RU2014129736A

RU2014129736A - Система индикации на основе полноразмерного антитела для эукариотических клеток и ее применение

Info

Publication number: RU2014129736A
Application number: RU2014129736A
Authority: RU
Inventors: Петер Михель ХЮЛЬСМАНН; Хендрик НЁТГЕН
Original assignee: Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2016-02-20
Also published as: CA2854246A1; KR20140107295A; US20150038354A1; SG11201403445YA; BR112014013035A2; CN104011080B; RU2625033C2; WO2013092720A1; MX2014007262A; HK1200849A1; EP2794662A1; CN104011080A; JP2015503907A

Abstract

1. Способ отбора клетки, секретирующей биспецифическое антитело, включающий следующие этапы:(a) создание популяции эукариотических клеток путем трансдукции популяцией лентивирусных частиц, где каждая лентивирусная частица содержит бицистронную экспрессионную кассету, кодирующую секретируемое биспецифическое антитело, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен первой тяжелой цепи в локусе «замок» или «ключ» до EV71-IRES, и нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен второй тяжелой цепи в соответствующем другом локусе после EV71-IRES, где вариабельный домен первой тяжелой цепи связывается с первым антигеном, а второй вариабельный домен связывается со вторым антигеном, где первый антиген и второй антиген могут быть одинаковыми или разными, где эукариотическая клетка экспрессирует общую легкую цепь, и(b) отбор из популяции эукариотических клеток клетки в зависимости от свойств секретируемого полноразмерного биспецифического антитела.2. Способ по п. 1, который включает в качестве первого этапа один или более чем один из следующих этапов:- иммунизация трансгенного животного антигеном, представляющим интерес, где В-клетки экспериментального животного экспрессируют одну и ту же легкую цепь, и/или- отбор В-клеток иммунизированного экспериментального животного путем общей сортировки с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), и/или- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь каждой В-клетки, путем отдельной ПЦР-амплификации в двух отдельных/последовательных полимеразных цепных реакциях, встраивающих уникальные сайты рестрикции для направленного клонирования в шаттл-вектор/л

Claims

1. Способ отбора клетки, секретирующей биспецифическое антитело, включающий следующие этапы:

(a) создание популяции эукариотических клеток путем трансдукции популяцией лентивирусных частиц, где каждая лентивирусная частица содержит бицистронную экспрессионную кассету, кодирующую секретируемое биспецифическое антитело, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен первой тяжелой цепи в локусе «замок» или «ключ» до EV71-IRES, и нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен второй тяжелой цепи в соответствующем другом локусе после EV71-IRES, где вариабельный домен первой тяжелой цепи связывается с первым антигеном, а второй вариабельный домен связывается со вторым антигеном, где первый антиген и второй антиген могут быть одинаковыми или разными, где эукариотическая клетка экспрессирует общую легкую цепь, и

(b) отбор из популяции эукариотических клеток клетки в зависимости от свойств секретируемого полноразмерного биспецифического антитела.

2. Способ по п. 1, который включает в качестве первого этапа один или более чем один из следующих этапов:

- иммунизация трансгенного животного антигеном, представляющим интерес, где В-клетки экспериментального животного экспрессируют одну и ту же легкую цепь, и/или

- отбор В-клеток иммунизированного экспериментального животного путем общей сортировки с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), и/или

- получение нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь каждой В-клетки, путем отдельной ПЦР-амплификации в двух отдельных/последовательных полимеразных цепных реакциях, встраивающих уникальные сайты рестрикции для направленного клонирования в шаттл-вектор/лентивирусный экспрессионный вектор.

3. Способ по п. 2, который включает этап:

- проведения ПЦР нуклеиновой кислоты, кодирующей полную первую тяжелую цепь, и нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен второй тяжелой цепи (2,2 т.п.о.), включая EV71-IRES, и клонирование во второй шаттл-вектор без трансмембранного домена.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где бицистронные экспрессионные кассеты содержат в направлении от 5′- к 3′-

- промотор,

- первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь полноразмерного антитела,

- EV71-IRES,

- вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь полноразмерного антитела.

5. Способ по любому из пп. 1-3, где антитело является бивалентным биспецифическим антителом.

6. Способ по любому из пп. 1-3, где антитело специфически связывается с двумя различными антигенами или двумя эпитопами на одном и том же антигене.

7. Способ по любому из пп. 1-3, где первая тяжелая цепь полноразмерного антитела содержит мутацию типа «замок», а вторая тяжелая цепь антитела содержит мутацию типа «ключ».

8. Способ по любому из пп. 1-3, где полноразмерное антитело содержит константную область человеческого происхождения, в частности из человеческого иммуноглобулина класса lgG1, lgG2 или lgG4.

9. Способ по любому из пп. 1-3, где эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего или дрожжевой клеткой.

10. Способ по п. 9, где клетка млекопитающего является CHO-клеткой или HEK-клеткой.

11. Способ по п. 4, где нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь иммуноглобулина, содержит все экзоны и все, кроме одного, интроны геномно-организованного гена тяжелой цепи иммуноглобулина.

12. Способ по любому из пп. 1-3, где антитело является гуманизированным или человеческим антителом, в частности человеческим антителом.