RU1826970C

RU1826970C - Способ получени производных пептидов WS-9326 А

Info

Publication number: RU1826970C
Application number: SU894613896A
Authority: RU
Inventors: Кино Тохру; Нисикава Мотоаки; Изаки Масами; Кийото Сумио
Original assignee: Фудзисава Фармасьютикал Ко., Лтд
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1993-07-07
Also published as: NO891389L; FI891581A0; EP0336230A3; FI102547B; JPH02204499A; FI102547B1; JP2551142B2; DK161789D0; KR890016061A; KR0132567B1; PH30960A; FI891581A; AU3239789A; CN1037857C; UA26845C2; RU2043365C1; DK161789A; AU627453B2; HUT49631A; NO177714B

Abstract

Использование: в фармакологии, поскольку получаемые пептиды-антагонисты к веществу Р, антагонисты к нейрокинину А (вещество К), пригодны дл профилактики и лечени астмы. Сущность изобретени : способ получени производных пептидов WS- 9326А формулы 1 снсвшои, R-Thr-N((0)-Leu-DPhe-QU0Thr(R AsnSer(R ) где Р1-ар(низший) алканоил с Cs-алкилом в орто-положении; R2-H, низший алканоил, путем восстановлени соединений общей формулы I, где R -ар(низший}алкеноил с Cs- алкенилом в ортоположении; Р2-значени указаны выше. 7 табл.. 10 ил.

Description

Изобретение касаетс способа получени пептидных производных WS-9326 А, ко- торые обладают фармакологической активностью, такой как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (вещество К), или тому подобным.

Целевые производные пептида WS- 9326 А согл асно изобретению могут быть представлены следующей формулой I

0-й2

ф

нн

ftb-Thr-N-C-C-Uu-D-Phe-ailo-Tbr-Asti-Scfсн .

где Я ь представл ет собой ар(низкий)алка- ноил, имеющий С5-алкил в орто-положении и Р2-водород или низкий алканоил.

Согласно изобретению пептидные производные WS-9326A формулы I могут быть получены следующим способом.

Способ. 0-R7

НС О

11 II

R a-Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-aUO-Thr-ASrrSer-i сньI

O-R

(Ш

I

ВОССТАНОВЛЕНИЕ

НС ОRR

1и и I

R-Thr-N-C-C-Leu-D-Pbe-aUO-Tht -Asn-Ser

b 1 t

снг

J

00

ю о ю XI о

CJ

(I)

4о

где R б и R имеют значени , указанные выше .

R a означает ар (низкий) алкеноил с С - алкенилом в орто-положении.

Способ получени целевого соединени формулы I по снен ниже.

Способ.

Соединение I или его соль можно получить , подверга восстановлению соединение II или его соль.

Подход щими катализаторами, используемыми при каталитическом восстановлении , вл ютс традиционные восстановители, также как платиновые катализаторы (т.е. платинова пластинка, губчата платина, платинова чернь, коллоидна платина, окись платины, платинова проволока и так далее), палладиевые катализаторы (т.е. губчатый палладий, пал- ладиева чернь, окись палладий, палладий на угле, коллоидный палладий,палладий на сульфате бари , палладий на карбонате бари и так далее), никелевые кагалмзаторры (т.е. измельченный никель, окись никел , никель Рене и так далее), кобальтовые катализаторы (т.е. измельченный кобальт, кобальт Рене и так далее), железные катализаторы (т.е. измельченна медь, медь Ульмана и так далее) и тому подобные.

Реакцию обычно провод т в традиционном растворителе, таком как ацето, диок- сан, спирт, гетрагмдрофурам, этилацетат, М,М диметилформамид, диметилсульфок- сид или любой другой растворитель, который не вли ет отрицательно на реакцию.

Температура реакции не вл етс критической и реакцию обычно провод т при температурах от охлаждени до нагревани .

Исходные соединени Н и ill вл ютс новыми и могут быть получены следующими способами.

Исходное соединение II - новое, может быть приготовлено путем следующих процессов синтеза и ферментации.

(Продукт процессов синтеза)

С п о с п б А. 0-V

не оу у

H-T.hr-N-C-C-Leu-D-PVie-auo-Thf-ASn-Ser1- СНЭ

или его реакционное производное при аминофуппе или его соль

0-R

Ф

НС О

АЦИЛИРОВАНИЕ R

o -T -M- -c-Leu-D-Phe-ullO-Thr-Asn Ser а, i

L сн

(10

СпособВ.

НС ОRR

1И 11II

R-Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-aUO-Thr-Asn-SeT1- a . i

,о L15

НС, О

С лИМII

R -Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-aUo-Thr-ASn-Ser

А 1

снь

J

(ПЬ)

лг

20 где R3 и R имеют значени , указанные выше;

9

R а - низший алканоил.

С п о с о б А.

Соединени II могут быть получены пу25 тем реакции ацилировани соединени 111 или его реакционноспособного производного при аминогруппе или его соли.

Поход щее реакционноспособное производное при аминогруппе соединени III

30 может включать основание Шиффа иминно- го типа или его таутомерный изомер анами- нового типа, полученное при реакции соединени III с карбонильным соединением , таким как альдегид, кетон и тому подо35 бное; силильное производное, полученное взаимодействием соединений III с силильным соединением, таким как био-(триметилсилил)- ацетамид, моно-(триметилсилил)-ацетамид, био-(триметилси ил)-мочевина или тому по40 добными; производное, образованное при взаимодействии соединени 111с треххлори- стым фосфором или фосгеном и тому подобными .

Подход щее ацилирующее средство,

45 используемое в насто щей реакции ацилировани , может включать традиционное ацилирующее средство может быть выражено формулой RV-OH (XIV)

50 где R а имеет значение, определенное ранее ) или его реакционноспособное производное или его соль.

Подход щее реакционноспособное производное соединени формулы (XIV) мо55 жет включать галоидангидрид, ангидрид кислоты, активированный амид, активированный сложных эфир и тому подобное. Подход щим примером может быть хлоран- гидрид; азид кислоты, смешанный ангидрид кислоты с кислотой, такой как замещенна

фосфорна кислота (т.е. диалкилфосфорна кислота, фенилфосфорна кислота, дифе- нилфосфорна кислота, дибензилфосфор- на кислота, галогенизированна фосфорна кислота и так далее), диалкил- фосфористз кислота, серниста кислота, тиосерна кислота, сульфокислота (т.е. ме- тансульфоксилота и так далее), алкилугле- кислота, алифатическа карбонова кислота (т.е. пизалинова кислота, валерианова кислота, изовалерианова кислота, 2-этил- масл на кислота или трихлоруксусна кислота и так далее) или ароматическа карбонова кислота (т.е. бензойна кислота и так далее); симметрический ангидрид кислоты , активированный амид с имидазолом, 4-замещенный имидазол, диметилпиразол, триезол или тетразол; или активированный сложный эфир (т.е. цианометиловый сложный эфир, метоксиметиловый эфир, димети- лиминометиловый эфир (CHa) пропаргиловый эфир, пэранитрофениловый эфир, 2,4-динитрофениловый эфир, трих- лорфениловый эфир, пентахлорфениловый эфир, метилсульфонилфениловый эфир, фе- нилазофениловый эфир, фениловый тиоэ- фир, п-нитрофениловый тиоэфир п-трезиловый тиоэфир, карбоксиметиловый тиоэфир, пираниловый эфир, пиридиловый эфир, пиперидиловый эфир, 8-хинолило- еый тиоэфир и так далее) или сложный эфир с N-оксисоединением (т.е. N.N-диме- тилгидроксиламин, 1-окси-2(1 Н)-пиридон, М-оксисукцинимид, N-оксифталимид, 1-ок- си-6-хлор-1Н-бензотиазол и так далее) и тому подобны). Эти реакционноспособные производные могут быть необ зательно выбраны из них в соответствии с видом используемого соединени формулы (XIV).

Реакцию обычно провод т в традиционном растворителе, таком как спирт (т.е. метанол , этанол и так далее), ацетон, диоксан, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N.N-диме- тилформамид, пиридин или любой другой растворитель, который не вли ет отрицательно на реакцию. Этот традиционный растворитель может быть также использован в смеси с водой.

Если соединение (XIV) используют в форме свободной кислоты или в форме ее соли в этой реакции, то реакцию предпочтительно провод т в присутствии традиционного конденсирующего средства, такого как М.м -дициклогексилкарбодиимид, М-цикло- гексил-Ы1-морфолиноэтилкарбодиимид, N- циклогексил-N -(4-диэтиламиноциклогексил)- карбодиимид, N,N -диэтилкарбодиимид, N.N -диизопропилкарбодиимид, М-этил-N - (З-диметиламинопропил)-карбодиимид, М,М-карбонилбис-(2-метилимидазол), пентаметиленкетен-М-циклогексиламин , дифе- нилкетен-Ы-циклогексилимин, этоксиацети- лен,1-алкокси-1-хлорэтилен,

триалкилфосфит, этилполифосфат. изопро- 5 лиловый эфир полифосфорной кислоты, ок- сихлорид фосфора (хлористый фосфарин), треххлористый фосфор, хлористый оксал- кил, трифенилфосфин, хлористый тионил. соль 2-этил-7-оксибензилоксазолил, гидро- 0 окись 2-этил-5-(мета-сульфофени )-изокса- золил, внутримолекул рна соль, 1-(п-хлорбензолсульфонилокси)-6-хлор-1Н -бензотриазол, так называемый реактив Вильсмайера. полученный взаимодействи- 5 ем М -диметилформамида с хлористым ти- онилом, фосгеном, трихлорметиловым эфиром хлормуравьиной кислоты, оксихло- ридом фосфора, и подобные.

Реакци может быть также проведена в 0 присутствии неорганического или органического основани , такого как бикарбонат щелочного металла, три(низший)алкиламин, пиридин, М-(низший)алкилморфолин, JM,N- ди{низший)элкилбензиламин. Температура 5 реакции не вл етс критической и реакцию обычно провод т при температурах от охлаждени до комнатной температуры.

Способ В.

Соединение II или его соль могут быть 0 получены путем реакции ацилировани соединени На или его соли.

На эту реакцию имеетс ссылка в Получени х 29 31, описанных позднее.

(Получение ферментацией) 5 WS-9326A можно получить ферментацией WS-9326A продуцирующих штамма, принадлежащего к роду Streptomyces, такому как Streptomyces Violaceoniger № 9326 в питательной среде.

0 Специфические микроорганизмы, использованные дл получени WS-9326A, будут описаны в дальнейшем.

Микроорганизм.

5 Микроорганизм, который может быть использован дл продуцировани WS- 9326А, вл етс штаммом-продуцентом WS-9326A, принадлежащим к роду Streptomyces, из которого Streptomyces

0 violaceoniger W 9326 недавно был выделен из твердого образца, наход щегос в коллекции Suwa City, Nagano Prefecture, Japan. Лиофилизированный образец вновь выделенного Streptomyces violaceoniger №

5 9326 депонирован в Научно-исследовательском институте агенства промышленных знаний и технологии (1-3, Higshi l-chome, Tsukuba-shl, Ibarakl-Ken 305, Japan) под номером ЕРМ ВР-1667 (дата депонировани : 20 нвар 1988г.).

Пон тно, что продуцирование новыхпоказывала гигроскопические свойства на

WS-9326A не ограничиваетс описываемымбольшинстве агаровых сред. Обратна стоздесь конкретным организмом, которыйрон культуры была желтовато-коричнева ,

приведен лишь в цел х иллюстрации. Этокоричнева и темно-коричнева . Пигмент

изобретение включает также использова-5 мицели обратной стороны не чувствителен

ние любых мутантов, которые способнык рН среды. Меленоидные пигменты и друпродуцировать WS-9326A, включа природ-гие растворимые пигменты не продуцируют,

ные мутанты, а также искусственные мутан-Анализ клеточных стенок был выполнен

ты, которые могут быть получены отпо методам Беккера и соавторов (Beeker В,

описанного здесь организма традиционны-10 М,Р. Lechevalier, R, E. Gordon and

ми средствами, такими как облучение рент-H.A.Lechevalier. Быстра дифференциаци

геновскими лучами, ультрафиолетовыммежду Nocardio и Streptomyces хроматограизлучением , обработка М-метил-М1-нитро-фией на бумаге цельного клеточного гидроN-нитрозогуанидином , 2-аминопурином илизата. Appl. Microbiol, 12, 421-423, 1964 и

тому подобными, Streptomyces15 Ямагуши Janagucht, Т. Сравнение состава

vtolaceoniger №9326 имеет следующие мор-клеточных мембран морфологически разфологические , культу рал ьные, биологиче-личных актиномицетов. - I. Bacteriol, 89,

ские и физиологические характеристики.444-455, 1965). Анализ цельных клеточных

(1)Морфологические характеристики.гидролизатов штамма № 9326 показал прибыли использованы методы, описанные20 сутствие LL-диаминомимелизовой кислоты,

Ширлингом и Готлибом (Shlrling E. В. andСледовательно, клеточна стенка этого

Gottlieb D). Методы дл характеристики ви-штамма, по-видимому, типа 1.

дов Streptomyces. - International Journal of(3) Биологические и физиологические

Sistemate Bacteriology, 16, 313-340, 1966)свойства.

дл этого таксономического исследовани .25 Физиологические свойства и усвоение

Морфологические наблюдени были вы-источников углерода показаны в табл, 2 и 3

полнены на оптическом и электронном мик-соответственно.

росхемах на культуре, выращенной приИспользование источников углерода опре30°С в течение 14 дней на агаре с дрожже-дел ли методами Придхема и Готлиба (Pridham

во-солодовым экстрактом, на агаре из овс -30 Т. G. and Gotlieb. Использование углеродных

ной муки, на агаре из крахмала исоединений некоторыми актиномицетами как

неорганических солей.вспомогательное средство определени видов.

Вегетативный мицелий развит хорошо-I. Bacteriol,,56,107-114, 1948).

без фрагментации. Воздушный мицелийМорфологи и химические характериразветвлен моноподиально и образует спи-35 стики штамма № 9326 позвол ют четко отнеральныецеписпорс 10-30 спорами на день.сти организм к роду Streptomyces, Штамм №

Споры имеют гладкую поверхность и оваль-9325 сравнивали с видами Streptomyces,

ную форму с размерами (0,6-0,8)х{0,8-1,3)описанными в 8-м издании руководства Бермкм . Отвердевших гранул, споранги и зоо-ге (Buchanan R. E. and N. E. Gibbons

спор не наблюдали.40 Sergey s manual of determinative

(2)Культуральные характеристикиbacteriology/ ,cighl edition, The Williams and Культуральные характеристики наблю-Wilkins Co, Baltimore, 1974), с видами

дали на дес ти видах сред, описанных Шир-Streptomyces, описанными в докладах Ширлингом и Готлибом в упом нутом вышелинга(ЗЫг11пд,Е. В. and D.Gottliebl. Совме- мсточнике и Ваксманом (Waksman S. A.: The45 СТНое описание типичной культуры actinomycetes vol. 2: Classification,Streptomyces. 2. Описани видов по резуль- identiaication and description of genera andтатам первого исследовани . Intern, I. Syst. species. The Williams and Wllnins G.,Bacterlol., 18, 69-189, 1968). (Shirlmg E. B. Baltimore, 1961). and D, Gottlieb: 1.Совместное описание тиВыращивание проводили при 30 С в те-50 пичной культуры Streptomyces). 2. Описани

чение 21 дн . Названи цвета, использован-видов по результатам первого исследованые в этом исследовании, вз ты изНИЙ1 intern, I. Syst. Bacteriol. 18; 69-189,

колориметрического руководства Метуэна1968). (Shirting Е.В. and D.Gottlteb: Совмест (Kornerup A. and I. H. Wanscher: MethuenHoe описание типичной культуры

Handboon of colour, methuen, London, 1978).55 Streptomyces). 3. Дополнительные описани

Результаты представлены в табл. 1. видов по результатам первого и второго исследований . Intern. I. Syst. Bacteriol. 18: 279Воздушный мицелий имел окраску от392, 1968 и (Shirlmg E. В. and D. Gottlieb:

серого до коричневато-серого цвета. ЧастьСовместное описание типичной культуры

колонии становилась черной и влажной и„Sjreptomyces).

4. Описани видов по результатам второго , третьего и четвертого исследований Intern. I. Syjjt. Bacteriol. 19: 391-512, 1969, с видами, внесенными в Уточненные перечни названий бактерий: (Skerman, V. В. D; V. MeGowan 8 Р.Н.А. Sneath: Уточненный список бактериальных названий. Intern. I. Syst. Bacteriol: 30: 225-420, 180), и с видами, описанными в других источниках (Williams S. Т., М. Goodfellow, G. Alderson, Е. М. Н. Wellington, P. H. A. Sneath and М. I, Sackin: Численна классификаци Streptomyces и родственных родов. I. Gen. Microbiol. 129: 1743-1813, 1983) и /Dietz, А: Критерии дл характеристики гигроскопических штаммов, опубликованы в Actinomycetes; The Boundary Microorganisms с. 183-191, изданный в 1976).

В результата сравнений было установлено , что штамм № 9326 имеет близкое сходство со Streptomyces violaceoniger. Поэтому штамм Nfe 9326 был идентифицирован как Streptomyces violaceoniger и назван Streptomyces violaceoniger № 9326.

Получение WS-9326A.

Новые WS-9326A согласно изобретению могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS-9326A, принадлежащего к роду Streptomyces (т.е. Streptomyces violactoniger Ms 9326, ЕРМ ВР-1667) в питательной среде.

В общем WS-9326A могут быть получены выращиванием штамма-продуцента WS- 9326А в водной питательной среде, содержащей источник усво емого углерода и азота, предпочтительно в аэробных услови х (т.е. встр хиваема культура, погруженна культура и так далее).

Предпочтительными источниками углерода в питательной среде вл ютс углеводы, такие как глюкоза, ксилоза, галактоза, глипе- рин, крахмал, декстрин и тому подобные.

Другими источниками, которые могут быть использованы вл ютс мальтоза, рам- ноза, рафиноза, арабиноза, манноза, сели- цин, сукцинат натри и тому подобные.

Предпочтительными источниками азота вл ютс дрожжевой экстракт, пептон, клейковина, хлопкова мука, соева мука, экстракт от замачивани кукурузы, пшеничные проростки, высушенные дрожжи, молотое перо, порошок земл ного ореха и так далее, а также неорганические и органические соединени азота, такие как соли аммони (т.е. нитрат аммони , сульфат аммони , фосфат аммони итак далее), мочевина, аминокислоты и тому подобные.

Источники углерода и азота, хот и преимущественно используемые в сочетании, не об зательно используютс в чистой форме , поскольку менее чистые материалы, которые содержат следы ростовых факторов и значительные количества минеральных питательных веществ, также пригодны дл использовани . Они могут быть добавлены к 5 минеральным сол м среды, таким как карбонат натри или кальци , фосфат натри или кали , хлористый натрий или калий, йодистый натрий или калий, соли магни , соли меди, соли кобальта и тому подобные. Если

необходимо, особенно когда культуральна среда сильно вспениваетс , могут быть добавлены антивспениватели, такие как жидкий парафин, жировое масло, растительное масло, минеральное масло или силикон.

5Как услови дл получени WS-9326A в

больших количествах предпочтительны аэробные услови погруженной культуры. Дл получени небольших количеств используют встр хиваемые или поверхностные

0 культуры в колбах или бутыл х. Кроме того, если выращивание провод т в больших резервуарах , то предпочтительно использование вегетативной формы организма дл инокулировани в ферментационные емко5 сти, чтобы избежать латентный период развити культуры в процессе получени WS-9326A. Таким образом, желательно сначала получить посевную культуру организма инокулированием относительно малого коли0 чества культуральной среды спорами или мицеллами микроорганизма и выращиванием этой инокулированной среды и затем перенести выращенный вегетативный инокул т в асептических услови х в большие резервуары.

5 Среда, в которой получен вегетативный инокул т , аналогична или отличаетс от среды, используемой дл получени WS-9326A.

Перемещение и аэраци культуральной смеси могут быть осуществлены различными

0 пут ми. Перемешивание может быть проведено лопаст ми винта или аналогичными механическими мешалками, вращением или встр хиванием бродильного чана, различны- . ми нагнетающими устройствами или пропу5 еканием стерильного воздуха через среду. Аэраци может быть осуществлена путем пропускани стерильного воздуха через ферментационную среду.

Брожение обычно провод т при темпе0 ратуре от 20 до 40°С, предпочтительно при 25-35°С, в течение времени примерно от 50 о 150 ч, которые могут варьировать в соответствии с услови ми брожени и масштабами производства.

5Полученные WS-9326A могут быть затем

выделены из культуральной среды традиционными средствами, которые обычно используютс дл выделени других известных биологически активных веществ. Полученные WS-9326A были найдены в культуральном фильтрате и мицелии, таким образом WS 9326A могут быть выделены и очищены из фильтрата и мицели , которые получены при фильтрации или центрифугировании культуральной жидкости традиционным методом , таким как концентрирование при пониженном давлении, лиофилизаци , экстракци традиционным растворителем, регулирование рН, обработка обычной смолой (т.е. анионо- или катионообменна смола, неионогенна абсорбирующа смола итак далее ), обработка традиционным абсорбентом (т.е. активированным углем, кремниевой кислотой , силикагельцеллюлозой, глиноземом и тому подобными), кристаллизаци , перекристаллизаци и тому подобные.

WS-9326A, полученный описанным выше способом, обладает следующими физическими и химическими свойствами.

(1)форма и цвет: бесцветный порошок

(2)цветна реакци :

положительна : на сульфат цери , реакци на пары иода, реакци на хлористое железо (3) - железо (3) цианистый калий; отрицательна : реакци на анигидрин, реакци Молима, реакци на хлористое железо (3), реакци Эрлиха, реакци Паули.

(3)растворимость:

растворим: метанол, этанол, слабо растворим: ацетон, этилацетат нерастворим: вода, хлороформ

(4)точка плавлени : 187-190°С

(5)удельное вращение: а$ 3:-84° (,0, метанол)

(6)спектр ультрафиолетового поглощени (метанол): Амакс 280 пикометров ( ,700)

(7)спектр поглощени инфракрасного излучени (КВг): Умакс 3300, 3050, 2950, 2920, 2860, 1730,1650,1610,1560,1540,1530, 1510,1440, 1380,1340, 1280,1240,1170,1110, 1080, 1060, 1040, 970, 880, 860, 830 , график которого представлен на фиг, 1.

(8)элементный анализ дл C54H68NaOi3-2H20:

Вычислено %: С 60,43; Н 6,76; N 10,44. Найдено %: С 60,18; Н 6,61; N 10,32.

(9)тонкослойна хроматографи

(10)молекул рна формула: Cr HGsNeOi.i

(11)молекул рный вес: АВ-масс-спектр m/z 1037(М+Н)+

(12)свойства вещества: кислое вещество (13) спектр дерного магнитного резонанса на драх 130: (100 МГц, СДзОД) д:

175,69 (с), 174,70 (с), 173,73 (с), 173,38 (с), 172,89 (с), 171,04 (с), 170,45 (с), 167,79 (с), 167,15 (с), 159,20 (с), 140,05 (д), 139,12 (с),

138,71 (с), 135,27 (д), 134,85 (с), 132,11 (д), 132,08 (с), 131,69 (д)х2, 130,70 (д), 129,90 (д), 130,70 (д), 129,90 (д), 129,61 (д)х2, 128,55 (д), 128,04 (д), 127,99 (д), 127,38 (д), 126,09 (с), 123,70 (д), 115,63 (д), 73,46(д), 71,34 (д), 62,80

(т), 59,53 (д), 56.91 (д), 56,76 (д), 55,55(д), 53,64 (д), 52,10(д), 39,85 (т), 37,18 (т), 37,09 (т), 34,58 (кв), 31,37 (т). 24,56 (д), 23,63 (т), 22,71 (кв), 22,52 (кв), 21,17 (кв), 17,19 (кв), 14,13 (кв), график которого представлен на фиг.

2.

(14)спектр дерного магнитного резонанса на драх 1Н, (400 МГц, СДзОД) д:

7,80 (1Н, д, Гц), 7,67 (1Н, д, Мб Гц): 7.45-7,14 (9Н, м), 7,06 (2Н, д, Гц), (1Н. с),

6,65 (2Н, д, Гц), 6,59 (1Н, д, Гц), 5,88 (1Н, дт, 1-12 и 7 Гц), 5.55 (1Н, м, 5,35) (1Н, широкий сигнал), 5,10 (1Н, дд, и 9,5 Гц), 4,68 (1Н, д, Гц), 4,55 (1 Н, т, Гц), 4,48 (1 Г, дд, и 12 Гц). 3,92 (3,92 (2Н, д, Гц),

3,70 (1 Н, т, Н7,5 Гц), 3,62 (1 Н, м), 3,46 (1 Н, дд, и 14 Гц), 2,94 (1Н, дд, ИЗ и 16 Гц), 2,89 (ЗН, с), 2,74 (1Н, дд, ,5 и 16 Гц), 2,69 (1Н, дд, и 14 Гц), 2,14 (2Н, м), 1,5-1,4 (2Н, м), 1,20(ЗН, д, N6 Гц), 1,08(ЗН, д, Гц), 1,0-0,8

(2Н, м), 0,91 (ЗН, т, Гц), 0,6 (1Н, м), 0,53 (ЗН, д, N6 Гц). 0,51 (ЗН, д, Гц), график которого представлен на фиг. 3.

(15)аминокислотный анализ: Л/5-9326(5мг)гидролизовали при 110°С

в течение 20 ч с хлористоводородной кислотой (2 мл) в запа нной пробирке. Смесь выпаривали досуха и получали продукты гидролиза, которые затем анализировали на автоматическом анализаторе аминокислот

Хитами 835.

Результаты аминокислотного анализа:

треонин (2), лейцин (1), фенилаланин (1), аспарагинова кислота (1), серии (1), металимин (1) и аммиак (1).

Что касаетс WS-9326A, то следует заметить , что спектры дерного магнитного резонанса на драх 13С и 1Н, представлен- ные на фиг. 2 и 3, показали, что WS-9326A существует по меньшей мере в двух стабильных конформаци х в растворе СДзОД, и химические сдвиги, описанные в приведенных выше пунктах (13) и (14), вл етс сдвигами основного конформера WS-9326A.

Из анализа представленных выше физических и химических свойств и по результатам дальнейших исследований по идентификации химической структуры химическое строение WS-9326A идентифици- ровано и интерпретировано следующим образом:

WS-9326A:

R-Thr-N-C-c-Leu-D-Phe-aUo-Thr-ASti-Ser-, | Нер

R-;

н

.CHoCHaCrii

с/ 2 2 3

н

/(Е)-3-{2-(2)-1-пентенил)-фенил -пропен- оил/

В изложенном и последующем описании насто щей за вки подход щие примеры и иллюстрации различных определений, которые изобретение включает в свой обь- ем, по сн ютс детально следующим образом .

Термин низший означает 1-6 углеродных атомов, если не оговорено особо.

Подход щий пример низшего алкэнои- ла включает формил, ацетил, пропаноил, бу- таноил, 2-метилпропаноил; пентаноил. 2,2-диметилпропаноил, гексаноил и т.п.

Подход щий ар(низший)алканоил может включать фенилпропаноил, фенилбута- ноил, фенилизобутилил, фенилпентаноил, фенил гексаноил и так далее), нафтил(ни- зший)алканоил (т.е. нафтилпропаноил, наф- тилбутаноил, нафтилпентаноил и тому подобные).

Подход щий ар(низший)алкеноил может включать: фенил(низший)алкеноил (т.е. фенилпропаноил, фенилбутаноил, фенилме- такрилоил, фенилпентеноил, фенилгексено- ил и так далее), нафтил (низший)алкеноил (т.е. нзфтилпропеноил, нафтилбутеноил, нафтилпентеноил и так далее) и тому подобные .

Подход щий Cs алкил может включать пентил и т.п.

Подход щий Cs алкенил может включить 1-. или 2-. или 3-, или 4-пентенил и т.п.

Биологические свойства пептидных производных WS-9326A.

5

10

0

5

0

5

0 5

0

5

Пептидные производные WS-9326A формулы I и их фармацевтически приемлемые соли обладают фармакологической активностью , такой как антагонизм к веществу Р, антагонизм к нейрокинину А (веществу К), или тому подобными, поэтому они полезны дл профилактики и лечени астмы и тому подобного.

В качестве примера демонстрации такой фармакологической активности привод тс ниже данные фармакологических исследований .

1 Испытуемые соединени :

(а) D-PrO-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-D- Trp-Phe-NH2 HCI (ниже называемое октапеп- тидом)

{Указанное соединение раскрыто в European Journal of Pharnacology, 99 (1984) 193-202.

(1)Тетрагидро- Л/5-9326А

(2)Тетрагидротриацетил- Л/5-9326А 11 Методы испытани и результаты: (1) Анализ по степени св зывани с радиоактивно меченным лигандом.

(а) Изготовление сырой мембраны.

Легкое.

Самцов морских свинок (альбиносов штамма Хартли, 600 г) умерщвл ли путем обезглавливани . Затем удал ли трахеи и легкие и хранили их при -80°С вплоть до использовани . Перед использованием указанные ткани оттаивали и гомогенизировали в 500 мл буфера (0,25 М сахарозы. 50 мМ трис-HCI, рН 7.5; 0,1 мМ ЭДТК) с помощью компактного смесител (MatsudenMI-761). Затем ткань гомогенизировали с помощью ультрадиспергатора (Yarrtato Model LK-21) с интервалами охлаждени между гомогенизаци ми , составл ющими 10 с (полное врем гомогенизации составл ло 60с). После этого гомогенат центрифугировали (ЭООхд за 10 мин} в цел х удалени сгустков ткани, а над- осадочную жидкость центрифугировали при 14000хд 20 мин, в результате чего получали осадки центрифугировани , так называемые неочищенные мембранные фракции. Эти осадки ресуспендировали в Среде 1, гомогенизированной с помощью тефлонового гомогенизатора , и центрифугировали при 14000хд в течение 20 мин. Полученные осадки хранили при температуре -20°С.

(в) Св зывание ЗН-вещества Р с подготовленными мембранами.

3Н-вещество (1 нМ, NeW England Nuclear) инкубировали с 50 мкл мембранного препарата в Среде 1 при 4°С в течение 30 мин в конечном объеме 250 мкл. По окончании периода инкубировани смесь быстро титровали через ватман CF/B стекловоло- конный фильтр (предварительно обработанныи 0.1 %-ным полиэтиленимином в течение 3 ч до его применени ), использу сбор клеток (Brandel M-24S), Затем фильтры промывали 10 раз 3 мл промывочного буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,5) при 0°С. Радиоактивность рассчитывали вЗ мл Аквозола-2 всцин- тилл ционном счетчике (РаскагЬ TRl-CARB 4530).

(2) Действие WS-9326A или тетрагидро- WS-9326A на трахею морских свинок.

Спиральные полоски трахеи получали от взрослых самцов белых морских свинок линии Хартлен (600 г) стандартным методом и помещали в заключенную в футл р 30 мл стекл нную тканевую ванну. Раст жение трахеальных полос измер ли изометрически посредством преобразовани усили сдвига, соединенного с полиграфом (био- псиограф - 180 система San-Ei Instrument). Трахеальные полосы (2 мм шириной и 50 мм длиной) суспендировали при остаточном раст гивающем напр жении 500 мг в 30 мл бан х, содержащих теплый (37°С) насыщенной кислородом (95% кислорода; 5% углекислого газа) раствор Тирода следующего состава: NaCI 137 ммолей (8 г/л) НС) 2,7 ммол (0,2 г/л) CaCl2 2H20 t,8 ммол (0,264 г/л), Mg CI2-6H20 1,02 ммол (0,208 г/л), ЫзНСОз 11,9 ммол (2 г/л), NaH2H2PC 4 2H20 0,42 ммол (0,066 г/л) и глюкозы 5,5 ммол (1 г/л). Ткани приводили в состо ние равновеси в течение 90 мин и затем испытывали WS-9326A против различных бронхоконст- рикторов (вещество Р М). Раст жение регистрировали записывающим устройством San-Ei Rectigraph-8 S, San-El Instrument).

Действие испытуемого соединени на сократительные реакции трахеи морских свинок, вызванные вещества Р приведено в табл. 5.

(3) действие тетрагидро- Л/5-9326А на сужение бронхов, вызванное нейрохинином А.

Самцов морских свинок линии Хартлей, весивших 300-500 г,, обездвиживали пенто- барбиталом натри (10 мг/животное, вводимым внутрибрюшинно). Брюшную вену канилировали дл введени нейрокинина А и лекарства. Катетер был также интубирован в трахею дл искусственной вентил ции легких . Животное получало вдыхаемый воздух посредством миниатюрного дыхательного насоса (Harvard B-34, производительность 5 мл/толчок, 60 толчков в 1 мин). Устойчивость к раздуванию легких измерили модифицированным методом обильного изли ни Кон- центта-Ресслера.

Агонист вводили внутривенно и антагонистическое лекарство вводили, как показано на фиг. 10 (приготовлено в смеси 0,1%метил-целлюлозы и физиологического раствора ):

Ингибирование вызванного нейрокини- ном А сужени бронхов с помощью тетрагидро- А/5-9326А видно из приведенного в табл. 6,

(4) Вли ние внутритрахеального введени тетрагидро- Л/59326А на индуцированное нейрокинином А сужение бронхов у

морских свинок.

Дл испытани действи ингал ции тет- рагидро- Л/3-9326А на сужение бронхов тет- рагидро- Л/5-9326А растворили в диметилсульфоксиде и вводили внутритрахеально . Метод почти не отличалс от описанного выше.

Как показано в табл. 7, тетрагидро-WS- 9326А оказалс сильнодействующим средством .

Фармацевнтическа композици согласно изобретению может быть использована в форме фармацевтического препарата, например в твердой, полутвердой или жидкой форме, котора содержит

пептидные производные формулы I в качестве активного ингредиента в смеси с органическими или неорганическим носителем или наполнителем, пригодным дл внешнего, внутривенного или парэнтерального применени . Активный ингредиент может быть смешан, например, с обычным нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем ( ми) или изготовлени таблеток, гранул, капсул, раствором, эмульсий, суспензий и

других форм, пригодных дл использовани . Носители, которые могут быть использованы , включают воду, глюкозу, лактозу, аравийскую камедь, желатин, маннит, крахмальную пасту, трисиликат магни ,

тальк, кукурузный крахмал, кератин, коллоидную двуокись кремни , картофельный крахмал, мочевину и другие носители, пригодные дл использовани при производстве препаратов в твердом, полутвердом или

жидком состо нии, и в дополнение могут бьггь использованы вспомогательные средства , стабилизаторы, осушители, красители и ароматические средства. Активное целевое соединение включают в фармацевтическую композицию в количестве, достаточном дл получени желаемого действи в зависимости от течени процесса и условий заболеваний.

Поскольку дозирование терапевтически

эффективного количества пептидных производных формулы I варьируетс в зависимости от возраста и состо ни каждого отдельного больного, подлежащего лечению , то в общем ввод т дл лечени болезни

дневную дозу 0,01-1000 мг, предпочтительно 0,1-500 мг, наиболее предпочтительно 0,5-100 мг активного ингредиента и однократную дозу примерно 0,5 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 250 мг и 500 мг.

В этом описании аминокислоты, пептиды , защитные группы и так далее указаны сокращени ми, прин тыми IUPFC-1UB (комиссией по биологической номенклатуре), которые вл ютс обычными в данной области .

Кроме того, в последующих примерах и получени х использованы и другие сокращени в дополнение к сокращени м, прин - тым Комиссией по биологической номенклатуре.

Следующие сокращени использованы в насто щем описании:

Thr-L-треонин

Sev-L- серии

Nye-L- тирозин

asn-L- аспэрагин

tlo-The-L-аллотреонин -Phe-D-фенилаланин Leu-L-лейцин

п-Нех-н-гексан Et-этил

z-бензилоксикарбонил

Рас- фенацил Bzl- бензил

Вос- трет-бутоксикарбонил Ме-метил

ТС1-2,2,2-трихлорэтил Mrup-4-метоксиметоксифенил З -трет-бутилметилси

лил ас-ацетил

Следующие примеры и получени даны дл иллюстрации изобретени в детал х.

Получение 1.

К раствору гидроокиси кали (26,8 г) в этаноле (500 мл) добавл ли глицин (14,6 г) и 4-метоксиметоксибензальдегид (48,5 г) при комнатной температуре. После перемешивани при комнатной температуре в течение 19 ч растворитель удал ли в вакууме. Остаток раствор ли в воде и подкисл ли хлористоводородной кислотой. Раствор промывали этилацетатом и устанавливали рН 6,0 бикарбонатом натри . В осадок выпадало белое твердое вещество, которое со- бирали и получали С-метоксиметил- /2-окситирозин (9,2 г), точка плавлени 164- 166°С,

МК-спектр(Квг)-1610см 1.

Получение 2.

К раствору 0-метоксиметил- / оксити- розина(21,0 г) в 1 н. гидроокиси натри (250 мл) добавл ли диметилсульфат (16,5 г). После перемешивани в течение 20 мин при 90°С раствор подкисл ли разбавленной хлористоводородной кислотой на лед ной бане . Кислый раствор промывали диэтиловым эфиром и устанавливали рН 6,0 1 н. гидроокисью натри . После выпаривани твердое вещество собирали фильтрацией и получали 5 О-метоксиметил-Ы-метил-Д- -окситирозин (5,2 г), точка плавлени 59-60°С.

ИК-спектр (КВг): 3400, 1700 .

Получение 3.

К раствору О-метоксиметил-М-метил-Д- 0 -окситировина (1501 г) и био-(триметилси- лил)-ацетамида (25 мл) в дихлорметана (150 мл)добавл ли раствор 2-нитрофенилсульфо- нилхлорида (11,2 г) в дихлорметане (50 мл). После перемешивани в течение 2 ч при 0°С 5 к раствору добавл ли био-(триметилсилил)- ацетамид (10 мл) и хлористый 2-нитрофенил- сульфонил (5,6 г). Смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре и добавл ли 1 н. гидроокись натри (200 мл). Органический 0 слой промывали водой (300 мл) и водные растворы объедин ли. После подкислени водного раствора разбавленной хлористоводородной кислотой продукт экстрагировали этилацетатом (300 мл) и экстракт промывали 5 водой (по 100 мл три раза). После просушивани раствора над сульфатом магни растворитель удал ли в вакууме и получали 0-метоксиметил-Ы-метил-М-{2-нитрофенилтио}- / --окситирозин (20,5 г), точка плавлени 59- 0 60°С. МК-спектр (КВг): 3400, 1700 см 1.

Получение 4

К раствору 0-метоксиметил-М-метил-М- (2-нитрофенилтио)-окситирозина (20,0 г) в этилацетате (100 мл) добавл ли диазометан 5 в диэтиловом эфире (80 мл). После перемешивани в течение 10 мин растворитель удал ли в вакууме. Остаток вводили в колонку силикагел (Merck 7734, 500 г) и элюировали хлороформом. Получали метиловый эфир 0- 0 метоксиметил-М-(2-нитрофенилтио}-/ -окси- тирозина (трео-изомер: 8,82 г) (зритро-изомер: 6,63 г).

Трео-пармер:

ИК-спектр (пленка): 3500, 2950. 1735 5 Тонкослойна хроматографи : ,31 (Merck art 5715. смесь этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Эритро-параметр:

ИК-спектр (пленка): 3500, 2550, 1735 . 0 Тонкослойна хроматографи : ,40 (Merck art 5715. этилацетат-н-гексан в отношении 1:1).

Получение 5.

К раствору метилового эфира 0-меток- 5 симетил-М-метил-М-(2-нитрофенилтио)- fi- окситирозина (эритро-изомер) (3,85 г) в дихлорметане (30 мл) добавл ли триэтиле- мин (1,38 г), 4-диметиламинопропилемин (0,45 г) и хлористый бензоил (1,52 г). После перемешивани в течение 16 ч при комнат19 182697020

ной температуре к смеси добавл ли 3-диме-К раствору М-бензилоксикарбонил- тилэминопропиламин (3,3 г) и растворительтреонина (3,7 г) и метилового эфира 0-метокудал ли в вакууме. Остаток раствор ли всиметил-М-метил- /2-бензоилокситирозинэ

этилэцетате(30 мл) и промывали разбавлен-(трео-изомер)(3,11 г) в дихлорметане (50 мл)

ной хлористоводородной кислотой, водным5 добавл ли этиловый эфир 1.2 -дигидро-2раствором бикарбоната натри и водой, По-этокси-1-кинолиакарбоновой кислоты (2,9 г),

еле выпаривани остаток помещали в колон-После перемешивани в течение 20 мин при

ку силикагел (Merck 7734, 150 г) икомнатной температуре растворитель удаэлюировали смесью н-гексан-этилацетат вл ли в вакууме. Остаток раствор ли в этилаотношении 5:2 по объему и получали мети-ю цетате (50 мл) и промывали

ловый эфир 0-метосиметил- М-метил-М-(2-дистиллированной хлористоводородной

нитрофенилтио)-/М5ензоилокситирозинакислотой, водным раствором бикарбоната

(эритро-изомер, 4,49 г).натри и водой. После выпаривани остаток

ИК-спектр (пленка): 2950, 1974 см ,вводили в колонку силикагел (Merck 7734,

Тонкослойна хроматографи : ,2315 100 г) и элюировали смесью н-гексан-этила (Merck art 5715, смесь этилацетал-н-гексан вцетат в отношении 1:1 по объему и получали

отношении 1:2).метиловый эфир М-(М-бензилоксикарбоПолучение 6. нил- -треонил)-0-метоксиметил-М-метил-/ Следующее соединение было полученобензоилокситирозина (трео-изомер)(2,04 г).

способом, аналогичным описанному в пол-20 МК-спектр(пленка):3400,2950, 1740(изучении 5:гиб пика), 1720 см.1

метиловый эфир О-метоксиметил-М-метил-Тонкослойна хроматографи : ,36

М-{2-нитрофенилтио)т 3-бензоилокситирозина(Merck art 5715, смесь метанол-хлороформ в

(трео-изомер),отношении 3:97).

точка плавлени 114-111°С.25 Получение 10

ИК-спектр (СНС1з): 2950, 1740см 1.Следующее соединение получали споТонкослойна хроматографи : ,26собом, аналогичным описанному в получе (Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан внии 9:

отношении 1:2).метиловый эфир М-(М-бензилоксикарбоПолучение 730 нил-1 -треонил)-0-метоксиметил-Н-метил-/ К раствору метилового эфира 0-меток-бензоилокситирозина (эритро-изомер).

симетил-М-метил-М-(2-нитрофенилтио)- /3-МК-спектр (пленка): 2950,1740,1730(избензоилокситирозина (4,94 г) вгибпика)см.

дихлорметане (50 мл) добавл ли тиофенолТонкослойна хроматографи : ,23

(4,8 мл) и трифторуксусную кислоту при 0°С35 (Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан в

(2,5 мл). После перемешивани в течение 30отношении 1:2).

мин к смеси добавл ли водный раствор би-Получение 11.

карбоната натри . Органический слой про-Mwp

мывали водным раствором бикарбонатаг п

натри и рассолом. После выпаривани ос-40 МИ (целевое

таток помещали на колонку с силикагелемZ-Thf -N-С-С ОМб соединение 1)

(Merck 7734) (100 г) и элюировали 5%-ным1

метанолом в хлороформе. Получали метило-

вый эфир 0-метоксиметил-М-метил-Д- -бен-К раствору метилового эфира Д-бензозоилокситирозина (трео-изомер 0,32 г).45 илокси-г-НМ-бензилоксикарбонил-1 -треон

ил)-0-метоксиметил-М-метилтирозина (треоТонкослойна хроматографи : ,31изомер) (1,20 г) в толуоле (20 мл) добавл ли

(Merck art 5714, смесь этилацетат-н-гексан в1,8-диазабицикле (5.4.0)-ундецен-7-ен (0,30

отношении 1:1).г), После перемешивани в течение получаса

Получение 850 при комнатной температуре к смеси добавСледующее соединение получали спо-л ли 7%-ную хлористоводородную кислоту

собом, аналогичным описанному в получе-(10 мл). Органический слой промывали вонии 7:дои и водным раствором бикарбоната наметиловый эфир 0-метоксиметил-М-ме-три . После сушки органического сло над

тип-/ - -бензоилокситирозина (эритро-изо-55 сульфатом магни растворитель удал ли в

мер). вакууме и получали целевое соединение I

Тонкослойна хроматографи ,25(0,95 г),

(Merck art 5715, смесь этилацетат-н-гексан вМК-спектр (пленка): 3400, 2930,1720см 1,

отношении 1:1).ra$. 7Jo () метанол).

Получение 9

Целевое соединение I было также получено взаимодействием метилового эфира бензоилокси-М-(М-бензилоксикарбонил-1.- треонил)-0-метоксиметил-М-метилтирозина (эритро-изомер) вместо метилового эфира ft - бензоилокси-М-(М-бензилоксикарбонил-1 - треонил)-О-метоксиметил-М-метилтмрозина (трео-изомер).

Получение 12 Мг

исходное соединение а

imp H ч /

с о

Z-Thr-N-C-C-OMe

Me

Mmp H Sif Y 0 z-|hr-N-C-C-OMe Челевое соединение Me

К раствору исходного соединени а (1,0 г) в М,Г -диметилформамиде(10 мл) добавл ли трет-бутилдиметиллилхлорид {0,75 г) и имидазол (0,34 г). После перемешивани в течение 16 ч при комнатной температуре к смеси добавл ли этилацетат (30 мл) и лед (50 г). Органический слой промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным раствором бикарбоната натри и водой. Растворитель удал ли в вакууме. Остаток вводили в колонку силикагел (Merck 7734, 30 г), элюировали хлороформом и получали целевое соединение I (1,21 г).

ИК-спектр (пленка): 2950, 1720 см

-55,9° (,56, метанол).

Получение 13 ..

Mmp Н .

Si+ C Оа

Ч IIи

Z-Thr-N-C- С-ОМе

Me

-1

М

н

I

Si С О III и

Z-Thr-N-C-C-OH

Me

исходное соединение а

целевое соединение I

К раствору исходного соединени а (0,95 г) добавл ли 1.н. водный раствор гидроокиси натри (4,8 мл). После перемешивани в течение двух дней при 30°С растворитель удал ли в вакууме. Остаток раствор ли в этилацетате (20 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой. После выпаривани получали целевое соединение I (0,81 г).

МК-смектр (пленка): 3300, 2950. 1720, 1700 (изгиб пика) см 1,

а : -82,9° (,0б. метанол), Получение 14

Мщр Н

s;+ Yo

I II II

Z-Thf-N-c- С-Он t- HCI-H-Leu-D-Phe-OTce Me

0 исходное соединение а исходное соединение b Mmp H

Si

N /

С О

5 И И

- Z-Thf-N-C-C-Leu-D-Phe-OTce

Me

целевое соединение I

20 к смеси исходного соединени а (1,60 г) и исходного соединени b (5,50 г) в дихлор- метане (50 мл) добавл ли триэтиламин )1,25 г) и этиловый эфир 1,2-дигидро-2-этокси-1- хинолинкарбоновой кислоты (3,04 г). После

25 перемешивани в течение 15 ч при комнатной температуре белое твердое вещество отфильтровывали и к фильтрату добавл ли исходное соединение b (2,23 г), триэтиламин (0,50 г) и этиловый эфир 1,2-дигидро-2-эток30 си-1-хинолинкарбоновой кислоты (1,24 г). Смесь перемешивали 18 ч и растворитель удал ли в вакууме. Остаток раствор ли в этилацетате (50 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, водным рас35 твором бикарбоната натри и водой. После выпаривани в вакууме остаток помещали в колонку силикагел (Merck 7734, 100 г), элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 2:7 по объему и получали целевое

40 соединение I (0,87 г).

ИК-спектр (пленка): 2950, 1760, 1740 (изгиб пика), 1720, 1660см 1.

-31,5° (.07. метанол). Получение 15

45

MmpN H Si СО Z-Thr-N-C-C-Leu-D-Phe-OTce

меJ

исходное соединение а

Н Mmp с.+ V л StСО

(1 II

Z-Thr-N-C-C-Zeu-D-Phe-OTce

Me

целевое соединение I

Раствор исходного соединени а (0,85 г) в толуоле (100 мл) и ацетоне (10 мл) облучали ультрафиолетовой лампой (100 В) в течение 1,5 ч при 0°С, После выпаривани остаток помещали в колонку силикагел (Merck 77340, 50 г), элюировали смесью н-гексан- этилацетат в отношении 2:1 по объему и получали целевое соединение 1(0,18 г).

Тонкослойна хроматографи : Rf 0,22 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 2:1).

М К-спектр (KB г): 3300, 1740 (изгиб пика), 1640см 1.

Получение 16

Ммр Н

si+ со

IИ

Z-Thv-N-C-C-Leu-D-Phe-OTce

ме|

исходное соединение а Н MmpI

+ V О

Si

7 TU к, Д

Z-Thr -N C-C-2eu-0-phe-OTce Me

целевое соединение {

Исходное соединение а (0,17 г) раствор ли в 67%-ном водном растворе уксусной кислоты (10 мл). После перемешивани в течение 28 ч при 25°С растворитель удал ли в вакууме. Остаток раствор ли в этилацетате (20 мл) и промывали водным раствором бикарбоната натри и водой. После концентрировани остаток промывали н-гексаном и растворитель удал ли в вакууме. Получали целевое соедлинение f (0,15 г).

МК-спектр (КВг): 3250. t740 (изгиба пика ), 1635см 1.

Тонкослойна хроматографи ; Rf 0,18 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 1:1).

Получение 17

н

С О8. t

II И+1

Z-Ttir-N-C-C-Leu-D-Phe-OTc6 Boo Ser

Meai

исходное соединение а исходное сое- Bztдинение b

Boc-Set н xMmp SC 0

„ ,.. I

Z Thr N-C-c-teu-D-Phe-OTCe,

Me целевое соединение I

К раствору исходного соединени а (0,14 г) в дихлорметане (5 мл) добавл ли исходное соединение b (0,10 г), водорастворимый гидрохлорид карбодиимида (65 мг) и 4- диметиламинопиридина (4 мг). Затем после 12-часового перемешивани при комнатной температуре к смеси добавл ли Ы,Г4-диме- тиламинопропиламин (50 мг) и растворитель выпаривали в вакууме. Остаток раствор ли

в этилацетате (20 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой . После выпаривани остаток вводили в колонку силикагел (Merck 7734, 10 г), элюировали смесью н-гексан-этилацетат в отношении 1:1 по объему и получали целевое соединение I (0,16 г).

МК-спектр (КВг): 3300, 1700, 1640, 1495

см

1

Тонкослойна хроматографи : ,38 20 (Merck art 5715, смесь н-гексан-этилацетат в отношении 1:1). Получение 18

Н ,Мтр

Bzl

oc Boc-Ser-i V 0 25-7 Ji «

z -Thr-N- c- C-Leu-D-Phe-OTce

Me

исходное соединение а

Bzl Boc-Asn-SerH

//

-|CO

Z-Thr-N-|i Leu 0 pbe oTce

Me

целевое соединение f Исходное соединение а (145 мг) раствор ли в смеси 4 н. хлористого водорода в

диоксане (3 мл) и анизоле (0,1 мл). После 30-минутного перемешивани при комнатной температуре растворитель удал ли в вакууме . Остаток раствор ли в дихлорметане (3 мл). К раствору добавл ли N-трет-бутоксикарбонил-Ьаспарагин (35 мг), триэтиламин (13 мг), 1-оксибензотриазол (18 мг) и растворимый в воде гидрохлорид карбодиимида (29 мг). После перемешивани в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавл ли 7%-ную хлористоводородную кислоту (5 мл). Органический слой промывали водой. После выпаривани остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5744 и про вл ли 6%-ным метанолом в хлороформе и получали целевое соединение I (1 ТО мг).

МК-спектр (КВг): 3300, 1650, 1505см 1. Тонкослойна хроматографи : Rf 0,44 (Merck art 5715, смесь хлороформ-метанол в отношении 1.0:1).

25182697026

Получение 19мг). После перемешивани в течение 9 ч при

комнатной температуре порошок цинка (30 мг) добавл ли к смеси с интервалами в 1 ч до

исчезновени исходного соединени а. По|Z jQf5 еле фильтрации растворитель удал ли в ваBoc-Asn-Ser-| с Qкууме. Остаток раствор ли в этилацетате (10

z-Thr-N-c-c-Leu-D-Pha-OTceмл пР°мывали водой и выпаривали в вакуу ме . Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Мегек 5744),

исходное соединение а10 про вл ли смесью этилацетат-ацетон-уксусна кислота-вода в отношении 6:3:1:1 по объ ,.-ч-Онему и получали целевое соединение I (43,5

Bzi I н Qмг).

Boc-auo-Thr-Asti-ser-j oИК-спектр (КВг): 3300, 1650, 1505 .

z-rln-N-r г i15 Тонкослойна хроматографи : ,16

nr-N с c-Leu-D-Phe-отсе (Merck art 5715 смесь хлороформ-тетанолeэцетол в отношении 10:1:0,1).

целевое соединение IПолучение 21

Исходное соединение а (105 мг) раство-К раствору фталальдегида (6.7 г) в дихр ли в смеси 4 н. хлористого водорода в 20 лорметане (30 мл) добавл ли этоксикарбо- диоксане (3 мл) и анизоле (0,1 мл). После нилметилентрифенилфосфоран (17,42 г) и перемешивани в течение 0,5 ч при комнат- смесь перемешивали 30 мин при комнатной ной температуре растворитель удал ли а ва- температуре. Растворитель выпаривали и ос- кууме. Остаток раствор ли в дихлорметане таток раствор ли в диэтиловом эфире. После (3 мл). К раствору добавл ли N-трет-бутокси- 25 фильтровани смеси фильтрат выпаривали. карбонил-Ьаллотреонин (22 мг), триэтила- Остаток отгон ли под вакуумом (125°С, 0,6мм мин (9 мг), 1-оксибензотриэзол (12 мг) и рт. ст.) и получали этиловый эфир (Е)-3-{2-фор- растворимый в воде гидрохлорид кэрбодии- милфенил)-акриловой кислоты (6 г). мида (19 мг). После перемешивани в теме-Спектр ЯМР (СДС1з, б): 1,24 (ЗН, т. ,5

ние 8 ч при комнатной температуре к смеси 30 Гц), 4,19 (2Н, кв, ,5 Гц), 6,28(1Н,д, Гц), добавл ли 7%-ную хлористоводородную (1Н, д, Гц), 7,5 (ЗН, м), 6,77 (1Н, м), 8,43 кислоту (5 мл). Органический слой промыва- (1Н, д, Гц). 10.18(1Н,с). ли водой. После выпаривали остаток под-Получение 22

вергали препаративной тонкослойнойК раствору бромистого бутилтрифенилхроматографии (Merck 5744) и про вл ли 35 фосфони (3,2 г) в тетрагидрофуране (50 мл) 6%-ным метанолом в хлороформе и получа- добавл ли трет-бутилат кали (900 мг) в атмос- ли целевое соединение I. фере азота и смесь перемешивали 30 мин при

Тонкослойна хроматографи : ,73 комнатной температуре. К смеси добавл ли (Merck an 5715, смесь хлороформ-метанол в раствор этилового эфира (Е)-3-{2-формилфе- отношении 5:1),40 нил)-акриловой кислоты (30 мл). Смесь переМК-спектр КВг): 3300,1740(плечо), 1650, мешивали 1 ч. После выпаривани 1500см 1.растворител остаток раствор ли в диэтилоПолучение 20вом эфире и промывали рассолом и водой.

онРаствор сушили над сульфатом магни ,

Szi 45 фильтровали и выпаливали. Остаток подверBoc-auo-thr-Asn-ser-i чс отали хроматографии на колонке силикагел

г -Thr-N-c-c-Leu-D-Phe-oTce г)и ЭЛЮИРОВЭЛИ смесью н-гексэн-этиламецетат в отношении 3:1. Фракции, содержащие целевое соединение, выпаривали и исходное соединение а50 получали этиловый эфир (Е)((г)-1-пентенил-фенил -акриловой кислоты (2,00 г).

t й . ;онЯМР-спектр (. б ): 0.38 (ЗН. т.

йпг П1| ru д Т ), 1,34(ЗН,т, ,5Гц), 1.42(2Н,н).2.05(2Н.

BoC-atlO-Thr-Asn-Ser-.С О7 лтгочi с cr- i-ne-/«iii -т

I ц iiм), 4,27 (2Н, нв, ,5 Гц), 5,85 (1Н, дт, и

2-Thr N-C-C-Leu-D-Phe-OH55 11 Гц), 6,39 (1Н, Д, Гц), 6.56 (1Н, Д.

МеГц), 7,3 (ЗН. м}, 7,61 (1Н, м), 7.92 (1Н, д,

Гц).

целевое соединение IПолучение 23

К раствору исходного соединени а (58,5К раствору этилового эфира (E)((z)-1 мг ), в 90%-ном водном растворе уксуснойпентенил)-фенил -акриловой кислоты (2,0 г) в кислогы (1 мл) добавл ли порошок цинкз (30

20%-ном водном метаноле добавл ли гидроокись кали (2,3 г). Смесь перемешивали 2 ч при 60°С, устанавливали рН 1,0 хлористоводородной кислотой и экстрагировали этилацета- том. После просушивани экстрагировали этилзцетатом. После просушивани экстракта над сульфатом магни и фильтрации растворитель-удал ли выпариванием. Остаток раствор ли в смеси гексан-этилзцетат в отношении 4:1. Этот раствор добавл ли к ди- циклогексиламину (1,63 мл) и получали кристаллы . Кристаллы раствор ли в этилацетате и промывали 1 н. серной кислотой. Рэстворсуши- ли над сульфатом магни , фильтровали, выпаливалииполучали (Е)-3-{2-((г)-пентенил)-фенил}-акриловую кислоту (0,92 г).

ИК-спектр(нуйол): 1690, 1680, 1620см 1,

Получение 24

(Е)((г)-1-Пентенил)-фенил)-акрилов- ую кислоту (1,08 г) раствор ли в смеси дих- лорметана (10 мл), хлористого оксалила (0,5 мл) и N.N-диметилформамида (0,05 мл). После перемешивани в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере азота растворитель выпаривали. Остаток раствор ли в нтексане и смеси фильтровали. Фильтрат выпаривали и получали хлористый (E)((z}-1- пентенил)-фенил -пропеонил (1,15 г),

ИК-спектр (чистый): 1750, 1730, 1605, 1585 .

ЯМР-спектр (, б ): 0,88 (ЗН, т, ,5 Гц), 1,45 (2Н. м), 2,06 (2Н,м), 5,95 (1 Н, дт. и 7 Гц),0 6,58 (tH, д,М 1 Гц), 6,66 (1Н, д. Гц), 7,4 (ЗН, м), 7,69(1 Н, м), 8,12 ОН, д, Гц).

Получение 25

Растворитель удал ли в вакууме, остаток раствор ли в этилацетате (10 мл) и промывали разбавленной хлористоводородной кислотой и водой.

После просушивани над сульфатом магни растворитель удал ли в вакууме и остаток раствор ли в трифторуксусной кислоте (1 мл) и анизоле (0,1 мл).

После перемешивани в течение 30 мин при комнатной температуре растворитель удал ли в вакууме. Остаток растворили в N.N-диметилформзмиде (2 мл) и смесь добавл ли к пиридину (40 мл).

После перемешивани в течение 16 ч при комнатной температуре растворитель удал ли в вакууме. Остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5744) и про вл ли смесью хлороформ-метанола в отношении 10:1 и получали целевое соединение I (15,2 мг).

ИК-спектр (КВг), 1963, 1510см 1,

ЯМР-спектр (СДзОД) д : 6,24 (1Н, с),

аЗ&°:+13,0°(,1, метанол). Получение 26

,он

VCr

С оBzt

Z-TVir-N-c-c-Leu-D-Pbe-altO-Thr-Asn-Ser-i

Me

исходное соединение а

он

N

с о

AcOH-H-Thr-N-C-C-Ueu-D-Phu-QUo-Thr-Asn-Set- Ме

тг1 н Boc-auo-Ttm-Asn-sef-i I II и

Z-Thr-N-c- C-Leu-D-phe-OH Me

исходное соединение а

он

с о

Н Н

I

Bzl

Z-Thr-ijj-c- C-Leu-D-Phe-auo-Thr-Asm-Ser -. L..

целевое соединение i

К раствору исходного соединени а (42 мг) в дихлорметане (4 мл) и N.N-диметилфор- мамиде (0,1 мл) добавл ли N-оксисукципи- мид (20,4 мг) и водорастворимый сол нокислый карбодиимид (8,2 мг).

После перемешивани в течение 15 ч при комнатной температуре к смеси добавл ли водорастворимый гидрохлорид карбо- диимида (4 мг) с интервалами 1,5 ч до исчезновени исходного соединени а.

целевое соединение I

Исходное соединение а (22 мг) раствор ли в растворе фтористый водород-пиридин (0,8 мл) и в анизоле (0,2 мл) в наполненном азотом мешке. После перемешивани в те- чение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавл ли несколько кусочков льда и устанавливали рН раствора 8,0 водным раствором бикарбоната натри . Смесь помещали в ионообменную колонку с дианоном НР-20 (10 мл) и промывали водой. Продукт элюировали метанолом и очищали тонкослоеной хроматографией (Merck 5715, смесь хлороформ-метанол-вода в отношении 3:1:0,1 по объему) и получали целевое соеди- некие I (13,0 мг).

ИК-спектр (КВг): 1635, 1510см 1.

ЯМР-спектр (СДзОД б ): 7,05 (1Н. с),

aft0: -90.6°(.1. метанол). Тонкослойна хроматографи : RHX35 (Merck art 5715, смесь хлороформ-метанол- вода и отношении 3:1:0,1)

Получение 27

н

AcOH.H-rbr i Leu-D-phe-aUo Th,A;fi.Se

он

н

С nI R-C1 ° н°е

ц jf соединение Ь

R-Thr-N-c-c-Leu-D-Phe-auo-Thr-Asn-Ser- Ме

целевое соединение

Р-(Е)((7)-1-пентенил)-фенил -пропе- ноил.

К раствору исходного соединени а, (6,0 мг) в дихлорметане (1,5 мл), бис-(диметилои- лил)-цетамиде(30 мкл)и N.N-диметилформа- миде (0,3 мл) добавл ли 0.02 в раствор исходного соединени в (0,4 мл). После перемешивани в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавл ли 4-диметила- миногтиридин(0,1 мг). Исходное соединение добавл ли к смеси с 30-минутными интервалами до исчезновени исходного соединени а. К смеси добавл ли разбавленную хлористоводородную кислоту и органический слой промывали водой. После выпаривани в вакууме остаток подвергали препаративной тонкослойной хроматографии (Merck 5715) и про вл ли смесью хлороформ метанол-вода в отношении 65:25:4 по объему, Получали целевое соединение 1 (0,2 мг).

Это соединение было идентично соединению WS-9326A. полученному в Получении 28.

Получение 28.

Водна посевна среда (160 мл), содержаща растворимый крахмал (1 %), сахарозу 1 %), глюкозу (1 %), хлопковую муку (1 %), пептон (0,5%), соевую муку (0,5%) и карбонат кальци (0,2 %) (рН устанавливали 7,0 посредством 6н. гидроокиси натри ) была налита в каждую из двадцати 500 мл колб, Эрленмейера и стерилизована при 120°С в течение 30 мин.

Петлю культуры Streptomyces violaceoniger N° 9326 на скошенном агаре инокулировали в каждую из сред и выращивали на роторном вибраторе (220 об/мин, дуга качени 5,1 см) при 30°С в течение трех дней. Полученна посевна культура была внесена в 160 л стерильной ферментационной среды, содержащей глицерин (3%), соевую муку (0,5%). порошок сои (1,5%), карбонат кальци (0,2%) и йодистый натрий (Nal) (0,001%) в 200-литровом встр хиваемом бродильном баке из нержавеющей стали . Брожение проводили при 30°С три дн при аэрации 160 л/мин и перемешивании при 200 об/мин. Количество WS-9326A в бродильном бульоне оценивали количест- 5 венно методом высокопроизводительной жидкостной хроматографии с использованием насоса Hitachi модель 6555. Использовали колонку из стали (4,6 мм внутренний диаметр, высота 250 мм), упакованную R0 ODS-S (УМС-упакованна колонка) при скорости тока 1,0 мл/мин.

В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола и воды в отношении 3:2. Пробу дл высокопроизводительной

5 жидкостной хроматографии готовили следующим образом: равный обьем ацетона добавл ли к бульону при энергичном перемешивании и выдерживали 1 ч и затем центрифугировали, 5 мл надосадочного сло

0 иньецировали в инжектор проб Hitachi модель 655.

Выделение и очистка Равное количество ацетона добавл ли к культуральному бульону (150 л) при переме5 шивании. Смесь выдерживали при комнатной температуре 1 ч и затем фильтровали. Фильтрат концентрировали до 80 л при пониженном давлении, устанавливали рН 7,0 хлористоводородной кислотой и затем экс0 трагировали 80 л этилацетата. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении и помещали на колонку силикаге- л (кизельгель 60. 70-230 меш, 3 л). Колонку промывали н-гексеном (10 л), смесью н-гек5 сан-этилацетат в отношении 1:1 (10 л), эти- лацетатом (20 л) vf активное вещество элюировали из колонки ацетоном (6 л). Активные фракции сушили при пониженном давлении и подвергали колоночной хрома0 тографии на силикагеле (кизельгель 60, 70- 230 меш, Merck, 1,2 л). Колонку промывали смесью хлороформ-метанол в отношении 20:1 (5 с) и целевое соединение элюировали раствором хлороформ-метанол в отношении

5 10:1 (6 л). Фракции сушили при пониженном давлении, получали порошок. Порошок раствор ли в небольшом количестве метанола и носили на колонку NS-гел (Nihon Seimitsu, 500 мл). Целевое соединение элю0 ировали смесью метанол-вода в отношении 8:2 (2 л) и концентрировали до 300 мл при пониженном давлении и затем экстрагировали 500 мл этилацетата. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении

5 и получали порошок (5 г). Порошок (5 г) раствор ли в 10 мл метанола (500 мг/мл) и под- вергэли высокопроизводительной жидкостной хроматографии с использованием стальной колонки (20 мм внутренний диаметр, 250 мм длиной), упакованной DОО5-5 (УМС-упакованна колонка) и элюиро- озли смесью метанол-вода в отношении 8:2 при скорости потока 9,9 мл/мин, Полученную таким образом активную фракцию концентрировали при пониженном давлении и затем экстрагировали зтилацетатом. Экстракт концентрировали досуха при пониженном давлении и получали чисто-белый порошок (150 мг) WS-9326A.

Получение 29

К раствору WS-9326A (300 мг) в пиридине (4,5 мл) добавл ли уксусный ангидрид (1,5 мл) и 4-диметиламинопиридин (1 мг) и реакционную смесь оставл ли на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривали досуха и получали масло, которое очищали препаративной тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ-метанол о отношении 10:t).

Полученный продукт растирали с диэти- ловым эфиром и получали триацетил-WS- 9326А (332 мг) в виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства триаце- TH/i-WS-9326A следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)цветна реакци : реакци положительна на сульфат цери , на серную кислоту и на пары иода;

отрицательна : реакци на нигидрин:

3)растворимость: раствор етс в метаноле , диметилсульфоксиде; слабо растворим в хлороформе, диэтиловом эфире; нерастворим е н-гексане:

4)точка плавлени : 141-143°С;

5)удельное вращение: а Ь3-122°(,0, метанол);

6)спектр ультрафиолетового поглощени

тметзнол Амакс

283нм( 132000);

7)молекул рна формула: CeoHy-sNeOie:

8)элементный анализ дл CeoHy NsOiex х2Н20:

Вычислено, %: С 60,09; Н 6,56; N 9,34. Найдено, %: С 60,19; Н 6,42; N 9,27.

9)молекул рный вес: АВ-масс-спектр: m/z 1l63,6(M-tH)+

10)тонкослойна хроматографи :

Про вл ющий растворитель Смесь хлоро- фом-метанол в отношении 10:1 по объему этилаце- тат

Значение Rf

0,50

0,12

)) спект р инфракрасного поглощени ;

vЈfKrc 3350, 3020, 2950, 2920, 2850, 1730, 1650, 1520, 1440, 1350. 1230, 1200, 1160. 1100: 1060: 1040: 910

12)свойства вещества: нейтральное ве- щество;

13)спектр дерного магнитного резонанса на драх 130: (100 МГц, СОС з-СОзОН в отношении 10:1), д:

174,20(с), 173,23 (с), 173,06 (с), 171,32 (с),

171,02 (с), 170,84 (с), 169,79 (с), 169,59 (с).

169,55 (с), 168,52 (с), 167,03 (с), 166,36 (с),

151,02 (с), 140,74 (д), 138,82 (с), 138,74 (с),

137,12 (с), 135,23 (д), 133,75 (с), 131,31 (с),

130,20 (д), 129,96 (д), 129,34 (д), 129,21 (д)х2,

128,56 (д)х2. 127,24 (д), 126,96 (д), 126,74 (д),

123,63 (д), 126,50 (д), 122,10 (д)х2, 121.29 (д),

70,99 (д), 69,22 (д), 63,22 (д), 73,73 (т), 58,13

(д), 56,10 (д), 53,22 (д), 52,66 (д), 52,18 (д),

49,93 (д), 39,75 (т), 39,39 (кв) 39,05 (т), 35,75

(т), 30,65 (г), 24,26 (д), 23.15 (кв), 22,79 (т),

21,42 (кв), 21,21 (кв), 20,99 (кв), 20,83 (кв),

17,05 (кв), 17,05 (кв), 16,18 (кв), 13,82 (кв)

график которого представлен на фиг. 4.

14)спектр дерного магнитного резо- нанса на драх 1Н: (400 МГц, СОС з СОзОН

в отношении 10:1) д:

8,25 (1Н, д, (8 Гц), 8,02 (1Н, д, (8 Гц), 7,88 (1Н,д, Гц), 7,86(1 Н, д, Гц), 7,70 (1Н, д Гц), 7,61 (1Н, д Гц), 7,45 (1Н, д,

Гц), 7,32-7,15 (6Н. м, 7,03 (2Н, д, Гц), 7,00-6,94 (ЗН,м), 6,88-6,79(4Н,м), 6,70 (1Н, с), 6,49 (1Н, д, 1-12 Гц), 5,76 (1Н, дт и 7,5 Гц), 5,54 (1Н, широкий синглет), 5,50-5,45 (2Н, м), 4,93 (1Н, м), 4,75 (1Н, м), 4,65-4,56

(2Н, м). 4.46(1 Н,дд, и 11 Гц), 4,31 (Ж, т, Гц)., 4.22 (1 Н, м), 4,18 (1 Н, дд, и 11 Гц), 3,56 (ЗН, с), 2,90 (1Н, дд, и 16 Гц), 2,85- 2,80 (2Н, м), 2,56 (1Н, дд, и 16 Гц), 2,26 (ЗН.с), 2.00 (ЗН, с). 1,96-1,89 (2Н,м), 1,85 (ЗН,

с), 1,58 (1 Н, м), 1,35 (ЗН, д, Гц), 1,32-1,20 (ЗН, м), 1,07 (ЗН, д, Гц), 0,84(1 Н, м), 0,72 (ЗН, д, 6 Гц), 0,71 (ЗН, т, ,5 Гц), 0,65 (ЗН, д, Гц), график которого представлен на фиг. 5.

Получение 30

К раствору WS-9326A (100 мг) в пиридине (1 мл) добавл ли уксусный ангидрид (0,01 мл) и смесь оставл ли на ночь при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха,

чтобы получить масло, которое очищали препаративной тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ-метанол в отношении 9:1), Полученный продукт растирали с диэти- ловым эфиром и получали моноацетил-WS9326А (55 мг) в виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства моно- ацетил-УУ5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)молекул рна форма: СббНто СЫ:

3)молекул рный вес: FAB-масс- спектр: m/z 1079,4 (М+Н)+;

4)тонкослойна хроматографи :

Стационар- Про вл ю- Значение Rf на фаза щий растворитель

Пластинка Смеет хлоро-0,17

силикагел форм-мета- (Merck artнол в

5715)отношении

10:1 по объему 5) спектр инфракрасного поглощени :

гЈ1кс-3300. 2920, 1730, 1650. 1500. 1360, 1190, 1170, 910

6} свойства вещества: нейтральное вещество;

7) спектр дерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц, СОС1з СОзОН в отношении 5:1): график которого представлен на фиг. 6.

Получение 31

К раствору WS-9326A (100 мг) в пиридине (1 мл) добавл ли уксусный ангидрид (0,03 ммл) и смесь оставл ли на ночь при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха и получали масло, которое очищали тонкослойной хроматографией (смесь хлороформ: метанол в отношение 9:1), что давало 72 мл диаметил WS-9326A в виде бесцветного порошка . Физические и химические свойства диацетил- Л/5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)молекул рна формула: CseHTaNeOis;

3)молекул рный вес: FAB-масс-спектр: m/z 1121.4(М+Н)+;

4)тонкослойна хроматографи :

Стационар- Про вл ю- Значение Rf на фаза щий раство-0,35

Пластинкаритель

силикагел Смесь хлоро- (Merek art форм-мета- 5715)нол в

отношении 10:1 по объему

5)спектр инфракрасного поглощени :

. 3020, 2950, 1730, 1650, 1520,1500, 1360,1200, 1170, 1100, 1040,569, 910см 1.

6)свойства вещества: нейтральное вещество;

7)спектр дерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц, CDCI.rCDsOD в отношении 5:1): график которого представлен на фиг. 7.

П ри м е р 1. WS-9326A(100 мг) раствор ли в метаноле (2 мл) и раствор гидрогени- зировали над палладиевой чернью (25 мг) под давлением водорода в 1 атмосферу при

5 комнатной температуре в течение 4 ч. Смесь фильтровали и фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Образовавшийс продукт растирали с диэтиловым эфиром и получали тетрэгидро- Л/5-9326В (92 мг) в

0 виде бесцветного порошка. Физические и химические свойства тетрэгидро- Л/5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)спектр ультрафиолетового поглоще- 5 ни ;

ДЙ1«НОЛ 287 нм (е 13000); . 3) молекул рна формула: C54H72N80i3: 4) молекул рный вес: FAB-масс-спектр: m/z 1041,6(М+Н)+;

0 5) спектр дерного магнитного резонанса на 13С(100 МГц, СОзОО), график которого представлен на фиг. 8;

6) спектр дерного магнитного резонанса на 1Н (400 МГц. СОзОО), график которого 5 представлен на фиг. 9.

П р и м е р 2. Триацегил- Л/5-932бА (100 мг) раствор ли в метаноле (3 мл) и раствор гидрогенизировали над палладиевой чернью (35 мг) под давлением водорода в 1 0 атмосферу при комнатной температуре в течение 3 ч.

Смесь фильтровали и фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Остаток растирали с диэтиловым эфиром и 5 получали тетрагидротриацетил-УУ5-9326А.

Физические и химические свойства тет- рагидротриацетил-У /5-9326А следующие:

1)форма и цвет: бесцветный порошок;

2)спектр ультрафиолетового поглоще- 0 ни :

/ISIS1 1 280 нм ( е 13000):

3)молекул рна формула: СеоНтвМеОш;

4)элементный анализ дл CeoHyeNgOie

Вычислено, %: С 60.80; Н 6,80; N 9,45. Найдено, %: С 61,08; Н 6,70; N 9.41.

5)молекул рный вес: FAB-масс-спектр: m/z 1167,6 (M+Hf;

Q б) спектр дерного магнитного резонанса на драх 13С (100 МГц, СОС1з) б :

173,3 (с), 129,23 (д), 172.96 (с), 128,95 (д)х2, 172,90 (с). 129.61 (д)х2, 172.81 (с), 170.87 (с). 170.56 (с), 170,50 (с), 169,46 (с).

5 169,16 (с). 168,48 (с), 167,99 (с), 165,52 (с), 150,70 (с), 140,84 (с), 138,93 (с), 138,58 (с)„ 136.83 (с), 131,04 (с), 129,71 (д)х2, 128,61 (д)х2, 128,52 (д), Т26,80(д). 126,70 (д), 126,01 (д), 125,85 (д), 121.87 (д)х2х2, 70.49 (д). 69,10 (д), 63,32 (т), 58.28 (д). 56,19 (д). 52,63 (д), 52.07 (д). 51,63 (д), 49,23 (д), 39,30 (т), 39,17 (кв),

38,31 (т), 36,52 (т), 35,33 (т), 32,60 (т), 31,77 (т), 30,74 (т), 27,66 (т), 24,08 (д), 22,82 (кв), 22,50 (т), 21,46 (кв), 20,74 (кв) 20,63 (мв), 16,77 (кв), 16,77 (кв), 16,22 (кв), 13,97 (кв).

7) спектр дерного магнитного резонанса на драх 1Н (400 МГц, СООз), 5:

8,18 (1Н, д, Гц), 7,66 (1Н, д. Гц), 7,65 (1 Н, д. (8 Гц), 7,29 (2Н, д. Гц), 7,22 (Ж, д, (8 Гц), 7,15-7,02 (12Н, м), 6,96 (1Н, д, Гц), 6,67 (1Н, с), 6,21 (1Н, широкий синг- лет), 5,51 (1 Н, широкий синглет), 5,43 (1 Н, м), 5,38 (1Н, широкий дублет, Гц), 4-85-4,75 (2Н, м), 4,66-4,58 (2Н. м), 4,40 (1Н, дд, и 6 Гц), 4,34 (1Н, м), 4,23 (1Н, дд, и 9 Гц), 4,07 1Н, м), 3,53 (ЗН, с). 3,04-2,84 (5Н, м), 2,75-2,50 (4Н, м), 2,46 (1Н, дд, и 5 Гц), 2,28 (ЗН, с), 1,99(ЗН,с). 1,85 (ЗН, с), 1,661,50 (ЗН, м). 1,37-1,27 (4Н,м), 1,27(ЗН, д, N7 Гц), 1,19(1Н, м), 1,08(ЗН, д, 7 Гц), 0,88 (1Н, м), 0,86 (ЗН, т. Гц), OJ2 (ЗН, д, Гц), 0,65 (ЗН,д, Гц).

Из анализа указанные выше физических и химических свойств и в результате дальнейших исследований по идентификации химической структуры химические структуры триацетил-У /3-9326А. моноацетил- и ди- ацетил- Л/5-9326В, тетрагидро- /УЗ-9326А и тетрагидротриэцетил- Л/3-9326А были идентифицированы следующим образом:

Триацетил- Л/3-9326А:

н Чс АсАс

R-Thr-N-C-c.-Leu-D-Phe-ailo-Thp-ASh-5e.r-, I MeI

Р-(Е}-3- 2-((7)-1-пентенил)фенил пропе 35

поил

моноацет - Л/3-9326А:

Hs0

С О R-Thr-N-C-C-be.u-D-Phe-aUo-Thr-Asr -Ser-.

. Ра. . ,

кчьШ

{Ь,КН2-((2)-1-пентенил}-фенил}-пропеноил

диацетип- Л/5-9326А

с-о.

1 И1

R-Tbr-N-C-C-Uu-D-Php alia T r-Asn-S«r-

. 1

R-lt/-j-t -uz;-1 -пёнтенил фенил}-пропе оил

тетрагидро-У /5-9326А

Он

0

С О

K-Tlr-Ы-О- C-Uu-D olio Ihr sn Ser, L ... .j

a

снгг.нг c-сн7сн2сн7сн7снч

(2-пентилфенил)-пропаноил тетрагидротриацетил 5-9326А

O-AC н 0

и иAc

R-Thr-N-c-c-Leu-0-Phe-auo-Thr-Asn-Ser-n | Hej

(2-пентилфенил)-пропаноил

П p и м е p 3. Следующие соединени

были получены в соответствии с методикой

примеров 1 и 2.

15

VJDОАС

R-Tht-N-c- C-Uu D-Phe-QUo-Thr-Asn-Ser-,

(2-пентилфенил)-пропаноил} TCX: ,17 Merck art 5715, CHCb- MeOH(10:1)J

ИК(Нуйол): 3300, 1760, 1730, 1650, 1530,

-1

1510, 1200, 1160, 1070,910см

н jCTaAc

s и Ялс

«-Thr-N-c-C-Leu-D-Phe-atto-Thr-ABn-Ser1 Me

L

3-(2-пентилфенил)-пропаноил

TCX: ,36 Merck 5715, CHCI3MeOH (10:1)j

ИК(нуйол): 3300, 1760, 1740, 1650, 1540,

1510. 1300, 1220, 1200, 1170, 1050,920см 1 HV

а,н

с о

-Thr-tvi-c-C-Leu-D-Phe-aUo-Thr-ABn-Ser-, L 14

Р-3-(2-пентилфенил)-пропаноил 1Н-спектр ЯМР )269,65, МГц, СОзОО), д: 9,26,9,22,8,77.8,74,8,69,8,64,8,61,8,07, 8,04, 7,36, 7,33, 7,31, 7,30, 7,27, 7.26, 7,24, 7,21, 7,18, 7,16, 7,07, 7,06, 7,04, 7,03, 6,96, 6,82. 6,79, 5,05, 5,03, 4,96, 4,82, 4,81, 4,62, 4,58, 4,49, 4,24, 4,20. 3,95, 3,93, 3,91, 3,89, 3,73. 3,61, 3,56, 3,32, 3,31, 3,30, 3,07, 2,99, 2,94, 2,88, 2,87, 2,79, 2,73, 2,68, 2,64, 2,63. 1,36, 1.36, 1,33, 1.31, 3,23, 0,65, 0.61,

1,94, 1,57, 1,38,

1.21. 0,97, 0,94, 0,92, 0,74, 0.67,

0,58.

Claims

Формула изобретени Способ получени производных пепти- ДО8 WS-9326A общей формулы IOR

Ф

СН ОРГЦ

1II III,

R-Thr-N-C-C-beu-OPhe-dllo-Thr-Asn-Ser,

L.i j

где R эр (низший) алканоил с Cs-злкилом в ортоположении;

R 2 - водород или низший алканоил, отличающийс тем, что соединение общей формулы OR

НС О У И

RcL-Thr-N-C-c-Leu-DPhe-Qllo-Thr-ASh-Ser

сн

Культуральные характеристики штамма 9326

Среда

Агар с солодово-дрожжевым экстрактом

Агар из овс ной муки

Агар из крохмала и неорганических солей

Аспарагино-глицериновый агар

Агар на железе с лептонно-дрожжевым экстрактом

Тирозиновый агар

Глюкозо-аспарагиновый

где R а - ар (низший) алкеноил с Cs-алкени- лем в ортоположении;

о

R 2 - имеет указанные значени . подвергают реакции восстановлени .

Таблица 1

Культуральные характеристики

G: хороший

А: обильный, коричневато-серый (6Е2)

R: темно-коричневый (7F6)

S: отсутствует

G: хороший

А: умеренный, темно-коричневый (7ЕЗ)

R: кочичневато-серый (7F2)

S: отсутствует

G: хороший

А: обильный, коричневатый серый (7Е2)

R: желтовато-коричневый (5Е6)

S: отсутствует

G: хороший

: обильный, коричневато-фиолетовый (19ЕЗ)

R: коричневый (6Е4)

S: отсутствует

G: хороший

А: тонкий, серовато-белый (IBt)

R: желтовато-коричневый (5D6)

S: отсутствует

G: хороший

А: обильный, коричневато-серый (9Е2)

R: коричневый до черного (6Е5)

S: отсутствует

G: хороший

А: умеренный, голубовато-серый

R: коричневый (6F4)

S: отсутствует

Среда

Питательный агар

Агар Беннетэ

Сахарозо-нитратный агар

Примечание: G-рост: А-воздушный мицелий; R-цвет обратоной стороны; S- растворимый пигмент.

Физиологические свойства штамма N° 9326

Услови

Температурный интервал дл роста, °С Оптимальный интервал температур дл роста , °С

Разжижение желатина Свертывание молока Пентонизаци молока

Гидролиз крахмала

Продуцирование меланоидного пигмента Разложение целлюлозы

Усвоение углерода штаммом № 9326

Примечание + означает усвоение

Прололжение табл. 1

Культуральные характеристики

G: умеренный

: умеренный, коричневато-серый (9Е2) серовато-коричневый (5ЕЗ) до желтовато- коричневого (5F4) S: отсутствует

G: слабый

незначительный, темно-коричневый (6F4)

R: темно-кочичневый (6F4)

S: отсутствует

G:слабый А: отсутствует

R: серовато-кочичневый (6ЕЗ) S: отсутствует

Таблица 2

Характеристика

11-47

29-31

Положительно Отрицательно Положительно Положительно Отрицательно Отрицательно

Таблица 3

Таблиц 4

Вли ние тетрагидро- Л/5-9326А или октапептида на специфическое св зывание вещества Р с мембраной легких морской свинки

Таблица 7

Ингибирование вызванного нейрокинином сужени бронхов путем внутрибронхиального

введени тетрагидро- Л/5-9326А

Тетрагидро- Л/5-9326А раствор ли в диметилсульфонсиде. 1 наномоль на 1 кг внутривенно.

г. 3 it 5В7 8 9 Ю 11 ft 13 Я15

woo зооо гаоа ш то та fzoo 1000 sou BOO

Фиг/

Таблица 5

Таблица б

С Cl OZ О Ok OS 04 С 00 05 ОС СИ C;t Dtl OVI OSt 091 Oil Cbi

о r- o

to

&

o-Vo - ч.,ц ikYnd : u ni; d:rauo

и ft

Г : . j. /5УИ niwl;r::iai Ji taucT jfii: H N

3

IiU. cneiTp oaou- e.r.lv S -Л ь CjICi-C; v f-)

t

г

OA69Z81

л

г

ГҐ1

о г- от

(О CV

00

С-54 50 .S45454IT I iOSS3

гм

ТТТТГ

oi ог at о os a о ое оь oot f о: °« ° 051 091 DEI оы

О Го

(О

см со

-C% в ОЛЗг- 5 -OvIl iU4Ji9i Jiifaiia ii ii- Up

t Ъч

«с

-$

15мни

15мин 15мм

№

2мин

гмин

t агонист {нейрокинш А ми хегрсеицим

f; антогонист (mesnpazi/dpo- Wf -ffSlffA) фиг

15/м/н 15мм 15мин fS/w#