NO177714B

NO177714B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive peptidderivater

Info

Publication number: NO177714B
Application number: NO891389A
Authority: NO
Inventors: Tohru Kino; Motoaki Nishikawa; Masami Ezaki; Sumio Kiyoto; Masakuni Okuhara; Shigehiro Takase; Satoshi Okada; Nobuharu Shigematsu
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1989-04-03
Publication date: 1995-07-31
Also published as: PH30960A; DE68927759D1; IL89734A; FI102547B1; AU627453B2; EP0336230B1; DE68927759T2; ZA892188B; JPH02204499A; HUT49631A; NO177714C; KR0132567B1; GB8807921D0; DK161789A; FI891581A0; NO891389L; FI891581A; EP0336230A2; FI102547B; RU1826970C

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av hittil ukjente peptidderivater og farmasøytisk akseptable salter derav som har farmakologiske virkninger.

Oppfinnelsen angår særlig fremstilling av hittil ukjente peptidderivater og farmasøytisk akseptable salter derav som har farmakologiske virkninger så som substans P-antagonisme, neurokinin A (substans K) antagonisme eller lignende.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe peptidderivater og farmasøytisk akseptable salter derav som egner seg til behandling og forebyggelse av astma og lignende, og som kan anvendes som aktiv bestanddel i farmasøytiske preparater.

De omhandlede peptidderivater fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kan angis ved følgende formel (I):

hvor R<1> er hydrogen, fenyl(lavere)alkoksykarbonyl, (ci-ci8)alkanoyl, benzoyl, tienyl(lavere)alkanoyl,

fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkenylgruppe, eller fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe;

R<4> er hydroksy eller beskyttet hydroksy;

R<5> er hydroksy eller beskyttet hydroksy;

R<6> er hydroksy, beskyttet hydroksy eller lavere alkoksy; og - - - er en enkeltbinding eller en dobbeltbinding.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse kan de hittil ukjente peptidderivater (I) fremstilles ved forskjellige fremgangsmåter.

[Fremstilling ved syntetiske fremgangsmåter]

FREMGANGSMÅTE 2

rS

XX r ^ „ OH H2N^^-\ w L

™ »\_ <LH>30 0 V=0

CH3 \=0 NH

o N_xtvT-

o CH3 N. H

X eller et salt derav Dl

R R

Ringslutning v u

» i—:—k <CH>3 o o y=o

CH 3 NH

0<CH>3NV

^\xx—, n^ Ky~ °—i /ar4

^/ CH NH

jD <la>

/ eller et salt derav i

R6 R

FREMGANGSMÅTE 3

OCU

CNH 2

CH3 \ 0 H 0 H

NH

CEZ~\ CH 3

(.•U)—o c u

H—■—

CH3 NH

jL^<*><Ib> ]l

^6 eller et salt derav a

J'Deacylering

CH3 0 <0>

NH

N V

h — I I 0

(ic)

y eller et salt derav

R

FREMGANGSMÅTE 4

C<H>3 R5 \ l

"""-j, " \ ^ N 1

HN F H 71 H X__ CH3 o 0 ><=0>

NH

CH3

0

CH. NH n

\ 2 (IC)

R5../^""eller et reaktivt derivat

^ derav ved aminogruppen

eller et salt derav

nI' Acylering

C^ 3R X^ ^CNH2

H <N>—(

CH3 (I Tl \. _

n 0 c ^4

CH3 NH

JL^ (Ib) I

„6 eller et salt derav R1

R a

FREMGANGSMÅTE 5

^3R5 0

xr <,_>r HN X] w/

CH II N (

\ / NH

v—/ i T3

(id, i

HO „ii i

H0 eller et salt derav R

i

Acylering

™^>— -"— «_J

o «Pj

i & *4

<CH>3 NH

r6 eller et salt derav i

a R

FREMGANGSMÅTE 6

CHt R 5 °

CNH 2

N—L /

CH HN » " ^T> N

/ 3 \HX*

0% \^

I II R 4

CH3 NH

r6 (ih) i1

eller et salt derav °

^ Reduksjon

if^l CH3R<5> »

r ° °

N* 1

CH CH3

jQs di) i

X eller et salt derav R

R c

FREMGANGSMÅTE 7

CH3R<5> jl

HlT^^ H H CH 3 °

NH

<CH3> CH3

^H^^r^^N"^^ ° ^ r4

CH3 NH

%J dd) 'i

HO R

eller et salt derav

J, Alkylering

CM, S

0 / \ 4

jrO — f f eller et (ICs3Ha) 3 lt derav <Nn>'<Hi1>

-2

hvor R1, R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning,

R<1>a er fenyl(lavere)alkoksykarbonyl, (C1-C18)<a>lkanoyl,

benzoyl, tienyl(lavere)alkanoyl,

fenyl(lavere)alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe, eller fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe,

R<6>a er acyloksy,

R^ er fenyl(lavere)alkenoyl substituert med en lavere

alkenylgruppe,

R<1>C er fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere

alkylgruppe, og

R<6>b er lavere alkoksy.

Utgangsforbindelsene (II) og (III) er hittil ukjente og kan fremstilles ved følgende fremgangsmåter.

FREMGANGSMÅTE A

0

CH* R |l

CNH2

R<8> -N

NH

CH 3

\d

—X/ i1 R

CHj NH

'x

(IV)

eller et salt derav

(i) Reaksjon for eliminering av aminobeskyttelsesgruppen i R8

(ii)

9 OH

R II

0

(V)

eller et salt derav <c>^/<rS> k

*9 5-~S -S—S

o o

NH

ch3 \ 7 0 C/// \4

R N 11 R

CH3 NH

R6 "

R (VI)

eller et salt derav

Reaksjon til eliminering av aminobeskyttelsesgruppen i R<* >(ii) CH., °\

R10

(VII)

eller et salt derav

c-!!3 rS " .

<CNH>?

hn^^^Xi ~~~ h h" <ch>3 o o

CH3Nv

r7^^n^^s/ ° n^4

°

CH3 NH

R 6 R

(VIII)

eller et salt derav

Reaksjon til eliminering av aminobeskyttelsesgruppen i R<10> og karboksybeskyttelses-gruppen i R<7>

CNH2

N CH HN T-^H ^ 'I \. ■

.CH3 \ o o y=o

CH3 NH

<fU>

<CH>3 NH

R6 Rl

R (ID

eller et salt derav

FREMGANGSMÅTE B

HN

CH3

ch3-\ CH3<r12>\

Xk ^^^/ 5

CH3 NH

R1

R

(IX)

eller et salt derav (i) Reaksjon til eliminering av aminobeskyttelsesgruppen i r" (ii) 0

II

CNH2

v°

OH

(X)

eller et salt derav

Y

I J CNH.,

c c

HN

NH

™ 3^ CH 3

CH, NH

(XI) Rl

R eller et salt derav

(i) Reaksjon til eliminering av aminobeskyttelsesgruppen i Rl<3>

(ii)

CH3^R5

R^ "—^ OH

0

(XII)

eller et salt derav

hvor R1, R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning,

R<7> er beskyttet karboksy,

R<8> er beskyttet amino,

R<9> er beskyttet amino,

R10 er beskyttet amino,

R<11> er beskyttet karboksy,

R12 er beskyttet amino,

R<13> er beskyttet amino, og

R<14> er beskyttet amino.

Fremgangsmåtene for fremstilling av utgangsforbindelsene og forbindelsene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse forklares i det følgende.

FREMGANGSMÅTE 1

Forbindelsen (Ia) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (II) eller et salt derav en ring-slutningsreaksj on.

Denne reaksjon utføres ved en vanlig fremgangsmåte for cyklisk peptidsyntese så som blandet syreanhydrid-fremgangsmåten, aktivert ester-fremgangsmåten, karbodiimid-fremgangsmåten eller lignende.

Reaksjonen utføres vanligvis i et konvensjonelt oppløsnings-middel så som alkohol, tetrahydrofuran, etylacetat, N,N-dimetylformamid, diklormetan, kloroform eller et hvilket som helst annet oppløsningsmiddel som ikke har noen skadelig innvirkning på reaksjonen.

Reaksjonstemperaturen er ikke kritisk, og reaksjonen utføres vanligvis under betingelser fra avkjøling til moderat oppvarmning.

FREMGANGSMÅTE 2

Forbindelsen (Ia) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (III) eller et salt derav en ring-slutningsreaksj on.

FREMGANGSMÅTE 3

Forbindelsen (Ic) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (Ib) eller et salt derav en deacyleringsreaksjon. En egnet fremgangsmåte for denne reaksjon kan f.eks. være en vanlig fremgangsmåte så som hydrolyse, reduksjon og lignende.

(i) Hydrolyse

Hydrolysen utføres fortrinnsvis i nærvær av en base eller en syre, herunder Lewis-syre.

En egnet base kan f.eks. være en uorganisk base og en organisk base så som et alkalimetall [f.eks. natrium, kalium, etc], et jordalkalimetall [f.eks. magnesium, kalsium, etc], et hydroksyd eller karbonat eller hydrogenkarbonat derav, et trialkylamin [f.eks. trimetylamin, trietylamin, etc], pikolin, 1,5-diazabicyklo[4.3.0]non-5-en, 1,4-diazabicyklo-[2.2.2]oktan, l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en eller lignende.

En egnet syre kan f.eks. være en organisk syre [f.eks. maursyre, eddiksyre, propionsyre, trikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, etc] og en uorganisk syre [f.eks. saltsyre, bromhydrogensyre, svovelsyre, hydrogenklorid, hydrogenbromid, etc]. Fjernelsen under anvendelse av Lewis-syre så som trihalogeneddiksyre [f.eks. trikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, etc] eller lignende utføres fortrinnsvis i nærvær av kationopptagende midler [f.eks. anisol, fenol, etc.].

Reaksjonen utføres vanligvis i et oppløsningsmiddel så som vann, en alkohol [f.eks. metanol, etanol, etc], metylenklorid, tetrahydrofuran, en blanding derav eller et hvilket som helst annet oppløsningsmiddel som ikke har noen skadelig innvirkning på reaksjonen. En flytende base eller syre kan også anvendes som oppløsningsmiddel. Reaksjonstemperaturen er ikke kritisk, og reaksjonen utføres vanligvis under betingelser fra avkjøling til moderat oppvarmning.

(ii) Reduksjon

Reduksjon utføres på konvensjonell måte, herunder kjemisk reduksjon og katalytisk reduksjon.

Egnede reduksjonsmidler som kan anvendes ved kjemisk reduksjon, er en kombinasjon av et metall (f.eks. tinn, sink, jern, etc.) eller en metalllisk forbindelse (f.eks. kromklorid, kromacetat, etc.) og en organisk eller uorganisk syre (f.eks. maursyre, eddiksyre, propionsyre, trifluoreddiksyre, p-toluensulfonsyre, saltsyre, bromhydrogensyre, etc).

Egnede katalysatorer som kan anvendes ved katalytisk reduksjon, er vanlige katalysatorer så som

platinakatalysatorer (f.eks. platinaplate, platinasvamp, platinasort, kolloidplatina, platinaoksyd, platinatråd, etc), palladiumkatalysatorer (f.eks. palladiumsvamp, palladiumsort, palladiumoksyd, palladiumkull, kolloidpalladium, palladium på bariumsulfat, palladium på bariumkarbonat, etc), nikkelkatalysatorer (f.eks. redusert nikkel, nikkeloksyd, Raney-nikkel, etc), koboltkatalysatorer (f.eks. redusert kobolt, Raney-kobolt, etc), jernkatalysatorer (f.eks. redusert jern, Raney-jern, etc), kobberkatalysatorer (f.eks. redusert kobber, Raney-kobber, Ullman-kobber, etc.) og lignende. Reduksjonen utføres vanligvis i et konvensjonelt oppløsningsmiddel som ikke har noen skadelig innvirkning på reaksjonen, så som vann, metanol, etanol, propanol, N,N-dimetylformamid, tetrahydrofuran eller en blanding derav. Når ovennevnte syrer som skal anvendes ved kjemisk reduksjon, er flytende, kan de også anvendes som oppløsningsmiddel.

Reaksjonstemperaturen for denne reduksjon er ikke kritisk, og reaksjonen utføres vanligvis under betingelser fra avkjøling til moderat oppvarmning.

FREMGANGSMÅTE 4

Forbindelsen (Ib) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (Ic) eller et reaktivt derivat derav ved aminogruppen eller et salt derav en acyleringsreaksjon.

Et egnet reaktivt derivat ved aminogruppen av forbindelsen (Ic) kan f.eks. være imino av Schiffs båsetype eller en tautomer isomer derav av enamintype dannet ved omsetning av forbindelsen (Ic) med en karbonylforbindelse så som aldehyd, keton eller lignende; et silylderivat dannet ved omsetning av forbindelsen (Ic) med en silylforbindelse så som bis-(trimetylsilyl)acetamid, mono(trimetylsilyl)acetamid, bis(trimetylsilyl)urinstoff eller lignende; et derivat dannet ved omsetning av forbindelsen (Ic) med fosfortriklorid eller fosgen og lignende.

Et egnet acyleringsmiddel for anvendelse ved den foreliggende acyleringsreaksjon kan f.eks. være vanlige midler og kan vises med formelen: R<1>a-OH (XIV) (hvor R<1>a har den ovenfor angitte betydning) eller et reaktivt derivat derav eller et salt derav.

Et egnet reaktivt derivat av forbindelsen (XIV) kan f.eks. være et syrehalogenid, et syreanhydrid, et aktivert amid, en aktivert ester og lignende. Et egnet eksempel kan være et syreklorid; et syreazid; et blandet syreanhydrid med en syre så som substituert fosforsyre (f.eks. dialkylfosforsyre, fenylfosforsyre, difenylfosforsyre, dibenzylfosforsyre, halogenert fosforsyre, etc), dialkylfosforsyrling, svovel-syrling, tiosvovelsyre, svovelsyre, sulfonsyre (f.eks. metan-sulfonsyre, etc), alkylkarbonsyre, alifatisk karboksylsyre (f.eks. pivalinsyre, pentansyre, isopentansyre, 2-etylsmørsyre eller trikloreddiksyre, etc.) eller aromatisk karboksylsyre (f.eks. benzoesyre, etc); et symmetrisk syreanhydrid; et aktivert amid med imidazol, 4-substituert imidazol, dimetyl-pyrazol, triazol eller tetrazol; eller en aktivert ester (f.eks. cyanometylester, metoksymetylester, dimetyliminometyl-[ (CH3)2N=CH-]-ester, vinylester, propargylester, p-nitro-fenylester, 2,4-dinitrofenylester, triklorfenylester, pentaklorfenylester, mesylfenylester, fenylazofenylester, fenyltioester, p-nitrofenyltioester, p-kresyltioester, karboksymetyltioester, pyranylester, pyridylester, piperidyl-ester, 8-kinolyltioester, etc), eller en ester med en N-hydroksyforbindelse (f.eks. N,N-dimetylhydroksylamin, l-hydroksy-2-(lH)-pyridon, N-hydroksysuccinimid, N-hydroksy-ftalimid, l-hydroksy-6-klor-lH-benzotriazol, etc.) og lignende. Disse reaktive derivater kan eventuelt velges avhengig av arten av forbindelsen (XIV) som skal anvendes.

Reaksjonen utføres vanligvis i et konvensjonelt oppløsnings-middel så som alkohol (f.eks. metanol, etanol, etc.); aceton, dioksan, acetonitril, metylenklorid, etylenklorid, tetrahydrofuran, N,N-dimetylformamid, pyridin eller et hvilket som helst annet oppløsningsmiddel som ikke har noen skadelig innvirkning på reaksjonen. Disse vanlige oppløsningsmidler kan også anvendes i blanding med vann.

Når forbindelsen (XIV) anvendes i fri syreform eller en

saltform derav i reaksjonen, utføres reaksjonen fortrinnsvis i nærvær av et vanlig kondenseringsmiddel så som N,N'-dicykloheksylkarbodiimid;

N-cykloheksyl-N'-morfolinoetylkarbodiimid; N-cykloheksyl-N'-(4-dietylaminocykloheksy1)karbodiimid; N,N'-dietylkarbodiimid, N,N'-diisopropylkarbodiimid; N-ety1-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid; N,N-karbonylbis-(2-metylimidazol); pentametylen-keten-N-cykloheksylimin; difenylketen-N-cykloheksylimin; etoksyacetylen; 1-alkoksy-l-kloretylen, trialkylfosfitt; etylpolyfosfat; isopropylpolyfosfat; fosforoksyklorid (fosforylklorid); fosfortriklorid; tionylklorid; oksalylklorid; trifenylfosfin; 2-etyl-7-hydroksybenzisoksazoliumsalt; 2-etyl-5-(m-sulfofenyl)isoksazoliumhydroksyd-intramolekylært salt; 1-(p-klorbenzensulfonyloksy)-6-klor-lH-benzotriazol; det såkalte Vilsmeier-reagens som fremstilles ved omsetning av N,N-dimetylformamid med tionylklorid, fosgen, triklor-metylklorformiat, fosforoksyklorid, etc; eller lignende.

Reaksjonen kan også utføres i nærvær av en uorganisk eller organisk base så som et alkalimetallhydrogenkarbonat, tri-(lavere)alkylamin, pyridin, N-(lavere)alkylmorfolin, N,N-di-(lavere)alkylbenzylamin eller lignende. Reaksjonstemperaturen er ikke kritisk, og reaksjonen utføres vanligvis under avkjøling eller ved omgivelsestemperatur.

FREMGANGSMÅTE 5

Forbindelsen (le) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (Id) eller et salt derav en acyleringsreaksjon.

Det henvises til den reaksjon som er beskrevet i eksempel 2, 4, 5, 7, 8, 17 og 18 nedenfor.

FREMGANGSMÅTE 6

Forbindelsen (li) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (Ih) eller et salt derav reduksjon.

Den reduksjonsmetode som kan anvendes ved denne reaksjon, kan f.eks. være katalytisk reduksjon.

Egnede katalysatorer som skal anvendes ved katalytisk reduksjon, er vanlige katalysatorer så som

platinakatalysatorer [f.eks. platinaplate, platinasvamp, platinasort, kolloidplatina, platinaoksyd, platinatråd, etc], palladiumkatalysatorer [f.eks. palladiumsvamp, palladiumsort, palladiumoksyd, palladiumkull, kolloidpalladium, palladium på bariumsulfat, palladium på bariumkarbonat, etc], nikkelkatalysatorer [f.eks. redusert nikkel, nikkeloksyd, Raney-nikkel, etc], koboltkatalysatorer [f.eks. redusert kobolt, Raney-kobolt, etc], jernkatalysatorer [f.eks. redusert jern, Raney-jern, etc], kobberkatalysatorer [f.eks. redusert kobber, Raney-kobber, Ullman-kobber, etc] og lignende.

Reaksjonen utføres vanligvis i et konvensjonelt oppløsnings-middel så som aceton, dioksan, alkohol, tetrahydrofuran, etylacetat, N,N-dimetylformamid, dimetylsulfoksyd eller et hvilket som helst annet oppløsningsmiddel som ikke har noen skadelig innvirkning på reaksjonen.

Reaksjonstemperaturen er ikke kritisk, og reaksjonen utføres vanligvis under betingelser fra avkjøling til kraftig oppvarmning.

FREMGANGSMÅTE 7

Forbindelsen (Ij) eller et salt derav kan fremstilles ved å underkaste forbindelsen (Id) eller et salt derav en alkyleringsreaksjon. det henvises til den reaksjon som er beskrevet i eksempel 19 nedenfor.

FREMGANGSMÅTE A

Forbindelsen (II) eller et salt derav kan fremstilles ved omsetning av forbindelsen (IV) eller et salt derav ifølge det synteseskjerna som er vist under fremgangsmåte A. Hver reaksjon i det nevnte skjema kan utføres ved en vanlig fremgangsmåte for peptidsyntese. Utgangsforbindelsen (IV) eller et salt derav kan fremstilles ved fremgangsmåtene beskrevet i fremstillingene nedenfor eller på lignende måte.

FREMGANGSMÅTE B

Forbindelsen (III) eller et salt derav kan fremstilles ved omsetning av forbindelsen (IX) eller et salt derav ifølge det synteseskjema som er vist under fremgangsmåte B. Hver reaksjon i det nevnte skjema kan utføres ved en vanlig fremgangsmåte for peptidsyntese. Utgangsforbindelsen (IX) eller et salt derav kan fremstilles ved fremgangsmåtene beskrevet i fremstillingene nedenfor eller på lignende måte.

[Fremstilling ved fermentering]

WS-9326A og WS-9326B kan fremstilles ved fermentering av en WS-9326A- og/eller WS-9326B-produserende stamme som tilhører slekten Streptomyces så som Stre<p>tomyces violaceoniger nr. 9326 i et næringsmedium.

Karakteristika for den mikroorganisme som anvendes for fremstilling av WS-9326A og WS-9326B, er forklart i det følgende.

Mikroorganisme

Den mikroorganisme som kan anvendes for fremstilling av WS-9326A og WS-9326B, er en WS-9326A- og/eller WS-9326B-produserende stamme som tilhører slekten Streptomyces. blant hvilke Streptomyces violaceoniger nr. 9326 nylig er isolert fra en jordprøve oppsamlet ved Suwa City, Nagano Prefecture, Japan.

En lyofilisert prøve av den nylig isolerte Streptom<y>ces viol-aceoni<g>er nr. 93 26 er deponert hos the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan) med deponeringsnummeret FERM BP-1667 (deponeringsdato: 20. januar 1988) .

Det er klart at fremstillingen av den hittil ukjente WS-9326A og WS-9326B ikke er begrenset til anvendelsen av den særlige organisme som er beskrevet her, og som kun er angitt som et illustrativt eksempel.

Streptomyces violaceoni<g>er nr. 93 2 6 har følgende morfologiske, dyrkningsmessige, biologiske og fysiologiske karakteristika:

[l] Morfologiske karakteristika:

De metoder som er beskrevet av Shirling og Gottlieb (Shirling, E.B. og D. Gottlieb: Methods for characterization of Stre<p>tomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology, .16, 313-340, 1966) , ble anvendt til denne taksionomiske undersøkelse.

Morfologiske iakttagelser ble foretatt med lys- og elektron-mikroskoper på kulturer som ble dyrket ved 30°C i 14 dager på havremelsagar, gjær-maltekstraktagar og uorganiske salter-stivelsesagar.

Det vegetative mycelium ble godt utviklet uten fragmentering. Luftmyceliet forgrenet seg enakset og dannet spiralkjeder av sporer med 10-30 sporer pr. kjede. Sporene hadde en glatt overflate og hadde oval form med en størrelse på 0,6-0,8 x 0,8-1,3 /m. Sklerotiske granuler, sporangia og zoosporer ble ikke observert.

[2] Dyrkningsmessige karakteristika: Dyrkningsmessige karakteristika ble observert på ti slags medier som beskrevet av Shirling og Gottlieb nevnt ovenfor samt av Waksman (Waksman, S.A.: The actinomycetes, Vol. 2 : Classification, identification and description of genera and species. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961).

Inkubasjonen ble utført ved 30°C i 21 dager. De farvenavn som ble anvendt i denne undersøkelse, er tatt fra Methuen Handbook of Colour (Kornerup, A. og J.H. Wanscher: Methuen Handbook of Colour, Methuen, London, 1978). Resultatene er angitt i tabell 1.

Forkortelser: G = vekst, A = luftmycelium,

R = farve på baksiden, S = oppløselig pigment

Luftmyceliet var grått til brunlig grått. En del av kolonien ble sort og fuktig og oppviste hygroskopisk karakter på de fleste agarmedier. Baksiden av kolonien var gulaktig brun, brun og mørkebrun. Baksiden av myceliepigmentet var ikke pH-følsom. Det ble ikke dannet melanoide pigmenter og andre oppløselige pigmenter.

Celleveggsanalyse ble utført ved fremgangsmåtene beskrevet av Becker et al. (Becker, B., M.P. Lechevalier, R.E. Gordon og H.A. Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates: Appl. Microbiol., 12, 421-423, 1964) og Yamaguchi (Yamaguchi, T.: Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes: J. Bacteriol., 89, 444-453, 1965). Analyse av hele cellehydrolysater av stamme nr. 9326 viste tilstedeværelse av LL-diaminopimelinsyre. Denne stammes cellevegg antas således å være av type I.

[3] Biologiske og fysiologiske egenskaper: Fysiologiske egenskaper og utnyttelse av karbonkilder er vist i henholdsvis tabell 2 og 3. Utnyttelsen av karbonkilder ble undersøkt ifølge fremgangsmåtene beskrevet av Pridham og Gottlieb (Pridham, T.G. og D. Gottlieb: The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination: J. Bacteriol., 56, 107-114, 1948). De morfologiske og kjemiske karakteristika av stamme nr. 9326 gjorde det mulig klart å bestemme at organismen tilhører slekten Streptomyces. Stamme nr. 9326 ble sammenlignet med Streptomyces-arter som er beskrevet i 8. utgave av Bergeys manual (Buchanan, R.E. og N.E. Gibbons: Bergey's manual of determinative bacteriology, 8. utgave. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974), Streptomyces-arter som er beskrevet i Shirlings ISP-rapporter [(Shirling, E.B. og D. Gottlieb: Cooperative description of type culture of Streptomyces.2. Species descriptions from first study. Intern. J. Syst. Bacteriol. 18: 69-189, 1968), (Shirling, E.B. og D. Gottlieb: Cooperative description of type culture of Streptomyces.3. Additional species descriptions from first and second studies. Intern. J. Syst. Bacteriol. 18: 279-392, 1968) og (Shirling, E.B. og D. Gottlieb: Cooperative description of type culture of Stre<p>tom<y>ces.4. Species descriptions from the second, third and fourth studies. Intern. J. Syst. Bacteriol. 19: 391-512, 1969)], de arter som er angitt på "Approved lists of bacterial names" (Skerman, V.B.D., V. McGowan & P.H.A. Sneath: Approved list of bacterial names. Intern. J. Syst. Bacteriol. 30: 225-420, 1980) samt de arter som er beskrevet i de øvrige referanser [(Williams, S.T., M. Goodfellow, G. Alderson, E.M.H. Wellington, P.H.A. Sneath og M.J. Sackin: Numerical classification of Streptomyces and related genera. J. Gen. Microbiol. 129: 1743-1813, 1983) og (Dietz, A.: Criteria for characterization of Hygroscopicus strains. I "Actinomycetes; The Boundary Microorganisms", s. 183-191, red. av T. Arai, 1976)]. Som et resultat herav viste det seg at stamme nr. 9326 lignet Streptomyces violaceoniger meget. Stamme nr. 9326 ble derfor identifisert som Streptomyces violaceoniger og betegnet Streptomyces violaceoniger nr. 9 326.

Fremstilling av WS-932 6A og WS-932 6B

De hittil ukjente WS-9326A og WS-9326B kan fremstilles ved dyrkning av en WS-9326A- og/eller WS-9326B-produserende stamme som tilhører slekten Streptomyces (f.eks. Streptomyces violaceoni<g>er nr. 9326, FERM BP-1667), i et næringsmedium.

Vanligvis kan WS-9326A og WS-9326B fremstilles ved dyrkning av en WS-9326A- og/eller WS-9326B-produserende stamme i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare karbon- og nitrogenkilder, fortrinnsvis under aerobe betingelser (f.eks. ryste-kultur, submers kultur, etc.).

De foretrukne karbonkilder i næringsmediet er karbonhydrater så som glukose, xylose, galaktose, glycerin, stivelse, dextrin og lignende.

Andre kilder som kan være inkludert, er maltose, rhamnose, raffinose, arabinose, mannose, salicin, natriumsuccinat og lignende.

De foretrukne nitrogenkilder er gjærekstrakt, pepton, glutenmel, bomullsfrømel, soyabønnemel, maisstøpevæske, tørrgjær, hvetekim, fjærmel, jordnøttpulver, etc, samt uorganiske og organiske nitrogenforbindelser så som ammoniumsalter (f.eks. ammoniumnitrat, ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, etc), urinstoff, aminosyre og lignende.

Selv om karbon- og nitrogenkiIdene med fordel anvendes i kombinasjon, skal de ikke nødvendigvis anvendes i deres rene form, idet mindre rene materialer som inneholder spor av vekstfaktorer og betydelige mengder mineralske næringsstoffer, også er egnet for anvendelse. Om ønsket kan det til mediet være satt mineralsalter så som natrium- eller kalsiumkarbonat, natrium- eller kaliumfosfat, natrium- eller kaliumklorid, natrium- eller kaliumjodid, magnesiumsalter, kobbersalter, koboltsalter og lignende. Om nødvendig, særlig når dyrkningsmediet skummer kraftig, kan det tilsettes et skumdempende middel så som flytende paraffin, fettolje, planteolje, mineralolje eller silikon.

Som betingelser for fremstilling av WS-9326A og WS-9326B i store mengder foretrekkes det submerse aerobe

dyrkningsbetingelser. For fremstilling i små mengder anvendes det en ryste- eller overflatekultur i en kolbe eller flaske. Når dyrkningen utføres i store tanker foretrekkes det videre å anvende den vegetative form av organismen til inokulasjon i produksjonstankene for å unngå vekstforsinkelser i løpet av fremstillingen av WS-9326A og WS-9326B. Det er således ønskelig først å produsere et vegetativt inokulum av organismen ved inokulering av en relativt liten mengde av dyrkningsmediet med sporer eller mycelier av organismen og dyrke dette inokulerte medium og derefter å overføre det dyrkede vegetative inokulum aseptisk til store tanker. Det medium, hvor det vegetative inokulum fremstilles, er i det vesentlige det samme som eller er forskjellig fra det medium som anvendes for fremstilling av WS-9326A og WS-9326B.

Agitasjon og luftning av kulturblandingen kan oppnås på en rekke måter. Agitasjon kan tilveiebringes ved hjelp av en skrue eller en tilsvarende mekanisk agitasjonsinnretning, ved å dreie eller ryste fermenteringsbeholderen, ved hjelp av forskjellig pumpeutstyr eller ved å lede steril luft gjennom mediet. Luftning kan utføres ved å lede steril luft gjennom fermenteringsblandingen.

Fermenteringen utføres vanligvis ved en temperatur mellom ca. 20°C og 40°C, fortrinnsvis 25-35°C, i et tidsrum på fra ca. 50 timer til 150 timer, hvilket kan varieres avhengig av fermen-teringsbetingelsene og -målestokken.

Således fremstilt WS-9326A og WS-9326B kan isoleres fra dyrkningsmediet på en konvensjonell måte som vanligvis anvendes til isolering av andre kjente biologisk aktive stoffer. Det fremstilte WS-9326A og WS-9326B finnes i kulturfiltratet og myceliet, og følgelig kan WS-9326A og WS-9326B isoleres og renses fra filtratet og myceliet, som fås ved filtering eller sentrifugering av dyrkningsvæsken, ved en vanlig fremgangsmåte så som konsentrasjon under redusert trykk, lyofilisering, ekstraksjon med et vanlig oppløs-ningsmiddel, pH-justering, behandling med en vanlig harpiks (f.eks. anion- eller kationbytterharpiks, ikke-ionisk adsorp-sjonsharpiks, etc), behandling med en vanlig absorbent (f.eks. aktivert trekull, kiselsyre, silikagel, cellulose, aluminiumoksyd, etc), krystallisasjon, omkrystallisasjon og lignende.

WS-9326A som er fremstilt ifølge den ovennevnte fremgangsmåte, har følgende fysiske og kjemiske egenskaper.

(1) Form og farve:

Farveløst pulver

(2) Farvereaksjon:

Positiv: ceriumsulfatreaksjon, joddampreaksjon,

jern (III) klorid-kaliumjem (III) cyanidreaksjon

Negativ: ninhydrinreaksjon, Molish-reaksjon, jern(III)-kloridreaksjon, Ehrlich-reaksjon, Pauli-reaksjon

(3) Oppløselighet:

Oppløselig: metanol, etanol

Tungt oppløselig: aceton, etylacetat Uoppløselig: vann, kloroform

(4) Smeltepunkt: 187-190°C

(5) Spesifikk rotasjon:

[a]<2>D<3> = -84° (C=1,0, MeOH)

(6) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum:

Xmaks (MeOH) = 280 nm (e=34.700)

(7) Infrarødt absorpsjonsspektrum:

<v>maks (KBr) = 3300, 3050, 2950, 2920, 2860, 1730, 1650, 1610, 1560, 1540, 1530, 1510, 1440, 1380, 1340, 1280, 1240, 1170, 1110, 1080, 1060, 1040, 970, 920, 880, 860, 830 cm-1

Dette er vist grafisk i fig. 1.

(8) Elementæranalyse:

Beregnet for C54<H>68<N>8013.2H20: C 60,43, H 6,76, N 10,44 Funnet: C 60,18, H 6,61, N 10,32

(9) Tynnskiktskromatografi:

(10) Molekylformel:

(11) Molekylvekt:

FAB-MS: m/z 1037 (M+H)<+ >(12) Egenskap hos stoffet: surt stoff (13) <13>C-NMR-spektrum: (100 MHz, CD30D) 5

Dette er vist grafisk i fig. 2.

(14) <1>H-NMR-spektrum: (400 MHz, CD3OD) S

Dette er vist grafisk i fig. 3.

(15) Aminosyreanalyse:

WS-9326A (5 mg) ble hydrolysert ved 110°C i 20 timer med saltsyre (2 ml) i et forseglet rør. Blandingen ble inndampet til tørrhet for å danne hydrolyseproduktene, som ble analysert på et Hitachi 835 automatisk aminosyre-analyseapparat.

Resultater av aminosyreanalysen:

threonin (2), leucin (1), fenylalanin (1), asparaginsyre (1) , serin (1), metylamin (1) og ammoniakk (1)

Hva angår WS-9 32 6A, skal det bemerkes at <13>c- og <1>H-nukleær-magnetisk resonansspektre som er vist i fig. 2 og 3, viser at WS-9326A eksisterer i minst to stabile konformasjoner i CD3OD-oppløsning, og de kjemiske skift som er beskrevet i ovenstående (13) og (14), gjelder for hovedkonformeren av WS-9326A.

WS-9326B som er fremstilt ifølge den ovennevnte fremgangsmåte, har følgende fysiske og kjemiske egenskaper.

(1) Form og farve: farveløst amorft pulver

(2) Farvereaksjon:

Positiv: ceriumsulfatreaksjon, joddampreaksjon

Negativ: ninhydrinreaksjon

(3) Oppløselighet:

(4) Smeltepunkt: 165-170°C (spaltning)

(5) Spesifikk rotasjon:

[a]2D3 = -64° (C=1,0, MeOH)

(6) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum:

<X>maks (MeOH) = 283 nm (6=27.000)

(7) Molekylformel: C54H70N8O13

(8) Elementæranalyse:

Beregnet for C54H70<N>8O13»2H2O: C 60,32, H 6,94, N 10,42 Funnet: C 59,97, H 6,87, N 10,29

(9) Molekylvekt: FAB-MS: m/z 1061,6 (M+Na)<+>

(10) Tynnskiktskromatografi:

Stasjonær fase Fremkallingsoppløsningsmiddel Rf- verdi

(11) Infrarødt absorpsjonsspektrum:

(12) <13>C-NMR-spektrum:

(100 MHz, CD30D) S

Dette er vist grafisk i fig. 6.

Dette er vist grafisk i fig. 7.

Hva angår WS-9326B, skal det bemerkes at <13>C- og <1>H-NMR-spektre som er vist i fig. 6 og 7, viser at WS-9326B eksisterer i minst to stabile konformasjoner i CD3OD-oppløsning, og de kjemiske skift som er beskrevet i ovenstående (12) og (13), gjelder for hovedkonformeren av WS-9326B.

Fra analysen av ovenstående fysiske og kjemiske egenskaper og som et resultat av ytterligere undersøkelser for å identifisere den kjemiske struktur, er de kjemiske strukturer av WS-9326A og WS-9326B blitt identifisert og bestemt som følger:

Egnede farmasøytisk akseptable salter av den omhandlede forbindelse (I) er vanlig ikke-toksiske salter og kan f.eks. være et salt med en base eller et syreaddisjonssalt så som et salt med en uorganisk base, f.eks. et alkalimetallsalt (f.eks. litiumsalt, natriumsalt, kaliumsalt, etc), et jordalkalimetallsalt (f.eks. kalsiumsalt, magnesiumsalt, etc), et ammoniumsalt; et salt med en organisk base, f.eks. et organisk aminsalt (f.eks. trietylaminsalt, pyridinsalt, pikolinsalt, etanolaminsalt, trietanolaminsalt, dicykloheksylaminsalt, N,N'-dibenzyletylendiaminsalt, etc), etc.; et uorganisk syreaddisjonssalt (f.eks. hydroklorid, hydrobromid, sulfat, fosfat, etc.); et organisk karboksyl-eller sulfonsyreaddisjonssalt (f.eks. formiat, acetat, trifluoracetat, maleat, tartrat, metansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat, etc.); et salt med en basisk eller sur aminosyre (f.eks. arginin, asparaginsyre, glutaminsyre, etc.) og lignende.

Egnede salter av forbindelsene (Ia)-(Ij), (II) og (III) kan være de samme som de som er eksemplifisert for forbindelsen (I) •

I ovenstående og etterfølgende beskrivelse er egnede eksempler og illustrasjoner av de forskjellige definisjoner, forklart detaljert som følger.

Uttrykket "lavere" betegner 1-6 karbonatomer, hvis ikke annet er angitt.

Uttrykket "høyere" betegner 7-20 karbonatomer, hvis ikke annet er angitt.

Egnet "acyl" og "acyl"-gruppe i uttrykket "acyloksy" kan f.eks. være karbamoyl, en alifatisk acylgruppe og en acylgruppe inneholdende en aromatisk ring, hvilket betegnes aromatisk acyl, eller en heterocyklisk ring, hvilket betegnes heterocyklisk acyl.

Et egnet eksempel på nevnte acyl kan illustreres som følger: Alifatisk acyl så som lavere eller høyere alkanoyl (f.eks. formyl, acetyl, propanoyl, butanoyl, 2-metylpropanoyl, pentanoyl, 2,2-dimetylpropanoyl, heksanoyl, heptanoyl, oktanoyl, nonanoyl, dekanoyl, undekanoyl, dodekanoyl, tridekanoyl, tetradekanoyl, pentadekanoyl, heksadekanoyl, heptadekanoyl, oktadekanoyl, nonadekanoyl, icosanoyl, etc.); lavere eller høyere alkoksykarbonyl (f.eks. metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, t-butoksykarbonyl, t-pentyloksykarbonyl, heptyloksykarbonyl, etc); lavere eller høyere alkansulfonyl (f.eks. metansulfonyl, etansulfonyl, etc); lavere eller høyere alkoksysulfonyl (f.eks. metoksysulfonyl, etoksy-sulfonyl, etc); eller lignende;

aromatisk acyl så som aroyl (f.eks. benzoyl, toluoyl, naftoyl, etc); ar(lavere)alkanoyl [f.eks. fenyl(lavere)alkanoyl (f.eks. fenylacetyl, fenylpropanoyl, fenylbutanoyl, fenylisobutylyl, fenylpentanoyl, fenylheksanoyl, etc), naftyl(lavere)alkanoyl (f.eks. naftylacetyl, naftylpropanoyl, naftylbutanoyl, etc), etc.]; ar(lavere)alkenoyl [f.eks. fenyl(lavere)alkenoyl (f.eks. fenylpropenoyl, fenylbutenoyl, fenylmetakryloyl, fenylpentenoyl, fenylheksenoyl, etc), naftyl(lavere)alkenoyl (f.eks. naftylpropenoyl, naftylbutenoyl, naftylpentenoyl, etc), etc.]; ar (lavere)alkoksykarbonyl [f.eks. fenyl(lavere)alkoksykarbonyl (f.eks. benzyloksykarbonyl, etc), etc.]; aryloksykarbonyl (f.eks. fenoksykarbonyl, naftyloksykarbonyl, etc); aryloksy-(lavere)alkanoyl (f.eks. fenoksyacetyl, fenoksypropionyl, etc.); arylglyoksyloyl (f.eks. fenylglyoksyloyl, naftyl-glyoksyloyl, etc); arensulfonyl (f.eks. benzensulfonyl, p-toluensulfonyl, etc); eller lignende;

heterocyklisk acyl så som heterocyklisk karbonyl (f.eks. tenoyl, furoyl, nikotinoyl, etc); heterocyklisk (lavere)alkanoyl (f.eks. tienylacetyl, tienylpropanoyl, tienylbutanoyl, tienylpentanoyl, tienylheksanoyl, tiazolylacetyl, tiadiazolylacetyl, tetrazolylacetyl, etc); heterocyklisk glyoksyloyl (f.eks. tiazolylglyoksyloyl, tienylglyoksyloyl, etc); eller lignende; hvor en egnet heterocyklisk gruppe i uttrykkene "heterocyklisk karbonyl", "heterocyklisk(lavere)alkanoyl" og "heterocyklisk glyoksyloyl" som nevnt ovenfor mer detaljert betegner en mettet eller umettet, monocyklisk eller polycyklisk heterocyklisk gruppe

inneholdende minst ett heteroatom så som et oksygen-, svovel-eller nitrogenatom og lignende.

En særlig foretrukket heterocyklisk gruppe kan være en heterocyklisk gruppe så som en umettet 3-8-leddet, særlig 5- eller 6-leddet, heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-4 nitrogenatomer, f.eks. pyrrolyl, pyrrolinyl, imidazolyl, pyrazolyl, pyridyl og N-oksydet derav, dihydropyridyl, pyrimidyl, pyrazinyl, pyridazinyl, triazolyl (f.eks. 4H-1,2,4-triazolyl, 1H-1,2,3-triazolyl, 2H-1,2,3-triazolyl, etc), tetrazolyl (f.eks. lH-tetrazolyl, 2H-tetrazolyl, etc), etc; en mettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-4 nitrogenatomer, f.eks. pyrrolidinyl, imidazolidinyl, piperidino, piperazinyl, etc; en umettet kondensert heterocyklisk gruppe inneholdende 1-4 nitrogenatomer, f.eks. indolyl, isoindolyl, indolizinyl, benzimidazolyl, kinolyl, isokinolyl, indazolyl, benzotriazolyl, etc; en umettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-2 oksygenatomer og 1-3 nitrogenatomer, f.eks. oksazolyl, isoksa-zolyl, oksadiazolyl (f.eks. 1,2,4-oksadiazolyl, 1,3,4-oksadiazolyl, 1,2,5-oksadiazolyl, etc), etc; en mettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-2 oksygenatomer og 1-3 nitrogenatomer, f.eks. morfolinyl, sydnonyl, etc; en umettet kondensert heterocyklisk gruppe inneholdende 1-2 oksygenatomer og 1-3 nitrogenatomer, f.eks. benzoksazolyl, benzoksadiazolyl, etc; en umettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-2 svovelatomer og 1-3 nitrogenatomer, f.eks. tiazolyl, isotiazolyl, tiadiazolyl (f.eks. 1,2,3-tiadiazolyl, 1,2,4-tiadiazolyl,

1,3,4-tiadiazolyl, 1,2,5-tiadiazolyl, etc), dihydrotiazinyl, etc.; en mettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-2 svovelatomer og 1-3 nitrogenatomer, f.eks. tiazolidinyl, etc; en umettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende 1-2 svovelatomer, f.eks. tienyl, dihydroditiinyl,

dihydroditionyl, etc.; en umettet kondensert heterocyklisk gruppe inneholdende 1-2 svovelatomer og 1-3 nitrogenatomer, f.eks. benzotiazolyl, benzotiadiazolyl, etc; en umettet 3-8-leddet (særlig 5-6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende et oksygenatom, f.eks. furyl, etc; en umettet 3-8-leddet (særlig 5- eller 6-leddet) heteromonocyklisk gruppe inneholdende et oksygenatom og 1-2 svovelatomer, f.eks. dihydrooksatiinyl, etc; en umettet kondensert heterocyklisk gruppe inneholdende 1-2 svovelatomer, f.eks. benzotienyl, benzoditiinyl, etc; en umettet kondensert heterocyklisk gruppe inneholdende et oksygenatom og 1-2 svovelatomer, f.eks. benzoksatiinyl, etc, og lignende.

Acylgruppen som angitt ovenfor kan være substituert med 1-10, ens eller forskjellige, egnede substituenter så som lavere alkyl (f.eks. metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, heksyl, etc); lavere alkenyl (f.eks. vinyl, allyl, 1-propenyl, 1- eller 2- eller 3-butenyl, 1- eller 2-eller 3- eller 4-pentenyl, 1- eller 2- eller 3- eller 4- eller 5-heksenyl, etc); lavere alkoksy (f.eks. metoksy, etoksy, propoksy, etc); lavere alkyltio (f.eks. metyltio, etyltio, etc); lavere alkylamino (f.eks. metylamino, etc); cyklo(lavere)alkyl (f.eks. cyklopentyl, cykloheksyl, etc); cyklo(lavere)alkenyl (f.eks. cykloheksenyl; etc); halogen; amino; beskyttet amino; hydroksy; beskyttet hydroksy; cyano; nitro; karboksy; beskyttet karboksy; sulfo; sulfamoyl; imino; okso; amino(lavere)alkyl (f.eks. aminometyl, aminoetyl, etc); karbamoyloksy; hydroksy(lavere)alkyl (f.eks. hydroksymetyl, 1-eller 2-hydroksyetyl, 1- eller 2- eller 3-hydroksypropyl, etc); cyano(lavere)alkenyltio (f.eks. cyanovinyltio, etc); eller 1ignende.

En egnet "hydroksybeskyttelsesgruppe" i uttrykket "beskyttet hydroksy" kan f.eks. være fenyl(lavere)alkyl (f.eks. benzyl, etc), acyl som nevnt ovenfor og lignende.

Egnet "beskyttet karboksy" kan f.eks. være forestret karboksy.

Et egnet eksempel på estergruppen i forestret karboksy kan f.eks. være lavere alkylester (f.eks. metylester, etylester, propylester, isopropylester, butylester, isobutylester, tert.butylester, pentylester, heksylester,

1-cyklopropyletylester, etc), som kan bære minst én egnet substituent, f.eks. lavere alkanoyloksy(lavere)alkylester [f.eks. acetoksymetylester, propionyloksymetylester, butyryloksymetylester, valeryloksymetylester, pivaloyloksy-metylester, heksanoyloksymetylester, l-(eller 2)-acetoksyetyl-ester, 1-(eller 2- eller 3)-acetoksypropylester, 1-(eller 2-eller 3- eller 4)-acetoksybutylester, 1-(eller 2)-propionyloksyetylester, l-(eller 2- eller 3)-propionyloksypro-pylester, 1-(eller 2)-butyryloksyetylester, 1-(eller 2)-iso-butyryloksyetylester, l-(eller 2)-pivaloyloksyetylester, 1- (eller 2)-heksanoyloksyetylester, isobutyryloksymetylester, 2- etylbutyryloksymetylester, 3,3-dimetylbutyryloksymetylester, 1- (eller 2)-pentanoyloksyetylester, etc], lavere alkansulfonyl(lavere)alkylester (f.eks. 2-mesyletylester, etc), mono-(eller di- eller tri)-halogen(lavere)alkylester (f.eks. 2-jodetylester, 2,2,2-trikloretylester, etc), lavere alkoksykarbonyloksy(lavere)alkylester (f.eks.

metoksykarbonyloksymetylester, etoksykarbonyloksymetylester, 2- metoksykarbonyloksyetylester, 1-etoksykarbonyloksyetylester, 1-isopropoksykarbonyloksyetylester, etc), ftalidyli-den(lavere)alkylester eller (5-lavere alkyl-2-okso-1,3-dioksol-4-yl)(lavere)alkylester [f.eks. (5-metyl-2-okso-1,3-dioksol4-yl)metylester, (5-etyl-2-okso-l,3-dioksol-4-yl)-metylester, (5-propyl-2-okso-l,3-dioksol-4-yl)etylester, etc.]; lavere alkenylester (f.eks. vinylester, allylestér, etc); lavere alkynylester (f.eks. etynylester, propynylester, etc); ar(lavere)alkylester, som kan bære minst én egnet substituent så som mono-(eller di- eller tri)-fenyl(lavere)alkylester, som kan bære minst én egnet substituent (f.eks. benzylester, 4-metoksybenzylester, 4-nitrobenzylester, fenetylester, tritylester, benzhydrylester, bis(metoksy-fenyl)metylester, 3,4-dimetoksybenzylester, 4-hydroksy-3,5-di-tert-butyIbenzylester, etc); arylester, som kan bære minst én

egnet substituent (f.eks. fenylester, 4-klorfenylester, tolylester, tert-butylfenylester, xylylester, mesitylester, kumenylester, etc); ftalidylester; og lignende.

Egnet "lavere alkoksy" kan f.eks. være metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, butoksy, isobutoksy, t-butoksy, pentyloksy, heksyloksy og lignende.

En egnet "aminobeskyttelsesgruppe" i uttrykket "beskyttet amino" kan f.eks. være acyl som nevnt ovenfor og lignende. Egnet "ar(lavere)alkenoyl" i uttrykket "ar(lavere)alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe" kan f.eks. være fenyl(lavere)alkenoyl (f.eks. fenylpropenoyl, fenylbutenoyl, fenylmetakryloyl, fenylpentenoyl, fenylheksenoyl, etc), naftyl(lavere)alkenoyl (f.eks. naftylpropenoyl, naftylbutenoyl, naftylpentenoyl, etc.) og lignende.

Egnet "lavere alkenyl" i uttrykket "fenyl(lavere)alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe" kan f.eks. være vinyl, allyl, 1-propenyl, 1- eller 2- eller 3-butenyl, 1-eller 2- eller 3- eller 4-pentenyl, 1- eller 2- eller 3- eller 4- eller 5-heksenyl og lignende.

Egnet "fenyl(lavere)alkanoyl" i uttrykket

"fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe" kan f.eks. være fenylacetyl, fenylpropanoyl, fenylbutanoyl, fenylisobutylyl, fenylpentanoyl, fenylheksanoyl, etc.

Egnet "lavere alkyl" i uttrykket "fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe" kan f.eks. være metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, heksyl og lignende.

Foretrukne utførelsesformer for den omhandlede forbindelse (I) er som folger: R<1> er hydrogen, fenyl(lavere)alkoksykarbonyl, lavere alkanoyl, benzoyl, tienyl(lavere)alkanoyl, fenyl(lavere)alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe) eller fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en

lavere alkylgruppe;

R<4> er hydoksy, fenyl(lavere)alkoksy (særlig fenyl(lavere)-alkoksy) eller acyloksy (særlig lavere alkanoyloksy); R<5> er hydroksy, ar(lavere)alkoksy (særlig fenyl(lavere)alkoksy) eller acyloksy (særlig lavere alkanoyloksy);

R<6> er hydroksy, lavere alkoksy, ar(lavere)alkoksy (særlig fenyl(lavere)alkoksy) eller acyloksy (særlig lavere

alkanoyloksy); og

- - - er en enkeltbinding eller en dobbeltbinding.

Biologiske egenskaper av peptidderivatene

Peptidderivatene (I) og farmasøytisk akseptable salter derav har farmakologiske virkninger så som substans P-antagonisme, neurokinin A (substans K) antagonisme eller lignende, og de egner seg derfor til behandling og forebyggelse av astma og lignende.

Som et eksempel til påvisning av en slik farmakologisk virkning er det angitt noen farmakologiske testdata i det følgende.

(1) Radioligand-bindingsassay

(a) Rå membranpreparater

Hjerne

Det ble anvendt Wistar-hunnrotter (200 g), og alle reagenser ble kjøpt hos Sigma Chemical Company. Hele hjerner (4 g) ble hakket i små stykker og homogenisert i 8 volumer iskaldt medium I (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MnCl2, 0,02% BSA, 2 jLtg/ml chymostatin, 4 /xg/ml leupeptin og 40 /ug/ml bacitracin) med en Ultra-Disperser (Yamato MODEL LK-21). Homogenatet ble enten oppbevart ved -20°C eller anvendt umiddelbart i bindingseksperimenter.

Lunge

Albino-hannmarsvin av Hartley-stammen (600 g) ble avlivet ved dekapitasjon. Trachea og lunger ble fjernet og oppbevart ved -80°C inntil bruk. Disse vev (150 g) ble opptint og homogenisert i 500 ml buffer (0,25M saccharose, 50 mM Tris-HC1, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) med et kompakt blandeapparat (Matsuden MJ-761). Vevet ble homogenisert med en Ultra-Disperser (Yamato MODEL LK-21) på maksimal innstilling i 10 sekunder med 10 sekunders intervaller med avkjøling mellom homogeniseringene (samlet homogeniseringstid: 60 sekunder). Homogenatet ble sentrifugert (900 x g i 10 minutter) for å fjerne vevsklumper, og supernatanten ble sentrifugert ved 14.000 x g i 20 minutter, hvilket ga pellets som ble betegnet rå membranfraksjoner. Pellets ble resuspendert i medium I, homogenisert med et teflon-homogeniseringsapparat og sentrifugert ved 14.000 x g i 20 minutter. Pellets ble oppbevart ved -20°C.

(b) <3>H-substans P-binding til preparative membraner

<3>H-Substans P (1 nM, New England Nuclear) ble inkubert med 50 /il av membranpreparasjonen i medium I ved 4°C i 30 minutter i et sluttvolum på 250 /il. Ved avslutningen av inkubasjons-perioden ble innholdet hurtig filtrert over et Whatman GF/B-glassfiberfilter (forbehandlet med 0,1% polyetylenimin i 3 timer før anvendelse) under anvendelse av en cellehøster (Brandel M-24S). Filtrene ble derefter vasket 10 ganger med i alt 3 ml av vaskebufferen (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) ved 0°C. Radioaktiviteten ble målt i 3 ml Aquazol-2 i en Packard scin-tillasjonsteller (Packard TRI-Karb 4530).

Tabell 4

WS-9326A-, WS-9326B-, triacetyl-WS-9326A- eller tetrahydro-WS-9326A-fortrengning av spesifikk [<3>H]-substans P-binding til rottehjerne- og marsvin-lungemembraner

IC50 (M)

(2) Virkning av WS-9326A eller tetrahydro-WS-9326A på marsvintrachea

Tracheale spiralstrimler ble fremstilt fra voksne albinohann-marsvin av Hartley-stammen (600 g) ifølge standardteknikker og anbragt i 30 ml organglassbad med kappe. Spenningen av tracheale strimler ble målt isometrisk ved hjelp av en kraftforskyvningstransducer koblet til en polygraf (Biopysiograph 180 system, San-Ei Instrument). Tracheale strimler (2 mm bredde og 50 mm lengde) ble suspendert under en hvilespenning på 500 mg i 30 ml organbad inneholdende varm (37°C) oksygenert (95% 02 : 5% C02) Tyrode-oppløsning med følgende sammensetning: NaCl 137 mM (8 g/liter), KC1 2,7 mM (0,2 g/liter), CaCl2«2H20 1,8 mM (0,264 g/liter), MgCl2«6H20 1,02 mM (0,208 g/liter), NaHC03 11,9 mM (1 g/liter), NaH2P04»2H20 0,42 mM (0,066 g/liter) og glukose 5,5 mM (1 g/liter). Vevene ble ekvilibrert i 90 minutter, og derefter ble WS-9326A eller tetrahydro-WS-9326A testet mot forskjellige bronchokonstriktorer (substans P 10"<8>M og neurokinin A 10"9M) . Spenningen ble opptegnet med en San-Ei Rectigraph-8S recorder (San-Ei Instrument).

Tabell 5

Virkning av WS-9326A eller tetrahydro-WS-9326A på sammen-trekningsreaksjonene av marsvintrachea fremkalt med neurokinin A (NKA) og substans P (SP)

(3) Virkning av WS-9326A eller tetrahydro-WS-9326A på bronchokonstriksjon fremkalt med neurokinin A og capsaicin

Hannmarsvin av Hartley-stammen med en vekt på 300-500 g ble immobilisert med natriumpentobarbital (10 mg/dyr administrert intraperitonealt). Det ble satt inn en kanyle i halsvenen for administrering av neurokinin A (eller capsaicin) og legemiddel. Et kateter ble også intubert i trachea for kunstig ventilasjon. Dyret ble respirert ved hjelp av en miniatyr-respirasjonspumpe (Harvard B-34, 5 ml/slag, 60 slag/minutt). Resistens overfor lungeinflasjon ble målt ved en modifikasjon av Konzett-Rosslers overflowsteknikk.

Agonist ble administrert intravenøst, og antagonistlegemidlet (fremstilt i 0,1% metylcellulose-saltvann) ble administrert intravenøst som vist nedenfor.

<<>4) Virkning av intratracheal administrering av WS-9326A

eller tetrahydro-WS-932 6A på neurokinin A-fremkalt bronkosammensnevring i marsvin

For å teste virkningen av inhalasjon av WS-9326A eller tetrahydro-WS-9 32 6A på bronkosammensnevringen ble WS-9326A eller tetrahydro-WS-9326A oppløst i DMSO og administrert intra-trachealt. Fremgangsmåten var omtrent den samme som nevnt ovenfor.

Som vist i tabell 8 og 9 var WS-9326A og tetrahydro-WS-9326A meget virkningsfulle.

(5) Akutt toksisitet

Akutt toksisitet av WS-9326A ble bestemt i ddY-mus (5 uker gamle, hankjønn) ved en enkelt intraperitoneal injeksjon av graderte doser av testforbindelse i 5 mus. LD50-verdien av WS-9326A var over 250 mg/kg og under 500 mg/kg (500 mg/kg > LD50 > 250 mg/kg).

Det farmasøytiske preparat kan være i form av et farmasøytisk preparat, f.eks. i fast, halvfast eller flytende form, som inneholder peptidderivatene (I) eller farmasøytisk akseptable salter derav som aktiv bestanddel i blanding med en organisk eller uorganisk bærer eller hjelpestoff som er egnet for ekstern, enteral eller parenteral anvendelse. Den aktive bestanddel kan f.eks. blandes med vanlige ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable bærere for tabletter, pellets, kapsler, oppløsninger, emulsjoner, suspensjoner og en hvilken som helst annen form som er egnet for anvendelse. De bærere som kan anvendes, er vann, glukose, laktose, akasiegummi, gelatin, mannitol, stivelsespasta, magnesiumtrisilikat, talkum, maisstivelse, keratin, kolloidalt silika, potet-stivelse, urinstoff og andre bærere, som er egnet for anvendelse ved fremstilling av preparater i fast, halvfast eller flytende form, og dessuten kan det anvendes hjelpestoffer, stabiliseringsmidler, fortykningsmidler og farvegivende midler samt parfymer. Den omhandlede aktive forbindelse er inkorporert i det farmasøytiske preparat i en tilstrekkelig mengde til å gi den ønskede virkning på sykdommens forløp eller tilstand.

Selv om dosen av den terapeutisk virksomme mengde av peptidderivatene (I) eller farmasøytisk akseptable salter derav varierer og også avhenger av alderen og tilstanden av hver enkelt pasient som skal behandles, gis det vanligvis en daglig dose på ca. 0,01-1000 mg, fortrinnsvis 0,1-500 mg og særlig 0,5-100 mg, av den aktive bestanddel til behandling av sykdommer, og det administreres vanligvis en gjennomsnittlig enkeltdose på ca. 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg og 500 mg.

I denne beskrivelse er aminosyrer, peptider, beskyttelses-grupper, etc. angitt med forkortelsene ifølge IUPAC-IUB (Commission on Biological Nomenclature) som er almindelig anvendt på området.

I nedenstående eksempler og fremstillinger anvendes dessuten følgende andre forkortelser ut over forkortelsene anerkjent av

IUPAC-IUB.

De forkortelser som anvendes i denne beskrivelse, er som føl-ger:

Den foreliggende oppfinnelse vil bli forklart nærmere i følgende eksempler og fremstillinger.

EKSEMPEL 1

Fermentering

Et vandig podemedium (160 ml) inneholdende oppløselig stivelse (1%) , saccharose (1%), glukose (1%), bomullsfrømel (1%) , pepton (0,5%), soyabønnemel (0,5%) og kalsiumkarbonat (0,2%)

(pH ble innstilt til 7,0 med 6N natriumhydroksyd) ble hellet i hver av 20 500 ml Erlenmeyer-kolber og sterilisert ved 120°C i 30 minutter.

Et podeøyefull av en skråkultur av Streptom<y>ces violaceoniger nr. 9326 ble inokulert til hvert av mediene og dyrket på et roterende rysteapparat (220 omdr./minutt, 5,1 cm forskydning) ved 30°C i 3 dager. Den resulterende podekultur ble inokulert til 160 liter sterilt fermenteringsmedium bestående av glycerin (3%), soyabønnemel (0,5%), formalt soyabønnepulver (1,5%), kalsiumkarbonat (0,2%) og natriumjodid (Nal) (0,001%) i en 200-liters rystefermentor av rustfritt stål. Fermenteringen ble utført ved 30°C i 3 dager under luftning med 160 liter/minutt og agitasjon ved 200 omdr./minutt. Mengden av WS-9326A i fermenteringsvæsken ble kvantifisert ved høytrykksvæskekromatografi (HPLC) under anvendelse av en Hitachi Model 655 pumpe. En stålkolonne (4,6 mm indre diameter, 250 mm lengde) pakket med R-ODS-5 (YMC-pakket kolonne) ble anvendt ved en strømningshastighet på 1,0 ml/minutt.

Den anvendte mobile fase var en blanding av metanol og vann (8:2). Prøven til HPLC-assayet ble fremstilt som følger: et like stort volum aceton ble satt til væsken under kraftig omrøring. Væsken fikk stå i 1 time og ble derefter sentrifugert. 5 ul supernatant ble injisert i en Hitachi Model 655 prøveinjektor.

Isolering og rensning

Et like stort volum aceton ble satt til dyrkningsvæsken

(150 liter) under omrøring. Blandingen fikk stå ved romtemperatur i én time og ble derefter filtrert. Filtratet ble konsentrert til 80 liter under redusert trykk og ble innstilt til pH 7,0 med IN saltsyre og derefter ekstrahert med 80 liter etylacetat. Ekstrakten ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk og påført en kolonne av silikagel (Kieselgel 60, 0,210-0,063 mm (70-230 mesh), Merck, 3 liter). Kolonnen ble vasket med n-heksan (10 liter), n-heksan-etylacetat [1:1]

(10 liter), etylacetat (20 liter), og det aktive stoff ble eluert fra kolonnen med aceton (6 liter). De aktive fraksjoner ble tørret under redusert trykk og ble underkastet kolonnekromatografi på silikagel (Kieselgel 60, 0,210-0,063 mm (70-230 mesh), Merck, 1,2 liter). Kolonnen ble vasket med kloroform-metanol [20:1] (5 liter), og det ønskede stoff ble eluert med en oppløsning av kloroform-metanol [10:1] (6 liter). Fraksjonen ble tørret under redusert trykk, hvilket ga et pulver. Pulveret ble oppløst i et liten volum metanol og påført en kolonne av NS-gel (Nihon Seimitsu, 500 ml). Det ønskede stoff ble eluert med metanol-vann [8:2] (2 liter) og konsentrert til 300 ml under redusert trykk og derefter ekstrahert med 500 ml etylacetat. Ekstrakten ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk, hvilket ga et pulver (5 g). Pulveret (5 g) ble oppløst i 10 ml metanol (500 mg/ml) og påført til HPLC under anvendelse av en stålkolonne (20 mm indre diameter, 2 50 mm lengde) pakket med D-ODS-5 (YMC-pakket kolonne) og eluert med en blanding av metanol og vann [8:2] ved en strømningshastighet på 9,9 ml/minutt. Den således erholdte aktive fraksjon ble konsentrert under redusert trykk og derefter ekstrahert med etylacetat. Ekstrakten ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk, hvilket ga et rent hvitt pulver (150 mg) av WS-9326A.

EKSEMPEL 2

Til en oppløsning av WS-9326A (300 mg) i pyridin (4,5 ml) ble det satt eddiksyreanhydrid (1,5 ml) og 4-dimetylaminopyridin (1 mg), og reaksjonsblandingen fikk stå ved romtemperatur natten over. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet, hvilket ga en olje, som ble renset ved preparativ TLC [kloroform-metanol (10:1)].

Det erholdte produkt ble triturert fra dietyleter, hvilket ga triacetyl-WS-9326A (332 mg) som et farveløst pulver. Fysiske og kjemiske egenskaper av triacetyl-WS-9326A er som følger:

(1) Form og farve: farveløst pulver

(2) Farvereaksjon:

Positiv: ceriumsulfatreaksjon, svovelsyrereaksjon,

j oddampreaksj on

Negativ: ninhydrinreaksjon

(3) Oppløselighet:

Oppløselig: metanol, dimetylsulfoksyd

Tungt oppløselig: kloroform, dietyleter

Uoppløselig: n-heksan

(4) Smeltepunkt: 141-143°C

(5) Spesifikk rotasjon:

[a]2D3 - -122° (C=1,0, MeOH)

(6) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum:

Xmaks (MeOH) = 283 nm (e=32.000)

(7) Molekylformel: C60<H>74<N>8<O>15

(8) Elementæranalyse:

Beregnet for C60<H>74<N>8<O>16»2H2O: C 60,09, H 6,56, N 9,34 Funnet: C 60,19, H 6,42, N 9,27

(9) Molekylvekt:

FAB-MS: m/z 1163,6 (M+H)<+>

(11) Infrarødt absorpsjonsspektrum:

(12) Egenskap av stoffet: nøytralt stoff

(13) <13>C-NMR-spektrum:

(100 MHz, CDCI3-CD3OH (10:1)) S

Dette er vist grafisk i fig. 5.

EKSEMPEL 3

Fermentering

Et vandig podemedium (160 ml) inneholdende oppløselig stivelse (1%), saccharose (1%), glukose (1%), bomullsfrømel (1%), pepton (0,5%), soyabønnemel (0,5%) og kalsiumkarbonat (0,2%) ble hellet i hver av 10 500 ml Erlenmeyer-kolber og sterilisert ved 12 0°C i 30 minutter.

Et podeøyefull skråkultur av Stre<p>tomyces violaceoniger nr. 9326 ble inokulert til hver av mediene og dyrket på et roterende rysteapparat (220 omdr./minutt, 5,1 cm forskyvning) ved 30°C i 3 dager.

Den resulterende podekultur ble inokulert til det vandige podemedium (160 liter) inneholdende oppløselig stivelse (1%), saccharose (1%), glukose (1%), bomullsfrømel (1%), pepton (0,5%), soyabønnemel (0,5%), kalsiumkarbonat (0,2%), Adekanol LG-109 (skumdempende middel, varemerke fra Asahi Denka Co.)

(0,07%) og Silicone KM-70 (skumdempende middel, varemerke fra Shinetsu Chemical Co.) (0,05%) i en 500-liters rystefermentor av rustfritt stål, som var blitt sterilisert ved 120°C i 30 minutter på forhånd. Fermenteringen ble utført ved 30°C i 1 dag under luftning med 160 liter/minutt og agitasjon ved 200 omdr./minutt.

Den resulterende podedyrkningsvæske (60 liter) ble inokulert til et sterilisert produksjonsmedium inneholdende glycerin (3,0%), soyabønnemel (1,0%), kyllingbenmel (1,0%), kalsiumkarbonat (0,2%), natriumjodid (0,001%), Adekanol LG-109 (0,07%) og Silicone KM-70 (0,05%) i en 4000-liters rystefermentor av rustfritt stål, som var blitt sterilisert ved 120°C i 3 0 minutter på forhånd, og dyrket ved 30°C i 4 dager under luftning med 3000 liter/minutt og agitasjon ved 100 omdr./minutt.

Fermenteringens forløp ble overvåket ved høytrykksvæske-kromatografi (HPLC) under anvendelse av en Hitachi Model 655 pumpe. En stålkolonne pakket med en omvendt fase-silikagel "YMC-pakket kolonne R-ODS-5" (varemerke, Yamamura Chemical Institute) ble anvendt ved en strømningshastighet på 1,0 ml/minutt. Den anvendte mobile fase var en vandig oppløsning av 45% acetonitril. Prøven til HPLC-assayet ble fremstilt som følger: et like stort volum aceton ble satt til væsken under kraftig omrøring, og blandingen fikk stå i én time og ble derefter sentrifugert. 5 /il supernatant ble injisert i en injektor av Hitachi Model 655 HPLC.

Isolering og rensning

Den således erholdte dyrkningsvæske ble filtrert ved hjelp av diatoméjord (Perlite Topko #34, varemerke, Showa Chemical Industry Co., Ltd.) (15 kg). Myceliefilterkaken ble ekstrahert med etylacetat (1600 liter), og ekstrakten ble filtrert. Filtratet (1400 liter) ble påført på en kolonne av aktivt kull (Sirasagi KL, varemerke, Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.) (200 liter). Kolonnen ble vasket med etylacetat (120 liter), og det ble derefter utført eluering med etylacetat-metanol [5:1]. De aktive fraksjoner (fraksjoner fra 50 liter til 1030 liter) ble samlet og konsentrert til 45 liter under redusert trykk. n-Heksan (120 liter) ble satt til den resulterende oppløsning under omrøring. Blandingen fikk stå ved romtemperatur i én time og ble derefter filtrert ved hjelp av Silika #600 (Chuo Silica Co., Ltd.) (3 kg). Den således erholdte filterkake ble vasket med n-heksan (15 liter), og de ønskede stoffer ble eluert med metanol (20 liter).

Eluatet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuet (500 g) ble oppløst med metanol-eddiksyre-diklormetan [1:1:2] (4 liter) og påført på en kolonne av silikagel (Kieselgel 60, 0,210-0,063 mm (70-230 mesh), 70 liter). Kolonnen ble fremkalt med metanol-eddiksyre-diklormetan [1:1:2] (0,5 liter) og diklormetan (25 liter). De ønskede stoffer ble eluert med diklormetan-metanol [10:1] og diklormetan-metanol [8:1]. De aktive fraksjoner ble samlet og konsentrert under redusert trykk. Residuet ble oppløst med metanol (l liter). Acetonitril (9 liter) ble satt til den resulterende oppløsning under omrøring. Blandingen fikk stå ved romtemperatur i én time, og det resulterende bunnfall ble oppsamlet ved filtrering. Dette utfellningstrinn ble gjentatt tre ganger. Det således erholdte bunnfall ble vasket med acetonitril (1 liter) og tørrret, hvilket ga et hvitt pulver (190 g) av WS-9326A. De filtrater som således ble oppnådd fra disse utfellningstrinn, ble samlet og konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuet (11,7 g) ble oppløst med 80% vandig metanol, og den resulterende oppløsning ble ledet gjennom en kolonne av aktivt kull (300 ml). Kolonnen ble vasket med 8 0% vandig metanol (1 liter), og eluering ble utført med metanol (6 liter). De aktive fraksjoner ble samlet og konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Residuet (3,4 g) ble oppløst med metanol (12 ml). Den resulterende oppløsning ble påført på en kolonne av omvendt fase-silikagel (YMC-pakket kolonne R-354 S-15/30 (ODS), (p50 x 1 300 mm x 2; fremstilt av Yamamura Chemical Institute) ekvilibrert med 50% vandig acetonitril. Kolonnen ble fremkalt med 50% vandig acetonitril under anvendelse av Waters HPLC (System 500). Eluatene inneholdende WS-9326B (fraksjoner fra 3 liter til 3,5 liter) ble samlet og konsentrert til tørrhet, hvilket ga et hvitt pulver (790 mg) av WS-9326B.

EKSEMPEL 4

Til en oppløsning av WS-9326A (100 mg) i pyridin (1 ml) ble det satt eddiksyreanhydrid (0,01 ml), og blandingen fikk stå ved romtemperatur natten over. Blandingen ble inndampet til tørrhet, hvilket ga en olje, som ble renset ved preparativ TLC (kloroform-metanol (9:1)). Det erholdte produkt ble triturert med dietyleter, hvilket ga monoacetyl-WS-9326A (55 mg) som et farveløst pulver. Fysiske og kjemiske egenskaper av monoacetyl-WS-932 6A er som følger:

(1) Form og farve: farveløst pulver

(2) Molekylformel: C56<H>70<N>8°14

(3) Molekylvekt: FAB-MS: m/z 1079,4 (M+H)<+>

(4) Tynnskiktskromatografi:

Stasjonær fase Fremkallingsoppløsningsmiddel Rf-verdi Silikagelplate Kloroform-metanol 0,17

(Merck Art 5715) (10:1, vol/vol)

(5) Infrarødt absorpsjonsspektrum:

Xmaks (KBr) = 3300, 2920, 1730, 1650, 1500, 1360, 1190, 1170, 910 cm"<1>

(6) Egenskap av stoffet: nøytralt stoff

(7) <1>H-NMR-spektrum (400MHz, CDCI3-CD3OD (5:1)):

Dette er vist grafisk i fig. 8.

EKSEMPEL 5

Til en oppløsning av WS-9326A (100 mg) i pyridin (l ml) ble det satt eddiksyreanhydrid (0,03 ml), og blandingen fikk stå ved romtemperatur natten over. Blandingen ble inndampet til tørrhet, hvilket ga en olje, som ble renset ved preparativ TLC (kloroform-metanol (9:1)), hvilket ga diacetyl-WS-9326A (72 mg) som et farveløst pulver. Fysiske og kjemiske egenskaper av diacetyl-WS-9326A er som følger:

(1) Form og farve: farveløst pulver

(2) Molekylformel: C58<H>72<N>8°15

(3) Molekylvekt: FAB-MS: m/z 1121,4 (M+H)<+>

(4) Tynnskiktskromatografi:

Stasjonær fase Fremkallingsoppløsningsmiddel Rf-verdi

Silikagelplate Kloroform-metanol 0,35

(Merck Art 5715) (10:1, vol/vol)

(5) Infrarødt absorpsjonsspektrum:

vmaks (KBr) = 3300, 3020, 2950, 1730, 1650, 1520, 1500, 1360, 1200, 1170, 1100, 1040, 980, 910 cm"<1>

(6) Egenskap av stoffet: nøytralt stoff

(7) ^-H-NMR-spektrum:

(400 MHz, CDCI3-CD3OD (5:1)):

Dette er vist grafisk i fig. 9.

EKSEMPEL 6

WS-9326A (100 mg) ble oppløst i metanol (2 ml), og oppløsningen ble hydrogenert over palladiumsort (25 mg) under et hydrogentrykk på 1 atmosfære ved romtemperatur i 4 timer. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Det erholdte produkt ble triturert med dietyleter, hvilket ga tetrahydro-WS-9326A

(92 mg) som et farveløst pulver. Fysiske og kjemiske egenskaper av tetrahydro-WS-9326A er som følger:

(1) Form og farve: farveløst pulver

(2) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum:

xmaks (MeOH) = 287 nm (e=13.000)

(3) Molekylformel: C54H72<N>8<0>13

(4) Molekylvekt: FAB-MS: m/z 1041,6 (M+H)<+>

(5) <13>C-NMR-spektrum:

(100 MHZ, CD30D):

Dette er vist grafisk i fig. 10

(6) ^-H-NMR-spektrum:

(400 MHz, CD3OD):

Dette er vist grafisk i fig. 11

EKSEMPEL 7

Til en oppløsning av tetrahydro-WS-9326A (1100 mg) i pyridin (10 ml) ble det satt eddiksyreanhydrid (3 ml) og 4-dimetylaminopyridin (3 mg), og reaksjonsblandingen fikk stå ved romtemperatur natten over. Oppløsningen ble inndampet til tørrhet, hvilket ga en olje, som ble renset ved silikagel-kolonnekromatografi (kloroform-metanol (20:1)). Det erholdte rene produkt ble triturert med dietyleter, hvilket ga tetrahydro-triacetyl-WS-9326A (998 mg) som et farveløst pulver. Fysiske og kjemiske egenskaper av tetrahydro-triacetyl-WS-9326A er som følger:

(1) Form og farve: farveløst pulver

(2) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum:

<x>maks (MeOH) = 280 nm (e=13.000)

(3) Molekylformel: C60H78N8O16

(4) Elementæranalyse:

Beregnet for <C>60H78N8<O>15»H2O: C 60,80, H 6,80, N 9,45

Funnet: C 61,03, H 6,70, N 9,41

(5) Molekylvekt: FAB-MS: m/z 1167,6 (M+H)<+>

(6) <13>C-NMR-spektrum:

(100 MHz, CDC13)

EKSEMPEL 8

Triacetyl-WS-932 6A (100 mg) ble oppløst i metanol (3 ml), og oppløsningen ble hydrogenert over palladiumsort (35 mg) under et hydrogentrykk på 1 atmosfære ved romtemperatur i 3 timer.

Blandingen ble filtrert, og filtratet ble inndampet til tørrhet under redusert trykk. Residuet ble triturert med dietyleter, hvilket ga en forbindelse (90 mg) som et farveløst pulver.

Denne forbindelse var i alle henseender identisk med tetrahydro-triacetyl-WS-9326A som ble oppnådd i eksempel 7.

Fra analysen av ovenstående fysiske og kjemiske egenskaper og som et resultat av ytterligere undersøkelse med henblikk på å identifisere den kjemiske struktur, er de kjemiske strukturer av triacetyl-WS-9326A, monoacetyl-WS-9326A, diacetyl-WS-9326A, tetrahydro-WS-9326A og tetrahydro-triacetyl-WS-9326A identifisert som følger: Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (3,24 g) i diklormetan (1000 ml) ble det satt trietylamin (350 pl) og 1-etoksykarbonyl-2-etoksy-l,2-dihydrokinolin (6,17 g) ved romtemperatur. Efter omrøring av blandingen i 24 timer ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet avdampet. Kloroform ble satt til residuet, og blandingen ble vasket med vann, IN saltsyre, vann, en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og vann. Efter at blandingen var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble underkastet "lober kolonne" (størrelse C) kromatografi og eluert med 3% metanol i kloroform. Fraksjoner inneholdende den ønskede forbindelse ble inndampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (1,06 g).

[a]jjj8 = -95,3<*> (c = 0,33, CHC13)

IR (CHCI3): 1660, 1600, 1510 cm"<1>

NMR (CDCI3, S): 0,88 (3H, d, J=6Hz), 0,93 (3H, d, J=6Hz), 1,09 (3H, d, J=6,5Hz), 1,37 (3H, d, J=6,5Hz), 2,82 (3H, s), 4,87

(2H, S), 6,93 (2H, d, J=8Hz).

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (42 mg) i diklormetan (4 ml) og N,N-dimetylformamid (0,1 ml) ble det satt N-hydroksysuccinimid (20,4 mg) og et vannoppløselig karbodiimid-hydroklorid (8,2 mg).

Efter omrøring i 15 timer ved romtemperatur ble vannoppløselig karbodiimid-hydroklorid (4 mg) satt til blandingen med 1,5 times intervaller, inntil utgangsforbindelsen (a) forsvant.

Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum, og residuet ble oppløst i etylacetat (10 ml) og vasket med fortynnet saltsyre og vann.

Efter tørring over magnesiumsulfat ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum, og residuet ble oppløst i trifluoreddiksyre (1 ml) og anisol (0,1 ml).

Efter omrøring i 30 minutter ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i N,N-dimetylformamid (2 ml), og blandingen ble satt til pyridin (40 ml) .

Efter omrøring i 16 timer ved romtemperatur ble oppløsnings-midlet fjernet i vakuum. Residuet ble underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (Merck 5744) og fremkalt med kloroform-metanol (10:1), hvilket ga den ønskede forbindelse (1)

(15,2 mg).

IR (KBr): 1635, 1510 cm"<1>

NMR (CD30D, 6) : 6,24 (1H, s)

[a]<2>D° = +18,0° (C = 0,1, MeOH)

EKSEMPEL 11

Utgangsforbindelsen (a) (240 mg) ble hydrogenert ved ca. 2812,4 kg/cm<2> (4 psi) med palladium (200 mg) i en blanding av maursyre og metanol (1:24, 10 ml) i 7 timer.

Efter filtrering av blandingen ble filtratet inndampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (140 mg).

IR (KBr): 1730, 1650, 1510 cm"<1>

[a]2!,<1> = -21,04° (C = 0,1, MeOH)

EKSEMPEL 12

ønsket forbindelse (1)

Utgangsforbindelsen (a) (22 mg) ble oppløst i en oppløsning av hydrogenfluorid-pyridin (0,8 ml) og anisol (0,2 ml) i en nitrogengasspose. Efter omrøring i l time ved romtemperatur ble det satt noen isstykker til blandingen, og oppløsningen ble innstilt til pH 8 med en vandig natriumhydrogenkarbonat-oppløsning. Blandingen ble satt på en kolonne av Diaion HP-20

(10 ml) og vasket med vann. Produktet ble eluert med metanol og renset ved tynnskiktskromatografi (Merck 5715, kloroform-metanol-vann (3:1:0,1, vol/vol)), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (13,0 mg).

IR (KBr): 1635, 1510 cm"<1>

NMR (CD3OD, 6) : 7,05 (1H, s)

[Qt]2D° = -90,6° (C = 0,1, MeOH)

TLC : Rf = 0,35 [Merck Art 5715, CHCl3-MeOH-H20 (3:1:0,1)]

EKSEMPEL 13

ønsket forbindelse (1)

R-: (E)-3-[2-((Z)-1-pentenyl)fenyl]propenoyl

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (6,0 mg) i diklormetan (1,5 ml), bis(dimetylsilyl)acetamid (30 /il) og N,N-dimetylformamid (0,3 ml) ble det satt en 0,02M oppløsning av utgangsforbindelsen (b) (0,4 ml). Efter omrøring i 1 time ved romtemperatur ble 4-dimetylaminopyridin (0,1 mg) satt til blandingen. Utgangsforbindelsen (b) ble satt til blandingen med 30 minutters intervaller, inntil utgangsforbindelsen (a) forsvant. Fortynnet saltsyre ble satt til blandingen, og den organiske fase ble vasket med vann. Efter inndampning i vakuum ble residuet underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (Merck 5715) og fremkalt med kloroform-metanol-vann (65:25:4 vol/vol), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (0,2 mg).

Denne forbindelse var identisk med WS-9326A som ble oppnådd i eksempel 1.

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (11 mg) i pyridin (1 ml) ble det satt en 0,02M oppløsning av utgangsforbindelsen (b) i diklormetan (0,6 ml). Efter omrøring i 1 time ved romtemperatur ble utgangsforbindelsen (b) satt til blandingen med 1 times intervaller, inntil utgangsforbindelsen (a) forsvant. Metanol (2 ml) ble satt til blandingen, og opp-løsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (10 ml) og vasket med fortynnet saltsyre og vann. Efter tørring over magnesiumsulfat ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble underkastet preparativ tynnskikts-kromatograf i (Merck 5715) og fremkalt med kloroform-metanol-vann (3:1:0,1, vol/vol), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (2,0 mg).

IR (KBr): 1640, 1510 cm-<1>

EKSEMPEL 15

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (49,7 mg) i pyridin (1 ml) ble det satt en 0,1M oppløsning av utgangsforbindelsen (b) i diklormetan (1,2 ml) under en nitrogenatmosfære, og blandingen ble omrørt i 3,5 timer ved romtemperatur. Til reaksjonsblandingen ble det satt etylacetat, og blandingen ble vasket med vann, 7% eddiksyre, vann og en mettet vandig oppløsning av natriumklorid. Efter tørring over magnesiumsulfat og filtrering ble oppløsningsmidlet avdampet, og residuet ble underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (0,5 mm x 2) og fremkalt med 20% metanol i kloroform, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (20,6 mg).

Denne forbindelse var identisk med WS-932 6B oppnådd i eksempel 3.

EKSEMPEL 16

Følgende forbindelser ble oppnådd på lignende måte som beskrevet i eksempel 15.

(1)

R- : benzoyl

[a]2!,1 = -45,8° (C = 0,74, MeOH)

smp. 176-178°C

TLC: Rf = 0,48 [Merck Art 5715, CHCl3-MeOH (5:1)] IR (KBr): 1720 (skulder), 1655, 1640 cm"<1>

(2)

R- : 2-(2-tienyl)acetyl

[a]2D<3> = -16,8° (C = 0,73, MeOH)

smp. 160-163°C

TLC: Rf = 0,24 [Merck Art 5715, CHCl3-MeOH (5:1)] IR (KBr): 1720 (skulder), 1650 cm-<1>

(3)

R- : acetyl

[<*]V = "37,4° (C = 0,72, MeOH)

smp. 231-233°C

TLC: Rf = 0,41 [Merck Art 5715, CHCl3-MeOH (5:1)] IR (KBr): 1720 (skulder), 1650 cm-<1>

EKSEMPEL 17

R-: 3-(2-pentylfenyl)propanoyl

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (100 mg) i pyridin (1 ml) ble det satt eddiksyreanhydrid (25 fxl) , og blandingen fikk stå ved romtemperatur natten over.

Blandingen ble inndampet til tørrhet, hvilket ga en olje, som ble renset ved preparativ TLC (CHCl3-MeOH (9:1)), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (78 mg).

TLC: Rf = 0,36 [Merck Art 5715, CHCl3-MeOH (10:1)]

IR (Nujol): 3300, 1760, 1740, 1650, 1540, 1510, 1300, 1220, 1200, 1170, 1050, 920 cm"<1>

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (0,21 g) i metanol (3 ml) ble det satt en oppløsning (3 ml) av diazometan i dietyleter. Efter omrøring i 5 minutter ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (Merck 5744) og fremkalt med 20% metanol i kloroform, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (45 mg).

IR (Nujol): 3300, 1730, 1645, 1530, 1510 cm-<1>

EKSEMPEL 20

Følgende forbindelse ble oppnådd på lignende måte som beskrevet i eksempel 14:

R-: 3-(2-pentylfenyl)propanoyl

Molekylvekt: FAB-MS: m/z 1041,6 (M+H)<+>

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (2,53 g), metanol (10 ml) og vann (3 ml) ble det satt cesiumkarbonat (1,63 g).

Efter at oppløsningsmidlet var fjernet, ble residuet oppløst i N,N-dimetylformamid, og blandingen ble satt til fenacylbromid (1,92 g). Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble avdestillert, og residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med vann. Efter at blandingen var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsningsmidlet avdampet, hvilket ga krystaller av den ønskede forbindelse (1) (3,7 g).

[<a>]<2>D° = -20,3° (C = 1, CHC13)

IR (Nujol): 1745, 1690, 1545 cm"<1>

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (1,48 g) og utgangsforbindelsen (b) (2,5 g) i diklormetan (80 ml) ble det satt l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid (0,764 g) og 4-dimetylaminopyridin (0,488 g) ved 0°C. Efter omrøring i 6 timer ble oppløsningsmidlet avdampet.

Residuet ble oppløst i etylacetat, og blandingen ble vasket med vann, IN saltsyre, en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og vann.

Efter tørring over magnesiumsulfat og filtrering ble oppløsnings-midlet avdampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1)

(2,58 g).

[oe]2)0 = +9,76' (C = 0,3, CHC13)

IR (CHCI3): 1755, 1720, 1705, 1505 cm"<1>

NMR (CDCI3, S): 1,37 (3H, d, J=6Hz), 1,45 (9H, s), 3,70 (1H,

m) , 3,88 (1H, m) , 4,52 (2H, m) , 4,23 (1H, m) , 5,17 (2H, s) ,

5,37 (2H, S)

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) i 90% vandig eddiksyre (100 ml) ble det satt sinkpulver (11 g) under omrøring, og blandingen ble omrørt i 2 timer under isavkjøling og 1 time ved romtemperatur.

Efter at blandingen var filtrert, ble filtratet konsentrert, innstilt til pH 2 med citronsyre og ekstrahert med etylacetat. Efter at ekstrakten var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble vasket med petroleumseter, hvilket ga den ønskede forbindelse (1)

(5,4 g).

NMR (CDCI3, 6) : 1,30 (3H, d, J=6Hz), 1,40 (9H, s), 3,60 (1H, m), 3,82 (1H, m)

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (7,7 g) i diklormetan (60 ml) ble det satt 2,2,2-trikloretanol (2,105 ml), l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid (4,2 g) og 4-dimetylaminopyridin (244 mg) under omrøring ved 0°C, og blandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C og inndampet. Residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med vann, IN saltsyre, vann og en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat.

Efter at blandingen var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble filtratet inndampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (9,37 g).

[COV = -29,84° (C = 0,4, CHCI3)

IR (CHCI3): 1755, 1690, 1610, 1510 cm-<1>

FREMSTILLING 5

Utgangsforbindelsen (a) (9,3 g) ble avkjølt til 0°C og satt til trifluoreddiksyre (15 ml).

Blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C og inndampet. Residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med vann, en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og vann. Efter tørring over magnesiumsulfat og filtrering ble oppløsningsmidlet avdestillert, hvilket ga den ønskede forbindelse (6 g).

NMR (CDC13, 6): 2,45 (3H, s), 3,03 (2H, m), 3,62 (1H, t, J=7Hz), 4,75 (2H, m), 5,06 (2H, s), 6,94 (2H, d, J=8Hz), 7,15 (2H, d, J=8Hz), 7,3-7,5 (5H, m)

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (4,07 g) og utgangsforbindelsen (b) (4,70 g) i diklormetan (40 ml) ble det satt l-etoksykarbonyl-2-etoksy-l,2-dihydrokinolin (2,8 g), og blandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble avdampet, og residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med IN saltsyre, vann, en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og vann.

Efter tørring over magnesiumsulfat og filtrering ble oppløsningsmidlet avdampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (4,35 g).

[<a>]<2>D° = -27,88° (C = 0,12, CHC13)

IR (CHCI3): 1750, 1710, 1655, 1510 cm"<1>

NMR (CDC13, 6) : 1,18 (3H, d, J=6Hz), 1,36 (9H, s), 2,92 (3H, s), 4,69 (2H, s), 4,91 (2H, s), 5,01 (2H, s), 6,80 (2H, d, J=8Hz), 7,02 (2H, d, J=8Hz)

Utgangsforbindelsen (a) (4,35 g) ble avkjølt til 0°C og satt til trifluoreddiksyre (20 ml). Efter omrøring av blandingen i 45 minutter ved 0°C ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble oppløst i etylacetat og vasket med en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og vann. Efter at oppløsningen var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble oppløst i diklormetan (100 ml).

Til oppløsningen ble det satt Boc-Asn (1,2 g), l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydroklorid (990 mg) og 1-hydrobenzotriazol (700 mg). Blandingen ble omrørt i 4 timer ved 0°C og vasket med IN saltsyre, vann, en mettet vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat og vann, og oppløsningsmidlet ble avdampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (4,75 g).

[<a>]<2>D° = -15,7° (C = 0,1, CHC13)

IR (KBr): 1740, 1690, 1645, 1510 cm"<1>

NMR (CDCI3, <S) : 1,25 (3H, d, J=6Hz) , 1,43 (9H, s) , 3,00 (3H, s) , 2,55 (1H, m) , 2,80 (1H, m) , 3,05 (1H, m) , 3,37 (1H, m), 3,62 (1H, m), 3,82 (1H, m), 6,88 (2H, d, J=8,5Hz), 7,09 (2H, d, J=8,5Hz)

ønsket forbindelse (1)

Den ønskede forbindelse (1) ble oppnådd ved omsetning av utgangsforbindelsen (a) på lignende måte som beskrevet i fremstilling 7.

[a]2D2 = -13,04° (C = 0,11, CHC13)

IR (KBr): 1740, 1700, 1655, 1510 cm-<1>

NMR (CDCI3, 6) : 1,18, 1,27 (hver 3H, d, J=6Hz), 1,43 (9H, s), 2,52 (1H, m), 2,80 (1H, m), 3,00 (3H, s), 3,36 (1H, m), 4,99 (2H, s), 6,87 (2H, d, J=8Hz), 7,10 (2H, d, J=8Hz)

[a]^1 = -15,19 (C = 0,1, CHC13)

IR (KBr): 1740, 1650, 1635, 1510 cm<-1>

NMR (CDCI3, 6) : 1,11 (3H, d, J=6Hz), 1,27 (3H, d, J=6Hz), 1,33 (9H, s), 3,01 (3H, s), 4,72 (2H, s), 4,98 (2H, s), 6,87 (2H, d, J=8Hz), 7,10 (2H, d, J=8Hz)

[a]2D1 = -19,07° (C = 0,1, CHC13)

IR (KBr): 1740, 1635, 1510 cm"<1>

NMR (CDCI3, 6) : 0,81 (6H, m), 1,13, 1,28 (hver 3H, d, J=6Hz), 1,40 (9H, s), 3,02 (3H, s), 4,96 (2H, s), 6,87, 7,09 (hver 2H, d, J=8Hz)

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (4,2 g) i 90% vandig eddiksyre (80 ml) ble det satt sinkpulver (9 g) ved 0°C, og blandingen ble omrørt i 2 timer ved 0°C og 1 time ved romtemperatur.

Efter at blandingen var filtrert, ble filtratet konsentrert. Kloroform ble satt til residuet, og blandingen ble vasket med IN saltsyre og vann.

Efter at blandingen var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble underkastet kolonnekromatografi på silikagel (150 g), og det ble utført eluering med 2% metanol i kloroform og derefter 8% metanol i kloroform.

Fraksjoner inneholdende den ønskede forbindelse ble inndampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (3,4 g).

[ a] 2^ = -23,42° (C = 0,1, MeOH)

IR (KBr): 1635, 1510 cm<-1>

Utgangsforbindelsen (a) (3,4 g) ble avkjølt til 0°C og satt til trifluoreddiksyre (20 ml).

Efter omrøring av blandingen i 1 time ved 0°C ble oppløsnings-midlet avdampet. Residuet ble oppløst i en oppløsning av hydrogenklorid i dioksan og derefter inndampet. Residuet ble oppløst i kloroform og vasket med vann. Efter at oppløsningen var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsnings-midlet avdampet, hvilket ga den ønskede forbindelse (1)

(3,27 g).

[a]2!,1 = -18,87° (C = 0,12, MeOH)

IR (KBr): 1650, 1510 cm-<1>

FREMSTILLING 13

Til en oppløsning av kaliumhydroksyd (26,8 g) i etanol

(500 ml) ble det satt glycin (14,6 g) og

4-metoksymetoksybenzaldehyd (48,5 g) ved romtemperatur. Efter omrøring i 19 timer ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i vann og gjort sur med saltsyre. Oppløsningen ble vasket med etylacetat og innstilt til pH 6,0 med natriumhydrogenkarbonat. Hvitt fast stoff ble utfellet og oppsamlet, hvilket ga 0-metoksymetyl-/3-hydroksytyrosin (9,2 g), smp. 164-166°C.

IR (KBr): 1610 cm"<1>

FREMSTILLING 14

Til en oppløsning av O-metoksymetyl-jØ-hydroksytyrosin (21,0 g) i IN natriumhydroksyd (2 50 ml) ble det satt dimetylsulfat (16,5 g). Efter omrøring i 20 minutter ved 90°C ble oppløsningen gjort sur med fortynnet saltsyre i et isbad. Den sure oppløsning ble vasket med dietyleter og innstilt til pH 6,0 med IN natriumhydroksyd. Efter inndampning ble det faste stoff oppsamlet ved filtrering, hvilket ga O-metoksymetyl-N-metyl-/3-hydroksytyrosin (5,2 g) , smp. 177-178°C.

IR (KBr): 3100, 1600 cm"<1>

FREMSTILLING 15

Til en oppløsning av 0-metoksymetyl-N-metyl-/3-hydroksytyrosin (15,1 g) og bis(trimetylsilyl)acetamid (25 ml) i diklormetan (150 ml) ble det satt en oppløsning av 2-nitrofenylsulfenylklorid (11,2 g) i diklormetan (50 ml). Efter omrøring i 2 timer ved 0°C ble det til oppløsningen satt

bis(trimetylsilyl)acetamid (10 ml) og

2-nitrofenylsulfenylklorid (5,6 g). Blandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur og satt til IN natriumhydroksyd

(200 ml). Den organiske fase ble vasket med vann (300 ml), og de vandige oppløsninger ble samlet. Efter at den vandige oppløsning var gjort sur med fortynnet saltsyre, ble produktet ekstrahert med etylacetat (300 ml), og ekstrakten ble vasket med vann (100 ml x 3). Efter at oppløsningen var tørret over magnesiumsulfat, ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum, hvilket ga O-metoksymetyl-N-metyl-N- (2-nitrof enyltio) hydroksytyrosin (20,5 g), smp. 59-60°C.

IR (KBr): 3400, 1700 cm-<1>

FREMSTILLING 16

Til en oppløsning av O-metoksymetyl-N-metyl-N-(2-nitrofenyl-tio) -/3-hydroksytyrosin (20,0 g) i etylacetat (100 ml) ble det satt diazometan i dietyleter (80 ml). Efter omrøring i 10 minutter ble oppløsingsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble satt på en silikagelkolonne (Merck 7734; 500 g) og eluert med kloroform, hvilket ga O-metoksymetyl-N-metyl-N-(2-nitrofenyl-tio) -/3-hydroksytyrosin-metylester (threo-isomer: 8,82 g, erythro-isomer: 6,63 g).

Threo- isomer

IR (film): 3500, 2950, 1735 cm"<1>

TLC: Rf = 0,40 [Merck Art 5715, AcOEt-n-Heks (1:1)]

Erythro- isomer

IR (film): 3500, 2950, 1735 cm"<1>

TLC: Rf = 0,31 [Merck Art 5715, AcOEt-n-Heks (1:1)]

FREMSTILLING 17

Til en oppløsning av O-metoksymetyl-N-metyl-N-(2-nitrofenyl-tio) -/?-hydroksytyrosin-metylester (erythro-isomer) (3,85 g) i diklormetan (30 ml) ble det satt trietylamin (1,38 g), 4-dimetylaminopyridin (0,45 g) og benzoylklorid (1,92 g). Efter omrøring i 16 timer ved romtemperatur ble 3-dimetyl-aminopropylamin (3,3 g) satt til blandingen, og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (30 ml) og vasket med fortynnet saltsyre, vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning og vann. Efter inndampning ble residuet satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734,

150 g) og eluert med n-heksan-etylacetat (5:2, vol/vol), hvilket ga O-metoksymetyl-N-metyl-N- (2-nitrof enyltio) -/3-benzoyloksytyrosin-metylester (erythro-isomer) (4,49 g).

IR (film): 2950, 1740 cm"<1>

TLC: Rf = 0,23 (Merck Art 5715, etylacetat:n-heksan = 1:2)

FREMSTILLING 18

Følgende forbindelse ble oppnådd på lignende måte som beskrevet i fremstilling 17: O-Metoksymetyl-N-metyl-N- (2-nitrof enyltio) -/3-benzoyloksy-tyrosin-metylester (threo-isomer), smp. 114-115°C.

IR (CHC13): 2950, 1740 cm"<1>

TLC : Rf = 0,26 (Merck Art 5715, etylacetat:n-heksan = 1:2)

FREMSTILLING 19

Til en oppløsning av O-metoksymetyl-N-metyl-N-(2-nitrofenyl-tio) -/3-benzoyloksytyrosin-metylester (threo-isomer) (4,94 g) i diklormetan (50 ml) ble det satt tiofenol (4,8 ml) og trifluoreddiksyre (2,5 ml) ved 0°C. Efter omrøring i 30 minutter ble vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning satt til blandingen. Den organiske fase ble vasket med vandig natrium-hydrogenkarbonatoppløsning og saltvann. Efter inndampning ble residuet satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734, 100 g) og eluert med 5% metanol i kloroform, hvilket ga O-metoksymetyl-N-metyl-/3-benzoyloksytyrosin-metylester (threo-isomer)

(0,32 g).

TLC: Rf = 0,31 (Merck Art 5715, AcOEt:n-Heks = 1:1)

FREMSTILLING 20

Følgende forbindelse ble oppnådd på lignende måte som beskrevet i fremstilling 19: 0-Metoksymetyl-N-metyl-/3-benzoyloksytyrosin-mety lester v,(ery thr o - i s omer)

TLC: Rf = 0,25 (Merck Art 5715, AcOEt:n-Heks = 1:1)

FREMSTILLING 21

Til en oppløsning av N-benzyloksykarbonyl-L-threonin (3,7 g) og O-metoksymetyl-N-metyl-jØ-benzoyloksytyrosin-metylester (threo-isomer) (3,11 g) i diklormetan (50 ml) ble det satt etyl-1,2-dihydro-2-etoksy-l-kinolinkarboksylat (2,9 g). Efter omrøring i 20 timer ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (50 ml) og vasket med forty

nnet saltsyre, vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning og vann. Efter inndampning ble residuet satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734, 100 g) og eluert med n-heksan-etylacetat (1:1, vol/vol), hvilket ga N-(N-benzyloksykarbonyl-L-threonyl) -0-metoksymetyl-N-metyl-/3-benzoyloksytyrosin-metylester (threo-isomer) (2,04 g).

IR (film): 3400, 2950, 1740 (skulder), 1720 cm"<1>

TLC: Rf - 0,3 6 (Merck Art 5715, MeOH:CHCl3 = 3:97)

FREMSTILLING 22

Følgende forbindelse ble oppnådd på lignende måte som beskrevet i fremstilling 21: N- (N-Benzyloksykarbonyl-L-threonyl) -0-metoksymetyl-N-metyl-/3-benzoyloksytyrosin-metylester (erythro-isomer)

IR (film): 2950, 1740, 1730 (skulder) cm"<1>

TLC: Rf - 0,23 (Merck Art 5715, AcOEt:n-Heks = 1:2)

Til en oppløsning av Ø-benzoyloksy-N-(N-benzyloksykarbonyl-L-threonyl)-O-metoksymetyl-N-metyltyrosin-metylester (threo-isomer) (1,20 g) i toluen (20 ml) ble det satt l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (0,30 g). Efter omrøring i 0,5 time ved romtemperatur ble 7% saltsyre (10 ml) satt til blandingen. Den organiske fase ble vasket med vann og vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning. Efter at den organiske oppløsning var tørret over magnesiumsulfat, ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (0,95 g).

IR (film): 3400, 2950, 1720 cm"<1>

[a]2D2 = -7,7° (C <=> 0,64, MeOH)

Den ønskede forbindelse (l) ble også oppnådd ved omsetning av /3-benzoyloksy-N- (N-benzyloksykarbonyl-L-threonyl) -O-metoksymetyl-N-metyltyrosin-metylester (erythro-isomer) i stedet for /?-benzoyloksy-N-(N-benzyloksykarbonyl-L-threonyl)-O-metoksymetyl-N-metyltyrosin-metylester (threo-isomer).

FREMSTILLING 24

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (1,0 g) i N,N-di-metylf ormamid (10 ml) ble det satt tert-butyldimetylsilyl-klorid (0,75 g) og imidazol (0,34 g). Efter omrøring i 16 timer ved romtemperatur ble etylacetat (30 ml) og is (50 g) satt til blandingen. Den organiske fase ble vasket med fortynnet saltsyre, vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning og vann. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Residuet ble satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734, 30 g) og eluert med kloroform, hvilket ga den ønskede forbindelse (1)

(1,21 g).

IR (film): 2950, 1720 cm-<1>

[a]2D<2> = -55,9° (C = 0,56, MeOH)

FREMSTILLING 25

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (0,95 g) ble det satt IN vandig natriumhydroksydoppløsning (4,8 ml). Efter omrøring i 2 dager ved 30°C ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (20 ml) og vasket med fortynnet saltsyre og vann. Inndampning ga den ønskede forbindelse (1) (0,81 g).

IR (film): 3300, 2950, 1720, 1700 (skulder) cm-<1>

[a]2D2 = -82,9° (C = 1,06, MeOH)

FREMSTILLING 26

Til en blanding av utgangsforbindelsen (a) (1,60 g) og utgangsforbindelsen (b) (5,50 g) i diklormetan (50 ml) ble det satt trietylamin (1,25 g) og etyl-1,2-dihydro-2-etoksy-1-kinolinkarboksylat (3,04 g). Efter omrøring i 15 timer ved romtemperatur ble et hvitt fast stoff frafiltrert, og utgangsforbindelsen (b) (2,23 g), trietylamin (0,50 g) og etyl-1,2-dihydro-2-etoksy-l-kinolinkarboksylat (1,24 g) ble satt til filtratet. Blandingen ble omrørt i 18 timer, og oppløs-ningsmidlet ble fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (50 ml) og vasket med fortynnet saltsyre, vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning og vann. Efter inndampning i vakuum ble residuet satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734, 100 g) og eluert med n-heksan-etylacetat (2:1, vol/vol), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (0,87 g).

IR (film): 2950, 1760, 1740 (skulder), 1720, 1660 cm"<1>

[a]<2>D° = -31,5° (C = 1,07, MeOH)

FREMSTILLING 27

En oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (0,85 g) i toluen (100 ml) og aceton (10 ml) ble bestrålet med en UV-lampe (100 V) i 1,5 time ved 0°C. Efter inndampning ble residuet satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734, 50 g) og eluert med n-heksan-etylacetat (2:1, vol/vol), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (0,18 g).

TLC: Rf = 0,22 (Merck Art 5715, n-Heks:AcOEt =2:1)

IR (KBr): 3300, 1740 (skulder), 1640 cm<-1>

FREMSTILLING 28

Utgangsforbindelsen (a) (0,17 g) ble oppløst i 67% vandig eddiksyreoppløsning (10 ml). Efter omrøring i 28 timer ved 25°C ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (20 ml) og vasket med vandig natriumhydrogenkarbonatoppløsning og vann.

Efter konsentrasjon ble residuet vasket med n-heksan, og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (0,15 g).

IR (KBr): 3250, 1740 (skulder), 1635 cm-<1>

TLC: Rf = 0,18 (Merck Art 5715, n-Heks:AcOEt = 1:1)

FREMSTILLING 29

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (0,14 g) i diklormetan (5 ml) ble det satt utgangsforbindelsen (b)

(0,10 g), vannoppløselig karbodiimid-hydroklorid (65 mg) og 4-dimetylaminopyridin (4 mg). Efter omrøring i 12 timer ved romtemperatur ble N,N-dimetylaminopropylamin (50 mg) satt til blandingen, og oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (20 ml) og vasket med fortynnet saltsyre og vann. Efter inndampning ble residuet satt på en kolonne av silikagel (Merck 7734, 10 g) og eluert med n-heksan-etylacetat (1:1, vol/vol), hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (0,16 g).

IR (KBr): 3300, 1700, 1640, 1495 cm"<1>

TLC : Rf = 0,38 (Merck Art 5715, n-Heks:AcOEt = 1:1)

FREMSTILLING 30

Utgangsforbindelsen (a) (145 mg) ble oppløst i en blanding av 4N hydrogenklorid i dioksan (3 ml) og anisol (0,1 ml). Efter omrøring i 3 0 minutter ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i diklormetan (3 ml). Til oppløsningen ble det satt N-tert-butoksykarbonyl-L-asparagin (35 mg), trietylamin (13 mg), l-hydroksybenzotriazol (18 mg) og vannoppløselig karbodiimid-hydroklorid (29 mg). Efter omrøring i 1 time ved romtemperatur ble 7% saltsyre (5 ml) satt til blandingen. Den organiske fase ble vasket med vann. Efter inndampning ble residuet underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (Merck 5744) og fremkalt med 6% metanol i kloroform, hvilket ga den ønskede forbindelse (1) (110 mg).

IR (KBr): 3300, 1650, 1505 cm-<1>

TLC : Rf = 0,44 (Merck Art 5715, CHCl3:MeOH = 10:1)

FREMSTILLING 31

Utgangsforbindelsen (a) (105 mg) ble oppløst i en blanding av 4N hydrogenklorid i dioksan (3 ml) og anisol (0,1 ml). Efter omrøring i 30 minutter ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i diklormetan (3 ml). Til oppløsningen ble det satt N-tert-butoksykarbonyl-L-allo-threonin (22 mg) , trietylamin (9 mg), 1-hydroksybenzotriazol (12 mg) og vannoppløselig karbodiimid-hydroklorid (19 mg). Efter omrøring i 8 timer ved romtemperatur ble 7% saltsyre

(5 ml) satt til blandingen. Den organiske fase ble vasket med vann. Efter inndampning ble residuet underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (Merck 5744) og fremkalt med 6% metanol i kloroform, hvilket ga den ønskede forbindelse (1).

TLC: Rf = 0,73 (Merck Art 5715, CHCl3:MeOH = 5:1)

IR (KBr): 3300, 1740 (skulder), 1650, 1500 cm-<1>

FREMSTILLING 32

Til en oppløsning av utgangsforbindelsen (a) (58,5 mg) i 90% vandig eddiksyreoppløsning (1 ml) ble det satt sinkpulver (30 mg). Efter omrøring i 9 timer ved romtemperatur ble sinkpulver (30 mg) satt til blandingen med 1 times intervaller, inntil utgangsforbindelsen (a) forsvant. Efter filtrering ble oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i etylacetat (10 ml), vasket med vann og inndampet i vakuum. Residuet ble underkastet preparativ tynnskiktskromatografi (Merck 5744) og fremkalt med etylacetat-aceton-eddiksyre-vann (6:3:1:1, vol/vol), hvilket ga den ønskede forbindelse (1)

(43,5 mg).

IR (KBr): 3330, 1650, 1505 cm"<1>

TLC: Rf = 0,16 [Merck Art 5715, CHCl3-MeOH-AcOH (10:1:0,1)]

FREMSTILLING 33

Til en oppløsning av ftalaldehyd (6,7 g) i diklormetan (30 ml) ble det satt etoksykarbonylmetylentrifenylfosforan (17,42 g), og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble avdampet, og residuet ble oppløst i dietyleter. Efter filtrering av blandingen ble filtratet inndampet. Residuet ble destillert i vakuum (125°C, 0,6 mm Hg), hvilket ga (E)-3-(2-formylfenyl)propensyre-etylester

(6 g) .

NMR (CDC13, 6) : 1,24 (3H, t, J=6,5Hz), 4,19 (2H, q, J=6,5Hz), 6,28 (1H, d, J=15Hz), 7,5 (3H, m), 7,77 (1H, m), 8,43 (1H, d, J=15Hz) , 10,18 (1H, s)

FREMSTILLING 34

Til en oppløsning av butyltrifenylfosfoniumbromid (3,2 g) i tetrahydrofuran (50 ml) ble det satt kalium-tert-butoksyd (900 mg) under nitrogenatmosfære, og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. En oppløsning av (E)-3-(2-formylfenyl)propensyre-etylester (2,0 g) i tetrahydrofuran (30 ml) ble satt til blandingen. Blandingen ble omrørt i 1 time. Efter at oppløsningsmidlet var avdampet, ble residuet oppløst i dietyleter og vasket med saltvann og vann.

Oppløsningen ble tørret over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet. Residuet ble underkastet kolonnekromatografi på silikagel (100 g) og eluert med en blanding av n-heksan og etylacetat (3:1). Fraksjonene inneholdende den ønskede forbindelse ble inndampet, hvilket ga (E)-3-[2-((Z)-l-pentenyl)fenyl]propensyre-etylester (2,00 g) .

NMR (CDCI3, 6) : 0,88 (3H, t, J=7Hz), 1,34 (3H, t, J=6,5Hz), 1,42 (2H, m), 2,05 (2H, m), 4,27 (2H, q, J=6,5Hz), 5,85 (1H, dt, J=7, 11Hz), 6,39 (1H, d, J=16Hz), 6,56 (1H, d, J=llHz), 7,3 (3H, m), 7,61 (1H, m), 7,92 (1H, d, J=16Hz)

FREMSTILLING 35

Til en oppløsning av (E)-3-[2-((Z)-1-pentenyl)fenyl]propensyre-etylester (2 g) i 20% vandig metanol ble det satt kaliumhydroksyd (2,3 g). Blandingen ble omrørt i 2 timer ved 60°C, innstilt til pH 1 med saltsyre og ekstrahert med etylacetat. Efter at ekstrakten var tørret over magnesiumsulfat og filtrert, ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble oppløst i en blanding av n-heksan og etylacetat (4:1). Oppløsningen ble satt til dicykloheksylamin (1,63 ml), hvilket ga krystaller. Krystallene ble oppløst i etylacetat og vasket med IN svovelsyre. Oppløsningen ble tørret over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet, hvilket ga (E)-3-[2-((Z)-1-pentenyl)fenyl]propensyre (0,92 g).

IR (Nujol): 1690, 1680, 1620 cm"<1>

FREMSTILLING 36

(E)-3-[2-((Z)-1-Pentenyl)fenyl]propensyre (1,08 g) ble oppløst i en blanding av diklormetan (10 ml), oksalylklorid (0,5 ml)

og N,N-dimetylformamid (0,05 ml). Efter omrøring i 1 time i nitrogenatmosfære ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet avdampet. Residuet ble oppløst i n-heksan, og blandingen ble filtrert. Filtrat ble inndampet, hvilket ga (E)-3-[2-((Z)-1-pentenyl)fenyl]propenoylklorid (1,15 g).

IR (ren): 1750, 1730, 1605, 1585 cm"<1>

NMR (CDC13, 5): 0,88 (3H, t, J=6,5Hz), 1,45 (2H, m), 2,06 (2H, m), 5,95 (1H, dt, J=ll, 7Hz), 6,58 (1H, d, J=llHz), 6,66 (1H, d, J=16Hz), 7,4 (3H, m), 7,69 (1H, m), 8,12 (1H, d, J=16Hz)

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formelen (I) hvor R<1> er hydrogen, fenyl(lavere)alkoksykarbonyl, (C1-C18)alkanoyl, benzoyl, tienyl(lavere)alkanoyl, fenyl(lavere)alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe, eller fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe ; R<4> er hydroksy eller beskyttet hydroksy; R<5> er hydroksy eller beskyttet hydroksy; R<6> er hydroksy, beskyttet hydroksy eller lavere alkoksy; og - - - er en enkeltbinding eller en dobbeltbinding, eller et salt derav, karakterisert ved at hvor R1, R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, eller et salt derav, underkastes en ringslutningsreaksjon for å danne en forbindelse med formelen (Ia) hvor R1, R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, eller et salt derav, eller hvor R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, og R<2>a er f enyl (lavere) alkoksykarbonyl, (C^-C^g) alkanoyl, benzoyl, tienyl(lavere)alkanoyl, fenyl(lavere)alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe, eller fenyl(lavere)-alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe; eller et salt derav underkastes en deacyleringsreaksjon for å danne en forbindelse med formelen (Ic) hvor R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, eller et salt derav, eller hvor R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, eller et reaktivt derivat derav ved aminogruppen eller et salt derav, underkastes en acyleringsreaksjon for å danne en forbindelse med formelen (Ib) hvor R<1>a, R<4>, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, eller et salt derav, eller

(5) en forbindelse med formelen (Ih) hvor R<4>, R5, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, og R1to er f enyl (lavere) alkenoyl substituert med en lavere alkenylgruppe, eller et salt derav, underkastes en reduksjonsreaksjon for å danne en forbindelse med formelen /Ti \ hvor R4, R<5>, R<6> og - - - hver har den ovenfor angitte betydning, og R<1>c er fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe, eller et salt derav, og en forbindelse med formel (I) hvor R<6> er hydroksy, underkastes eventuelt en acylerings- eller alkyleringsreaksjon for å danne en forbindelse med formel (I) hvor R<6> er henholdsvis acyloksy eller alkoksy.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R<1> er fenyl(lavere)alkanoyl substituert med en lavere alkylgruppe, R<4> er hydroksy, R<5> er hydroksy, R<6> er hydroksy, og - - - er en dobbeltbinding, karakterisert ved at man benytter tilsvarende utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, for fremstilling av en forbindelse med formel (I) hvor R<1> er 3-(2-pentylfenyl)-propanoyl, karakterisert ved at man benytter tilsvarende utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, for fremstilling av en forbindelse med formel (I) som er en forbindelse med følgende strukturformel: (hvor R<1> har den i krav 3 angitte betydning), karakterisert ved at man benytter tilsvarende utgangsmaterialer.