraperitoneal injektion för test av antitumöreffekten._Resultaten var följande- 3-hydroxi-l,3,5(lO)- _ -ösrratrien-124-[4-{p-[bis Klorambucil (2-kloretyl)aminq7fenyl}- butyryloxijacetat Dos (mg/kg) 5 0.5 5 Inhiberings- - effekt (%) 30 97 A: t t i 't t - .f ti; es a 20 I Test 3.

Bindningsfunktion av 3-hydroxi-l,3,5(10)-östratrien-l7ß-[4-{p- -[B15(2-kloretyl)aminQ7fenyl}butyryloxi]acetat till östrogen- sensitiva celler. íöstradiol märkt med tritium (3H) inkuberades på_kaninuterus för att bindadenna och därefter tillsattes prov till systemet för att mäta mängden fri 3H-östradiol som ersatts genom den till- satta östradiolen. Resultaten visas i figur l. Man fann att fri ïflf-östradiol ökades på samma sätt som östraaiol sjalv. 7906761-7 25 Detta visar att provet har en bindande funktion till östrogen- receptorer.

Testprotokoll Ett av klorambucilderivaten enligt föreliggande uppfinning (nedan benämnt föreliggande förening) jämfördes med de två föreningarna enligt det anförda amerikanska patentet nr 4 029 778 beträffande bindningsförmågan till cancerceller.

Föreliggande föreningvar 3-bensoyloxi-l,3,5(l0)-östratrien- -l7ß-[Ä-fp-Åbis(2-kloretyl)aminq7fenyl}butyryloxiÄacetat märkt med H i syragruppen. En föreningvarkortison-21,4'-[p-ÄÜ-bis- (ß-kloretyl)aminq7fenyl]butyrat (exempel l0 i US 4 029 778) märkt med 3H i syradelen och den andra föreningen var klorambu- 3H. I var och en av de tre grupperna av C 3H/He- cil märkt med möss transplanterades femte veckan efter födseln l x 106 cancer- celler (MMl02) vid fossa axillaris, och 14 dagar efter trans- plantationen administrerades oralt en av testkemikalierna som lösning i olivolja till var och en av mössen i respektive grupp 5 i en dos av 0,153 x 10- mol/kg (motsvarande 40 mikro-Ci radio- aktivitet). 10 timmar efter administrationen avlivades mössen och uterus avlägsnades. Resekterad uterus torkades, vägdes och brändes i en provoxidationsanordning och avgaserna absorberades i mono- fas-40 för beräkning av radioaktiviteten med en scintillations~ räknare. Mängden av varje testkemikalie bunden till uterusväv- naden beräknades genom radioaktiviteten och vikten av torkad uterus och framgår av följande tabell som bindningsförmågan med en enhet av 10-13 M/mg-vävnad. 7906761-7 26 Tabell: Bindningsförmåqa till uterin vävnad -l3 Enhet: l0 M/mg-vävnad Testkemikalieförening Bindningsförmåga Föreliggande förening 8 Förening_i ex. 10 i hänvisningen 0,1 Klorambucil 0,5 Såsom framgår av tabellen, är förmågan hos föreliggande före- ning att bindas till vävnad hos cancerbärande djur överlägsen den hos föreningen enligt hänvisningen.

Komgosition: Beredning l: Aktiv beståndsdel enligt exempel 3 50 viktdelar Mannitol g 35 " Sorbitol 25 " Karboximetylcellulosa 5 " Magnesiumstearat 5 “ Talk 40 " Komponenterna blandades och pulveriserades och preesades till en tablett med en diameter av 10 mm.

Beredning 2: Aktiv beståndsdel enligt exempel 2 100 viktdelar Laktøs 500 " Sockerfettsyraester 10 " Stärkelse l00_ " Vatten (l % natriumkarboximetyl- cellulosa) 100 " Komponenterna knådades och strängsprutades genom en pelleterings- till bildning av granuler och torkades och siktades därefter för att få en partikelstorlek av l0 till 24 mesh för framställning av granuler för oral administration. 7906761 -7 27 Beredning 3: Granulerna enligt beredning 2 fylldes i kommersiellt tillgäng- liga kapslar för framställning av 0,5 cm3 kapslar.

Beredning 4: , Aktiv beståndsdel enligt exempel l 5 viktdelar Olivolja 95 " Komponenterna upphettades och blandades samt steriliserades för framställning av ett injektionspreparat.

Claims (11)

7905761-7 28 PATENTKRAV

1. l. Klorambucilderivat med formeln (I) Q Q ' ,CH2CH2Cl ' 'fl H C QC(CH2)n0CCH2CH2CH2~4m__}~ _34 , \__ / \- .f *\ g g CHZCHZCI f z Ro” o Q 0 0 if czg |; Ü R vari R betecknar -H, -Cäí /3. -C-CH3, 'C'C2H5 'eller 'C'C3H7' och n är l eller 2.

2. Antitumörmedel, bestående av klorambucilderivat med formeln (I) Q ' /CH2CH2Cl H 'z /- \ -' n, i I, \\ I H3C CIJC (CH2)nOCCH2CH2CH2 , il)- ./ \'\ A 5 . CHZCHZCI 0 O 0 0 vari R betecknar -H, -C1\ /3, -C-CH3» 'C'C2H5 'eller “C'C3H7' och n är l eller 2.

3. Antitumörmedel enligt patentkravet 2, bestående av 3-hydroxi- eller 3-acyloxi-l,3,5(l0)-östratrien-l@ß~|4-íp/bis-_ (2-kloretyl)amino/fenyljbutyryloxilacetat.

4. Antitumörmedel enligt petentkravet 2, bestående av 3-bensoyloxi-l,3,5(l0)-östratrien-17/%|4-fp-/bis(2-k1oretyl)- emino/fenyl}butyryloxilacetat. 79Û6761~7 29

5. Antitumörmedel enligt patentkravet 2, bestående av 3~acetoxi-1,3,5(10)-östratrien-lZß-I4-fp-/bls(2-kloretyl) amino/fenyl}butyryloxilacetat.

6. Antitumörmedel enligt patentkravet 2, bestående av 3~propionyloxi-l,3,5(lO)föstratrien-lzß~|4~{p-/bis(2-klor- etyl)amino/fenylšbutyryloxilacetat.

7. Förfarande för framställning av klorambucilderivat med formeln (I) Q 9 ~ /cuzcnzcl olclæn ) oëcn cs CH *B- f' H30 | 2 n 2 2 2 »"\ K, - / gf .e g *H cnzcnzcl Ro ” \ Û 9 Q ° ° L fIF\ :I Ü ß vari R betecknar -H. -C«\ ¿) -C*CH3, -C-C2H5 -eller -C-C3H7, och n är 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att klorambucil och hydroxylgruppen i 17-ställningen av östradiol eller acylerad östradiol bindes i närvaro av ett bindemedel bestående av föreningar med formeln X(CH2)nCOOH eller X(CH2)nCOX vari n är l eller 2 och X betecknar en halogenatom.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k - n a t därav, att bindemedlet först får reagera med hydroxyl- gruppen i l7-ställningen av östradio] eller acylerad östradíol i ett lösningsmedel och att den modifierade östradiolen eller acylerade östradiolen därefter får reagera med karboxylgruppen 790_6761-7 30 i klorambucil i ett lösningsmedel.

9. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k ~ n a t därav, att bindemedlet först får reagera med karboxyl- gruppen i klorambucil i ett lösningsmedel och att den modifie- rade klorambucilen därefter får reagera med hydroxylgruppen i l7-ställningen av östradiol eller acylerad östradiol i ett lös- ningsmedel.

10. Förfarande enligt patentkravet ?, k ä n n e t e c k ~ n a t därav, att ett klorambucilderivat med formeln (I), vari R betecknar en hydroxylgrupp, acyleras med bensoylhalogenid, acetylhalogenid, propionylhalogenid, butyrylhalogenid, bensoe- syraanhydrid, ättiksyraanhydrid, propionsyraanhydrid eller smörsyraanhydrid i ett lösningsmedel.

11. ll. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k - n a t därav, att klorambucil överföres i ett silversalt eller alkalimetallsalt av klorambucil och att den därefter får reagera med bindemedlet eller den modifierade östradiolen eller acylerade östradiolen i ett lösningsmedel.