ES2939555T3 - Método para generar anticuerpos de alta afinidad - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a un método para identificar células que expresan anticuerpos específicos de antígeno con una alta afinidad de unión por un antígeno monomérico. Usando la clasificación de células activada por fluorescencia, las células que expresan anticuerpos específicos de antígeno de alta afinidad se seleccionan de una población de células inmunitarias aisladas de un mamífero que ha sido inmunizado o expuesto de otro modo al antígeno. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de alta afinidad se pueden clonar luego en otras células linfoides y no linfoides en las que se puede expresar el anticuerpo y desde las que se pueden secretar los anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para generar anticuerpos de alta afinidad

Campo técnico de la invención

La presente invención generalmente se refiere a anticuerpos de alta afinidad. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para seleccionar células primarias productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos que exhiben una unión de alta afinidad.

Antecedentes de la invención

La alta afinidad es un atributo deseable para muchos anticuerpos terapéuticos. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales de alta afinidad es fundamental para el desarrollo de inmunoterapias específicas. Sin embargo, en muchos animales inmunizados, los anticuerpos de muy alta afinidad son poco frecuentes y los métodos estándar para generar anticuerpos son ineficientes para aislar los anticuerpos de alta afinidad.

Típicamente, los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de hibridomas de ratón, que generalmente resultan de la fusión de linfocitos B de ratones inmunizados con células de mieloma murino. Sin embargo, el aislamiento de anticuerpos de alta afinidad poco frecuentes mediante la tecnología de hibridomas no es eficaz debido a las limitaciones de rendimiento en el cultivo de hibridomas.

Otro enfoque para producir anticuerpos de alta afinidad implica el uso de tecnología de visualización para producir un candidato de anticuerpo principal a partir de una genoteca de fagos, levaduras o mamíferos. Aunque puede utilizarse el aislamiento directo de ADN de los linfocitos B que expresan anticuerpos, las genotecas de ADN se expresan en sistemas de expresión celular, tales como sistemas de fagos, levaduras, o bacterianos, y luego se “criban” o titulan para seleccionar los anticuerpos que tienen afinidades altas. Las tecnologías de visualización pueden proporcionar genotecas de proteínas de alta calidad, aunque proporcionan una diversidad limitada. En consecuencia, la maduración de la afinidad basada en mutagénesis in vitro es frecuentemente un siguiente paso en la generación de anticuerpos de alta afinidad derivados de tales genotecas.

Por lo tanto, existe la necesidad de un método eficaz para obtener, en cantidad, anticuerpos que tengan la especificidad requerida y la alta afinidad de unión de manera eficiente, sin la necesidad de varias rondas de selección (tales como “cribado”) o mutagénesis dirigida al sitio.

Franz et al., 2011 Blood 118(2):348-357 describe la caracterización ex vivo y el aislamiento de linfocitos B de memoria poco frecuentes con tetrámeros de antígeno. Hoven et al., 1989 J. Immunol. Methods 117:275-284 describen la detección y el aislamiento de linfocitos B específicos del antígeno mediante el clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS).

Compendio de la invención

La invención se define en las reivindicaciones independientes. Otros aspectos y modalidades preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, modalidad y ejemplo de la presente descripción que no pertenezcan al alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan meramente con fines ilustrativos.

La invención proporciona un método para seleccionar células primarias productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos que exhiben una unión de alta afinidad, expresado como Kd, de 0.1 nM a 10 nM para un antígeno de interés, el método que comprende: (a) poner en contacto una población de células primarias productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos unidos a la membrana al antígeno de interés con una forma monomérica del antígeno de interés a una concentración de 0.1 nM a 2 nM durante un tiempo suficiente para que el antígeno se una al anticuerpo en la superficie de las células; (b) lavar las células durante un período de tiempo para eliminar el antígeno no unido; y (c) recolectar células unidas al antígeno.

Compendio de la enseñanza técnica

La presente descripción se basa en la observación de que las células que expresan anticuerpos con alta afinidad para un antígeno de interés pueden seleccionarse y enriquecerse directamente a partir de una población de células productoras de anticuerpos de afinidades variables. Por lo tanto, los anticuerpos se seleccionan directamente de células primarias productoras de anticuerpos, antes de un aislamiento y recolección de una sola célula, tal como usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Esto proporciona un método simple para la producción de anticuerpos de alta afinidad a partir de un grupo celular de células primarias productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos con diferentes afinidades. El método elimina la necesidad de una selección de afinidad prolongada después de que los anticuerpos se clonan y expresan en células huésped. Por lo tanto, no es necesaria la detección/selección de anticuerpos específicos del antígeno seguidos de mutagénesis dirigida al sitio para lograr la maduración de la afinidad in vitro para mejorar la afinidad de unión.

En la presente descripción se describe un método en el que las células primarias productoras de anticuerpos que expresan un anticuerpo específico del antígeno se seleccionan eficientemente en función de sus propiedades de unión in situ, luego se aíslan usando técnicas para el aislamiento de una sola célula, tales como usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), un método de selección de alto rendimiento que puede muestrear cientos de millones de células en una población celular. Las células que expresan anticuerpos de alta afinidad deseables pueden identificarse y aislarse directamente a partir de todas las células que producen anticuerpos (en lugar de a partir de genotecas de anticuerpos de selección después de las etapas de clonación). Los anticuerpos producidos por las células seleccionadas pueden entonces clonarse y reproducirse recombinantemente en células huésped para uso directo, disminuyendo así la cantidad de etapas tomadas mientras se garantiza una mayor probabilidad de anticuerpos deseables.

También se describe en la presente descripción un método para la selección de anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno de interés con alta afinidad. El método puede usarse para el aislamiento eficaz de anticuerpos a un antígeno monomérico con afinidades que varían de aproximadamente 0.1 pM a aproximadamente 10 nM.

También se describe en la presente descripción un método para seleccionar células que expresan anticuerpos que exhiben una alta afinidad de unión para un antígeno de interés de una población de células que expresan anticuerpos de afinidad de unión diferente para el antígeno, el método que comprende: poner en contacto una población de células primarias productoras de anticuerpos con especificidad a un antígeno de interés con una baja concentración de antígeno marcado durante un tiempo suficiente para que el antígeno marcado se una al anticuerpo en la superficie de las células; lavar las células marcadas unidas al antígeno con un amortiguador adecuado durante un período de tiempo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 60 minutos; luego aislar las células unidas al antígeno. La etapa de aislamiento puede comprender además identificar las células unidas al antígeno con una proteína de unión al antígeno que comprende una etiqueta para identificación. El método puede comprender además poner en contacto las células con una proteína de unión a antígenos que comprende una etiqueta fluorescente; y usar clasificación de células activadas por fluorescencia, identificando así células únicas que tienen un antígeno unido y expresan un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés con alta afinidad. En determinados aspectos de la descripción, la población celular se pone en contacto con una baja concentración de antígeno marcado entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 15 nM, en algunos aspectos entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 10 nM; y en algunos aspectos, la concentración del antígeno biotinilado es de aproximadamente 5 nM. En algunos aspectos, las células a las que se ha unido el antígeno marcado exhibirán alta intensidad de fluorescencia (FI). El método se refiere además a un método para separar los anticuerpos de alta afinidad de los anticuerpos de baja afinidad, tal como aislar los anticuerpos que tienen una K^d de menos de aproximadamente 25 nM, o menos de aproximadamente 20 nM, o menos de aproximadamente 15 nM, o menos de aproximadamente 10 nM.

También se describe en la presente descripción un método de selección de células en donde las células específicas del antígeno se ponen en contacto con el antígeno biotinilado, en el cual el método comprende además estreptavidina fluorescentemente marcada. En determinados aspectos de la descripción, pero no parte de la invención en todo el alcance, la concentración de antígeno biotinilado puede estar entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 15 nM, entre aproximadamente 2 nM y aproximadamente 10 nM; o aproximadamente 5 nM.

En un aspecto relacionado, el método comprende además recolectar las células que exhiben alta intensidad fluorescente para obtener células que expresan anticuerpos de alta afinidad para el antígeno de interés.

También se contemplan células huésped que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo aislado usando los métodos descritos en la presente descripción.

En aún otro aspecto relacionado, el método se refiere a un método para seleccionar células productoras de anticuerpos específicos al antígeno de alta afinidad a partir de una población de células seleccionadas del grupo que consiste en células plasmáticas, linfocitos B, hibridomas y otras células recombinantes, mielomas de células plasmáticas, y células derivadas de tejidos tales como bazo, ganglios linfáticos, médula ósea o sangre periférica.

Estos, y otros objetos, características y ventajas de la descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de los diversos aspectos de la descripción tomados junto con las figuras acompañantes.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una superposición de datos de citometría de flujo para dos microesferas recubiertas con AcM de Tie2, ya sea sin lavado o lavadas dos veces, antes de la incubación con estreptavidina PE. Las microesferas de poliestireno se recubrieron con el anticuerpo monoclonal 12P3 (histograma sombreado) o 39P2 (histograma de línea discontinua), dos anticuerpos monoclonales de ratón específicos para la proteína Tie2 humana, cada uno con semividas de disociación de unión conocida (t1/2) (1.46 min para 12P3 y 198.6 min para 39P2). Las microesferas de poliestireno conjugadas con anticuerpos de captura anti mFc policlonales se incubaron con 12P3 o 39P2 durante toda la noche. Al día siguiente, las microesferas se lavaron con p Bs para eliminar los anticuerpos 12P3 y 39P2 no unidos y después se incubaron con 5 nM de biotina hExTek durante una hora. Luego, cada muestra se dividió en dos alícuotas. Las microesferas en todas las muestras se sedimentaron mediante centrifugación a 1,000 g durante 4 minutos. Se eliminó la biotina no unida hExTek en los sobrenadantes. Se lavó una alícuota para cada mAb de Tie2 con PBS dos veces, 10 minutos de duración cada lavado, después se tiñó con estreptavidina marcada con PE (panel derecho). Las alícuotas restantes se tiñeron con estreptavidina PE sin la etapa de lavado (panel izquierdo). Después de 45 minutos, las microesferas en todas las muestras se sedimentaron mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo. Una clara separación de los anticuerpos de alta afinidad y los anticuerpos de menor afinidad puede verse en los perfiles de histograma cuando las muestras se lavaron dos veces durante 10 min/lavado. La separación de los perfiles de FACS indica que las microesferas recubiertas con 39P2 de alta afinidad pueden aislarse de una población de microesferas mixtas compuesta por las microesferas 39P2 y las microesferas 12P3.

La Figura 2 demuestra la separación de células de hibridoma que expresan un anticuerpo de baja afinidad a partir de células de hibridoma que expresan un anticuerpo de alta afinidad por citometría de flujo. Las líneas celulares de hibridomas que producen los anticuerpos 12P3 y 39P2 expresan IgG anclada por membrana, así como IgG soluble que carece de dominio transmembrana. Las dos líneas celulares de hibridomas se incubaron con 5 nM de biotina hExTek durante una hora. Las dos poblaciones de células unidas al antígeno se dividieron cada una en tres alícuotas. Una alícuota para cada muestra de línea celular recibió exceso de estreptavidina PE sin la eliminación de biotina hExTek y se incubó durante 30 minutos. En paralelo, las otras alícuotas para cada muestra de línea celular se lavaron con PBS en exceso durante 20 minutos o 40 minutos, después se tiñeron con estreptavidina PE durante 30 minutos. La fluorescencia de PE de todas las muestras celulares se analizó mediante FACS. La línea celular 39P2 estaba compuesta por dos poblaciones de células, según lo evidenciado por dos picos (línea punteada) con diferentes niveles de fluorescencia de PE en FACS: PEalto y PEbajo, debido a los diferentes niveles de expresión de IgG superficial. La intensidad de fluorescencia media de las células 39P2 de PEalto (línea punteada) no cambió significativamente cuando las células se lavaron durante 20 min. o 40 min. antes de la tinción con estreptavidina PE. La fluorescencia de PE de las células 12P3 teñidas se superpone principalmente con la fluorescencia de PE de las células 39P2 de PEalto. Sin embargo, la fluorescencia de PE de las células 12P3 (histograma sombreado) que se lavaron durante 20 min. o 40 min. después de la incubación con biotina hExTek, pero antes de la tinción con estreptavidina PE fue significativamente menor que la fluorescencia de PE de las células 39P2 de PEalto, de manera que estas dos poblaciones de células estaban bien separadas en FACS. La separación de los histogramas de FACS de las poblaciones de células permite el aislamiento de las células 39P2 de PEalto a partir de una mezcla de células 39P2 y 12P3 de PEalto mediante la clasificación de células PE alto en un citómetro de flujo.

La Figura 3 muestra que la selección de linfocitos B inmunizados con antígeno monomérico produjo más anticuerpos con una tasa de disociación más lenta que la tinción de linfocitos B clasificados con antígeno dimérico. Los ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con una proteína purificada compuesta por el dominio extracelular Tie2 y el dominio Fc humano (Tie2 hFc). Los esplenocitos de los animales inmunizados se cosecharon, agruparon y dividieron en dos alícuotas. Las células en una alícuota se incubaron con 5 nM de proteína Tie2 hFc biotinilada y FITC anti mFc durante 1 hora. En el tiempo medio, la otra mitad del grupo de esplenocitos se incubó con 5 nM de ExTek biotinilado y FITC anti mFc durante 1 hora. Las células unidas al antígeno se lavaron dos veces con PBS, después se tiñeron con estreptavidina (SA)-PE durante una hora. Las células teñidas se lavaron una vez con PBS y se analizaron mediante citometría de flujo en un MoFlo (Cytomation). Los linfocitos B positivos a IgG y positivos a antígenos individuales se clasificaron en pocillos separados en una placa de 96 pocillos. La RT-PCR de los genes de anticuerpos de estos linfocitos B se realizó de acuerdo con un método descrito por Wang y Stollar (Journal of Immunological Methods 2000; 244: 217-225). Brevemente, los ADNc para cada linfocito B único se sintetizaron mediante reacción de transcriptasa inversa (RT) (SuperscriptTM III, Invitrogen). Cada producto de RT resultante se dividió después y se transfirió a dos pocillos correspondientes en dos placas de 96 pocillos. Un conjunto de los productos de ^rT resultantes se amplificó primero por p Cr usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena pesada de IgG humana y un cebador 3' específico para la región constante de cadena pesada de ratón, para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después nuevamente por PCR usando un conjunto de cebadores degenerados 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana y un conjunto de cebadores degenerados 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana. El otro conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena ligera kappa humana y un cebador 3' específico para la región constante de cadena ligera kappa de ratón para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después nuevamente por PCR usando un conjunto de cebadores degenerados 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana y un conjunto de cebadores degenerados 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana. Los productos PCR de las cadenas pesadas y cadenas ligeras se clonaron en los vectores de anticuerpo que contienen región constante de cadena pesada de IgG1 humana y región constante kappa de cadena ligera, respectivamente. Los anticuerpos hIgGI recombinantes se produjeron por transfección transitoria de células CHO K1. Las constantes de disociación de la unión entre la proteína ExTek y 61 anticuerpos específicos de Tie2 presentes en estos sobrenadantes de cultivo se determinaron en Biacore. Entre los 61 anticuerpos específicos de Tie241 se derivaron de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc (dímero; Figura 3, barra no sombreada) y 20 se derivaron de linfocitos B clasificados con ExTek (monómero; Figura 3, barra sombreada). El 22 % y el 0 % de los anticuerpos derivados de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc o ExTek, respectivamente, tuvieron una t1/2 de disociación de menos de 5 minutos (Figura 3). El 34 % y el 5 % de los anticuerpos derivados de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc o ExTek, respectivamente, tuvieron una t1/2 de disociación de menos de 10 minutos. El 44 % y 20 % de los anticuerpos derivados de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc o ExTek, respectivamente, tuvieron una t1/2 de disociación t1/2 de menos de 20 minutos (Figura 3). Por lo tanto, seleccionar linfocitos B con proteína monomérica ExTek enriquecida para anticuerpos con t1/2 más larga que seleccionar linfocitos B con la proteína dimérica Tie2 hFc.

La Figura 4 ilustra la cantidad de proporción de anticuerpos (Ab) de alta afinidad entre los 148 anticuerpos anti Erb3 aislados mediante la selección de linfocitos B con 5 nM de proteína biotina Erb3.mmh al agrupar los Ab aislados mediante sus respectivos valores Kd, de la siguiente manera: Kd menores de 1 nM (78 Abs), Kd entre 1 nM y 10 nM (57 Abs), Kd entre 10 nM y 100 nM (12 Abs), y Kd entre 100 nM y 1 mM (1 Ab). Los anticuerpos anti Erb3 con menos de 10 nM de K^d (135/148; más del 91 % de los anticuerpos aislados) superaron significativamente a los anticuerpos con más de 10 nM de KD.

La Figura 5 ilustra la proporción de anticuerpos (Abs) de alta afinidad entre los 63 anticuerpos anti NGF aislados mediante la selección de linfocitos B con 5 nM de proteína biotina NGF al agrupar los Abs aislados mediante sus respectivos valores K^d, de la siguiente manera: K^d de menos de 1 nM (55 Abs), K^d entre 1 nM y 10 nM (7 Abs), y K^d entre 10 nM y 100 nM (1 Ab). Los anticuerpos anti NGF con menos de 10 nM de K^d (62/63; más del 98 % de los anticuerpos aislados) superaron significativamente a los anticuerpos con más de 10 nM de KD.

La Figura 6 ilustra la proporción de anticuerpos (Ab) de alta afinidad entre los 648 anticuerpos anti activina A a la proteína Activina A aislados mediante la selección de linfocitos B con 1 nM de proteína biotina activina A mediante la agrupación de los Ab aislados mediante sus respectivos valores K^d, de la siguiente manera: K^d menores a 1 nM (212 Abs), Kd entre 1 nM y 10 nM (416 Abs), y Kd entre 10 nM y 100 nM (20 Abs). Los anticuerpos anti Activina A con menos de 10 nM Kd (628/648; más del 96 % de los anticuerpos aislados) superaron significativamente a los anticuerpos con más de 10 nM de KD.

Descripción detallada

Como se señaló anteriormente, la invención se define en las reivindicaciones independientes. Otros aspectos y modalidades preferidas se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, modalidad y ejemplo de la presente descripción que no pertenezcan al alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan meramente con fines ilustrativos.

En la práctica de la presente invención, se usan muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, biología celular, bioquímica, e inmunología, que están dentro de las habilidades de la técnica. Estas técnicas se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3.° edición, J.F. Sambrook y D.W. Russell, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001; Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Melvyn Little, ed. Cambridge University Press 2009; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).

En la siguiente descripción, se seguirán determinadas convenciones con respecto al uso de la terminología. Generalmente, los términos usados en la presente descripción pretenden interpretarse acorde con el significado de esos términos como son conocidos por los expertos en la técnica.

La presente descripción puede usarse para la producción eficiente de anticuerpos con afinidades que varían de aproximadamente 0.1 pM a aproximadamente 25 nM, particularmente que tienen una Kd menor que 10 nM.

El anticuerpo y los anticuerpos como esos términos se conocen en la técnica se refieren a proteínas de unión al antígeno del sistema inmunitario. El término anticuerpo como se refiere en la presente descripción incluye anticuerpos completos de longitud completa que tienen una región de unión a antígenos, y cualquier fragmento de esta en el que se retiene la “porción de unión a antígenos” o “región de unión a antígenos”, o cadenas únicas, por ejemplo, fragmento variable de cadena única (scFv), de esta. Un “anticuerpo” de origen natural es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (que se abrevia en la presente descripción como VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (que se abrevia en la presente descripción como VL) y una región constante de cadena ligera CL. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse, además, en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR que se disponen del amino terminal al carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con el antígeno.

Los términos “células productoras de anticuerpos” y “células que expresan anticuerpos” se refieren a células que expresan el anticuerpo naturalmente, es decir, como resultado de la activación de linfocitos B o como resultado de la tecnología recombinante y la ingeniería genética. El término, por lo tanto, abarca linfocitos del linaje de linfocitos B dependientes de antígenos, que incluyen linfocitos B de memoria, plasmablastos y células plasmáticas terminalmente diferenciadas, así como células recombinantes tales como hibridomas y células no linfoides modificadas genéticamente para expresar anticuerpos. “Células primarias” se refiere a células cultivadas fuera de su entorno natural, tales como células tisulares aisladas de un mamífero. Las células primarias productoras de anticuerpos pueden ser derivadas de tejidos, tales como del bazo, los ganglios linfáticos, la médula ósea o la sangre periférica. Además, “células productoras de anticuerpos” y “células que expresan anticuerpos” abarcan células en las que los anticuerpos expresados se unen o se anclan en la membrana celular, es decir, anticuerpos de superficie celular, así como células que secretan anticuerpos. Además, las células productoras de anticuerpos adicionales pueden derivarse de las células productoras de anticuerpos primarias iniciales o las células productoras de anticuerpos primarias seleccionadas por los métodos descritos en la presente descripción. Como tal, las líneas celulares, células plasmáticas, linfocitos B de memoria, hibridomas, mielomas de células plasmáticas y células que expresan anticuerpos recombinantes pueden derivarse o aislarse de células primarias productoras de anticuerpos antes o después de la recolección de células productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos de alta afinidad. Por ejemplo, las células productoras de anticuerpos primarias pueden fusionarse a células de mieloma para fabricar hibridomas, o de cualquier otra manera inmortalizarse, tal como infectadas con un virus (por ejemplo, EBV), o pueden diferenciarse por técnicas de clasificación de células en función de marcadores de proteínas expresados por tipos de linfocitos B particulares. Por ejemplo, las células productoras de anticuerpos seleccionadas que expresan anticuerpos de alta afinidad pueden clasificarse por FACS en función de marcadores de linfocitos B en la superficie celular.

“Afinidad de unión”, como ese término se conoce en la técnica, “generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de cualquier otra manera, como se usa en la presente descripción, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula por su socio de unión puede representarse generalmente por la constante de equilibrio de disociación (KD o K^d). Existe una relación inversa entre el valor Kd (molar) y afinidad de unión, por lo tanto, mientras menor es el valor de la Kd (M), más alta la afinidad. Por lo tanto, “mayor afinidad” se refiere a anticuerpos que generalmente se unen al antígeno más fuerte y/o más rápido y/o permanecen unidos por más tiempo. Generalmente, se necesita una concentración más baja (M) de antígeno para lograr el efecto deseado debido a su interacción de unión más fuerte.

Los términos “baja afinidad” y “baja afinidad” es un término usado para reflejar una unión más débil, tal como una menor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor K^d mayor. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente.

El término "kd" (s -1 o 1/s) se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, o la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo Ig, o fragmento de unión a anticuerpo o interacción molecular. Este valor también se denomina como valor de koff.

El término "ka" (M-1 * s-1 o 1/M) se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción anticuerpoantígeno particular, o la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o interacción molecular.

El término "KD" o "K^d" (M) se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular, o la constante de disociación de equilibrio de un anticuerpo, Ig, fragmento de unión de anticuerpo o interacción molecular. La constante de disociación de equilibrio se obtiene mediante la división de la ka con la kD.

Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión se conocen en la técnica, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente descripción. Las afinidades de unión obtenidas usando el método están en el rango de aproximadamente 0.1 pM a aproximadamente 10 nM según lo determinado por resonancia de plasmones superficiales.

El término anticuerpo de “alta afinidad” se refiere a aquellos anticuerpos que tienen una afinidad de unión, expresada como Kd, que tienen un valor numérico de aproximadamente 0.1 pM a aproximadamente 25 nM, o aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 10 nM. Con este fin, los anticuerpos de alta afinidad tienen una Kd medida de aproximadamente 2.5 x 10-9 M o menos, aproximadamente 1 x 10-10 M o menos, o aproximadamente 0.5 x 10-10 M o menos, medida mediante resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad con la solución. Los expertos en la técnica reconocerán que los valores para Kd de anticuerpos pueden representarse numéricamente ya sea como nE-z, o como n x 10-z, por ejemplo, 3.2E-12 es equivalente a 3.2 x 10-12 e indica una K^d de 3.2 picomolar (pM).

También se describe en la presente descripción un método para identificar y aislar células productoras de anticuerpos específicas de antígeno que expresan anticuerpos que exhiben una alta afinidad de unión a un antígeno de interés; los ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos pueden clonarse después en células huésped para la producción masiva de los anticuerpos de alta afinidad.

El presente método evita el uso de mutaciones para potenciar la afinidad de unión. El método también elimina la necesidad de cribar genotecas de anticuerpos después de la expresión de tales anticuerpos en un sistema de células huésped.

Inmunización y recolección de células productoras de anticuerpos primarias

La inmunización de mamíferos puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, E. Harlow y D. Lane-Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1988); Malik y Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, 1994, CA). El antígeno puede administrarse directamente a un mamífero, sin adyuvante, o con adyuvante para ayudar en la estimulación de la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund completo e incompleto, sistema adyuvante MPL+TDM (Sigma), o RIBI (dipéptidos de muramilo) (véase O'Hagan, Vaccine Adjuvant, por Human Press, 2000, NJ). Sin depender de una teoría particular, el adyuvante puede evitar la rápida dispersión del polipéptido al aislar el antígeno en un depósito local, y puede contener factores que pueden estimular la respuesta inmunitaria del huésped.

El antígeno de interés se administra como una proteína, fragmento de proteína, fusión de proteínas o plásmido de ADN que contiene el gen antígeno de interés y expresa el antígeno de interés usando la maquinaria de expresión celular del huésped para expresar el antígeno polipéptido in vivo. Varias técnicas de inmunización se conocen en la técnica. Se entiende que el mamífero inmunizado puede ser un humano que se ha expuesto al antígeno y que expresa inmunidad humoral para el antígeno de interés.

En un aspecto, un mamífero no humano se inmuniza con un antígeno de interés y la respuesta inmunitaria del animal al antígeno se monitorea usando un inmunoensayo específico del antígeno. Una vez lograda una respuesta inmunitaria adecuada, se recolectan células productoras de anticuerpos del animal inmunizado. Las células productoras de anticuerpos se obtienen a partir de una serie de fuentes, que incluyen, entre otras, bazo, ganglios linfáticos, médula ósea y sangre periférica.

Por ejemplo, después de la inmunización, los esplenocitos se extraen de un animal inmunizado. Después de la eliminación de los glóbulos rojos mediante lisis, los linfocitos B positivo - antígeno IgG+ de los animales inmunizados se aíslan de la población celular usando los métodos descritos en la presente descripción.

En otro aspecto, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se extraen de un mamífero humano o no humano que se sabe que tiene inmunidad humoral a un antígeno de interés. Las células B positivas para el antígeno IgG+, que tienen las afinidades más altas en la población de células productoras de anticuerpos pueden aislarse para su procesamiento adicional de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción.

Enriquecimiento de una población de anticuerpos de alta afinidad

Para seleccionar para las células que expresan anticuerpos que exhiben la afinidad de unión más alta para el antígeno de interés, las células cosechadas se ponen en contacto con una concentración baja, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 25 nM, o de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 20 nM o de aproximadamente 2 nM a aproximadamente 10 nM, de antígeno monomérico que se marca, durante un tiempo suficiente para que el antígeno marcado se una al anticuerpo en la superficie de las células inmunitarias; en algunos casos, es adecuada la exposición de las células inmunitarias al antígeno marcado durante aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos. La concentración baja puede ser menor que aproximadamente 10 nM. La baja concentración de antígeno puede ser aproximadamente 9 nM, aproximadamente 8 nM, aproximadamente 7 nM, aproximadamente 6 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1 nM. En aún otros aspectos, la concentración de antígeno es 5 nM. La concentración de antígeno puede ser menor que aproximadamente 1 nM. Alternativamente, la concentración de antígeno es 1 nM o es menor que 1 nM. El antígeno puede ser soluble.

La etiqueta puede ser biotina, p. ej., el antígeno está biotinilado. Los marcadores de antígeno, también llamados moléculas de detección, permiten la detección adicional del antígeno de interés unido a las células productoras de anticuerpos. La detección puede realizarse mediante inmunotinción con un anticuerpo específico para la etiqueta o mediante tinción directa con un reactivo que se une a la etiqueta. Varios kits y técnicas de detección son conocidos en la técnica.

A continuación, las células se lavan con amortiguador durante un período de tiempo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 60 minutos para eliminar el antígeno no unido; pueden usarse múltiples lavados que suman de 10 a 60 minutos, p. ej., 3 lavados de 10 minutos o un lavado de 30 minutos; 2-4 lavados de 10-15 minutos cada uno, etc. El lavado de las células durante un período de tiempo puede comprender un (1) lavado de aproximadamente 10 minutos, o aproximadamente 15 minutos, o aproximadamente 20 minutos, o aproximadamente 25 minutos, o aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente 35 minutos, o aproximadamente 40 minutos, o aproximadamente 45 minutos, o aproximadamente 50 minutos, o aproximadamente 55 minutos, o aproximadamente 60 minutos en total. Puede usarse el lavado de las células durante un período de tiempo que comprende dos (2) lavados cada una de aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente 10 minutos, o aproximadamente 15 minutos o aproximadamente 20 minutos, o aproximadamente 25 minutos, o aproximadamente 30 minutos por lavado. Se contemplan intervalos de lavado adicionales, esencialmente equivalentes a los descritos en la presente descripción.

Aunque en algunas circunstancias el antígeno de interés puede encontrarse en la naturaleza como un polímero, tal como un dímero, el antígeno puede modificarse genéticamente a un monómero para los fines de la descripción. Por ejemplo, el experto en la técnica puede emplear la desnaturalización parcial de polímeros, modificación genética de proteínas o técnicas de fusión de proteínas. Por ejemplo, el dominio de dimerización puede mutarse o eliminarse para no permitir la dimerización.

El antígeno de interés puede utilizarse como un dímero u otra forma multimérica (es decir, tetrámero, heptámero, hexámero, etc.) para fines de inmunización, sin embargo los mismos epítopos diana del antígeno de interés se emplean en un monómero para los fines de enriquecimiento de anticuerpos de alta afinidad.

De manera simultánea o sucesiva, las células pueden detectarse como linfocitos B, en particular células IgG+IgM-(incubadas con marcador anti linfocitos B, reactivos anti IgG o anti Fc, o similares) en la anticipación de las técnicas de aislamiento de células únicas de la siguiente etapa. Los reactivos de detección de IgG o linfocitos B pueden incubarse con las células antes, durante o después de la incubación con el antígeno de interés. Los reactivos de detección de linfocitos B están disponibles comercialmente. (Véase también Huang, J. et al., 2013 Nature Protocols, 8(10):1907-1915.)

Una vez eliminado el antígeno libre, las células seleccionadas están enriquecidas para anticuerpos de alta afinidad. Se ha descubierto inesperadamente que a modo de descripción, un grupo seleccionado de células que expresan anticuerpos se enriqueció al lograr un alto porcentaje de anticuerpos de alta afinidad aislados de las células seleccionadas, tales como más de 50 % 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, o 85 % de anticuerpos aislados, o más de 90 %, 95 %, 96 %, 97 % o 98 % de anticuerpos aislados son anticuerpos de alta afinidad.

Una vez que se ha eliminado el antígeno libre, las células se ponen en contacto con una proteína de unión al antígeno que comprende una etiqueta detectable, por ejemplo, una etiqueta fluorescente para los fines de identificar las células específicas del antígeno. Cuando el antígeno ha sido biotinilado, se usa para la detección una estreptavidina marcada con fluorescencia. En el caso en que un marcador detectable se activa enzimáticamente, las células se ponen en contacto con la enzima adecuada para detectar células que portan antígeno unido.

Clasificación de células simples de células productoras de anticuerpos

El uso de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para detectar y aislar las células que expresan anticuerpos enriquecidos de alta afinidad es una herramienta altamente eficaz y sensible para la clasificación de células únicas. Los protocolos para el aislamiento de células únicas mediante citometría de flujo son bien conocidos (Huang, J. et al, 2013, supra). Con ese fin, las células que se unen al antígeno fluorescente (o antígeno biotinilado/estreptavidina marcado con fluorescencia) se detectan e identifican como células que expresan anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés con alta afinidad, y se aíslan a pocillos individuales en placas de 96 pocillos, o 384 pocillos. Una vez clasificadas, las células individuales pueden propagarse mediante técnicas de cultivo celular comunes para la preparación posterior del ADN. Alternativamente, los genes de anticuerpos pueden amplificarse a partir de linfocitos B únicos directamente y posteriormente clonarse en vectores de ADN.

Las células pueden clasificarse y recogerse mediante métodos alternativos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la recolección manual de células únicas, la dilución limitada y el cribado de linfocitos B del antígeno adsorbido, que son todos conocidos en la técnica (Rolink, et al., 1996 J Exp Med 183:187-194; Lightwood, D. et al., 2006 J. Immunol. Métodos 316(1-2): 133-43. Publicación electrónica, 18 de septiembre de 2006).

Los linfocitos B aislados pueden fusionarse con una célula inmortal, tal como una línea celular de mieloma, para crear un hibridoma. Las técnicas de hibridoma se encuentran dentro de la técnica del experto (Harlow y Lane, 1988, supra). Los linfocitos B aislados pueden diferenciarse o clasificarse adicionalmente para identificar tipos de linfocitos B específicos, tal como la determinación por marcadores de expresión génica o de superficie celular.

Producción recombinante de anticuerpos

Una vez que se recolectan las células, el ADN se prepara a partir de las células para producir los anticuerpos de manera recombinante. Como se mencionó anteriormente, los linfocitos B pueden cultivarse, fusionarse a células de mieloma o inmortalizarse de cualquier otra manera, tal como infectarse con un virus (por ejemplo, EBV), para hacer que el ADN sea más abundante, según sea necesario, antes de extraer ADN y clonar genes de anticuerpos directamente de cada linfocito B clasificado. Brevemente, los genes que codifican cadenas pesadas y ligeras variables de inmunoglobulina (es decir, VH, Ig V^k y VA) se recuperan usando RT-PCR de ARNm aislado de las células productoras de anticuerpos seleccionadas, según se realiza usando técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Wang et al. (J. Immunol. Métodos 244:217-225) y descritas en la presente descripción. Los genes de anticuerpos se clonan en vectores de expresión de cadena pesada y ligera de IgG y se expresan mediante la transfección de células huésped.

Para la producción recombinante de un anticuerpo descrito en la presente descripción en una célula huésped adecuada, el ácido nucleico que codifica los genes de anticuerpo se inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión (de manera estable o transitoria). Muchos vectores, particularmente vectores de expresión, están disponibles o pueden modificarse genéticamente para comprender los elementos reguladores adecuados. Un vector de expresión puede ser cualquier vector adecuado, que incluye vectores de ácido nucleico cromosómico, no cromosómico, y sintético (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de la expresión). Los ejemplos de tales vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, y vectores de ácidos nucleicos virales (ARN o ADN). En un aspecto, una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo está comprendida en un vector de ARN o ADN no marcado, que incluye, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe, por ejemplo, en Sykes y Johnston, Nat Biotech 12:355-59 (1997)), un vector de ácido nucleico compactado (como se describe por ejemplo en las patentes núms. US6,077,835 y/o WO00/70087), o un vector plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18, o pUC 118/119. Tales vectores de ácidos nucleicos y el uso de estos se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, patentes núms. US 5,589,466 y US 5,973,972).

Alternativamente, un vector de expresión puede ser un vector adecuado para la expresión en un sistema de levaduras. Puede emplearse cualquier vector adecuado para la expresión en un sistema de levaduras. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa de levadura, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nueva York (1987), y Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).

El vector puede comprender una molécula de ácido nucleico (o gen) que codifica una cadena pesada del anticuerpo y una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera del anticuerpo, en donde el anticuerpo se produce por el linfocito B seleccionado mediante un método descrito en la presente descripción. El vector utilizado incluye un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico (genes) descritas en donde la molécula de ácido nucleico (gen) se une operativamente a una secuencia de control de expresión adecuada para la expresión en la célula huésped.

La elección del vector depende en parte de la célula huésped que se va a usar. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen procariota o eucariota (generalmente mamífero).

La célula huésped puede ser una célula bacteriana o de levadura, o una célula de mamífero. La célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en CHO (por ejemplo CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo COS-7), célula madre, células de retina, Vero, CV1, del riñón (por ejemplo HEK293, 293 EBNA, MSR 293, Md CK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente.

Se apreciará que el anticuerpo de longitud completa (cadena pesada y cadena ligera que comprende regiones variables y constantes) puede clonarse posteriormente en un vector o vectores apropiados. Alternativamente, la región Fab de un anticuerpo aislado puede clonarse en un vector o vectores en línea con regiones constantes de cualquier isotipo para el fin previsto. Por lo tanto, cualquier región constante puede utilizarse en la construcción de anticuerpos aislados, que incluyen regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, e IgE, o regiones constantes de cadena pesada quimérica. Tales regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal en dependencia del uso previsto de los anticuerpos. Además, las regiones variables de anticuerpos o región Fab pueden clonarse en uno o más vectores apropiados para la expresión de la proteína en otros formatos, tales como ScFv, diacuerpo, etc.

La descripción proporciona una célula huésped de mamífero que codifica una molécula de ácido nucleico que comprende un anticuerpo de alta afinidad específico para un antígeno de interés, en donde una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera del anticuerpo se aislaron de un linfocito B que expresa el anticuerpo, y en donde el linfocito B se seleccionó de una población de células de un mamífero inmunizado con una baja concentración del antígeno en forma monomérica.

Determinación de la afinidad de unión a antígenos

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos derivados de células aisladas usando el método descrito en la presente descripción se determinan de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante resonancia de plasmones superficiales. Las mediciones pueden realizarse a 25 °C en, por ejemplo, un instrumento Biacore 2000 o similar. Los anticuerpos se capturan en una superficie del sensor Fc antihumano, y la proteína monomérica soluble se inyecta sobre la superficie. Las constantes de velocidad cinética de asociación (ka) y de disociación (kd) se determinan mediante el proceso y ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático para el ajuste de curvas. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (Kd) y semividas disociativas (t1/2) se calculan a partir de las constantes de velocidad cinética como: Kd(M) = ka/kd; y t-i/2 (min) = (In2/(60*kd).

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Separación de microesferas recubiertas con un anticuerpo de disociación rápida de microesferas recubiertas con un anticuerpo de disociación lenta mediante citometría de flujo.

Los linfocitos B de ratones inmunizados expresan BCR de afinidad variable contra un inmunógeno. En un experimento para demostrar la viabilidad de separar los linfocitos B mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia en función de las velocidades de disociación de unión al antígeno usando antígeno marcado (ExTek.6His humano; ver Lin, P. et al. PNAS EE. UU. 21 de julio de 1998; 95(15): 8829-8834), microesferas de poliestireno (número de cat. MPFc-60-5, Spherotech, Lake Forest, IL) se recubrieron con mAb 12P3 o 39P2, dos anticuerpos monoclonales de ratón contra la proteína Tie2 humana. La disociación t1/2 de la unión entre estos dos anticuerpos y hExTek, una proteína purificada compuesta por el dominio extracelular de Tie2 humano y un marcador 6-His, es de 1.46 min para 12P3 y de 198.6 min para 39P2. Las esferas de poliestireno conjugadas con anticuerpos de captura anti mFc policlonales se incubaron con 12P3 o 39P2 durante toda la noche. Al día siguiente, las microesferas se lavaron con PBS para eliminar los anticuerpos 12P3 y 39P2 no unidos y después se incubaron con 5 nM de biotina hExTek durante una hora. Luego, cada muestra se dividió en dos alícuotas. Las microesferas en todas las muestras se sedimentaron mediante centrifugación a 1,000 g durante 4 minutos. Se eliminó la biotina no unida hExTek en los sobrenadantes. Se lavó una alícuota de microesferas para cada mAb Tie2 con PBS dos veces, 10 minutos de duración cada lavado, después se tiñó con estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE). Las dos alícuotas restantes se tiñeron con estreptavidina PE sin la etapa de lavado. 45 minutos después, las microesferas en todas las muestras se sedimentaron mediante centrifugación, se resuspendieron en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo.

Los resultados se muestran en la Figura 1.

La Figura 1 muestra una superposición de datos de citometría de flujo para las dos microesferas recubiertas con mAb Tie2, ya sea sin una etapa de lavado o lavadas dos veces, antes de la incubación con estreptavidina PE. Hubo una clara separación en sus perfiles, cuando se lavó dos veces durante 10 minutos cada uno. La clara separación de los perfiles de FACS indica que las microesferas recubiertas con 39P2 pueden aislarse de una población de microesferas mixtas compuesta por las microesferas 39P2 y las microesferas 12P3. Por lo tanto, es probable que los linfocitos B que expresan anticuerpos anclados en la superficie con constantes de disociación rápidas o lentas puedan separarse mediante el uso de 5 nM de antígeno marcado para marcar los linfocitos B e incorporar una etapa de lavado posterior antes de la adición de un reactivo de detección secundario tal como la estreptavidina de ficoeritrina (PE).

Ejemplo 2 . Separación de células de hibridomas que expresan un anticuerpo de baja afinidad a partir de células de hibridomas que expresan un anticuerpo de alta afinidad mediante citometría de flujo.

Las líneas celulares de hibridomas que producen los anticuerpos 12P3 y 39P2 expresaron IgG anclada por membrana, así como IgG soluble que carece de dominio transmembrana. La línea celular 39P2 contenía dos poblaciones de células con diferentes niveles de expresión de IgG superficial. Estas dos líneas celulares de hibridomas se tiñeron con 5 nM de biotina hExTek durante una hora. Las dos poblaciones de células teñidas se dividieron cada una en tres alícuotas. Una alícuota para cada muestra de línea celular recibió exceso de estreptavidina PE sin la eliminación de biotina hExTek y se incubó durante 30 minutos. En paralelo, las otras alícuotas para cada muestra de línea celular se lavaron con PBS en exceso durante 20 minutos o 40 minutos, después se tiñeron con estreptavidina PE durante 30 minutos. La fluorescencia de PE de todas las muestras celulares se analizó mediante FACS (Figura 2). La línea celular 39P2 estaba compuesta por dos poblaciones de células con diferentes niveles de fluorescencia de PE en FACS: PEalto y PEbajo, causado por diferentes niveles de expresión de IgG superficial. La intensidad de fluorescencia media de las células 39P2 de PEalto no cambió significativamente cuando las células se lavaron durante 20 min o 40 min antes de la tinción con estreptavidina PE. La fluorescencia de PE de las células 12P3 teñidas se superpone principalmente con la fluorescencia de PE de las células 39P2 de PEalto. Sin embargo, la fluorescencia de PE de las células 12P3 que se lavaron durante 20 min o 40 min después de la incubación con biotina hExTek, pero antes de la tinción con estreptavidina PE fue significativamente menor que la fluorescencia de PE de las células 39P2 de PEalto, de manera que estas dos poblaciones de células estaban bien separadas en FACS. La separación de los histogramas de FACS de las poblaciones de células permite el aislamiento de las células 39P2 de PEalto a partir de una mezcla de células 39P2 y 12P3 de PEalto mediante la clasificación de células PE alto en un citómetro de flujo.

Los resultados se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 3. Tinción y clasificación de linfocitos B inmunizados con antígeno monomérico produjo más anticuerpos con una velocidad de disociación más lenta que la tinción y clasificación de los linfocitos B con antígeno dímero

Los ratones VELOCIMMUNE® se inmunizaron con una proteína purificada compuesta por el dominio extracelular Tie2 y el dominio Fc humano (Tie2 hFc). Esta proteína es un dímero debido a la asociación Fc:Fc. Después de tres inyecciones de Tie2 hFc para potenciar la respuesta inmunitaria, los ratones fueron sacrificados y los esplenocitos fueron recolectados. Los esplenocitos se agruparon y se dividieron en dos alícuotas. Las células en una alícuota se tiñieron con 5 nM de proteína Tie2 hFc biotinilada y FITC anti mFc durante 1 hora. Mientras tanto, la otra mitad del grupo de esplenocitos se tiñó con 5 nM de ExTek biotinilado y FITC anti mFc durante 1 hora. Las células teñidas se lavaron durante 10 minutos con PBS, después se tiñeron con SA-PE durante una hora. Las células teñidas se lavaron una vez con PBS y se analizaron mediante citometría de flujo en un MoFlo (Cytomation).

Los linfocitos B con IgG única positiva y con antígeno positivo se clasificaron en pocillos separados en una placa de 96 pocillos. La RT-PCR de los genes de anticuerpos de estos linfocitos B se realizó de acuerdo con un método descrito por Wang y Stollar (Journal of Immunological Methods 2000; 244: 217-225). Brevemente, los ADNc para cada linfocito B único se sintetizaron mediante reacción de transcriptasa inversa (RT) (Superscript™ III, Invitrogen). Cada producto de RT resultante se dividió después y se transfirió a dos pocillos correspondientes en dos placas de 96 pocillos. Un conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena pesada de IgG humana y un cebador 3' específico para la región constante de cadena pesada de ratón, para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después nuevamente por PCR usando un conjunto de cebadores degenerados 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana y un conjunto de cebadores degenerados 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana. El otro conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena ligera kappa humana y un cebador 3' específico para la región constante de cadena ligera kappa de ratón para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después nuevamente por PCR usando un conjunto de cebadores degenerados 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana y un conjunto de cebadores degenerados 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana. Los productos PCR de las cadenas pesadas y cadenas ligeras se clonaron en los vectores de anticuerpo que contienen región constante de cadena pesada de IgG1 humana y región constante kappa de cadena ligera, respectivamente. Los anticuerpos hIgG1 recombinantes se produjeron por transfección transitoria de células CHO K1. Las constantes de disociación de la unión entre la proteína ExTek y 61 anticuerpos específicos de Tie2 presentes en estos sobrenadantes de cultivo se determinaron en Biacore.

Entre los 61 anticuerpos específicos para Tie2, 41 se derivaron de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc y 20 se derivaron de linfocitos B clasificados con ExTek. El 22 % y el 0 % de los anticuerpos derivados de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc o ExTek, respectivamente, tuvieron una t1/2 de disociación de menos de 5 minutos (mostrado en la Figura 3).El 34 % y el 5 % de los anticuerpos derivados de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc o ExTek, respectivamente, tuvieron una t1/2 de disociación de menos de 10 minutos. El 44 % y el 20 % de los anticuerpos derivados de linfocitos B clasificados con Tie2 hFc o ExTek, respectivamente, tuvieron una t1/2 de disociación de menos de 20 minutos (Figura 3).Por lo tanto, la tinción y clasificación de linfocitos B con la proteína monomérica ExTek enriquecida para anticuerpos con t1/2 más larga que la tinción y clasificación de linfocitos B con la proteína dimérica Tie2 hFc.

Ejemplo 4. Aislamiento y producción de anticuerpos Erb3 de alta afinidad generados mediante el aislamiento directo de esplenocitos

Un inmunógeno proteico que comprende el dominio extracelular Erb3 humano fusionado a Fc de ratón (Erb3.mFc) se produjo en células CHO y se purificó. La proteína Erb3.mFc se administró directamente a ratones VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana y cadena ligera kappa (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., patente de EE. UU. 6,596,541). La respuesta inmunitaria de anticuerpo se monitoreó mediante un inmunoensayo específico para Erb3. Cuando se logró una respuesta inmunitaria deseada, se cosecharon esplenocitos. Los glóbulos rojos se eliminaron mediante lisis seguida de sedimentación de los esplenocitos recolectados.

Los esplenocitos resuspendidos se incubaron primero con FITC anti mFc y 5 nM de proteína Erb3 monomérica biotinilada (Erb3.mmh) durante 1 hora. Las células teñidas se lavaron durante 10 minutos con PBS, después se tiñeron con SA-PE durante una hora. Las células teñidas se lavaron una vez con PBS y se analizaron mediante citometría de flujo en un MoFlo (Cytomation).

Cada linfocito B positivo a IgG, positivo a antígenos se clasificó y se sembraron en un pocillo separado en una placa de 384 pocillos. La RT- PCR de los genes de anticuerpos de estos linfocitos B se realizó de acuerdo con un método descrito por Wang y Stollar (Journal of Immunological Methods 2000; 244: 217-225). Brevemente, los ADNc para cada linfocito B único se sintetizaron mediante reacción de transcriptasa inversa (RT) (Superscript™ III, Invitrogen). Cada producto de RT resultante se dividió después y se transfirió a dos pocillos correspondientes en dos placas de 96 pocillos. Un conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena pesada de IgG humana y un cebador 3' específico para la región constante de cadena pesada de ratón, para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después nuevamente por PCR usando un conjunto de cebadores degenerados 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana y un conjunto de cebadores degenerados 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena pesada de IgG humana. El otro conjunto de los productos de RT resultantes se amplificó primero por PCR usando un cebador degenerado 5' específico para la secuencia líder de región variable de cadena ligera kappa humana y un cebador 3' específico para la región constante de cadena ligera kappa de ratón para formar un amplicón. El amplicón se amplificó después nuevamente por PCR usando un conjunto de cebadores degenerados 5' específico para el marco 1 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana y un conjunto de cebadores degenerados 3' específico para el marco 4 de la secuencia de región variable de cadena ligera kappa humana. Los productos PCR de las cadenas pesadas y cadenas ligeras se clonaron en los vectores de anticuerpo que contienen región constante de cadena pesada de IgG1 humana y región constante kappa de cadena ligera, respectivamente. El plásmido de expresión de cadena ligera tiene un sitio loxP y un sitio lox2272 que flanquean el casete de expresión de cadena ligera, y el plásmido de expresión de cadena pesada tiene un sitio lox2272 y un sitio lox511 que flanquea los casetes de expresión de cadena pesada. Los plásmidos que tienen una secuencia de región variable de cadena pesada humana o una secuencia de región variable de cadena ligera humana se aislaron de cultivos de E. colitransformados. Los plásmidos purificados que tienen una secuencia de región variable de cadena pesada humana y los plásmidos que tienen una secuencia de región variable de cadena ligera humana a partir del mismo linfocito B se combinaron y transfectaron después en una célula huésped de CHO EESYR® modificada. Dado que la célula CHO huésped tiene, de 5' a 3', un sitio loxP, un eCFP, un sitio lox2272, DsRed, y un sitio lox511 en el locus EESYR®, la célula CHO huésped puede aislarse mediante citometría de flujo como una célula azul positiva, roja positiva y verde negativa. Además, los plásmidos que expresan Cre de manera transitoria también se transfectaron en la célula huésped CHO EESYR® modificada. Las células CHO EESYR® transfectadas se clasificaron por citometría de flujo. Se aislaron los recombinantes adecuados que muestran células azules negativas, rojas negativas y verdes positivas y se establecieron líneas celulares de CHO que expresan anticuerpos recombinantes estables a partir de las recombinantes adecuados aislados.

Ejemplo 5. Afinidad de unión de anticuerpos Erb3 a la proteína monomérica Erb3

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de todos los 148 anticuerpos anti Erb3 monoclonales humanos derivados de linfocitos B seleccionados con 5 nM de proteína biotina Erb3.mmh se determinaron mediante resonancia de plasmones superficiales a 25 °C. Las mediciones se realizaron en un instrumento Biacore 2000. Los anticuerpos, expresados por transfección transitoria de células CHO K1 como IgG1 humana, se capturaron en una superficie del sensor Fc antihumano, y la proteína Erb3.mmh monomérica soluble se inyectó sobre la superficie. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y de disociación (kd) cinética se determinaron mediante el proceso y ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático para el ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (Kd) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: Kü(M)=ka/kd.

La Figura 4 muestra que entre los 148 anticuerpos anti Erb3 aislados mediante la selección de linfocitos B con 5 nM de proteína biotina Erb3.mmh, 78 Abs se unieron a Erb3.mmh con Kd de menos de 1 nM, 57 Abs se unieron a Erb3.mmh con K^d entre 1 nM y 10 nM, 12 Abs se unieron a Erb3.mmh con K^d entre 10 nM y 100 nM, y 1 Ab se unió a Erb3.mmh con K^d entre 100 nM y 1 mM. Los anticuerpos Anti Erb3 con menos de 10 nM de K^d superaron significativamente los anticuerpos con más de 10 nM de Kd, lo que demuestra que la selección y el aislamiento de linfocitos B que se unieron a 5 nM de biotina Erb3.mmh enriquecida para anticuerpos con alta afinidad (menos de 10 nM de Kd).

Diecinueve (19) anticuerpos anti Erb3 con la mejor afinidad contra Erb3.mmh se produjeron a partir de células CHO EESYR® estables y se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A.

La Tabla 1 muestra las afinidades (ka, kd, K^d) y la ti/2 de disociación de los 19 anticuerpos Erb3 purificados contra la proteína Erb3.mmh o Erb3.mFc según lo determinado por Biacore. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (Kd) y semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD(M)=ka/kd; y t1/2 (min)=(ln2/(60*kd).

Tabla 1

continuación

Ejemplo 6 . Aislamiento y producción de anticuerpos con factor de crecimiento nervioso (NGF) de alta afinidad

Los métodos y procedimientos para el aislamiento y la producción de anticuerpos anti NGF de alta afinidad fueron los mismos que los descritos en el ejemplo de Erb3 (Ejemplo 4), excepto que la proteína NGF humana se usó como el inmunógeno y 5 nM de NGF biotinilado se usó para seleccionar linfocitos B.

Ejemplo 7 . Afinidad de unión de los anticuerpos de NGF a la proteína de NGF

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los 63 anticuerpos anti NGF monoclonales humanos derivados de los linfocitos B seleccionados con 5 nM de proteína de biotina NGF se determinaron mediante resonancia de plasmones superficiales a 25 °C. Las mediciones se realizaron en un instrumento Biacore 2000. Los anticuerpos, expresados por transfección transitoria de células CHO K1 como IgG1 humana, se capturaron en una superficie del sensor Fc antihumano, y la proteína NGF humana se inyectó sobre la superficie. La asociación (ka) y de disociación (kd) cinética se determinaron mediante el proceso y ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático para el ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (Kd) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD(M)=ka/kd.

La Figura 5 muestra que entre los 63 anticuerpos anti NGF aislados mediante la selección de linfocitos B con 5 nM de biotina NGF, 55 Abs unidos a NGF con KD de menos de 1 nM, 7 Abs unidos a NGF con KD entre 1 nM a 10 nM, y 1 Ab unido a NGF con KD entre 10 nM a 100 nM. Los anticuerpos Anti NGF con menos de 10 nM de KD superaron significativamente los anticuerpos con más de 10 nM de KD, lo que demuestra que la selección y el aislamiento de linfocitos B que se unieron a 5 nM de biotina NGF enriquecida para anticuerpos con alta afinidad (menos de 10 nM de KD).

Veintiún (21) anticuerpos anti NGF con la mayor afinidad contra NGF se produjeron a partir de

La Tabla 2 muestra las afinidades (ka, kd, K^d) y la ti/2 de disociación de los 21 anticuerpos purificados contra el NGF contra la proteína NGF según lo determinado por Biacore. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (K^d) y semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD(M)=ka/kd; y t1/2 (min)=(In2/(60*kd).

Tabla 2

Ejemplo 8 . Aislamiento y producción de anticuerpos contra la activina A de alta afinidad

Los métodos y procedimientos fueron los mismos que los descritos en el ejemplo de Erb3 (Ejemplo 4) anterior, excepto que la proteína de Activina A humana se usó como el inmunógeno y 1 nM de Activina A biotinilado se usó para seleccionar linfocitos B.

Ejemplo 9 . Afinidad de unión de anticuerpos de la activina A a la proteína activina A

Las afinidades de unión de los 648 anticuerpos anti Activina A monoclonales humanos derivados de linfocitos B seleccionados con 1 nM de proteína biotina Activina A se determinaron en un instrumento Biacore. Los anticuerpos, expresados por transfección transitoria de células CHO K1 como IgG1 humana, se capturaron en una superficie del sensor Fc antihumano, y la proteína de Activina A humana se inyectó sobre la. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y de disociación (kd) cinética se determinaron mediante el proceso y ajuste de los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático para el ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (Kd) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD(M)=ka/kd.

La Figura 6 muestra que entre los 648 anticuerpos anti Activina A aislados mediante la selección de linfocitos B con 1 nM de biotina Activina A, 212 Abs unidos a Activina A con KD de menos de 1 nM, 416 Abs unidos a Activina A con KD entre 1 nM a 10 nM, y 20 Abs unidos a Activina A con KD entre 10 nM a 100 nM. Los anticuerpos Anti Activina A con menos de 10 nM de KD superaron significativamente los anticuerpos con más de 10 nM de KD, lo que demuestra que la selección y el aislamiento de linfocitos B que se unieron a 1 nM de biotina Activina A enriquecida para anticuerpos con alta afinidad (menos de 10 nM de KD).

Dieciocho (18) anticuerpos anti Activina A con la afinidad más alta contra la Activina A se produjeron a partir de células CHO EESYR® estables y se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A. La Tabla 3 muestra las afinidades (ka, kd, K^d) y la t1/2 de disociación de los 18 anticuerpos purificados contra la proteína activina A según lo determinado por Biacore. Las constantes de equilibrio de disociación de unión (Kd) y semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD(M)=ka/kd; y t1/2 (min)=(In2/(60*kd).

Tabla 3

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para seleccionar células primarias productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos que exhiben una unión de alta afinidad, expresada como Kd, de 0,1 nM a 10 nM para un antígeno de interés, el método que comprende:

(a) poner en contacto una población de células primarias productoras de anticuerpos que expresan anticuerpos unidos a la membrana al antígeno de interés con una forma monomérica del antígeno de interés a una concentración de 0,1 nM a 2 nM durante un tiempo suficiente para que el antígeno se una al anticuerpo en la superficie de las células;

(b) lavar las células durante un período de tiempo para eliminar el antígeno no unido; y

(c) recolectar células unidas al antígeno.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración del antígeno monomérico es:

(a) 1 nM;

(b) entre 1 nM y 2 nM; o

(c) 0,1 nM a 1 nM.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dichos anticuerpos tienen una K^d de menos de 10 nM.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el antígeno monomérico comprende una etiqueta detectable.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la etiqueta detectable se conjuga directamente al antígeno y opcionalmente la etiqueta detectable se conjuga al antígeno a través de un par de socios de unión, opcionalmente en donde:

(a) un socio de unión del par de socios de unión se etiqueta con un marcador detectable; o

(b) el par de socios de unión es biotina/estreptavidina.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el antígeno es biotinilado y el socio de unión es estreptavidina que comprende un marcador detectable.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el marcador detectable es una etiqueta fluorescente.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde:

(a) el período de tiempo para lavar las células es de menos de aproximadamente 60 minutos;

(b) el período de tiempo para lavar las células durante un período de tiempo comprende un (1) lavado de aproximadamente 10 minutos, o aproximadamente 15 minutos, o aproximadamente 20 minutos, o aproximadamente 25 minutos, o aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente 35 minutos, o aproximadamente 40 minutos, o aproximadamente 45 minutos, o aproximadamente 50 minutos, o aproximadamente 55 minutos, o aproximadamente 60 minutos en total; o

(c) lavar las células durante un período de tiempo comprende dos (2) lavados cada uno de aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente 10 minutos, o aproximadamente 15 minutos o aproximadamente 20 minutos, o aproximadamente 25 minutos, o aproximadamente 30 minutos por lavado.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende además poner en contacto las células que retienen el antígeno biotinilado después del lavado con estreptavidina que comprende una etiqueta detectable.

10. El método de la reivindicación 7, en donde el uso de clasificación de células activadas por fluorescencia, las células que se unen a la etiqueta fluorescente se identifican para obtener células que expresan dichos anticuerpos.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, que comprende además: recolectar las células que se unen a la etiqueta detectable para aislar las células que expresan dichos anticuerpos.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además aislar células que expresan dichos anticuerpos de las células recogidas unidas al antígeno.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde las células productoras de anticuerpos primarias se obtienen de bazo, ganglios linfáticos, sangre periférica y/o médula ósea.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además aislar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo de las células recogidas en la etapa (c).

15. El método de la reivindicación 14, dicho método que comprende además:

(a) transfectar una célula huésped con un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el anticuerpo; y

(b) cultivar la célula huésped transfectada en condiciones para respaldar la expresión del anticuerpo por parte de la célula huésped,

en donde opcionalmente el vector es un vector de expresión y opcionalmente la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino (CHO).