PT99011A - Processo para a preparacao de novos derivados de 1-aril-3-piridinil-2-propeno-1-ona e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

" PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS DE 1-ARIL-3-PIRIDINIL-2-PR0PEN0-1-ONA E DE COMPOSIÇOES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM."

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a 1-aril-3-piridinil-2--propeno-1-onas e à sua utilização como inibidores da absorção do cálcio nos leucócitos e trombócitos e ainda a composições farmacêuticas que contêm estes compostos como componentes acti-vos e ao processo para a sua preparação,

ANTECEDENTES

Os leucócitos polimorfonucleares (leucócitos) proporcionam meios fundamentais de defesa contra as infecções microbianas. A resposta à invasão pelos microrganismos provoca a activação de processos de oxidação celular (produção de radicais hidroxilo) e processos não oxidativos, (enzimas digestivas, mi-eloperoxidase, elastase, etc.), com o objectivo de eliminar eficazmente estes microrganismos.

Contudo, a resposta dos leucócitos a um desafio exterior pode também causar a destruição dos tecidos do hospedeiro e desempenhar um papel importante em numerosas condições de doenças não infecciosas. -2-

Os leucócitos possuem uma grande variedade de mecanismos que lhes permitem responder a desafios estranhos que são iniciados pelos receptores da superfície celular. A activaçlo dos receptores ou a activaçlo celular geral origina uma fisiologia celular modificada que faz com que a célula se-torne ela própria "activada" . As moléculas intracelulares que sinalizam a activaçlo são frequentemente referidas como mensageiros secundários, sendo os primeiros mensageiros os próprios ligandos da activaçlo extracelular.

Um dos mensageiros secundários principais em muitas células éo ião cálcio (Ca+^). Conhecem-se duas vi.as gerais pelas quais os receptores da superfície da célula geram sinais de cálcio intracelular. Uma destas vias é pela activaçlo de fosfolipase C. Esta enzima gera inositol trifosfato que, por sua vez, liberta o cálcio armazenado na célula. Alternativamente , os receptores celulares podem abrir ou fechar os canais do ião permitindo que o cálcio penetre vindo do exterior da célula. Os canais de cálcio na membrana plasmática são de dois tipos: (1) canais de cálcio sensíveis à voltagem que são activados quando um pequeno e transitório fluxo de iões altera momentaneamente a voltagem que atravessa a membrana plasmática; ou (2) os canais operados pelos receptores que são directamente abertos pelos ligandos dos receptores. 0 primeiro mecanismo opera principalmente nas células sensíveis à voltagem, tais como os neuró-nios e as células musculares. Muitas células, como os leucócitos, não são células sensíveis principalmente à voltagem mas tem receptores na superfície celular que estão funcionalmente ligados aos canais do ião cálcio sensíveis nos receptores na -3- membrana plasmática. A ligação de certos ligandos activa estes receptores, portanto abrindo os canais e permitindo que o ião cálcio penetre no citosol onde funciona então como um mensageiro secundário.

Quando as células são activadas, correspondendo a um influxo de cálcio, as estruturas na célula que se ligam aos iões de cálcio são responsáveis por estas alterações, dependendo da sua afinidade e especificidade relativas para o cálcio. Conhecem-se algumas proteínas dependentes de iões cálcio. A primeira destas proteínas a ser descoberta e caracterizada foi a tro-pomina C encontrada nas células do músculo esquelético activadas electricamente. Uma proteína que se liga ao cálcio, descoberta mais tarde, é a calmodulina que está simultaneamente nas células sensíveis aos receptores e à voltagem. Entre o número crescente de proteínas celulares de que se sabe serem reguladas pela calmodulina de uma forma dependente dos iões cálcio são algumas das formas de nucleótido fosfodiesterase cíclica e ade-nilato ciclase, assim como as ATPases dependentes do cálcio ligado na membrana, a fosforilase guinase, as guinases de cadeia leve da miosina e a sua associação com os fusos do aparelho mi-tótico e feixes de filamentos de activa. Embora o número total de proteínas que estão dependentes do cálcio ou que são afecta-das pelas enzimas dependentes dos iões cálcio não seja conhecido é evidente que o cálcio constitui uma exigência como um meio de activação destes processos.

Quando os leucócitos são activados, numerosos eventos podem ocorrer que são importantes por levarem a estados de doença mediados pelo cálcio intracelular. Por exemplo, pensa-se que -4- os leucócitos, principalmente os neutrófilos, desempenham um papel integral nos sintomas e lesão dos tecidos do hospedeiro nas doenças seguintes: gota, artrite reumatóide, vasculite imune, glomerulonefrite, doença inflamatória do intestino, síndro-me de desconforto respiratório do adulto, enfisema, asma, lesões térmicas associadas a hemólise e neoplasias malignas nos sítios de inflamação crónica (Malech e Gallin; 1987). Portanto, parece necessário inibir a absorção dos iões cálcio pelos leucócitos como objectivo de aliviar ou retardar a progressão destas doenças do sistema imunológico e inflamatórias que estão associadas à absorção do cálcio. A absorção dos iões cálcio pelos leucócitos e a melhoria de doenças do sistema imunológico e de doenças inflamatórias pode também abranger as doenças relacionadas com os tecidos dérmicos. Incluídas na lista das doenças inflamatórias relacionadas topicamente estão as doenças relacionadas com a derme, que incluem as dermatoses de neutrófilos, dermatite crónica, psoriase, dermatite de contacto, dermatite atópica ou sebor-reica e o acne. 0 cálcio é também um mediador importante nos trombóci-tos (plaquetas) onde, como se sabe, os iões cálcio são necessários para induzirem o esquema intrínseco da coagulação do sangue. Por exemplo, é bem conhecida a necessidade de iões cálcio para o processo de coagulação sanguínea e formação de trombos e estes processos podem ser inibidos in vitro e em certo grau in vivo, se se adicionarem agentes quelantes como, por exemplo, EDTA, citrato ou oxalato para complexarem os iões cálcio. Con- -5- sidera-se que os iões cálcio desempenham uma parte importante da cascata fibrinolítica e que é um mecanismo activo através do qual a resposta fibrinolítica se pode controlar por via terapêutica.

Uma das funções principais das plaquetas ocorre no sítio do dano vascular em que estas formam um agregado de coágulo para fechar a ferida. Esta resposta pode ter também uma quantidade de efeitos indesejáveis, por exemplo, durante a re-perfusão isquémica a formação do trombo pode conduzir à oclusão da artéria, ao ponto de causar o enfarte do miocárdio. Portanto, é necessário, em muitas circunstâncias, inibir a absorção dos iões cãlcio nas plaquetas como objectivo de controlar a resposta trombolítica. A entrada dos iões cálcio no citosol, por várias formas de activação induzida pelos repectores ou por descarga de reservas intracelulares, está ligada criticamente a certos eventos celulares de activação de leucócitos e de agregação de plaquetas. A alteração dos esquemas de mobilização dos iões cálcio proporciona um mecanismo para induzir as respostas dos leucócitos e das plaquetas. Portanto, é de esperar que os compostos que inibem a mobilização dos iões cálcio reduzam os processos de doenças dependentes do cálcio associados à activação de leucócitos e à inibição nas doenças inflamatórias e imunológicas e aos problemas que envolvem a agregação das plaquetas em certas situações trombolíticas. -6-

SUMARIO DA INVENÇAO A presente invenção refere-se a novos derivados de 1--aril-3-piridinil-2-propeno-1-ona que são utilizáveis como ini-bidores da absorção do cálcio nos leucócitos associados a doenças inflamatórias crónicas ou agudas e doenças do sistema imuno lógico incluindo as doenças relacionadas com os tecidos da derme. Finalmente, a presente invenção também se refere à utilização dos derivados 1-aril-3-piridinil-2-propeno-1-ona para o tratamento de processos dependentes do cálcio do sistema cardio vascular incluindo as doenças do sistema trombolítico.

Esta invenção refere-se aos compostos de fórmula geral

(D na qual

Ar representa um grupo de fórmula geral

em que R^, R2 e Rg representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou de halogénio, um grupo alquilo C^g, alcoxi C,,_g, sulfureto de alquilo C^ g ou um grupo de fórmula geral -N(Y^ )^2) ou ^z“ -7- -(Ar)-(CH2)n-0- em que Y1 e Y2 representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo g, Ar representa um grupo fenilo ou naftilo, n representa zero ou o número inteiro 1, X representa um grupo alcoxi C16 ou um grupo de fórmula geral N(Y1)(Y2) e z representa zero ou o número inteiro 1 ou 2, e aos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também porporciona um método para a inibição da absorção do cálcio em um doente, que consiste em administrar uma quantidade com eficácia inibidora terapêutica de um composto de fórmula geral (1).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Tal como aqui se utiliza, a designação "alquilo C^_g" refere-se a um grupo hidrocarbilo, de cadeia linear ou ramificada saturada, com um a seis átomos de carbono. Estão incluídos no âmbito desta designação os grupos metilo, etilo, ia-pro-pilo, isopropilo, η,-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-j>entilo, ia-hexilo e outros. A designação "alcoxi C^g" refere-se a grupos metoxi, etoxi, propoxi, etc. A designação "sul-fureto de alquilo C1-6 " refere-se a sulfureto de metilo, sul-fureto de etilo, etc. Também se entende que a designação de fórmula geral Xz-(Ar)-{CH2)n-0- inclui especificamente grupos benziloxi, (4-metoxi)-benziloxi, (4-dimetilamino)-benziloxi, etc. 0 termo "halogéneo" refere-se a átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo. -8-

Os compostos de fórmula geral (1) podem ser preparados mediante procedimentos e técnicas convencionais. 0 esquema geral de síntese para a preparação de compostos de fórmula geral (1) é indicado a seguir no Esquema A em que todos os substituin-tes,a menos que indicado de outro modo, têm os significados definidos antes.

Esquema A —C-CHq + Ar -3

0

(D

Em geral, um composto 1-aril-3-piridinil-2-propeno-1--ona de estrutura 3_ pode preparar-se mediante condensação de uma cetona apropriada de estrutura J_ com um piridinocarboxal-deído apropriado de estrutura 2. Por exemplo, um composto 1--ari1-3-piridini1-2-propeno-1-ona de estrutura 3 pode preparar--se mediante condensação de uma cetona apropriada de estrutura J_ com um piridino-carboxaldeído apropriado de estrutura 2 na presença de acetato de cobalto(II) conjuntamente com 2,2'-di-piridilo, no seio de um dissolvente aprótico polar apropriado, como por exemplo, a dimetiIformamida. Alternativamente, o acoplamento pode realizar-se na presença de acetato de piperidina no seio de um dissolvente polar apropriado, tal como o etanol.

Os compostos iniciais para se utilizarem no processo 9- geral de síntese representado no Esquema A são facilmente obtidos por um especialista na matéria.

Os exemplos seguintes apresentam sínteses típicas de acordo com o Esquema A. Estes exemplos são considerados apenas ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção, em qualquer sentido. Como aqui se utilizam os termos seguintes têm os seguintes significados: "g" refere-se a gramas; "mmole" refere-se a milimoles; "ml" refere-se a mililitros; "P.E." refere-se a ponto de ebulição; "°C" refere-se a graus Celsius; "mmHg" refere-se a milímetros de mercúrio; P.F." refere-se a ponto de fusão; "mg" refere-se a miligramas; "|iM" re- o fere-se a micromolar; "jug" refere-se a microgramas e A refere--se a angstrom.

Exemplo 1 1 -(4-metilmercaptofeni1)-3-(4-piridiniI)-2-propeno-1-ona

Introduziu-se 0,8 g(4mmoles) de acetato de coba1 to(II) anidro em um balão seco. Adicionaram-se 150 ml de dimetilforma-mida e 600 mg (4 mmoles) de 2,21 -dipiridilo, e agitou-se durante 30 minutos. Adicionaram-se 4 g (24 mmoles) de 4-(metilmerca-pto)-acetofenona e 2,6 g (24 mmoles) de 4-piridino-carboxaldeí-do. Aqueceu-se à temperatura de 80°C durante 20 horas. Evaporou--se o dissolvente e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (to 1ueno/acetato de etilo a 1:1). A recris-talização (acetato de etilo/hexano) deu 0,8 g do composto em título; P.F. 133o-134°C. -10-

Exemplo 2 1 -(3-trifluorometilfenil)-3-(4-piridinil)-2-propeno-1-ona

Dissolveram-se 700 mg ( 4 mmoles) de acetato de cobal-to(II) anidro em dimetilformamida. Adicionaram-se 620 mg (4 mmoles) de 2,2'-dipiridilo e agitou-se durante 30 minutos. Adicionaram-se 9,4 g (50 mmoles) de 3-(trifluorometi1)-aceto-fenona e 5,3 g (50 mmoles) de 4-piridino-carboxaldeído. Aqueceu -se à temperatura de 80°C durante 18 horas. Evaporou-se o dissolvente e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (tolueno/acetato de etilo a 1:1), obtendo-se 9,4g A recristalização (em éter dietí1ico/hexano) deu o composto em título; P.F. 89°-90°C.

Exemplo 3 1 -(4-dimetilaminofenil)-3-(4-piridinil)-2-propeno-1-ona

Introduziram-se 3,5 g (20 mmoles) de acetato de cobal-to(II) anidro num balão seco. Dissolveu-se em 500 ml de dimetil formamida e adicionaram-se 3 g (20 mmoles) de 2,2'-dipiridiIo, agitando durante 30 minutos. Adicionaram-se 50 g(306 mmoles) de 4-(dimeti 1 amino)-acetofenona e 25 g (230 mmoles) de 4-piridino--carboxaldeído. Aqueceu-se à temperatura de 85°C durante 20 horas. Evaporou-se o dissolvente e purificou-se o resíduo por cro matografia sobre gel de sílica (tolueno/acetato de etilo a 2:1) A recristalização em éter dietí1ico/cloreto de metileno deu 1,8 g do composto em título; P.F. 150°-151°C. -11-

Exemplo 4 1-(2-furanil)-3-(4-piridinil)-2-propeno-1-ona

Dissolveram-se 700 mg (4 mmoles) de acetato de cobal-to(II) anidro em 150 ml de dimetiIformamida. Adicionaram-se 500 mg (4 mmoles) de 2,2' dipiridilo e agitou-se durante 30 minutos. Adicionaram-se 5 g (50 mmoles) de 4-piridino-carboxal-deído e 5,5 g (50 mmoles) de 2-acetiIfurano. Aqueceu-se à temperatura de 80°C durante 18 horas. Evaporou-se o dissolvente e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (tolueno/acetato de etilo a 1:1) obtendo-se 30 mg do composto em título; P.F. 122°-124°C.

Exemplo 5 1-(tiofeno-2-il)-3-(4-piridinil )-2-propeno-1-ona

Dissolveram-se 700 mg (4 mmoles) de acetato de cobal-to(II) anidro em 100 ml de dimetiIformamida. Adicionaram-se 500 mg ( 4 mmoles) de 2,21-dipiridilo e agitou-se durante 30 minutos. Adicionaram-se 6,3 g (50 mmoles) de 2-(acetiltiofeno e 5 g (50 mmoles) de 4-piridino-carboxaldeído e aqueceu-se à temperatura de 80°C durante 18 horas. Evaporou-se o dissolvente e purificou-se o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (tolueno/acetato de etilo a 1:1). A recristalização em éter die-tí1ico/hexano deu 120 mg do composto em título; P.F. 150,5o-- 15 2 0 C. -12-

Exemplo 6 1-(3,4,5-trimetoxifenil)-3-(3-piridinil)-2-propeno-1-ona

Adicionaram-se 5,25 g (25 mmoles) de 3,4,5-trimetoxi-acetofenona, 2,35 ml (25 mmoles) de 3-piridino-carboxaldeído, 4,93 ml (50 mmoles) de piperidina, 2,86 ml (50 mmoles) de ácido acético e 25 ml de etanol. Aqueceu-se sob refluxo durante 6 horas, fazendo passar o destilado através de uma coluna de o peneiros moleculares de 3A (25 g). Diluiu-se com 600 ml de acetato de etilo, lavou-se com 200 ml de hidróxido de sódio 1N, em seguida com água e depois com solução saturada de cloreto de sódio, secou-se com sulfato de magnésio e evaporou-se o dissolvente. Purificou-se por cromatografia sobre gel de sílica com acetato de etilo a 90%/hexano. A recristalização (com cloreto de metileno/éter dietí1ico/hexano), forneceu 1,75 g do composto em título; P.F. 137°-138°C.

Anál. Calcd para C 1 7H 17N04: c, 68,21; H, 5,73; N, 4,68; Determ: C, 68,12; H, 5,75; N, 4,46.

Exemplo 7 1-(3,4,5-trimetoxifenil)-3-(2-piridinil)-2-propeno-1-ona

Associaram-se 5,25 g (25 mmoles) de 3,4,5-trimetoxi-acetofenona, 2,35 ml (25 mmoles) de 2-piridino-carboxaldeído, 4,93 ml (50 mmoles) de piperidina, 2,86 ml (50 mmoles) de ácido acético e 25 ml de etanol. Aqueceu-se sob refluxo durante 6 horas, fazendo passar o destilado através de uma coluna de 25 g o de peneiros moleculares de 3A. Diluiu-se com 600 ml de acetato -13- de etilo, lavou-se com solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, em seguida com água e depois com solução saturada de cloreto de sódio. Secou-se sobre sulfato de magnésio e evaporou--se o dissolvente sob vazio. Furificou-se por cromatografia sobre gel de sílica utilizando como eluente acetato de etilo a 70%/hexano e recristalizou-se em cloreto de metileno/éter die-tí1ico/hexano para se obter o composto em título; P.F. 94°-95°C.

Anál.Calc. para C17H17N04: C, 68,21; H, 5,73; N, 4,68;

Determ: C, 68,25; H, 5,72; N, 4,52.

Exemplo 8 1-fenil-3-(4-piridinil)-2-propeno-1-ona

Juntaram-se 9,53 ml (0,1 mole) de 4-piridino-carbo-xaldeído, 3,0 ml (0,05 mole) de ácido acético, 5,0 ml (0,05 mole) de piperidina e 20 ml de etanol. Aqueceu-se sob refluxo, fazendo passar o destilado através de uma coluna de peneiros mo-o leculares de 3A. Adicionaram-se 5,82 ml (0,05 mole) de aceto-fenona em 20 ml de etanol em 8 porçóes iguais durante 8 horas e submeteram-se a refluxo durante a noite. Evaporou-se o dissolvente sob vazio, dissolveu-se o resíduo em 700 ml de cloreto de metileno, lavou-se 2 vezes com hidróxido de sódio 1N e secou-se com sulfato de magnésio. Evaporou-se o dissolvente sob vazio e purificou-se o resíduo por cromatografia sob gel de sílica utilizando como eluente acetato de etilo a 80%/hexano. Dissolveu--se o produto em 600 ml de cloreto de metileno, lavou-se com 100 ml de água contendo 2,5 g de bissulfito de sódio, 100 ml de água e solução saturada de cloreto de sódio. Secou-se com -14- sulfato de magnésio, evaporou-se o dissolvente sob vazio e cristalizou-se (2x em éter dietílico). Secou-se à temperatura de 50°C sob vazio (1 mmHg) para se obter 3,7 g do composto em título; P.F. 77°-78°C.

Anál. Cale. para C^H^NO: C, 80,38; H, 5,30; N, 6,69;

Determ: C, 80,24; H, 5,30; N, 6,66.

Os compostos seguintes podem preparar-se por processos análogos aos descritos anteriormente nos Exemplos 1 a 8: 1 -(t i ofen-2-il)-3-(3-piridinil)-2-propeno-1-ona; 1-(tiofen-2-il)-3-(2-piridinil)-2-propeno-1-ona; 1 -(2-furani1)-3-(3-piridini1)-2-propeno-1-ona; 1-(2-furani1)-3-(2-piridini1)-2-propeno-1-ona; 1 -(4-dimeti 1aminofeni1)-3-(3-piridinil)-2-propeno-1-ona; 1 -(4-dimeti 1aminofen il)-3-(2-piridinil)-2-propeno-1-ona; 1-C (4-metilmercapto)fenilJ-3-(3-piridinil)-2-propeno-1-ona; 1 -C (4-meti 1 mercapto)feni 1 j7-3-(2-piridinil)-2-propeno-1-ona; 1 -(3-trifluorometilpeni1)-3-(3-piridini1)-2-propeno-1-ona; 1 -(3-trifluometilfeni1)-3-(2-piridinil)-2-propeno-1-ona.

Num aspecto da presente invenção proporciona-se um método para inibir a absorção do cálcio nos leucócitos. Como aqui se utiliza o termo "inibição" refere-se a qualquer processo através do qual a absorção do cálcio nos leucócitos é retardada, interrompida ou detida não se querendo necessariamente indicar a eliminação total da absorção do cálcio nas células ou nos tecidos afectados. +2 -15-

Os termos "cálcio" e "ião cálcio" (Ca ) podem ser utilizados indiscriminadamente para referir o elemento cálcio e os seus estados iónicos que podem estar sempre activamente envolvidos nos processos celulares de leucócitos. Além disso, entende-se que a inibição da absorção do cálcio nos leucócitos pelos compostos de fórmula geral (1) pode afectar um ou mais estados elementares do cálcio e não deve estar limitada a qualquer forma iónica do cálcio e/ou das suas associações com qualquer ião contrário particular; por exemplo, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, fluoreto de cálcio, etc. são conhecidos e devem ser considerados como abrangidos pela definição do cálcio aqui utilizada. A absorção do cálcio nos leucócitos é um dos eventos que assinala a activação dos leucócitos e serve como mensageiro secundário para a célula. Frequentemente a absorção do cálcio está dependente de algum mensageiro principal, como, por exemplo, a ligação de um ligando ao seu receptor na superfície da célula. A ligação de ligandos aos seus receptores pode servir para abrir os canais do cálcio permitindo a sua entrada no cito-sol, onde em seguida funciona como um mensageiro secundário. Quando as células estão activados, correspondendo a um influxo de iões cálcio podem ocasionar diversos eventos que conduzem ou contribuem para as doenças inflamatórias ou do sistema imunoló-gico.

Os leucócitos abrangem uma classe de células do sistema imunológico que são histológica e bioquimicamente distintas de outras células do sistema imunológico. Os leucócitos, como -16- referidos aqui, abrangem cinco classes principais de células: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, macrófagos e linfócitos. Nesta classe de células pode ainda haver classificações de tipos celulares; por exemplo, os neutrófilos podem ainda incluir os leucócitos polimorfonucleares. Todas as classes principais de leucócitos estão relacionadas, uma vez que derivam de uma célula indiferenciada miebóide progenitora. Embora o termo neu-trófilo aqui seja utilizado frequentemente, ele utiliza-se para exemplificar a acção dos leucócitos como de todas as células derivadas das células miebóides indiferenciadas não significando qualquer limitação do uso ou da administração dos compostos de fórmula geral (1) que podem ser causadores ou sintomáticos da acção de qualquer tipo particular de leucócitos ou células do sistema imunológico. Além disso, a acção dos leucócitos, por um processo que limita ou detem a absorção do cálcio para utilizar uma cura de um processo de doença, não se limita às doenças que são provenientes de tecidos ou células múltiplas e abrange uma interacção complexa de interacções de tecidos e celulares. Um aspecto da presente invenção consiste na inibição da absorção do cálcio nos leucócitos em que o efeito da inibição origina uma alteração benéfica das funções fagocitárias dos leucócitos.

Entende-se, portanto, que as células leucóciticas podem ser classificadas de acordo com a função inibida; por exemplo, pode utilizar-se o termo fagócitos ou células com funções fagocíticas como um grupo ou subgrupo de células que abrangem as células aqui designadas como leucócitos.

Os leucócitos reagem a uma grande variedade de situações inflamatórias e imunológicas. Durante estes eventos a acti- -17- vação do receptor ou a activação celular geral resulta numa fisiologia celular alterada em que os leucócitos começam a estar activados frequentemente, o termo "activação" é utilizado para referir o processo ou o estado dos leucócitos que iniciaram a sua activação e que se pode caracterizar pela resposta das células à absorção do cálcio enquanto se tornam activadas ou mantêm o estado de activação. A activação de mecanismos celulares oxidativos e não oxidativos que resulta da activação dos leucócitos desempenha um importante papel no desenvolvimento de numerosos processos de doenças imunológicas. Como parte do sistema da defesa celular, incluindo os sintomas indesejáveis e a lesão de tecidos do hospedeiro, a activação dos leucócitos participantes constitui uma acção dependente do cálcio.

Os processos de doença não infecciosos em que os leucócitos, principalmente os neutrófilos, são considerados como desempenhando uma parte integral nos sintomas e na lesão dos tecidos do hospedeiro incluem: gota, artrite reumatóide, vascu-lite imune, glomerulonefrite, dermatose neutrofí1ica, doença inflamatória do intestino, enfarte do miocárdio, síndrome de desconforto respiratório do adulto, enfisema, asma, lesão pelo calor associada a hemólise e neoplasias malignas nos sítios de inflamação crónica (Malech e Gallin; 1987).

Em numerosas doenças de auto-imunidade, como por exemplo a gota, artrite auto-imune, vasculite auto-imune e algumas formas de glomerulonefrite, verifica-se que os neutrófilos se acumulam nas áreas das articulações e contribuem para a destruição da articulação e do tecido mole. Embora numerosos processos 18- de doenças estejam envolvidos na patofisiologia destas doenças, o recrutamento dos neutrófilos para a área está bem documentado e pode ser responsável por grande parte dos aspectos histopatoló-gicos observáveis nestas doenças. Neste sentido, numerosos estudos experimentais têm demonstrado claramente que os processos não oxidativos que resultam da activação dos neutrófilos, particularmente a libertação da elastase neutrofílica e outras enzimas proteolíticas e glicolíticas, podem directamente lesar os tecidos do hospedeiro.

Uma grande variedade de alterações dermatopáticas estão associadas à infiltração de neutrófilos nos tecidos ecto-dérmicos e dérmicos da pele. Incluem-se nestas doenças da pele, em que os neutrófilos participam no progresso de doença, mas não se limitam a estas, as formas de dermatoses psoriasiformes, dermatoses neutrofílica dos vasos como se encontra na síndroma da Sweet e na doença de Behcet e piodermia gangrenosa. Nestes processos de doença os neutrófilos servem para aumentar e manter os sintomas inflamatórios, reforçando a lesão tecidular e podem, portanto, impedir a cura.

Numerosas outras doenças, tais como a doença inflamatória do intestino e o enfarte do miocárdio, estão relacionadas com a deficiência da função neutrofílica num órgão em especial. Estudos em animais surgerem que as anomalias da circulação dos neutrófilos no intestino resultam numa activação anormal destas células. No mesmo sentido, os neutrófilos têm-se revelado como recrutados para o enfarte dos tecidos do miocárdio e como desempenhando um papel no aumento da lesão do tecido após o enfarte do miocárdio. -19- A patogénese de numerosas doenças respiratórias, incluindo a síndrome de desconforto respiratório do adulto, (ARDS), enfisema e asma, têm sido relacionadas com a infiltração de neu-trófilos e agravamento da doença. 0 dano oxidativo mediado pelos neutrôfilos nos tecidos pulmonares pode ser um componente importante na patogénese destas doenças respiratórias. Além disso, a acumulação de neutrôfilos, com a libertação de elastase, pode ter um papel importante na destruição do tecido no enfisema e um importante papel nas fases finais da resposta inflamatória da asma alérgica. A resposta alérgica, durante a qual os neutrófi-los libertam os seus componentes, pode ocorrer por libertação da histamina nos mastócitos. A activação dos neutrôfilos pode ser útil na patogénese geral das doenças relacionadas com a activação do complemento. Sabe-se que o complemento pode activar os neutrôfilos com produção simultânea de radicais hidroxilo. A produção de radicais hidroxilo proveniente da activação dos neutrôfilos pode ser aí responsável pela fragilidade dos eritrócitos e peta he-mólise intravascular associada à activação do complemento. 0 termo "inflamação" tal como aqui se utiliza designa um processo que muito frequentemente envolve os leucócitos do sistema imunológico e que ê o processo envolvido nas "situações inflamatórias". Clinicamente, os principais sinais de inflamação podem incluir um ou mais dos sintomas seguintes: vermelhidão, edema, calor, dor, perda de função e febre. Contudo, certas situações celulares acompanhantes da inflamação incluem, mas não estão limitadas a, activação dos leucócitos, marginação e -20- emigração dos leucócitos e exudação leucocitária. Também se considera que em qualquer condição em que existe um estado inflamatório latente ou precose os leucócitos podem participar nas causas subjacentes ou servir para prolongar ou expandir o estado de doença. Portanto, os processos que envolvem uma situação inflamatória são considerados como envolvendo os leucócitos do sistema imuno-lógico e, como tal, podem ser considerados no reportório das "doenças imunes" e situações afectadas pelos leucócitos susce-ptíveis de serem tratadas com os compostos de fórmula geral (1). Também se considera que os compostos da presente invenção que podem alterar a absorção do cálcio pelos leucócitos sejam potencialmente benéficos na melhoria de condições que envolvem as doenças inflamatórias e/ou imunes. 0 desenvolvimento de métodos como os da presente invenção para anular as respostas dos neutrófilos ou para inactivar os metabolitos oxidativos dos neutrófilns e o conteúdo de grânulos será útil para limitar a destruição de tecidos nestas doenças inflamatórias não infecciosas.

As plaquetas (trombocitos), são células anucleadas do sangue que derivam de megacariocitos da medula óssea. As plaquetas também são necessárias para a coagulação sanguínea e auxiliam a reparação de roturas nas paredes dos vasos sanguíneos. A reacção das plaquetas à formação de coágulos e na reparação dos danos nos tecidos vasculares podem também apresentar numerosos efeitos secundários indesejáveis; por exemplo, durante a re-perfusão isquémica, a formação de trombos e a agregação associada às plaquetas pode eventualmente conduzir à oclusão da artéria. -21-

Neste campo também é bem conhecido que a coagulação ou oclusão das paredes das artérias e veias pode conduzir a ocorrência de enfarte miocárdio. Também é bem conhecido que o cálcio é necessário para o processo da coagulação do sangue e para a formação de trombos; por exemplo, a modulação da resposta de coagulação por EDTA e outros agentes quelantes que se ligam ao cálcio está firmemente estabelecida nesta área. Considera-se, portanto, que a inibição da absorção do cálcio nas plaquetas pode considerar--se por si mesma um meio viável para modular terapeuticamente a activação plaquetária, que pode incluir a libertação de mediadores vasoactivos e a formação de agregados de plaquetas, quando com esse fim se administra a um doente. A designação de "doente" utilizada aqui refere-se a um animal de sangue quente, tal como um mamífero, que é portador de um dado estado de doença imune. Entende-se que cães, gatos, ratos, murganhos, cavalos, gado, carneiros e seres humanos, são exemplos de animais abrangidos pela significação deste termo.

Considera-se que os compostos de fórmula geral (1) exer cem o seu efeito inibidor da absorção do cálcio nos leucócitos e nas plaquetas, proporcionando, portanto, alívio nos mecanismos dependentes do cálcio envolvidos na imunorregulação, incluin do as doenças inflamatórias e do sistema imunológico. Contudo, entende-se que a presente invenção não se limita a qualquer mecanismo teórico ou proposto particular para explicar a sua eficácia e aplicação última. Também se entende que o uso dos presen tes compostos de fórmula geral (1) abrange igualmente os seus ra dicais que incluem os seus derivados de fórmulas gerais (1a), (1b), (1c) e (1d). -22-

Como é bem conhecido pelos técnicos nesta área, vários estados de doença e certas doenças do sistema imunológico inflamatórias são caracterizados por eventos que conduzem à absorção de cálcio nos leucócitos. Como aqui se utiliza, "eventos que conduzem à absorção de cálcio nos leucócitis" referem-se tanto a estados iniciais conduzindo à situaçao inicial ou estados associados como a eventos associados à manutenção da inflamação ou da situação imune. Além disso, também é conhecido que certas doenças cardiovasculares são caracterizadas por eventos que conduzem à absorção do cálcio nas plaquetas e estes eventos podem referir-se logo a eventos iniciais conduzindo à situação ou a eventos associados à manutenção da doença cardiovascular.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de um doente com um estado de doença cálcio-dependente, nos leucócitos, podendo este estado ser, mas não estando limitado a, uma doença inflamatória ou imune, que consiste em administrar uma quantidade eficaz, inibidora da absorção do cálcio, de um composto de fórmula geral (1).

Uma quantidade terapeuticamente eficaz, inibidora da absorção do cálcio, de um composto de fórmula geral (1) significa uma quantidade que é eficaz para controlar a activação dos leucócitos envolvidos em estados de doença do sistema imunológico. Considera-se que a designação "controlo da activação" se refere a todos os processos em que pode existir um abrandamento interrupção, suspensão ou paragem na progressão da doença imune e não indica necessariamente uma eliminação total dos sintomas. -23-

Além disso, também se sabe que certas doenças cardiovasculares são caracterizadas por eventos que conduzem à absor-çáõ de cálcio nas plaquetas, podendo estes eventos ser direc-tamente relacionados com eventos iniciais conduzindo à situação ou com eventos associados à manutenção do estado de doença cardiovascular. A presente invenção também proporciona um método para o tratamento de um doente portador de doença dependente do cálcio nas plaquetas, podendo esta doença incluir, mas não se limitando a, doenças cardiovasculares, que consiste em administrar uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral (1), que iniba a absorção de cálcio.

Uma quantidade inibidora da absorção do cálcio terapeu-ticamente eficaz de um composto de fórmula geral (1) significa uma quantidade que tem eficácia para controlar a função plaquetária envolvida na doença cardiovascular. A designação controlo da função plaquetária envolvida na doença cardiovascular refere-se a abrandamento, interrupção ou paragem na progressão da doença cardiovascular e não indica necessariamente a eliminação total de todos os sintomas da doença.

Uma quantidade inibidora com eficácia terapêutica numa doença ou situação cardiovascular ou imune, pode ser facilmente determinada pelo médico assistente, como especialista na matéria, mediante a aplicação de técnicas convencionais e observação dos resultados obtidos em circunstâncias análogas. Na determinação da dose terapeuticamente eficaz, são considerados numerosos factores pelo médico, que incluem, mas não estão limita- -24- dos a: espécie de mamífero; estatura, idade e saúde geral; doença específica envolvida; grau ou envolvimento na gravidade da doença; reacção individual do doente; composto particular administrado; modo de administração; características de biodisponi-bilidade da preparação administrada; posologia escolhida; uso de medicação simultânea; e outras circunstâncias importantes.

Uma quantidade com eficácia terapêutica do composto de fórmula geral (1) pode variar entre 0,1 miligrama por quilograma de massa corporal e por dia (mg/Kg/dia) e cerca de 100mg/Kg/ /dia. Admite-se que as quantidades preferidas estejam compreendidas entre 0,5 e 10 mg/Kg/dia, aproximadamente.

No tratamento eficaz de um doente portador de uma doença como as referidas anteriormente pode administrar-se um composto de fórmula geral (1) sob qualquer forma ou modo que tornem este composto biodisponível em quantidades eficazes, incluindo vias de administração oral e parentérica. Por exemplo, os compostos de fórmula geral (1) podem ser administrados por via oral, subcutânea, intramuscular, endovenosa, transdérmica, intranasal, rectal, tópica, etc. A administração oral é, de um modo geral, a preferida. Um técnico preparador de composições pode facilmente escolher a forma apropriada e um modo de administração dependendo das características particulares do composto escolhido, do estado de doença a tratar, do estádio da doença e de outras circunstâncias importantes.

Os compostos podem administrar-se isoladamente ou sob a forma de composições farmacêuticas, em associação com veículos -25- ou excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, cuja proporção e natureza são determinadas pela solubilidade e propriedades químicas do composto escolhido, da via de administração seleccionada e da prática farmacêutica convencional. Os compostos desta invenção, embora eles próprios eficazes, podem ser preparados e administrados sob a forma dos seus sais de adição de ácido aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tomando em consideração a estabilidade, conveniência de cristalização, solubilidade acrescida, etc.

Num outro aspecto da presente invenção proporcionam-se composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral (1) em mistura ou de qualquer forma associado a um ou mais veículos ou excipientes aceitáveis em farmácia. A designação "quantidade eficaz inibidora da absorção do cálcio" aplicada aos compostos de fórmula geral (1) refere--se a quantidades inibidoras eficazes apropriadas para inibir absorção do cálcio nos leucócitos podendo esta inibição ser num doente que sofra de doença imune ou inflamatória. A designação de "quantidade eficaz inibidora da absorção do cálcio" é ainda aplicada aos compostos de fórmula geral (1) para referir quantidades inibidoras eficazes, como apropriado, para inibirem a absorção do cálcio nas plaquetas, sendo esta inibição dirigida a um doente que sofra de uma doença associada ao sistema cardiovascular.

As composições farmacêuticas são preparadas por métodos convencionais. 0 veículo ou excipiente pode ser um material sólido, semi-sólido ou líquido que possa servir como veículo ou -26- ou meio para o componente activo. Os veículos e excipientes apropriados são bem conhecidos. As composições farmacêuticas podem ser adaptadas para administração oral, parentérica ou tópica a um doente, sob a forma de comprimidos, cápsulas, supositórios, soluções, suspensões, etc.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via oral , por exemplo, com um dissolvente inerte ou com um veículo comestível. Podem também ser incluídos em cápsulas de gelatina ou em comprimidos. Para a administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e utilizados sob a forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, gomas de mascar, etc. Estas preparações devem conter pelo menos 4% do composto da presente invenção, o componente activo, mas esta quantidade pode também variar dependendo da forma particular e pode situar-se de forma conveniente entre 4% e cerca de 701 do peso da unidade. A quantidade do composto presente nas composições é de forma à obtenção de uma posologia apropriada. As composições e preparações preferidas, de acordo com a presente invenção, são preparadas de forma a que a dose oral unitária contenha 5,0 a 300 miligramas de um composto da presente invenção.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e outros podem também conter um ou mais dos adjuvantes seguintes: agentes ligantes, tais como celulose microcristalina, goma de tra-gacanta ou gelatina; excipientes, tais como amido ou lactose; agentes de desagregação como o ácido algínico, Primogel, amido de milho, etc.; agentes lubrificantes como o estearato de magnésio ou o Sterotex; agentes deslizantes como o dióxido de -27- silício coloidal; e agentes apaladantes como a sacarose ou a sacarina, agentes aromatizantes como a essência de hortelã--pimenta, salicilato de metilo ou a essência de laranja. Quando a forma unitária é uma cápsula, esta pode conter, além das substâncias do tipo referido anteriormente, um veículo líquido como, por exemplo, polietilenoglicol ou um óleo gordo. Outras formas posológicas unitárias podem conter diversos materiais que modifiquem a forma física da dose unitária, por exemplo, revestimentos. Assim, os comprimidos ou as pílulas podem ser revestidos com açúcar, goma-laca ou outros agentes de revestimento entérico. Um xarope, pode conter, a'ém dos compostos da presente invenção, sacarose, como agente edulcorante, e certos conservantes, corante e aromas.

Os produtos usados na preparação das diversas composições devem ser de qualidade farmacêutica, não tóxicos na quantidade utilizada.

Para administração terapêutica por via parentérica, os compostos da presente invenção podem ser incorporados numa solução ou suspensão. Estas preparações devem conter, pelo menos 0,1% de um composto desta invenção mas esta quantidade pode estar compreendida entre cerca de 0,1 e cerca de 50%, do seu peso. A quantidade do composto da invenção contida nestas composições será tal que se obtenha uma dose apropriada. As composições e preparações preferidas, de acordo com a presente invenção, são preparadas de forma a conterem numa unidade de dose para administração parentérica 5,0 a 100 miligramas de um composto da presente invenção. -28-

Os compostos de fórmula geral (1) desta invenção podem ainda ser administrados por via tópica e, neste caso, o veículo pode apropriadamente ser uma solução, uma pomada ou uma base em gel. A base, por exemplo, pode conter um ou mais dos seguintes produtos: parafina, lanolina, polieti lenogl icóis, cera de abelhas, óleo mineral, dissolventes como a água ou álcool, e agentes emulsionantes e estabi1izantes. As composições tópicas podem conter uma concentração de um composto de fórmula geral (1) ou de um seu sal compreendida entre cerca de 0,1 e 10% p/v (peso por unidade de volume).

As soluções ou suspensões podem ainda incluir um ou mais dos adjuvantes seguintes: dissolventes estéreis como a água para injectáveis, solução de cloreto de sódio, óleos fixos, polieti1enoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros dissolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como o álcool benzílico ou o meti1-parabeno; agentes antioxidantes como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminotetraacético; agentes tampão como os acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para correcção da tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou a dextrose. As preparações parentéricas podem apresentar-se em ampolas, seringas descartáveis ou frascos-ampola de dose múltipla, feitos de vidro ou material plástico.

Considera-se que os termos seguintes e (abreviaturas) aqui utilizados são sinónimos dois a dois; leucócitos polimorfo-nucleares (PMNL), ácido [ 4-(2-hidroxieti1)-1-piperazino-etanos-sulfónicoJ(HEPES), factor de gravidade multiplicativo utilizado 29- para exprimir a força centrífuga exercida durante a centrifugação (xg), mililitros (ml), graus celsius (°C), ião cálcio (Ca+^), nanometros (nm), dimetilsulfóxido (DMSO), ácido etileno bis(oxietilenonitrilo)-tetraacético (EGTA), gramas (g), miligramas (mg), nanogramas (ng), molar (NI), milimolar (nM), mic^o-molar (yjM), zimozan opsonizado (OZ), acetomiristato de forbol (PMA), formi1-metioni1-leucilfeni1ala nina (fMLP), leucotrieno b4 (lt b4).

Os compostos são frequentemente representados por uma abreviatura de três letras "NIDL", um espaço e cinco ou seis dígitos. Consideram-se aí abrangidas as representações seguintes: 1-fenil-3-^ (4-benziloxi)feni1 7-2-propino-1-ona (MDL 100, 225) 1-(fenil-3-(4-piridinil)-2-propino-1-ona (NIDL 101 , 098); 1-(4--dimeti 1 aminofeni 1 )-3-(4-piridini 1)-3-propino-1 -ona (NIDL 102, 175); 1 - f en i 1 - 3 - Z" (4-benziloxi )fenil J-2-propino-l-ona (NIDL 101, 097); 1-(4-dimetilaminofenil)-3-(4-piridini1)-2-propeno--1-ona (NIDL 101, 240); 1 -feni 1 -3-(4-piridini 1)-2-propeno-1 -ona (NIDL 29, 355); 1 -(4-dieti 1 aminofeni 1)-3-(4-quino 1 ini 1)-2-propi-no-1 -ona (NIDL 102, 387). A resposta dos leucócitos aos sinais de activação (estimulantes) pode ser avaliada pela determinação in vitro do cál cio intracelular ou pela determinação de factores libertados, tais como o anião superóxido e mieloperoxidase. Também, a resposta dos leucócitos à estimulação in vivo, pode ser avaliado em animais de experiência pelo edema, tal como o edema experimental na pata do rato induzido pela carragenina, artrite experimental induzida no rato pelo adjuvante de Lewis, e a reacção -30- de Arthus na pele do rato. A Requerente descreve, em seguida, o método e a utilização dos compostos reivindicados e a sua utilidade nos ensaios precedentes.

Materiais

Utilizaram-se ratos Sprague-Dawley (150-250 gramas) provenientes de Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN). Suplementaram-se sais equilibrados de Hanhs (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) com HEPES 20 mM e ajustou-se o pH para 7,4. Utilizou--se caseínado de sódio proveniente de ICN Biochemical (Cleveland, OH) A ionomicina era proveniente de Cal Biochem. (San Diego ,CA). A superóxido dismutase era de DDI Pharmaceuticals (Mountain View, CA). Todos os outros reagentes são provenientes de Sigma Chemical Co. (St. Louis. MO). Todos os reagentes adquiridos foram utilizados tal como recebidos.

Isolamento de leucócitos polimorfonucleares (PMNL)

Os PMNL de ratos foram obtidos de exudados resultantes de injecção peritoneal de 6 ml de caseínato de sódio a 8%. Decorridas 18 horas após a injecção sacrificaram-se os ratos por inalação de dióxido de carbono e lavou-se a cavidade peritoneal com solução salina equilibrada de Hanh (HBSS). Após a concentração de PMNL por centrifugação, os eritrocitos contaminantes foram eliminados por lise hipotónica. Os PMNL foram, em seguida, lavados por duas vezes por centrifugação durante 10 minutos a 400 xg e ressuspensos em meio HBSS. A viabilidade das células foi superior a 90% por exclusão com azul de Trypan e mais de 90% 31 eram células PMNL de acordo com a coloração de Wright-Giemse. Avaliação do cálcio intracelular

Obtiveram-se os níveis de cálcio intracelular utilizando Fura-2 como indicador fluorescente (Grynkiewiez et al., 1985). Empregiou-se Fura-2 em PMNL sob a forma do éster acetoximetí 1 ico (Fura-2/ΑΜ) utilizando o método de Korchak et al., (1988). Es-

O pecificamente, incubaram-se 1 χ 10 PMNL/ml em HBSS com Fura-2/ΑΜ 10 ^uM, durante 10 minutos à temperatura de 37°C. A suspensão de células foi em seguida diluída dez vezes com HBSS e depois incubada durante outros 20 minutos. Depois centrifugaram-se as células a 400 xg durante 8 minutos à temperatura de 25°C e ressus-penderam-se os PMNL (1 χ 10^ células/ml) em HBSS contendo albumina de soro de bovino a 1%. As células foram mantidas à temperatura ambiente e utilizadas em 3 horas.

As determinações dos níveis de cálcio intracelular foram realizadas utilizando um espectrofluorómetro de comprimento de onda duplo (Photon Technology International, New Bruns-wich, Nj). Agitaram-se 2 ml de suspensão de PMNL (1 χ 10 células/ml) com o auxílio de um agitador magnético, à temperatura de 37°c. As células foram previamente incubadas com os compostos durante 15 minutos à temperatura de 37°C antes da activação. Os compostos foram dissolvidos em DMS0 e adicionados directamente nunca se excedendo a quantidade de DMS0 em 0,3% no final da suspensão celular. A alteração total do volume com adição dos compostos ou veículo e do estímulo nunca excedeu 3%. As concentrações de cálcio intracelulares foram calibradas colocando-se um -32- nível máximo de cálcio das células com a adição de ionomicina 7 jjM a PMNL em HBSS contendo 1% de BSA. Isto foi seguido por tratamento com EGTA 20 mM durante 1 hora para se obter um nível mínimo de cálcio. Foi utilizado o método de Grynkiewiez et al., (1985) para quantificar os níveis de cálcio intracelular, considerando que a KQ para Fura-2 era de 240 nM. Cada experiência foi realizada e repetida em três ocasiões separadas e o esquema das alterações do cálcio é representativo destas experiências.

Libertação de mieloperoxidase (MPO)

Determinou-se a libertação de MPO utilizando a oxida- ção de 0-dianisidina catalisada por MPO. As experiências realizaram-se em placas de 96 miocrocavidades (Webster e Henson, 1978). Em cada cavidade incubaram-se alíquotas de 50 microlitos

7 suspensão de PMNL (2 χ 10 células/ml em HBSS), com veículo contendo HBSS (0,3¾ de DMSO) ou inibidor, durante 30 minutos à temperatura de 37°C. A concentração final em DMSO nunca excedeu 0,3% e foi constante durante cada experiência. Para a activação de PMNL, adicionaram-se 50 p\ de cada um dos reagentes seguintes, durante 30 minutos à temperatura de 37°C: N-formil--Met-Leu-Phe (fMLP; 0,1 ytiM); acetomiristato de forbol (PMA, 200 ng/ml); ou zimosan opsonizado de soro de rato (0Z; 2,6 mg/ml, preparado pelo método de Ward et al., 1983). Os estímulos foram adicionados em 50 jul de HBSS que também continha os compostos ou o veículo, como apropriado, para evitar a alteração da concentração do inibidor. -33- A activação celular foi determinada por centrifugação das placas a 600 x g durante 5 minutos à temperatura de 22°C. Retiraram-se aliquotas (100 ^il) de sobrenadante de cada cavidade e transferiram-se para uma placa microtituladora de 96 cavidades de fundo plano para o doseamento de MPO. A cada alíquota de sobrenadante adicionaram-se 100 jil de solução preparada recentemente contendo 50 jjI de tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 6,2), 25 jjl da 0-dianisidina 3,9 mM e 25 |il de peróxido de hidrogénio 0,015 M. Obtiveram-se brancos utilizando a mesma solução sem peróxido de hidrogénio. Agitaram-se placas e, em seguida, incubaram-se à temperatura ambiente na ausência de luz durante cerca de 15 minutos. Mediram-se as absorvâncias a 450 nm.

Produção de anião superóxido (SOA) A produção de anião superóxido foi medida por um método semelhante ao método de Leslie (1987) utilizando placas mi-crotituladoras, na presença de catalase (Arthur et al-, 1987).

Incubaram-se aliquotas de 50 ul de uma suspensão de PMNL de ra-7 * to (2 x 10 células/ml em HBSS) com 50 jil de veículo contendo HBSS (0,3¾ de DMS0) ou o composto, durante 30 minutos à tempera tura de 37°C, do modo descrito anteriormente. Em seguida, adicionou-se a cada amostra 100 microlitos de tampão contendo 5,98 mg/ml de citocromo C (Sigma Type III) e 0,1 mg/ml de catalase, mais os compostos quando apropriado. Para a determinação espec-trofotométrica preparou-se também um branco, contendo células ~ não estimuladas na presença de citocromo C, catalase e S0D. Para a activação de PMNL, adicionaram-se 75 jil de PMA ou de 0Z pa ra se obter a concentração final do activador celular (mais o -34- veículo ou inibidor como descrito anteriormente para a libertação de MPO) e em seguida incubaram-se as células à temperatura de 37°C durante 60 minutos. Determinou-se a activação por centrifugação a 600 x g durante 5 minutos à temperatura de 4°C.

Em seguida, transferiram-se alíquotas (200 ^il) de sobrenadante para uma segunda placa microtituladora de fundo plano e analisa-ram-se por espectrofotometria a 550 nm.

Exemplo 9

Efeito de estímulos diversos no cálcio intracelular de leucócitos polimorfonucleares (PMNL)

Estimularam-se PMNL de rato previamente impregnados com Fura-2, com fMLP e seguiram-se os níveis de cálcio intracelular (Figura 1). 0 péptido fMLP quimiotáctico produziu uma resposta bifásica com um primeiro pico que atingiu um máximo após 30 segundos e um segundo pico que atingiu un máximo cerca de 100 segundos após o estímulo péptidico A resposta bifásica é consistente com a observada por Korchak et al., (1986) para os neutrófilos humanos, em que o máximo da resposta corresponde a uma libertação precose de cálcio intracelular, como seria produzida por uma resposta com LTB^. A segunda fase da resposta, correspondendo ao segundo pico, cerca de 100 segundos após o estímulo, é associada a um influxo de cálcio extracelular, típico de uma resposta induzida por Con-canavalina A. A resposta bifásica é interpretada pelos especialistas na matéria como significando que a primeira fase é a libertação de cálcio intracelular e a segunda fase corresponde ao influxo de cálcio extracelular. -35- A incubação prévia de PMNL com MDL 101 240 ou MDL 29 355, representada na Figura 1, resultou numa supressão selec-tiva dependendo da concentração da segunda onda de alterações de cálcio intracelular. A inibição do segundo pico da resposta pelos compostos de fórmula geral (1), como representado pelas ac-tividades de MDL 101 240 e MDL 29 355, pode observar-se como efi caz para inibir a absorção de cálcio dos PMNL tratados. Pode observar-se também uma inibição para MDL 101 240 mais forte do que para MDL 29 355, embora ambos os compostos sejam nitidamente inibidores mediante a supressão da segunda fase da resposta. No entanto, a concentrações elevadas (> 100 ^im), os compostos começam a afectar a primeira fase (dados não representados). A resposta do controlo, onde não está incluído qualquer composto de fórmula geral (1), ao estímulo fMLP, apresenta a resposta bifásica. -36-- -36--

ω Ο Ό Β W) <υ W ο & ω Η Ο Ο Τ Ο Ο Ν Ο Ο χ !Mq] -37-

Exemplo 10

Efeito dos presentes compostos na libertação de enzima de PMNL de rato e formação do anião superóxido

Isolaram-se PMNL de rato em HBSS contendo ião cálcio.

Como resumido no Quadro seguinte, a estimulação de fMLP em PMNL de rato na presença de citocalasina B ou com zimosano opsonizado ou io-nomicina resulta na libertação de mieloperoxidase (fMLP/MPO, OZ/MPO e ION/MPO; colunas 2,4 e 6, respectivamente). A adição de MDL 29 355 ou MDL 101 240 mostrou uma inibição dose-dependen-te da libertação de mieloperoxidase nas concentrações dadas. Identicamente, PMA e OZ induziram a produção do anião superóxido que foi inibida de um modo dependente da dose pela adição de MDL 29 355 ou MDL 101 240. Estes dados também são consistentes com o efeito que se observa se PMNL de rato forem privados do cálcio extracelular (dados não representados). -38-

Efeito do estímulo na inibição de MDL 29 355 de PMN, MPO e SOA de rato 1 CONC 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (uM) MDL' 102 175 fMLP/MPO SEM 0Z/MP0 SEM I0N/MP0 SEM PMA/S0A SEM 0Z/S0A SEM 300 104,2 4,4 42,4 15,1 99,6 4,7 103,8 9,1 102,0 1,5 100 100,6 2,7 7,1 3,5 89,1 1,9 21,1 5,6 67,6 2,4 30 53,3 11,2 3,2 0,6 24,4 7,4 -12,3 12,7 27,5 6,8 10 16,5 7,1 3,6 7,4 14,8 6,5 -20,7 12,3 2,5 8,9 3 5,0 13,1 3,4 7,6 -1,7 7,3 -30,2 2,5 -12,6 13,6 1 0,1 7,4 -1,7 5,6 -4,5 6,9 -29,5 10,7 -10,7 18,2 4 SEM representa o erro-padrão da média para as experiências cujos números se indicam antes.

Efeito do estímulo na inibição de MDL 101 240 de PMN, MPO e SOA de rato 1 CONC (liM) MDL TE175 2 fMLP/MPO 3 SEM 4 OZ/MPO 5 SEM 6 I0N/MP0 7 SEM 8 PMA/SOA 9 SEM 10 OZ/SOA 11 SEM 100 112,5 9,3 141,5 23,5 35,6 13,1 81,5 1,7 85,0 3,2 30 67,3 3,6 82,5 5,5 12,0 13,6 34,5 3,5 66,3 9,4 10 31,2 1,4 28,1 4,8 -2,0 13,6 5,9 3,3 21,3 11,6 3 11,7 5,7 7,3 11,0 -5,0 4,4 4,7 1,1 2,5 13,0 1 13,1 6,6 2,5 11,0 -8,0 6,0 -7,2 3,0 -7,8 8,4 SEM representa o erro-padrão da média para as experiências cujos números se indica antes. -39-

Exemplo 11

Edema na pata do rato induzido pela Carragenina

Utilizaram-se ratos machos Charles River e Sprague Dawley com pesos compreendidos entre 90 e 100 gramas. A inflamação na pata posterior esquerda foi induzida por uma solução a 1% de carragenina (0,05 ml), injectada na superfície plantar da pata. A pata do outro lado foi injectada com igual volume de solução de cloreto de sódio. Os fármacos foram administrados por via oral ou intrape-ritoneal (1 ml/100 gramas) uma hora antes da injecção na pata.

Três horas após a injecção de carragenina foram medidas a diferença no volume da pata de controlo e na pata inflamada. Cada pata foi imersa numa cavidade com mercúrio e registado o volume do mercúrio deslocado. As patas foram uniformemente introduzidas no mercúrio até ao começo da pelagem. Utilizou-se um transdutor da pressão venosa ligado a um registador oscilogrâfico para medir pequenos volumes do mercúrio deslocado. Cada grupo de medições consistiu na média de quatro ratos, cada um com três determinações separadas. Os resultados do edema da pata do rato induzido pela Carragenina estão representados no quadro seguinte.

Edema na pata do rato induzida pela carragenina

Compostos Via % inibição MDL 29 355 i.p. 51,4 í 8,5 -40-

Exemplo 12

Artrite experimental no rato induzida por adjuvante de Lewis

Ratos provenientes de fêmeas Lewis (Charles River) com pesos compreendidos entre 150 e 200 gramas foram injectados por via intradérmica na cauda com 0,1 ml de Mycobacteriumubutyric m (Difco) em óleo mineral (5 mg/ml) ou apenas com óleo mineral. A partir do dia da inoculação e durante 32 dias, determinou-se o edema da pata para as patas esquerda e direita utilizando o método do deslocamento do mercúrio. Desde o 1s dia alguns animais foram tratados com 30 mg/Kg p.o. de MDL 29 355, uma vez por dia.

No 209 dia, quando o edema da pata de controlo tinha alcançado o máximo, os animais tratados com MDL 29 355 exibia significativamente menos inchaço, 36,4¾ - 16,6¾. No 32Q dia, o inchaço da pata.para os animais tratados não era significativamente diferente dos controlos não tratados (30,9 % - 22,4¾ inibidos), mas 1 de 3 animais tratados nunca apresentou artrite induzida pelo adjuvante, a qual se observava em todos os animais de controlo.

Exemplo 13

Reacção de Arthus na pele do rato

Ratos Sprague-Dawley, machos anestesiados (Charles River) com pesos de 200 a 250 gramas receberam 100 mg/Kg i.v. de solução de albumina de soro de bovino estéril (BSA, 5 mg/ml). Imediatamente após a injecção, os animais receberam uma injecção intradérmica de 100 ug de anti-BSA desenvolvido no coelho, em solução -41- de cloreto de sódio. Isto produz uma inflamação mediada por um complexo imune (reacção de Arthus) em que os complexos imunes fixam complemento libertando factores que atraem os neutrófilos.

Em seguida, os neutrófilos são activados provocando um dano local no tecido como manifestado pela presença de uma mancha hemorrágica. A extensão da reacção reflecte-se no tamanho da mancha medida por técnicas de análise de imagem. Quando se administrou MDL 29 355 por via intraperitoneal na dose de 100 mg/Kg 30 minutos antes do inicio da reacção de Arthus, o tamanho da mancha hemorrágica diminuiu cerca de 55,0¾ - 15,8¾. Quando se administrou MDL 29 355 por via intradérmica na dose de 100 jjg com o anticorpo, a mancha hemorrágica reduziu 41,7¾ - 12,5%.

Claims (13)

1. -42- REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de compostos de fórmula geral

   Rb (D na qual Ar representa um grupo de fórmula geral -43-

   em que Rlf R2 e R3 representam, cada um, independentemente, • um átomo de hidrogénio ou de halogéneo, um grupo alquilo , alcoxi C^_g, sulfureto de alquilo g ou benziloxi ou um grupo de fórmula geral -N (Y·^) (Y2) ou X2-(Ar) - (CH2)n-0- em que Y^ e Y2 repre sentam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^_g; Ar representa um grupo fenilo ou naftilo; n representa zero ou o número inteiro 1; X representa um grupo alcoxi ^ ou um grupo de fór mula geral N(Y^)(Y2); e z representa zero ou o número inteiro 1 ou 2, ou dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, ca racterizado pelo facto de se condensar uma cetona apropriada de fórmula geral 0 II Ar—C-CH3 1 -44 na qual Ar tem os significados definidos antes, com um piridinocarboxaldeído de fórmula geral CHO

   2 na qual Rl' R2 e R3 ^111 os icados definidos antes, na presença de acetato de cobalto (II) e de 2,2’-dipiridilo e no seio de um dissolvente polar aprõtico ou na presença de acetato de piperidina e no seio de um dissolvente polar.
2. 2, - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(tiofen-2-il)-3-(3-piridinil)-2-propeno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(2-tiofenil)-3-(2-piridinil)-2-propeno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos. -45-
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(2-furanil)-3-(3-piridinil)-2-propeno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(2-furanil)-3-(2-piridinil)-2-propeno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(4-dimetilaminofenil)-3-(3-piridinil)-2-prope-no-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(4-dimetilaminofenil)-3-(2-piridinil)-2-prope-no-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
8. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-[(4-metilmercapto)fenil]-3-(3-piridnil)-2-propeno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos. -46-
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-[(4-metilmercapto)fenil]-3-(2-piridinil)-2-pro peno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(3-trifluorometilfenil)-3-(3-piridinil)-2-pro-peno-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(3-trifluorometilfenil)-3-(2-piridinil)-2-prope no-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
12. 12. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de doenças dependentes do cálcio presente nos leucócitos ou nas plaquetas tais como doenças auto-imunes como, por exemplo, artrite reumatóide ou vascu-lite, doenças inflamatórias como, por exemplo, dermatoses neu-trófilas ou doenças cardiovasculares como, por exemplo, enfarte de miocãrdio, caracterizado pelo facto de se misturar, como in grediente activo, uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral (I) preparado pelo processo de acordo com uma qual- -47- quer das reivindicações 1 a 11 e que apresenta acção inibidora da captação de cálcio nos leucócitos ou nas plaquetas, ou de um seu sal aceitável em farmácia, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
13. 13.- Método para o tratamento de doenças dependentes do cálcio presente nos leucócitos ou nas plaquetas tais como doenças auto-imunes como, por exemplo, artrite reumatóide ou vasculite, doenças inflamatórias como, por exemplo, dermatoses neutrõfilas ou doenças cardiovasculares como, por exemplo, enfarte de miocãrdio, caracterizado pelo facto de se administrar diariamente a um doente uma quantidade compreendida entre 0,1 e 100 mg/Kg de peso do corpo.desse doente, de preferência entre 0,5 e 10 mg, de um composto de fórmula geral (I) preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 e com acção inibidora da captação do cálcio nos leucócitos ou nas plaquetas, ou de um seu sal aceitável em farmácia. O Agsnte Oficial da Propriedade Indusfrial