HU204853B - Process for producing peptide derivatives - Google Patents

Description

A találmány tárgya gyógyászati hatással rendelkező új peptidszármazékok, illetve gyógyászatilag alkalmazható sóik.

Közelebbről, a találmány tárgya P-anyag antagonista, neurokinin A (K-anyag) antagonista és hasonló aktivitással rendelkező, új peptidszármazékok és gyógyászatiig alkalmazható sóik.

A találmány tárgya továbbá eljárás P-anyag antagonista, neurokin A (K-szubsztancia) antagonista és hasonló aktivitással rendelkező új peptidszármazékok, illetve gyógyászati szempontból alkalmazható sóik előállítására.

A találmány szerinti peptidszármazékok, illetve gyógyászatiig alkalmazható sóik felhasználhatók asztma és hasonló betegségekkezelésére.

Az EP0101929A1 számú nyilvánosságra hozatali irat az Ai-GIn-A₂-Phe-A₃-NHCH(Y)-COOC(CH₃)₃ általános képletű polipeptideket vagy sóikat ismerteti, ahol Y (CH₃)₃-COOC-(CH2)_n-csoport, Ai arginin, lizin vagy az N-terminálison arginint vagy lizint tartalmazó di- vagy tripeptíd, A₃ egy semleges aminosav vagy aromás aminosav, ahol mindegyik aminosav L vagy D formájú lehet; és η 0,1 vagy 2. E vegyületek P-antagonisták.

A találmány szerinti peptidszármazékok az © álta- 1 lános képlettel jellemezhetők, ahol R¹ hidrogénatom, fenilcsoporttal szubsztituált 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, (1-7 szénatomosjalkanoilcsoport, 15-20 szénatomos alkanoilcsoport, benzoilcsoport, tienil-(l-7 szénato- í mos)alkanoil-csoport, fenil-(l-7 szénatomos)alkanoil-csoport - ahol a fenilcsoport 1-8 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált vagy fenil-(3-7 szénatomos)alkenoil-csoport ahol a fenilcsoport 2-8 szénatomos alkenilcso- 2 porttal szubsztituált;

R² hidroxicsoport és

R³ karboxi- vagy 1-7 szénatomos alkoxi-karbonilcsoport; vagy

R² és R³ együttesen-0-C(0)-csoportot alkot, 4

R⁴ hidroxi-, fenil-(l-4 szénatomos)alkoxi- vagy 1-7 szénatomos alkanoil-oxi-csoport;

R⁵ hidroxi-, fenil-(l-4 szénatomosjalkoxi- vagy 1-7 szénatomos alkanoil-oxi-csoport;

R⁶ hidroxi-, 1-6 szénatomos alkoxi-, fenil-(l-4 szén- 4í atomos)alkoxi- vagy 1-7 szénatomos alkanoiloxi-csoport; és

----egyes vagy kettős kötés.

A találmány szerint az © általános képletű új peptidszármazékok különböző módon állíthatók elő (12- 5(

20. ábra).

Az ábrákon szereplő képletekben R¹, R², R³, R⁴, R⁵,

R^á és — - jelentése azonos a fent megadottakkal;

R¹’ azonos R¹ jelentésével, azonban hidrogénatomtól eltérő; 55

Ra jelentése 1-4 szénatomos alkanoil-oxi-csoport;

Rl jelentése 1-7 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport;

Rl a fenilcsoporton 2-8 szénatomos alkenilcsoporttal szubsztituált feniI-(3-7 szénatomos)alkenoil-csoport, és θθ

Rl a fenilcsoporton 2-8 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált feniI-(3-7 szénatomos)alkanoil-csoport.

A (H) és (ΠΙ) általános képletű kiindulási anyagok 5 újak és a 10. és 11. ábrán bemutatott reakciófolyamatok szerint állíthatók elő. Az ábrákon szereplő képletekben R¹, R³, R^s, R⁶ és - - - - jelentése azonos a fentebb tett meghatározásokkal;

R⁷ jelentése védett karboxilcsoport;

R⁸ jelentése védett aminocsoport;

R⁹ jelentése védett aminocsoport;

R^!0 jelentése védett aminocsoport;

R^u jelentése védett karboxilcsoport;

R¹² jelentése védett aminocsoport;

R¹³ jelentése védett aminocsoport, és R¹⁴ jelentése védett aminocsoport.

Az ábrákon bemutatott eljárásokat az alábbiakban részletezzük:

12. ábra reakcíófolyamata

Az (la) általános képletű vegyűlet vagy sója előállítható a (© általános képletű vegyűlet vagy sójának gyűrűvé zárásával.

Ezt a reakciót a ciklikus peptidek szintézisénél szoká5 sós módszerek szerint végezzük, például kevert savanhidrides, aktív észteres, karbodiimides eljárással, stb.

A reakciót általában a szokásos oldószerben végezzük, tehát alkoholban, tetrahidrofuránban, etil-acetátban, Ν,Ν-dimetil-formamidban, diklór-metánban, klo) reformban, vagy bármilyen olyan oldószerben, mely kedvezőtlenül nem befolyásolja a reakciót.

A reakcióhőmérséklet nem döntő, végezhetjük hűtés mellett vagy melegítéssel is.

i 13. ábra reakciófolyamata

Az (la) általános képletű vegyületet vagy sóját a (ΠΙ) általános képletű vegyűlet vagy sójának gyűrűvé zárásával állítjuk elő.

A reakciót a ciklikus peptidek szintézisénél szokásos módszerek szerint végezzük, például kevert savanhidrides, aktív észteres, karbodiimides eljárással, stb.

A reakciót általában a szokásos oldószerben végezzük, tehát alkoholban, tetrahidrofuránban, etil-acetátban, Ν,Ν-dimetil-fonnamidban, diklór-metánban, kloroformban vagy bármilyen olyan oldószerben, mely kedvezőtlenül nem befolyásolja a reakciót.

Areakciőhőmérséklet nem döntő, végezhetjük hűtés mellett vagy melegítéssel is.

14. ábra reakciófolyamata

Az (Te) általános képletű vegyületet vagy sóját előállíthatjuk az (Ib) vegyűlet vagy sójának dezacilezésével. Erre alkalmas reakciók a hidrolízis, redukció stb.

A hidrolízist előnyösen egy bázis vagy sav - beleértve a Lewis-savakat is - jelenlétében végezzük.

Alkalmas szervetlen, illetve szerves bázis például egy alkálifém (nátrium, kálium stb.), alkálifőldfém (magnézium, kalcium stb.), ezek hidroxidja, karbonátja vagy hidrogén-karbonátja, trialkil-amin (trimetil-amin, trietil-amin stb.), pikolin, l,5-diaza-biciklo[4.3.0]non2

HU 204 853 Β

5-én, l,4-diaza-bÍciklo[2.2.2]oktán, 1,8-diaza-biciklo[5.4.0]undec-7-én stb.

Alkalmas szerves, illetve szervetlen savak például a hangyasav, ecetsav, propionsav, triklór-ecetsav, trifluor-ecetsav, illetve a sósav, bróm-hidrogénsav, kénsav, hidrogén-klorid, hidrogén-bromid stb. A hidrolízishez használt Lewis-savakat - például trihalogén-ecetsavakat: triklór-ecetsav, trifluor-ecetsav stb. - előnyösen kationmegkötő reagensek jelenlétében alkalmazhatjuk (például anizol, fenol stb.).

A reakcióhoz használt oldószer rendszerint víz, alkohol (metanol, etanol stb.), metilén-klorid, tetrahidrofurán vagy ezek elegye vagy bármilyen olyan oldószer, ami kedvezőtlenül nem befolyásolja a reakciót. A cseppfolyós bázis vagy sav önmagában alkalmazható oldószerként is. A reakcióhőmérséklet nem döntő, alkalmazhatunk hűtést vagy melegítést is.

A redukciót a szokásos módon kémiai redukcióval vagy katalitikus úton végezzük.

A kémiai redukció alkalmas reakciókeveréke fémeket (ón, cink, vas stb.) vagy fémvegyületeket (például króm-klorid, króm-acetát stb.) és szervetlen vagy szerves savakat (például hangyasav, ecetsav, propionsav, trifluor-ecetsav, p-toluolszulfonsav, sósav, bróm-hidrogénsav stb.) tartalmaz.

A katalitikus redukcióhoz a szokásosan használt katalizátorokat alkalmazhatjuk, például platina (platinalemez, platinaszivacs, platinakorom, kolloidális platina, platina-oxid, platinaszál stb.), palládium (palládiumszivacs, palládiumkorom, palládium-oxid, palládium szénen, kolloidális palládium, palládium bárium-szulfáton, palládium bárium-karbonáton stb.), nikkel (például redukált nikkel, nikkel-oxid, Raney-nikkel stb.), kobalt (például redukált kobalt, Raney kobalt stb.), vas (például redukált vas, Raney-vas stb.), rézkatalizátorokat (például réz, Raney-réz, Ullman-réz stb.) és hasonlókat. A redukciót olyan szokásosan használt oldószerben hajtjuk végre, ami a reakciót kedvezőtlenül nem befolyásolja, ilyen lehet a víz, metanol, etanol, propanol, Ν,Ν-dimetil-formamid, tetrahidrofurán vagy ezek keveréke. Amennyiben a kémiai redukciónál a fent említett savak folyékonyak, úgy ezek maguk is lehetnek egyúttal oldószerek.

A reakció hőmérséklete nem döntő, végrehajthatjuk hútés vagy melegítés mellett is.

15. ábra reakciófolyamata

Az (Ib) általános képletű vegyületet vagy sóját úgy állítjuk elő, hogy az (Ic) általános képletű vegyületet, vagy az aminocsoportján képzett reaktív származékát vagy sóját acilezzük.

Ilyen, az aminocsoporton képzett reaktív származék lehet például a Schiff-bázis típusú imino vagy annak tautomer enamin típusú izomerje, melyet úgy állítunk elő, hogy az (Ic) általános képletű vegyületet egy karbonilvegyülettel, például aldehiddel, ketonnal vagy hasonlóval reagáltatjuk. A szililszármazékokat úgy állíthatjuk elő, hogy az (Ic) általános képletű vegyületet egy szililvegyülettel, például bisz(trimetil-szilil)-acetamiddal, mono(trimetil-szilil)-acetamiddal, bÍsz(trimetil-szilil)-karbamiddal stb. reagáltatjuk. Képezhetünk származékokat az (Ic) általános képletű vegyületnek foszfor-trikloriddal vagy foszgénnel való reagáltatásával is.

Az acilezéshez a szokásosan használt acilezőszereket használjuk, melyeket az 2?í-OH (XTV) általános képlettel írhatunk le (R^la jelentését lásd fentebb), de használhatjuk ezek reaktív származékait vagy sóit is.

A (XIV) vegyület alkalmas reaktív származéka a savhalogenid, savanhidrid, aktív amid, aktív észter stb.

Alkalmas acilezőszerre példaként említhetjük a savkloridokat, savazidokat, kevert savanhidrideket melyekben szubsztituált foszforsav (például dialkilfoszforsav, fenil-foszforsav, difenil-foszforsav, dibenzil-foszforsav, halogénezett-foszforsav stb.) dialkilfoszforossav, kénessav, tio-kénsav, kénsav, szulfonsav (például metánszulfonsav stb.), alkil-karbonsav, alifás karbonsav (például pivalinsav, pentánsav, izopentánsav, 2-etil-vajsav vagy triklór ecetsav stb.) szerepel szimmetrikus savanhidrideket, imidazollal, 4-es helyen szubsztituált imidazollal, dimetil-pirazollal, triazollal vagy tetrazollal képzett aktív amidokat, aktív észtereket (például ciano-metil-, metoxi-metil-, dimetil-imino-metil-[(CH₃)2N⁺«CH-], vinil-, propargil-, p-nitrofenil-, 2,4-dinitro-fenil-, triklór-fenil-, pentaklór-fenil-, mezil-fenil-, fenil-azo-fenil-, fenil-tio-, p-nitro-feniltio-, ρ-krezil-tio-, karboxi-metil-tio-, piranil-, piridil-, piperidil-, 8-kinolil-tio-észter stb.), vagy az N-hidroxivegyületekkel (például Ν,Ν-dimetil-hidroxil-amin, 1hidroxi-2-(lH)-piridon, N-hidroxi-szukcinimid, N-hidroxi-ftálimid, l-hidroxi-6-klór-lH-benzotiazol stb.) képzett észtereket stb. A fentiekből tehát kiválaszthatjuk az alkalmazandó (XIV) vegyületnek megfelelő származékot

A reakciót valamilyen általánosan használt oldószerben végezzük, például alkoholban (metanol, etanol stb.), acetonban, dioxánban, acetonitrilben, metilénkloridban, etilén-kloridban, tetrahidrofuránban, N,Ndimetil-formamidban, piridinben vagy más olyan oldószerben, mely a reakciót kedvezőtlenül nem befolyásolja. Ezeket az oldószereket használhatjuk vizes elegyként is.

Amikor a (XIV) vegyületet szabad savként vagy sójaként alkalmazzuk, előnyös a reakciót egy kondenzálószerjelenlétében végezni. Ilyenek az Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimid, N-ciklohexil-N’-morfolino-etil-karbodiimid, N-ciklohexiI-N’-(4-dietil-amino-ciklohexil)karbodiimid, Ν,Ν-dietil-karbodiimid, N,N’-diizopropil-karbodiimid, N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)karbodiimid, N,N-karbonil-bisz(2-metil-imidazol), pentametilén-ketén-N-ciklohexil-imin, difenil-keténN-ciklohexil-imin, etoxi-acetilén, 1-lakoxi-l·klór-etilén, trialkil-foszfit, etil-polifoszfát, izopropil-polifoszfát, foszfor-oxi-klorid (foszforil-klorid), foszfor-triklorid, tionil-klorid, oxalil-klorid, trifenil-foszfin, 2-etil-7hidroxi-benzizoxazolium-só, 2-etil-5-(m-szulfo-fenil)izoxazolium-hidroxid belső só, l-(p-klór-benzolszulfonil-oxi)-6-klór-lH-benzotriazol, az ún. Vilsmeier-reagens, amit úgy állítunk elő, hogy Ν,Ν-dimetil-formamidot tionil-kloriddal, foszgénnel, triklór-metil-klórformiáttal vagy foszfor-oxi-kloriddal stb. reagáltatunk.

HU 204853 Β

A reakciót elvégezhetjük szervetlen vagy szerves bázisok - például alkálifém-hidrogén-karbonát, alacsony szénatomszámú trialkil-amin, piridin, N-(aIacsony szénatomszámú)alkil-morfolin, NJ4-di(alacsony szénatomszámú)alkil-benzil-amin stb. - jelenlétében is.

A reakciőhőmérséklet nem döntő, végezhetjük a reakciót hűtés vagy melegítés mellett is.

16. ábra reakciófolyamata

Az (le) általános képletű vegyületet vagy sóját az (Id) vegyület vagy sójának aciiezésével állíthatjuk elő.

Ezt a reakciót a 2., 4., 5., 7., 8., 17. és 18. példával szemléltetjük.

17. ábra reakciófolyamata

Az (If) általános képletil vegyületet vagy sóját az (la) vegyület vagy sójának hidrolízisével állíthatjuk elő.

A hidrolízist úgy végezzük, mint azt már a 3. reak- 1 ciófolyamatnál a fentiekben leírtuk.

18. ábra reakciófolyamata

Az (lg) általános képletű vegyületet vagy sóját az (If) vegyület vagy sójának észterezésével állíthatjuk 2 elő. Az észterezéshez a szokásos reagenseket használjuk, tehát valamilyen alkoholt vagy aktív származékát (például halogenidet, szulfonátot, szulfátot, diazovegyületetstb.).

A reakciót a szokásos oldószerek valamelyikében 3 hajtjuk végre, tehát acetonban, dioxánban, alkoholban, metilén-kloridban, etilén-kloridban, n-hexánban, tetrahidrofuránban, etil-acetátban, NJí-dimetil-fonnamidban, vagy más olyan oldószerben, ami hátrányosan nem befolyásolja a reakciót. 3

A reakcióhőmérséklet nem döntő, végezhetjük a reakciót hűtés és melegítés mellett is.

19. ábra reakciófolyamata

Az (Ii) általános képletű vegyületet vagy sóját az 41 (Ih) vegyület vagy sója redukciójával állíthatjuk elő.

A redukciót végezhetjük katalitikus úton. Ehhez a szokásosan használt katalizátorokat alkalmazhatjuk, például platina (platinahuzal, platinaszivacs, platinakorom, kolloidális platina, platina-oxid, platinalemez 4£ stb.), palládium (palládiumszivacs, palládiumkorom, palládium-oxid, palládium szénen, kolloidális palládium, palládium bárium-szulfáton, palládium báriumkarbonáton stb.), nikkel (redukált nikkel, nikkel-oxid, Raney-nikkel stb.), kobalt (redukált kobalt, Raney-ko- 50 balt stb.), vas (redukált vas, Raney-vas stb.), réz (redukált réz, Raney-réz, Ullman-réz stb.) és más katalizátorokat.

A reakciót a szokásos oldószerekben végezzük, acetonban, dioxánban, alkoholban, tetrahidrofuránban, 55 etil-acetátban, N^í-dimetil-foimamidban, dimetil-szulfoxidban vagy más olyan oldószerben, ami a reakciót kedvezőtlenül nem befolyásolja.

A reakciőhőmérséklet nem döntő, végezhetjük a reakciót hűtés és melegítés mellett is. 60

20. ábra reakciófolyamata

Az (Ij) általános képletű vegyületet vagy sóját az (Id) vegyület vagy sójának alkilezésével állítjuk elő.

Ezt a reakciót a 19. példával szemléltetjük.

21. ábra reakciófolyamata

A (Π) általános képletű vegyületet vagy sóját a (TV) vegyületből vagy sójából állítjuk elő a 21. ábrán megadott reakciólépések során. Valamennyi reakciólépés általánosan használt a peptidszintézisnél. A (IV) általános képletű kiindulási anyag, vagy sójának előállítását a példáknál részletezzük.

22. ábra reakciófolyamata

A (ΙΠ) általános képletű vegyületet vagy sóját a (IX) vegyületből vagy sójából állítjuk elő, az ábrán bemutatott reakciólépéseket követve. Valamennyi reakciólépés általánosan használt a peptidszintéziseknél. A (IX) általános képletű kiindulási anyag vagy sójának előállí3 tását a későbbiekben ismertetjük.

A WS-9326A és WS-9326B peptidszármazékokat mikrobiológiai fermentációval állítjuk elő, az említett anyagokat termelő Streptomyces-ek, például a Streptomyces violaceoniger No.9326 törzs tenyésztésével.

> A felhasznált Streptomyces-ek WS-9326A és/vagy WS-9326B peptidszármazékokat termelnek. Ilyen a Streptomyces violaceoniger 9326, amit újabban izoláltak a japán Suwa városból (Nagano prefektura) származó talajmintákból.

¹ A Streptomyces violaceoniger 9326 törzset liofilizált állapotban helyezték el FERM BP-1667 letéti szám alatt az alábbi intézménynél: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japán; a letétbehelyezés ideje: 1988. január 20.).

Nyilvánvaló, hogy a WS-9326A és a WS-9326B anyagok előállítása nem korlátozódik csupán az itt ismertetett mikroorganizmusokkal történő előállításra, ezt csak szemléltető célzattal mutatjuk be. A találmány kiterjed valamennyi olyan mutánsra is, mellyel WS9326A vagy WS-9326B anyagokat állíthatunk elő, akár természetes, akár mesterségesen előállított - például Röntgen besugárzással, ultraibolyafény-besugárzással, N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidines kezeléssel, 2amino-purinos kezeléssel stb. - mutánsról van szó.

A Streptomyces violaceoniger 9326 törzs az alábbi alaktani, tenyészeti, biológiai és fiziológiai tulajdonságokkal rendelkezik:

Alaktani leírása - a rendszertani vizsgálatokhoz Shirling és Gottlieb JMethods fór characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology, 16: 313-340 (1966)] eljárásait használtuk.

Az alaktani megfigyeléseket fény- és elektronmikroszkóppal végeztük 30 ’C hőmérsékleten zablisztes, élesztŐ-/malátakivonatos agaron vagy ásványi só-/keményítőagaron kinővesztett 14 napos tenyészeteken.

A vegetatív micélium jólfejiett, fragmentáció nélküli. A légmicéliumok monopodiálisan elágazók, 1030 spórából álló spirális füzért képeznek. A spórák

HU 204 853 Β felszíne sima, alakja ovális, a mérete 0,6-0,8·0,81,3 μτη. Szkeloritikus granulumokat, sporangiát és zoospőrákat nem figyeltünk meg.

A tenyészet jellemző tulajdonságait Shirling és Gottlieb fent említett cikkében ismertetett, illetve Waksman által leírt [Waksman, S. A., The actinomycetes, 2. köt.: Classifícation, identification and description of Genera and species. The Villiams and Wilkins Co., Baltimore (1961)] 10 féle táptalajon vizsgáltuk.

A tenyészeteket 21 napig növesztettük 30 °C hőmérsékleten. A színek leírására a Methuen Handbook of Colour, [Komerup, A. és J. H. Wansher Methuen Handbook of Colour, Methuen, London (1978)] kézikönyvet alkalmaztuk. Az adatokat az I. táblázatban foglaljuk össze.

I. táblázat

Táptalaj A tenyészet leírása élesztő/malátakivonatos agar N: jó

L: erőteljes, bamásszürke (6E2)

F: sötétbarna (7F6)

Op.: nincs zablisztes agar N: jó

L: közepes, sötétbarna (7E3)

F: bamásszürke (7F2)

Op.: nincs ásványi só/keményítőagar N: jó

L: erőteljes, bamásszürke (7E2)

F: sárgásbarna (5E6)

Op.: nincs glicerin/aszparaginos agar N: jó

L: erőteljes, szürkésibolya (19E3)

F: barna (6E4)

Op.: nincs pepton/élesztőkivonat/vasas N: jő agar L: vékony, szürkésfehér (IBI)

F: sárgásbarna (5D6)

Op.: nincs tirozinos agar N: jó

L: erőteljes, bamásszürke (9E2)

F: barna (6E5) - fekete Op.: nincs glűkóz/aszparaginos agar N:jó

L: közepes, kékesszürke (19E2)

F: barna (6F4)

Op.: nincs tápagar N: közepes

L: közepes, bamásszürke (9E2)

F: szürkésbama (5E3) sárgásbarna (5F4)

OP.: nincs

Táptalaj	A tenyészet leírása
Bennet-agar	N: gyenge L: gyenge, sötétbarna (6F4) F: sötétbarna (6F4) Op.: nincs
szacharóz/nitrátos agar	N: gyenge L: nincs F: szürkésbama (6E3) Op.: nincs

N: növekedés,

L: léghifa,

F: fonák oldal,

Op.: oldható festékanyag.

A légmicélium színe szürkétől barnás szürkéig változik. A telep egy része elfeketül és nedves lesz, a legtöbb agaros táptalajon higroszkopikus jelleget mutat A fonákoldal színe sárgásbarna, barna vagy sötétbarna. A fonákoldal színanyaga nem érzékeny a kémhatás változására. Melanoid és más oldható pigment nem képződik.

A sejtfalanalízist Becker és munkatársai [Becker, B., Μ. P. Lechevalier, R. E. Gordon és H. A. Lechevalier „Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates”, Appl. Microbiol., 12: 421-423, (1964)], valamint Yamaguchi módszerével végeztük [Yamaguchi T., „Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes”, J. Bacteriol., 89: 444-453 (1965)]. A 9326 jelű törzs teljes sejthidrolizátumának az analízise LL-diamino-pimellnsav jelenlétét mutatja ki. Következésképp a törzs sejtfala az I. típusba tartozik.

Biológiai és élettani sajátosságok: A törzs élettani tulajdonságait és szénforrás-hasznosítását a II., illetve IH. táblázatban foglaljuk össze.

A szénforrás hasznosítására vonatkozó vizsgálatainkat Pridham és Gottlieb módszereivel végeztük [Pridham, T. G. és Gottlieb, D., „The utilization of carbon compounds by somé Actinomycetales as an aid fór species determination”, J. Bacteriol., 56: 107-114 (1948)].

A 9326 jelű törzs alaktani és kémiai tulajdonságai a mikroorganizmust világosan a Streptomyces nemzetségbe sorolják. A 9326 jelű törzset a Bergey kézikönyv 8. kiadásában leírt Streptomyces fajokkal [Buchnan, E. E. és N, E. Gibbons: „Bergey’s manual of determinative bacteriology” 8. kiadás, The Williams and Wilkins Co., Baltimore (1974)] és a Shirling által leírt Streptomyces fajokkal hasonlítottuk össze [(Shirling, E. B. és D. Gottlieb: „Coiporative description of type culture of Streptomyces. 2. Species description from fírst study”. Intem. J. Syst. Bacteriol., 18: 69-189 (1968)], [(Shirling, E. B. és D. Gottlieb: „Cooperative description of type culture of Streptomyces. 3. Additional species descriptions from fírst and second studies”, Intem. J.

HU 204 853 Β

Syst Bacteriol., 18: 279-392 (1968)] és [(Shirling, E. B. és D. Gottíieb „Cooperative dexcription of type culture of Streptomyces. 4. Species descriptíon from the second, third and fourth studies”, hitem. J. Syst Bacteriol., 19: 391-512 (1969)], a faj szerepel az „Approved Lists of bacterial names” listáján [Skerman, V. B. D., V. McGowan és P. H. A. Sneath: „Approved Iist of bacterial names”, Intem. J. System. Bacterial., 30: 225-420 (1980)] és szerepel a faj más leírásokban is [Williams, S. T.: M. Goodfellow, G. Alderson, E. Μ. H. Wellington, P. H. A. Sneath és M. J. Sackin: „Numerical classification of Streptomyces and related genera., J. Gén. Mícrobiol., 129: 1743-1813 (1983)] és [Dietz. A: „Criteria fór characterization of Hygroscopicus strains. In: „Actinomycetes; The boundary microorganismus” 183-191. old.; szerk.: T. Arai (1976)].

Π. táblázat

A 9326 jelű törzs élettani tulajdonságai

a növekedés hőmérséklettartománya	11-47 'C
optimális hőm. a növekedéshez	29-31 'C
zselatinelfolyósítás	+
tejkoaguláció	-
tejpeptonizáciő	+
keményítőhidrolízis	+
melanoidpígment-termelés	-
cellulózbontás -
III. táblázat

A 9326 jelű törzs szénhasznosítása

D-glükóz	+
szacharóz	+
D-xilőz	+
D-fruktóz
L-ramnóz	+
raffínóz	+
L-arabinőz	+
inozitol	+
mannitol	+

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a 9326 jelű törzs a Streptomyces violacoeniger-hez áll közel, ezért a 9326 törzset Streptomyces violaceoniger fajként azonosítottuk és a Streptomyces violaceoniger 9326 elnevezéssel láttuk el.

Az űj WS-9326A és WS-9326B peptidszármazékokat a WS-9326A-t és/vagy WS-9326B-t termelő Streptomyces törzzsel (például Streptomyces violaceoniger 9326 FERM BP-I667) állítjuk elő táptalajon tenyésztve.

Általában a WS-9326A és a WS-9326B peptidszármazékokat úgy állíthatjuk elő, hogy a WS-9326A-t és/vagy WS-9326B-t termelő törzset asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó vizes táptalajon tenyésztjük, előnyösen aerob körülmények között (rázott kultúrában, süllyesztett tenyészetben stb.).

Szénforrásként előnyösek a szénhidrátok, például glükóz, xilóz, galaktóz, glicerin, keményítő, dextrin és hasonlók.

További szénforrás lehet még a maltóz, ramnóz, raffi5 nóz, arabinőz, mannóz, szalicin, nátrium-szukcinát stb.

Előnyös nitrogénforrás az élesztőkivonat, pepton, sikérliszt, gyapotmagliszt, szőjaliszt, kukoricalekvár, szárított élesztő, búzacsíra, toli-liszt, földimogyoróliszt stb., valamint a szerves és szervetlen nitrogéntartalmú 10 vegyületek, például ammóniumsók (ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, ammónium-foszfát stb.), karbamid, aminosavak stb.

Az előnyösen kombináltan alkalmazott szén- és nitrogénforrásul szolgáló anyagoknak nem kell tiszta álla! 5 pótban lenniük, mert a kevésbé tiszta anyagok, melyek növekedési faktorokat és jelentős mennyiségű ásványi tápanyagot tartalmaznak, ugyancsak használhatók. Ha szükséges, ezeket a táptalajhoz adhatjuk ásványi sók alakjában, például, mint kalcium-karbonát, nátrium10 vagy kalcium-foszfát, nátrium- vagy kálium-klorid, nátrium- vagy kálium-jodid, magnéziumsó, rézsó, kobaltsó stb. Ha szükséges, különösen, ha a táptalaj erősen habzik, habzásgátló anyagokat - például folyékony paraffint, zsíros olajokat, növényi olajokat, ásványi olajat vagy szilikont - adhatunk hozzá.

A WS-9326A és a WS-9326B nagy mennyiségben való előállításához süllyesztett aerob tenyészkörülményeket használunk. Kis mennyiség előállításához rázott lombikos fermentációt vagy felülettenyésztést alkal3 mázunk. Amennyiben a fermentációt nagy tankokban végezzük, előnyös a termelő tankfermentor beoltásához egy vegetatív oltóanyagot használni, hogy ezáltal a WS-9326A és WS-9326B termelésénél elmaradjon a lag fázis. Következésképp először egy kisebb térfogatú 5 táptalajt beoltunk a kérdéses mikroorganizmus spóráival vagy micéliumaival és vegetatív oltóanyagot állítunk elő, majd ezt a vegetatív állapotban lévő tenyészetet visszük át steril körülmények között a nagy fermentorba. Az oltóanyag elkészítéséhez vagy ugyanazt a tápközeget használjuk, mint a WS-9326A és a WS9326B előállításánál vagy attól eltérőt.

A tenyészet kevertetését és levegőztetését különféle módon végezhetjük. A kevertetés történhet lapátos keverővei vagy hasonló mechanikus kevertetéssel, a fermentor forgatásával vagy rázatásával, különféle pumparendszerekkel, vagy steril levegőnek a tenyészetbe való átvezetésével. A levegőztetés hatékonnyá tehető, ha steril levegőt vezetünk át a fermentlén.

A fermentációt rendszerint 20-40 ’C hőmérséklettartományban végezzük, előnyösen 25-35 ’C hőmérsékleten. A fermentáció ideje 50-150 óra, ami a fermentáció körülményeitől és a méretektől függ.

A WS-9326A és a WS-9326B felmenőéből történő kinyerése az önmagában ismert módszerek valamelyikével történik, melyeket általánosan használunk más ismert biológiailag aktív anyagok kinyerésére. A WS9326Á és a WS-9326B termékek a tenyészet szűrletében és a micéliumon található, és a WS-9326A-t és a WS-9326B-t kinyerhetjük és tisztíthatjuk a szőriéiből és a kiszűrt micéiiumból. A micéliumot szűéssel vagy

HU 204 853 Β centrifugálással választjuk el a fermentléből. A szokásos kinyerési eljárás történhet csökkentett nyomáson való bepárlással, fagyasztva szárítással, megfelelő oldószerrel való extrahálással, a kémhatás beállításával, megfelelő gyanták (például anion- vagy kationcserélő gyanták, adszorbciós gyanták stb.), általánosan használt adszorbensek (például aktivált csontszén, szilikasav, szilikagél, cellulóz, alumínium-oxid stb.) alkalmazásával, kristályosítással, átkristályosítással stb.

A fentiek szerint előállított WS-9326A termék az alábbi fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek:

(1) Megjelenés és szín: színtelen por (2) Színreakciók: cérium-szulfátos reakció, jódgőzös reakció, vas(III)-klorid/kálium-vas(III)-cianid reakció, negatív színreakciók: ninhidrin próba: Molish-reakció, vas(III)-kloridos reakció, Ehrlich-reakció, Paulireakció.

(3) Oldékonyság oldható: metanolban, etanolban; rosszul oldódik: acetonban, etil-acetátban; oldhatatlan: vízben, kloroformban.

(4) Olvadáspont: 187-190 °C (5) Fajlagos forgatás, [a]??: -84’ (c-1,0, metanol).

(6) Ultraibolya-spektrum, λπ.^: 280 nm (ε-34 700).

(7) Infravörös-spektrum, v^: 3300,3050,2920,2860, 1730, 1650, 1610, 1560, 1530, 1510, 1440, 1380, 1340, 1280, 1240, 1170, 1080, 1060, 1040, 970, 920,860,830 cm’¹, (a spektrumot lásd az 1. ábrán).

(8) Elemanalízis a CsíHősNsOn^HaO képlet alapján: számított: C-60,43, H-6,76, N-10,44%;

mért: C-60,18, H=6,61,N=10,32%.

(9) Vékonyréteg-kromatográfia:

adszorbens	mozgófázis	Rf-érték
szilikagéllemez	kloroform/metanol, 5:1	0,38
(Merck Art 5715)
RP-18 lemez (Merck) metanol/víz, 8:2	0,46

(10) Képlet: CWWWo (11) Molekulasúly:

FAB-tömegspektrum alapján: m/z=1037 (M+H)⁺ (12) Kémiai jellege: savjellegű (13) ¹³C-mágneses magrezonancia spektruma (100 MHz, CD₃OD) delta:

175,69 (s),	174,70(8),
173,73 (s),	173,38 (s),
172,89 (s),	171,04(3),
170,45 (s),	167,79 (s),
167,15 (s),	159,20 (s),
140,05 (d),	139,12 (s),
138,71 (s),	135,27 (d),
134,85 (s),	132,11 (d),
132,03 (s),	131,69 (d)»2,
130,70 (d),	129,90 (d),
129,61 (d)«2,	129,22 (d)-2,
128,55 (d),	128,04 (d),

127,99 (d),	127,38 (d),
126,09 (s),	123,70 (d),
115,63 (d)-2,	73,46 (d),
71,34 (d),	62,80 (t),
59,53 (d),	56,91 (d),
56,76 (d),	55,55 (d),
53,64 (d),	52,10 (d),
39,85 (t),	37,18 (t),
37,09 (t),	34,58 (q),
31,37 (t),	24,56 (d),
23,63 (t),	22,71 (q),
22,52 (q),	21,17 (q),
17,19 (q),	14,13 (q).
A spektrum a 2. ábrán látható.

(14) Ή-mágneses magrezonancia spektruma (400 MHz, CD₃OD) delta:

7,80 (IH, d, J-8 Hz),

7.67 (IH, d, J=16 Hz),

7,45-7,14 (9H, m),

7,06 (2H, d, J=8 Hz),

6,83 (IH, s),

6,65 (2H, d, J-8 Hz),

6,59 (IH, d, J-12 Hz),

5.88 (lH,dt,J-12Hzés7Hz),

5.55 (IH, m),

5,35 (IH, széles),

5,10 (IH, dd, J-3 Hz és 9,5 Hz),

4.68 (IH, d, J-lOHz),

4.55 (IH, t, J-6 Hz),

4,48 (IH, dd, J-3 Hz és 12 Hz),

3,92 (2H, d, J-6 Hz),

3,70 (IH, t, J-7,5 Hz),

3,62 (IH, m),

3,46 (IH, dd, J-3 Hz és 14 Hz),

2,94 (IH, dd, J-3 Hz és 16 Hz),

2.89 (3H, s),

2,74 (IH, dd, J-9,5 Hz és 16 Hz),

2.69 (IH, dd, J-12 Hz és 14 Hz),

2,14 (2H, m),

1,5-1,4 (2H,m),

1,20 (3H, d, J-6 Hz),

1,08 (3H, d, J-6 Hz),

1,0-0,8 (2H,m),

0,91 (3H, t, J-7 Hz),

0,6 (IH, m),

0,53 (3H, d, J-6 Hz),

0,51 (3H, d, J-6 Hz).

A spektrum a 3. ábrán szerepel.

(15) Aminosav-analízis:

mg WS-9326A anyagot 2 ml sósavban hidrolizálunk lezárt csőben, 110 ’C hőmérsékleten 20 órán keresztül. A hidrolizátumot szárazra pároljuk, és a bepárlási maradékot Hitachi 835 automata aminosav-analizátoron elemezzük. Az analízis eredménye: treonin (2), leucin (1), fenil-alanin (1), aszparaginsav (1), szerin (1), metil-amin (1) és ammónia (1).

A ¹³C- és az Ή-magrezonancia spektrumát (2. és 3. ábra) illetően megjegyezzük, hogy a WS-9326A anyag

HU 204853 Β a deutero-kloroformos (CD₃OD) oldatban legalább két stabil konformációban szerepel és a (13), illetve (14) pontoknál megadott fenti kémiai eltolódásí adatok a WS-9326A főkonfonnerére vonatkoznak.

A fentiekben ismertetett eljárással előállított WS- 5

9326B anyag fizikai és kémiai tulajdonságai:

(1) Megjelenés és szín: színtelen, amorf por.

(2) Színreakciók, pozitív: cérium-szulfátos reakció, jódgőzös reakció; 10 negatív: ninhidrides reakció.

(3) Oldhatóság oldható: metanolban, gyengén oldódik: etanolban, oldhatatlan: vízben, acetonban, etil-acetátban, 15 kloroformban.

(4) Olvadáspont: 165-170 °C (bomlik).

(5) Fajlagos forgatás: [a]F: -64° (c=l,0, metanol).

(6) Ultraibolya-spektrum: ^££^-283 nm (ε=27 000).

(7) képlet: Cj^oNgOn. 20 (8) Elemanalízis a C₅4H7oNsOi3*2H20 képlet alapján: számított: C=60,32, H=6,93, N=10,42%;

mért: C-59,97, H=6,87, N-10,29%.

(9) Molekulasúly:

A FAB-tömegspektrum alapján, m/z-1061,6 25 (M+Na)⁺ (10) Vékonyréteg-kromatográfía:

adszorbens mozgófázis	Rrérték
szilikagéllemez kloroform/metanol,	0,38
(Merck Art. 5715) 5:1
RP-18 lemez metnaol/víz, 8:2	0,25

(A mozgófázis alkotórészeinek aránya térfo- 35 gategységben megadva).

(11) Infravörös-spektrum:

λ®ί=3300, 3050, 2950, 1735, 1660, 1530, 1510, 1450, 1400, 1380, 1340, 1260, 1220, 1080, 980,

920 cm'¹. 40 (12) ^I3C-mágneses magrezonancia-spektrum (100 MHz, CD3OD) delta:

174,99(8),	174,54 (s),
173,60 (s),	173,41 (s),	45
173,30 (s),	171,27 (s),
170,74 (s),	170,19(5),
168,69 (s),	157,59 (s),
140,53 (d),	139,35 (s),
139,18 (s),	135,76 (d),	50
134,17(5),	131,15 (d)»2,
130,93 (d),	130,35 (d),
129,88 (d)«2	129,39 (d)«2,
128,70 (d),	128,58 (s),
128,13 (d),	127,64 (d),	55
127,53 (d),	121,99 (d),
116,45 (d)«2	72,76 (d),
70,82 (d),	62,73 (0,
62,67 (d),	59,35 (d),
56,33 (d)«2,	56,19 (d),	60

53,36 (d),	52,24 (d),
40,24 (t),	37,55(t),
37,08 (t),	33,69(0,
31,57 (t),	29,93 (q),
24,61 (d),	23,70 (q),
23,59 0),	22,16 (q),
21,36 (q),	17,12 (q),
14,23 (q).
A spektrum a 6. ábrán szerepel.
(13) Ή-mágneses magrezonancia-spektrum
(400 MHz, CD3OD) delta:
7,86	(lH,J-16Hz),
7,80	(IH, széles d, J-8 Hz),
7,12-7,42	(11H, m),
6,77	(2H, d, J=8,5 Hz),
6,61	(IH, d, J=ll,5 Hz),
5,88	(lH,dt,J-73Hzésll,5Hz),
5,08	(IH, dd, J-3,5 Hz és 10 Hz),
5,04	(IH, q, J-6,5 Hz),
4,66	(ÍH, dd, J-3,5 Hz és 13 Hz),
4,65	(ÍH, d, J=ll,5Hz),
4,56	(IH, dd, J-2,5 Hz és 7 Hz),
4,48	(IH, dd, J-4,5 Hz és 11 Hz),
4,46	(lH,s),
3,88	(2H,m),
3,64	<2H,m),
3,51	(IH, dd, J-3,5 Hz és 14 Hz),
3,17	(ÍH, dd, J-4,5 Hz és 14 Hz),
3,01	(IH, dd, J-ll Hzés 14Hz),
2,94	(IH, dd, J-3,5 Hz és 16 Hz),
2,71	(3H,s),
2,71	(IH, dd, J-10 Hz és 16 Hz),
2,64	(IH, dd, J-13 Hz és 14 Hz),
2,04	(2H,m),
1,43	(2H,m),
1,28	(2H,m),
1,20	(3H, d, J=6 Hz),
0,95	(3H,d, J-6,5 Hz),
0,87	(3H, t, J=7,5 Hz),
0,53	(lH,m),
0,52	(6H, d, J-10,5 Hz).

A spektrum a 7. ábrán szerepel.

A¹³C- és Ή magrezonancia-spektrummal kapcsolatban megjegyezzük, hogy a deutero-kloroformos (CD3OD) oldatban a WS-9326B anyag legalább két stabil konformációban szerepel, a (12) és (13) pontoknál megadott fenti, kémiai eltolódás! adatok a WS9326B főkonfonnerére vonatkoznak.

A fenti fizikai és kémiai adatok alapján, valamint a további, a szerkezetre vonatkozó vizsgálatok szerint a WS-9326A és a WS-9326B anyagokra megállapított képletet a 23. és 24. ábrán mutatjuk be.

Az (I) általános képletu vegyület gyógyászatilag alkalmazható sói az általánosan használt nem toxikus sók. Ezeket a bázis- vagy savaddíciós sókat képezhetjük szervetlen bázissal - ilyenek például az alkálifémsók (például Iítiumső, nátriumsó, káliumsó stb.), az alkáliföldfémsók (például kalciumső, magnéziumsó stb.), ammőnium8

HU 204 853 Β sók-, szerves bázissal - ilyenek a szerves aminsók (például trietil-amin-só, piridinsó, pikolinsó, etanol-amin-só, trietanol-amin-só, diciklohexil-amin-só, N,N’-dibenziletilén-diamin-só stb.) szervetlen savakkal (például hidroklorid, hidrobromid, szulfát, foszfát stb.), szerves karbonsavakkal vagy szulfonsavakkal (például formiát, acetát, trifluor-acetát, maleát, tartarát, metánszulfonát, benzolszulfonát, p-toluolszulfonát stb.), bázikus vagy savas aminosavakkal (például argininnel, aszparaginsavval, glutaminsavval stb.) és hasonlókkal.

Az (la)-(Ij), (II) és (HE) általános képletű vegyületek alkalmas sói azonos típusúak, mint amelyeket az (I) általános képletű vegyülettel kapcsolatban felsoroltunk.

A találmányban használt kifejezéseket az alábbiak szerint értelmezzük.

A fent említett alkanoilcsoportokra példaként említhető csoportok: formil, acetil, propanoil, butanoil, 2metil-propanoil, pentánod, 2,2-dimetil-propanoil, hexánod, heptanoil, pentadekanoil, hexadekanoil, heptadekanoil, oktadekanoil, nonadekanoil, ikozanoil stb.

Alkoxi-karbonil-csoport például a metoxi-karbonü-, etoxi-karbonil-, terc-butoxi-karbonil-, terc-pentil-oxikarbonil-, heptil-oxi-karbonil-csoport stb.

A „védett hidroxilcsoport” kifejezésen az alkalmas, „hidroxilcsoportot védő csoport” lehet fenil-(rövid szénláncú alkil)-csoport (például benzil stb.), valamelyik fent említett acilcsoport és hasonló.

Az alkalmas „védett karboxilcsoport” jelenthet észterezett karboxilcsoportot.

Az észterezett karboxilcsoport észtercsoportjára az alábbi példákat említhetjük:

- rövid szénláncú alkilcsoport (például metil-észter, etil-észter, propil-észter, izopropil-észter, butil-észter, izobutil-észter, terc-butil-észter, pentil-észter, hexil-észter, 1-ciklopropil-etil-észter stb.), mely legalább egy alkalmas szubsztituenst is tartalmazhat, ez esetben az észtercsoport lehet például egy rövid szénláncú alkanoil-oxi-(rövid szénláncú alkil)-csoport [például acetoxi-metil-észter, propionil-oxi-metil-észter, butiril-oxi-metil-észter, valeril-oxi-metilészter, pivaloil-oxi-metil-észter, hexanoil-oxi-metilészter, l-(vagy 2)-acetoxi-etil-észter, l-(vagy 2 vagy 3 vagy 4)-acetoxi-butil-észter, l-(vagy 2)-propioniloxi-etil-észter, l-(vagy 2 vagy 3)-propionil-oxi-propil-észter, l-(vagy 2)-butiril-oxi-etil-észter, l-(vagy 2)-izobutiril-oxi-etil-észter, l-(vagy 2)-pivaloiI-oxietil-észter, l-(vagy 2)-hexanoil-oxi-etil-észter, izobutiril-oxi-metil-észter, 2-etil-butiril-oxi-metil-észter, 3,3-dimetil-butiril-oxi-metil-észter, l-(vagy 2)pentanoil-oxi-etd-észter stb.], egy, két vagy három halogénatommal szubsztituált, rövid szénláncú alkilcsoport (például 2-jód-etil-észter, 2,2,2-triklór-etil-észter stb.), rövid szénláncú alkoxi-karbonil-oxi-(rövid szénláncű alkil)-csoport (például metoxi-karbonil-oxi-metilészter, etoxi-karbonil-oxi-metil-észter, 2-metoxi-karbonil-oxi-etil-észter, 1-etoxi-karbonil-oxi-etil-észter, 1izopropoxi-karbonil-oxi-etil-észterstb.), ftálidilidén-(rövid szénláncú alkil)-csoport vagy 5-(rövid szénláncú alkil)-2-oxo-l,3-dioxol-4-il-(rövid szénláncú alkil)-csoport [például (5-metil-2-oxo-l,3-dioxol4- il)-metil-észter, (5-etd-2-oxo-l,3-dioxo-4-d)-metilészter, (5-propil-2-oxo-l,3-dioxol-4-il)-etil-észter stb.]

- rövid szénláncú alkenilcsoport (például vind-észter, allil-észter stb.);

- rövid szénláncú alkinilcsoport (például etind-észter, propinil-észter stb.);

- arilcsoporttal szubsztituált rövid szénláncú alkdcsoport, mely aralkilcsoport legalább egy szubsztituenssel helyettesített lehet; ilyen például a mono-, divagy trifenil-(rövid szénláncú alkil)-csoport, mely legalább egy alkalmas szubsztituenst hordozhat (például benzil-észter, 4-metoxi-benzd-észter, 4- nitrobenzil-észter, fenetil-észter, tritil-észter, benzhidrdészter, bisz(metoxi-fenil)-metil-észter, 3,4-dimetoxibenzil-észter, 4-hidroxi-3,5-di-terc-butd-benzil-észter stb.);

- arilcsoport, mely legalább egy alkalmas szubsztituenssel is rendelkezhet (például fenil-észter, 4-klórfenil-észter, tolil-észter, terc-butil-fenil-észter, xililészter, mezitil-észter, kumenil-észter stb.);

- ftalidilcsoport és hasonlók.

Az alkalmas „rövid szénláncú alkoxicsoport kifejezésen például metoxi-, etoxi-, propoxi-, izopropoxi-, butoxi-, izobutoxi-, terc-butoxi-, pentil-oxi-, hexil-oxicsoportot és hasonlókat értünk.

A „védett aminocsoport” kifejezésben az alkalmas „aminocsoportot védő csoport” lehet a fent említett acilcsoportok valamelyike stb.

Az „arilcsoporttal szubsztituált rövid szénláncú alkenoilcsoport, mely aralkenoilcsoport rövid szénláncú alkenilcsoporttal helyettesített” kifejezésben a „rövid szénláncú alkenilcsoport” például vinil-, alld-, 1-propenil-, 1- vagy 2- vagy 3-butenil-, 1- vagy 2- vagy 3vagy 4-pentend-, 1- vagy 2- vagy 3- vagy 4- vagy

5- hexenilcsoportot stb. jelenthet.

Az „arilcsoporttal helyettesített rövid szénláncú alkanoilcsoport, mely aralkanoilcsoport rövid szénláncú aíkilcsoporttal helyettesített” kifejezésben az alkalmas „arilcsoporttal helyettesített rövid szénláncú alkanoilcsoport” például fenil-(rövid szénláncú alkanod)-csoport (például fenil-acetil, fenil-propanoil, fenil-butanoil, fenil-izobutilil, fenil-pentanoil, fenil-hexanod stb.), naftil-(rövid szénláncú alkanoil)-csoportot (például naftil-acetil, naftil-propanoil, naftil-butanod stb.) és hasonló csoportokat jelent.

Az „arilcsoporttal szubsztituált rövid szénláncú alkanoilcsoport, mely aralkanoilcsoport rövid szénláncú aíkilcsoporttal helyettesített” kifejezésben az alkalmas „rövid szénláncú alkilcsoport” metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, terc-butil-, pentil-, hexil- és hasonló csoportot jelenthet.

A peptidszármazékok biológiai tulajdonságai: az (I) általános képletű peptidszármazékok és gyógyászati szempontól alkalmazható sóik P-anyag antagonista, neurokinin A (K-anyag) antagonista és hasonló farmakológiái hatással rendelkeznek, ezért alkalmasak asztma és hasonló betegségek kezelésére és megelőzésére.

Az említett jellegű farmakológiai aktivitás kimutatására az alábbi vizsgálatokat használhatjuk:

HU 204853 Β (1) Radioligand-kötő vizsgálat (a) nyers membrán kinyerése agyból, illetve tüdőből:

200 g-os nőstény Wistar-patkányokat használunk. A reagensek a Sigma Chemical Company-tól származnak. 4 g teljes agyat kis darabokra vágunk és 8 térfogatnyi I. közegben (50 mM trisz-HCI, ρΗ=7Λ 5 mM MnCl₂, 0,02% boqú-szérumalbumin, 2 pg/ml kimosztatin, 4pg/ml Ieupeptin és 40 pg/ml bacitracin) elhomogenizáljuk Ultra-Disperser (Yamato Model LK-21) homogenizátoiral. Ahomogenizátumot -20 °C hőmérsékleten tároljuk vagy azonnal felhasználjuk a vizsgálatokhoz.

600 g-os hím albínó Hartley-tengerimalacokat dekapitulációval megölünk. A légcsövet és a tudókét eltávolítjuk és -80 °C hőmérsékleten, tartjuk felhasználásig. 150 g szövetet felolvasztunk, 500ml pufferben (0,25 M szacharóz, 50 mM trisz-HCI, pH=7,5,0,1 mM EDTA) homogenizáljuk MatsudenMJ-761 kompakt keverőben. A szövetet Ultra-Disperser-ben (Yamato Model LK-21) homogenizáljuk tovább maximum 10 sec-os homogenizálásokkal, amelyeket 10 sec-os hűtési fázisok választanak el (a homogenizálás összideje: 60 sec). A szövettöredéket centrifiigálással elválasztjuk (900 g, 10 perc), afelülúszőt 14 000 g-n centrifugálva 20 percig, a nyert üledéket tekintjük a nyers membránpreparátumnak. Ezt az üledéket I. közegben felszuszpendáljuk, teflonhomogenizátorban homogenizáljuk, a homogenizátumot 14 000 g-n 20 percig centrifugáljuk. Az üledéket -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

(b) Triciummal jelzett P-anyag megkötése a membránpreparátumon:

nM triciummal jelzett P-anyagot (New England Nuclear) az I. közegben készült 50 pl membránpreparátummal inkubáltatunk 4 °C hőmérsékleten 30 percen ke- i resztül; a végtérfogat 250 pl. Az inkubációs idő végén az inkubációs keveréket egy Brandel M-245 sejtszeparátorral gyorsan átszűrjük egy GF/B üvegszálas szűrőn, melyet 3 órával a felhasználása előtt 0,1%-os polietiléniminnel előkezeltünk. A szűrőt 0 °C hőmérsékleten 3 ml ¹ mosópufferrel (50 mM trisz-HCI, pH=73) mossuk át, a puffért tíz adagba elosztva. A radioaktivitást 3 ml AquaζοΙ-2-ben határozzuk meg egy Packard TRI-CARB 4530 szcintillációs számláló segítségével.

IV. táblázat

Patkányagy és tengerímalac tüdőmembrán által megkötött tricíált P-anyag helyettesítése

WS-9326A-val, WS-9326B-veI, tiacetiI-WS-9326A-val vagy tetrahidro-WS-9326B-vel 5

	ICSo(M)
agy	tüdő
WS-9326A	2,540-5	3,840-6
triacetil-WS-9326A	9,4405	7,740-5
WS-9326B		8,840-5
tetrahidro-WS-9326A		4,240-7

(2) A WS-9326A vagy a tetrahidro-WS-9326A hatása tengerimalac- légcsőre

600 g-os kifejlett, hím, albínó Hartley-tengerimalacok légcsövéből spirális csíkokat vágunk ki a szoká5 sós eljárás szerint és egy termosztáló köpennyel ellátott 30 ml-es üvegedénybe helyezzük, melyben szövetfürdő van. A légcsőszalag tenzióját ízometrikusan mérjük egy poligráfhoz (Biophysiograph 180 System, San-Ei Instrument) kötött szerkezet közvetítésével.

Ez a transzduszer közvetíti az elmozdulást. 30 ml 37 °C hőmérsékletűszövetfürdóben 500 mg nyugalmi tenziő alatt felfüggesztünk egy 2 mm széles 50 mm hosszú légcsőszalagot. A szövetfürdő Összetétele: 137 mM (8 g/I) nátrium-klorid, 2,7 mM (0,2 g/1) kálium-klorid, 1,8 mM (0,264 g/1) kalcium-klorid-2víz, 1,02 mM (0,208 g/1) magnézium-klorid-6-víz, 11,9 mM (1 g/1) nátrium-hidrogén-karbonát, 0,42 mM (0,066 g/1) nátrium-dihidrogén-foszfát és 5,5 mM (1 g/I) glükóz. A szövetfürdőt 95% oxigén és 5% szén-dioxid összetételű gázeleggyel buborékoltatjuk át. A szöveteket 90 percen át inkubáltatjuk, hogy a rendszer egyensúlyba jöjjön, majd különféle höigőoszszehúzódást kiváltó anyaggal szemben vizsgáljuk a WS-9326A vagy a tetrahidro-WS-9326A anyagokat.

A hörgőösszehúzódás kiváltásához 10'⁸ M P-anyagot vagy ΙΟ’⁹ M neurokinin A-t alkalmazunk. A tenziót egy San-Ei Rectigraph-85 írószerkezettel rögzítjük (San-Ei Instrument).

) V táblázat

WS-9326Avagy tetrahidro-WS-9326Ahatása a neurokinxn A (NKA) és a P-anyag (SP) által kiváltott összehúzódásra tengerimalac- légcsőnél

WS-9326A	gátlás, %
(pg/ml)	NKA ΙΟ’9 M	SP ÍO-’M
3	44%	-10%
10	79%	50%
30	100%	63%
tetrahidro-	1,64(16	3,140-6
-WS-9326A
ICso(M)

(3) A WS-9326A vagy a tetrahidro-WS-9326A hatása a neurokinin A-val vagy kapszaicinnel kiváltott hőrgőszűkületre.

300-500 g-os hím Hartley-tengerimalacokat 10 mg intraperitoneálisan beadott nátrium-pentobarbitállal elkábítunk. A nyaki vénába kanült vezetünk a neurokinin A vagy a kapszaicin és a hatóanyag bejuttatására. A légcsőbe vitt katéteren keresztül mesterségesen lélegeztetünk. A lélegeztetést egy kis respirációs pumpával végezzük (Harvard B-34,5 ml/löket, 60 lökef/perc).

A tüdő kitágulásával szembeni ellenállás mérésére Konzett-Rössler módosított technikáját alkalmazzuk.

Az antagonistákat és az antagonista hatóanyagot (0,1%-os metil-cellulózt tartalmazó sóoldatban) intravénásán adjuk be a 25. ábrán feltüntetett időrend szerint

HU 204 853 Β

VI. táblázat

A neurokinin A által kiváltott hörgőszúkülés gátlása WS-9326Á-val vagy tetrahidro-WS-9326A-val

dózis	A neurokinin A (1 mmól/kg, ív) gátlása, % n:5
2 perc	17 perc	32 perc 47 perc	62 perc
WS-9326A10 mg/kg, ív tetrahidro-WS-9326A 10 mg/kg, ív	-16,5±5,6 41,0±5,6	30,2±12,9 100,0±0,0	45,8+13,8 55,4±8,1 99,2±0,8 98,4+1,6	49,9+13,4 100,0±0
VH. táblázat A kapszacin által kiváltott hörgőszűkülés gátlása WS-9326A-val
dózis	2 perc	A kapszacin (10 nmól/kg, ív) gátlása, ív n:4 17 perc 3 2 perc 47 perc	62 perc
10 mg/kg, ív	16,6±5,1	40,6+12,2	51,2+10,4 37,2+19,7	47,1+16,7

(4) Az intratracheálisan bejuttatott WS-9326A vagy tetrahidro-WS-9326A hatása a neurokinin A által kiváltott hörgőszűkületre tengerimalacoknál: a WS-9326A vagy a tetrahidro-WS-9326A inhalálásának a höigőszukülésre gyakorolt hatását vizsgáljuk. A WS-9326A-t 25 vagy a tetrahidro-WS-9326A-t dimetil-szulfoxidban oldjuk és intratracheálisan juttatjuk be. A módszer szinte ugyanaz, mint a fent ismertetett. Amint a Vül. és IX. táblázat mutatja, a WS-9326A és a tetrahidro-WS-9326A igen hatékony.

vni. táblázat

Neurokinin A** gátlása, % dózis* 20 perc 35 perc 50 perc 65 perc n

0,03 mg/kg	32,3	28,4	35,6	35,5	4
0,3	50,6	42,4	44,9	42,0	4
3	73,4	79,4	81,7	77,7	4
EDjo mg/kg	0,23	0,29	0,19	0,24

* WS-9326A dimetil-szulfoxidban oldva. ** 1 nmól/kg, ív.

IX. táblázat

A neurokinin A-val kiváltott hörgőszűkülés gátlása a légcsövön keresztül bejuttatott tetrahidro-WS-9326A-val

A neurokinin A* * gátlása, % 50 dózis * 20 perc 35 perc 50 perc 65 perc n

0,003 mg/kg	5,4	23,5	17,2	12,6	4
0,03	50,0	50,9	51,4	43,0	4
0,3	77,7	75,7	74,6	71,1	4
ED50 mg/kg	0,048	0,030	0,037	0,059

* tetrahidro-WS-9326 dimetil-szulfoxidban oldva.

** 1 nmól/kg, ív.

(5) Akut toxicitás: a WS-9326A akut toxicitását 5 hetes, hím ddY-egereken határozzuk meg. 5 egérnek lépcsőzetes dózisban egyszeri intraperitoneális injekcióval adjuk be a vizsgálandó anyagot. A WS-9326A LDjo-értéke 250 mg/kg felett és 500 mg/kg alatt van.

(500 mg/kg>LD5o>25O mg/kg)

A találmány szerinti hatóanyagot gyógyszerkészítményként használhatjuk. Akészítmények lehetnek szilárdak, félfolyékonyak vagy folyékonyak. Hatóanyagként az (I) általános képletű peptidszármazékokat vagy gyógyászati szempontból alkalmazható sóikat tartalmazzák szerves vagy szervetlen hordozóanyagok vagy az externális, enterális vagy parenterális alkalmazáshoz szükséges adalékanyagok kísérletében. A hatóanyagot a szoká35 sósán alkalmazott nem toxikus, gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagokkal alkamazzuk a tabletták, pirulák, kapszulák, oldatok, emulziók, szuszpenziók és hasonló készítmények elkészítéséhez. A vivőanyag lehet víz, glükóz, laktóz, akáciamézga, zselatin, mannitol, ke40 ményítőpaszta, magnézium-triszilikát, talkum, kukoricakeményítő, keratin, kolloidálís szilícium-oxid, burgonyakeményítő, karbamid és más olyan vivőanyagok, melyek a szilárd, folyékony készítmények előállítását lehetővé teszik. Továbbiakban alkalmazhatunk még adalékanya45 gokat, stabilizálóanyagokat, sűrítőanyagokat, színanyagokat, illatosítókat stb. A hatóanyag olyan mennyiségben van a gyógyszerkészítményben, mely szükséges ahhoz, hogy a betegség folyamatára vagy állapotára a kívánt hatást kiváltsa.

Az (I) általános képletű peptidszármazék vagy gyógyászatilag alkalmazható sójának gyógyászatiiag hatékony mennyisége változó és függ a kezelendő személy korától, állapotától, a napi dózis 0,01-100 mg, előnyösen 0,1-500 mg, még előnyösebben 0,5-100 mg hatóanyag; 55 az átlagos egyszeri dózis mennyisége általában 0,5 mg, 1 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg 250 mg és 500 mg.

A találmányi leírásban a IUPAC-IUB (Camission on Biological Nomenclature) szerinti rövidítéseket használjuk az aminosavakra, peptidekre, védőcsoportokra 60 stb. vonatkozólag. A szakirodalom ezeket általánosan

HU 204853 Β használja. A példákban az IUPAC-IUB rövidítésein kívül más rövidítéseket is használunk.

A találmányi leírásban szereplő rövidítések;

Thr: L-treonin

Ser: L-szerín

Tyr. L-tirozin

Asn: L-aszparagin alIo-Thr. L-alIotreonin

D-Phe; D-fenil-alanin

Leu: L-Leucin

Z; benzil-oxi-karbonil

Pác: fenacil

Bzl: benzil

Boc: terc-butoxi-karbonil

Me: metil

Tce: 2,2,2-trikIór-etil

Mmp: 4-metoxi-metoxi-fenil

Sic terc-butil-dimetil-szilil

Ac: acetil

Et: etil n-Hex: n-hexán

VRK: vékonyréteg-kromatográfía.

Az elmondottakat az alábbiakban példákkal szemléltetjük. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi kőiét nem korlátozzák.

l.példa

500 ml-es Erlenmeyer-Iombikban 120 ’C hőmérsékleten 30 percen át sterilezőnk 160 mi alábbi összetételű inokulum-táptalajt: 1% keményítő, 1% szacharóz, 1% glükóz, 1% gyapotmagliszt, 0,5% pepton, 0,5% szójaliszt és 0,2% kalcium-karbonát, a kémhatás 6 n nátrium-hidroxid-oldattal pH-7,0 értékre beállítva.

A táptalajt kaccsal beoltjuk a Streptomyces violaceoniger 9326 törzs ferdeagaros tenyészetéről és a lombikokat körrázógépen (220 percenkénti fordulatszám,

5,1 cm-es kitérés) rázatjuk 3 napon át 30 'C hőmérsékleten. Az oltótenyészettel 160 liter, alábbi összetételű ‘ fermentációs táptalajt oltunk be: 3% glicerin, 0,5% szójallszt, 1,5% szójadara, 0,2% kalcium-karbonát, 0,001% nátrium-jodid. A 200 literes rozsdamentes acélfermeníorban 3 napon át fermentálunk 30 ’C hőmérsékleten percenként 160 liter levegővel levegőztet- ² ve és percenként 200-as fordulatszámmal kevertetve. A WS-9326A mennyiségi meghatározását HPLC-vel végezzük, egy Hitachi Model 655 pumpát használva. A kromatografáláshoz használt acéloszlop (4,6 mm belső átmérő, 250 mm hosszúság) R-ODS-5 töltettel töltött £ (YMC-packed), az átfolyási sebesség 1,0 ml/perc.

Mozgófázis: metanol/víz, 8:2. A HPLC vizsgálathoz a mintát az alábbiak szerint készítjük el: azonos térfogatú acetont adunk a tenyészlémintához, erőteljesen összerázzuk, 1 órán át állni hagyjuk, majd centrifugál- 5 juk. 5 μΐ felülúszót viszünk az oszlopra a Hitachi Model 655 injektoron keresztül.

150 liter fermentléhez hozzáadunk azonos térfogatnyi acetont kevertetés közben. Hagyjuk a keverékeket szobahőmérsékleten állni egy órán át, majd szüljük. 6l

A szűrletet csökkentett nyomáson 80 literre pároljuk be, kémhatását 1 n sósavval pH-7,0 értékre állítjuk be és 80 liter etil-acetáttal extrahálunk. Az extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és szilikagél5 oszlopra visszük a bepárlási maradékot (Kieselgel 60,

70-230 mesh, Merck, 3 liter). Az oszlopot 10 liter n-hexánnal, 10 liter n-hexán/etil-acetát, 1:1 eleggyel, 20 liter etil-acetáttal mossuk és a hatóanyagot 6 liter acetonnal eluáljuk az oszlopról. Az aktív frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és a maradékot szilikagéloszlopon kromatografáljuk (Kieselgel 60, 70-230 mesh, Merck, 1,2 liter). Az oszlopot 5 liter kloroform/metanol, 20:1 eleggyel mossuk és a kívánt anyagot 6 liter kloroform/metanol 10:1 eleggyel eluál15 juk. A frakciókat csökkentett nyomáson szárazra párolva, egy port kapunk. Ezt a port kis térfogatnyi metanolban oldjuk és egy NS géloszlopra (Nihon Seimitsu, 500 ml) visszük. A kívánt anyagot 21 metanol/víz 8:2 eleggyel eluáljuk, és csökkentett nyomáson 300 ml I térfogatra pároljuk, majd 500 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, 5 g port nyerve. Ezt 10 ml metanolban oldjuk (500 mg/ml) és D-ODS-S töltetű (YMC-packed) HPLC oszlopra (rozsdamentes acél, 20 mm átmérő, ί 250 mm hosszú). Eluensként metanol/víz, 8:2 elegyet használunk, az áramlási sebesség 9,9 ml/perc. A kapott aktív frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk és etil-acetáttal extraháljuk. Csökkentett nyomáson bepárolva az extraktumot, 150 mg WS-9326A anyagot kapunk fehér por alakjában.

2. példa

300 mg WS-9326A 4,5 ml pírídinben készült oldatához hozzáadunk 1,5 ml ecetsavahidridet és 1 mg 4-dimetil-amino-piridint. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten hagyjuk állni egy éjszakán át. A reakciókeveréket bepároljuk, az olajos maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfíával tisztítjuk, eluens kloroform/metanol, 10:1.

A kapott terméket dietil-éterben eldörzsölve 332 mg triacetil-WS-9326A-t kapunk színtelen por alakjában.

A triacetil-WS-9326A fizikai és kémiai jellemzői:

(1) Megjelenés és szín: színtelen por.

(2) Színreakciók pozitív: cérium-szulfátos reakció, kénsavas reakció, jődgőzös reakció negatív: ninhidrines reakció.

(3) Oldhatóság oldódik: metanolban, dimetil-szulfoxidban, gyengén oldódik: kloroformban, dietil-éterben, oldhatatlan: n-hexánban.

(4) Olvadáspont: 141-143 ’C.

(5) Fajlagos forgatás, [aj??: -122° (c-1,0, metanol).

(6) Ultraibolya-spektrum: λ^^Η-283 nm (ε-32 000).

(8) Elemanalízis a ΟβΰΗγ^ΝβΟϊό^Η^Ο képlet alapján: számított: C-60,09, H-6,56, N-9,34%;

mért C-60,19, H-6,42, N-9,77%.

(9) Molekulasúly, FAB-tömegspektrum alapján: m/z-1163,6 (M+H)\

HU 204 853 Β (10) Vékonyréteg-kromatogram

adszorbens	mozgófázis	Rrérték
szilikagéllemez	kloroform/metanol	0,50
(Merc Art 5715)	10:1 (térf.) etil-acetát	0,12

(11) Infravörös-spektrum: vS£=3350, 3020, 2950, 2920,2850,1730,1650,1520,1440,1360,1230,

1200,1160,1100,1060,1040,910 cm’¹.

(12) Kémiai jellege: semleges.

(13) ¹³C-mágneses magrezonancia-spektrum (100 MHz, CDCI3/CD3OH, 10:1) delta:

174,20 (s),	173,23 (s),
173,06 (s),	171,32 (s),
171,02 (s),	170,84 (s),
169,79(8),	169,59 (s),
169,55 (s),	168,52 (s),
167,03 (s),	166,36 (s),
151,02 (s),	140,74 (d),
138,82 (s),	138,74 (s),
137,12 (s),	135,23 (d),
133,75 (s),	131,31 (s),
130,20 (d),	129,96 (d)*2,
129,34 (d),	129,21 (d)»2,
128,56 (d)-2,	127,24 (d),
126,95 (d),	126,74 (d),
126,63 (d),	126,50 (d),
122,10 (d)-2,	121,29 (d),
70,99 (d),	69,22 (d),
63,73 (t),	58,13 (d),
56,10 (d),	53,22 (d),
52,66 (d),	52,18 (d),
49,93 (d),	39,75 (t),
39,39 (q),	39,06(t),
35,67 (t),	30,65 (t),
24,26 (d),	23,15 (q),
22,79(t),	21,42 (q),
21,21 (q),	20,99 (q),
20,83 (q),	17,05 (q),
16,18 (q),	13,82 (q).
A spektrum a 4. ábrán látható.
(14) Ή-mágneses magrezonancia-spektrum
(400 MHz, CDCI3/CD3OH, 10:1) delta:
8,25	(IH, d, J-8 Hz),
8,02	(IH, d, J-8 Hz),
7,88	(IH, d, J-16 Hz),
7,86	(IH, d, J-8 Hz),
7,70	(IH, d, J-6 Hz),
7,61	(IH, d, J-8 Hz),
7,45	(IH, d, J-7 Hz),
7,32-7,15	(6H,m),
7,03	(2H, d, J-8 Hz),
7,00-6,94	(3H,m),
6,88-6,79	(4H,m),
6,70	(1H,S),

6,49	(IH, d, J-12 Hz),
5,76	(lH,dt,J-12Hzés7,5Hz),
5,54	(IH, széles, s),
5,50-5,45	(2H,m),
4,93	(lH,m),
4,75	(lH,m),
4,65-4,56	(2H, m),
4,46	(IH, dd, J-6Hzés 11 Hz),
4,31	(IH, t,J-6Hz),
4,22	(lH,m),
4,18	(IH, dd, J-8 Hz és 11 Hz),
3,56	(3H,s),
2,90	(IH, dd, J-6 Hz és 16 Hz),
2,85-2,80	(2H, m),
2,56	(IH, dd, J-4Hzés 16 Hz),
2,26	(3H, s),
2,00	(3H, s),
1,96-1,89	(2H,m),
1,85	(3H,s),
1,58	(lH,m),
1,35	(3H, d, J=6Hz),
1,32-1,20	(3H,m),
1,07	(3H, d, J-6 Hz),
0,84	(lH,m),
0,72	(3H, d, J-6 Hz),
0,71	(3H, t, J-7,5 Hz),
0,65	(3H, d, J-6 Hz).

3. példa

500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 160 ml, alábbi összetételű inokulum-táptalajt sterilezőnk 120 °C hőmérsékleten 30 percen át 1% keményítő, 1% szacharóz, 1% glükóz, 1% gyapotmagliszt, 0,5% pepton, 0,5% szójaliszt, 0,2% kalcium-karbonát.

A táptalajt Streptomyces violaceoniger 9326 törzszsel oltjuk be egy ferde agárról kaccsal lekapart tenyészettel és 30 °C hőmérsékleten rázatjuk 3 napon át körkörös rázógépen 220 percenkénti fordulatszám és

5,1 cm-es kitérés mellett,

A fenti oltótenyészettel oltunk be 500 literes rozsdamentes acélfermentorban lévő 160 liter alábbi összetételű vizes táptalajt: 1% oldható keményítő, 1% szacharóz, 1% glükóz, 1% gyapotmagliszt, 0,5% pepton, 0,5% szójaliszt, 0,2% kalcium-karbonát, 0,07% Adekanol LG-109 (Asahi Denka Co.) habzásgátló és 0,05% Silikone KM70 (Shin-etsu Chemical Co.) habzásgátló, melyet 120 °C hőmérsékleten sterilezünk 30 percen át. A fermentációt 1 napon át végezzük 30 ’C hőmérsékleten percenként 160 liter levegővel történő levegőztetéssel, percenkénti 200 fordulatszámú kevertetés mellett.

A fenti tenyészet 60 literével oltunk be egy 4000 literes rozsdamentes acélfermentorban lévő alábbi összetételű táptalajt: 3% glicerin, 1% szójaliszt, 1% csirkehús-csontliszt, 0,2% kalcium-karbonát, 0,01% nátrium-jodid, 0,07% Adekanol LG-109 és 0,05% Silicone KM-70. A táptalajt előzőleg 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk 30 percen át. A fermentálást 30 ’C hőmérsékleten végezzük 3 napon át percenként 3000 literes levegőztetéssel és percenkénti 100 fordulatszámú kevertetés mellett.

HU 204 853 Β

A fermentáció nyomonkövetésére HPLC analízist használunk (Hitachi Model 655 pumpa). A kromatográfiás acéloszlop töltete fordított fázisú szilikagél („YMC-packed column R-ODS-5”, Yamamura Cheimical Institute); az áramlási sebesség: 1,0 ml/perc; az 5 eluens: 45% acetonitrilt tartalmazó vizes elegy. A HPLC vizsgálatokhoz a minta előkészítése: a fermentIémintához hozzáadunk azonos térfogatú acetont, erélyesen összerázzuk és hagyjuk állni egy órán át, majd centrifugáljuk. 5 pl felűlúszőt injektálunk a Hitachi 10 Model 655 készülékbe.

A kapott fermentlevet 15 kg diatómaföld (Perlite Topko # 34, Showa Chemical Industry Co., Ltd.) szűrési segédanyaggal együtt leszűrjük. A kiszúrt micéliumot 1600 liter etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot szűrjük. Az 14001 szűrletet 2001 aktív szénből (Sirasaki KL, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.) készült oszlopra viszszük. Az oszlopot 200 liter etil-acetáttal mossuk, majd etil-acetát/metanol, 5:1 arányú eleggyel eluálunk. Az aktív frakciókat (50-1030 liter) egyesítjük, és csökkentett nyomáson 45 literre töményítjük. Kevertetés mellett 120 1 n-hexánt adunk az oldathoz, szobahőmérsékleten hagyjuk állni egy órán át, majd 3 kg Silika # 600 (Chuo Silika Co., Ltd.) segédanyaggal együtt szúíjük. Akiszűrt anyagot 15 liter n-hexánnal mossuk, a kívánt anyagot 20 liter metanollal oldjuk le.

Az eluátumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Az 500 g bepárlási maradékot 4 liter metanol/ecetsav/diklőr-metán, 1:1:2 elegyben oldjuk és 70 liter Kieselgel 60,70-230 mesh szifikagélből készült oszlopra visszük. Az oszlopot 3,5 liter metanol/ecetsav/diklór-metán, 1:1:2 eleggyel és 25 liter diklórmetánnal kifejlesztjük, a kívánt anyagot diklőr-metán/metanol, 10:1 és diklőr-metán/metanol, 8:1 elegyekkel eluáljuk. Az aktív fázisokat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot 1 liter metanolban oldjuk és kevertetés mellett 9 liter acetonitrilt adunk az oldathoz. A keveréket hagyjuk szobahőmérsékleten állni egy Órán át, a csapadékot szűréssel összegyűjtjük. Ezt a lecsapási lépést háromszor megismételjük. Az így kapott csapadékot 1 liter acetonitrfilel mossuk, szárítjuk, 190 g WS-9326A terméket kapva fehér por alakjában. A lecsapási lépéseknél kapott szűrleteket egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk. A 11,7 g bepárlási maradékot 80%-os vizes metanolban oldjuk, az oldatot 300 ml térfogatú aktív szenes oszlopon engedjük át. Az oszlopot 6 liter 80%-os vizes metanollal mossuk és 6 liter metanollal eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A 3,4 g bepárlási maradékot 12 ml metanolban oldjuk, az oldatot fordított fázisú szilikagéloszlopra [YMC packed column R-354 S- 15/30 (OD), 050*300 mm«2; Yamamura Chemical Institute] visszük, amit 50%-os vizes acetonitrillel ekvilibráltatunk. Az oszlopot 50%-os vizes acetonitrillel fejlesztjük ki Waters HPLC System 500 készüléket használva. A WS- 9326B tennéket tartalmazó frakciókat (33,5 liter) egyesítjük és szárazra pároljuk, 790 mg WS-9326B terméket nyerve fehér por alakjában.

űr- 15

4. példa

100 mg WS-9326A1 ml piridinben készült oldatához hozzáadunk 0,01 ml ecetsavanhídridet és a reakciókeveréket szobahőmérsékleten hagyjuk állni egy éjszakán át. A reakciókeveiéket bepárolva, az olajos maradékot pieparatív vékonyréíeg-kromatográfíával tisztítjuk; eluens: kloroform/metanol, 9:1. A terméket dietil-éterben eldörzsölve, 55 mg monoacetil-WS-9326A-t kapunk színtelen por alakjában. Amonoacetíl-WS-9326Akémiai és fizikai tulajdonságai a következők:

(1) Megjelenés és szín: színtelen por.

(2) Képlett CjsHtoNsOm (3) Molekulasúly, FAB-tömegspektrum m/z-1079,4 (M+H)⁺.

(4) Vékonyréteg-kromatogram alapján:

adszorbens	mozgófázis	Rrérték
szilikagéllemez	kloroform/metanol	0,17
(Merck Art 5716) 10:1 (térf.)

(5) Infravörös elnyelési spektrum, v£S«3300, 2920,

1730,1650,1500,1360,1190,1170,910 cm⁴.

(6) Kémiai jelleg: semleges.

(7) Ή-mágneses magrezonancia-spektrum (400 MHz, CDCI3-CDOD, 5:1) - a spektrum a 8. ábrán látható.

5, példa

100 mg WS-9326A1 ml piridinben készült oldatához hozzáadunk 0,03 ml ecetsavanhídridet, és a reakciókeveréket szobahőmérsékleten hagyjuk állni egy éjszakán keresztül. Areakcíókeveréket bepároljuk, az olajos maradékot preparatív vékonyréteg- kromatográfiával tisztítjuk; eluens: kloroform/metanol, 9:1. 72 mg dlacetil-WS9326A terméket kapunk színtelen por alakjában. A díacetil-WS-9326A kémiai és fizikai tulajdonságai:

(1) Megjelenés és szín: színtelen por.

(2) Képlett CjgHnNgOtf (3) Molekulasúly, FAB-tömegspektrum alapján: m/z-1121,4 (M+H)⁺.

(4) Vékonyréteg-kromatogram:

adszorbens: szilikagéllemez (Merck Art 5715); eluens: kloroform/metanol, 10:1 (térf.);

Rrérték: 0,35 (5) Infravörös elnyelési spektrum: v^K-3300, 3020,

2950,1730,1650, 1520,1500,1360,1200, 1170,

1100,1040,980,910 cm⁴ (6) Kémiai jelleg: semleges.

(7) ¹H-mágneses magrezonancia-spektrum (400 MHz, CDCI3-CD3OD, 5:1) - a spektrum a 9. ábrán látható.

6. példa

1G0 mg WS-9326A-Í feloldunk 2 ml metanolban és az oldatot 25 mg palládiumkorom jelenlétében hidrogénezzük 1 atm hidrogéngáz nyomáson, szobahőmér60

HU 204 853 Β sékleten 4 órán át. A reakciókeveréket megszűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott terméket dietil-éterben eldöizsölve 92 mg tetrahidroWS- 9326A anyagot kapunk színtelen por alakjában. A tetrahidro-WS-9326A fizikai és kémiai tulajdonságai:

(1) Megjelenés és szín: színtelen por.

(2) Ultraibolya elnyelési spektrum, Ή^^Η· 287 nm (ε=13 000).

(3) Képlet: MvjNsOo (4) Molekulasúly, FAB-tömegspektroszkópia alapján: m/z-1041,6 (M+H)⁺.

(5) ^uC-mágneses magrezonancia-spektrum (100 MHz, CD₃OD); a spektrum a 10. ábrán látható.

(6) Ή-mágneses magrezonancia-spektrum (400 MHz, CD3OD); a spektrum all. ábrán látható.

7. példa

1100 mg tetrahidro-WS-9326A 10 ml piridinben készült oldatához hozzáadunk 3 ml ecetsavanhidridet és 3 mg 4-dimetil-amino-piridint. A reakciókeverékt szobahőmérsékleten hagyjuk állni egy éjszakán át. Az oldatot bepároljuk, az olajos maradékot szilikagéloszlopon tisztítjuk; eluens kloroform/metanol, 20:1. A kapott tiszta terméket dietil-éterben eldörzsölve 998 mg tetrahidro-triacetil-WS-9326A-t kapunk színtelen por alakjában. A tetrahidro-triacetilWS-9326A fizikai és kémiai tulajdonságai:

(1) Megjelenés és szín: színtelen por.

(2) Ultraibolya elnyelési spektrum, 280 nm (ε-13 000).

(3) Képlet: C6oH₇₈N₈O_ie (4) Elemanalízis a C6oH78N₈Oi6’H20 képlet alapján: számított: C-60,80, H-6,80, N-9,45%;

mért C=61,03, H=6,70, N=9,41%.

(5) Molekulasúly, FAB-tömegspektroszkópia alapján: m/z-1167,6 (M+H)⁺.

(6) ¹³C-mágneses magrezonancia-spektrum (100 MHz, CDCI3), delta:

173,30 (s),	129,23 (d),
172,96 (s),	128,95 (d)«2,
172,90 (s),	128,61 (d)«2,
172,81 (s),	128,52 (d),
170,87 (s),	126,80 (d),
170,56 (s),	126,07 (d),
170,50 (s),	126,01 (d),
169,46 (s),	125,85 (d),
169,16 (s),	121,87 (d)-2,
168,48 (s),	70,46 (d),
167,99(s),	69,10 (d),
165,52 (s),	63,32 (t),
150,70 (s),	58,28 (d),
140,84 (s),	56,19 (d),
138,93 (s),	52,63 (d),
138,58 (s),	52,07 (d),
136,83 (s),	51,63 (d),
131,04 (s),	49,23 (d),
129,71 (d)«2,	39,30 (t),

39,17 (q),	22,50(1),
38,31 (t),	21,46 (q),
36,52 (t),	21,00 (q),
35,22 (t),	20,74 (q),
32,60 (t),	20,63 (q),
31,77 (t),	16,77 (q),
30,74 (t),	16,22 (q),
27,66 (t),	13,97 (q),
.24,08 (d),
22,82 (q).
Ή-mágneses magrezonancia-spektrum
(400 MHz, CDC13) delta:
8,18	(IH, d, J-8 Hz),
7,66	(IH, d, J-8 Hz),
7,65	(IH, d, J-8 Hz),
7,29	(2H, d, J-8 Hz),
7,22	(IH, d, J-8 Hz),
7,15-7,02	(12H,m),
6,96	(IH, d, J-7 Hz),
6,67	(lH,s),
6,21	(IH, széles s),
5,51	(IH, széles s),
5,43	(lH,m),
5,36	(IH, széles, d, J-8 Hz),
4,85-4,75	(2H,m),
4,66-4,58	(2H,m),
4,40	(IH, dd, J-ll Hz és 6 Hz),
4,34	(lH,m),
4,23	(IH, dd, J-ll Hz és 9 Hz),
4,07	(lH,m),
3,53	(3H,s),
3,04-2,84	(5H, m),
2,75-2,50	(4H,m),
2,46	(IH, dd, J-16 Hz és 5 Hz),
2,28	(3H,s),
1,99	(3H,s),
1,87	(3H,s),
1,66-1,50	(3H, m),
1,37-1,27	(4H,m),
1,27	(3H, d, J-7 Hz),
1,19	(lH,m),
1,03	(3H, d, J-7 Hz),
0,88	(lH,m),
0,86	(3H, t, J-6 Hz),
0,72	(3H, d, J-6 Hz),
0,65	(3H, d, J-6 Hz).

8. példa

100 mg triacetil-WS-9326A-t feloldunk 3 ml metanolban és 35 mg palládiumkorom jelenlétében hidrogénezünk 1 atm. hidrogéngáz nyomás alatt, szobahőmérsékleten 3 órán keresztül.

A keveréket megszűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A bepárlási maradékot dietil-éterben eldörzsölve 90 mg terméket kapunk színtelen por alakjában. Ez a termék minden tekintetben azonos a 7. példa szerint kapott tetrahidro-triacetil-WS-9326A-val.

A fenti fizikai és kémiai tulajdonságok és a szerkezetükre irányuló további analízisek alapján a triacetil15

I

HU 204 853 Β

WS-9326A, a monoacetil-WS-9326A, a diacetil-WS9326A, a tetrahidro-WS-9326A és a tetrahidro-triacetil-WS-9326A anyagok a (XIV), (XV), (XVI), (XVII), illetve (XVIII) képletekkel írhatók le.

9. példa

A reakciőfolyamatot a 26. ábrán láthatjuk. 3,24 g kiindulási anyagot (XIX) feloldunk 1000 ml diklór-metánban és hozzáadunk 300 μΐ trietil-amint és 6,17 g l-etoxi-karbonil-2-etoxí-l ,2-dihidrokinolint Szobahő mérsékleten kevertejük 24 órán át, majd az oldószert lepároljuk. A maradékhoz kloroformot adunk, a kloroformos oldatot vízzel, 1 n sósavval, vízzel, nátriumhidrogén-karbonát telített vizes oldatával, végül vízzel mossuk. Magnézium-szulfáttal szárítunk, szűrünk és a szűrietból az oldószert lepároljuk. A maradékot „Iober” oszlopon (C méretű) kromatografáljuk, 3% metanolt tartalmazó kloroformmal eluálva. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat bepároljuk, 1,06 g (XX) kívánt terméket nyerve.

[a]jf= -95,3’ (c=0,33, kloroform).

IR (CHCI3): 1660,1600,1510 cm'¹.

NMR (CDCI3), delta: 0,88 (3H, d, J-6 Hz), 0,93 (3H, d, J-6 Hz), 1,09 (3H, d, J-6,5 Hz), 1,37 (3H, d, J=6,5 Hz), 2,82 (3H, s), 3,87 (2H, s), 6,93 (2H, d, J-8 Hz).

10. példa

A reakciőfolyamat a 27. ábrán látható.

mg kiindulási anyag (XXI) 4 ml diklór-metán és 0,1 m Ν,Ν-dimetil-formamid elegyében készült oldatához hozzáadunk 20,4 mg N-hidroxl-szukcinimidet és

8,2 mg vízoldékony karbodiimid-hidrokloridot órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, másfél óránként 4 mg karbodiimid-hidrokloridot adunk a keverékhez, amíg a kiindulási anyag el nem tűnik.

Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot 10 ml etil-acetátban oldjuk, híg sósavval és vízzel mossuk.

Magnézium-szulfáttal való szárítás után az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, a maradékot 1 ml trifluor-ecetsav 0,1 ml anizol elegyében oldjuk.

Szobahőmérsékleten kevertetünk 30 percen keresztül, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A bepárlási maradékot 2 ml NN-dimetil-formamidban oldjuk és hozzáadunk 40 ml piridint.

órás, szobahőmérsékleten történő kevertetés után az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot vékonyréteg-kromatográfíával tisztítjuk (Merck 5744, eluens: klorofoim/metanol, 10:1). 15,2 mg (ΧΠ) terméket kapunk.

IR(KBr): 1635,1510 cm'¹.

NMR (CD3OD) delta: 6,24 (IH, s).

[a]2P« +18,0° (c-0,1, metanol).

11. példa

A reakciőfolyamat a 28. ábrán látható.

240 mg (XXIII) kiindulási anyagot palládium jelenlétében hidrogénezünk 10 ml hangyasav/metanol, 1:24 elegyében, 0,028 bar (4 psi) nyomáson 7 órán keresztül. A keverék leszűrése után a szűrletet bepárolva 140 mg (XXIV) vegyülethez jutunk.

IR (KBr): 1730,1650,1510 cm'¹.

[a]#«21,04’ (o0,l, metanol).

12. példa

A reakciófolyamat a 29. ábrán látható.

Nitrogéngáz alatt 22 mg (ΧΧΠ) kiindulási anyagot feloldunk 0,8 ml hidrogén-fluorid/piridin elegyben, ő- 10 melyhez 0,2 ml anizolt adunk. Egy órán át kevertetjük a reakcióelegyet szobahőmérsékleten, majd néhány darab jeget teszünk hozzá, és az oldat kémhatását nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldattal beállítjuk pH>=8 értékre. A reakciókeveréket 10 ml térfogatú Diaion 15 HP-20 oszlopra visszük, majd vízzel mossuk az oszlopot. A kívánt terméket metanollal eluáljuk és vékonyréteg-kromatográfíával tisztítjuk Merck 5715 lemezen, eluensként kloroform/metanol/víz, 3:1:0,1 (téri.) elegyet használva. 13,0 mg (XXVI) vegyületet kapunk.

IR (KBr): 1635,1510 cm'¹.

NMR (CD3OD), delta: 7,05 (IH, s).

[αβ°= -90,6’ (¢=0,1, metanol).

VRK: Rf-0,35 (Merck 5715, kloroform/metanol/víz, 3:1:0,1).

13. példa

A reakciőfolyamat a 30. ábrán látható.

6,0 mg (XXVI) kiindulási anyag 1,5 ml diklór-metánban készült oldatához, mely tartalmaz 30 gl 30 bisz(dimetil-szilil)-acetamidot és 0,3 ml N,N-dimetilformamidot is, hozzáadunk a (XXVII) kiindulási anyag 0,02 M oldatából 0,5 ml-t Egy órás, szobahőmérsékleten történő kevertetés után 0,1 mg dimetilamino-piridint adunk a reakciókeverékhez. A 35 (XXVII) kiindulási anyagból 30 percenként adunk a reakciókeverékhez, amíg a (XXVI) kiindulási anyag el nem tűnik. Híg sósavat adunk az oldathoz és a szerves fázist vízzel mossuk. Csökkentett nyomáson történő bepárlás után a bepárlási maradékot prepara40 tív vékonyréteg-kromatográfíával tisztítjuk Merck 5715 lemezen, eluensként klorofoim/metanol/víz, 65:25:4 (térf.) rendszert használva. 92 mg (XXVIII) vegyülethez jutunk.

Ez a termék azonos az 1. példában leírtak szerint 45 kapott WS-9326A vegyülettel.

14. példa

Areakciófolyamatot a 31. ábra mutatja.

mg (XXVI) kiindulási anyag 1 ml piridinben 50 készült oldatához hozzáadunk a (XXVII) kiindulási anyag 0,02 M diklór-metános oldatából 0,6 ml-t. Miután egy órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, a (XXVII) kiindulási anyagból óránként adunk a reakciőkeverékhez, amíg a (XXVI) kiindulási anyag el nem 55 tűnik. 2 ml metanolt adunk a reakciókeverékhez, és az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A bepárlási maradékot 10 ml etil-acetátban oldjuk, híg sósavval, majd vízzel mossuk. Miután az oldatot magnéziumszulfát felett megszárítjuk, az oldószert csökkentett 60 nyomáson eltávolítjuk. A bepárlási maradékot prepa20

HU 204 853 Β ratív vékonyréteg-kromatográfiával tisztítjuk Merck 5715 lemezen, eluensként kloroform/metanol/víz, 3:1:0,1 (térf.) elegyet használva. 2,0 mg (XXIX) vegyületet nyerünk.

IR(KBr): 1640,1510 cm⁴.

15. példa

Areakciőfolyamatot a 32. ábra mutatja.

49,7 mg (XXIV) kiindulási anyag 1 ml piridinben készült oldatához nitrogéngáz alatt hozzáadunk a (XXVII) kiindulási anyag 0,1 M diklór-metános oldatából 1(2 ml-t és szobahőmérsékleten ke vertetünk 3,5 órán át. A reakciókeverékhez etil-acetátot adunk és a reakciókeveréket vízzel, 7%-os ecetsavval, vízzel, majd nátrium-klorid telített vizes oldatával mossuk. Magnézium-szulfátos szárítás után szűrünk, az oldószert lepároljuk és a bepárlási maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával tisztítjuk (0,5 mm*2), eluensként 20% metanolt tartalmazó kloroformot használva. 20,6 mg (XXX) vegyületet kapunk. Ez a vegyület azonos a 3. példában leírtak szerint előállított WS-9326B-vei.

16. példa

A 15. példában leírtak szerint az alábbi vegyűleteket állíthatjuk elő:

(XXXI) vegyület [a]y- -45,8° (c-0,74, metanol).

Op.: 176-178 ’C.

VRK: Rf-0,48 (Merck 5715, kloroform/metanol, 5:1).

IR (KBr)-1720 (váll), 1655,1640 cm⁴.

(XXXII) vegyület [a]??» -16,8° (c-0,73, metanol).

Op.: 160-163 ’C.

VRK: Rf-0,24 (Merck 5715, kloroform/metanol, 5:1).

IR (KBr): 1720 (váll), 1650 cm⁴.

(ΧΧΧΙΠ) vegyület [a]B^l= -37,4° (c=0,72, metanol).

Op.: 231-233 ’C.

VRK: Rf=0,41 (Merck 5715, kloroform/metanol, 5:1)

IR (KBr): 1720 (váll), 1650 cm⁴.

17. példa

A reakciófolyamat a 33. ábrán látható.

100 mg (XXXIV) kiindulási anyag 1 ml piridinben készült oldatához hozzáadunk 11 μΐ ecetsavanhidridet és a reakciókeveréket hagyjuk állni egy éjszakán át szobahőmérsékleten.

A reakciókeveréket bepároljuk, az olajos maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával (eluens: kloroform/metanol, 9:1) tisztítva 52 mg (XXXV) terméket nyerünk.

VRK: Rf-0,17 (Merck 5715 lemez, kloroform/metanol, 10:1).

IR (Nujol): 3300, 1760, 1730, 1650, 1530, 1510,

1200,1160,1070,910 cm⁴.

18. példa

A reakciófolyamat a 34. ábrán látható.

100 mg (XXXIV) kiindulási anyag 1 ml piridinben készült oldatához hozzáadunk 25 μΐ ecetsavanhidridet és a keveréket hagyjuk egy éjszakán keresztül állni szobahőmérsékleten.

A reakciókeveréket bepároljuk, az olajos maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával (kloroform/metanol, 9:1) tisztítva 78 mg (XXXVII) terméket kapunk.

VRK: Rf=0,36 (Merck 5715 lemez, kloroform/metanol, 10:1).

IR (Nujol): 3300, 1740, 1650, 1540, 1510, 1300, 1220,1200,1170,1050,920 cm⁴.

19. példa

A reakciófolyamatot a 35. ábra mutatja.

0,21 g (XXXVI) kiindulási anyag 3 ml metanolban készült oldatához hozzáadunk 3 ml dietil-éteres diazometán oldatot. 5 perces kevertetés után az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A bepárlási maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával (Merck 5744 lemez, eluens 20% metanolt tartalmazó kloroform) tisztítva 45 mg (XXXVIII) terméket kapunk.

IR (Nujol): 3300,1730,1645,1530,1510 cm⁴.

20. példa

A reakciófolyamat a 36. ábrán látható.

1,0 g (XXXVI) kiindulási anyag 15 ml metanolban készült oldatához hozzáadunk 5 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatot 0 ’C hőmérsékleten. Egy órás kevertetés után 5 ml 1 n sósavat adunk az oldathoz. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot 20 ml etil-acetát és 30 ml hígított sósavkeverékben oldjuk. A szerves fázist sóoldattal mossuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A nyert szilárd anyagot etil-acetáttal mossuk, 0,95 g (XXXIX) terméket kapva.

IR (Nujol): 3300,1710 (váll), 1645,1510 cm⁴.

21. példa

A reakciófolyamat a 37. ábrán látható.

1,0 g (XL) kiindulási anyag 2 ml metanol és 20 ml etilacetát elegyében készült oldatához hozzáadunk 2 ml 10%-os trimetil-szilil-diazometán n-hexános oldatot. 5 perces kevertetés után az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A bepárlási maradékot 20 g-os szilikagéloszlopra (Merck 7734) visszük és kloroform/metanol, 10:1 eleggyel eluálunk, 0,55 g (XLI) vegyületet nyerve,

IR (Nujol): 3300,1735,1645,1530,1510 cm⁴.

22. példa

A14. példában leírtak szerint állítjuk elő a (XXXIV) vegyületet.

Molekulasúly a FAB-tömegspektrum szerint: m/z-1041,6 (M+H)⁺.

23. példa

A reakciófolyamat a 38. ábrán látható.

2,53 g (XLII) kiindulási anyag 10 ml metanol és 3 ml víz elegyében készült oldatához hozzáadunk 1,63 g cérium-karbonátot.

Az oldószert lepárolva a maradékot N,N-dimetilformamidban oldjuk és a reakciókeverékhez 1,92 g fenacil-bromidot adunk. A reakcíókeveréket 30 percen át kevertetjük szobahőmérsékleten. Az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és viszel mossuk. Magnézium-szulfátos szárítás és szűrés után az oldószert lepároljuk 3,7 g kristályos (XLIH) 5 terméket nyerve, [a]2P= -20,3’ (ol, kloroform).

IR (Nujol): 1745,1690,1545 cm'¹.

24. példa 10

A reakciófolyamat a 39. ábrán látható.

1,48 g (XLHI) kiindulási anyag és 2,5 g (XLIV) kiindulási anyag 80 ml diklór-metánban készült oldatához hozzáadunk 0 °C hőmérsékleten 0,764 g l-etíI-3(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot és 15 0,488 g 4-dimetil-amino-piridint. 6 órás kevertetés után az oldószert lepároljuk.

A bepáríási maradékot etil-acetátban oldjuk és az oldatot vízzel, 1 n sósavval, nátrium-hidrogén-karbonát telített vizes oldatával és vízzel mossuk. 20

Magnézium-szulfáttal való szárítás és szűrés után az oldószert lepároljuk. 2,58 g (XLIVa) vegyületet nyerve.

[a]r?- +9,76° (c-0,3, kloroform).

IR (CHCb): 1755,1720,1705,1505 cm'¹. 25

NMR (CDClj), delta: 1,37 (3H, d, J-6 Hz), 1,45 (9H, s), 3,70 (1H, m), 3,88 (1H, m), 4,52 (2H, m), 4,23 (1H, m), 5,17 (2H, s), 5,37 (2H, s).

25. példa 30

A reakciófolyamat a 40. ábrán látható.

A (XLIVa) kiindulási anyag 100 ml 90%-os vizes ecetsavas oldatához kevertetés mellett hozzáadunk 11 g cinkport és a reakcíókeveréket jeges hűtés mellettkevertetjük 1 órán át, majd szobahőmérsékleten 2 órán keresztül. 35

A reakcíókeveréket leszűrjük, a szűrietet betöményítjük citromsavval, a kémhatását pH=2 értékre állítjuk be, majd etil-acetáttal extrahálunk.

Az extraktumot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, az oldószert bepároljuk. A maradékot petrolé- 40 térrel mossuk, 5,4 g (XLV) terméket kapva.

NMR (CDClj), delta: 1,30 (3H, d, J=6 Hz), 1,40 (9H, s), 3,60 (1H, m), 3,82 (1H, m).

26. példa 45

A reakciófolyamat a 41. ábrán látható.

7,7 g (XLVI) kiindulási anyag 60 ml diklór-metánban készült oldatához hozzáadunk kevertetés mellett, ’C hőmérsékleten 2,105 ml 2,2,2-triklór-etanolt,

4,2 g l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid- 50 hidrokloridot és 244 mg 4-dimetil-amino-piridint. A reakciókeveréket 1 órán át kevertetjük 0 ’C hőmérsékleten, majd bepároljuk. A bepáríási maradékot etil-acetátban oldjuk, vízzel, 1 n sósavval, vízzel, majd nátrium-hidrogén-karbonát telített vizes oldatá- 55 val mossuk az oldatot.

Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és bepárolva 9,37 g (XLVII) termékhez jutunk.

[a]J?- -29,84’ (c-0,4, kloroform).

IR (CHClj): 1755,1690,1610,1510 cm’¹. 60

27. példa

A reakciófolyamat a 42. ábrán látható.

9,3 g (XLVII) kiindulási anyagot 0 ’C hőmérsékletre hűtünk és hozzáadjuk 15 ml trifluor-ecetsavhoz.

A reakciókeveréket 30 percen át keverjük 0 ’C hőmérsékleten, majd bepároljuk. A bepáríási maradékot etil-acetátban oldjuk, vízzel, nátrium-hidrogén-karbonát telített vizes oldatával és vízzel mossuk. Magnézium-szulfáttal való szárítás és szűrés után az oldószert lepároljuk, 6 g (XLVHI) terméket nyerve,

NMR (CDClj) delta: 2,45 (3H, s), 3,03 (2H, m), 3,62 (1H, t, J-7 Hz), 4,75 (2H, m), 5,06 (2H, s), 6,94 (2H,d, J=8 Hz), 7,15 (2H, d, J-8 Hz), 7,3-7,5 (5H,m).

28. példa

A reakciófolyamat a 43. ábrán látható.

4,07 g (XLV) kiindulási anyag 40 ml diklór-metánban készült oldatához hozzáadunk 2,8 g 1-etoxi-karbonil-2-etoxi-l,2-dihidro-kinolint és a reakciókeveréket 24 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten. Az oldószert lepároljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk, 1 n sósavval, vízzel, nátrium-hidrogén-karbonát telített vizes oldatával és vízzel mossuk.

Magnézium-szulfáttal szárítjuk az oldatot, szűrünk, az oldószert lepárolva 4,35 g (L) termékhez jutunk.

[a]2P- -27,88’ (c-0,12, kloroform).

IR (kloroform): 1750,1710,1655,1510 cm’¹.

NMR (CDClj) delta: 1,18 (3H, d, J-6 Hz), 1,36 (9H, s), 2,29 (3H, s), 4,69 (2H, s), 4,91 (2H, s), 5,01 (2H, s), 6,80 (2H, d, J-8 Hz), 7,02 (2H, d, J-8 Hz).

29. példa

A reakciófolyamat a 44. ábrán látható.

4,35 g (L) kiindulási anyagot 0 ’C hőmérsékletre hűtünk és hozzáadjuk 20 ml trifluor-ecetsavhoz. 45 percen át kevertetjük a reakciókeveréket 0 ’C hőmérsékleten, majd bepároljuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk, nátrium-hidrogén-karbonát telített vizes oldatával és vízzel mossuk. Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és bepároljuk. A maradékot 100 ml diklór-metánban oldjuk.

Az oldathoz hozzáadunk 1,2 g Boc-Asn-t, 990 mg l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidro45 kloridot és 700 mg 1-hidro-benzo-triazolt. A reakciókeveréket 4 órán át kevertetjük 0 ’C hőmérsékleten, 1 n sósavval, vízzel, nátrium-hidrogén-karbonát telített vizes oldatával, végül vízzel mossuk, az oldószert lepárolva, 4,75 g (LI) terméketkapunk.

[a]g>« -15,7° (c-0,1, kloroform).

IR(KBr): 1740,1690,1645,1510 cm’¹.

NMR (CDClj) delta: 1,25 (3H, d, J-6 Hz), 1,43 (9H, s), 3,00 (3H, s), 2,55 (1H, m), 2,80 (1H, m), 3,05 (1H, m), 3,37 (1H, m), 3,62 (1H, m), 3,82 (1H, m),

6,88 (2H, d, J-8,5 Hz), 7,09 (2H, d, J-8,5 Hz).

30. példa

Areakciófolyamat a 45. ábrán látható.

A 28. példában leírtak szerint állítjuk elő a (LH) 30 vegyületet a (LI) kiindulási vegyületből.

HU 204 853 Β [α]£- -13,04’ (c=0,ll, CHCb).

IR(KBr): 1740,1700,1655,1510 cm¹.

NMR (CDCb) delta: 1,18, 1,27 (mindegyik 3H, d,

J=6 Hz), 1,43 (9H, s), 2,52 (IH, m), 2,80 (IH, m), 3,00 (3H, s), 3,36 (IH, m), 4,99 (2H,s), 6,87 (2H, d, J-8 Hz), 7,10 (2H, d, J-8 Hz).

31. példa

A reakciófolyamat a 46. ábrán látható.

A 28. példában leírtak szerint állítjuk elő a (Lili) kívánt vegyületet a (LII) kiindulási anyagból.

[a]y= -15,19’ (c-0,1, CHCb).

IR (KBr): 1740,1650,1635,1510 cm⁴.

NMR (CDCb) delta: 1,11 (3H, d, J=6 Hz), 1,27 (3H, d, J-6 Hz), 1,33 (9H, s), 3,01 (3H, s), 4,72 (2H, s), 4,98 (2H, s), 6,87 (2H, d, J=8 Hz), 7,10 (2H, d, J=8 Hz).

32. példa

A reakciófolyamat a 47. ábrán látható.

A 28. példában leírtak szerint állítjuk elő a (LV) vegyületet a (LIV) kündulási vegyületből.

[a$- -19,07’ (c-0,1, CHCb).

IR (KBr): 1740,1635,1510 cm⁴.

NMR (CDCb) delta: 0,81 (6H, m), 1,13,1,28 (mindegyik 3H, d, J-6 Hz), 1,40 (9H, s), 3,02 (3H, s), 4,96 (2H, s), 6,87,7,09 (mindegyik 2H, d, J-8 Hz).

33. példa

A reakciófolyamat a 48. ábrán látható.

4,2 g (LV) kiindulási anyag 80 ml 90%-os vizes ecetsavban készült oldatához 0 ’C hőmérsékleten hozzáadunk 9 g cinkport, és a reakciókeveréket 0 ’C hőmérsékleten kevertetjük 2 órán át, majd szobahőmérsékleten 1 órán át.

A reakciókeveréket leszűrjük, a szűrletet bepároljuk, a maradékhoz kloroformot adunk és 1 n sósavval, majd vízzel mossuk.

Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, az oldószert lepároljuk, a maradékot 150 g szilikagélből készült oszlopra visszük, az elúciót 2% metanolt tartalmazó kloroformmal, majd 8% metanolt tartalmazó kloroformmal végezzük.

A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat bepárolva 3,4 g (LVI) termékhez jutunk.

[a]Í^l- -23,42° (c-0,1, metanol).

IR (KBr): 1635,1510 cm⁴.

34. példa

A reakciófolyamat a 49. ábrán látható.

3,4 g (LVI) kiindulási anyagot 0 ’C hőmérsékletre hűtünk és 20 ml trifluor-ecetsavhoz adjuk.

Miután a reakciókeveréket 1 órán át 0 ’C hőmérsékleten kevertettük, bepároljuk, a maradékot sósavas dioxánban oldjuk és bepároljuk. A bepárlási maradékot kloroformban oldjuk és vízzel mossuk. Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és bepárolva 3,27 g (LVII) terméket kapunk.

[a]?,¹- -18,87’ (c-0,12, metanol).

IR(KBr): 1650,1510 cm⁴.

35. példa

26,8 g kálium-hidroxid 500 ml etanolban készült oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 14,6 g glicint és 48,5 g 4-metoxi-metoxi-benzaldehidet. A reakciókeveréket 19 órán át kevertetjük, az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A bepárlási maradékot vízben oldjuk és az oldatot sósavval megsavanyítjuk. Az oldatot etil-acetáttal mossuk, majd a kémhatását nátrium-hidrogén-karbonáttal pH=6,0 értékre állítjuk be. Fehér csapadék válik ki, amit összegyűjtve 9,2 g o-metoxi-metil-P-hidroxi-tirozint kapunk.

Op.: 164-166 ’C.

IR (KBr): 1610 cm⁴.

36. példa

21,0 g o-metoxi-metil-3-hidroxi-tirozin 250 ml 1 n nátrium-hidroxid-oldatban készült oldatához hozzáadunk 165 g dimetil-szulfátot. Miután 90 ’C hőmérsékleten kevertettük 20 percen át, az oldatot jeges fürdőben híg sósavval megsavanyítjuk. A savas oldatot dietil-éterrel mossuk, a kémhatását 1 n nátrium-hidroxid-oldattal pH=6,0 értékre állítjuk be, Bepárlás után a kivált szilárd anyagot szűréssel összegyűjtve 5,2 g o-metoxi-metil-Nmetil-3-hidroxi-tirozint kapunk.

Op.: 177-178 ’C.

IR(KBr): 3100,1600 cm⁴.

37. példa

15,1 g o-metoxi-metil-N-metil-P-hidroxi-tirozin és 25 ml bisz(trimetil-szilil)-acetamid 150 ml diklór-metánban készített oldatához hozzáadjuk 11,2 g 2-nitro-fenilszulfenil-klorid 50 ml diklór-metánban készült oldatát. 2 órán át kevertetünk 0 ’C hőmérsékleten, majd 10 ml bisz(trimetil-szilil)-acetamidot és 5,6 g 2-nitro-fenil-szulfenil-kloridot adunk az oldathoz. A reakciókeveréket szobahőmérsékleten kevertetjük 3 órán át és hozzáadunk 200 ml 1 n nátrium-hidroxidot. A szerves fázist 300 ml vízzel mossuk, a vizes oldatokat egyesítjük. A vizes oldatot híg sósavval megsavanyítjuk, 300 ml etil-acetáttal extrahálunk, az extraktumot 3*100 ml vízzel mossuk. Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, az oldószert csökkentett nyomáson lepárolva 205 g o-metoxi-metilN-metil-(2-nitro-fenil-tio)-P-hidroxi-tirozint kapunk.

Op.: 59-60 ’C.

IR(KBr): 3400,1700 cm⁴.

38. példa

20,0 g o-metoxi-metil-N-metil-N-(2-nitro-fenil-tio)β-hidroxi-tirozin 100 ml etil-acetátban készült oldatához hozzáadunk 80 ml diazometán dietil-éteres oldatot. 10 perces kevertetés után az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, a maradékot 500 g szilikagélből (Merck 7734) készült oszlopra visszük és kloroformmal eluálunk, o-metoxi-metil-N-metil-N-(2-nitro-feniltio)-3-hidroxi-tirozin-metil-észtert kapva, 8,82 g tieoés 6,63 g eritro-izomer alakjában.

Treo-izomer

IR (film): 3500,2950,1735 cm⁴.

VRK (Merck 5717 lemez, etil-acetát/n-hexán, 1:1): Rí-0,40.

HU 204853 Β

Eritro-izomer

IR (film): 3500,2950,1735 cm'¹.

VRK (Merck 5715 lemez, etil-acetát/n-hexán, 1:1): Rf=0,31.

39. példa

3,85 g o-metoxi-metiI-N-metiI-N-(2-nitro-feniI-tio)β-hidroxi-tirozin-metil-észter eritro-izomer 30 ml di-klór metánban készült oldatához hozzáadunk 1,38 g trietilamint, 0,45 g 4-dimetil-amino-piridint és 1,92 g benzoil- 10 kloridot 16 órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, majd 3,3 g 3-dimetil-amino-propil-amint adunk areakciókeverékfiez és az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot 30 ml etil-acetátban oldjuk, hígított sósavval, nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával és 15 vízzel mossuk. Bepárlás után kapott maradékot 150 g szilikagélből (Merck 7734) készült oszlopra visszük és nhexán/etil-acetát, 5:2 (térf.) eleggyel eluálva, 4,49 g ometoxi-metil-N-metil-N-(2-nitro-fenil-tio)-p-benzoiloxi-tirozin-metil-észter, eritro-izomert kapunk. 20

IR (film): 2950,1740 cm⁴.

VRK (Merck Art 5715 lemez, etil-acetát/n-hexán,

1:2): Rr-0,23.

40. példa 25

Az o-metoxi-N-metil-N-(2-nitro-fenil-tio)^-benzoil-oxi-tirozin-metil-észter, treo-izomer előállítása a 38. példában leírtak szerint történik.

Op.: 114-115 ’C.

IR (CHCb) delta: 2950,1740 cm⁴. 30

VRK (Merck Art 5715, etil-acetát/n-hexán, 1:2), Rí=0,26.

41. példa

4,94 g o-metoxi-metiI-N-metil-N-(2-nitro-fenil-tio)- 35 β-benzoil-oxi-tirozin-metil-észter treo-izomer 50 ml diklór-metánban készült oldatához 0 ’C hőmérsékleten hozzáadunk 4,8 ml tiofenolt és 2,5 ml trifluor-ecetsavat. 30 percen át kevertetjük, utána nátrium-hidrogén-karbonát oldatát adjuk a reakciőelegyhez. A szer- 40 vés fázist nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával és sóoldattal mossuk. Bepárlás után a maradékot 100 g szilikagélből (Merck 7734) készült oszlopra visszük és 5% metanolt tartalmazó kloroformmal eluálunk, 0,32 g o-metoxi-metÍl-N-metil-P-benzoil-oxi-tirozin-metil- 45 j észter, treo-izomert nyerve. ;

VRK (Merck Art 5715, etil-acetát/n-hexán, 1:1), «

Rí=0,31. i t

42. példa 50 '

Az o-metoxi-metil-N-metil-P-benzoil-oxi-tirozin- a metil-észter, eritro-izomert a 40. példában leírtak szerint állítjuk elő.

VRK (Merck Art 5715, etil-acetát/n-hexán, 1:1), Rf=0,25. 55

43. példa

3,7 g N-benzil-oxi-karbonil-L-treonin és 3,11 g o-me- 4 toxi-metil-N-metil-P-benzoil-oxi-tírozin-metii-észter k treo-izomer 50 ml diklór-metánban készült oldatához 60 o hozzáadunk 2,9 g l,2-dihidro-2-etoxi-I-kinolin-kaiboxilátot. 20 órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, majd : az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 50 ml etil-acetátban oldjuk, híg sósavval, nátrium5 hidrogén-karbonát vizes oldatóval és vízzel mossuk. Bepárlás utón a maradékot 100 g szilikagélből (Merck 7734) készült oszlopra visszük és n-hexán/etil-acetót, 1:1 r (térf.) eleggyel eluálva 2,04 g N-(N-benzil-oxi-karbonilΕ-1ΐΒοηί1)-ο-ιηβΐοχί^βίϋ-Ν-ηκίΐ1-β-0βηζοΠ-οχχ-ίίιοζίη• 10 metil-észter, treo-izomert kapunk.

, IR (film): 3400,2950,1740 (váll), 1720 cm⁴.

VRK (Merck Art 5715, metanol/kloroform, 3:97), Rf=0,36.

; 15 44. példa

A 42. példában leírtak szerint állítjuk elő az N-(Nbenzil-oxi-karbonil-L-treonil)-o-metoxi-metil-N-metil-P -benzoil-oxi-tirozin-metil-észter, eritro-izomert

IR (film): 2950,1740,1730 (váll) cm⁴.

VRK (Merck Art 5715, etil-acetót/n-hexán, 1:2), Rí-0,23.

45. példa

1,20 g 3-benzoil-oxi-N-(N-benzil-oxi-karbonil-L25 treonil)-o-metoxi-metil-N-metiI-tirozin-metil-észíer, treo-izomer 20 ml toluolban készült oldatához hozzáadunk 0,30 g 1,8 diaza-biciklo[5.4.0]undec-7-ént. Fél órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, majd 10 ml 7%-os sósavat adunk a reakciókeverékhez. A szerves 30 fázist vízzel és nátrium-hidrogén- karbonát vizes oldatával mossuk, magnézium-szulfáttal szárítjuk, az oldószert lepárolva 0,95 g (LVIII) tennéket kapunk.

IR (film): 3400,2950,1720 cm⁴.

[a]??- -7,7’ (c-0,64, metanol).

A (LVIII) termékhez hozzájuthatunk úgy is, ha a βbenzoiI-oxi-N-(N-benziI-oxi-karbonil-L-treonil)-o-metoxi-metil-N-metil-tirozin-metil-észter, treo-izomer helyett eritro-izomeiből indulunk ki.

46. példa

A reakciófolyamat az 50. ábrán látható.

1,0 g (LVIII) kiindulási anyag 10 ml Ν,Ν-dimetilformamidban készült oldatához 0,75 g terc-butil-dimetil-szilil-kloridot és 0,34 g imidazolt adunk. Szobahő45 mérsékleten kevertetünk 16 órán át, majd hozzáadunk 30 ml etil-acetátot és 50 g jeget. A szerves fázist híg sósavval, nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával és vízzel mossuk. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot 30 g szilikagélből (Merck 50 7734) készült oszlopra visszük és kloroformmal eluálva 1,21 g (LIX) tennéket nyerünk.

IR (film): 2950,1720 cm⁴.

[a]i²- -55,9’ (c=0,56, metanol).

47. példa

A reakciófolyamat az 51. ábrán látható.

0,95 g (LK) kiindulási anyag oldatához hozzáadjuk

4,8 ml 1 n nátrium-hidroxid vizes oldatát. Két napon keresztül kevertetünk 30 ’C hőmérsékleten, majd az 30 oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A mara20

HU 204 853 B dékot 20 ml etil-acetátban oldjuk, híg sósavval és vízzel mossuk. Az oldatot bepárolva 0,81 g (LX) vegyületet kapunk.

IR (film): 3300,2950,1720,1700 (váll) cm·’.

[ct]2?= -82,9° (c=l,06, metanol).

48. példa

A reakciófolyamat az 52. ábrán látható.

1,60 g (LX) kiindulási anyag és 5,50 (LXI) kiindulási anyag 50 ml diklór-metánban készült keverékéhez hozzáadunk 3,04 g l,2-dihidro-2-etoxi-l-kinolin-karboxilátot. 15 órán át kevertetjük a reakciókeveréket szobahőmérsékleten, a fehér szilárd anyagot kiszűrjük és a szűrlethez hozzáadunk 2,23 g (LXI) kiindulási anyagot, 0,50 g trietil-amin és 1,24 g etil-1,2-dihidro-2etoxi-l-kinolin-karboxilátot. A reakciókeveréket 18 órán keresztül kevertetjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, A maradékot 50 ml etil-aceátban oldjuk, híg sósavval, nátrium- hidrogén-karbonát vizes oldatával és vízzel mossuk. Csökkentett nyomáson bepárolva az oldatot, a maradékot 100 g szilikagélböl (Merck 7734) készült oszlopra visszük és n-hexán/etil-acetát, 2:1 (térf.) eleggyel eluálunk, 0,87 g (LXII) terméket nyerve.

IR (film): 2950,1760,1740 (váll), 1720,1660 cm⁴.

[<x]g>- -31,5’ (c-1,07, metanol).

49. példa

A reakciófolyamat az 53. ábrán látható.

0,85 g (LXII) kiindulási anyag 100 ml toluolban és 10 ml acetonban készült oldatát ultraibolya-lámpával (100 V) sugározzuk be 1,5 órán át, 0 ’C hőmérsékleten. Az oldatot bepárolva a maradékot 50 g szilikagélből (Merck 7734) készült oszlopra visszük, és n-hexán/etilacetát, 2:1 (térf.) eleggyel eluálunk, 0,18 g (LXIII) terméket nyerve.

VRK (Merck Art 5715, n-hexán/etil-acetát, 2:1), Rf=0,22.

IR (KBr): 3300,1740 (váll) 1640 cm⁴.

50. példa

A reakciófolyamat az 54. ábrán látható.

0,17 g (LXIII) kiindulási anyagot feloldunk 10 ml 67%-os vizes ecetsavban. 28 órán át kevertetjük 25 ’C hőmérsékleten, az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A maradékot 20 ml etil-acetátban oldjuk, az oldatot nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával és vízzel mossuk.

Betöményítés után a maradékot n-hexánnal mossuk és az oldószert csökkentett nyomáson lepárolva 0,15 g (LXIV) terméket kapunk.

IR (KBr): 3250,1740 (váll), 1635 cm⁴.

VRK (Merck Art 5715, n-hexán/etil-acetát, 1:1), Rí-0,18.

51. példa

A reakciófolyamat az 55. ábrán látható.

0,14 g (LXIV) kiindulási anyag 5 ml diklór-metánban készült oldatához hozzáadunk 0,10 g (XLIV) kiindulási anyagot, 65 mg vízoldékony karbodiimid-hidrokloridot és 4 mg 4-dimetil-amino-piridint. 12 órán át kevertetünk szobahőmérsékleten. 50 mg N,N-dimetilamino-propil-amint adunk a reakciókeverékhez és az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A maradékot 20 ml etil-acetátban oldjuk, híg sósavval és vízzel mossuk. Bepárlás után a maradékot 10 g szilikagélből (Merck 7734) készült oszlopra visszük és n-hexán/etilacetát, 1:1 (térf.) eleggyel eluálva, 0,19 g (LXV) terméket kapunk.

IR (KBr): 3300,1700,1640,1495 cm⁴.

VRK (Merck Art 5715, n-hexán/etil-acetát, 1:1),

Rp»0,38.

52. példa

A reakciófolyamat az 56. ábrán látható.

145 mg (LXV) kiindulási anyagot 3 ml 4 n sósav dioxános oldatában oldjuk, mely 0,1 ml anizolt tartalmaz. 30 percen át kevertetünk szobahőmérsékleten, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 3 ml diklór-metánban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk 35 mg N-terc-butoxi-karbonil-L-aszparagint, 13 mg tritetil-amint, 18 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és 29 mg vízoldékony karbodiimid-hidrokloridot. 1 órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, majd hozzáadunk 5 ml 7%-os sósavat. A szerves fázist vízzel mossuk. Bepárlás után a maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával (Merck 5744) tisztítjuk, eluensként 6% metanolt tartalmazó kloroformot használva. 110 mg (LXVI) terméket kapunk.

IR (KBr): 3300,1650,1505 cm⁴.

VRK (Merck Art 5715, kloroform/metanol, 10:1),

Rí-0,44.

53. példa

A reakciófolyamat az 57. ábrán látható.

105 mg (LXVI) kiindulási anyagot feloldunk 0,1 ml anizolt tartalmazó 3 ml 4 n sósav dioxános oldatban. 30 percen át kevertetünk szobahőmérsékleten, majd az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. Amaradékot 3 ml diklór-metánban oldjuk. Az oldathoz hozzáadunk 22 mg N-terc-butoxi-karbonil-L-allotreonint, 9 mg trietil-amint, 12 mg 1-hidroxi-benzotriazolt és 19 mg vízoldékony karbodiimid-hidrokloridot. Miután 8 órán át kevertettük a reakciókeveréket szobahőmérsékleten, hozzáadunk 5 ml 7 %-os sósavat. A szerves fázist vízzel mossuk. A bepárlás után a maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfíával (Merck 5744) tisztítjuk, eluensként 6% metanolt tartalmazó kloroformot használva.

A (LXVII) termék adatai:

VRK (Merck Art 5715, kloroform/metanol, 5:1), RH),73.

IR (KBr): 3300,1740 (váll), 1650,1500 cm⁴.

54. példa

A reakciófolyamat az 58. ábrán látható.

58,5 mg (LXVII) kiindulási anyagot 1 ml 90%-os vizes ecetsavban oldunk, és hozzáadunk 30 mg cinkport. 9 órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, további 30 mg cinkport adunk hozzá 1 órás időközökkel, amíg a (LXVII) kiindulási anyag el nem tűnik. Szűrés

HU 204 853 Β után az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot 10 ml etil-acetátban oldjuk, vízzel mossuk és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot preparatív vékonyréteg-kromatográfiával (Merck 5744) tisztítjuk, eluensként etil-acetát/aceton/ecetsav/víz, 6:3:1:1 (térf.) elegyet használva. 43,5 mg (LXV1II) terméket kapunk.

IR (KBr): 3330,1650,1505 cm'¹.

VRK (Merck Art 5715, kloroform/metanol/ecetsav,

10:1:0,1), Rf-0,16.

55. példa

6,7 g ftálimid 30 ml diklór-metánban készült oldatához hozzáadunk 17,42 g etoxi-karbonil-metilén-trifenil-foszforánt és a reakciókeveréket 30 percen át kevertetjük szobahőmérsékleten. Az oldószert lepároljuk és a maradékot dietil-éterben oldjuk. Miután a keveréket leszűrtük, a szűrletet bepároljuk, a bepárlási maradékot vákuumban desztilláljuk 125 ‘C hőmérsékleten és 80 Pa nyomáson. 6 g (E)-3-(2-formil-fenil)-propén- ! sav-etil-észtert kapunk.

NMR (CDC1₃) delta: 1,24 (3H, t, 1=6,5 Hz), 4,19 (2H, q, J=6,5 Hz), 6,28 (IH, d, J-I5 Hz), 7,5 (3H, m), 7,77 (IH, m), 8,32 (IH, d, J-15 Hz), 10,18 (IH, s).

56. példa

3,2 g butil-trifenil-foszfőnium-bromid 50 ml tetrahidrofuránban készült oldatához nitrogéngáz alatt hozzáadunk 900 mg kálium-terc-butoxidot és 30 percen át kevertetűnk szobahőmérsékleten. 2,0 g (E)-3-(2-formil-fe- £ nil)-propénsav-etil-észter 30 ml tetrahidrofuránban készült oldatát adjuk a reakciókeverékhez és 1 órán át kevertetjük. Az oldószert ezt követően lepároljuk, a maradékot dietil-éterben oldjuk és sőoldattal és vízzelmossuk.

Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük 3 és bepároljuk. A maradékot 100 g szilikagélből készült oszlopra visszük és n-hexán/etil-acetát, 3:1 eleggyel eluálunk. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat bepárolva 2,00 g (E)-3-{Z-[(Z)-l-pentenil]-fenil}-propénsav-etil-észtert kapunk. 4

NMR (CDC1₃) delta: 0,88 (3H, t, J=7 Hz), 1,34 (3H, t, J=6,5 Hz), 1,42 (2H, m), 2,05 (2H, m), 4,27 (2H, q, J=6,5 Hz), 5,85 (IH, dt, J=7 Hz és 11 Hz), 7,3 (3H, m), 7,61 (IH, m), 7,92 (IH, d, J-16 Hz).

4Í

57. példa g (E)-3-{2-[(Z)-l-pentil]-feniI}-propénsav-etilészter 20%-os vizes metanolban készült oldatához hozzáadunk 2,3 g kálium-hidroxidot. A reakciőkeveréket 2 órán át kevertetjük 60 °C hőmérsékleten, a 5C kémhatását sósavval pH=l értékre állítjuk be és etilacetáttal extrahálunk. Az extraktumot magnéziumszulfáttal szárítjuk, szűrjük és az oldószert lepároljuk.

A maradékot n-hexán/etil-acetát, 4:1 elegyben oldjuk, az oldatot 1,63 ml diciklohexil-aminhoz adjuk. A ke- 55 Ietkezett kristályos anyagot etil-acetátban oldjuk és az oldatot 1 n kénsavval mossuk. Az oldatot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és bepároljuk, 0,92 g (E)-3-{2-[(Z)-l-pentenil]-fenií}-propénsavat nyerve.

IR (Nujol): 1690,1680,1620 cm'¹. 60

58. példa

1,08 g (E)-3-{2-[(Z)-l-pentenil]-fenil>-propénsavat feloldunk 10 ml diklór-metán, 0,5 ml oxalil-klorid és 0,05 ml Ν,Ν-dimetiI-fonnamid elegyében. Nitroj géngáz alatt kevertetjük a reakciókeveréket 1 órán át szobahőmérsékleten, majd az oldószert lepároljuk. A maradékot n-hexánban oldjuk és a keveréket leszűrjük. A szűrletet bepárolva 1,15 g (E)-3-{2-[(Z)-l-pentenil]fenil}-propenil-kloridot kapunk.

IR (Neat): 1750,1730,1605,1858 cm·¹.

NMR (CDCla) delta: 0,88 (3H, t, J=6,5 Hz), 1,45 (2H, m), 2,06 (2H, m), 5,95 (IH, dt, J-ll Hz és 7 Hz), 6,58 (IH, d, J-ll Hz), 6,66 (IH, d, J-16 Hz), 7,4 (3H, m), 7,69 (IH, m), 8,12 (IH, d, J=16 Hz).

Claims (4)

1. Eljárás az (I) általános képletű- ahol R¹ hidrogénatom, fenilcsoporttal szubsztítuált 1-4

I szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, 1-7 szénatomos alkanoilcsoport, 15-20 szénatomos alkanoilcsoport, benzoilcsoport, tienil-(l-7 szénatomos)alkanoil-csoport, fenil-(l-7 szénatomos)alkanoil-csoport - ahol a fenilcsoport 1-8 szénatoί mos alkilcsoporttal szubsztítuált - vagy fenil-(3-7 szénatomos)alkenoil-csoport- ahol a fenilcsoport

2-8 szénatomos alkenilcsoporttal szubsztítuált;

R² hidroxicsoportés

R³ kaiboxi- vagy 1-7 szénatomos alkoxi-karbonilcsoport; vagy

R² és R³ együttesen -O-C(O)-csoportot alkot;

R⁴ hidroxi-, fenil-(l-4 szénatomos)alkoxi- vagy 1-7 szénatomos alkanoil-oxi-csoport;

R³ hidroxi-, fenil-(l-4 szénatomos)alkoxi- vagy 1-7 szénatomos alkanoil-oxi-csoport;

R⁶ hidroxi-, 1-6 szénatomos alkoxi-, fenil-(l-4 szénatomos)alkoxí- vagy 1-7 szénatomos alkanoiloxi-csoport; és

2ΣΖΖ. egyes vagy kettős kötés vegyület vagy sójának előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a (Π) általános képletű - ahol R¹, R⁴, R⁵, R⁶ és - — jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját gyűrűvé zárjuk az Ga) általános képletű - ahol R¹, R⁴, R^s, R⁶ és

----jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját nyerve;

vagy

b) a (ΠΙ) általános képletű - ahol R¹,R⁴,R³,R⁶és

----jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját gyűrűvé zárjuk az Ga) általános képletű - ahol R¹, R⁴, R³, R^ő és zzz-Z jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

c) az Gb) általános képletű - ahol R², R³, R⁴, R³,

R⁶ és----jelentése a fenti és Rl jelentése acilcsoportvegyületet vagy sóját dezacilezzük (Ic) általános képletű - ahol R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ és jelentése a fenti vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

d) az Gc) általános képletű - ahol R², R³, R⁴, R³, R⁶ és - — jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját vagy az aminocsoporton szubsztítuált reakcióképes származékát acilezzük, az (Ib) általános képletű- ahol R², R³, R⁴, R³,

HU 204 853 B

R⁶ és - - - - jelentése a fenti és Rl' fenilcsoporttal szubsztituált 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, (1-7 szénatomos)alkanoilcsoport, 15-20 szénatomos alkanoilcsoport, benzoilcsoport, tienil-(l—7 szénatomos)alkanoil-csoport, fenil-(l-7 szénatomos)alkanoilcsoport - ahol a fenilcsoport 1-8 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált - vagy fenil-(3-7 szénatomos)alkenoil-csoport - ahol a fenilcsoport 2-8 szénatomos alkenilcsoporttal szubsztituált - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

e) az (Id) általános képletű - ahol R¹, R², R³, R⁴, R³ és

- — jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját acilezzük, az (le) általános képletű - ahol R¹, R², R³, R⁴, R³és

- — jelentése a fenti és 7?« jelentése 1-4 szénatomos alkanoil-oxi-csoport - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

f) az (la) általános képletű - ahol R¹,R⁴,R⁵,R⁶és

- — jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját hidrolizáljuk, az (If) általános képletű - ahol R¹, R⁴, R³, R^s és - — jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

g) az (If) általános képletű - aholR^I,R⁴,R⁵, R⁶és

- — jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját észterezzük, az (lg) általános képletű - ahol R¹, R⁴, R³, R⁶ és

- - - - jelentése a fenti és jelentése 1-7 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

h) az (Ih) általános képletű- ahol R², R³, R⁴, R³, R⁶ és

- — jelentése a fenti és Rl jelentése fenil-(3-7 szénatomos)alkenoil-csoport, ahol a fenilcsoport 2-8 szénatomos alkenilcsoporttal helyettesített - vegyületet vagy sóját redukáljuk, az (E) általános képletű - ahol R², R³, R⁴, R³, R⁶ és jelentése a fenti és Rl jelentése fenil-(3-7 szénatomos)alkanoil-csoport, ahol a fenilcsoport 2-8 szénatomos alkilcsoporttal helyettesített - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy

i) az (Id) általános képletű - ahol R¹, R², R³, R⁴, R³ és jelentése a fenti - vegyületet vagy sóját alkilezzük, az (Ij) általános képletű - ahol R¹, R², R³, R⁴, R³, és 2^2 jelentése a fenti és R% jelentése 1-6 szénatomos alkoxicsoport - vegyületet vagy sóját nyerve; vagy k) WS-9326A és/vagy WS-9326B termelő Streptomyces violaceoniger 9326 FERM BP 1667 törzset, annak mutánsait és variánsait táptalajon tenyésztjük és a WS-9326A és a WS-9327B vegyületeket vagy sóikat a fermentléból kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű - ahol R¹ jelentése fenilcsoporttal helyettesített 1-7 szénatomos alkanoilcsoport, ahol a fenilcsoport 1-8 szénatomos alkilcsoporttal helyettesített; R² és R³ együttesen egy -O-C(=O)- képletű csoportot képez; R⁴ jelentése hidroxilcsoport; R³ jelentése hidroxilcsoport; R⁶ jelentése hidroxilcsoport és - - - - jelentése kettős kötés - vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált reagenseket reagáltatjuk egymással.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű - ahol R¹ jelentése 3-(2-pentil-fenil)-propanoilcsoport és R², R³, R⁴, R³, R⁶ és - - - - jelentése a 2. igénypontban megadott - vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált reagenseket reagáltatjuk egymással.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás tetrahidro-WS9326A előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően szubsztituált reagenseket reagáltatjuk egymással.