DK147145B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af chlorambucilderivater - Google Patents

Description

i 147145

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte chlorambucilderivater med den i krav 1's indledning angivne almene formel, hvori R har den der angivne betydning.

5 Som det er velkendt, påvirker de fleste antitumormidler ikke blot cancerceller, men også normale celler og har følgelig alvorlige bivirkninger. De er derfor vanskelige at administrere igennem længere tid med henblik på en fuldstændig ødelæggelse af cancercellerne.

Fra DK pat.ans.nr. 252/77 og nr. 719/77 kendes således chlor-10 ambucilderivater med formlen 17a-[4-(4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino)-phenyl)-butanoyloxyacetoxy]pregn-4-ene-3,20-dion, 17a-[4-(4-(N,N-bis-(2-chlorethyl)amino)phenyl)-butanoyloxyacetoxy]-6a-methylpregn-4-ene-3,20-dion henholdsvis 17-acetoxy-3-[4-(4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino)-phenyl)-butanoyloxy]-pregn-3,5-dien-20-on med anticancerogen virk-15 ning, men disse kendte chlorambucilers toksiske virkning er imidlertid så stor, at det er umuligt at opnå en effektiv kurativ virkning, d.v.s.

100% destruktion af cancerceller uden samtidig drab af værtsorganismen.

Dette er imidlertid muligt med chlorambucilforbindelserne fremstillet ifølge nærværende opfindelse takket være en kombination af mindre 20 toksicitet og større anticancerogen virkning for samme daglige dosisstørrelse, jvf. efterfølgende sammenlignende afprøvning af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen og de fra ovennævnte DK patentansøgninger kendte forbindelser.

Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge opfindelsen har den i 25 indledningen angivne almene formel (I), hvori R har den dér angivne betydning, og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne.

Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse har særlig affinitet til cancerceller og har en særlig virkning ved ' 30 selektivt at angribe cancerceller.

De specifikke cancerceller har receptorer for steroidhormoner, navnlig østradiolderivater som komponenten i chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

Receptorerne kan være målet for chlorambucilderivaterne fremstillet 35 ifølge den foreliggende opfindelse. Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse angriber følgeligt cancerceller, der har receptorer for østradiol og dets derivater.

Disse cancerformer omfatter brystcancer, prostatacarcinoma, hepa-toma, struma- og endometriumcarcinoma. Produkterne fremstillet ifølge 2 147145 den foreliggende opfindelse er særligt effektive overfor brystcancer, endometriumcarcinoma og prostatacarcinoma.

Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse spredes selektivt til en organismes cancerceller og angriber cancer-5 cellerne uden bivirkning.

Det særlige ved forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er, at østradiol eller dets derivat bindes til chlorambucil uden tab af aktive steder pi østradiolet eller dets derivat og uden tab af aktive antitumorsteder pi chlorambucilet.

10 Det foretrækkes at omdanne OH-gruppen i 3-stil lingen pi østradiol til en acyloxy-gruppe, sisom:

OOOO

I™ II II II

-°-c-(J> , -o-c-ch3, -o-c-c2h5 og -o-c-c3h7 15

Acyloxygruppen omdannes let til en OH-gruppe i en organisme af et legeme til binding af receptorerne i cellerne.

Chlorambucilderivaterne fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse ved at binde chlorambucil til hydroxylgruppen i 17-stillingen af 20 østradiol eller dets derivat med en halogen-alkansyre eller et halogenid deraf.

De optimale midler til binding af østradiol eller dets derivat med chlorambucil omfatter monobromacetylbromid, monochloracetylchlorid, monochloreddikesyre og monobromeddikesyre.

25 Chlorambucilet og østradiolet eller dets derivat omsættes med halogen-al kansyren eller halogenidet deraf ved de i kravet angivne fremgangsmåder.

Ved en fremgangsmåde omsættes halogen-al kansyren eller halogenidet deraf f.eks. først med østradiol eller acyleret østradiol, og derpå 30 omsættes det modificerede østradiol eller dets acylerede derivat med chlorambucil. Ved en anden fremgangsmåde omsættes halogen-al kansyren eller halogenidet deraf først med chlorambucil, og derpå omsættes det modificerede chlorambucil med østradiol eller acyleret østradiol.

Ved den første fremgangsmåde reagerer halogen-alkansyren eller 35 halogenidet deraf med en ikke-aktiv position af østradiol eller acyleret østradiol til opnåelse af en ester med formlen:

X(CH2)nCOOB

hvor B betegner en østradiol- eller acyleret østradiol rest, fra hvilken OH-gruppen i 17-stillingen er fjernet, og X betegner et halogenatom.

3 147145

Derpå reagerer esterens halogen med chlorambucil til frembringelse af chlorambucilderivatet.

Reaktionerne vil blive yderligere belyst i det følgende.

Halogen-al kansyren eller halogenidet deraf, såsom monob romacetyl -bromid, reagerer med OH-gruppen i 17-stillingen af østradiol eller acyleret østradiol, der har en acylgruppe i 3-stillingen, i et opløsningsmiddel, såsom carbontetrachlorid, chloroform, tetrahyd rof uran, dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylformamid (DMF), pyridin og acetone. Reaktionsproduktet reagerer yderligere med chlorambucil i et opløsningsmiddel, såsom dimethylsulfoxid, dimethylformamid, pyridin, toluen, carbontetrachlorid, chloroform, tetrahyd rof uran (THF). Chlorambucil kan anvendes i form af en syre eller dennes metalsalt, såsom sølvsalt og alkalimetalsalt.

Temperaturen for hver reaktion ligger sædvanligvis mellem -30°C og 100°C, fortrinsvis mellem -10°C og 80°C. Reaktionstiden ligger sædvanligvis mellem fra 0,5 til 74 timer. Reaktionsproduktet renses ved passende rensningsmetoder til opnåelse af chlorambucilderivaterne ifølge denforeliggende opfindelse.

Ved den anden fremgangsmåde reagerer halogen-al kansyren eller halogenidet deraf med carboxylgruppen i chlorambucil til opnåelse af en forbindelse med formlen:

ACOO(CH2)nCOX

hvor A betegner en chlorambucilrest, fra hvilken COOH-gruppen i 1-stillingen er fjernet. Derpå reagerer forbindelsens halogen (X) med OH-gruppen i 17-stillingen af østradiol eller acyleret østradiol, der har en acylgruppe i 3-stillingen, til frembringelse af chlorambucilderi-vaterne.

De ved disse reaktioner benyttede opløsningsmidler er respektivt de samme som dem for reaktionen af chlorambucil eller østradiol eller acyleret østradiol.

Reaktionstemperaturen og reaktionstiden kan vælges inden for de samme områder.

OH-gruppen i 3-stillingen af østradiol komponenten i chlorambucilderivatet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse kan være acyleret inden eller kan acyleres efter binding af chlorambucilet til østradiolen med halogen-alkansyren eller et halogenid deraf, men det foretrækkes at benytte en inden bindingen præacyleret østradiol komponent.

Fremstillingen af den præacylerede østradiol komponent, der dog ikke er en del af nærværende opfindelse, kan udføres ved at OH-gruppen i 3-stillingen af østradiol omsættes med alkalimetahydroxid i et opløs- 4 147145 ningsmiddel, såsom THF, til omdannelse af den til en NaO-gruppe eller KO-gruppe, og derpå omsættes reaktionsproduktet yderligere med et acylchlorid, såsom benzoylchlorid, acetylchlorid og propionylchlorid, til opnåelse af den acylerede østradiol.

5 Temperaturen for hver enkelt reaktion ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen ligger sædvanligvis i området fra -30°C til 100°C, fortrinsvis -10°C til 80°C. Reaktionstiden ligger sædvanligvis i området fra 0,5 til 74 timer. Det resulterende produkt renses ved sædvanlige rensningsmetoder til opnåelse af chlorambuciIderivaterne fremstillet ifølge 10 den foreliggende opfindelse.

Nogle fremgangsmåder ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af chlorambucilderivaterne vil blive belyst ved nogle eksempler, hvor reaktionsbetingelserne vælges på passende måde.

Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfin-15 delse har som konjugater af chlorambucil og østradiol eller acyleret østradiol formlen (I). Denne kendsgerning blev bekræftet ved IR-spektra, UV-spektra, NMR, TLC, massespektra, grundstofanalyse og smeltepunktsbestemmelse på produkterne.

Ifølge undersøgelser af akut toxicitet, indføring af forbindelsen i 20 østrogensensitive celler og antitumorvirkning har chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse bemærkelsesværdig lav toxicitet og bemærkelsesværdig høj bindingsevne til østrogensensitive celler og stor antitumorvirkning.

Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfin-25 delse er særligt effektive til ødelæggelse af cancervæv og -celler, der er østradiolsensitive, og de kan følgelig anvendes til brystcancer, pro-statacarcinoma, hepatoma, struma- og endometriumcarcinoma. Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er også virkningsfulde ved mavecancer, rectal cancer, laryngial cancer, øsopha-30 guscarcinoma, lungecancer, hudcancer og leukosarcoma, og de har bemærkelsesværdig lav toxicitet i sammenligning med kendte anticancer-midler eller antitumormidler, såsom chlorambucil alene. Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse har ikke østra-diols specifikke seksuelle funktion, selv om de er østradiolderivater.

35 Grunden hertil kendes ikke på nuværende tidspunkt. Det antages, at disse virkninger understøttes af visse ukendte mekanismer ved siden af den medicinske virkning, der er baseret på det sædvanlige receptorbegreb.

5 147145 Når chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse anvendes som terapeutisk medicin, kan lægemiddelsammensætninger til indgivelse fremstilles ved de for kendte antitumormidler sædvanlige metoder.

5 Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfin delse kan formuleres i ønskelige former til injektion, oral indgivelse, suppositorier eller pasta. Når de formuleres til faste former til oral indgivelse, såsom tabletter, piller, granula, pulvere og kapsler, er det muligt at tilblande et bindemiddel, et fortyndingsmiddel, et fyldstof, et 10 smøremiddel, en olie, et overfladeaktivt middel eller en disintegrator i formulationen. Når de formuleres til flydende former til oral indgivelse, kan formulationen være en vandig suspension, en olieagtig suspension, en opløsning, en sirup eller en rystemikstur. Når de formuleres til suppositorieformen, kan formulationen fremstilles under anvendelse af en 15 hydrofob eller hydrofil basis og en stabilisator, en disintegrator eller et farvningsmiddel. Når de formuleres til injektionsformen, kan der tilsættes en vandig opløsning, et opløsningsmiddel, et næringsmiddel, en stabilisator og et overfladeaktivt middel. Til at opretholde eller forbedre den medicinske virkning kan der efter ønske inkorporeres en base, en 20 syre eller et salt. Mængden af aktivt ingrediens i sammensætningen (præparationen) ligger sædvanligvis fra 0,001 til 90 vægtprocent og fortrinsvis fra 0,01 til 60%.

De formulerede chlorambucilderivater kan administreres ved oral indgift, percutan adsorption, intramuskulær injektion, intraperitoneal 25 injektion, subcutan injektion, intravenøs injektion, intrarectal injektion og lokal administration.

Dosis for chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse ligger i området fra ca. 0,01 til 50 mg/kg/dag/voksent individ ved oral indgift, og det ligger i området fra ca. 0,001 til 20 mg/kg/ 30 dag/ voksent individ ved intravenøs injektion.

Chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse har følgende egenskaber: (1) . Når der er dannet cancer i et væv med receptorer, angriber produktet selektivt cancercellerne i vævet og dræber cancercellerne. På 35 denne måde er det virksomt i kun små doser.

(2) . Produktet har mindre bivirkning i sammenligning med den ved indgivelse af chlorambucil. Det kan derfor indgives i lang tid, og følgeligt kan cancercellerne destrueres fuldstændigt.

6 147145 (3) . Det som bærekomponenten i chlorambucilderlvatet benyttede østradiol elfer acyleret østradiof har en enkelt strukturel sammensætning, og dets fysiologiske virkning er velkendt, hvorfor produktet kan indgives uden bekymring.

(4) . Strukturen og virkningen af antitumor komponenten i chloram-bucilderivatet er allerede kendt, hvorfor produktet kan indgives uden bekymring.

(5) . Cancercellernes receptorer kan undersøges. Det tilsvarende steroidhormon eller dets derivat kan udvælges som bærekomponent for chlorambucildervatet. Den terapeutiske virkning ved forskellige cancere kan tages i betragtning ved udvælgelse af bærekomponenten.

(6) . Chlorambucilderlvatet kan administreres i sædvanlige formula-tionsformer, såsom oral indgivelse, injektion og suppositorieindgivelse.

Den foreliggende opfindelse vil blive yderligere belyst ved nogle eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af 3-hydroxy-l ,3,5(10)-østratrien-178-[4-rp-fbis(2-chlor-ethyQaminojphenyllbutyrvloxy Tacetat.

I) Fremstilling af 3-hydroxy-l,3,5(10)-østratr?en-17p-monobromacetat.

10 g l,3,5(10)-østratrien-3,17p-diol blev opløst i 400 ml vandfri tetrahydrofuran (THF), og derpå blev der tilsat 8,8 g pyridin.

En opløsning af 22,5 g monobromacetylbromid i 74 g carbontetra-chlorid blev dribevis tilsat til den resulterende opløsning ved ca. -5°C til -7°C. Blandingen blev opbevaret 1 nat. Efter reaktionen blev det resulterende præcipitat fraskilt ved filtrering. Opløsningsmidlet blev afdestiileret fra filtratet. Remanensen blev opløst i ether og rekrystal-liseret fra ether til opnåelse af 1,3,5(10)-østratrien-3,17p-bis(monobrom-acetat). 2 g af produktet blev opløst i 900 ml methanol og opløsningen blev afkølet til -5°C. En opløsning af 0,24 g KgCOg i 20 ml vand blev dråbevis tilsat til den resulterende opløsning. Efter 30 minutters reaktion blev 1000 ml vand tilsat, og det resulterende præcipitat blev fraskilt og tørret. Det blev ved grundstofanalyse og IR-spektrum bekræftet, at produktet var 3-hydroxy-1,3,5(10)-østradien-17p-monobromacetat.

II) Fremstilling af 3-hydroxy-l,3,5(10)-østratr?en-17P-f4rp-rbis(2-chlor- ethyl )amino] phenyi 1 butyryloxy ] acetat. (Chlorambucil-østradiolkonjugat) 200 mg sølv[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenylTbutyrat (sølvsalt af chlorambucil) blev tilsat 10 ml DMSO til dannelse af en hvid, colloidai opløsning.

U7U5 7

Derpå blev der tilsat 190,8 mg 3-hydroxy-1,3,5(10)-østratrien-178~monobromacetat, og blandingen blev i mørke omrørt ved stuetemperatur i 64 timer. Præcipitatet skiftede til en gulliggrøn farve. Der blev tilsat en lille mængde acetone, og præcipitatet blev fraskilt ved filtre-5 ring gennem et G-4 filter. Præcipitatet skiftede fra gulliggrøn farve til en sortagtig grøn farve ved lysbestriling. Filtratet var farveløst og transparent. DMSO blev afdestilleret under reduceret tryk pi et vandbad ved 80°C, og der blev tilsat 100 ml vand til præcipitering af hvide krystaller. Krystallerne blev opbevaret i 1 time til fjernelse af DMSO, 10 og krystallerne blev frasepareret med et G-4 filter, vasket grundigt med destilleret vand og tørret under reduceret tryk i en desiccator. Det urensede udbytte var 330,5 mg.

a. Rensning af produktet 15 330,5 mg råkrystaller blev opløst i et blandet solvent af 50 volumen dele cyclohexan og 10 volumendele ethylacetat. Opløsningen blev langsomt ført gennem en søjle, der var fyldt med 40 g silicagel, og produktet blev gradvist adskilt, hvorved der opnåedes 188,2 mg rent produkt (udbytte: 62,86%).

20 Resultaterne af grundstofanalyse, smeltepunktsbestemmelse og IR- spektrum pi produktet er som følger:

Grundstofanalyse: C Η N Cl

Fundet (%): 66,0 7,0 2,3 11,0 25 Beregnet (%): 66,22 6,98 2,27 11,52

Smeltepunkt: halvsmelter ved 25°C.

"1 IR-spektrum (cm ) 3420 2920 2840 1750 1740 1612 1582 1516 30 1450 1380 1350 1280 1250 1210 1175 1142 1070 1000 960 917 867 810 800 740 655 EKSEMPEL 2 35 Fremstilling af 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-østratrien-176-[4-fp-rbis(2-chlor-ethy I )amino1 pheny I ] butyryloxy ] acetat.

10 g 1,3,5(10)-østratrien-3,176-diol blev opløst i 100 ml THF, og der blev tilsat 10 ml af en vandig opløsning indeholdende 1,47 g NaOH. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 30 minutter. Blandingen 8 147145 blev derpå koncentreret til tørhed under reduceret tryk pi et vandbad ved 80°C til fjernelse af vandet. Remanensen blev opløst i vandfri THF, og til den resulterende opløsning blev der dråbevis tilsat 50 ml af en ethyletheropløsning indeholdende 5,5 g benzoylchlorid, hvorpå 5 reaktionen blev udført ved stuetemperatur i 16 timer. Efter reaktionen blev den fremkomne natriumchlorid fraskilt på sædvanlig måde. Filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk. Til fjernelse af ikke-om-sat benzoylchlorid blev der tilsat 200 ml af en vandig 0,1 N NaOH-opløs-ning, og blandingen bfev omrørt ved stuetemperatur i 15 minutter. De 10 resulterende hvide krystaller blev fraskilt med et G-3 filter, blev vasket grundigt med destilleret vand og tørret under reduceret tryk i en desic-cator.

Produktet blev analyseret ved tyndtlagschromatografi pi silicagel med en blandet udviklings-solvent (ethylacetat og cyclohexan i et 15 volumenforhold på 50:30), hvorved der fremkom en hovedplet med Rf = 0,34.

Råkrystallerne blev rekrystalliseret fra ethylacetat, og der blev derved opnået 8,6 g hvide krystaller.

Ved smeltepunktsbestemmelsen, grundstofanalyse og IR-spektrum 20 blev det bekræftet, at produktet er 178-hydroxy-1,3,5(10) østratrien- 3-benzoat.

Af det resulterende produkt blev 7,0 g opløst i THF, og der blev tilsat 2,0 g pyridin, og blandingen bfev afkølet til -5°C.

En opløsning indeholdende 15,5 g 30% monobromacetylbromid-car-25 bontetrachlorid i 50 ml THF blev efterhånden dråbevist tilsat den resulterende blanding. Efter tilsætningen blev blandingen omrørt ved -5°C i 2 timer og derpå på et isbad i 4 timer og blev endeligt opbevaret i et køleskab i 16 timer. Efter reaktionen blev det resulterende hvide præ-cipitat fraskilt med et G-4 filter, tørret under reduceret tryk på et 30 vandbad ved 30°C, 200 ml ethylether blev tilsat, og blandingen blev omrørt, hvorved der opnåedes 5,3 g hvide krystaller.

Resultaterne af grundstofanalysen og smeltepunktsbestemmelse er som følger: 35 Grundstofanalyse: C H Br

Fundet (%): 64,3 5,8 15,7

Beregnet (%): 64,23 5,78 15,8

Smel tepun ktsbestemmel se: 145-146°C

9

U714S

Produktet blev analyseret ved tyndtlagschromatografi på silicagel med en blandet udviklings-solvent (ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold på 50:30), hvorved der fremkom en enkelt plet med Rf = 0,77. Pi IR-spektret blev der ikke konstateret absorption baseret på 5 OH-gruppen, og det var følgeligt bekræftet, at produktet er 3-benzoyl-oxy-1,3,5(10)-østratrien-178-monobromacetat.

"1 IR-spektrum: (cm ) 2920 1735 1728 1595 1579 1490 10 1448 1412 1382 1286 1280 1260 1210 1200 1170 1145 1095 1075 1019 1004 897 780 700 680 182,3 mg 3-benzoyloxy-1,3,5(l0)-østratrien-178-monobromacetat og 148,5 mg 0,6 sølv 4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butyrat blev 15 tilsat til 5 ml DMSO, og reaktionen blev udført i mørke ved stuetem peratur i 3 dage. Efter reaktionen blev det præcipiterede sølvbromid fraskilt ved filtrering, og til filtratet blev der tilsat 400 ml vand. Det resulterende hvide præcipitat blev fraskilt ved centrifugeringsadskillelse. Præcipitatet blev opløst i 50 ml acetone, og det uopløselige 20 materiale blev fraskilt ved filtrering gennem et G-4 filter.

Filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 165 mg af et olieagtigt produkt.

Produktet blev analyseret ved tyndtlagschromatografi på silicagel med en blandet udviklings-solvent (ethylacetat og cyclohexan i et volu-25 menforhold pi 10:50), hvorved der fremkom en hovedplet med Rf = 0,44.

Da der var ikke-omsat materiale tilbage, blev reaktionsproduktet chromatograferet på silicagel med en blandet solvent (ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold på 10:50) til opnåelse af et renset pro-30 dukt. Det rensede produkt var en hvid, krystallinsk forbindelse ved 20°C. Resultaterne af grundstofanalyse og IR-spektrum af produktet er som angivet nedenfor. Det blev bekræftet, at produktet er 3-benzoyl-oxy-1,3,5(10)-østratrien-178-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]buty-ryloxy]acetat.

35 10 147145

Grundstofanalyse: C Η N Cl

Fundet (%): 68,5 6,60 1,99 9,79

Beregnet (%): 68,33 6,53 1,94 9,86 5 Smeltepunkt (°C) 110-111.

-1 IR-spektrum: (cm ) 2920 2860 1755 1735 1612 1582 1516 1491 1450 1420 1380 1355 10 1260 1224 1210 1174 1145 1079 1022 1005 960 915 890 800 740 705 EKSEMPEL 3 15 Fremstilling af 3-propionyloxy-1/3>5(10)-østratrien-178-r4-rp-fbis(2-chlor- ethy I )amino] pheny I ] butyry loxy ]acetat 10 g 1,3,5(10)-østratrien-3,178-diol blev opløst i 100 ml THF, og der blev tilsat 10 ml af en vandig opløsning indeholdende 1,47 g NaOH, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 30 minutter. Reaktions-20 produktet blev koncentreret til tørhed under reduceret tryk pi et vandbad ved 80°C til fjernelse af vandet. Remanensen blev opløst i vandfri THF, og der blev dråbevist tilsat en opløsning indeholdende 3,40 g pro-

C

pionylchlorid i 50 ml vandfri THF, hvorpå reaktionen blev udført ved stuetemperatur i 16 timer. Efter reaktionen blev natriumchloridpræcipi-25 tatet fraskilt, og filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk, og remanensen blev rekrystalliseret fra ethanol, hvorved der opnåedes 9 g hvide krystaller.

Det blev ved grundstofanalyse og IR-spektrum bekræftet, at produktet er l7p-hydroxy-1,3,5(10)-østratrien-3-propionat.

30 7,0 g af produktet blev opløst i 70 ml vandfri THF, 3,0 g pyridin blev tilsat og blandingen blev afkølet til -5°C. En opløsning indeholdende 17,3 g 30% monobromacetylbromid-carbontetrachlorid i 50 ml THF blev dribevist tilsat til den resulterende blanding. Efter tilsætningen blev blandingen holdt ved -5°C i 2 timer og derpå opbevaret i et køleskab 35 i 16 timer til omsætning af dem. Efter reaktionen blev det resulterende præcipitat fraskilt ved filtrering. Filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk på et vandbad ved 30°C, hvorpå 200 ml ethyl-ether blev tilsat og blandingen blev omrørt, hvorved der opnåedes 6,0 g hvide krystaller. Filtratet blev yderligere koncentreret, hvorved der 11

147UB

opnåede 3,5 g hvide krystaller. Krystallerne blev rekrystalliseret fra en blandet solvent af ether og ethanol.

Resultatet af grundstofanalysen er som følger.

5 Grundstofanalyse: C H Br

Fundet (%): 61,5 6,5 17,9

Beregnet (%): 61,43 6,45 17,78 I IR-spektret blev der ikke konstateret absorption baseret på OH- 10 grupper, og det blev følgeligt bekræftet, at produktet er 3-propionyl-oxy-1,3,5(10)-østratrien-178-monobromacetat.

1,0 g af produktet og 0,91 g sølv 4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phe-nyl]butyrat blev dispergeret og opløst i 50 mg DMSO, og reaktionen blev udført i mørke ved stuetemperatur i 3 dage. Efter reaktionen blev sølv- 15 præcipitatet fraskilt ved filtrering, og der blev tilsat 4 I vand. Præcipi-tatet blev fraskilt ved centrifugeringsadskillelse, og det hvide præcipi-tat blev opløst i 50 ml acetone, og uopløseligt materiale blev fraskilt ved filtrering gennem et G-4 filter. Filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 1,3 g af et olieagtigt produkt.

20 For at rense produktet blev det chromatograferet på silicagel med en blandet solvent af ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold på 10:50. Det rensede produkt var ved 20°C et viskøst, olieagtigt produkt. Resultaterne af grundstofanalyse og IR-spektrum var som følger.

25 Grundstofanalyse: C Η N Cl

Fundet (%): 67,1 7,0 2,1 11,0

Beregnet (%): 66,0 6,99 2,08 10,56 30 IR-spektrum (cm ): 2916 2840 1750 1740 1610 1512 1488 1441 1415 1379 1361 1270 1210 1200 1170 1140 1068 1004 956 931 885 817 793 735 cm"1.

Det blev bekræftet, at produktet er 3-propionyloxy-1,3,5(10)-østra- 35 trien-176-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butyryloxy]acetat.

12 147145 EKSEMPEL 4

Fremstilling af 3-acetoxy-1,3,5(10)-østratrien-178-r4-rp-fbis(2-chlor-ethyl )aminoT phenyl 1 butyryloxy lacetat.

1,0 g 3-acetoxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-monobromacetat, der var 5 opnået ved samme proces som i eksempel 2, og 0,9 g sølv 4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butyrat blev tilsat til 50 ml DMSO, og reaktionen blev udført i mørke ved 25°C i 3 dage. Efter reaktionen blev sølvbromid-præcipitatet fraskilt, og til filtratet blev der tilat 4 I vand. Det resulterende hvide præcipitat blev fraskilt ved centrifugeringsadskillelse. Præci-10 pitatet blev opløst i 50 ml acetone. Det uopløselige materiale blev fraskilt med et G-4 filter, og filtratet blev inddampet til tørhed under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 1,2 g af et olieagtigt produkt. Produktet blev chromatograferet pi silicagel med en blandet solvent af ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold på 10:50. Det rensede 15 produkt var ved 20°C et viskøst, olieagtigt materiale.

Resultatet af grundstofanalysen var som følger.

Grundstofanalyse: C Η N Cl

Fundet (%): 66,0 6,9 2,0 10,9 20 Beregnet (%): 65,64 6,84 2,13 10,79 I IR-spektret blev der ikke konstateret absorption baseret på OH-gruppe, det blev følgeligt bekræftet, at produktet er 3-acetoxy-1,3,5(10)-østratrien-176-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyI]butyryl-oxy]cetat.

25 IR-spektrum (cm ): 2915 2840 1750 1740 1610 1512 1488 1442 1415 1378 1360 1270 1210 1200 1170 1140 1068 1005 30 956 931 885 817 793 735 EKSEMPEL 5 1 g 3-acetoxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-monobromacetat og 0,8 g natrium 4-[p-[bis(2-chlorethy!)amino]phenyl]butyrat blev tilsat 50 ml 35 THF til omsætning af dem ved 60°C i 24 timer.

Efter reaktionen blev præcipitatet fraskilt ved filtrering, og filtratet blev koncentreret og tørret. Produktet blev separeret og renset pi en silicagel-søjle med en blandet solvent af ethylacetat og cyclohexan, hvorved der opnåedes 0,9 g renset produkt. Produktet var 3-acetoxy- 147145 13 1,3,5(10)-østratrien-^-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butyryl- oxy]acetat.

EKSEMPEL 6 5 Fremstilling af 3-acetoxy-1,3,5(10)-østratrien-17g-r4-ip-[bis(2-chlor ethy I )amino] phenyl 1 butyryioxy] acetat.

200 mg sølv 4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butyrat (sølvsalt af chlorambucil) blev tilsat til 10 ml DMSO til dannelse af en hvid, col-loidal opløsning. Til den colloidale opløsning blev der derpå tilsat 190,8 10 mg 3-hydroxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-monobromacetat, og blandingen blev i mørke omrørt ved stuetemperatur i 64 timer. Efter 64 timer skiftede præcipitatet til en gulliggrøn farve. En lille mængde acetone blev tilsat til præcipitatet, og præcipitatet blev fraskilt ved filtrering gennem et G-4 filter. Filtratet var farveløst og transparent. DMSO blev af-15 destilleret på et vandbad ved 80°C, og derpå blev der tilsat 100 ml vand til præcipitering af hvide krystaller. Blandingen blev opbevaret i en time, og DMSO blev derpå afdestilleret. De hvide krystaller blev fraskilt ved filtrering gennem et G-4 filter, blev derpå vasket med destilleret vand og tørret under reduceret tryk i en desiccator. Det u-20 rensede udbytte var 330,5 mg.

330,5 mg urenset produkt blev opløst i en blandet solvent af cyclo-hexan og ethylacetat i et volumenforhold på 50:10. Opløsningen blev langsomt ført gennem en søjlefyldning af 40g silicagel til gradvis separering af produktet, og der blev opnået 188,2 mg rent produkt (udbyt-25 te: 62,86%).

Resultaterne af grundstofanalyse og smeltepunktsbestemmelse på produktet er som følger.

Grundstofanalyse: 30 C Η N Cl

Fundet (%): 66,0 7,0 2,3 11,0

Beregnet (%): 66,22 6,98 2,27 11,52

Smeltepunkt: halvsmeltet vd 25°C.

Det blev bekræftet, at produktet er 3-hydroxy-1,3,5(l0)-østra-35 trien-17β-[4-[p-[bis(2-chlorethy I )amino] phenyl] butyryioxy jacetat.

50 mg af produktet blev opløst i 1 ml vandfri pyridin, og der blev tiisat 1 ml eddikesyreanhydrid til omsætning af dem i et køleskab i 16 timer. Efter reaktionen blev reaktionsblandingen koncentreret og tørret under reduceret tryk på et vandbad ved 30°C. Resten blev tilblandet 14 147145 destilleret vand, og blandingen henstod 1 time, hvorved der udfældedes et olieagtigt produkt i hvid coiloidal form. Pyridin og eddikesyre blev fjernet sammen med destilleret vand, og produktet blev vasket med vand til neutralitet. Det olieagtige produkt blev fraskilt fra en vandig opløs-5 ning, koncetreret og tørret i en desiccator under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 45 mg af et olieagtigt produkt.

Produktet blev analyseret ved tyndtlagschromatografi pi silicagel med en blandet udviklings-solvent af ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold pi 30:50, hvorved der fremkom en enkelt plet med Rf 10 = 0,78.

Til rensning af produktet blev dette chromatograferet på silicagel med en blandet solvent af ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold pi 10:50. Det rensede produkt var ved 20°C en viskøs, olieagtig forbindelse.

15 Resultatet af grundstofanalysen var som følger.

Grundstofanalyse: C Η N Cl

Fundet (%): 66,0 6,5 2,0 10,9

Beregnet (%): 65,64 6,84 2,13 10,79 20 I IR-spektret blev der ikke konstateret absorption baseret pi OH- gruppe, og det var følgeligt bekræftet, at produktet er 3-acetoxy-1,3,5 (lO)-østratrien-178-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butyryloxyJace-tat.

25 IR-spektrum (cm ): 2915 2840 1750 1740 1610 1512 1488 1442 1415 1378 1360 1270 1210 1200 1170 1140 1068 1005 956 931 885 817 793 735 30 EKSEMPEL 7

Fremstilling af 3-propionyloxy-l ,3,5(10)-østratrien-178-[4-[p-fbis(2-chlor-ethyl)am?nojphenyl]butyryloxylacetat.

50 mg 3-hydroxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-[4-[p-[bis(2-chlorethyl) 35 aminojphenyljbutyryloxy]acetat blev opløst i 1 ml vandfri pyridin, og der blev tilsat 1,5 ml propionsyreanhydrid, hvorefter blandingen blev opbevaret i et køleskab i én dag. Reaktionsblandingen blev inddampet til tørhed under reduceret tryk på et vandbad ved 30°C. Remanensen blev blandet med destilleret vand, og blandingen henstod i 2 timer 147145 15 til dannelse af et colloidt, olleagtigt produkt. Pyridin og eddikesyre blev fjernet med destilleret vand, og produktet blev vasket med vand til neutralitet. Vandfasen blev fraskilt, og oliefasen blev tørret under reduceret tryk i en desiccator, hvorved der opnåedes 40 mg af et olie-5 agtigt produkt. For at rense produktet blev det chromatograferet pi silicagef med en blandet solvent af ethylacetat og cyclohexan i et volumenforhold på 10:50. Det rensede produkt var e viskøs, olieagtig forbindelse. I IR-spektret blev der ikke konstateret absorption ved 3600--1 3200 cm . I betragtning af resultatet var det bekræftet, at produktet 10 er 3-propionyloxy-1,3,5(10)-østratrien-176-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)ami-no]phenyi]butyryloxy]aeetat.

EKSEMPEL 8

Fremstilling af 3-benzoyloxy-l,3,5C10)-østratr?en-176-[4-fp-fbis(2-chlor-15 ethyl )aminoj phenyl jbutyryloxy lacetat.

50 mg 3-hydroxy-1,3,5(10)-østratrien-176-[4-[p-[bis(2-chlorethyl) amino]phenyl]butyryloxyjacetat blev opløst i 1 ml vandfri pyridin, og der blev tilsat 2 g benzosyreanhydrid, hvorpå blandingen blev opbevaret i et køleskab i en dag. Reaktionsblandingen blev inddampet til tør-20 hed under reduceret tryk på et vandbad ved 30°C. Remanensen blev tilblandet destilleret vand, og blandingen henstod i 1,5 time til dannelse af et colloidt, olieagtigt produkt. Pyridin og eddikesyre blev fjernet med destilleret vand, og produktet blev vasket med vand til neutralitet. Vandfasen blev fraskilt, og oliefasen blev inddampet til tørhed un-25 der reduceret tryk i desiccator, hvorved der opnåedes 45 mg af et olieagtigt produkt.

For at rense produktet blev det chromatograferet på silicagel med en blandet solvent af ethylacetat og chciohexan i et volumenforhold· på 10:50. Det rensede produkt var en viskøs, olieagtig forbindelse.

30 I IR-spektret blev der ikke konstateret absorptionsbånd ved 3600 til 3200 cm . I lyset af denne kendsgerning var det beskræftet, at produktet er 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-østratrien-176-[4-[p-[bis(2-chlor-ethyl)amino]phenyl]butyryloxy]acetat.

35 16 147145 EKSEMPEL 9

Fremstilling af 3-hydroxy-1 ,3,5(l0)-estratrien-178-[4-{p-[bis(2-chlor- ethyQaminolpheny I} buty ryloxy] acetat.

1000 mg Sølv-[4-{p-[bis(2-chlorethyl)aminojphenyl}butyrat], (sølvsaltet af chlorambucif), blev sat tii 10 ml DMSO til dannelse af en hvid kolloidal opløsning. Derpå blev 406,6 mg monobromeddikesyre tilføjet, og den resulterende blanding blev omrørt ved stuetemperatur i 48 timer i mørke. Precipitatet ændrede farve til gulligtgrøn. En lille mængde acetone blev tilføjet, og præcipitatet blev fraskilt ved filtrering gennem et G-4 filter. Filtratet var farveløst og transparent. DMSO blev af-destilleret under reduceret tryk pi et vandbad ved 80°C, og der blev tilføjet 100 ml vand til dannelse af hvide krystaller. De hvide krystaller (552,4 mg) blev opløst i 10 ml THF, og POCI3 (468,1 mg) blev derpå tilføjet ved stuetemperatur. Efter omsætningen blev POCI^ afdestilleret under reduceret tryk til opnåelse af 4-{p-[bis(2-chlorethyl)amino]phe-n yl} butyry loxy ] acety (ch lorid.

C1CH2CH2\ ,1 N-f V CH2CH2CH2C00CH2C0C1| cich2ch2 Nc==' )

De rå krystaller (220 mg) af 4-{p-[bis(2-chlorethyl)amino]phe-nyl}butyryloxy]acetylchloridet blev sat til 10 ml pyridin til dannelse af en opløsning heraf. Derpå blev 51 mg 1,3,5(10)-estratrien-3,17p-diol tilsat til opløsningen, og den resulterende blanding blev omrørt ved stuetemperatur i 24 timer. Efter 24 timer blev præcipitatet fraskilt ved filtrering gennem et G-4 filter. Filtratet var farveløst. 134 mg af produktet blev opløst i en blandet solvent (methanol og acetone i volumenforholdet 50:50), og opløsningen blev afkølet til 0°C. 11 mg opløst i 2 ml vand blev dråbevist tilsat til den resulterende opløsning.

Efter 60 minutters reaktion blev der tilsat 100 ml vand, og det resulterende præcipitat blev fraskilt og tørret.

De rå krystaller blev opløst i en blandet solvent bestående af 50 volumendele cyclohexan og 10 volumendele ethylacetat. Opløsningen blev langsomt ledt gennem en søjle, der var fyldt med 40 g silicagel, og produktet blev gradvist adskilt til opnåelse af 69 mg rent produkt. Ved elimentær analyse og IR-spektret blev det bekræftet, at produktet var 3-hydroxy-1,3,5(10)-estratrien-178-[4-{p-[bis(2-chlorethyl)amino]phe-ny I jbutyry loxy ] acetat.

147145 17 EKSEMPEL 10

Fremstilling af 3-benzoyloxv-1,3,5(10)-estratrien-17g-f4-{p-rbis(2-chlor-ethyl)amino]phenyl}butyryloxy]acetat.

380 mg 4-{p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl}butyryloxyacetylchlorid blev sat til 10 ml pyridin til dannelse af en opløsning.

Derpå blev 130 mg 17p-hydroxy-1,3,5(10)-estratrien-3-benzoat tilblandet ved stuetemperatur. Efter 24 timer blev pyridinen afdestilleret under reduceret tryk på et vandbad ved 40°C. Remanensen blev opløst i en blandet solvent bestående af 50 volumendele cyclohexan og 10 volumendele EttoH. Opløsningen blev langsomt ledt gennem en søjle fyldt med 40 g silicagel, og produktet blev gradvist adskilt til opnåelse af 170 mg rent produkt. Det blev ved elimentær analyse og IR-spektret bekræftet, at produktet var 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-estratrien-17p-[4-{p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl}butyryloxy]acetat.

AFPRØVNING 1

Akut toxicitet og antitumorvirkning (in vivo) af chlorambucilderivater fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse (1) Akut toxicitet (LD^)

Til bestemmelse af LD5q blev der som en gruppe benytte 8 ICR-JCL hunmus (5 uger gamle) til formering i et transparent polybur, og hver forbindelse blev opløst i olivenolie og indgivet musene i en dosis ved intraperitoneal injektion (i.p.), oral indgift (p.o.) og subcutan injektion (s.c.), og derpå blev LDgQ-værdien efter 7 dage evalueret ved Litchfield-Wilcoxons grafiske metode. Resultaterne var som følger: LD50 for chlorambucil var: 20 mg/kg ved i.p., 80 mg/kg ved p.o. og 26 mg/kg ved s.c.

LD50 for prøve nr. 2 i tabel 1 fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse var: større end 3000 mg/kg ved i.p., større end 6000 mg/kg ved p.o. og større end 3000 mg/kg ved s.c.

(2) Antitumor-prøvning (in vivo)

Stykker af humane brystcancerceller med steroid hormon receptor blev subcutant implanteret under forbenene på mus [BALB/C-nu,nu, (5 uger gamle)] til dannelse af faste tumorer. Fra 24 efter implante-ringen blev olivenoliedispersioner eller -opløsninger af det aktive ingrediens indgivet subcutant eller oralt hver anden dag, ialt 10 gange.

25 dage efter implanteringen blev tumorerne fjernet. Tumor-inhibe-ringsvirkningen blev bestemt ud fra (A): den gennemsnitlige vægt af udskårne tumorer fra 10 mus (på hvilke det aktive ingrediens var 18 147145 blevet anvendt) og (B): den gennemsnitlige vægt af udskårne tumorer fra 10 kontrolmus.

% tumorinhiberingsvirkning = (1--——) x 100

B

Både ved subcutan og oral indgift af chlorambucil i en dosis på 15 mg/kg var inhiberingsvirkningen fra ca. 50 til 70%, medens inhibe-ringsvirkningen ved indgivelse af chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse var større end 90%. Når chlorambucilderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse blev indgivet, overlevede alle musene.

Undersøgelse af autopsier afslørede alvorlige forandringer af milt, uterus og thymus efter indgivelse af chlorambucil, medens der ikke blev konstateret forandringer efter indgivelse af prøver fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

19 147145

V V

o o o o o o

ro OJ

V V

o o o o o o

00 00 OJ

V- V

o o o o o o

OJ CO CVI

-J o UJ in

ω Q

< -1

ίο CO

f 00 OJ

c c > 5) Γ D) ϋ σ> c O. jc S: Ja: — \ Cl) \ c σ> ό O) 15 £ c E ti

V—' ·— J

_ U

o ro o ja in s_ in 3

Q o q W

_l _l w _ 20_ 147145 o o τ— τ— N \

LO O O O

LO r- r- O r- r- O

O O

Γ" V” \ \ in o ^ o o r- T" r— r~ 0> ^ o c- r— \ \

O O CO LO O CM

r- r- 05 i- 05

O O

r— T” \ \

LO O CO O O LO

r- v— 05 τ— i— 05

CO

O O

r- r— N \

O O c- LO O CO

ϊ- r- 05 r- 05 cn| c____ ’c C'J -f o o , T- r-

-J > \ N

tu f m o oo o o oo CQ o r-T-05 c— r-05 < Ξ 1- 3 ^ 4-> +3 CM λ

C O O

τ— t—

O O CM LO O O

t— r~ 05 r* 05

O O

O \ O O \ r- τ— f*· c- Γ'· I'' ί-

Ο O

o \ in lo \ co

r 00 li) 05 LO

* 0)1 * 0)1 ω οχ' Ό Ό ~

C C C C

CD -5έ CD ^ >5. i! > S- > T- > o; ^ τ > S. O) i: « TJ a 5; ϋ tT+j^PO! c σ C % 0) g ° Έ c gi ° r c 2 Ό £ c ω jEca; u c c w o i3 »S ^ o ύ j μ : « s ϊ s « s s ·« "+-> CO (/5 rø Ώ <Λ CU .£ £rcs_0s_ 3 O i*

Q. < O Ω li- o\° V) Q LL o\P

147145 21

Note.

Prøve nr. 1: Chlorambucil

Prøve nr. 2: 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-[4-[p-[bis(2- 5 chIorethyl)amino]phenyl]butyryloxy]acetat.

Prøve nr. 3: 3-acetoxy-1,3,5(10)-østratrien-178-[4-[p-[bis(2- ch loreth y I )amino] pheny I ] buty ry loxy ] acetat.

Prøve nr. 4: 3-propionyloxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-[4-[p-[bis (2-chlorethyl)amino]phenyl]butyryloxy]acetat 10 Prøve nr. 5: Olivenolie (kontrol) AFPRØVNING 2

Antitumorvirkningen blev udført ifølge afprøvning I, men med den afvigelse, at hvert af de aktive ingredienser blev indgivet ved intra-15 peritoneal injektion i form af en dispersion af ingrediens et i Polysolvate 80 (emulgeringsmiddel). Resultaterne blev som følger:

Chlorambucil 3-hydroxy-1,3>5(10)-østratrien-17p-[4-[p-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]buty- 20 ryloxyjacetat_

Dosis (mg/kg) 5 0,5 5 % inhiberings- virkning 30 91 97

Akut toxicitets· 25 test LD50 20 1000< AFPRØVNING 3:

Bindingsfunktion for 3-hydroxy-1,3,5(10)-østratrien-17p-[4-[p-[bis- ( 2-ch lorethy I )amino] pheny I ] buty ryloxyjacetat til østrogensensitive celler.

3 30 Østradiol mærket med tritium ( H) blev inkuberet med uterus fra kanin til binding af det, og derpå blev prøven tilsat til systemet til 3 bestemmelse af den mængde fri H-østradiol, som blev erstattet af den tilsatte østradiol. Resultaterne er vist på tegningen. Det blev konstate- 3 ret, at mængden af H-østradiol forøgedes som det samme med østradiol 35 selv. Dette forhold viser, at prøven har bindingsfunktion til østrogenreceptorer.

22 147145 SAMMENLIGNENDE AFPRØVNING AF FORBINDELSER FREMSTIL-LET IFØLGE OPFINDELSEN OG IFØLGE KENDT TEKNIK._

Stykker pi 2 mm x 2 mm af human brystcancerceller blev implan-teret subcutant under forbenet pi hver af 8 nøgne mus (BALA/CA-Nu).

Fra 24 timer efter implanteringen blev den aktive substans i en opløsning af sesamolie indgivet dagligt i en oral dosis i 14 dage. 21 Dage efter den påbegyndte indgivelse blev tumorerne udskåret og vejet. Den hæmmende virkning pi tumorvækst blev bestemt "ud fra den gennemsnitlige vægt (A) af udskårne tumorer fra 8 mus, som var blevet indgivet den aktive substans, og den gennemsnitlige vægt (B) af tumorer udskåret fra 8 kontrolmus.

Tumorhæmmende virkning (%) = (1 - x 100

De opnåede resultater er anført i omstående tabel 1.

Med henblik på at undersøge bivirkninger blev koncentrationen af frit chiorambucii og antallet af hvide blodlegemer i blodet bestemt en time efter den sidste indgivelse.

De til undersøgelsen benyttede forbindelser er anført nedenfor og blev fremstillet ifølge de anførte referencer:

Substans nr 1: 17oi-[4-(4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino)phenyl)-butanoyloxyacetoxy]pregn- 4-ene-3,20-dion fremstillet ifølge DK patentansøgning nr. 252/77, eksempel 3, forbindelse 2 (USA patent nr. 4.177.269)

Substans nr 2: 17a-[4-(4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino)phenyI)-butanoyloxyacetoxy]- 6a-methylpregn-4-ene-3,20-dion fremstillet ifølge DK patentansøgning nr. 252/77, eksempel 3, forbindelse 16 (USA patent nr. 4.177.269).

Substans nr 3: 17-acetoxy-3-[4-(4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino)phenyl)-butanoyloxy]- pregn-3,5-dien-20-on fremstillet ifølge DK patentansøgning nr. 719/77, eksempel 1, forbindelse \ (USA patent nr. 4.150.126.

Substans nr 4: chiorambucii.

147145 23

Substans nr 5: 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-estratrien-17p-[4-{p-(bis(2-chlorethyl)amino)- phenyl}butanoyloxy]acetat fremstillet ifølge nærværende opfindelse.

Substans nr 6: 3-acetoxy-1,3,5(10)-estratrien-17p-[4-{p-(bis-chlorethyl)amino)- phenyl}butanoyloxy]acetat fremstillet ifølge nærværende opfindelse.

Substans nr 7: 3-propionyloxy-1,3,5(10)-estratrien-'^-[4-{p-(bis-chiorethyl)amino)- phenyl}butanoyloxy]acetat fremstillet ifølge nærværende opfindelse.

Bemærkning til tabellen: 1) CBL:

Koncentrationen af alkaleringsmiddel i blodet 1 time efter sidste indgivelse 14 dage efter påbegyndelsen af indgivelsen.

2) WBC:

Antallet af hvide blodlegemer i blodet efter sidste indgivelse den 14. dag efter påbegyndelsen af indgivelsen.

3) Terapeutisk index beregnet ud fra følgende data:

LDcri = 50% reduktion af antallet af hvide blodlegemer og DU

EDgg = 90% inhibering (hæmning) af cancercellerne.

4) MR^

Inhiberingsforhold (hæmningsforhold) 5) Procentvis formindskelse af antallet af hvide blodlegemer.

Det ses af de opnåede resultater i nedenstående tabel 3, at dels er forbindelserne fremstillet ifølge nærværende ansøgning langt mindre toksiske end de kendte forbindelser, jvf. søjle 2 og 3 i tabellen, og dels er den kurative virkning af forbindelserne fremstillet ifølge nærværende ansøgning for samme daglige dosisstørrelse væsentlig bedre end den af de kendte forbindelser. Kombinationen af disse to effekter bevirker, at der med forbindelserne fremstillet ifølge nærværende ansøgning kan opnås en 100% kurativ virkning, hvilket, som det ses, ikke er tilfældet med nogen af de kendte forbindelser.

24 147146

Tabel 3 Hæmningsvirkning og bivirkninger --:—---ro—F5

Dosxs ^ 2) røBC Cancer IR Terapeutisk Refe-

Sub_ (mg/kg) CBL _n (cell/mm3) (mm3) (%) index rence

stans (x 10 g/ml) (WBC

______

Kon- 0,5% ^ ί “ΐίΐ 0 7990 2800 0 0 trol cellulose· __V_____ 5) 6.25 360 3920(-51%) 1850 33,9 DK pat' 1 12,5 600 2900(-64%) 1021 63,5 0,25 ans.nr.

252/77 25.0 1020 2010(-75%) 280 90,0 100.0 døde 6.25 350 4000(-50%) 1900 32,1 DK pat.

2 12,5 520 2900(-64%) 810 71,1 0,25 ans.nr.

25.0 1050 2250(-72%) 290 89,7 252/77 100.0 døde - - - ________________i____ 6.25 380 4000(-50%) 2000 28,6 DK pat.

3 12,5 630 2300 1100 60,7 0,25 7 ans.nr.

25.0 1100 2100 275 90,2 71 9/77 100.0 døde “ _ 0,5 530 4000(-50%) 1460 47,9 7 Chlor- 4 2,5 700 2000(-75%) 307 89,0 0,2 ambucil 12,5 døde “ ~ 6.25 1,9 7900(-1%) 500 82,1

Ifølge 5 12>5 5>° 7700(-4%) 290 90,0 32< opfin_ 25.0 9,3 7800(-2%) 0 100,0 . , ' ’ delsen | 100,0 53,0 7400(7,4%) 0 100,0 6.25 2,3 7750(3%) 490 82,5 Ifølge 12,5 10,1 7760(2,9%) 300 ' 89,3 opfin- 6 25,0 20,3 7700(3,6%) 0 100,0 32< delsen 100.0 101,5 7350(8,0%) 0 100,0 • ~ ' - * - , 1 1 " - * ' — — - !-'.....I - . ti .» — ......... - 6.25 3,9 -7700(3,6%) 510 81,8 Ifølge 7 12,5 12,1 7700(3,6%) 313 88,8 : 32< opfin- 25.0 25,9 7650(4,3%) 0 100,0 delsen 100.0 112,7 7400(7,4%) 0 100,0

Claims (3)

147145 Patentkrav. Analogifremgangsmåde til fremstilling af chlorambucilderivater med den almene formel: 5 O | >CH2CH2C1 3C <CH2)nOCCH2CH2CH2-^y_/

10 H3C CH2CH2C1 χσ RO 15 hvor R betegner et hydrogenatom eller en acylgruppe med 1-7 carbon-atomer, og n er 1 eller 2, kendetegnet ved, 1. at hydroxylgruppen i 17-stillingen af østradiol med formlen: 20 O H H3C . rrj χα ΗΌ 30 omsættes i et opløsningsmiddel med en forbindelse udvalgt fra gruppen af forbindelser, der har formlen: X(CH2)nC0°H eller x(CH2)nc°x 35 hvor n er 1 eller 2, og X er et halogenatom, hvorefter den herved dannede østradiolforbindelse i et opløsningsmiddel omsættes med car-boxylgruppen i chlorambucil med formlen: 147145 O II /C^CBjCl Ηθ“Η2ΟΒ2αΗ2-(Λ/ 5 \ (III) ch2ch2ci eller et metalsalt heraf til dannelse af forbindelsen: 10 O o .ch2ch2ci 3C (CH2) nOCCH2CH2CH2-^y^N/

15 H3C ^CH2CH2C1 (IV) 20 ii(j hvori hydroxylgruppen i 3-stillingen af østradioldelen af forbindelsen (IV) i et opløsningsmiddel derefter evt. acyleres med et syreanhydrid 25 R-O-R eller et syrehalogenid R-X, hvori R betegner en acylgruppe med 1-7 carbonatomer og X betegner et halogenatom til dannelse af forbindelsen: O o 30 /ch2ch2ci >c(CH2)noccH2CH2CH2 -CK H3C CH2CH2C1 RO 147U5 hvori R betegner en acylgruppe med 1-7 carbonatomer, og at forbindelsen IV eller V isoleres, eller 2. at hydroxylgruppen i 17-stillingen af acyleret østradiol med den 5 almene formel: OH·' H3C rh 10 - (vi) Xu RO hvori R betegner en acylgruppe med 1-7 carbonatomer, i et opløsnings-15 middel omsættes med eri forbindelse udvalgt fra gruppen af forbindelser, der har formlen: x(CH2)nC0°H eller X(CH2)nCOX hvor n er 1 eller 2, og X er et halogenatom, hvorefter den herved 20 dannede østradiolforbindelse i et opløsningsmiddel omsættes med car-boxylgruppen i chlorambucil med formlen (III) eller et metalsalt heraf til dannelse af forbindelsen (V), hvori R betegner en acylgruppe med 1-7 carbonatomer, og at forbindelse V isoleres, eller 3. at carboxylgruppen i chlorambucil med formlen (III) eller et 25 metalsalt heraf i et opløsningsmiddel omsættes med en forbindelse udvalgt fra gruppen af forbindelser, der har formlen: X(CH0) COOH eller ά n X(CH2)nC°X hvor n er 1 eller 2, og X er et halogenatom, hvorefter den herved 30 dannede halogenforbindelse i et opløsningsmiddel omsættes med hydroxylgruppen i 17-stillingen af: a) østradiol med formlen (II) til dannelse af forbindelsen med formlen (IV), hvori hydroxylgruppen i 3-stilingen af østradioldelen i et opløsningsmiddel derefter evt. acyleres med et syreanhydrid R-O-R 35 eller et syrehalogenid R-X, hvori R betegner en acylgruppe med 1-7 carbonatomer og X betegner et halogenatom til dannelse af forbindelsen (V), hvori R betegner en acylgruppe med 1-7 carbonatomer, eller