CN104011080A - 用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途 - Google Patents

用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN104011080A
CN104011080A CN201280063751.7A CN201280063751A CN104011080A CN 104011080 A CN104011080 A CN 104011080A CN 201280063751 A CN201280063751 A CN 201280063751A CN 104011080 A CN104011080 A CN 104011080A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
antibody
coding
nucleic acid
library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201280063751.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104011080B (zh
Inventor
P·M·许尔斯曼
H·克内根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN104011080A publication Critical patent/CN104011080A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104011080B publication Critical patent/CN104011080B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种选择表达双特异性抗体的细胞的方法，所述方法包括步骤(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中所述细胞群体的每个细胞均展示由慢病毒核酸编码并且与两种或更多种抗原或相同抗原上的两个或更多个表位特异性结合的膜结合型全长抗体，和(b)根据展示的膜结合型全长抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞，其中慢病毒病毒粒子群体的每个慢病毒病毒粒子包含用于表达膜结合型抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含EV71-IRES。

Description

用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途
技术领域
本发明涉及单克隆抗体领域，特别地涉及编码这类抗体的核酸。本发明提供用于产生和选择真核细胞的方法，所述真核细胞表达并在其表面上展示能够特异性结合一种或多种目的抗原的抗体，特别地是全长单克隆抗体，特别是双特异性单克隆抗体。
发明背景
用于分离重组抗体的已知方法是噬菌体展示法(Hogenboom,MethodsMol.Biol.178(2002)1-37)、核糖体/mRNA展示法(Lipovsek和Plueckthun,J.Immunol.Method290(2004)51-67)和微生物细胞展示法(Boder和Wittrup,Nat.Biotechnol.15(1997)553-557)。
US2002/0123057中报道了基于哺乳动物细胞中痘苗病毒介导的完整抗体表达的筛选系统。另一种筛选系统基于哺乳动物细胞中抗体的细胞表面表达(Ho等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)9637-9642)。
噬菌体展示允许在单轮淘洗中筛选1012至1013个克隆(Barbas III等人，(编著)，Phage Display-A Laboratory manual，Cold Spring HabourPress，(2001))，而按照每个细胞一种抗体的模式，哺乳动物筛选程序的通量限于同时分析约106至107个克隆。
Higuchi等人描述了在COS细胞中的细胞展示(J.Immunol.Meth.202(1997)193-204)。Beerli等人报道了在BHK细胞中从抗原特异性B细胞产生的基于辛德毕斯病毒的scFv细胞表面展示文库(Proc.Natl.Acad.Sci.USA105(2008)14336-14341)。Ho和Pastan报道了采用HEK293细胞的方法(scFv)(Methods Mol.Biol.562(2009)99-113)。Alonso-Camino等人报道了淋巴细胞展示(PLoS One.4(2009)e7174)。Zhou等人报道了使用HEK293细胞的方法(Acta Biochim.Biophys.Sin.42(2010)575-584)。Zhou等人报道Flp-In系统(MAbs.2(2010)508-518)。
Taube,R.等人报道(PLOS One3(2008)e3181)人抗体在人细胞和慢病毒的病毒粒子的表面上的稳定表达。
在WO2007/047578中报道了抗体的细胞展示文库。
发明简述
已经发现，可以通过使用包含双顺反子表达盒的慢病毒病毒粒子，在真核细胞上表达并展示全长抗体。通过使用EV71的IRES(内部核糖体进入位点)元件，将所述元件连接抗体轻链和抗体重链的表达盒或两条抗体重链的表达盒，可以如本文中报道的，通过使用慢病毒病毒粒子在真核细胞上表达全长抗体。
在慢病毒载体中存在抗体轻链表达盒和抗体重链表达盒的情况下，抗体重链表达盒可以在编码C末端抗体结构域的外显子后包含非组成型剪接位点，从而提供除可溶性抗体重链外还表达膜结合型抗体重链的手段，导致膜结合型全长抗体的呈递。
在慢病毒载体中存在两个抗体重链表达盒的情况下，两个抗体重链表达盒或仅第二抗体重链表达盒可以在编码C末端抗体结构域的外显子后包含编码跨膜结构域的外显子，导致膜结合型全长抗体的呈递。
另外，本文提供用于产生并选择真核细胞的方法，所述真核细胞表达并在其表面上展示抗体、特别是全长单克隆抗体。
如本文中报道的，一个方面是包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-跨膜结构域或GPI-锚(GPI-anchor)。
如本文中报道的，该慢病毒载体是这样一种表达载体，它包含用于表达全长抗体轻链和全长抗体重链的双顺反子表达盒，其中分隔这两个表达盒的IRES是EV71-IRES。
已经发现，仅EV71-IRES可以用于在慢病毒表达系统中表达双顺反子表达盒中的全长抗体。
由于可剪接内含子的提供，可以从本文中报道的表达载体表达可溶性形式的抗体重链以及膜结合形式的抗体重链。
通过表达可溶性形式和膜结合形式的抗体重链，细胞一方面分泌可以例如在ELISA中测试的全长抗体，并且同时在其表面上呈递膜结合形式的全长抗体，后者可以用于细胞的选择，例如通过FACS选择，从而使得能够分离单细胞克隆。
如本文中报道的，一个方面是包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-跨膜结构域或GPI-锚。
如本文中报道的，该慢病毒载体是这样一种表达载体，它包含用于表达两种不同的全长抗体重链的双顺反子表达盒，其中分隔这两个表达盒的IRES是EV71-IRES。
通过表达膜结合形式的抗体重链，细胞在其表面上呈递膜结合形式的全长抗体，所述全长抗体可以用于选择细胞，例如通过FACS选择，从而使得能够分离单细胞克隆。
在一个实施方案中，抗体是与抗原特异性结合的抗体。因此，在一个实施方案中，抗体或编码抗体的核酸从已经基于与抗原的特异性结合而被选择的B-细胞中获得。
在一个实施方案中，抗体是双价单特异性抗体。在一个实施方案中，抗体与抗原特异性结合。
在一个实施方案中，抗体是双价双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。
在一个实施方案中，抗体是四价双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。
在一个实施方案中，表达载体是慢病毒(表达)载体。
如本文中报道的，一个方面是包含两个或更多个慢病毒颗粒的慢病毒载体文库，其中每个慢病毒颗粒都包含如本文中报道的表达载体，其中每个载体编码的抗体彼此相差至少一个氨基酸。
在一个实施方案中，载体文库由1,000至1,000,000个不同的表达载体组成。
在一个实施方案中，由载体文库的载体编码的抗体在抗体的可变域中差异至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，由载体文库的载体编码的抗体在抗体的一个CDR中差异至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，该CDR是重链CDR3。
如本文中报道的一个方面是，包含如本文中报道的双顺反子表达盒的真核细胞。在一个实施方案中，双顺反子表达盒已经转导至细胞中。
如本文中报道的一个方面是，包含两个或更多个真核细胞的真核细胞文库，每个细胞包含如本文中报道的双顺反子表达盒或载体，其中每个细胞表达的抗体彼此差异至少一个氨基酸。
在一个实施方案中，真核细胞文库由1,000至1,000,000个不同的哺乳动物细胞组成。
在一个实施方案中，由真核细胞文库的细胞表达的抗体在抗体的可变域中差异至少一个氨基酸残基。
在一个实施方案中，由真核细胞文库的真核细胞表达的抗体在抗体的一个CDR中差异至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，该CDR是重链CDR3。
如本文中报道的一个方面是，包含如本文中报道的载体文库的真核细胞文库。
在一个实施方案中，真核细胞文库的真核细胞表达并展示单一抗体。
在一个实施方案中，真核细胞文库的真核细胞展示单一抗体。
在一个实施方案中，真核细胞文库是表达抗体文库的真核细胞群体，其中编码核酸来源自经免疫动物的B细胞。在一个实施方案中，将B细胞就其对目的抗原的特异性进行预先选择。
在一个实施方案中，真核细胞文库是真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的全长抗体的第一表达盒和编码与第二抗原特异性结合的全长抗体的第二表达盒。
在一个实施方案中，真核细胞文库是真核细胞群体，其中每个细胞均包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒编码与第一抗原结合的第一全长抗体轻链和第一全长抗体重链，所述第二表达盒编码与第二抗原特异性结合的第二全长抗体轻链和第二全长抗体重链。
在一个实施方案中，真核细胞文库是真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的第一全长抗体重链和与第二抗原特异性结合的第二全长抗体重链的表达盒，其中真核细胞表达共同轻链。
在一个实施方案中，第一全长抗体重链包含穴(hole)突变并且第二抗体重链包含结(knob)突变。
在一个实施方案中，第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
在一个实施方案中，通过随机化亲本表达载体的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基，获得表达载体文库。
在一个实施方案中，表达载体文库通过组合两个不同的半抗体获得。
如本文中报道的一个方面是，一种用于分离或选择抗体的方法，所述抗体与一种或多种目的抗原、特别两种目的抗原特异性结合。
已经发现，本文中报道的筛选方法可以按“每个细胞一种抗体”的模式进行，这是有利的，原因是它允许在单一一轮选择中完成筛选。
本文中报道了一种产生、选择和/或分离细胞的方法，其中所述细胞表达与抗原特异性结合的抗体。
在一个实施方案中，抗体是单克隆全长抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性单克隆全长抗体。
如本文中报道的方法允许从选择的细胞中克隆抗体可变区或完整抗体。
如本文中报道的一个方面是，重组产生用如本文中报道的方法选择的抗体的方法。
在一个实施方案中，全长抗体包含人源恒定区，特别地是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
如本文中报道的方法允许以完全物种特异性的形式、特别是全人抗体的形式，重组产生具有期望特异性的抗体。
如本文中报道的一个方面是，一种选择表达与目的抗原特异性结合的抗体的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)任选地，从B细胞群体选择分泌特异性结合一种或多种抗原的抗体的B细胞亚群或单一B细胞或B细胞克隆群体，
(b)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员都编码特异性结合一种或多种抗原的抗体(一种或多种)的变体，
(i)产生多重DNA分子，其中所述产生包括扩增来自B细胞亚群的DNA分子汇集物的步骤、或从编码与一种或两种目的抗原特异性结合的单一抗体的DNA通过随机化编码核酸序列而产生DNA分子文库的步骤，和
(ii)将该多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链；
(c)用每个病毒粒子都包含慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体转导真核细胞群体；
(d)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(e)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合目的抗原(一种或多种)或其片段或抗原决定簇的能力，选择细胞。
如本文中报道的一个方面是，一种选择表达双特异性抗体(其与两种目的抗原特异性结合)的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员均编码双特异性抗体的变体，
(i)从编码单一双特异性抗体的DNA，通过随机化该编码核酸序列，产生多重DNA分子，和
(ii)将该多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于以膜结合形式表达全长双特异性抗体；
(b)用每个病毒粒子都包含慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体，转导真核细胞群体；
(c)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(d)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合所述目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力，选择细胞。
慢病毒表达文库与包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒的慢病毒表达载体的组合使用使得可以实现高筛选效率，其中所述双顺反子表达盒用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链。
在一个实施方案中，本发明方法包括产生编码抗体的多重DNA分子，所述产生多重DNA分子包括步骤：
(1)从B细胞亚群，扩增编码重链可变区(HCVR)的DNA分子的第一汇集物；并且
(2)从B细胞亚群，扩增编码轻链可变区(LCVR)的DNA分子的第二汇集物；
(3)将编码LCVR的多重DNA分子和编码HCVR的多重DNA分子的组合克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于同时以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
在一个实施方案中，本发明方法包括产生编码抗体的多重DNA分子，其中所述抗体与一种或两种目的抗原特异性结合，所述产生多重DNA分子包括步骤：
(1)从单一B细胞或B细胞克隆群体，扩增编码HCVR的DNA分子和编码LCVR的DNA分子，和
(2)通过随机化至少一个密码子，将编码HCVR的DNA分子和/或编码LCVR的DNA分子进行随机化，从而产生编码HCVR的多重DNA分子和编码LCVR的多重DNA分子；
(3)将随机化的编码LCVR的多重DNA分子和编码HCVR的多重DNA分子的组合克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于同时以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
在一个实施方案中，本发明方法包括产生慢病毒表达文库，所述产生包括步骤：
(i)产生编码抗体的多重DNA分子，所述产生包括步骤：
(1)从B细胞亚群分离mRNA；
(2)将mRNA转录成cDNA；
(3)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；和
(4)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；
(ii)将第一DNA分子汇集物和第二DNA分子汇集物的DNA分子对，克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于同时以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链。
在一个实施方案中，本发明方法包括产生慢病毒表达文库，所述产生包括步骤：
(i)产生编码与一种或两种抗原特异性结合的抗体的多重DNA分子，所述产生包括步骤：
(1)从单一B细胞或B细胞克隆群体，分离mRNA；
(2)将mRNA转录成cDNA；
(3)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(4)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(5)随机化第一和/或第二DNA分子，由此产生第一DNA分子汇集物和第二DNA分子汇集物，
(ii)将第一和第二DNA分子汇集物的DNA分子对，克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述表达盒用于同时以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链。
如本文中报道的一个方面是，一种选择表达双特异性抗体(其与两种目的抗原特异性结合)的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员均编码双特异性抗体的重链的变体，
(i)从编码单一双特异性抗体的重链的DNA，通过编码核酸序列的随机化，产生多重DNA分子，和
(ii)将多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体中，所述慢病毒表达载体包含用于表达双特异性抗体的两条重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，其中位于EV71-IRES下游的核酸编码带有C末端跨膜结构域的抗体重链；
(b)用每个病毒粒子均包含慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体，转导表达抗体轻链的真核细胞群体，其中所述抗体轻链可以与任何所述抗体重链形成抗原结合位点；
(c)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(d)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力，选择所述细胞。
如本文中报道的一个方面是，一种在真核细胞的表面上展示全长抗体的慢病毒表达载体。
在一个实施方案中，该表达载体包含编码信号肽、EV71-IRES、跨膜区和任选地检测标签的DNA元件。
在一个实施方案中，该表达载体包含允许将全长抗体重链和全长抗体轻链的DNA分子克隆、尤其定向特异性克隆至表达载体中的限制性位点。
如本文中报道的一个方面是，一种包含如本文中报道的表达载体的表达文库。
如本文中报道的一个方面是，一种包含如本文中报道的表达载体或包含如本文中报道的表达文库的至少一个成员的真核细胞。
通过如本文中报道的方法产生的单克隆抗体可以用于研究目的、诊断目的或疾病的治疗。
在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
如本文中报道的一个方面是，一种选择表达抗体的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中细胞群体的每个细胞均展示由慢病毒核酸编码并且与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合的膜结合型全长抗体，和
(b)根据展示的膜结合型全长抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞，
其中所述慢病毒病毒粒子群体中的每个慢病毒病毒粒子都包含用于表达膜结合型抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含EV71-IRES。
在一个实施方案中，慢病毒病毒粒子群体中的每个慢病毒病毒粒子的双顺反子表达盒各编码亲本抗体的不同变体，所述亲本抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合。
在一个实施方案中，双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-跨膜结构域或GPI-锚。
在一个实施方案中，真核细胞群体的每个细胞均展示膜结合型全长抗体并且分泌全长抗体。
在一个实施方案中，真核细胞群体的每个细胞均展示并且分泌单一全长抗体。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是，一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-用于同时产生膜结合型抗体和分泌型抗体的可变剪接内含子，和
-跨膜结构域或GPI-锚。
如本文中报道的一个方面是，一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-以5'至3'方向编码第二全长抗体重链和跨膜结构域或GPI-锚的第二核酸。
如本文中报道的一个方面是，根据先前方面的慢病毒载体的用途，用于产生展示并分泌全长抗体或展示全长抗体的真核细胞群体。
如本文中报道的一个方面是，选择表达双特异性抗体的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含位于EV71-IRES上游的以穴基因座(hole locus)或结基因座(knob locus)编码第一重链可变域的核酸和位于EV71-IRES下游的以相应的另一基因座编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以是相同或不同的，其中真核细胞表达共同轻链，其中重链之一或二者还在其C末端包含跨膜结构域，并且
(b)根据展示的膜结合型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
在一个实施方案中，仅EV71-IRES下游的重链在其C末端包含跨膜结构域。
如本文中报道的一个方面是，选择分泌双特异性抗体的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含编码分泌型双特异性抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-IRES上游以穴基因座或结基因座编码第一重链可变域的核酸和在EV71-IRES下游以相应另一基因座编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，第一抗原和第二抗原可以是相同或不同的，其中真核细胞表达共同轻链，
(b)根据分泌型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
在一个实施方案中，该方法包括以下作为第一步骤：
-用目的抗原免疫转基因动物，其中该实验动物的B细胞表达相同的轻链。
在一个实施方案中，该方法包括步骤：
-通过FACS进行大批分选(bulk sorting)，选择该经免疫的实验动物的B细胞。
在一个实施方案中，该方法包括步骤：
-采用两个分开的/相继的聚合酶链反应，通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，其中所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体。
在一个实施方案中，该方法包括步骤：
-对编码完整第一重链的核酸和包含EV71-IRES的编码第二重链可变域的核酸(2.2kbp)进行PCR并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体，其中通过限制性切割和再连接载体，移除第一重链的跨膜结构域。
如本文中报道的全部实施方案应当涉及本发明的全部方面，并且可以按任何可能的组合方式进行组合。
发明详述
本文中报道了一种通过使用全长抗体在其天然环境(即哺乳动物细胞的分泌途径)中表达的选择方法，其中所述天然环境确保正常情况下参与抗体合成和加工(折叠、二硫键形成、糖基化等)的所有细胞组分均可以以生理形式和浓度而获得。
一般方面
如本领域技术人员已知，使用重组DNA技使得可以产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如在一个单一或几个位置通过置换、改变、交换、缺失或插入而被修饰。修饰或衍生可以例如借助位点定向诱变实施。这类修饰可以由本领域技术人员容易地实施(见例如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,USA(1999))。重组技术的使用使得本领域技术人员可以用异源核酸转化各种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)装置使用相同的元件，但是属于不同物种的细胞可能具有例如不同的密码子选择。其中，相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由不同的核酸编码。此外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
使用重组DNA技使得可以产生核酸和/或多肽的许多衍生物。这类衍生物可以例如在一个单一或几个位置通过置换、改变、交换、缺失或插入而修饰。修饰或衍生可以例如借助位点定向诱变实施。这类修饰可以由本领域技术人员容易地实施(见例如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999))；Hames,B.D.和Higgins,S.J.,Nucleic acid hybridization-apractical approach,IRL Press,Oxford,England(1985))。
重组技术的使用使得可以用异源核酸转化各种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表达)装置使用相同的元件，但是属于不同物种的细胞可能具有例如不同的密码子选择。因而，相同的多肽(就氨基酸序列而言)可以由不同的核酸编码。此外，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。
定义
“亲和力成熟的”抗体指，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，相比不具有所述改变的亲本抗体，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
本文中的术语“抗体”以最广意义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。
抗体的“类别”指由其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。存在抗体的5个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“表达”指细胞内部发生的转录和/或翻译过程。细胞中目的核酸序列的转录水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量确定。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过RT-PCR或通过RNA印迹杂交定量(见Sambrook等人，1999，上引文)。由目的核酸编码的多肽可以通过各种方法定量，例如通过ELISA、通过测定多肽的生物活性的试验，或通过与该活性无关的测定法、使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白进行，如蛋白质印迹法或放射免疫测定(见Sambrook等人，1999，上文)。
“表达盒”指含有为了在细胞中至少表达所含核酸而必需的调节元件(如启动子和多聚腺苷化位点)的构建体。
“表达载体”是一种核酸，其提供在细胞中表达所包含结构基因所要求的全部元件。一般，表达质粒包括原核质粒扩增单元(例如针对大肠杆菌，包括复制起点，和选择标记)、真核选择标记、以及一个或多个用于表达目的结构基因(一个或多个)的表达盒，所述表达盒各自包含启动子、结构基因和包含多聚腺苷化信号的转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制下，并且将这种结构基因称作与该启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子是有效连接的。
术语“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242中所述的EU编号体系，也称作EU Index。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR通常由4个FR结构域：FR1、FR2、FR3和FR4组成。因此，HVR序列和FR序列通常按以下顺序在VH(或VL)中出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
“基因”指这样的核酸，其是例如染色体上或质粒上可能影响肽、多肽或蛋白质表达的区段。除编码区(即结构基因)之外，基因包含其他功能性元件，例如信号序列、启动子(一个或多个)、内含子和/或终止子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可以互换使用并且指已经向其中引入了外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，包括原代转化的细胞和源自其的子代，无论传代次数是多少。子代可以在核酸内容方面不完全与亲本细胞相同，而是可以含有突变。本发明涵盖突变子代，所述突变子代具有与针对最初转化细胞所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性。
“人抗体”是具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源产生的抗体的氨基酸序列。人抗体定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体包含至少1个、并且一般2个可变域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如CDR)与非人抗体的那些HVR对应，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的至少部分抗体恒定区。抗体，例如，非人抗体，的“人源化形式”指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中的如下每个区域，所述区域在序列上高变和/或形成结构上确定的环(“高变环”)。通常，天然的4链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在第24-34氨基酸残基处(L1)、第50-56氨基酸残基(L2)、第89-97氨基酸残基(L3)、第31-35B氨基酸残基(H1)、第50-65氨基酸残基(H2)和第95-102氨基酸残基处(H3)(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242)。除了VH中的CDR1以外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，这些残基是接触抗原的残基。SDR包含在称为缩简-CDR或a-CDR的CDR区域中。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在第31-34氨基酸残基处(L1)、第50-55氨基酸残基(L2)、第89-96氨基酸残基(L3)、第31-35B氨基酸残基(H1)、第50-58氨基酸残基(H2)和第95-102氨基酸残基处(H3)(Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另外说明，否则HVR残基和可变域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人的上引文编号。
“内部核糖体进入位点”或“IRES”描述这样一种序列，所述序列独立于IRES5'的基因而功能性地促进翻译起始，并且允许两个顺反子(可读框)在动物细胞中从单一转录物翻译。IRES为紧邻其下游的可读框的翻译(下游在本文中与3'可互换地使用)提供独立的核糖体进入位点。不同于可以是多顺反子(即，编码从mRNA依次翻译的几种不同多肽)的细菌mRNA，动物细胞的大部分mRNA是单顺反子，编码仅一种蛋白质的合成。在真核细胞中采用多顺反子转录物时，翻译将从最靠5'的翻译起始位点起始，终止于第一终止密码子处，并且转录物将从核糖体释放，导致仅翻译mRNA中的第一个编码多肽。在真核细胞中，在转录物中具有与第二可读框或后续可读框有效连接的IRES的多顺反子转录物允许相继翻译所述下游可读框，以产生由该同一个转录物编码的该两种或更多种多肽。先前已经描述IRES元件在载体构建中的应用，例如，见Pelletier,J.等人,Nature334(1988)320-325；Jang,S.K.等人,J.Virol.63(1989)1651-1660；Davies,M.V.等人,J.Virol.66(1992)1924-1932；Adam,M.A.等人,J.Virol.65(1991)4985-4990；Morgan,R.A.等人Nucl.Acids Res.20(1992)1293-1299；Sugimoto,Y.等人,Biotechnology12(1994)694-698；Ramesh,N.等人,Nucl.Acids Res.24(1996)2697-2700；和Mosser,D.D.等人,BioTechniques22(1997)150-152)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了通常以微量存在的可能变体抗体外，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，其中所述变体抗体例如含有天然存在的突变或出现在产生单克隆抗体制备物的期间。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，而不应将其解释为需要通过任何特殊方法产生该抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过各种技术产生，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制造单克隆抗体的这些方法和其他示例性方法在本文中描述。
如本文所用，“核酸”指由核苷酸(也称作碱基)a、c、g和t(或在RNA中u)组成的聚合物分子，例如指DNA、RNA或其修饰物。多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子、或合成性多核苷酸分子、或一个或多个天然存在的多核苷酸分子与一个或多个合成性多核苷酸分子的组合。该定义还涵盖：其中改变(例如通过诱变)、缺失或添加了一个或多个核苷酸的天然存在的多核苷酸分子。核酸可以是分离的，或整合在另一个核酸中，例如整合在表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸同样以由核苷酸组成的其核酸序列来表征。
对于本领域技术人员而言，将例如多肽的氨基酸序列转换成编码这种氨基酸序列的相应核酸序列的程序和方法是熟知。因此，核酸可以以由核苷酸组成的其核酸序列来表征，并且同样地可以以其所编码的多肽的氨基酸序列来表征。
如本文所用，“核酸”还指天然存在的、或部分或全部非天然存在的、编码多肽的核酸，其中所述多肽可以重组产生。核酸可以从分离的或通过化学手段合成的DNA片段制成。核酸可以整合至另一个核酸中，例如整合在真核宿主细胞的表达质粒或基因组/染色体中。质粒包括穿梭质粒和表达质粒。一般，该质粒也包含原核扩增单元，所述单元包含复制起点(例如ColE1复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性基因)分别用于原核生物中复制和选择质粒。
“有效连接”指两个或更多个组件的并置，其中如此描述的组件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子顺式发挥作用以控制或调节所连接的编码序列的转录，则启动子和/或增强子与编码序列有效连接。通常但不必然地，“有效连接”的DNA序列是相邻的，以及在需要连接两个蛋白质编码区如分泌性前导序列和多肽的情况下，是相邻且符合读框的。然而，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但是它不一定与编码序列相邻。增强子无需是相邻的。如果增强子增加编码序列的转录，则增强子与编码序列有效连接。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、其内部或下游，并且离启动子相当距离。如果多聚腺苷化位点位于编码序列的下游端处，从而转录可以通过编码序列行进至多聚腺苷化序列中，则多聚腺苷化位点与编码序列有效连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游端(3'末端)处，从而转录可以通过编码序列行进至该终止密码子并在此终止，则翻译终止密码子与该外显子核酸序列有效连接。连接可以通过本领域已知的重组方法实现，例如，使用PCR方法学和/或通过在便利的限制性位点连接。如果便利的限制性位点不存在，则可以根据常规操作，使用合成性寡核苷酸衔接子或接头。
“多顺反子转录单位”是其中一个以上结构基因处于相同启动子控制下的转录单位。
如本申请使用的术语“多聚腺苷化信号”(polyA信号)指，用来引起特定核酸序列区段的初级转录物断裂和多聚腺苷化的核酸序列。包含多聚腺苷化信号的3'非翻译区可以选自：源自SV40、牛生长激素(bGH)基因、免疫球蛋白基因和胸苷激酶基因(tk，例如单纯疱疹胸苷激酶多聚腺苷化信号)的、包含多聚腺苷化信号的3'非翻译区。
“启动子”指控制与它有效连接的基因/结构基因或核酸序列的转录的多核苷酸序列。启动子包括RNA聚合酶结合和转录启动的信号。所用的启动子在待考虑表达所选序列的宿主细胞的细胞类型中将是功能性的。本领域熟知(并且在数据库如GenBank中标识)许多启动子，包括来自各种不同来源的组成型、诱导型和阻遏型启动子，其可以原样或在克隆的多核苷酸中获得(例如，来自保藏机构如ATCC以及其他商业来源或个人来源)。
“启动子”包含指导结构基因转录的核苷酸序列。一般，启动子位于基因的5'非编码或非翻译区内，临近于结构基因的转录起始位点。启动子内在转录起始方面发挥作用的序列元件经常以共有核苷酸序列来表征。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSEs；McGehee,R.E.等人,Mol.Endocrinol.7(1993)551)、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman,R.,Seminars inCancer Biol.1(1990)47)、糖皮质激素应答元件(GRE)和其他转录因子的结合位点，如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.等人,J.Biol.Chem.267(1992)19938)、AP2(Ye,J.等人,J.Biol.Chem.269(1994)25728)、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253)和八聚体因子(通常，见Watson等人，(编著)，Molecular Biology of the Gene,第4版(The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.(1987))，以及Lemaigre,F.P.和Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14)。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应于诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，转录速率不受诱导剂调节。阻遏型启动子也是已知的。例如，一旦生长激素与其在细胞表面上的受体结合，则特异性激活c-fos启动子。可以通过例如由CMV启动子后接两个Tet操纵基因位点组成的人工杂合启动子，实现四环素(tet)调节的表达。Tet-阻遏蛋白与两个Tet-操纵基因位点结合并阻断转录。一旦添加诱导物四环素，则Tet-阻遏蛋白从Tet-操纵基因位点释放，转录进行(Gossen,M.和Bujard,H.,PNAS89(1992)5547-5551)。关于其他诱导型启动子，包括金属硫蛋白启动子和热休克启动子，例如，见Sambrook等人(上引文)和Gossen等人,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已经鉴定为强启动子用于高水平表达的真核启动子有：例如SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子，小鼠金属硫蛋白-I启动子、罗氏肉瘤病毒长末端重复序列、中国仓鼠延伸因子1α(CHEF-1，见例如US5,888,809)，人EF-1α、遍在蛋白和人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV IE)。
“启动子”可以是组成型或诱导型的。增强子(即，作用于启动子以增加转录的顺式作用DNA元件)可能需要与启动子联合来发挥功能，以增加单独采用启动子时所获得的表达水平，并且其可以纳入为转录调节元件。经常地，含有启动子的多核苷酸区段也包括增强子序列(例如，CMV或SV40)。
术语“转录终止子”指50-750个碱基对长度的DNA序列，所述DNA序列向RNA聚合酶提供mRNA合成终止的信号。为了防止RNA聚合酶通读，特别是在使用强启动子时，在表达盒3'末端的非常高效(强)的终止子是可取的。低效的转录终止子可能导致操纵子样mRNA形成，这可能是不想要的(例如质粒编码的)基因表达的原因。
在本发明的范围内，可以用本领域已知的基本上任何类型的转染方法获得转染的细胞。例如，核酸可以借助电穿孔法或微量注射法引入细胞中。备选地，可以使用脂转染试剂如FuGENE6(Roche Diagnostics GmbH，德国)、X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH，德国)和LipofectAmine(Invitrogen Corp.，美国)。再备选地，核酸可以通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒的适宜病毒载体系统，引入细胞中(Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)5313-5314)。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变域通常具有相似的结构，每个结构域包含4个保守的构架区(FR)和3个高变区(HVR)(例如，见Kindt,T.J.等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补性VL或VH结构域文库进行分离(例如，见Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628)。
术语“载体”指能够扩增与之连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体、以及在已引入了所述载体的宿主细胞中并入该宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
术语“动物”指包含能够产生抗体的免疫系统的生物。在一个实施方案中，动物选自鱼类、两栖类、鸟类、爬行类和哺乳动物，特别地是偶蹄类、啮齿类和灵长类。在一个实施方案中，动物选自羊、麋鹿、鹿、驴、骡鹿、貂、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、仓鼠、豚鼠和小鼠。在一个实施方案中，动物是小鼠、大鼠或灵长类。在一个实施方案中，动物是非人灵长类或人类。在一个实施方案中，动物是具有人免疫球蛋白基因座的转基因动物。
轻链可变区(LCVR)由来自相应动物种系基因的重排核酸分子编码。轻链可变区是κLCVR或λLCVR。
在一个实施方案中，轻链可变区是人κLCVR。在一个实施方案中，轻链可变区是由如下核酸(DNA)编码的轻链可变区，其中可以使用SEQ IDNO:12至18中一者或多者与SEQ ID NO:19的引物组合和实施例11中所述的PCR条件，从人B细胞或具有人免疫球蛋白基因座的转基因动物的B细胞，扩增所述核酸。
在一个实施方案中，轻链可变区是人λLCVR。在一个实施方案中，轻链可变区是由如下核酸(DNA)编码的可变区，其中可以使用SEQ ID NO:20至27中一者或多者与SEQ ID NO:28的引物组合和实施例11中所述的PCR条件，从人B细胞或包含人免疫球蛋白基因座的转基因动物的B细胞，扩增所述核酸。
重链可变区(HCVR)由来自相应动物的种系基因的重排核酸分子编码。在一个实施方案中，重链可变区是人重链可变区。在一个实施方案中，重链可变区是由如下核酸(DNA)编码的重链可变区，其中可以使用SEQ IDNO:1至4中一者或多者与SEQ ID NO:5的引物组合和实施例11中所述的PCR条件，从人B细胞或包含人免疫球蛋白基因座的转基因动物的B细胞，扩增出所述核酸。
重链可变区(HCVR)由来自相应动物的种系基因的重排核酸分子编码。在一个实施方案中，重链可变区是人重链可变区。在一个实施方案中，重链可变区是由如下核酸(DNA)编码的重链可变区，其中可以使用SEQ IDNO:6至10中一者或多者与SEQ ID NO:11的引物组合和实施例11中所述的PCR条件，从人B细胞或包含人免疫球蛋白基因座的转基因动物的B细胞，扩增出所述核酸。
抗体
本文提供的方法用于产生重组单克隆抗体。抗体可以具有各种结构，如但不限于单特异性抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单价抗体和多价抗体(例如双价抗体)。
在某些实施方案中，抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在US4,816,567；和Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如、源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中该抗体的类别或亚类已经自亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般，将非人抗体人源化以减少针对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)源自非人抗体并且FR(或其部分)源自人抗体序列的一个或多个可变域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基替换，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法在例如Almagro，JAlmagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并且例如在Riechmann,I.等人,Nature332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；US5,821,337、US7,527,791、US6,982,321和US7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua,W.F.等人,Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn,J.等人,Methods36(2005)61-68以及Klimka,A.等人,Br.J.Cancer83(2000)252-260(描述FR改组的“导向选择”方案)中进一步描述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”方法选择的构架区(例如，见Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308)；从特定亚组的人抗体的轻链可变区或重链可变区的共有序列衍生的构架区(例如，见Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(例如，见Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和得自FR文库筛选的构架区(例如，见Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
在某些实施方案中，抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般地描述在van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374以及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分，其替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125并且例如还见描述XENOMOUSETM技术的US6,075,181和US6,150,584；描述技术的US5,770,429；描述K-M技术的US7,041,870；和描述技术的US2007/0061900。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以由基于杂交瘤的方法产生。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系(例如，见Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.等人,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),第51-63页；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。还在Li,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)3557-3562中描述了借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。额外的方法包括例如在US7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,J.,Xiandai Mianyixue26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。在Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Histology和Histopathology20(2005)927-937和Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology27(2005)185-191中也描述了人杂交瘤技术(三体瘤技术(Trioma technology))。
也可以通过分离从人源噬菌体展示文库选出的Fv克隆可变域序列，产生人抗体。此可变域序列随后可以与期望的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
可以通过对组合文库筛选具有所需活性(一种或多种)的抗体，进行抗体分离。例如，本领域已知多种方法可以用于产生噬菌体展示文库并在这类文库中筛选具有所需结合特征的抗体。这类方法例如在H.R.等人,Methods Mol.Biol.178(2002)1-37中综述，并且例如进一步描述在McCafferty,J.等人,Nature348(1990)552-554；Clackson,T.等人,Nature352(1991)624-628；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.和Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology248(2003)161-175；Sidhu,S.S.等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；和Lee,C.V.等人,J.Immunol.Methods284(2004)119-132中。
在某些噬菌体展示法中，VH基因库和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，随后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合性噬菌体，如Winter,G.等人,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述。噬菌体一般展示抗体片段，以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式。不要求构建杂交瘤，来自经免疫源的文库可以提供针对免疫原的高亲和力抗体。备选地，不作任何免疫，可以(例如，从人)克隆幼稚库，以提供单一来源的针对广泛的非自身抗原以及自身抗原的抗体，如Griffiths,A.D.等人,EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，也可以通过如下方式合成地产生幼稚文库:从干细胞克隆未重排的V-基因区段，使用含有随机序列的PCR引物，以编码高度可变的CDR3区并体外实现重排，如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开例如包括US5,750,373和US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936及US2009/0002360。
本文中，从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为人抗体或人抗体片段。
在某些实施方案中，抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性针对第一抗原并且另一种结合特异性针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与相同抗原的两个不同表位结合。双特异性抗体也可以用来使细胞毒药物定位于表达该抗原的细胞。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于：重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540,WO93/08829，和Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)；和“结入穴”(knob-in-hole)工程化(例如，见US5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，见US4,676,980，和Brennan,M.等人，Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，见Kostelny,S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，见Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，见Gruber,M.等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt,A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69)中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(见，例如US2006/0025576)。
抗体或片段也可以是多特异性抗体，如WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792或WO2010/145793中所述。
方法
在某些实施方案中，在此提供的方法用来改变，即增加或减少，抗体被糖基化的程度。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之结合的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的二天线型寡糖，所述寡糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297(例如，见Wright,A.和Morrison,S.L.,TIBTECH15(1997)26-32)。该寡糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与二天线型寡糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生具有某些改善特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供的方法导致抗体产生，所述抗体具有与Fc区(直接或间接)结合的缺少岩藻糖的糖结构。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：如通过MALDI-TOF质谱法所测量的，相对于与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算在Asn297的糖链内的岩藻糖的平均量，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约297位置的天冬酰胺残基(根据Kabat的Fc区残基EU编号)；然而，因抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于297位置上游或下游约±3个氨基酸的位置，即，位置294和300之间。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能(例如，见US2003/0157108；US2004/0093621)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括：在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；和WO2004/056312，特别实施例11)；和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(例如，见Yamane-Ohnukii,N等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO2003/085107)。
在某些实施方案中，提供的方法可以用来产生具有平分型(bisected)寡糖的抗体，例如，其中与抗体Fc区连接的二天线型寡糖被GlcNAc平分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO2003/011878；US6,602,684；和US2005/0123546中描述。也可以产生在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO1997/30087；WO1998/58964；和WO1999/22764中描述。
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如US4,816,567中所述。核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含该核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含该核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化了)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)包含编码含有抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体、和包含编码含有抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0)或人胚肾细胞(HEK293)。在一个实施方案中，提供一种产生抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
为重组产生抗体，分离编码抗体的核酸，并插入一个或多个载体以便进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离该核酸，并将其测序。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，尤其当不需要糖基化和Fc区效应子功能时。对于细菌中表达抗体片段和多肽，例如，见US5,648,237、US5,789,199和US5,840,523；还见Charlton,K.A.,引自：Methods inMolecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.。(编著)，Humana Press,Totowa,NJ(2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段。在表达后，抗体可以从细菌细胞糊状物中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体(见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还可以源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定可以与昆虫细胞联合使用的许多杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主(例如，见US5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978和US6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如在例如Graham,F.L.等人，J.GenVirol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤(MMT060562)；如在例如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞；MRC5细胞；和FS4细胞。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR阴性(DHFR(-))CHO细胞((Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，例如，见Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编著),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
本发明的具体实施方案
本文中报道了用于选择表达具有所需特异性的抗体的细胞的方法以及用于产生这类抗体的方法。
虽然可以用各种筛选方法鉴定抗体，但是后续在生产规模的开发可能受阻于蛋白质表达限制、不正确折叠和/或不正确的翻译后修饰以及不正确的抗体装配，如同型二聚体形成。
与抗原结合片段相反，全长抗体具有几种额外特征，如延长的血清半寿期(与数小时或数日相比，数周)、支持次级免疫功能，如ADCC、CDC、FcRn结合
在一个实施方案中，抗体与一种目的抗原特异性结合。
在一个实施方案中，抗体与两种不同抗原特异性结合或与相同抗原上两个不同的非重叠表位结合。
通常，目的抗原是蛋白质抗原、非蛋白质抗原、或半抗原。在一个实施方案中，目的抗原选自(a)微生物抗原或病原体抗原、(b)肿瘤抗原、(c)自身抗原和(d)变应原。
肿瘤抗原是与肿瘤或癌症相关并且可以由抗体结合的化合物，如肽。肿瘤抗原可以通过如下方式制备：从癌细胞制备癌细胞的粗提物(例如，如Cohen等人，Cancer Research,54(1994)1055中所述)，或通过部分纯化抗原、通过重组技术、或通过从头合成已知的抗原。肿瘤抗原包括完整肿瘤或癌症多肽抗原的抗原性部分或完整肿瘤或癌症多肽抗原。这类抗原可以重组地或通过本领域已知的任何其他手段分离或制备。癌症或肿瘤包括但不限于胆管癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；表皮内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌，以及其他癌和肉瘤。
术语“抗原决定簇”指由B-淋巴细胞特异性识别的抗原部分。B-淋巴细胞通过产生抗体响应于外来抗原决定簇。
就展示在哺乳动物细胞上的抗体而言，结合抗原的特异性在一个实施方案中以基本上如本文实施例12中所述的荧光测定法确定，其中荧光信号的强度与展示抗体的细胞所结合的抗原的量相关。当荧光信号的强度高于针对对照细胞检测到的信号时，将哺乳动物细胞上展示的抗体视为特异性结合抗原的抗体。在一个实施方案中，信号至少两倍于对照细胞的信号。
术语“表达文库”指相同类型的多重表达载体，其中每个表达载体各表达不同的抗体。在一个实施方案中，表达文库是病毒表达文库。在一个实施方案中，表达文库是慢病毒表达文库。
术语“感染复数”(MOI)指在病毒表达文库、尤其慢病毒表达文库中感染性病毒粒子的数目和暴露于病毒的细胞的数目之间的比率。
本文中报道了一种产生、选择和/或分离表达具有所需特异性的抗体的细胞的方法。
更详细地，该方法包括：
提供编码全长抗体的核酸
在一个实施方案中，就其特异性结合目的抗原的能力进行B细胞选择，从分离的B细胞群体中选出B细胞亚群，以获得核酸。
在一个实施方案中，通过就其特异性结合一种或两种目的抗原的能力进行B细胞选择，从分离的B细胞群体选出单一B细胞，以获得核酸。
在一个实施方案中，该单一B细胞是B细胞克隆群体。
在一个实施方案中，所述核酸通过如下方式获得：从单一B细胞或B细胞克隆群体的分离mRNA扩增编码可变域的核酸，并且将扩增的mRNA转录成cDNA。
产生慢病毒表达文库
如本文中报道并且在如本文中报道的方法中使用的慢病毒表达载体是包含用于以可溶性形式和膜结合型形式表达全长抗体的双顺反子表达盒的载体。通过同时提供可溶性形式和膜结合型形式的抗体，可以基于表面呈递的抗体选择表达抗体的细胞，并且可以通过使用分泌型抗体，对抗体测试例如其结合特异性。
已经发现，为了在哺乳动物细胞上表达和展示全长抗体，需要使用双顺反子表达构建体，所述双顺反子表达构建体还包含可剪接核酸以便从同一个表达盒表达可溶性形式和膜结合型形式。
为了有效包装在病毒粒子中，慢病毒表达载体的尺寸受到限制，而且由于必需表达并呈递全长抗体，故编码跨膜区的核酸也不得不缩短并且在尺寸上缩减。
可以通过以下方式产生慢病毒表达文库的多样性：
(i)在一个实施方案中，通过使用从B细胞汇集物获得的编码HCVR和LCVR的核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述汇集物中的B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
(ii)在一个实施方案中，通过使用从HCVR和LCVR编码核酸的汇集物选出的成对HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述汇集物通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸和LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，其中所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。在一个实施方案中，该单一B细胞是B细胞克隆群体。
在一个实施方案中，所述至少一个密码子位于HCVR或LCVR的CDR中。在一个实施方案中，该CDR是CDR3。在一个实施方案中，CDR3是HCDR3。
(iii)在一个实施方案中，通过使用成对的不同HCVR编码核酸和单一LCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述不同的HCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
在一个实施方案中，该单一B细胞是B细胞克隆群体。
在一个实施方案中，所述至少一个密码子位于HCVR的CDR中。
在一个实施方案中，CDR是CDR3。
(iv)在一个实施方案中，通过使用成对的不同LCVR编码核酸和单一HCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述不同的LCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
在一个实施方案中，该单一B细胞是B细胞克隆群体。
在一个实施方案中，所述至少一个密码子位于LCVR的CDR中。
在一个实施方案中，CDR是CDR3。
在一个实施方案中，产生慢病毒表达文库的多样性包括步骤
(a)：
(i)从B细胞亚群分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；和
(v)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(b)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生第一DNA分子汇集物，
(vi)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生第二DNA分子汇集物，和
(vii)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(c)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子的配对；
或(d)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第一DNA分子的配对。
为了产生分泌型多肽，目的结构基因包括编码“信号序列”或“前导肽”的DNA区段。该信号序列指导新合成的多肽抵达并穿过ER膜，在此多肽可以进入分泌路线。在蛋白质跨越ER膜期间，信号序列由信号肽酶切去。就信号序列的功能而言，宿主细胞分泌机器对其的识别是至关重要的。因此所用的信号序列必需被宿主细胞的分泌机器的蛋白质和酶识别。
用于产生慢病毒表达文库的慢病毒表达载体允许表达分泌形式和膜结合形式的抗体。通过连接抗体重链的C末端恒定域至可变剪接核酸(内含子)并进一步连接至编码跨膜区或GPI-锚信号肽的外显子，表达膜结合形式。
如本申请使用的术语“GPI-锚”指与多肽或蛋白质的C末端连接的翻译后修饰。“GPI-锚”具有包含至少一个磷酸乙醇胺残基、三甘露糖苷、氨基葡萄糖残基和肌醇磷脂的核心结构。尽管具有这种核心结构，但GPI-锚正常情况下拥有某种微不均一性并且因此具有GPI-锚的蛋白质正常情况下是具有同源GPI-锚的蛋白质的混合物，其中所述同源GPI-锚具有带不同侧链修饰的相同核心结构。
术语“GPI-锚信号肽”指多肽或蛋白质的C末端氨基酸序列，所述C末端氨基酸序列由GPI-锚可以与之结合的一个氨基酸、任选的间隔序列肽和一个疏水肽组成。该信号肽的几乎全部，即任选的间隔序列肽和疏水肽，在翻译后被酶GPI-氨基转移酶移除，并且在GPI-锚的核心磷酸乙醇胺的氨基和GPI-锚所结合的氨基酸之间形成键。
如本申请使用的术语“跨膜结构域”指由至少一个外显子在DNA水平上编码的多肽或蛋白质，其包括胞外区、跨膜区和胞内区。跨膜结构域通常包含三个不同的结构区：N端胞外区、中间保守的跨膜段和C端胞质区。在一个实施方案中，跨膜结构域以N末端至C末端方向包含胞外区和跨膜区。跨膜结构域可以额外地包含胞内区或胞质区。
术语“可变剪接核酸”指始于5'剪接供体位点并止于3'剪接受体位点的核酸。这种可变剪接核酸包含不以组成型方式从相应的前mRNA剪接除去的非编码区，例如，在编码免疫球蛋白重链CH3或CH4结构域的外显子后的内含子。在可变剪接核酸的5'剪接供体位点处发生的“可变剪接事件”是可变剪接核酸是否从前mRNA剪接出来或它是否至少部分地维持并包含于成熟(加工的)mRNA中的决定性事件。
如本文所用的术语“可变剪接”及其语法等同物指，真核细胞中的一个过程，其中归因于一个或多个内含子的不同加工，不同的成熟mRNA可以从单一前mRNA获得并且因此可以表达不同同种型的多肽。在本发明的一个实施方案中，所产生的前mRNA中的单一一个内含子，即仅一个内含子，可以可变地剪接。在另一个实施方案中，第二核酸可以可变地剪接。在又一个实施方案中，第二核酸包含可变剪接内含子。该差异加工是一个“是/否”的决定，即在可变剪接过程中，待加工的内含子，即“可变剪接核酸”，要么至少部分地留下，要么被剪接出来。这不必理解为导致不同外显子跟随的分支点机制。它实际上是一种这样的机制，其中可变剪接核酸或者被剪接下来或者被至少部分地保持在成熟mRNA中。以这种机制，可变剪接核酸和因此以符合可读框方式包含在其中的翻译终止密码子或者被留下或者被移除。
可变剪接是真核细胞中的调节机制。采用可变剪接，可以从相同的前mRNA获得在成熟mRNA中不同外显子的组合，从而导致由同一DNA编码的多种不同蛋白质。
为了允许可变剪接，编码抗体重链C末端结构域的最后一个外显子必需没有符合读框的翻译终止密码子。
术语“符合读框的翻译终止密码子”指这样一种翻译终止密码子(TAA、TAG或TGA)，它在可读框相对于核酸的居先编码区不移码的情况下接续在该核酸的编码区后，即它在翻译期间终止该编码区。符合读框的翻译终止密码子与核酸的居先编码区有效连接。
术语“无符合读框的翻译终止密码子”指在所指的核酸中不存在翻译终止密码子(TAA、TAG或TGA)，和/或存在这样一种翻译终止密码子，所述翻译终止密码子可以存在于核酸的编码区内部或其末端处，但是因一个或两个碱基对的移动，在加工的mRNA翻译期间其不能被识别(即，不符合可读框，不是有效连接的)，并因此在翻译过程中不终止该编码区。
“可剪接核酸”的特征在于，至少一个5'剪接供体位点、一个3'剪接受体位点、和通常位于受体位点上游20-50碱基处的所谓分支位点。这种构造影响在RNA剪接期间从前mRNA识别并切除从5'剪接供体位点至3'剪接受体位点的核酸。在剪接步骤期间，产生成熟mRNA，从中翻译出多肽或蛋白质。在本发明的一个实施方案中，至少一个核酸，优选地第二核酸，是含有额外调节元件(如符合读框的终止密码子)的可剪接核酸。
但是这个剪接过程不是绝对的。例如，这是可能的：内含子在前mRNA加工期间不从前mRNA移除，并且因此至少部分地嵌入成熟mRNA中。如果符合读框的终止密码子存在于这种“可选地”纳入的内含子中，则翻译在这个终止密码子处终止并且产生所编码多肽的变体。
内含子的识别和切除还经常受前mRNA中的其它顺式作用元件调节。归因于它们的功能和位置，这些元件分别被称作外显子剪接增强子(ESE)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接增强子(ISE)或内含子剪接沉默子(ISS)(Black,D.L.,Annu.Rev.Biochem.72(2003)291-336)。
大部分真核基因的基因组DNA具有内含子-外显子构造。例如，在编码分泌形式的免疫球蛋白重链的C末端结构域(即，CH3或CH4)的外显子内部存在5'剪接供体位点。
如果该剪接供体位点在重链前mRNA的加工中无效，则这个外显子之后含有终止密码子的内含子将至少部分地留在成熟mRNA中。该mRNA随后翻译成以CH3或CH4结构域结尾并且成为可溶性免疫球蛋白的免疫球蛋白重链。这是免疫球蛋白分泌细胞中免疫球蛋白重链基因的主要加工途径。
如果该剪接供体位点在免疫球蛋白重链前mRNA的加工中有效，则后连的内含子以及由此该终止密码子被移除。因此，翻译不终止在免疫球蛋白重链的C末端结构域后。而且，以随后拼接上的编码跨膜结构域的外显子，翻译继续。免疫球蛋白重链基因的该次要加工途径产生在免疫球蛋白产生细胞的细胞表面上呈递的质膜结合型免疫球蛋白形式。
这个过程称作“可变剪接”，在这个过程中可选地被移除的核酸(即内含子)称作“可变剪接核酸”。
如果编码异源多肽或蛋白质的核酸由/借助可变剪接核酸与编码至少跨膜结构域的片段的核酸连接或与编码GPI-锚信号肽的核酸连接，即可变剪接核酸位于这两个核酸之间，并且这三个核酸有效连接，则表达异源多肽或蛋白质的两种变体：可溶性变体，即仅包含该多肽或蛋白质的变体，和质膜结合型变体，即同时包含该多肽或蛋白质和跨膜结构域或GPI-锚的变体。
例如，为了在真核细胞中重组表达免疫球蛋白重链，可以使用具有基因组内含子-外显子构造的核酸或仅含有编码区的核酸，即cDNA。在两种情况下，核酸均以编码免疫球蛋白重链C末端结构域的外显子之后的终止密码子结尾。在基因组构造中此后的后续性内含子和外显子(包括可变剪接核酸和跨膜结构域)被省去。因此采用这种核酸时，仅获得可溶性免疫球蛋白重链。
如果为了重组表达免疫球蛋白或其片段而至少部分地保留免疫球蛋白重链基因的基因组构造，即如果保留在编码C末端结构域的外显子之后的内含子(即可变剪接核酸)和后续的编码跨膜结构域的外显子(一个或多个)，则可变剪接是可能的。在可变剪接事件中，编码CH3-或CH4-结构域的外显子的3'端密码子和终止密码子作为内含子序列/随着内含子序列被移除，改而产生不同的成熟mRNA，其中编码区(即可读框)在其3'末端由该额外保持的外显子延长。这种mRNA翻译成C末端延长的免疫球蛋白重链，其含有由额外3'外显子编码的额外跨膜结构域或其片段。在免疫球蛋白装配期间这种延长的免疫球蛋白重链被掺入，从而产生质膜结合型免疫球蛋白。现在已经令人惊讶地发现，采用本发明的这种核酸，可以选择产生异源多肽的转染细胞。这种方法是广泛适用的，并不限于免疫球蛋白。为实施这种方法，无符合读框的终止密码子的用于重组表达异源多肽的核酸必须与源自免疫球蛋白的可变剪接核酸有效地且符合读框地连接，其中所述可变剪接核酸包含符合读框的翻译终止密码子和多聚腺苷化位点。后续的第三核酸是可变的，并且可以选自编码跨膜结构域或其片段的任何核酸以及编码GPI-锚信号肽的任何核酸。这些元件，即编码多肽的核酸、可变剪接核酸、和编码跨膜结构域或GPI-锚信号肽的核酸，可以从不同的基因以及不同的生物选择并组合。唯一前提是，这三种核酸以如下方式组合，该方式使得可变剪接核酸中的翻译终止密码子与编码多肽的核酸的可读框是符合读框的，即它可以被核糖体识别并且终止翻译。
通常而言，采用可变剪接，可溶性形式的异源多肽的C末端的一部分可选地从前mRNA作为内含子的部分被移除/可以被移除。该部分可选地涵盖分泌形式的3'端密码子、3'非翻译区和终止密码子。因此，可选地被移除的始于5'剪接供体位点并止于3'剪接受体位点的该核酸，与未经可变加工的变体的C末端重叠/可以重叠。
在其中第一核酸编码免疫球蛋白重链的一个实施方案中，第一核酸包含基因组构造的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。在一个实施方案中，第三核酸编码跨膜结构域的片段或GPI-锚信号肽，其中该跨膜结构域片段由单个外显子编码。在另一个实施方案中，跨膜结构域是由M1-M2-外显子融合物编码(即，由无基因组间插内含子的单个外显子编码)的免疫球蛋白跨膜结构域。在一个实施方案中，免疫球蛋白跨膜结构域由cDNA编码。
通过将其中免疫球蛋白重链基因的总体基因组构造被至少部分地保留的核酸引入宿主细胞，获得一方面表达可溶性异源多肽且另一方面表达质膜结合型异源多肽的细胞。例如，为获得两种免疫球蛋白变体，即为了使得可变剪接成为可能，不需要维持免疫球蛋白重链基因的整个基因组构造，即全部内含子和外显子。仅要求维持处于功能形式的可变剪接位点。
“功能性剪接位点”是这样的核酸序列，它包含5'剪接供体位点和3'剪接受体位点，因而允许从前mRNA切除居间核酸序列。内含子的识别和切除经常受前mRNA上的其它顺式作用元件调节。归因于它们的功能和位置，这些元件分别称作外显子剪接增强子(ESE)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接增强子(ISE)或内含子剪接沉默子(ISS)(Black,D.L.,Annu.Rev.Biochem.72(2003)291-336，上述文献通过引用的方式并入本文)。
多肽的质膜结合型变体牢固地与表达它的细胞结合。因此质膜结合型变体可以用作标志物以分离已经成功转染了用于表达异源多肽或蛋白质例如免疫球蛋白的核酸的细胞。在一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白。在一个实施方案中，免疫球蛋白选自IgG、IgE和IgA。
在该方法的下一个步骤中，将成对的DNA分子克隆入慢病毒表达载体。
此后，将慢病毒表达文库引入第一哺乳动物细胞群体中。转导的细胞在其表面上展示慢病毒表达文库的抗体。从转导细胞的文库(即从第一哺乳动物细胞群体)，就细胞表面上展示的抗体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力，选择一个或多个细胞。
在一个实施方案中，特异性结合目的抗原的抗体是人源化抗体或人抗体，特别地是人抗体。
在一个实施方案中，特异性结合目的抗原的抗体是全长抗体。
展示在哺乳动物细胞的表面上的抗体表达为包含跨膜区的全长抗体。
由哺乳动物细胞分泌至培养基中的抗体是全长抗体，即没有跨膜结构域。
在一个实施方案中，表达文库的、尤其慢病毒表达文库的每个成员均编码全长抗体，其中抗体被表达为分泌型抗体和包含跨膜区的膜结合型抗体。
在一个实施方案中，通过随机组合不同的轻链可变区和重链可变区，增加抗原特异性抗体的变化性。
可变区的克隆是本领域公知的标准方法并且已经对各个物种(包括人类、非人灵长类、小鼠、兔和鸡)进行描述。综述见Barbas III等人(编著)，Phage Display-A Laboratory Manual,Cold Spring Habour Press(2001)，尤其是其中Andris-Widhopf等人的章节，Generation of AntibodyLibraries:PCR Amplification and Assembly of Light-and Heavy-chainCoding Sequences。Andris-Widhopf等人公开了能够扩增上述物种的可变区编码区(VR编码区)、尤其HCVR编码区或LCVR编码区，的寡核苷酸的序列。另外，可以由技术人员通过以下方式设计能够扩增HCVR编码区或LCVR编码区、尤其人HCVR编码区或LCVR编码区的寡核苷酸：比较从数据库(如Immunogenetics(http://imgt.cines.fr/)、Kabat(www.kabatdatabase.com)和Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/))可获得的已知抗体编码区序列并且鉴定适于引物设计的共有序列。基于分子生物学中的常识，基于前文提到的手册(Barbas III等人(编著)Phage Display-A Laboratory Manual,Cold Spring Habour Press(2001))和其中引用的参考文献，技术人员能够设计出能扩增HCVR编码区或LCVR编码区的寡核苷酸，其中在一个实施方案中，引物包含克隆扩增产物的合适限制性位点。扩增并克隆VR的其他策略在Sblattero,D.和Bradbury,A.,Immunotechnology3(1998)271-278和Weitkamp等人,J.Immunol.Meth.275(2003)223-237中描述。
在一个实施方案中，可变区核酸包含限制性位点(RS)以允许按确定的方向在慢病毒表达载体中克隆装配的编码区。在一个实施方案中，限制性位点彼此不同，并且它们中的至少一者产生单链突出端(“粘末端”)，由此允许定向克隆。在一个实施方案中，RS具有8个或更多个碱基对长度并由“稀有切割”限制性酶识别，所述限制性酶选自但不限于以下：Ascl、Fsel、Notl、Pacl、Pmel、Sfil和Swal。
可以采用分别在构架1区和4区中退火的特定有义引物和反义引物的混合物，通过PCR扩增人HCVR、人κLCVR和人λLCVR编码区。该主要的引物组在以下文献描述：Sblattero,D.和Bradbury A.,Immunotechnology3(1998)271-278。作为使用特定反义引物混合物扩增HCVR、κLCVR和λLCVR编码序列的替代，可以使用一个在γ、κ或λ恒定区中退火的反义引物。
可以通过预扩增B细胞亚群的转录物组(transcriptome)，特别通过使用如Zhu等人,BioTechniques30(2001)892-897所述的模板转换方案，增强后续克隆特定可变区(VR)编码区的效率。然而，需要在转录物组的预扩增与某些稀有cDNA种类的可能丧失和序列差错的可能积累之间进行平衡。
在一个实施方案中，将RNA转录成cDNA包括步骤：预扩增B细胞亚群或单一B细胞或B细胞克隆群体的转录物组，其中预扩增包括步骤：
(a)将RNA中所含的多腺苷酸化mRNA选择性转录成单链cDNA；和
(b)从单链cDNA扩增双链cDNA。
在一个实施方案中，使用SEQ ID NO:1至11中的一种或多种寡核苷酸进行双链cDNA扩增。在一个实施方案中，PCR循环的数目小于20、小于15、从10至14，或是约14。
在一个实施方案中，通过汇集在独立PCR反应中获得的DNA分子，产生DNA分子汇集物，特别是第一和/或第二DNA分子汇集物。
寡核苷酸混合物、第一寡核苷酸混合物和/或第二寡核苷酸混合物包含能够扩增VR编码区、尤其HCVR编码区或LCVR编码区的一对寡核苷酸或完全由其组成。
在一个实施方案中，在反应中使用多于一对的寡核苷酸，以单个反应产生DNA分子汇集物，特别是第一和/或第二DNA分子汇集物。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物，特别地第一寡核苷酸混合物，包含能够扩增人HCVR编码区的至少两种寡核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物，特别地第一寡核苷酸混合物，包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11的至少两种、特别地全部寡核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物、特别地第二寡核苷酸混合物，包含能够扩增κLCVR编码区、尤其人LCVR编码区的至少两种寡核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物、特别地第二寡核苷酸混合物，包含能够扩增κLCVR编码区的至少两种寡核苷酸，其中特别地，寡核苷酸混合物、特别地第二寡核苷酸混合物包含选自SEQ ID NO:12至SEQ IDNO:19的至少两种、特别地全部寡核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物、特别地第二寡核苷酸混合物，包含能够扩增λLCVR编码区、尤其人λLCVR编码区的至少两种寡核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物、特别地第二寡核苷酸混合物，包含能够扩增λLCVR编码区的至少两种寡核苷酸，其中还特别地，寡核苷酸混合物、特别地第二寡核苷酸混合物包含选自SEQ ID NO:20至SEQID NO:28的至少两种、特别地全部寡核苷酸。
在一个实施方案中，寡核苷酸混合物、第一寡核苷酸混合物或第二寡核苷酸混合物包含能够扩增VR编码区的引物的总量，其中该总量中所含的全部正向引物和全部反向引物处于等摩尔比率。
在一个实施方案中，由表达文库编码、特别由慢病毒表达文库编码的抗体包含就一个LCVR。
为确保细胞表面展示抗体，表达带信号肽的抗体链，其中信号肽指导抗体链经细胞(特别是哺乳动物细胞)的内质网抵达分泌途径，其中特别地，所述信号肽位于每条抗体链的N末端处，并且其中还特别地在细胞中、尤其在哺乳动物细胞中所述信号肽在加工和运输期间从抗体链切下。另外，以一定比例表达带有使抗体锚定在细胞膜中的跨膜区的抗体重链。非常特别地，跨膜区位于抗体重链的C端并且造成抗体保持结合在细胞的外表面。也可以例如通过GPI连接，实现抗体在细胞膜中的锚定(Moran和Caras,The Journal of Cell Biology115(1991)1595-1600)。
指导蛋白质抵达真核细胞分泌途径的信号肽通常是本领域已知的并且例如公开于Nielsen等人，Protein Engineering10(1997)1-6中。
在一个实施方案中，信号肽源自分泌型或I型跨膜蛋白。
在一个实施方案中，信号肽源自分泌型蛋白，如血清蛋白家族成员(白蛋白、转铁蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白)、胞外基质蛋白(胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖)、肽激素(胰岛素、胰高血糖素、内啡肽、脑啡肽、ACTH)、消化酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)或乳蛋白(酪蛋白、乳白蛋白)。
在一个实施方案中，信号肽源自免疫球蛋白，特别是轻链可变区。
在一个实施方案中，信号肽是小鼠Igκ轻链信号肽。
在一个实施方案中，跨膜区源自整合型膜蛋白。
在一个实施方案中，跨膜区是源自I型跨膜蛋白(Do等人,Cell85(1996)369-78；Mothes等人,Cell89(1997)523-533)如细胞黏附分子(整联蛋白、黏蛋白、钙黏着蛋白)、凝集素(唾液酸黏附素、CD22、CD33)或受体酪氨酸激酶(胰岛素受体、EGF受体、FGF受体、PDGF受体)的内在停止转移膜锚定序列(internal stop-transfer membrane-anchor sequence)。
在一个实施方案中，跨膜区是人G类膜结合型免疫球蛋白的跨膜区。
在一个实施方案中，跨膜区源自受体酪氨酸激酶，更特别地源自人血小板衍生生长因子受体(hPDGFR)、最特别地源自hPDGFR B链(登录号NP002600)。
在一个实施方案中，跨膜区源自人PDGFRβ链。
慢病毒可以在广泛类型的宿主细胞中发挥功能，包括哺乳动物、鸟类、两栖类、爬行动物和昆虫细胞。它们的基因组包含能够指导由病毒基因组的核酸编码的蛋白质(包括异源蛋白)大量表达的元件。
分开结构性病毒蛋白和非结构性病毒蛋白的表达，结构蛋白可以由包装细胞系或由辅助病毒复制子提供。在一个实施方案中，表达文库基于分开的慢病毒RNA复制子。在一个实施方案中，一个复制子编码非结构蛋白，另一个编码结构蛋白。
在一个实施方案中，分离的B细胞的群体源自显示增加的抗体滴度的动物，其中所述抗体特异性结合目的抗原。可以通过本领域公知的方法(例如通过ELISA)，确定动物血液中结合目的抗原的抗体的滴度。
在一个实施方案中，动物暴露于或已经暴露于目的抗原或其片段或抗原决定簇，其中特别地，通过天然暴露、病原体感染或免疫进行暴露。
在一个实施方案中，动物被病原体感染或已经被病原体感染，其中病原体包含目的抗原或其片段或抗原决定簇。
在一个实施方案中，分离的B细胞的群体源自用免疫原性组合物免疫的动物，其中免疫原性组合物包含以下或备选地由以下组成：(a)目的抗原；(b)目的抗原的片段；和(c)目的抗原的抗原决定簇。
本领域已知的任何免疫原性组合物都可以用于本发明中，特别地是产生强烈免疫反应的组合物。示例性免疫原性组合物是包含病毒样颗粒(VLP)，特别地RNA噬菌体的VLP的组合物。可用的免疫原性组合物在WO2006/097530、WO2006/045796、WO2006/032674、WO2006/027300、WO2005/117963、WO2006/063974、WO2004/084939、WO2004/085635、WO2005/068639、WO2005/108425、WO2005/117983、WO2005/004907、WO2004/096272、WO2004/016282、WO2004/009124、WO2003/039225、WO2004/007538、WO2003/040164、WO2003/031466、WO2004/009116和WO2003/024481中报道。
在一个实施方案中，用免疫原性组合物进行动物的免疫，其中免疫原性组合物的免疫原性由免疫刺激性物质增强，特别由免疫刺激性寡核苷酸、最特别地由含有非甲基化CpG的寡核苷酸增强，如在例如WO2003/024481、WO2005/004907和WO2004/084940中公开。
在一个实施方案中，含有非甲基化CpG的寡核苷酸是G10(WO2005/004907的SEQ ID NO:54)。
在一个实施方案中，通过以下方式用免疫原性组合物进行动物的免疫：将该免疫原性组合物以间隔至少1周、特别以间隔2周直至3个月的方式，施用给动物至少3次，特别地3次至6次。
在一个实施方案中，通过在每单次施用中将至少100μg、特别地200μg至1000μg免疫原性组合物给动物，进行动物的免疫。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含佐剂，特别是弗氏完全或不完全佐剂或明矾。
在一个实施方案中，分离的B细胞的群体或单一B细胞或B细胞克隆群体来自选自以下的来源：(a)血液；(b)次级淋巴器官，特别是脾或淋巴结；(c)骨髓；和(d)包含记忆B细胞的组织。在一个实施方案中，该来源是血液。在一个实施方案中，分离的B细胞的群体包含外周血单个核细胞(PBMC)或特别地由其组成。
在一个实施方案中，动物是哺乳动物或鸟。
在一个实施方案中，动物选自：(a)人；(b)小鼠；(c)兔；(d)鸡；和(e)大鼠。
在一个实施方案中，动物是哺乳动物，特别地是大鼠、小鼠、兔或人。
在一个实施方案中，动物是转基因小鼠或转基因兔或人类。
可以通过富集抗原特异性B细胞，显著地增加筛选和克隆抗原特异性抗体的效率。通过就B细胞特异性结合目的抗原的能力来选择B细胞、从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群的方法，是本领域通常已知的。这些方法所基于的是：分离的B细胞的群体中所含有的抗原特异性B细胞与目的抗原的相互作用。
在一个实施方案中，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；并且
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞或单一B细胞。
一种用于从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群的方法是，使B细胞与抗原包被的载体结合和进行FACS分选，如WO2004/102198中所述那样。
在一个实施方案中，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇包被载体；
(b)使分离的B细胞的群体与载体接触并且允许B细胞借助目的抗原或其片段或抗原决定簇与载体结合；
(c)移除未结合的B细胞，其中特别地载体包含珠或进一步特别地由珠组成，其中再进一步特别地，珠是顺磁珠；和
(d)从顺磁珠回收B细胞亚群或单一B细胞。
在一个实施方案中，通过FACS分选法，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞。
在一个实施方案中，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合的B细胞。
在一个实施方案中、荧光染料选自：(a)PerCP、别藻蓝蛋白(APC)、(b)德克萨斯红、(c)罗丹明、(d)Cy3、(e)Cy5、(f)Cy5。5、(f)Cy7、(g)Alexa Fluor染料，特别是Alexa647nm或Alexa546nm、(h)藻红蛋白(PE)、(i)绿色荧光蛋白(GFP)、(j)叠层染料(tandem dye)(例如PE-Cy5)和(k)异硫氰酸荧光素(FITC)。
在一个实施方案中，荧光染料是Alexa647nm或Alexa546nm。
在一个实施方案中，通过本领域已知的任何方法，用荧光染料标记化合物、特别地是目的抗原或其片段或抗原决定簇，尤其通过将荧光染料偶联至化合物而直接标记该化合物，其中可以借助共价结合以及非共价结合实现偶联。备选地，通过化合物与第二化合物、尤其抗体结合，间接地用荧光染料标记化合物，特别是目的抗原或其片段或抗原决定簇，其中第二化合物包含荧光染料。
除了细胞特异性结合目的抗原的能力之外，可以针对其它标记进一步选择B细胞亚群，其中所述其它标记是对表达希望加以克隆的免疫球蛋白的B细胞类型具有特异性的标记。备选地，可以排除优势表达不希望类型的免疫球蛋白的一些不想要的B细胞类型。额外地，可以采用活力标记如，例如，PI(碘化丙啶)或7-AAD(7-氨基-放线菌素)以选择活细胞。进一步附加地或备选地，可以采用细胞死亡标志物或凋亡标志物，例如，YO-PRO-1或膜联蛋白V以分选出死细胞或凋亡细胞。
另外，有利的是，在从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群时，包括针对B细胞特异性标志物的存在进行正选择，特别是针对CD19或B220的正选择。
在一个实施方案中，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞群体或单一B细胞；和
(c)针对至少一个额外参数，选择B细胞，其中特别地，针对至少一个额外参数进行的选择是
(i)针对下述参数的正选择，所述参数选自：存在B细胞特异性标志物、特别是CD19或B220，和B细胞活力；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在、和凋亡标志物的存在。
在一个实施方案中，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群还包括以下步骤：选择类别转换的B细胞，特别是IgM阴性和/或IgD阴性B细胞、最特别地IgM阴性和IgD阴性B细胞。
在一个实施方案中，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用第一荧光染料标记，其中荧光染料特别是Alexa647nm、Alexa488或Alexa546nm；
(b)使分离B细胞群体的细胞与抗-IgM和/或抗-IgD抗体接触，其中抗-IgM和/或抗-IgD抗体用第二和/或第三荧光染料标记，其中第二和/或第三荧光染料在与第一荧光染料发射荧光的波长不同的波长发射荧光；并且
(c)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合但是不与抗-IgM结合和/或不与抗-IgD抗体结合的B细胞群体或单一B细胞。
对于后续筛选过程的效率而言，尽管并非绝对必需，但有利的是在其表面上表达和展示抗体的每个细胞包含约一种，尤其是就一种，单一抗体，其中特别地，每个细胞包含不同种的抗体。这称作“每个细胞一种抗体的模式”。
例如，通过使用病毒表达文库，特别地是慢病毒表达文库，并且在引入/转导表达文库(即病毒粒子)进入用于展示的细胞HEK293群体时，选择低比率的病毒粒子/真核细胞数目(尤其哺乳动物细胞数目)，可以实现每个细胞一种抗体的模式。
在一个实施方案中，表达文库是病毒表达文库，特别地是慢病毒表达文库，并且通过用病毒表达文库、特别用慢病毒表达文库感染真核细胞、特别地哺乳动物细胞，将表达文库引入第一真核细胞群体、特别是第一哺乳动物细胞群体，其中还特别地，感染以最多10、特别地最多1、更特别地最多0.2和最特别地最多0.1的感染复数进行。在一个实施方案中，感染复数是约0.1。
在一个实施方案中，通过FACS分选法实施细胞的分离。在一个实施方案中，细胞的分离包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇染色第一真核细胞群体、特别是哺乳动物细胞群体，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；并且
(b)借助FACS分选法，分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体。
在一个实施方案中，借助FACS分选法分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体包括步骤：就至少一个额外参数进一步选择细胞。在一个实施方案中，该至少一个额外参数选自
(i)针对细胞活力的正选择；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在和凋亡标志物的存在。
负选择也可以包括针对与一种或多种、特别是一种不想要的抗原的结合进行的负选择。本领域技术人员能够在筛选中任选地包含不想要的抗原，特别地以未标记的形式，以便淘汰出表达结合不想要的抗原(一种或多种)的抗体的细胞。
在一个实施方案中，该方法还包括步骤：
(a)在第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体存在的情况下培养至少一个细胞个体、特别地就一个细胞个体；
(b)验证第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力。
在一个实施方案中，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或、特别是并且第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体，包含选自以下的细胞或特别地由其组成：(a)BHK21细胞、特别是ATCCCCL-10；(b)Neuro-2a细胞；(c)HEK-293T细胞、特别是ATCCCRL-11268；(d)CHO-K1细胞、特别是ATCC CRL-62；和(e)HEK293细胞。
在一个实施方案中，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体包含CHO-K1细胞或特别地由其组成，其中还特别地，表达文库是慢病毒表达文库。
使用本领域公知的方法，展示目的抗体的细胞个体可以用来克隆和用来重组地表达包含细胞上展示的抗体的可变区的抗体(见例如Weitkamp等人,J.Immunol.Meth.275(2003)223-237)。原则上，可以表达任何已知形式的抗体(关于抗体的不同形式，见Hollinger和Hudson，Nature生物技术23(2005))，特别地作为IgG、最特别地作为全人IgG抗体。
因而，本文中报道了一种产生特异性结合目的抗原的抗体的方法，所述方法包括步骤：
(a)根据如本文中报道的方法分离表达抗体的细胞；
(b)从分离的细胞获得RNA；
(c)从RNA合成编码抗体的cDNA；
(d)将cDNA克隆至表达载体中；
(e)在细胞中表达抗体；和
(f)纯化抗体。
在一个实施方案中，抗体包含LCVR和HCVR，其中特别地，所述HCVR和LCVR源自相同的细胞个体。
在一个实施方案中，cDNA的合成包括从RNA合成单链cDNA的步骤。
在一个实施方案中，cDNA的合成还包括以下步骤：从单链cDNA扩增cDNA，其中特别地，使用以下寡核苷酸进行扩增
i)SEQ ID NO:1至4的寡核苷酸之一和SEQ ID NO:5的寡核苷酸作为引物，或
ii)SEQ ID NO:6至10的寡核苷酸之一和SEQ ID NO:11的寡核苷酸作为引物。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中、特别在CHO-K1细胞和HEK293细胞中进行融合产物的表达。
本文中报道了一种通过以下方式产生特异性结合目的抗原的抗体的方法：将抗体作为免疫球蛋白，特别地作为物种特异性免疫球蛋白、最特别地作为小鼠、大鼠、兔、鸡或人免疫球蛋白，最特别地作为全人免疫球蛋白表达。
本文中报道了一种产生特异性结合目的抗原的抗体的方法，所述方法包括步骤：
(a)根据如本文中报道的方法分离表达抗体的细胞；
(b)从细胞获得RNA；
(c)从RNA合成cDNA；
(d)从cDNA扩增DNA，所述DNA编码由细胞表达的抗体的可变区(VR)；
(e)产生包含所述DNA的表达构建体，其中该表达构建体编码细胞所表达的抗体的至少一个VR；
(f)在细胞中表达该表达构建体。
在一个实施方案中，该方法包括步骤：
(a)根据上文描述的方法分离表达抗体的细胞；
(b)从细胞获得RNA；
(c)从RNA合成cDNA；
(d)从cDNA扩增第一DNA，所述第一DNA编码由细胞表达的抗体的HCVR；
(e)产生包含第一DNA的第一表达构建体，其中第一表达构建体编码包含重链恒定区(HCCR)和该HCVR的重链免疫球蛋白；
(f)从cDNA扩增第二DNA，所述第二DNA编码由细胞表达的抗体的LCVR；
(g)产生包含第二DNA的第二表达构建体，其中第二表达构建体编码包含轻链恒定区(LCCR)和该LCVR的轻链免疫球蛋白；
(h)在细胞中表达第一表达构建体和第二表达构建体。
在又一个优选的实施方案中，HCCR、HCVR、LCCR和LCVR是人源的。
在一个实施方案中，表达构建体、第一表达构建体和/或第二表达构建体还编码疏水性前导序列、特别地物种特异性疏水性前导序列、最特别地人疏水性前导序列。在一个实施方案中，第一表达构建体还编码人重链疏水性前导序列。在一个实施方案中，第二表达构建体还编码人轻链疏水性前导序列，其中人轻链疏水性前导序列选自(a)人κ轻链疏水性前导序列；和(b)人λ轻链疏水性前导序列。
在一个实施方案中，cDNA的合成包括从RNA合成单链cDNA的步骤。
在一个实施方案中，cDNA的合成还包括以下步骤：从单链cDNA扩增cDNA。
在一个实施方案中，HCCR是人HCCR，特别是选自以下的人HCCR：(a)人γ1HCCR；(b)人γ2HCCR；和(c)人γ4HCCR。
在一个实施方案中，LCCR是人LCCR，特别地是选自以下的人LCCR：(a)人κLCCR；和(b)人λLCCR。
在一个实施方案中，用HCVR特异性引物进行第一DNA的扩增。
在一个实施方案中，用LCVR特异性引物进行第二DNA的扩增，其中特别地，LCVR特异性引物选自κLCVR特异性引物和λLCVR特异性引物。在一个实施方案中，LCVR特异性引物是κLCVR特异性引物，其中特别地，κLCVR特异性引物是选自SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:18中的任一个与SEQ ID NO:19的组合。在一个实施方案中，LCVR特异性引物是λLCVR特异性引物，其中特别地，λLCVR特异性引物是选自SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:27中的任一个与SEQ ID NO:28的组合。
在一个实施方案中，LCCR是人κLCCR并且其中LCVR是人κLCVR。在一个实施方案中，LCCR是人λLCCR并且其中LCVR是人λLCVR。
原则上，可以通过在相同细胞中表达两种不同表达载体，重组地产生包含重链和轻链的免疫球蛋白。备选地，可以将编码轻链和重链的表达构建体克隆至单一表达载体中。因此，在一个实施方案中，第一表达构建体的表达和第二表达构建体的表达包括表达作为第一表达载体的部分的第一表达构建体和表达作为第二表达载体的部分的第二表达构建体，其中第一表达载体和第二表达载体被共转染至细胞。在一个实施方案中，第一表达构建体的表达和第二表达构建体的表达包括表达作为相同表达载体的部分的第一表达构建体和第二表达构建体。
对于物种特异性抗体的表达、特别是人抗体的表达，产生这样的表达盒，所述表达盒编码该物种的、特别是人的HCCR或LCCR以及相应的前导序列，并且包含允许插入相应VR编码区的限制性位点。在一个实施方案中，产生第一表达构建体包括将第一DNA克隆入第一表达盒的步骤，其中第一表达盒编码HCCR以及特别地HCCR疏水性前导序列。在一个实施方案中，产生第二表达构建体包括将第二DNA克隆入第二表达盒的步骤，其中第二表达盒编码LCCR以及特别地LCCR疏水性前导序列。
在一个实施方案中，抗体以选自以下的形式表达：(a)单链抗体，特别是scFv；(b)双体抗体(diabody)；(c)Fab片段；(d)F(ab')2片段；和(e)全长抗体，特别选自IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在一个实施方案中，抗体是全人抗体。
在一个实施方案中，将抗体表达为IgG类别的完整抗体，特别地表达为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；其中特别地，抗体是人抗体，最特别地是全人抗体。
抗体的表达可以在本领域已知的任何真核表达系统中进行。通常和特别地，抗体的表达在真核细胞中进行，其中还特别地，真核细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一个实施方案中，抗体的表达在哺乳动物细胞中进行，其中还特别地，哺乳动物细胞选自HEK细胞、CHO细胞、COS细胞。非常特别地，哺乳动物细胞是CHO细胞。
本文还报道一种用于在真核细胞、特别是哺乳动物细胞的表面上展示全长抗体的表达载体。在一个实施方案中，该表达载体是病毒表达载体，更特别地是慢病毒表达载体。在一个实施方案中，该表达载体包含编码信号肽、跨膜区的DNA元件并且其中该表达载体包含允许将编码抗体可变区的DNA分子克隆、特别取向特异性克隆至表达载体中的限制性位点。在又一个优选的实施方案中，该表达载体以允许表达膜结合型抗体的取向包含所述DNA元件和限制性位点，其中所述膜结合型抗体从N末端至C末端包含信号肽、抗体重链和跨膜区。
本文中报道了表达文库，特别地是表达全长抗体的表达文库，其包含如本文中报道的表达载体。
本文中报道了真核细胞、特别是哺乳动物细胞，所述细胞包含如本文中报道的表达载体或包含如本文中报道的表达文库的至少一个样本。
本文还报道了一种用于抗体优化/成熟的方法。该方法特别地适于筛选小规模至中等规模多样性，即多于400种变体。可以使用哺乳动物细胞、尤其HEK293细胞实施该方法。
通过如本文中报道的细胞展示方法，
-使得在HEK293细胞中/上表达并展示全长抗体成为可能；
-使得需要有限资源的有效方法成为可能；
-使得经济的单管法成为可能，因为全部抗体变体均在一根管中获得；
-使得抗体成熟成为可能；和
-使得产生廉价文库成为可能，所述廉价文库不依赖于具体产生模式，例如自人供体的PCR，或采用合成性DNA寡聚物。
近些年期间演进的基于B细胞的抗体产生和筛选方法提供了在哺乳动物细胞中产生并筛选设计的/工程化的/天然的IgG基抗体文库的新方法。
本文中报道了使用设计/工程化/中等多样性的全长抗体哺乳动物细胞文库的方法，所述文库具有103至106的多样性。
多达106种变体的文库容量允许
-展示1,000种轻链和1,000种重链(产生106种不同的抗体)；
-改组单条链而保持另一链恒定(产生106种可能的变体)；
-成熟单个CDR(106种变体允许4至5个氨基酸位置随机化(长度19个氨基酸的变体/位置，全部氨基酸无Cys：如果随机化4个氨基酸的话，130.000种变体))。
本文中报道了一种使用以膜结合形式和分泌形式表达的全长IgG的方法。
本文中报道了一种允许基于客户设计/随机设计抗体序列的方法。
本文中报道了一种使用基于FACS的抗体变体淘洗和/或筛选的方法。
如本文中报道的这些方法可以用于装配预先选择的人供体来源的抗体轻链和重链序列，例如通过PCR产生的人B细胞来源的抗体序列。
在一个实施方案中，B细胞源自/获自/分离自血液。
如本文中报道的方法可以例如通过改组轻链或修饰/随机化(单一)CDR个体，用于成熟抗体的抗原结合特性(如亲和力、物种交叉反应性、pH依赖性抗原结合)。
如本文中报道的方法可以用于装配预先选择的人供体来源的抗体轻链和重链序列(例如通过PCR分离的人肿瘤B细胞来源的抗体序列)。
如本文中报道的方法可以用于检验和装配合理设计的抗体序列(例如催化性抗体、抗体原)。因此，如本文中报道的方法可以通过引入特定序列特征，用于抗体工程化。
如本文中报道的方法可以用于抗体的人源化，例如在经典CDR移植方案失败的情况下和/或在其中要求/想要检验1,000个或10,000个变体的情况下，用于鉴定回复突变。
如本文中报道的方法可以用于优化抗体的生物物理和/或生物化学特性(例如稳定性，聚集倾向性)。
如本文中报道的方法可以用于优化抗体表达和/或分泌。
编码CDR的核酸或编码可变域的核酸或在如本文中报道的方法中使用的B-细胞可以从免疫动物或从疾病幸存的动物或目前患有活动疾病的动物或从具有人IgG基因座的转基因动物或从幼稚(naive)动物获得。
可变域中编码CDR的核酸可以全部源自天然存在的可变域(包括在免疫动物后所获得的那些)，或可以在天然存在的CDR和合成性CDR之间混合，或可以完全是合成性CDR。
例如，包含随机化的CDR3编码核酸的文库可以是这样的文库，其中各个成员在编码的CDR3的长度方面多样(例如长度从4至25个氨基酸残基)，其中避免使用终止密码子，其中避免半胱氨酸残基出现，其中避免糖基化位点，其中避免不稳定序列基序，和/或其中针对每个位置，随机化人CDR3区的4种最常见氨基酸残基。
多样性生成模块可以在以下区域内是多样的
-随机化的CDR，例如随机化的CDR3(反映人CDR3长度、无终止密码子、无半胱氨酸、无N-糖基化位点、无不稳定基序的序列设计)；和/或
-设计的CDR，例如基于设计或现存序列的“理性”序列变体；和/或
-供体CDR或可变域(人供体、免疫动物来源的)。
多样性模块可以通过PCR或基因合成产生，并且可以借助经典连接反应或不依赖序列和连接反应的克隆法(SLIC)，克隆入表达载体中。
在表达系统中，在单个细胞中产生并展示单一特异性的抗体。这可以通过在瞬时系统中以受控MOI使用病毒感染(慢病毒或Bacmam)、或通过在稳定系统中单一重组事件(LoxP、FLP)实现。该表达系统应当确保膜结合型和/或分泌型全长抗体的高水平表达。
可以通过淘洗法和/或通过FACS选择，分离命中物，实施文库成员的筛选。可以在上清液中实施分泌型抗体的筛选。通过PCR分离所选择克隆的编码可变域的核酸。
因而，本文中报道了采用FACS和/或基于珠的方法以抗原驱动方式富集(例如亲和力改善的)结合物的方法。
如本文中报道的细胞展示方法
用于展示全长抗体文库的方法：
将多样性生成模块，如包含随机化的CDR3编码核酸序列的抗体DNA文库，引入如本文中报道的慢病毒展示载体中。
将包含多样性生成模块的慢病毒展示载体和所需辅助质粒引入表达系统中以产生感染性病毒粒子。
在分离含有病毒的上清液并定量病毒载量(例如通过转导实验或借助RT-PCR)后，采用调节的MOI，转导哺乳动物细胞如HEK293细胞用于产生文库，以获得展示膜结合型文库成员并同时分泌可溶性文库成员的细胞。
基于膜结合型文库成员筛选各个文库成员，以便鉴定并选择呈递抗体变体的细胞，其中所述抗体变体具有预定特征，例如就亲和力、物种交叉反应性、pH依赖性抗原结合方面而言。
在下一个步骤中，将选出的细胞作为单个细胞保藏，以获得克隆性细胞群体，或作为细胞汇集物保藏。此后，培育保藏的细胞以产生抗体变体。分泌型抗体变体可以用于进一步表征，如初级筛选。
将第一筛选中选出的克隆或群体培养延长的时间段。
此后，分离编码可变域的核酸。
用于展示双特异性抗体文库的方法：
双特异性抗体通常是与相同抗原上的两个不同非重叠表位或与不同抗原上的两个表位特异性结合的抗体分子。
不同的双特异性抗体样式是已知的。
可以在如本文中报道的方法中使用的示例性双特异性抗体样式是
-Crossmab样式：包含与第一表位或抗原特异性结合的第一结合位点和与第二表位或抗原特异性结合的第二结合位点的全长IgG抗体，其中各条链如下：
-轻链1(轻链可变域+轻链κ恒定域)
-轻链2(轻链可变域+重链CH1域)
-重链1(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带穴突变的CH3)
-重链2(重链可变域+轻链κ恒定域+铰合部+CH2+带结突变的CH3)；
-单臂单链样式：包含与第一表位或抗原特异性结合的第一结合位点和与第二表位或抗原特异性结合的第二结合位点的抗体，其中各条链如下
-轻链(轻链可变域+轻链κ恒定域)
-组合的轻链/重链(轻链可变域+轻链κ恒定域+G4S接头+重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带结突变的CH3)
-重链(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带穴突变的CH3)；
-双臂单链样式：包含与第一表位或抗原特异性结合的第一结合位点和与第二表位或抗原特异性结合的第二结合位点的抗体，其中各条链如下
-组合的轻链/重链1(轻链可变域+轻链κ恒定域+G4S-接头+重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带穴突变的CH3)
-组合的轻链/重链2(轻链可变域+轻链κ恒定域+G4S-接头+重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带结突变的CH3)；
-共同轻链双特异性样式：包含与第一表位或抗原特异性结合的第一结合位点和与第二表位或抗原特异性结合的第二结合位点的抗体，其中各条链如下
-轻链(轻链可变域+轻链κ恒定域)
-重链1(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带穴突变的CH3)
-重链2(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带结突变的CH3)。
-四价scFv样式：包含与第一表位或抗原特异性结合的第一结合位点和与第二表位或抗原特异性结合的第二结合位点(scFv)的双特异性四价抗体，其中各条链如下
-轻链(轻链可变域+轻链κ恒定域)
-组合的重链-scFv(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+CH3+G4S-接头+scFv)。
-四价scFab样式：包含与第一表位或抗原特异性结合的第一结合位点和与第二表位或抗原特异性结合的第二结合位点(scFv)的双特异性四价抗体，其中各条链如下
-轻链(轻链可变域+轻链κ恒定域)
-组合的重链-scFab(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+CH3+G4S-接头+scFab)。
以上概述的双特异性抗体样式的表达盒的元件结构如下(按5'至3'方向，还见图7)：
-Crossmab样式：
[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[轻链1或2]-[IRES]-[重链1或2]-[WPRE+3'-LTR]；
-单臂单链样式：
1)[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[轻链]-[IRES]-[重链]-[WPRE+3'-LTR]，和/或
2)[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[组合的轻链/重链]-[WPRE+3'-LTR]；
-双臂单链样式：
[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[组合的轻链/重链1或2]-[WPRE+3'-LTR]；
-共同轻链双特异性样式：
1)[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[重链1]-[IRES]-[重链2]-[WPRE+3'-LTR]，和/或
2)[hCMV启动子]-[轻链]-[bGH polyA]；
-四价scFv样式：
1)[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[重链]-[IRES]-[轻链]-[WPRE+3'-LTR]；
-四价scFab样式：
1)[5'-LTR+包装元件+RRE]-[hCMV启动子]-[重链]-[IRES]-[轻链]-[WPRE+3'-LTR]。
下文中描述在真核细胞的表面上展示全长抗体并选择细胞的工作流程：
在第一步骤中，基于待展示的双特异性抗体样式，构建如本文中报道的所需表达载体。
此后，产生两个独立病毒粒分别用于各一半抗体。将细胞用穿梭载体和辅助质粒转染以产生不能复制但是具有感染性的病毒颗粒。
为了产生展示文库，
-将哺乳动物细胞在低MOI(感染复数)情况下用分别编码相应抗体部分的两种病毒颗粒感染，或
-将哺乳动物细胞在低MOI情况下用编码第一半抗体的病毒颗粒感染，并随后将细胞用编码第二半抗体的病毒颗粒感染，或
-将稳定表达共同轻链的哺乳动物细胞用编码两条重链的病毒粒子感染。
此后，选择/富集表达双特异性单克隆抗体的转导细胞。
使用例如FACS，将表达双特异性抗体的抗原结合细胞分选(保藏)为单个细胞或汇集物。
培养并扩充分选的细胞。
此后，在FACS分选和培养的表达双特异性抗体的细胞的细胞上清液中对分泌型抗体进行功能性筛选。
此后，对表达功能性双特异性抗体的细胞进行挑选。
最后，通过PCR和DNA测序法克隆该组合的轻链和重链表达盒。
为了产生针对单个靶的双特异性抗体的表达载体，将兔或小鼠用重组靶蛋白或重组或天然表达靶蛋白的细胞免疫。在免疫后收集脾细胞或外周血细胞并制备RNA。使用荧光标记的抗原作为选择标记，可以通过FACS将抗原特异性B细胞进行大量富集。此后，产生cDNA，并且将重链和轻链的可变域通过PCR扩增并连接入如本文中报道的用于全长IgG的展示载体或连接入表达载体用于表达和生产。
为了产生共同轻链抗体，如上文所述免疫转基因兔。转基因兔具有敲除的兔IgM和κIg基因座。敲除的兔Ig基因座由包含人轻链和重链基因的人Ig基因座替换。轻链基因已经在转基因Ig基因座中充分重排，导致在从这些兔获得的全部B细胞中表达单一轻链。重链转基因未重排。重链通过可变基因与J元件和D元件的随机重排和体细胞高变和基因转换而是高度多样的(见例如WO2005/007696)。
为了产生病毒粒子，穿梭载体(＝如本文中报道的慢病毒展示载体)与辅助质粒一起共转染至HEK293细胞中(例如用Cellfectin转染)。通过离心收获含有病毒粒子的上清液。可以通过用病毒原液的等分试样转导HEK293细胞，检验感染性病毒粒子的数目。通过FACS计数表达抗体的HEK293细胞的数目。
为了产生表达和展示抗体的HEK293细胞，将细胞用低MOI的含有穿梭载体的病毒感染。用荧光标记抗原标记，通过FACS，对表达特异性抗体的细胞进行大量选择和分选。在分离后，抗原特异性的轻链和重链组合作为包含IRES的一个片段由PCR分离，即轻链和重链可变域的关连组合被保存。
为了产生半抗体文库，PCR-DNA片段(编码抗原特异性抗体的轻链和重链)连入结表达载体中和穴表达载体中。对于结构建体和穴构建体，均如之前描述产生病毒颗粒。
为展示双特异性抗体，通过用不同的病毒转导，产生表达结和穴基抗体重链两者的HEK293细胞。为了分选/选择可溶性抗体，将荧光标记的抗原添加至细胞。将细胞洗涤几次以选择双价结合物(降低由两个抗体臂结合的抗原的解离速率)。通过FACS，将长半寿期结合物分选为单细胞。
为筛选功能性双特异性抗体，在基于细胞或不基于细胞的功能测定法(例如受体磷酸化、增殖、诱导凋亡)中，检验培养的HEK293细胞的上清液中的分泌型抗体。从选择的克隆中，通过PCR从HEK293细胞克隆功能活性抗体的轻链和重链。
如本文中报道的一个方面是一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长抗体及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS，大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增编码重链的核酸：两个独立聚合酶链反应，引入单限制性位点，使得可以定向克隆入穿梭载体，一个聚合酶链反应使用SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10的一种或多种引物或全部引物和SEQ ID NO:11的引物用于结链，一个聚合酶链反应使用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的一种或多种引物或全部引物和SEQ ID NO:5的引物用于穴链；连接：将编码第一重链可变域的核酸连入不带跨膜结构域的穴基因座中，即EV71-IRES上游，将编码第二重链可变域的核酸连入带跨膜结构域的结基因座中，即EV71-IRES下游，
-产生病毒，感染稳定表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择展示在哺乳动物细胞的表面上的双特异性抗体(通过解离速率筛选)，使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选(bulk sort)，
-使用例如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域的编码核酸(其没有TM结构域)，将其克隆至无跨膜结构域的第二穿梭载体中，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞表面上展示包含共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS、大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增重链编码核酸(两个独立聚合酶链反应，引入使得可以定向克隆入穿梭载体中的单限制性位点)；连接：将第一重链可变域编码核酸连入带跨膜结构域的穴基因座中，即EV71-IRES上游，并且将第二重链可变域编码核酸连入带跨膜结构域的结基因座中，即EV71-IRES下游，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择哺乳动物细胞膜展示的双特异性抗体(通过解离速率筛选)，使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选，
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体；通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，选择双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞表面上展示包括共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS、大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增重链编码核酸：两个独立聚合酶链反应，引入使得可以定向克隆入穿梭载体的单限制性位点；连接：将第一重链可变域编码核酸连接入第一穿梭载体中带或不带跨膜结构域的穴基因座中，并且将第二重链可变域编码核酸连接入第二穿梭载体中带或不带跨膜结构域的结基因座中，但是至少一个基因座具有跨膜结构域，
-产生病毒(一种病毒用于第一穿梭载体并且一种病毒用于第二穿梭载体)，用第一病毒和第二病毒依次感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择展示在哺乳动物细胞表面上的双特异性抗体(通过解离速率筛选)、使用FACS大批分选命中物(哺乳动物细胞克隆)，
-PCR重链可变域编码核酸，并克隆入第三穿梭载体中于不带跨膜结构域和EV71-IRES的双顺反子表达单元中，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体并选择双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长双特异性抗体、及选择真核细胞和由此选择双特异性抗体，包括以下步骤：
-将第一实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)用第一目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
-将第二实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)用第二目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
其中第一抗原和第二抗原是不同的，
-选择第一和第二经免疫的实验动物的B细胞，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选(bulk sorting)进行选择，
-采用两个独立/相继聚合酶链反应，通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体成为可能，
-将第一重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES上游、带跨膜结构域的穴基因座或结基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，并且将第二重链可变域编码核酸连接入相同的穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、带跨膜结构域的相应另一个基因座中，即如果IRES上游的重链具有穴基因座，则IRES下游的重链具有结基因座，并且反之亦然，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原是不同的，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-通过双重标记的转导细胞的FACS，选择在其表面上展示双特异性抗体的细胞，
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体；通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域。
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体并选择双特异性抗体。
如本文中报道的一个方面是一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长双特异性抗体、及选择真核细胞和由此也选择双特异性抗体，包括以下步骤：
-将实验动物，在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔，用目的抗原，在一个实施方案中胞外受体结构域，免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
-选择免疫的实验动物的B细胞，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选进行选择，
-通过采用两个独立/相继聚合酶链反应，通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体成为可能，
-将重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、带跨膜结构域的重链基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，其中穿梭载体/慢病毒表达载体在IRES上游包含编码共同轻链的核酸，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-通过抗原特异性标记的转导细胞的FACS，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选，选择在其表面上展示抗体的细胞，
-每个所选择细胞的重链编码核酸分别通过分开的PCR扩增获得，其中采用两个独立/相继聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体成为可能，
-将第一重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES上游、不带跨膜结构域的穴基因座或结基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，并且将第二重链可变域编码核酸连接入相同的穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、不带跨膜结构域的相应另一个基因座中，即如果IRES上游的重链具有穴基因座，则IRES下游的重链具有结基因座，并且反之亦然，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-选择分泌双特异性抗体的细胞。
在全部方面的一个实施方案中，其B细胞表达相同轻链的实验动物(即实验动物的全部B细胞仅表达单一一种轻链)是转基因实验动物。在一个实施方案中，转基因实验动物具有敲除的IgM和κIg基因座，所述基因座由包含人轻链和重链基因的人Ig基因座替换，其中轻链基因在转基因Ig基因座中被充分重排，重链转基因未被重排。在这个实施方案中，重链通过可变基因与J元件和D元件的随机重排和体细胞高变和基因转换而是高度多样的。
在全部方面的一个实施方案中，共同轻链双特异性抗体包含与第一抗原特异性结合的第一结合位点和与第二抗原特异性结合的第二结合位点的抗体，其中各条链如下
-轻链(轻链可变域+轻链κ恒定域)，
-第一重链(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带穴突变的CH3)，
-第二重链(重链可变域+CH1+铰合部+CH2+带结突变的CH3)。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，用于从B细胞扩增重链可变区的引物是：i)SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的引物与SEQ IDNO:5的引物的组合，和/或ii)SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10的引物与SEQ ID NO:11的引物的组合。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，用于从B细胞扩增轻链(κ)可变区的引物是SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:18的引物与SEQ IDNO:19的引物的组合。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，用于从B细胞扩增轻链(λ)可变区的引物是SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:27的引物与SEQ IDNO:28的引物的组合。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，用于从HEK细胞扩增重链可变区的引物是SEQ ID NO:29的引物与SEQ ID NO:30的引物的组合。
展示载体：
在基础慢病毒表达载体中，仅有限容量可用于编码抗体的核酸，这是因为从5'-LTR至3'-LTR大于约9kb的载体不能包装入慢病毒病毒粒子中。从5'-LTR至CMV-启动子(2.7kb)和从WPRE元件至3'-LTR(1.5kb)的区域覆盖4.2kb大小(实施例1)。可以掺入最大4.8kb，而不降低病毒生产效率。
更具体地，最大约4800bp可以整合至基本载体中，这是因为超过4800bp限，每1000bp，病毒滴度将减半。
已经发现，组合表达借助EV71-IRES偶联的轻链和重链的表达盒可以用来缩短DNA插入物。轻链的编码核酸用在重链的编码核酸前。
在一个实施方案中，EV71-IRES具有SEQ ID NO:31的序列。
已经发现，对于偶联表达两个编码核酸，肠病毒71(EV71)的IRES是特别合适的。源自脑心肌炎病毒(EMCV)、小鼠Gtx、人ELF4g的IRES元件具有EV71-IRES元件功效的不到15％。
双顺反子表达元件的表达受包含内含子A的人CMV启动子驱动。双顺反子表达元件编码分泌形式(即可溶形式)和膜结合形式的全长人或人源化或嵌合或非人动物来源的抗体。
取决于产生的抗体，整合物的元件具有以下尺寸：
i)仅膜结合型抗体：
ii)膜结合型和分泌型抗体(1)：
iii)膜结合型和分泌型抗体(2)：
iv)无IRES的膜结合型和分泌型抗体(2)：
在一个实施方案中，bGH polyA信号序列具有SEQ ID NO:32的序列。在一个实施方案中，hCMV启动子具有SEQ ID NO:33的序列。
在一个实施方案中，内含子6+M1/M2融合物具有SEQ ID NO:34的序列。
v)膜结合型两条重链(KiH)：
vi)单膜结合型两条重链(KiH)：
vii)膜结合型scFv模式：
viii)膜结合型scFab模式：
在一个实施方案中，M1/M2融合物具有SEQ ID NO:35的序列。
已经发现,EV71-IRES允许使用双顺反子表达元件组合表达重链和轻链(保持小载体尺寸)。
已经发现,使用EV71-IRES元件连接轻链表达盒与重链表达盒，可以获得增加的表达(生产力)：
已经发现，可以用可变剪接锚来驱动同时表达膜结合型和分泌型抗体形式。
已经并入单限制性位点，以允许引入通过PCR产生的可变轻链和重链编码核酸。
已经使用能够扩增全部人构架的简并引物(带有相容性限制性位点)。
采用如本文中报道的方法，通过组合不同结合特异性(来自例如在免疫活动期间、或通过亲和力成熟、或通过人源化而获得的不同抗体)，可以鉴定作为单克隆抗体的组合的双特异性抗体。
采用如本文中报道的方法，可以产生大量的双特异性抗体并且筛选以鉴定协同性组合。
如本文中报道的本发明的示例项
1.一种选择表达双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-IRES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-IRES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，其中所述重链之一或二者还在其C末端包含跨膜结构域，和
(b)根据展示的膜结合型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
2.根据项1的方法，特征在于仅EV71-IRES下游的重链在其C末端包含跨膜结构域。
3.一种选择分泌双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含编码分泌型双特异性抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-IRES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-IRES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，和
(b)根据分泌型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
4.根据项1至3中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞展示或分泌单一全长双特异性抗体。
5.根据1至4中任一项的方法，表征在于，包括以下一个或多个步骤作为第一步骤：
-用目的抗原免疫转基因动物，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，和/或
-通过FACS通过大批分选，选择免疫的实验动物的B细胞，和/或
-通过分开PCR扩增，获得每个B-细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单一限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体。
6.根据项1至2和4至5中任一项的方法，特征在于包括步骤：
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体，任选地如果存在第一重链的跨膜结构域，通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域。
7.根据项1至2和4至6中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-任选地，编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
8.根据项3至6中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸。
9.根据根据项1至8中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。
10.根据项1至9中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。
11.根据项1至10中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
12.根据项1至11中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
13.根据项1至12中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
14.根据项1至13中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
15.根据项1至13中任一项的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
16.根据项1至15中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
17.根据项1至16中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
18.根据项1至17中任一项的方法，特征在于该跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
19.根据项1至18中任一项的方法，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
20.根据项1至19中任一项的方法，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
21.一种选择表达抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中细胞群体的每个细胞展示膜结合型全长抗体，其中所述抗体的至少两条链由双顺反子表达盒编码，并且所述抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合，和
(b)根据展示的膜结合型全长抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞，
其中，慢病毒病毒粒子群体的每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含EV71-IRES用于表达膜结合型抗体。
22.根据项21的方法，特征在于慢病毒病毒粒子群体的慢病毒病毒粒子的每个双顺反子表达盒编码亲本抗体的不同变体，所亲本抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合。
23.根据项21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
24.根据项21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-任选地，编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
25.根据项21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码在其C末端与scFv连接的全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
26.根据项21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码在其C末端与scFab连接的全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
27.根据根据项21至26中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞均展示膜结合型全长抗体并且分泌全长抗体。
28.根据项21至26中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞均展示并且分泌单一全长抗体。
29.根据项21至28中任一项的方法，特征在于抗体与抗原特异性结合。
30.根据项21至23中任一项的方法，特征在于抗体是双价单特异性抗体。
31.根据项21至22和24中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。
32.根据项21至22和25至26中任一项的方法，特征在于抗体是四价双特异性抗体。
33.根据项21至28和31至32中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。
34.根据项31至33中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
35.根据项31至34中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
36.根据项21至35中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
37.根据项21至36中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
38.根据项21至36中任一项的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
39.根据项21至38中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
40.根据项21至39中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
41.根据项21至40中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
42.根据项21至41中任一项的方法，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
43.根据项21至42中任一项的方法，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
44.一种双顺反子表达盒，其以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
45.一种双顺反子表达盒，其以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
46.根据项44至45中任一项的双顺反子表达盒，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
47.根据项44至46中任一项的双顺反子表达盒，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
48.根据项44至47中任一项的双顺反子表达盒，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
49.根据项44至48中任一项的双顺反子表达盒，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
50.根据项44至49中任一项的双顺反子表达盒，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
51.根据项44至50中任一项的双顺反子表达盒，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
52.根据项44至51中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
53.根据项44至52中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
54.根据项44至53中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
55.根据项44至54中任一项的双顺反子表达盒，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
56.真核细胞，包含根据项44至55中任一项的双顺反子表达盒。
57.根据项56的真核细胞，特征在于双顺反子表达盒已经转导入了所述细胞中。
58.根据项56至57中任一项的真核细胞，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
59.根据项58的真核细胞，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
60.一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
61.一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
62.根据项60至61中任一项的慢病毒载体，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
63.根据项60至62中任一项的慢病毒载体，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
64.根据项60至63中任一项的慢病毒载体，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
65.根据项60至64中任一项的慢病毒载体，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
66.根据项60至65中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
67.根据项60至66中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
68.根据项60至67中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
69.根据项60至68中任一项的慢病毒载体，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
70.真核细胞，包含根据项60至69中任一项的慢病毒载体。
71.根据项70的真核细胞，特征在于细胞已经转导了所述慢病毒载体。
72.根据项70至71中任一项的真核细胞，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
73.根据项72的真核细胞，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
74.根据项60至69中任一项的慢病毒载体的用途，用于产生展示或分泌或者展示且分泌全长抗体的真核细胞群体。
75.根据项74的用途，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
76.根据项75的用途，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
77.包含两个或更多个慢病毒颗粒的慢病毒载体文库，每个慢病毒颗粒都包含根据项60至69中任一项的表达载体，其中每种载体所编码的抗体彼此差异至少一个氨基酸。
78.根据项77的慢病毒载体文库，特征在于载体文库由1,000至1,000,000个不同的表达载体组成。
79.根据项77至78中任一项的慢病毒载体文库，特征在于由载体文库的载体编码的抗体在抗体的CDR之一中相差至少一个氨基酸残基。
80.根据项79的慢病毒载体文库，特征在于该CDR是重链CDR3。
81.根据项77至80中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过随机化亲本表达载体的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基，获得该表达载体文库。
82.根据项77至81中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过组合编码两种不同半抗体的核酸，获得该慢病毒表达载体文库。
83.根据项77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用从B细胞的汇集物获得的编码HCVR和LCVR的核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
84.根据项77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用从HCVR和LCVR编码核酸的汇集物选出的成对HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，所述汇集物通过随机化从单一B细胞获得的HCVR和LCVR编码核酸的至少一个密码子而获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
85.根据项77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用成对的不同HCVR编码核酸和单一LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述不同的HCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
86.根据项77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用成对的不同LCVR编码核酸和单一HCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述不同的LCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
87.根据项77至86中任一项的慢病毒载体文库，特征在于单一B细胞是B细胞克隆群体。
88.根据项77至87中任一项的慢病毒载体文库，特征在于产生慢病毒表达文库的多样性包括步骤
(a)：
(i)从B细胞亚群分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；和
(v)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(b)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生第一DNA分子汇集物，
(vi)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生第二DNA分子汇集物，和
(vii)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(c)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子的配对；
或(d)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第一DNA分子的配对。
89.根据项77至88中任一项的慢病毒载体文库，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
90.根据项77至89中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
91.根据项77至90中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
92.根据项77至91中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
93.包含两个或更多个真核细胞的真核细胞文库，每个细胞包含根据项44至55中任一项的双顺反子表达盒或根据项60至69中任一项的慢病毒载体，其中每个细胞所表达的抗体彼此差异至少一个氨基酸。
94.真核细胞文库，包含根据项77至92的慢病毒载体文库。
95.根据项94的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库的每个真核细胞表达单一抗体。
96.根据项94至95中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库的每个真核细胞展示单一抗体。
97.根据项94至96中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是表达抗体文库的真核细胞群体，其中编码核酸源自经免疫动物的B细胞群体。
98.根据项97的真核细胞文库，特征在于，就B细胞对一种或多种目的抗原的特异性，预先选择B细胞。
99.根据项94至98中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的全长抗体的第一表达盒和编码与第二抗原特异性结合的全长抗体的第二表达盒。
100.根据项94至99中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒编码与第一抗原结合的第一全长抗体轻链和第一全长抗体重链，所述第二表达盒编码与第二抗原特异性结合的第二全长抗体轻链和第二全长抗体重链。
101.根据项94至100中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的第一全长抗体重链和与第二抗原特异性结合的第二全长抗体重链的表达盒，其中真核细胞表达共同轻链。
102.根据项94至102中任一项的真核细胞文库，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
103.根据项94至101中任一项的真核细胞文库，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
104.根据项94至103中任一项的真核细胞文库，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
105.根据项94至104中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
106.根据项94至105中任一项的真核细胞文库，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
107.根据项94至106中任一项的真核细胞文库，特征在于分离的B细胞的群体或单一B细胞或B细胞克隆群体来自从以下选择的来源：(a)血液；(b)次级淋巴器官，特别是脾或淋巴结；(c)骨髓；和(d)包含记忆B细胞的组织。
108.根据项107的真核细胞文库，特征在于分离的B细胞的群体包含外周血单个核细胞(PBMC)或特别地由其组成。
109.根据项94至108中任一项的真核细胞文库，特征在于动物是哺乳动物，特别是大鼠、小鼠、兔或人类。
110根据项109的真核细胞文库，特征在于动物是转基因小鼠或转基因兔或人。
111.根据项94至110中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；并且
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞或单一B细胞。
112.根据项94至111中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇包被载体；
(b)使分离的B细胞的群体与载体接触并且允许B细胞借助目的抗原或其片段或抗原决定簇与载体结合；
(c)移除未结合的B细胞，其中特别地载体包含珠或进一步特别地由珠组成，其中再进一步特别地，珠是顺磁珠；和
(d)从顺磁珠回收B细胞亚群或单一B细胞。
113.根据项94至112中任一项的真核细胞文库，特征在于通过FACS分选，实施从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞。
114.根据项94至113中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合的B细胞。
115.根据项94至114中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞群体或单一B细胞；和
(c)针对至少一个额外参数，选择B细胞，其中特别地，针对至少一个额外参数进行的选择是
(i)针对下述参数的正选择，所述参数选自：存在B细胞特异性标志物、特别是CD19或B220，和B细胞活力；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在、和凋亡标志物的存在。
116.根据项94至115中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群还包括步骤：选择类别转换的B细胞，特别是IgM阴性和/或IgD阴性B细胞、最特别地IgM阴性和IgD阴性B细胞。
117.根据项94至116中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用第一荧光染料标记，其中荧光染料特别是Alexa647nm、Alexa488或Alexa546nm；
(b)使分离的B细胞群体的细胞与抗-IgM和/或抗-IgD抗体接触，其中抗-IgM和/或抗-IgD抗体用第二和/或第三荧光染料标记，其中第二和/或第三荧光染料在与第一荧光染料发射荧光的波长不同的波长发射荧光；和
(c)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合但是不与抗-IgM结合和/或不与抗-IgD抗体结合的B细胞群体或单一B细胞。
118.根据项94至117中任一项的真核细胞文库，特征在于文库是病毒文库，特别地是慢病毒文库，并且通过用病毒文库、特别用慢病毒文库感染真核细胞、特别地哺乳动物细胞，将文库引入第一真核细胞群体、特别是第一哺乳动物细胞群体，其中还特别地，感染以最多10、特别地最多1、更特别地最多0.2和最特别地最多0.1的感染复数进行。
119.根据项118的真核细胞文库，特征在于感染复数是约0.1。
120.根据项94至119中任一项的真核细胞文库，特征在于通过FACS分选，实施细胞的分离。在一个实施方案中，细胞的分离包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇染色第一真核细胞群体、特别是哺乳动物细胞群体，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选，分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体。
121.根据项94至120中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选法分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体包括步骤：就至少一个额外参数，进一步选择细胞。
122.根据项94至122中任一项的真核细胞文库，特征在于所述方法还包括步骤：
(a)在第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体存在的情况下培养至少一个、特别地就一个、细胞个体；
(b)验证第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力。
123.根据项94至122中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或、特别是并且第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体，包含选自以下的细胞或特别地由选自以下的细胞组成：(a)BHK21细胞、特别是ATCC CCL-10；(b)Neuro-2a细胞；(c)HEK-293T细胞、特别是ATCC CRL-11268；(d)CHO-K1细胞、特别是ATCC CRL-62；和(e)HEK293细胞。
124.根据项94至123中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体包含CHO-K1细胞或特别地由CHO-K1细胞组成，其中还特别地，表达文库是慢病毒表达文库。
125.一种选择表达与目的抗原特异性结合的抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)任选地，从B细胞群体选择分泌特异性结合一种或多种抗原的抗体的B细胞亚群或单一B细胞或B细胞克隆群体，
(b)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员都编码特异性结合一种或多种抗原的抗体(一种或多种)的变体，
(i)产生多重DNA分子，其中所述产生包括自B细胞亚群扩增DNA分子汇集物的步骤、或从编码与一种或两种目的抗原特异性结合的单一抗体的DNA通过随机化该编码核酸序列而产生DNA分子文库的步骤，和
(ii)将该多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链；
(c)用每个病毒粒子各包含一个慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体转导真核细胞群体；
(d)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(e)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合目的抗原(一种或多种)或其片段或抗原决定簇的能力，选择细胞。
126.一种选择表达双特异性抗体(其与两种目的抗原特异性结合)的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员均编码双特异性抗体的变体，
(i)从编码单一双特异性抗体的DNA，通过随机化该编码核酸序列，产生多重DNA分子，和
(ii)将该多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于以膜结合形式表达全长双特异性抗体；
(b)用每个病毒粒子各包含一个慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体，转导真核细胞群体；
(c)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(d)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合所述目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力，选择细胞。
127.根据项125至126中任一项的方法，特征在于，该方法包括产生编码抗体的多重DNA分子，所述产生多重DNA分子包括步骤：
(1)从B细胞亚群，扩增编码重链可变区(HCVR)的DNA分子的第一汇集物；并且
(2)从B细胞亚群，扩增编码轻链可变区(LCVR)的DNA分子的第二汇集物；
(3)将编码LCVR的多重DNA分子和编码HCVR的多重DNA分子的组合克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
128.根据项125至127中任一项的方法，特征在于，该方法包括产生编码抗体的多重DNA分子，其中所述抗体与一种或两种目的抗原特异性结合，所述产生多重DNA分子包括步骤：
(1)从单一B细胞或B细胞克隆群体，扩增编码HCVR的DNA分子和编码LCVR的DNA分子，和
(2)通过随机化至少一个密码子，将编码HCVR的DNA分子和/或编码LCVR的DNA分子进行随机化，从而产生编码HCVR的多重DNA分子和编码LCVR的多重DNA分子；
(3)将随机化的编码LCVR的多重DNA分子和编码HCVR的多重DNA分子的组合克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
129.根据项125至128中任一项的方法，特征在于，所述方法包括产生慢病毒表达文库，所述产生包括步骤：
(i)产生编码抗体的多重DNA分子，所述产生包括步骤：
(1)从B细胞亚群分离mRNA；
(2)将mRNA转录成cDNA；
(3)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；和
(4)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；
(ii)将来自第一DNA分子汇集物和第二DNA分子汇集物的DNA分子对，克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
130.根据项135至129中任一项的方法，特征在于，所述方法包括产生慢病毒表达文库，所述产生包括步骤：
(i)产生编码与一种或两种抗原特异性结合的抗体的多重DNA分子，所述产生包括步骤：
(1)从单一B细胞或B细胞克隆群体，分离mRNA；
(2)将mRNA转录成cDNA；
(3)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(4)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(5)随机化第一和/或第二DNA分子，由此产生第一DNA分子汇集物和第二DNA分子汇集物，
(ii)将来自第一和第二DNA分子汇集物的DNA分子对，克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述表达盒。
131.根据项125至130中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
132.根据项131的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
133.根据项125至132中任一项的方法，特征在于动物选自羊、麋鹿、鹿、驴、骡鹿、貂、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、仓鼠、豚鼠和小鼠。在一个实施方案中，动物是小鼠、大鼠或灵长类。
134.根据项125至133中任一项的方法，特征在于动物是非人灵长类或人。
135.根据项125至134中任一项的方法，特征在于动物是具有人免疫球蛋白基因座的转基因动物。
136.根据项125至135中任一项的方法，特征在于，通过就B细胞特异性结合目的抗原的能力进行B细胞选择，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群，以获得核酸。
137.根据项125至136中任一项的方法，特征在于，通过就B细胞特异性结合一种或两种目的抗原的能力进行B细胞选择，从分离的B细胞的群体选出单一B细胞，以获得核酸。
138.根据项125至137中任一项的方法，特征在于单一B细胞是B细胞克隆群体。
139.根据项125至138中任一项的方法，特征在于，通过从单一B细胞或B细胞克隆群体的分离mRNA扩增可变域编码核酸，并且将扩增的mRNA转录成cDNA，获得核酸。
140.根据项125至139中任一项的方法，特征在于，通过使用从B细胞的汇集物获得的HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，所述B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
141.根据项125至140中任一项的方法，特征在于，通过使用从HCVR和LCVR编码核酸的汇集物选择的成对HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述汇集物通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸和LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，其中所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
142.根据项125至140中任一项的方法，特征在于，通过使用成对的不同HCVR编码核酸和单一LCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述不同的HCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
143.根据项125至142中任一项的方法，特征在于，通过使用成对的不同LCVR编码核酸和单一HCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述不同的LCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
144.根据项125至143中任一项的方法，特征在于，所述单一B细胞是B细胞克隆群体。
145.根据项125至144中任一项的方法，特征在于，产生慢病毒表达文库的多样性包括步骤
(a)：
(i)从B细胞亚群分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；和
(v)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(b)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生第一DNA分子汇集物，
(vi)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生第二DNA分子汇集物，和
(vii)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(c)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子的配对；
或(d)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第一DNA分子的配对。
146.根据项125至145中任一项的方法，特征在于，通过随机组合不同的轻链可变区和重链可变区，增加抗原特异性抗体的变化性。
147.根据项125至146中任一项的真核细胞文库，特征在于，分离的B细胞的群体或单一B细胞或B细胞克隆群体来自从以下选择的来源：(a)血液；(b)次级淋巴器官，特别是脾或淋巴结；(c)骨髓；和(d)包含记忆B细胞的组织。
148.根据项147的真核细胞文库，特征在于，分离的B细胞的群体包含外周血单个核细胞(PBMC)或特别地由其组成。
149.根据项125至148中任一项的真核细胞文库，特征在于动物是哺乳动物，特别是大鼠、小鼠、兔或人类。
150.根据项149的真核细胞文库，特征在于动物是转基因小鼠或转基因兔或人。
151.根据项125至150中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；和
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞或单一B细胞。
152.根据项125至151中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇包被载体；
(b)使分离的B细胞的群体与载体接触并且允许B细胞借助目的抗原或其片段或抗原决定簇与载体结合；
(c)移除未结合的B细胞，其中特别地载体包含珠或进一步特别地由珠组成，其中再进一步特别地，珠是顺磁珠；和
(d)从顺磁珠回收B细胞亚群或单一B细胞。
153.根据项125至152中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选，实施从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞。
154.根据项125至153中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合的B细胞。
155.根据项125至154中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞群体或单一B细胞；和
(c)针对至少一个额外参数，选择B细胞，其中特别地，针对至少一个额外参数进行的选择是
(i)针对下述参数的正选择，所述参数选自：存在B细胞特异性标志物、特别是CD19或B220，和B细胞活力；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在、和凋亡标志物的存在。
156.根据项125至155中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群还包括以下步骤：选择类别转换的B细胞，特别是IgM阴性和/或IgD阴性B细胞、最特别地IgM阴性和IgD阴性B细胞。
157.根据项125至156中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用第一荧光染料标记，其中荧光染料特别是Alexa647nm、Alexa488或Alexa546nm；
(b)使分离的B细胞群体的细胞与抗-IgM和/或抗-IgD抗体接触，其中抗-IgM和/或抗-IgD抗体用第二和/或第三荧光染料标记，其中第二和/或第三荧光染料在与第一荧光染料发射荧光的波长不同的波长发射荧光；和
(c)通过FACS分选，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合但是不与抗-IgM结合和/或不与抗-IgD抗体结合的B细胞群体或单一B细胞。
158.根据项125至157中任一项的真核细胞文库，特征在于，文库是病毒文库，特别地是慢病毒文库，并且通过用病毒文库、特别用慢病毒文库感染真核细胞、特别地哺乳动物细胞，将文库引入第一真核细胞群体、特别是第一哺乳动物细胞群体，其中还特别地，感染以最多10、特别地最多1、更特别地最多0.2和最特别地最多0.1的感染复数进行。
159.根据项158的真核细胞文库，特征在于，感染复数是约0.1。
160.根据项125至159中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选，实施细胞的分离。在一个实施方案中，细胞的分离包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇染色第一真核细胞群体、特别是哺乳动物细胞群体，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；并且
(b)通过FACS分选，分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体。
161.根据项125至160中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选法分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体包括步骤：就至少一个额外参数，进一步选择细胞。
162.根据项161的真核细胞文库，特征在于，该至少一个额外参数选自
(i)针对细胞活力的正选择；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在和凋亡标志物的存在。
163.根据项125至162中任一项的真核细胞文库，特征在于，该方法还包括步骤：
(a)在第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体存在的情况下培养至少一个，特别地就一个，细胞个体；
(b)验证第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力。
164.根据项125至163中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或、特别是并且第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体，包含选自以下的细胞或特别地由选自以下的细胞组成：(a)BHK21细胞、特别是ATCC CCL-10；(b)Neuro-2a细胞；(c)HEK-293T细胞、特别是ATCC CRL-11268；(d)CHO-K1细胞、特别是ATCC CRL-62；和(e)HEK293细胞。
165.根据项125至164中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体包含CHO-K1细胞或特别地由CHO-K1细胞组成，其中还特别地，表达文库是慢病毒表达文库。
166.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS，大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增编码重链的核酸：两个独立聚合酶链反应，引入单限制性位点使得可以定向克隆入穿梭载体，一个聚合酶链反应使用SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10的一种或多种引物或全部引物和SEQ ID NO:11的引物用于结链，一个聚合酶链反应使用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的一种或多种或全部引物和SEQ ID NO:5的引物用于穴链；连接：将编码第一重链可变域的核酸连入不带跨膜结构域的穴基因座中，即EV71-IRES上游，将编码第二重链可变域的核酸连入带跨膜结构域的结基因座中，即EV71-IRES下游，
-产生病毒，感染稳定表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择展示在哺乳动物细胞的表面上的双特异性抗体(通过解离速率筛选)，使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选(bulk sort)，
-使用例如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(其没有TM结构域)，将其克隆至不带跨膜结构域的第二穿梭载体中，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
167.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞表面上展示包含共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS、大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增重链编码核酸：两个独立聚合酶链反应，引入使得可以定向克隆入穿梭载体中的单限制性位点；连接：将第一重链可变域编码核酸连入带跨膜结构域的穴基因座中，即EV71-IRES上游，并且将第二重链可变域编码核酸连入带跨膜结构域的结基因座中，即EV71-IRES下游，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择哺乳动物细胞膜展示的双特异性抗体(通过解离速率筛选)，使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选，
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体；通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，选择双特异性抗体。
168.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞表面上展示包括共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS、大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增重链编码核酸：两个独立聚合酶链反应，引入使得可以定向克隆入穿梭载体的单限制性位点；连接：将第一重链可变域编码核酸连接入第一穿梭载体中带或不带跨膜结构域的穴基因座中，并且将第二重链可变域编码核酸连接入第二穿梭载体中带或不带跨膜结构域的结基因座中，但是至少一个基因座具有跨膜结构域，
-产生病毒(一种病毒用于第一穿梭载体并且一种病毒用于第二穿梭载体)，用第一病毒和第二病毒依次感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择展示在哺乳动物细胞表面上的双特异性抗体(通过解离速率筛选)、使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选，
-PCR重链可变域编码核酸，并克隆入第三穿梭载体中于不带跨膜结构域和EV71-IRES的双顺反子表达单元中，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
169.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长双特异性抗体、及选择真核细胞和由此也选择双特异性抗体，包括以下步骤：
-将第一实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)用第一目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
-将第二实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)用第二目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
其中第一抗原和第二抗原是不同的，
-选择第一和第二经免疫的实验动物的B细胞，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选(bulk sorting)进行选择，
-通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体，
-将第一重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES上游、带跨膜结构域的穴基因座或结基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，并且将第二重链可变域编码核酸连接入相同的穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、带跨膜结构域的相应另一个基因座中，即如果IRES上游的重链具有穴基因座，则IRES下游的重链具有结基因座，并且反之亦然，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原是不同的，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-通过双重标记的转导细胞的FACS，选择在其表面上展示双特异性抗体的细胞，
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体；通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
170.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长双特异性抗体、及选择真核细胞和由此也选择双特异性抗体，包括以下步骤：
-将实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)，用目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
-选择免疫的实验动物的B细胞，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选进行选择，
-通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体，
-将重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、带跨膜结构域的重链基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，其中穿梭载体/慢病毒表达载体在IRES上游包含编码共同轻链的核酸，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-通过抗原特异性标记的转导细胞的FACS，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选，选择在其表面上展示抗体的细胞，
-通过分开的PCR扩增，获得每个所选择细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体，
-将第一重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES上游、不带跨膜结构域的穴基因座或结基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，并且将第二重链可变域编码核酸连接入相同的穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、不带跨膜结构域的相应另一个基因座中，即如果IRES上游的重链具有穴基因座，则IRES下游的重链具有结基因座，并且反之亦然，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-选择分泌双特异性抗体的细胞。
171.根据项1至170中任一项的方法选择的细胞用于产生抗体的用途。
提供以下实施例、序列和附图以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对所述方法作出修改而不脱离本发明的精神。
序列表
附图简述
图1：IRES连接的GFP表达的FACS-点图；a)gtx-IRES、b)EV71-IRES、c)ELF4G-IRES、d)EMCV-IRES。
图2：IRES-连接的抗体LC和HC表达的比较；a)gtx-IRES、b)EV71-IRES、c)ELF4G-IRES、d)EMCV-IRES；下方图：表达构建体的示意图。
图3：转染后24小时获得的瞬时转染的HEK293细胞的FACS图；
a)用pLVX M#2(膜结合型IgG)瞬时转染：灰色填充的图：fectin对照的自发荧光，点线图：抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞，实线图：用pLVX M#2转染后抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞；
b)用pLVX M#5(膜结合型和分泌型)瞬时转染：灰色填充图：fectin对照的自发荧光，点线图：抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞，实线图：用pLVX M#5转染后抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞；
图4转导后96小时获得的病毒转导的HEK293细胞的FACS图；
a)采用pLVX M#2病毒的病毒转导：灰色填充图：Polybrene对照的自发荧光，点线图：抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞，实线图：用pLVX M#2病毒转导后抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞；
b)采用pLVX M#5病毒的病毒转导：灰色填充图：fectin对照的自发荧光，点线图：抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞，实线图：用pLVX M#5病毒转导后抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488染色的细胞。
图5：在用新鲜收获的慢病毒上清液转导后96小时、使用流式细胞分析，通过滴定慢病毒母液确定慢病毒滴度。
图6在转导后立即以及在转导后分别14日或28日的病毒转导的HEK293细胞的FACS图；
a)用pLVX M#2病毒进行病毒转导后96小时，分选抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488缀合物阳性HEK293细胞(黑色条线(bar)区域)：灰色填充图：Polybrene对照；实线图：转导的细胞系；
b)用pLVX M#2病毒转导后，初始分选后14日和28日，通过FACS染色对分选的细胞进行的再分析：灰色填充图：Polybrene对照；点线图：第一次分选后14日第二次分析的转导细胞系；实线图：第一次分选后28日第二次分析的转导细胞系；
c)用pLVX MS#5进行病毒感染后96小时、分选抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488缀合物阳性HEK293细胞(黑色条线)：灰色填充图：Polybrene对照；实线图：转导的细胞系；
d)用pLVX M#5病毒转导后，初始分选后14日和28日，通过FACS染色对分选的细胞进行的再分析：灰色填充图：Polybrene对照；点线图：第一次分选后14日第二次分析的转导细胞系；实线图：第一次分选后28日第二次分析的转导细胞系。
图7：双特异性抗体表达盒。
图8：通过FACS分选用Alexa-488抗原缀合物标记的细胞，回收呈递膜结合型抗体的HEK293A细胞。
图9：来自pLVX M#2或MS#5阳性的分选细胞(汇集物分选)的上清液的ELISA结果。
图10：FACS、ELISA对比分析单保藏的FACS阳性细胞的结果。
图11：对两种病毒存在下感染的细胞的染色结果，其中病毒携带用于膜结合型表达针对两种不同抗原的IgG的质粒：
(A)左侧条-单细胞水平：抗原1阳性细胞；右侧条：抗原2阳性细胞；采用高分选门、对于MOI100、未检测到双重感染；y-轴：存活(Scatter)/单峰(singlet)-亲本的频率；
(B)左侧条-汇集物水平：抗原1阳性细胞；中间条：抗原2阳性细胞；右侧条：抗原1阳性和抗原2阳性细胞。
图12：用不同慢病毒颗粒转导的细胞的FACS分析：左侧-无IRES的pLVX MS，两个分开的含有hCMV启动子的表达盒，用于表达膜结合型和分泌型全长抗体；中间-具有IRES的pLVX MS，带一个hCMV启动子的一个双顺反子表达盒，用于表达膜结合型和分泌型全长抗体；右侧-具有IRES的pLVX M，带一个hCMV启动子的一个双顺反子表达盒，用于表达膜结合型全长抗体。
图13：FACS分析取决于慢毒表达载体大小(bp)的TU/ml；左侧条-TU/ml；右侧条-以bp计的慢毒表达载体大小。
图14：载体图pLVX-puro。
图15：载体图pLVX M#2。
图16：载体图pLVX MS#5。
图17：HEK293细胞的FACS分析，所述HEK293细胞用编码不带有或带有一个跨膜结构域的抗体的双特异性展示载体转染；V.1.1：M-B(结)-IRES-M-B(穴)(膜锚在两条结合物重链上)，V1.2：M-B(结)-IRES-M-N(穴)(膜锚在两条重链上，结合物和非结合物)，V1.3：M-N(结)-IRES-B(穴)(膜锚仅在非结合物上)，V1.4：B(结)-IRES-M-N(穴)(膜锚仅在非结合物上)，V1.5：M-N(结)-IRES-M-N(穴)(仅非结合物，膜锚在两条重链上)，V1.6B(穴)-IRES-M-N(结)(膜锚在非结合物上，结和穴交换)；1：对照1-仅fectin，2：对照2-仅共同LC，3：V1.1M-B-IRES-M-B+共同LC，4：V1.2M-B-IRES-M-N+共同LC，5：V1.3M-N-IRES-B+共同LC，6：V1.4B-IRES-M-N+共同LC，7：V1.5M-N-IRES-M-N+共同LC，8：V1.6B-(穴)-IRES-M-N(结)+共同LC。
实施例1
载体pLVX M#2和pLVX MS#5的构建
穿梭载体：移除MCS、PPGK启动子和嘌呤霉素抗性基因。将轻链-EV71-IRES-重链-带有跨膜结构域的可变剪接元件插入质粒中。
起始穿梭载体包含以下元件：
元件 来源
1 5'LTR 人免疫缺损病毒-1
2 PBS(引物结合位点) 猴病毒40
3 psi(ψ) 人免疫缺损病毒-1
4 RRE 人免疫缺损病毒-1
5 cPPT 人免疫缺损病毒
6 PCMV IE 人巨细胞病毒
7 MCS 合成的
8 PPGK 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
9 嘌呤霉素 白浅灰链霉菌(Streptomyces alboniger)
10 WPRE 肝炎病毒
11 3'LTR 人免疫缺损病毒-1
12 pUC ori 大肠杆菌
13 氨苄青霉素 大肠杆菌
质粒pLVX M#2包含以下元件：
元件 来源
1 5'LTR 人免疫缺损病毒-1
2 PBS(引物结合位点) 猴病毒40
3 psi(ψ) 人免疫缺损病毒-1
4 RRE 人免疫缺损病毒-1
5 cPPT 人免疫缺损病毒
6 PCMV IE 人巨细胞病毒
7 IgG轻链 人
8 EV71-IRES EV71病毒
9 IgG重链 人
10 WPRE 肝炎病毒
11 3'LTR 人免疫缺损病毒-1
12 pUC ori 大肠杆菌
13 氨苄青霉素 大肠杆菌
质粒pLVX MS#5包含以下元件：
实施例2
感染性病毒的产生
在6孔平板的各孔中接种3.75*105个Lenti-XTM293T细胞，并温育过夜。次日，每个孔使用20μl LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen目录号：P/N52887)，将细胞用2.5μg pLVX M#2或pLVX MS#5和12.75μlLenti-X HTX包装混合物(Clontech631248)共转染。在温育24小时后更换培养基。转染后48小时收获含有病毒的上清液。
实施例3
HEK293细胞的瞬时转染
将1*105个Lenti-XTM293T细胞接种在24孔平板中并温育过夜。次日，将细胞在每个孔中用0.9μg pLVX M#2或pLVX MS#5和2.7μlLipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen目录号：P/N52887)转染。用山羊抗人IgG(H+L)-Alexa488缀合物(Invitroge目录号A11013)进行染色，并且转染后24小时进行FACS分析。
图3中显示结果。
实施例4
HEK293细胞的病毒转导
病毒感染/转导
将48孔平板孔中接种的1.5*104个HEK293A细胞温育过夜。次日，移走完全培养基，并且将细胞在8μg/ml Polybrene存在下用300μl未稀释的含病毒的上清液感染。在温育24小时后更换培养基。用山羊抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488缀合物(Invitroge目录号A11013)进行细胞的染色，并且转染后96小时进行FACS分析。
图4中显示结果。
慢病毒滴度的确定
在用新鲜收获的慢病毒上清液转导后96小时，使用流式细胞分析，通过测量慢病毒母液，确定慢病毒滴度。
滴度用下式计算：
TU/ml＝F*c*D/V
其中
F＝阳性细胞的频率
C＝板孔中在转导时的细胞总数(例如200,000个细胞)
V＝以ml计的接种物体积(0.3ml)
D＝慢病毒稀释度
TU＝转导单位
图5中显示结果。
实施例5
病毒转导的HEK293细胞系的稳定性
病毒产生和病毒感染/转导如先前实施例2和4中所述那样进行。
将分选的细胞在6孔平板或T75摇瓶中扩增。在80％汇合度时进行细胞传代。对于FACS染色，将1×105个细胞与10μg/ml山羊抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488缀合物在100μl总体积中温育。
无选择压力，进行长期稳定性的确定。图6中显示相应的FACS图。
实施例6
分选展示膜结合型抗体的细胞和野生型细胞的混合物
在24孔微量滴定平板中，将HEK293A野生型细胞与用载体pLVXM#2稳定转导的HEK293A细胞混合(第28日)，用250μl10μg/ml Alexa488偶联的抗原染色，FACS分析，并分选Alexa488阳性细胞。
分选后4日，将24孔微量滴定平板孔中的全部细胞，即大约1*105个细胞用50μl10μg/ml Alexa488偶联的抗原染色，随后FACS分析。
图8中显示结果。
实施例7
分选的细胞(膜结合型IgG阳性)分泌IgG至培养上清液中
将分选的细胞在6孔微量滴定平板或T75瓶中扩大。在80％汇合度时实施细胞传代。来自95％汇合度的细胞的上清液用于IgG ELISA。在下表和图9中展示结果。
表：来自pLVX M#2或MS#5阳性的分选细胞(汇集物分选)的上清液的ELISA结果。
实施例8
膜结合型抗体和分泌型抗体的相关性
产生病毒
在6孔平板的每个孔中接种3.75*105个Lenti-XTM293T细胞并温育过夜。次日，每个孔使用20μl LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen目录号：P/N52887)，将细胞用2.5μg pLVX MS#5和12.75μl Lenti-X HTX包装混合物(Clontech631248)共转染。在温育24小时后更换培养基。转染后48小时收获含有病毒的上清液。
病毒感染/转导
将24孔平板孔中接种的3*104个Hek293A细胞温育过夜。次日，移走该全部培养基，并且将细胞在8μg/ml Polybrene存在下用600μl未稀释或1:25稀释的含病毒的上清液感染。在温育24小时后更换培养基。用山羊抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488缀合物(Invitroge目录号：A11013)进行细胞的染色，并且在转导后96小时进行FACS分析，将单细胞分选至96孔板的孔中。
将三个细胞群体进行单独分选：
-采用高分选门，pLVX MS#5未稀释病毒感染的细胞
-采用低分选门，pLVX MS#5未稀释病毒感染的细胞
-采用低分选门，pLVX MS#51:25稀释病毒感染的细胞。
从96孔板将分选的细胞生长在95％汇合度时，扩大入24孔平板中。对于FACS染色，将5*104个细胞与10μg/ml山羊抗人IgG(H+L)抗体-Alexa488缀合物在100μl总体积中温育。从分选的细胞分离RNA用于LC的PCR分析(递降PCR(Touchdown PCR))。
在图10中显示结果。
可以从该比较的分析结果见到，对抗人IgG(H+L)抗体Alexa488染色的单细胞克隆进行的FACS分析、和对来自每分选门的一个单细胞克隆的培养上清液进行的人IgG ELISA，均可以用于选择细胞，其中对于FACS，使用相对于对照样品大于2的商作为阈值(结果也在下表中显示)。
表
实施例9
在带有不同抗体的质粒的两种病毒存在下感染
已经在pLVX mAb1-M和pLVX mAb2-M汇集物的混合物存在的情况下转导了细胞。采用PCR计算的不同MOI值(1000、100和40)转导细胞。在转导后，通过与mAb1-抗原-Alexa488缀合物和mAb2-抗原-Cy5缀合物温育，对分选细胞单克隆(IgG+)染色。
图11中显示结果。
实施例10
用不同的全长IgG慢病毒载体感染细胞
如实施例2中报道，用以下慢病毒表达载体，产生病毒：
-无IRES的pLVX MS，两个含有hCMV启动子的分开的表达盒，用于表达膜结合型和分泌型全长抗体；
-具有IRES的pLVX MS，带一个hCMV启动子的一个双顺反子表达盒，用于表达膜结合型和分泌型全长抗体；
-具有IRES的pLVX M，带一个hCMV启动子的一个双顺反子表达盒，用于表达膜结合型全长抗体。
用包含这三种载体的稀释病毒，如实施例4中所述，转导细胞。用抗人IgG(H+L)抗体Alexa488缀合物染色后，通过FACS分析转导的细胞。图12和图13中显示结果。
实施例11
从B细胞扩增核酸
从抗原特异性B细胞分离总RNA。使用模板转换方案(Zhu等人,BioTechniques30(2001)892-897)，采用CDS寡核苷酸(5'-AAG CAG TGGTAA CAA CGC AGA GTA CTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTT TVN-3'，SSEQ ID NO:36)作为引物和SMART II寡核苷酸(5'-d[AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CGC]r[GGG]-3'，SEQID NO:37)作为转换模板，用PowerScriptTM逆转录酶(Clontech)，产生单链cDNA。在200μl总体积中使用Advantage2聚合酶混合物(Clontech)和锚引物(5'-AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3'，SEQ ID NO:38)，通过14个循环PCR，大批(bulk)扩增cDNA。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化双链cDNA。
对于穴构建体，用1个有义引物(SEQ ID NO:5)加4个反义引物(SEQID NO:1至SEQ ID NO:4)的等摩尔混合物，对于结构建体，用1个有义引物(SEQ ID NO:11)加5个反义引物(SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10)的等摩尔混合物，扩增重链可变区编码序列；用7个有义引物(SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:18)的等摩尔混合物加1个反义引物(SEQ ID NO:19)的等摩尔混合物，扩增κ轻链可变区编码序列；以及，用7个有义引物(SEQID NO:20至SEQ ID NO:27)的等摩尔混合物外加1个反义引物(SEQ IDNO:28)的等摩尔混合物，扩增λ轻链可变区编码序列。
可以使用引物SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30扩增，借助IRES连接的穴和结重链的编码区。
实施例12
通过荧光激活的细胞分选法，富集展示特异性结合抗体的细胞
亚汇合(80％)的HEK细胞用全长抗体文库或作为阴性对照的空病毒载体以感染复数(MOI)0.2感染。在5小时后，细胞用细胞解离缓冲液(Sigma)脱壁、洗涤并染色。将一半细胞用Alexa647nm-标记的抗原(4μg/ml)染色30分钟。剩余细胞用Alexa546nm-标记的抗原(4μg/ml)和来自兔的抗慢病毒血清(1:6000稀释)染色30分钟，随后用Cy5标记的驴抗兔IgG(1μg/ml)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)染色20分钟。随后将全部细胞洗涤、过滤并用碘化丙啶(PI)染色以排除死细胞。在FACS Vantage SE流式细胞仪(Becton Dickinson)上，分别针对Alexa647nm阳性、PI阴性细胞和Alexa546nm阳性、慢病毒阳性、PI阴性细胞，进行单细胞分选。
将每个细胞分选至含有50％汇合的HEK饲养细胞的24孔平板孔中。一旦病毒扩散(分选后2-3日)，通过FACS分析，对感染的细胞进行抗原结合的检测。
实施例13
膜锚定物对双特异性抗体的细胞表面表达的影响
将1*105个HEK293A细胞接种在24孔平板的孔中并温育过夜。次日，将细胞用0.5μg共同轻链载体和0.5μg V1.1至V1.5穿梭载体(驱动两条不同重链表达)共转染。与共同轻链组合的重链B结合至抗原，而与共同轻链组合的重链N不与抗原结合。
用山羊抗人IgG(H+L)-Alexa488缀合物(Invitroge目录号A11013)和生物素化抗原和链霉亲和素-PE(SA-PE)进行双重染色。转染后48小时进行FACS分析。
使用的穿梭载体是：
V.1.1：M-B(结)-IRES-M-B(穴)(膜锚定物在两个结合物重链上)
V.1.2：M-B(结)-IRES-M-N(穴)(膜锚定物在两条重链上，结合物和非结合物)
V.1.3：M-N(结)-IRES-B(穴)(膜锚定物仅在非结合物上)
V.1.4：B(结)-IRES-M-N(穴)(膜锚定物仅在非结合物上)
V.1.5：M-N(结)-IRES-M-N(穴)(仅非结合物，膜锚定物在两条重链上)
V.1.6：B(穴)-IRES-M-N(结)(膜锚定物在非结合物上，结和穴交换)当两条重链以结入穴(knob-into-hole)技术形成异二聚体时，非结合性抗体部分(N)上的跨膜锚定物足以使结合性抗体部分B展示在细胞表面上(V1.4，图17)，这表明单个跨膜锚定物足以使由两条不同重链和一条共同轻链组成的完整IgG展示在细胞表面上。

Claims (171)

1.一种选择表达双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-IRES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-IRES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，其中所述重链之一或二者还在其C末端包含跨膜结构域，和
(b)根据展示的膜结合型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
2.根据权利要求1的方法，特征在于仅EV71-IRES下游的重链在其C末端包含跨膜结构域。
3.一种选择分泌双特异性抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中每个慢病毒病毒粒子包含编码分泌型双特异性抗体的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含在EV71-IRES上游的穴基因座或结基因座中编码第一重链可变域的核酸、和在EV71-IRES下游的相应另一个基因座中编码第二重链可变域的核酸，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，其中真核细胞表达共同轻链，和
(b)根据分泌型全长双特异性抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞展示或分泌单一全长双特异性抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，表征在于，包括以下一个或多个步骤作为第一步骤：
-用目的抗原免疫转基因动物，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，和/或
-通过FACS通过大批分选，选择免疫的实验动物的B细胞，和/或
-通过分开PCR扩增，获得每个B-细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单一限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体。
6.根据权利要求1至2和4至5中任一项的方法，特征在于包括步骤：
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体，任选地如果存在第一重链的跨膜结构域，通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域。
7.根据权利要求1至2和4至6中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-任选地，编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
8.根据权利要求3至6中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
15.根据权利要求1至13中任一项的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
16.根据权利要求1至15中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
18.根据权利要求1至17中任一项的方法，特征在于该跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
19.根据权利要求1至18中任一项的方法，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
20.根据权利要求1至19中任一项的方法，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
21.一种选择表达抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)通过用慢病毒病毒粒子群体转导，产生真核细胞群体，其中细胞群体的每个细胞展示膜结合型全长抗体，其中所述抗体的至少两条链由双顺反子表达盒编码，并且所述抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合，和
(b)根据展示的膜结合型全长抗体的特性，从真核细胞群体选择细胞，
其中，慢病毒病毒粒子群体的每个慢病毒病毒粒子包含双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含EV71-IRES用于表达膜结合型抗体。
22.根据权利要求21的方法，特征在于慢病毒病毒粒子群体的慢病毒病毒粒子的每个双顺反子表达盒编码亲本抗体的不同变体，所亲本抗体与一种或多种抗原或相同抗原上的一个或多个表位特异性结合。
23.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
24.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-任选地，编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
25.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码在其C末端与scFv连接的全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
26.根据权利要求21至22中任一项的方法，特征在于双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码在其C末端与scFab连接的全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
27.根据权利要求21至26中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞均展示膜结合型全长抗体并且分泌全长抗体。
28.根据权利要求21至26中任一项的方法，特征在于真核细胞群体的每个细胞均展示并且分泌单一全长抗体。
29.根据权利要求21至28中任一项的方法，特征在于抗体与抗原特异性结合。
30.根据权利要求21至23中任一项的方法，特征在于抗体是双价单特异性抗体。
31.根据权利要求21至22和24中任一项的方法，特征在于抗体是双价双特异性抗体。
32.根据权利要求21至22和25至26中任一项的方法，特征在于抗体是四价双特异性抗体。
33.根据权利要求21至28和31至32中任一项的方法，特征在于抗体与两种不同抗原或与相同抗原上的两个表位特异性结合。
34.根据权利要求31至33中任一项的方法，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
35.根据权利要求31至34中任一项的方法，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
36.根据权利要求21至35中任一项的方法，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
37.根据权利要求21至36中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
38.根据权利要求21至36中任一项的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
39.根据权利要求21至38中任一项的方法，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
40.根据权利要求21至39中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
41.根据权利要求21至40中任一项的方法，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
42.根据权利要求21至41中任一项的方法，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
43.根据权利要求21至42中任一项的方法，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
44.一种双顺反子表达盒，其以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
45.一种双顺反子表达盒，其以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
46.根据权利要求44至45中任一项的双顺反子表达盒，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
47.根据权利要求44至46中任一项的双顺反子表达盒，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
48.根据权利要求44至47中任一项的双顺反子表达盒，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
49.根据权利要求44至48中任一项的双顺反子表达盒，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
50.根据权利要求44至49中任一项的双顺反子表达盒，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
51.根据权利要求44至50中任一项的双顺反子表达盒，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
52.根据权利要求44至51中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
53.根据权利要求44至52中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
54.根据权利要求44至53中任一项的双顺反子表达盒，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
55.根据权利要求44至54中任一项的双顺反子表达盒，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
56.真核细胞，包含根据权利要求44至55中任一项的双顺反子表达盒。
57.根据权利要求56的真核细胞，特征在于双顺反子表达盒已经转导入了所述细胞中。
58.根据权利要求56至57中任一项的真核细胞，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
59.根据权利要求58的真核细胞，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
60.一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码全长抗体轻链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码全长抗体重链的第二核酸，
-可剪接内含子，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
61.一种包含双顺反子表达盒的慢病毒载体，所述双顺反子表达盒以5'至3'方向包含
-启动子，
-编码第一全长抗体重链的第一核酸，
-EV71-IRES，
-编码第二全长抗体重链的第二核酸，和
-编码跨膜结构域或GPI-锚的核酸。
62.根据权利要求60至61中任一项的慢病毒载体，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
63.根据权利要求60至62中任一项的慢病毒载体，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
64.根据权利要求60至63中任一项的慢病毒载体，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
65.根据权利要求60至64中任一项的慢病毒载体，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
66.根据权利要求60至65中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
67.根据权利要求60至66中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
68.根据权利要求60至67中任一项的慢病毒载体，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
69.根据权利要求60至68中任一项的慢病毒载体，特征在于抗体是人源化或人抗体，特别是人抗体。
70.真核细胞，包含根据权利要求60至69中任一项的慢病毒载体。
71.根据权利要求70的真核细胞，特征在于细胞已经转导了所述慢病毒载体。
72.根据权利要求70至71中任一项的真核细胞，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
73.根据权利要求72的真核细胞，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
74.根据权利要求60至69中任一项的慢病毒载体的用途，用于产生展示或分泌或者展示且分泌全长抗体的真核细胞群体。
75.根据权利要求74的用途，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
76.根据权利要求75的用途，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
77.包含两个或更多个慢病毒颗粒的慢病毒载体文库，每个慢病毒颗粒都包含根据权利要求60至69中任一项的表达载体，其中每种载体所编码的抗体彼此差异至少一个氨基酸。
78.根据权利要求77的慢病毒载体文库，特征在于载体文库由1,000至1,000,000个不同的表达载体组成。
79.根据权利要求77至78中任一项的慢病毒载体文库，特征在于由载体文库的载体编码的抗体在抗体的CDR之一中相差至少一个氨基酸残基。
80.根据权利要求79的慢病毒载体文库，特征在于该CDR是重链CDR3。
81.根据权利要求77至80中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过随机化亲本表达载体的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基，获得该表达载体文库。
82.根据权利要求77至81中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过组合编码两种不同半抗体的核酸，获得该慢病毒表达载体文库。
83.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用从B细胞的汇集物获得的编码HCVR和LCVR的核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
84.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用从HCVR和LCVR编码核酸的汇集物选出的成对HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，所述汇集物通过随机化从单一B细胞获得的HCVR和LCVR编码核酸的至少一个密码子而获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
85.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用成对的不同HCVR编码核酸和单一LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述不同的HCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
86.根据权利要求77至82中任一项的慢病毒载体文库，特征在于通过使用成对的不同LCVR编码核酸和单一HCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，其中所述不同的LCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
87.根据权利要求77至86中任一项的慢病毒载体文库，特征在于单一B细胞是B细胞克隆群体。
88.根据权利要求77至87中任一项的慢病毒载体文库，特征在于产生慢病毒表达文库的多样性包括步骤
(a)：
(i)从B细胞亚群分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；和
(v)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(b)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生第一DNA分子汇集物，
(vi)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生第二DNA分子汇集物，和
(vii)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(c)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子的配对；
或(d)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第一DNA分子的配对。
89.根据权利要求77至88中任一项的慢病毒载体文库，特征在于编码免疫球蛋白重链的核酸包含该基因组结构的免疫球蛋白重链基因的全部外显子和除一个内含子之外的全部内含子。
90.根据权利要求77至89中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域是跨膜结构域的片段或GPI-锚的信号肽，其中该跨膜结构域的片段由单个外显子编码。
91.根据权利要求77至90中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域是由不带基因组间插内含子的单个外显子的M1-M2-外显子融合物编码的免疫球蛋白跨膜结构域。
92.根据权利要求77至91中任一项的慢病毒载体文库，特征在于跨膜结构域由cDNA编码。
93.包含两个或更多个真核细胞的真核细胞文库，每个细胞包含根据权利要求44至55中任一项的双顺反子表达盒或根据权利要求60至69中任一项的慢病毒载体，其中每个细胞所表达的抗体彼此差异至少一个氨基酸。
94.真核细胞文库，包含根据权利要求77至92的慢病毒载体文库。
95.根据权利要求94的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库的每个真核细胞表达单一抗体。
96.根据权利要求94至95中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库的每个真核细胞展示单一抗体。
97.根据权利要求94至96中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是表达抗体文库的真核细胞群体，其中编码核酸源自经免疫动物的B细胞群体。
98.根据权利要求97的真核细胞文库，特征在于，就B细胞对一种或多种目的抗原的特异性，预先选择B细胞。
99.根据权利要求94至98中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的全长抗体的第一表达盒和编码与第二抗原特异性结合的全长抗体的第二表达盒。
100.根据权利要求94至99中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含第一表达盒和第二表达盒，所述第一表达盒编码与第一抗原结合的第一全长抗体轻链和第一全长抗体重链，所述第二表达盒编码与第二抗原特异性结合的第二全长抗体轻链和第二全长抗体重链。
101.根据权利要求94至100中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞文库是这样的真核细胞群体，其中每个细胞均包含编码与第一抗原特异性结合的第一全长抗体重链和与第二抗原特异性结合的第二全长抗体重链的表达盒，其中真核细胞表达共同轻链。
102.根据权利要求94至102中任一项的真核细胞文库，特征在于第一全长抗体重链包含穴突变并且第二抗体重链包含结突变。
103.根据权利要求94至101中任一项的真核细胞文库，特征在于第一全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第一全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域，或第二全长抗体轻链包含CH1结构域作为恒定域并且第二全长抗体重链包含CL结构域作为第一恒定域。
104.根据权利要求94至103中任一项的真核细胞文库，特征在于全长抗体包含人源恒定区，特别是人IgG1、IgG2或IgG4类的恒定区。
105.根据权利要求94至104中任一项的真核细胞文库，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
106.根据权利要求94至105中任一项的真核细胞文库，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
107.根据权利要求94至106中任一项的真核细胞文库，特征在于分离的B细胞的群体或单一B细胞或B细胞克隆群体来自从以下选择的来源：(a)血液；(b)次级淋巴器官，特别是脾或淋巴结；(c)骨髓；和(d)包含记忆B细胞的组织。
108.根据权利要求107的真核细胞文库，特征在于分离的B细胞的群体包含外周血单个核细胞(PBMC)或特别地由其组成。
109.根据权利要求94至108中任一项的真核细胞文库，特征在于动物是哺乳动物，特别是大鼠、小鼠、兔或人类。
110.根据权利要求109的真核细胞文库，特征在于动物是转基因小鼠或转基因兔或人。
111.根据权利要求94至110中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；并且
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞或单一B细胞。
112.根据权利要求94至111中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇包被载体；
(b)使分离的B细胞的群体与载体接触并且允许B细胞借助目的抗原或其片段或抗原决定簇与载体结合；
(c)移除未结合的B细胞，其中特别地载体包含珠或进一步特别地由珠组成，其中再进一步特别地，珠是顺磁珠；和
(d)从顺磁珠回收B细胞亚群或单一B细胞。
113.根据权利要求94至112中任一项的真核细胞文库，特征在于通过FACS分选，实施从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞。
114.根据权利要求94至113中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合的B细胞。
115.根据权利要求94至114中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞群体或单一B细胞；和
(c)针对至少一个额外参数，选择B细胞，其中特别地，针对至少一个额外参数进行的选择是
(i)针对下述参数的正选择，所述参数选自：存在B细胞特异性标志物、特别是CD19或B220，和B细胞活力；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在、和凋亡标志物的存在。
116.根据权利要求94至115中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群还包括步骤：选择类别转换的B细胞，特别是IgM阴性和/或IgD阴性B细胞、最特别地IgM阴性和IgD阴性B细胞。
117.根据权利要求94至116中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用第一荧光染料标记，其中荧光染料特别是Alexa647nm、Alexa488或Alexa546nm；
(b)使分离的B细胞群体的细胞与抗-IgM和/或抗-IgD抗体接触，其中抗-IgM和/或抗-IgD抗体用第二和/或第三荧光染料标记，其中第二和/或第三荧光染料在与第一荧光染料发射荧光的波长不同的波长发射荧光；和
(c)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合但是不与抗-IgM结合和/或不与抗-IgD抗体结合的B细胞群体或单一B细胞。
118.根据权利要求94至117中任一项的真核细胞文库，特征在于文库是病毒文库，特别地是慢病毒文库，并且通过用病毒文库、特别用慢病毒文库感染真核细胞、特别地哺乳动物细胞，将文库引入第一真核细胞群体、特别是第一哺乳动物细胞群体，其中还特别地，感染以最多10、特别地最多1、更特别地最多0.2和最特别地最多0.1的感染复数进行。
119.根据权利要求118的真核细胞文库，特征在于感染复数是约0.1。
120.根据权利要求94至119中任一项的真核细胞文库，特征在于通过FACS分选，实施细胞的分离。在一个实施方案中，细胞的分离包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇染色第一真核细胞群体、特别是哺乳动物细胞群体，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选，分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体。
121.根据权利要求94至120中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选法分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体包括步骤：就至少一个额外参数，进一步选择细胞。
122.根据权利要求94至122中任一项的真核细胞文库，特征在于所述方法还包括步骤：
(a)在第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体存在的情况下培养至少一个、特别地就一个、细胞个体；
(b)验证第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力。
123.根据权利要求94至122中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或、特别是并且第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体，包含选自以下的细胞或特别地由选自以下的细胞组成：(a)BHK21细胞、特别是ATCC CCL-10；(b)Neuro-2a细胞；(c)HEK-293T细胞、特别是ATCC CRL-11268；(d)CHO-K1细胞、特别是ATCC CRL-62；和(e)HEK293细胞。
124.根据权利要求94至123中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体包含CHO-K1细胞或特别地由CHO-K1细胞组成，其中还特别地，表达文库是慢病毒表达文库。
125.一种选择表达与目的抗原特异性结合的抗体的细胞的方法，包括步骤
(a)任选地，从B细胞群体选择分泌特异性结合一种或多种抗原的抗体的B细胞亚群或单一B细胞或B细胞克隆群体，
(b)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员都编码特异性结合一种或多种抗原的抗体(一种或多种)的变体，
(i)产生多重DNA分子，其中所述产生包括自B细胞亚群扩增DNA分子汇集物的步骤、或从编码与一种或两种目的抗原特异性结合的单一抗体的DNA通过随机化该编码核酸序列而产生DNA分子文库的步骤，和
(ii)将该多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链；
(c)用每个病毒粒子各包含一个慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体转导真核细胞群体；
(d)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(e)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合目的抗原(一种或多种)或其片段或抗原决定簇的能力，选择细胞。
126.一种选择表达双特异性抗体(其与两种目的抗原特异性结合)的细胞的方法，所述方法包括步骤
(a)通过以下方式产生慢病毒表达文库，其中慢病毒表达文库的每个成员均编码双特异性抗体的变体，
(i)从编码单一双特异性抗体的DNA，通过随机化该编码核酸序列，产生多重DNA分子，和
(ii)将该多重DNA分子克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒用于以膜结合形式表达全长双特异性抗体；
(b)用每个病毒粒子各包含一个慢病毒表达文库成员的慢病毒病毒粒子群体，转导真核细胞群体；
(c)在真核哺乳动物细胞的表面上展示由慢病毒表达文库编码的抗体；和
(d)从真核细胞群体分离细胞，其中就细胞表面上展示的抗体特异性结合所述目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力，选择细胞。
127.根据权利要求125至126中任一项的方法，特征在于，该方法包括产生编码抗体的多重DNA分子，所述产生多重DNA分子包括步骤：
(1)从B细胞亚群，扩增编码重链可变区(HCVR)的DNA分子的第一汇集物；并且
(2)从B细胞亚群，扩增编码轻链可变区(LCVR)的DNA分子的第二汇集物；
(3)将编码LCVR的多重DNA分子和编码HCVR的多重DNA分子的组合克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
128.根据权利要求125至127中任一项的方法，特征在于，该方法包括产生编码抗体的多重DNA分子，其中所述抗体与一种或两种目的抗原特异性结合，所述产生多重DNA分子包括步骤：
(1)从单一B细胞或B细胞克隆群体，扩增编码HCVR的DNA分子和编码LCVR的DNA分子，和
(2)通过随机化至少一个密码子，将编码HCVR的DNA分子和/或编码LCVR的DNA分子进行随机化，从而产生编码HCVR的多重DNA分子和编码LCVR的多重DNA分子；
(3)将随机化的编码LCVR的多重DNA分子和编码HCVR的多重DNA分子的组合克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
129.根据权利要求125至128中任一项的方法，特征在于，所述方法包括产生慢病毒表达文库，所述产生包括步骤：
(i)产生编码抗体的多重DNA分子，所述产生包括步骤：
(1)从B细胞亚群分离mRNA；
(2)将mRNA转录成cDNA；
(3)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；和
(4)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；
(ii)将来自第一DNA分子汇集物和第二DNA分子汇集物的DNA分子对，克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒。
130.根据权利要求135至129中任一项的方法，特征在于，所述方法包括产生慢病毒表达文库，所述产生包括步骤：
(i)产生编码与一种或两种抗原特异性结合的抗体的多重DNA分子，所述产生包括步骤：
(1)从单一B细胞或B细胞克隆群体，分离mRNA；
(2)将mRNA转录成cDNA；
(3)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(4)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(5)随机化第一和/或第二DNA分子，由此产生第一DNA分子汇集物和第二DNA分子汇集物，
(ii)将来自第一和第二DNA分子汇集物的DNA分子对，克隆入慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含用于以可溶形式以及膜结合形式表达全长抗体轻链和全长抗体重链的、EV71-IRES连接的双顺反子表达盒，所述表达盒。
131.根据权利要求125至130中任一项的方法，特征在于真核细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
132.根据权利要求131的方法，特征在于哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK细胞。
133.根据权利要求125至132中任一项的方法，特征在于动物选自羊、麋鹿、鹿、驴、骡鹿、貂、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、仓鼠、豚鼠和小鼠。在一个实施方案中，动物是小鼠、大鼠或灵长类。
134.根据权利要求125至133中任一项的方法，特征在于动物是非人灵长类或人。
135.根据权利要求125至134中任一项的方法，特征在于动物是具有人免疫球蛋白基因座的转基因动物。
136.根据权利要求125至135中任一项的方法，特征在于，通过就B细胞特异性结合目的抗原的能力进行B细胞选择，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群，以获得核酸。
137.根据权利要求125至136中任一项的方法，特征在于，通过就B细胞特异性结合一种或两种目的抗原的能力进行B细胞选择，从分离的B细胞的群体选出单一B细胞，以获得核酸。
138.根据权利要求125至137中任一项的方法，特征在于单一B细胞是B细胞克隆群体。
139.根据权利要求125至138中任一项的方法，特征在于，通过从单一B细胞或B细胞克隆群体的分离mRNA扩增可变域编码核酸，并且将扩增的mRNA转录成cDNA，获得核酸。
140.根据权利要求125至139中任一项的方法，特征在于，通过使用从B细胞的汇集物获得的HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒载体文库的多样性，所述B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
141.根据权利要求125至140中任一项的方法，特征在于，通过使用从HCVR和LCVR编码核酸的汇集物选择的成对HCVR和LCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述汇集物通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸和LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，其中所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
142.根据权利要求125至140中任一项的方法，特征在于，通过使用成对的不同HCVR编码核酸和单一LCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述不同的HCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的HCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
143.根据权利要求125至142中任一项的方法，特征在于，通过使用成对的不同LCVR编码核酸和单一HCVR编码核酸，产生慢病毒表达文库的多样性，其中所述不同的LCVR编码核酸通过随机化从单一B细胞获得的LCVR编码核酸的至少一个密码子来获得，所述单一B细胞产生与一种抗原或两种不同抗原特异性结合或与相同抗原的两个不同的非重叠表位特异性结合的抗体。
144.根据权利要求125至143中任一项的方法，特征在于，所述单一B细胞是B细胞克隆群体。
145.根据权利要求125至144中任一项的方法，特征在于，产生慢病毒表达文库的多样性包括步骤
(a)：
(i)从B细胞亚群分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子汇集物；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子汇集物；和
(v)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(b)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生第一DNA分子汇集物，
(vi)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生第二DNA分子汇集物，和
(vii)成对地提供第一DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子汇集物的一个成员的配对；
或(c)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第一DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第二DNA分子的配对；
或(d)：
(i)从单一B细胞或从B细胞克隆群体分离RNA，
(ii)将RNA转录成cDNA；
(iii)使用包含至少两种能够扩增HCVR编码区的寡核苷酸的第一寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第一DNA分子；
(iv)使用包含至少两种能够扩增LCVR编码区的寡核苷酸的第二寡核苷酸混合物，从cDNA扩增出第二DNA分子；
(v)通过随机化第二DNA分子的至少一个密码子，产生DNA分子汇集物，和
(vi)成对地提供DNA分子汇集物的一个成员和第一DNA分子的配对。
146.根据权利要求125至145中任一项的方法，特征在于，通过随机组合不同的轻链可变区和重链可变区，增加抗原特异性抗体的变化性。
147.根据权利要求125至146中任一项的真核细胞文库，特征在于，分离的B细胞的群体或单一B细胞或B细胞克隆群体来自从以下选择的来源：(a)血液；(b)次级淋巴器官，特别是脾或淋巴结；(c)骨髓；和(d)包含记忆B细胞的组织。
148.根据权利要求147的真核细胞文库，特征在于，分离的B细胞的群体包含外周血单个核细胞(PBMC)或特别地由其组成。
149.根据权利要求125至148中任一项的真核细胞文库，特征在于动物是哺乳动物，特别是大鼠、小鼠、兔或人类。
150.根据权利要求149的真核细胞文库，特征在于动物是转基因小鼠或转基因兔或人。
151.根据权利要求125至150中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；和
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞或单一B细胞。
152.根据权利要求125至151中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇包被载体；
(b)使分离的B细胞的群体与载体接触并且允许B细胞借助目的抗原或其片段或抗原决定簇与载体结合；
(c)移除未结合的B细胞，其中特别地载体包含珠或进一步特别地由珠组成，其中再进一步特别地，珠是顺磁珠；和
(d)从顺磁珠回收B细胞亚群或单一B细胞。
153.根据权利要求125至152中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选，实施从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞。
154.根据权利要求125至153中任一项的真核细胞文库，特征在于从分离的B细胞的群体选出B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；和
(b)通过FACS分选法，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合的B细胞。
155.根据权利要求125至154中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触；
(b)选择特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的B细胞群体或单一B细胞；和
(c)针对至少一个额外参数，选择B细胞，其中特别地，针对至少一个额外参数进行的选择是
(i)针对下述参数的正选择，所述参数选自：存在B细胞特异性标志物、特别是CD19或B220，和B细胞活力；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在、和凋亡标志物的存在。
156.根据权利要求125至155中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群还包括以下步骤：选择类别转换的B细胞，特别是IgM阴性和/或IgD阴性B细胞、最特别地IgM阴性和IgD阴性B细胞。
157.根据权利要求125至156中任一项的真核细胞文库，特征在于，从分离的B细胞的群体选择B细胞亚群或单一B细胞包括步骤：
(a)使分离的B细胞的群体与目的抗原或其片段或抗原决定簇接触，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用第一荧光染料标记，其中荧光染料特别是Alexa647nm、Alexa488或Alexa546nm；
(b)使分离的B细胞群体的细胞与抗-IgM和/或抗-IgD抗体接触，其中抗-IgM和/或抗-IgD抗体用第二和/或第三荧光染料标记，其中第二和/或第三荧光染料在与第一荧光染料发射荧光的波长不同的波长发射荧光；和
(c)通过FACS分选，分离与目的抗原或其片段或抗原决定簇结合但是不与抗-IgM结合和/或不与抗-IgD抗体结合的B细胞群体或单一B细胞。
158.根据权利要求125至157中任一项的真核细胞文库，特征在于，文库是病毒文库，特别地是慢病毒文库，并且通过用病毒文库、特别用慢病毒文库感染真核细胞、特别地哺乳动物细胞，将文库引入第一真核细胞群体、特别是第一哺乳动物细胞群体，其中还特别地，感染以最多10、特别地最多1、更特别地最多0.2和最特别地最多0.1的感染复数进行。
159.根据权利要求158的真核细胞文库，特征在于，感染复数是约0.1。
160.根据权利要求125至159中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选，实施细胞的分离。在一个实施方案中，细胞的分离包括步骤：
(a)用目的抗原或其片段或抗原决定簇染色第一真核细胞群体、特别是哺乳动物细胞群体，其中目的抗原或其片段或抗原决定簇用荧光染料标记；并且
(b)通过FACS分选，分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体。
161.根据权利要求125至160中任一项的真核细胞文库，特征在于，通过FACS分选法分离特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的细胞个体包括步骤：就至少一个额外参数，进一步选择细胞。
162.根据权利要求161的真核细胞文库，特征在于，该至少一个额外参数选自
(i)针对细胞活力的正选择；和/或
(ii)针对下述参数的负选择，所述参数选自：IgM抗体的存在；IgD抗体的存在、细胞死亡标志物的存在和凋亡标志物的存在。
163.根据权利要求125至162中任一项的真核细胞文库，特征在于，该方法还包括步骤：
(a)在第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体存在的情况下培养至少一个，特别地就一个，细胞个体；
(b)验证第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体特异性结合目的抗原或其片段或抗原决定簇的能力。
164.根据权利要求125至163中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或、特别是并且第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体，包含选自以下的细胞或特别地由选自以下的细胞组成：(a)BHK21细胞、特别是ATCC CCL-10；(b)Neuro-2a细胞；(c)HEK-293T细胞、特别是ATCC CRL-11268；(d)CHO-K1细胞、特别是ATCC CRL-62；和(e)HEK293细胞。
165.根据权利要求125至164中任一项的真核细胞文库，特征在于，第一真核细胞群体、特别地第一哺乳动物细胞群体和/或第二真核细胞群体、特别地第二哺乳动物细胞群体包含CHO-K1细胞或特别地由CHO-K1细胞组成，其中还特别地，表达文库是慢病毒表达文库。
166.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS，大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增编码重链的核酸：两个独立聚合酶链反应，引入单限制性位点使得可以定向克隆入穿梭载体，一个聚合酶链反应使用SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10的一种或多种引物或全部引物和SEQ ID NO:11的引物用于结链，一个聚合酶链反应使用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的一种或多种或全部引物和SEQ ID NO:5的引物用于穴链；连接：将编码第一重链可变域的核酸连入不带跨膜结构域的穴基因座中，即EV71-IRES上游，将编码第二重链可变域的核酸连入带跨膜结构域的结基因座中，即EV71-IRES下游，
-产生病毒，感染稳定表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择展示在哺乳动物细胞的表面上的双特异性抗体(通过解离速率筛选)，使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选(bulk sort)，
-使用例如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物，PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(其没有TM结构域)，将其克隆至不带跨膜结构域的第二穿梭载体中，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
167.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞表面上展示包含共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS、大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增重链编码核酸：两个独立聚合酶链反应，引入使得可以定向克隆入穿梭载体中的单限制性位点；连接：将第一重链可变域编码核酸连入带跨膜结构域的穴基因座中，即EV71-IRES上游，并且将第二重链可变域编码核酸连入带跨膜结构域的结基因座中，即EV71-IRES下游，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择哺乳动物细胞膜展示的双特异性抗体(通过解离速率筛选)，使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选，
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体；通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，选择双特异性抗体。
168.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞表面上展示包括共同轻链的全长抗体、及选择细胞和由此选择抗体，包括以下步骤：
-免疫实验动物如转基因兔，
-(通过FACS、大批分选(bulk sort))选择抗原特异性B细胞，
-PCR扩增重链编码核酸：两个独立聚合酶链反应，引入使得可以定向克隆入穿梭载体的单限制性位点；连接：将第一重链可变域编码核酸连接入第一穿梭载体中带或不带跨膜结构域的穴基因座中，并且将第二重链可变域编码核酸连接入第二穿梭载体中带或不带跨膜结构域的结基因座中，但是至少一个基因座具有跨膜结构域，
-产生病毒(一种病毒用于第一穿梭载体并且一种病毒用于第二穿梭载体)，用第一病毒和第二病毒依次感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，选择展示在哺乳动物细胞表面上的双特异性抗体(通过解离速率筛选)、使用FACS进行命中物(哺乳动物细胞克隆)的大批分选，
-PCR重链可变域编码核酸，并克隆入第三穿梭载体中于不带跨膜结构域和EV71-IRES的双顺反子表达单元中，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
169.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长双特异性抗体、及选择真核细胞和由此也选择双特异性抗体，包括以下步骤：
-将第一实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)用第一目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
-将第二实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)用第二目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
其中第一抗原和第二抗原是不同的，
-选择第一和第二经免疫的实验动物的B细胞，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选(bulk sorting)进行选择，
-通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体，
-将第一重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES上游、带跨膜结构域的穴基因座或结基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，并且将第二重链可变域编码核酸连接入相同的穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、带跨膜结构域的相应另一个基因座中，即如果IRES上游的重链具有穴基因座，则IRES下游的重链具有结基因座，并且反之亦然，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原是不同的，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-通过双重标记的转导细胞的FACS，选择在其表面上展示双特异性抗体的细胞，
-PCR整个第一重链编码核酸和包含EV71-IRES的第二重链的可变域编码核酸(2.2kbp)，并且克隆入不带跨膜结构域的第二穿梭载体；通过限制性切割和再连接入载体，移除第一重链的跨膜结构域，
-产生病毒，感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，对细胞作单细胞分选，筛选上清液中的双特异性抗体，并选择双特异性抗体。
170.一种工作流程/方法，所述工作流程/方法用于在真核细胞的表面上展示包括共同轻链的全长双特异性抗体、及选择真核细胞和由此也选择双特异性抗体，包括以下步骤：
-将实验动物(在一个实施方案中转基因小鼠或转基因兔)，用目的抗原(在一个实施方案中胞外受体结构域)免疫，其中实验动物的B细胞表达相同的轻链，
-选择免疫的实验动物的B细胞，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选进行选择，
-通过分开的PCR扩增，获得每个B-细胞的编码重链的核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体，
-将重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、带跨膜结构域的重链基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，其中穿梭载体/慢病毒表达载体在IRES上游包含编码共同轻链的核酸，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-通过抗原特异性标记的转导细胞的FACS，在一个实施方案中通过FACS通过大批分选，选择在其表面上展示抗体的细胞，
-通过分开的PCR扩增，获得每个所选择细胞的重链编码核酸，其中采用两个独立/相继的聚合酶链反应，所述聚合酶链反应引入单限制性位点以使得可以定向克隆入穿梭载体/慢病毒表达载体，
-将第一重链可变域编码核酸连接入穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES上游、不带跨膜结构域的穴基因座或结基因座中，在一个实施方案中IRES是EV71-IRES，并且将第二重链可变域编码核酸连接入相同的穿梭载体/慢病毒表达载体中IRES下游、不带跨膜结构域的相应另一个基因座中，即如果IRES上游的重链具有穴基因座，则IRES下游的重链具有结基因座，并且反之亦然，其中第一重链可变域与第一抗原结合并且第二可变域与第二抗原结合，其中第一抗原和第二抗原可以相同或不同，
-产生病毒，
-用病毒感染表达共同轻链的哺乳动物细胞，
-选择分泌双特异性抗体的细胞。
171.根据权利要求1至170中任一项的方法选择的细胞用于产生抗体的用途。
CN201280063751.7A 2011-12-22 2012-12-19 用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途 Expired - Fee Related CN104011080B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11195375.8 2011-12-22
EP11195375 2011-12-22
EP12179029.9 2012-08-02
EP12179029 2012-08-02
PCT/EP2012/076163 WO2013092720A1 (en) 2011-12-22 2012-12-19 Full length antibody display system for eukaryotic cells and its use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104011080A true CN104011080A (zh) 2014-08-27
CN104011080B CN104011080B (zh) 2017-10-20

Family

ID=47458959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280063751.7A Expired - Fee Related CN104011080B (zh) 2011-12-22 2012-12-19 用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20150038354A1 (zh)
EP (1) EP2794662A1 (zh)
JP (1) JP2015503907A (zh)
KR (1) KR20140107295A (zh)
CN (1) CN104011080B (zh)
BR (1) BR112014013035A2 (zh)
CA (1) CA2854246A1 (zh)
HK (1) HK1200849A1 (zh)
MX (1) MX2014007262A (zh)
RU (1) RU2625033C2 (zh)
SG (1) SG11201403445YA (zh)
WO (1) WO2013092720A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020047818A1 (zh) * 2018-09-03 2020-03-12 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
WO2020177719A1 (zh) * 2019-03-05 2020-09-10 信达生物制药(苏州)有限公司 展示与分泌目的多肽的酵母展示系统及其用途
WO2021057726A1 (zh) * 2019-09-23 2021-04-01 南开大学 利用哺乳动物展示筛选FcγR特异性结合Fc
CN113150122A (zh) * 2021-05-19 2021-07-23 上海儒克生物科技有限公司 高通量全兔源单克隆抗体的制备方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
KR20130097156A (ko) 2010-07-26 2013-09-02 트리아니, 인코포레이티드 트랜스제닉 동물 및 이의 사용 방법
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
GB201407852D0 (en) * 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
AU2015336308B2 (en) * 2014-10-20 2020-05-14 The Scripps Research Institute Proximity based methods for selection of binding partners
CN104818295A (zh) * 2015-02-03 2015-08-05 武汉友芝友生物制药有限公司 制备和筛选表达双特异性抗体细胞株的方法
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
WO2017136734A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
AU2017236796B2 (en) * 2016-03-19 2021-07-15 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulated expansion thereof
CN109790214B (zh) 2016-09-29 2022-09-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用于选择产生多肽的细胞的改进方法
GB201720351D0 (en) 2017-12-06 2018-01-17 Iontas Ltd Selecting for developability in drug discovery
CN118696055A (zh) * 2021-12-23 2024-09-24 赫尔辛基大学 筛选用于在哺乳动物细胞中有效表达和分泌异源多肽的信号肽的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1429916A (zh) * 2001-12-30 2003-07-16 韩泽广 规模化原核和真核细胞体内抗体和抗原文库构建及筛选
CN1566341A (zh) * 2003-06-12 2005-01-19 北京安波特基因工程技术有限公司 一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
JP4213224B2 (ja) * 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
PT994903E (pt) 1997-06-24 2005-10-31 Genentech Inc Metodos e composicoes para glicoproteinas galactosiladas
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
IL149809A0 (en) 1999-12-15 2002-11-10 Genentech Inc Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1340088B1 (en) 2000-11-17 2007-01-17 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
NZ603111A (en) 2001-08-03 2014-05-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2003024481A2 (en) 2001-09-14 2003-03-27 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use
ES2321491T3 (es) 2001-10-05 2009-06-08 Cytos Biotechnology Ag Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos.
DE60232265D1 (de) 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
CN1321695C (zh) 2001-11-07 2007-06-20 赛托斯生物技术公司 用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的展示il－5、il－3或嗜酸细胞活化趋化因子的抗原阵列
KR20050044316A (ko) 2001-11-07 2005-05-12 사이토스 바이오테크놀로지 아게 호산구성 알레르기 질환 치료용의 ｉｌ-5, ｉｌ-13 또는에오탁신을 제시하는 항원 어레이
CA2467363A1 (en) * 2001-11-16 2003-06-12 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
US7749753B2 (en) 2002-04-09 2010-07-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
NZ556507A (en) 2002-06-03 2010-03-26 Genentech Inc Synthetic antibody phage libraries
US20050112095A1 (en) * 2002-07-09 2005-05-26 Tsu-An Hsu Internal ribosome entry sites for recombinant protein expression
AU2003246690B2 (en) 2002-07-17 2010-03-11 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein
AU2003250106B2 (en) 2002-07-18 2009-11-26 Cytos Biotechnology Ag Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof
BR0311800A (pt) 2002-07-19 2005-03-22 Cytos Biotechnology Ag Conjugados ghrelina-veìculo
ATE506964T1 (de) 2002-07-19 2011-05-15 Cytos Biotechnology Ag Impfstoffzusammensetzungen enthaltende amyloid beta 1-6 antigenarrays
BRPI0316779B8 (pt) 2002-12-16 2023-02-28 Genentech Inc Anticorpo anti-cd20 humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seus usos, composição, artigo manufaturado e formulação líquida
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7442381B2 (en) * 2003-03-20 2008-10-28 Alphavax, Inc. Alphavirus replicons and helper constructs
AU2004223736B2 (en) 2003-03-26 2010-05-27 Cytos Biotechnology Ag Melan-A peptide analogue-virus-like-particle conjugates
US20060286035A1 (en) 2003-04-29 2006-12-21 Cytos Biotechnology Ag Methods and compositions for modulating the interaction between adiponectin and its receptor
US20070087331A1 (en) 2003-05-15 2007-04-19 Cytos Biotechnology Ag Selection of b cells with specificity if interest: method of preparation and use
ES2408582T3 (es) * 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
DE602004031017D1 (de) 2003-07-10 2011-02-24 Cytos Biotechnology Ag Zusammensetzung verpackte virusartige teilchen umfassend zur verstärkung einer immunantwort
US7585668B2 (en) 2003-07-15 2009-09-08 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Humanized immunoglobulin loci
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
DK2077282T3 (en) 2003-11-05 2017-01-30 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with elevated Fc receptor binding affinity and effector function
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
US20050191317A1 (en) 2004-01-20 2005-09-01 Cytos Biotechnology Ag Ghrelin-carrier conjugates
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005108425A1 (en) 2004-05-10 2005-11-17 Cytos Biotechnology Ag Il-23 p19 antigen array and uses thereof
WO2005117983A2 (en) 2004-06-02 2005-12-15 Cytos Biotechnology Ag Carrier conjugates of tnf-peptides
MXPA06013854A (es) 2004-06-02 2007-03-02 Cytos Biotechnology Ag Usos medicos de conjugados portadores de peptidos del factor de necrosis tumoral, no humanos.
AU2005281743A1 (en) 2004-08-04 2006-03-16 Cytos Biotechnology Ag Carrier conjugates of GnRH-peptides
AU2005286475A1 (en) 2004-09-21 2006-03-30 Cytos Biotechnology Ag Virus-like particles comprising a fusion protein of the coat protein of AP205 and an antigenic polypeptide
BRPI0516775A (pt) 2004-10-25 2008-09-23 Cytos Biotechnology Ag ensaios de polipeptìdeo de antìgeno de inibidor gástrico (gip) e seus usos
ZA200704908B (en) 2004-12-13 2008-10-29 Cytos Biotechnology Ag IL-15 Antigen Arrays and uses thereof
AU2006224529B2 (en) 2005-03-18 2012-05-24 Cytos Biotechnology Ag Cat allergen fusion proteins and uses thereof
WO2007047578A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Inc. Cell display of antibody libraries
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
US7846724B2 (en) * 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
US20070292936A1 (en) 2006-05-09 2007-12-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP1975239A1 (en) * 2006-09-27 2008-10-01 Bundesrepublik Deutschland, letztvertreten durch den Präsidenten des Paul-Ehrlich-Instituts Prof. Dr. Johannes Löwer Pseudotyping of retroviral vectors, methods for production and use thereof for targeted gene transfer and high-throughput screening
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
MX350962B (es) 2008-01-07 2017-09-27 Amgen Inc Metodo para fabricar moleculas heterodimericas de fragmentos cristalizables de anticuerpo, utilizando efectos electrostaticos de direccion.
EP2098536A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-09 4-Antibody AG Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
MX2011011925A (es) 2009-05-27 2011-12-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos.
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
CN103261220B (zh) * 2010-08-16 2016-06-15 诺夫免疫股份有限公司 用于生成多特异性和多价抗体的方法
CA2791109C (en) * 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1429916A (zh) * 2001-12-30 2003-07-16 韩泽广 规模化原核和真核细胞体内抗体和抗原文库构建及筛选
CN1566341A (zh) * 2003-06-12 2005-01-19 北京安波特基因工程技术有限公司 一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAN TAUBE.ET AL: "LENTIVIRUS DISPLAY:STABLE EXPRESSION OF HUMAN ANTIBODY ON THE SURFACE OF HUMAN CELLS AND VIRUS PARTICLES.", 《PLOS ONE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020047818A1 (zh) * 2018-09-03 2020-03-12 广西慧宝源健康产业有限公司 双特异性抗体及其使用方法
WO2020177719A1 (zh) * 2019-03-05 2020-09-10 信达生物制药(苏州)有限公司 展示与分泌目的多肽的酵母展示系统及其用途
WO2021057726A1 (zh) * 2019-09-23 2021-04-01 南开大学 利用哺乳动物展示筛选FcγR特异性结合Fc
CN113150122A (zh) * 2021-05-19 2021-07-23 上海儒克生物科技有限公司 高通量全兔源单克隆抗体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140107295A (ko) 2014-09-04
BR112014013035A2 (pt) 2018-10-09
SG11201403445YA (en) 2014-07-30
RU2625033C2 (ru) 2017-07-11
CN104011080B (zh) 2017-10-20
US20150038354A1 (en) 2015-02-05
CA2854246A1 (en) 2013-06-27
MX2014007262A (es) 2014-08-01
EP2794662A1 (en) 2014-10-29
WO2013092720A1 (en) 2013-06-27
HK1200849A1 (zh) 2015-08-14
JP2015503907A (ja) 2015-02-05
RU2014129736A (ru) 2016-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104011080B (zh) 用于真核细胞的全长抗体展示系统及其用途
CN104011075B (zh) 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
JP2015522286A (ja) 特異的な結合タンパク質または機能性タンパク質の遺伝子転位を利用した同定
US10882910B2 (en) Expression vector organization, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
CN114026224B (zh) 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系
MX2012005117A (es) Construcciones de sorf y expresion de gen multiple.
CN114080451B (zh) 通过使用Cre mRNA进行的靶向整合来产生蛋白质表达细胞的方法
CN113993887A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价双特异性抗体表达细胞的方法
CN114258403A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价多特异性抗体表达细胞的方法
CN114008212A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生三价抗体表达细胞的方法
CN114008081A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生二价双特异性抗体表达细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1200849

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20171020

Termination date: 20191219

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1200849

Country of ref document: HK