PT984982E

PT984982E - Analogos peptidicos de lh-rh suas utilizacoes e composicoes farmaceuticas contendo-os

Info

Publication number: PT984982E
Application number: PT98924306T
Authority: PT
Inventors: Remi Delansorne; Jacques Paris
Original assignee: Theramex
Priority date: 1997-06-02
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2002-02-28
Also published as: CN1263535A; DZ2509A1; WO1998055505A1; ZA983992B; EP0984982B1; NO995891D0; CO4790174A1; NO321786B1; JO2034B1; SI0984982T1; DK0984982T3; CN1134450C; AP1195A; HUP0003592A2; CA2292846A1; IL133210A0; DE69801369D1; AU7654198A; CA2292846C; PL195474B1

Description

DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS PEPTÍDICOS DE LH-RH, SUAS UTILIZAÇÕES E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO-OS"

Este invento refere-se a análogos peptídicos de LH-RH, à sua utilização e a composições farmacêuticas nas quais estão presentes. LH-RH, ou hormona libertadora da hormona luteinizante, é uma hormona neurohumoral produzida no hipotálamo que estimula a secreção das gonadotrofínas LH (hormona luteinizante) e FSH (hormona estimulante do folículo), que por sua vez regulam as funções endócrina e exócrina do ovário na fêmea, e dos testículos no macho. Possui a seguinte fórmula estrutural: 1234567 89 10 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Historicamente (Karten e Rivier, Endocr. Rev., 1986, 7(1), 44-66), foi alcançada uma melhoria sintética da actividade de LH-RH primeiro, através de substituição da glicinamida C-terminal por uma etilamida ligada directamente a Pro9, e depois, através da introdução de D-Ala na posição 6. Ambos os avanços independentes produziram análogos cada uma cerca de 5 vezes mais activo que LH-RH. Todos os agonistas terapeuticamente úteis resultam de mais melhoramentos importantes na posição 6 com a introdução de D-aminoácidos hidrófobos alifáticos ou aromáticos em vez de D-Ala, com ou sem a modificação combinada de Pro9-N-etilamida. Nesta extremidade C-terminal, apenas se obtiveram ligeiras melhorias com amidas fluorinadas ou com azaglicinamida. A /4 -2- substituição dc Trp na posição 3 por INal foi relatada (Kartcn c Rivier, 1986, cf. acima) para dar um agonista duas vezes mais potente que LH-RH, sem mais desenvolvimentos sintéticos ou terapêuticos. A única outra modificação individual de aminoácidos que se reparou que aumentava a actividade biológica de alguns agonistas verificou-se na posição 7. Assim, a N-metilação de Leu7 na própria LH-RH não aumentou a sua potência, mas aumentou a actividade de alguns agonistas sintéticos já potentes com alguns D-aminoácidos na posição 6 tais como D-Trp (Karten e Rivier, 1986, cf. acima); para além disso, L-aminoácidos carregados e mais volumosos que a leucina (Ser(0-Bul), Asp(0-Bul), Glu(0-Bul), BocLys) melhoraram de algum modo a actividade de [des-Gly10; Pro9-N-etilamida]-LH-RH mas reduziram a potência de agonistas modificados em 6 (Karten e Rivier, 1986, cf. acima).

No que se refere a antagonistas, numerosas modificações em todas as posições menos em Pro9, e uma grande variedade de combinações entre estas, foram tentadas com sucessos diferentes para alcançar a inibição da actividade da LH-RH endógena (Dutta, Drugs of the Future, 1988, 13(8), 761-787; Karten e Rivier, Endoc. Rev, 1986, 7(1), 44-66). Por exemplo, antide, um potente antagonista de LH-RH padrão, resulta de mudanças de aminoácidos nas posições 1, 2, 3, 5, 6, 8 e 10. A N-metilação de Leu7 trouxe uma diminuição na potência, e as únicas mudanças nesta posição que foram relatadas como aumentando-a (máximo de 2 vezes) foi a substituição de Leu7 por Trp7 ou Phe7. A síntese de três análogos de LH-RH modificados na posição 7 por um fenilo, uma ciclohexilalanina ou uma cicloleucina, foi descrita em Febs Letter 1981, 123(2). 300-302. WO 91/05563 refere-se a análogos de LH-RH de fórmula: -3- e «•••'«awQnv ^ N-Ac-A1-A2-A3-Ser-As-A6-A7-A8-A9-A10 na qual A7 representa em particular uma ciclohexilalanina. DE-A-2 424 287 descreve análogos de LH-RH de fórmula:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-X-Arg-Pro-Y

em que X representa Ser(‘Bu), Thr(‘Bu), Asp(OlBu), Glu(OlBu), Om(Boc) ou Lys(Boc).

Verificou-se presentemente que a substituição de Leu7 por adamantilalanina (Ada) ou neopentilglicina (Npg) aumenta a actividade da própria LH-RH e toma possível obter análogos com uma elevada afinidade para os receptores de LH-RH. Mais especificamente, os análogos [Npg7]-LH-RH deste invento são potentes agonistas/antagonistas de LH-RH in vivo.

Assim, de acordo com um aspecto do presente invento, são

proporcionados análogos peptídicos de LH-RH com alta afinidade para os receptores de LH-RH, nos quais Ada7 ou, de preferência, Npg7 substituem Leu7. De preferência estes análogos peptídicos são da fórmula (SEQID No: 1): (I)

Al-A2-A3-A4-A5-A6-HAA-A7-Pro-Z na qual: AI é pGlu; D-pGlu; Sar; AcSar; Pro ou um derivado deste tal como AcPro, ForPro, OH-Pro, Ac-OH-Pro, desidro-Pro ou Ac-desidro-Pro; Ser; D-Ser; Ac-D-Ser; Thr; D-Thr; Ac-D-Thr; ou um D-aminoácido aromático que possa ser acilado, tal como D-Phe, D-HPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D- -4- -4- A 3 U*' 4 Λ' /1# INal, D-difenil-Ala, D-Dal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A2 é uma ligação directa; His; ou um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-HPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A3 é um L- ou D-aminoácido aromático tal como Phe, HPhe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal, 4Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (C]-C4)alquilo, (C[-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, HPhe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal, 4Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Ora, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Cr C6)alquilo ou um (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Ci-C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil- -5- azaglicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBul); D-Asp(OBu); D-Glu(OBu‘); D-Thr(OBul); D-Cys(OBul); D-Ser(ORi) onde R.! é uma porção açúcar; um aza-aminoácido tal como azaGly ou azaAla; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (Q-Cõ)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Cr Cg)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo tal como D-Ala, D-Abu, D-Aib, D-3Aib, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Tle, D-Nle, D-Hol, D-Npg, D-CPa, D-Cpa, D-Cba ou D-Cha; um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-HPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-antril-Ala, D-fenantril-Ala, D-benzidril-Ala, D-fluorenil-Ala, D-Bal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Cr C4)alquilo, (CpC^alcoxi, nitro ou trifluorometilo; D-ciclohexadienil-Gly; D-perhidronaftil-Ala; D-perhidrodife-nil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Cr Có)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Cr Có)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nico-tinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, -6- -6-

£ }ϊ· pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-mctil-picoli-noílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; HAA é Ada ou Npg; A7 é um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Ci-C6)al-quilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (CrC6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; Z é GlyNH2; D-AlaNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é um (Cj-C^alquilo que pode ser substituído por um hidroxi ou um ou vários átomos de flúor, um (C3-Cõ)cicloalquilo, ou um radical heterocíclico seleccionado a partir de morfolinilo, pirrolidinilo e piperidilo; bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Nestes análogos peptídicos, HAA é de preferência Npg que pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C4)alquilo opcionalmente substituído por um ou vários átomos de flúor.

Um grupo preferido de análogos peptídicos (I) compreende os péptidos da fórmula (SEQID No: 6): (Γ)

Al-A2-A3-A4-A5-A6-Npg -A7-Pro-Z Át í -7- Át í -7- na qual: AI é pGlu; D-pGlu; Sar; AcSar; Pro ou um derivado deste tal como AcPro, ForPro, OH-Pro, Ac-OH-Pro, desidro-Pro ou Ac-desidro-Pro; Ser, D-Ser; Ac-D-Ser; Thr; D-Thr; Ac-D-Thr; ou um D-aminoácido aromático que pode ser acilado, tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorome-tilo; A2 é uma ligação directa; His; ou um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (C]-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A3 é um L- ou D-aminoácido aromático tal como Phe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (CrC4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (CrC6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituí- dos por um ou dois grupos (C]-C6)alquilo ou (C3-C6)ciclo-alquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-gli-cilo, Fmoc ou Boc; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBul); D-AspCOBu1); D-Glu(OBul); D-ThrfOBu'); D-Cys(OBu‘); D-Ser(OR0 onde Ri é uma porção açúcar; um aza-aminoácido tal como azaGly ou azaAla; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (Ci-Cô)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Cr Cg)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo tal como D-Ala, D-Abu, D-Aib, D-3Aib, D-Vai, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Tle, D-Nle, D-Hol, D-Npg, D-CPa, D-Cpa, D-Cba ou D-Cha; um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-antril-Ala, D-fenantril-Ala, D-benzidril-Ala, D-fluorenil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (CrC4)alquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; D-ciclohexadienil-Gly; D-perhidronaftil-Ala; D-perhidrodifenil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (CrC6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Ci-C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-mctil-nicotinoílo, glicil-nico-tinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-aza-glicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc;

Npg pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C^alquilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor; A7 é um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Orn, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Ci-Cô)al-quilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (CrC<j)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, pirazinilo, pirazinil-car-bonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; Z é GlyNH2; D-AlaNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é um (CrC4) alquilo que pode ser substituído por um hidroxi ou um ou vários átomos de flúor, um (C3-C6)cicloalquilo, ou um radical heterocíclico seleccionado a partir de morfolinilo, pirrolidinilo e piperidilo; bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Na presente descrição o termo "(Ci-C4)alquilo" denota os grupos metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo, e t-butilo. O termo "(Ci-C6)alquilo" denota os grupos metilo, etilo, n-propilo, -10- i-propilo, n-butilo, Lbutilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, i-pentilo, s-pentilo, t-pentilo e hexilo. O termo "(Ci-Cg)alquilo" denota os grupos metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, i-pentilo, s-pentilo, t-pentilo, hexilo, heptilo e octilo; O termo "(Ci-C4)alcoxi" denota um grupo -OR onde R é um (Cp C4) alquilo. O termo "(C2-C7)acilo" denota um grupo -COR onde R é um (Cp C6)alquilo. O termo "(C3-C6)cicloalquilo" denota os grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo e ciclohexilo. O termo "porção açúcar" denota D- ou L-pentoses e seus amino- derivados. O termo "análogos de LH-RH" denota péptidos em que pelo menos um aminoácido foi modificado na sequência de LH-RH.

Na presente descrição e nas reivindicações, são utilizadas as seguintes abreviaturas:

Abu: ácido 2-aminobutírico ACha: aminociclohexilalanina 3Aib: ácido 3-aminoisobutírico AlaNH2: alaninamida Arg: arginina

Ac: acetilo

Aib: ácido 2-aminoisobutírico Ala: alanina APhe: p-aminofenilalanina Asp: ácido aspártico azaAla: aza-alanina azaGlyNH2: azaglicinamida

Boc: terc-butoxicarbonilo

Cha: ciclohexilalanina CPa: ciclopropilalanina

Fmoc: fluorenilmetoxicarbonilo

Glu: ácido glutâmico

GlyNH2: glicinamida HCit: homocitrulina HLys: homolisina

Ile: isoleucina

Leu: leucina

MeSer: N-metilserina

Nal: 3-(2-nafil)alanina NEt: N-etilamida

Nle: norleucina

Nva: norvalina OBzl: éster benzílico

Pal: 3-(3-piridil)alanina

Pen: penicilamina

Phe: fenilalanina

Qal: 3-(3~quinolil)alanina

Ser: serina (S-Et)Pen: S-etil-penicilamina Tle: feroleucina Tyr: tirosina Ada: adamantilalanina MeNpg: N-metilneopentilglicina

Um grupo preferido azaGly: aza-glicina

Bal: benzotienilalanina

Cba: ciclobutilalanina

Cit: citrulina

Cpa: ciclopentilalanina

For: formilo

Gly: glicina HArg: homoarginina

His: histidina

Hol: homoleucina

IprLys: Ns-isopropil-lisina

Lys: lisina

Met: metionina INal: 3-(l-naftil)alanina

NicLys: Ns-nicotinoil-lisina

Npg: neopentilglicina OBu1: terc-butóxi

Om: omitina pCIPhe: 3-(4-clorofenil)alanina pGlu: ácido piroglutâmico Pro: prolina sar: sarcosina (S-Me)Pen: S-metil-penicilamina Thr: treonina Trp: triptofano vai: valina HPhe: homofenilalanina 4Pal: 3-(4-piridil)alanina análogos peptídicos de acordo com -12-

ZU presente invento, possuindo actividade agonista de LH-RH, compreende os péptidos da fórmula (SEQID No: 2): (Ha)

A1 - A2-A3-A4-A5-A6-HAA-A7-Pro-Z em que: AI é pGlu, Sar ou AcSar; A2 é His; A3 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, HPhe, Tyr, Tip, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal, 4Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (CrC4)alquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluoro-metilo; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, HPhe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal, 4Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (CrC^alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluoro-metilo; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBu‘); D-Asp(OBu‘); D-Glu(OBul); D-Thr(OBu); D-Cys^Bu'); D-Ser(OR0 onde Ri é uma porção açúcar; um aza-aminoácido tal como azaGly ou azaAla; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (Ci-C6)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Cr C8)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo tal como D-Ala, D-Abu, D-Aib, D-3Aib, D-Vai, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Tle, D-Nle, D-Hol, D-Npg, D-CPa, D-Cpa, D-Cba ou D-Cha; um D- aminoácido aromático tal como D-Phe, D-IIPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-antril-Ala, D-fenantril-Ala, D-benzidril-Ala, D-fluorenil-Ala, D-Bal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)aíquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; D-ciclohexadienil-Gly; D-perhidronaftil-Ala; D-perhidrodife-nil-Ala; ou um D-aminoácido básico tal como D-Arg, D-HArg, D-Om, D-Lys, D-HLys, D-Cit, D-HCit, D-APhe ou D-ACha, onde D-Arg e D-HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Ci-Q)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde D-Om, D-Lys, D-HLys, D-APhe e D-ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Ci-C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo Fmoc ou Boc; HAA é tal como definido para (I); A7 é um L-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha; Z é GlyNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é um (Ci-C^alquilo que pode ser substituído por um hidroxi ou um ou vários átomos de flúor, um (C3-C6)cicloalquilo, ou um radical heterocíclico seleccionado a partir de morfolinilo, pirrolidinilo e piperidilo; bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Um grupo preferido de análogos peptídicos (lia) compreende os péptidos da fórmula (SEQID No: 7): -14- -14- em que:

Al-A2-A3-A4-A5-A6-Npg -A7-Pro-Z AI é pGlu, Sar ou AcSar; A2 é His; A3 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (CrC4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluoro-metilo; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (C]-C4)alquilo, (C]-C4)alcoxi, nitro ou trifluoro-metilo; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBul); D-Asp^Bu1); D-Glu(OBu‘); D-Thr(OBu‘); D-Cys(OBu‘); D-Ser(OR0 onde Ri é uma porção açúcar; um aza-aminoácido tal como azaGly ou azaAla; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (CrC6)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Cr C8)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo tal como D-Ala, D-Abu, D-Aib, D-3Aib, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Tle, D-Nle, D-Hol, D-Npg, D-CPa, D-Cpa, D-Cba ou D-Cha; um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-antril-Ala, D-fenantril-Ala, -15- D-benzidril-Ala, D-fluorcnil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; D-ciclohexadienil-Gly; D-perhidronaftil-Ala; D-perhidrodifenil-Ala; ou um D-aminoácido básico tal como D-Arg, D-HArg, D-Om, D-Lys, D-HLys, D-Cit, D-HCit, D-APhe ou D-ACha, onde D-Arg e D-HArg podem ser N-substituídos por um grupo (CrC6)alquilo ou (C3-Có)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde D-Om, D-Lys, D-HLys, D-APhe e D-ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (CrC6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo Fmoc ou Boc;

Npg pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C4)al-quilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor; A7 é um L-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha; Z é GlyNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é um (CrC4)alquilo que pode ser substituído por um hidroxi ou um ou vários átomos de flúor, um (C3-C6)cicloalquilo ou um radical heterocíclico seleccionado a partir de morfolinilo, pirrolidinilo e piperidilo; bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Outro grupo preferido de análogos peptídicos de acordo com o presente invento, possuindo actividade antagonística de LH-RH, compreende os péptidos da fórmula (SEQ ID No: 3):

Al -A2-A3-A4-A5-A6-HAA-A7-Pro-Z (Ilb) na qual: AI é pGlu; D-pGlu; Sar; AcSar, Pro ou um derivado deste tal como AePro, ForPro, OH-Pro, Ac-OH-Pro, desidro-Pro ou Ac-desidro-Pro; Ser, D-Ser; Ac-D-Ser; Thr; D-Thr; Ac-D-Thr; ou um D-aminoácido aromático que pode ser acilado, tal como D-Phe, D-HPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A2 é uma ligação directa ou um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-HPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A3 é um L- ou D-aminoácido aromático tal como Phe, HPhe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal, 4Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, HPhe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal, 4Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (C,-Ce)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APlie e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Cr C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nico-tinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, pira-zinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-SerfOBu1); D-Asp(OBu‘); D-Glu(0-Bul); D-Thr(0-Bul); D-Cys(OB-u‘); D-Ser(O-R0 onde Ri é uma porção açúcar; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Ci-Cs)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo tal como D-Ala, D-Abu, D-Aib, D-3Aib, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Tle, D-Nle, D-Hol, D-Npg, D-CPa, D-Cpa, D-Cba ou D-Cha; um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-HPhe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-antril-Ala, D-fenantril-Ala, D-benzidril-Ala, D-fluorenil-Ala, D-Bal, D-Pal, D-4Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; D-ciclohexadienil-Gly; D-perhidronaftil-Ala; D-perhidrodifenil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (CrCrjalquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Ci-C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicoti-

-18-

noílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azagli-cilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; HAA é tal como definido para (I); A7 é um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Cr C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Ci-C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nico-tinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azagli-cilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; Z é GlyNH2; D-AlaNH2; bem como os seus saís farmaceuticamente aceitáveis.

Neste análogos peptídicos, HAA é de preferência Npg que pode ser N-alfa-substituído por um grupo (C]-C4)alquilo opcionalmente substituído por um ou vários átomos de flúor.

Um grupo preferido de análogos peptídicos (Ilb) compreende os péptidos da fórmula (SEQID No: 8): AI -A2-A3-A4-A5-A6-Npg-A7-Pro-Z (11¾) na qual: AI é pGlu; D-pGlu; Sar; AcSar; Pro ou um derivado deste tal como AcPro, ForPro, ΟΙΙ-Pro, Ac-OII-Pro, dcsidro-Pro ou Ac-desidro-Pro; Ser, D-Ser; Ac-D-Ser; Thr; D-Thr; Ac-D-Thr; ou um D-aminoácido aromático que pode ser acilado, tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (CrC4)al quilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A2 é uma ligação directa ou um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Cr C4)alquilo, (CrC4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A3 é um L- ou D-aminoácido aromático tal como Phe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Ci-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático tal como Phe, Tyr, Trp, Nal, INal, difenil-Ala, Bal, Pal ou Qal, onde Phe e Trp podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Ci-C4)alquilo, (Cj-C4)alcoxi, nitro ou trifluorometilo; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Ci-C6)al-quilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (CrC6)alquilo ou (C3- \ íe^Jj -20- C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBu‘); D-Asp(OBul); D-Glu(0-Bul); D-Thr(0-Bul); D-Cys(0-Bul); D-Ser(0-R,) onde Rj é uma porção açúcar; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Ci-C8)alquilo ou (C3-C6)ciclo-alquilo tal como D-Ala, D-Abu, D-Aib, D-3Aib, D-Val, D-

Nva, D-Leu, D-Ile, D-Tle, D-Nle, D-Hol, D-Npg, D-CPa, D-Cpa, D-Cba ou D-Cha; um D-aminoácido aromático tal como D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-Nal, D-lNal, D-difenil-Ala, D-antril-Ala, D-fenantril-Ala, D-benzidril-Ala, D-fluorenil-Ala, D-Bal, D-Pal ou D-Qal, onde D-Phe e D-Tip podem ser substituídos por um ou mais halogénios ou grupos (Cr C4)alquilo, (CpC^alcoxi, nitro ou trifluorometilo; D-ciclohexadienil-Gly; D-perhidronaftil-Ala; D-perhidrodife-nil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Q-C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Cr C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nicotinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-azaglicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picoli- -21- noílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc;

Npg pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C^al-quilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor; A7 é um L- ou D-aminoácido básico tal como Arg, HArg, Om, Lys, HLys, Cit, HCit, APhe ou ACha, onde Arg e HArg podem ser N-substituídos por um grupo (Ci-Cjalquilo ou (C3-C6)cicloalquilo num ou em ambos os átomos de azoto, e onde Om, Lys, HLys, APhe e ACha podem ser N-substituídos por um ou dois grupos (Cr C6)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo, ou por um grupo nicotinoílo, isonicotinoílo, 6-metil-nicotinoílo, glicil-nico-tinoílo, nicotinil-azaglicilo, furilo, glicil-furilo, furil-aza-glicilo, pirazinilo, pirazinil-carbonilo, picolinoílo, 6-metil-picolinoílo, chiquimilo, chiquimil-glicilo, Fmoc ou Boc; Z é GlyNH2 ou D-AlaNH2; bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

De entre os análogos peptídicos de fórmula (lia), os da fórmula (SEQID No: 4): (ma)

pGlu-His-A3-Ser-Tyr-A6-HAA-Arg-Pro-Z na qual: A3 e HAA são tal como definido para (lia); A6 é Gly; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (CrCg)alquilo; ou um D-aminoácido aromático; Z é GlyNH2 ou um grupo -NHQH5; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são especialmente preferidos. -22-

De entre os análogos peptídicos de fórmula (IHa), aqueles onde A3 é Trp são preferidos; de entre os últimos, aqueles onde HAA é Npg que pode ser N-alfa-metilado, são especialmente preferidos.

De entre os péptidos de fórmula (Ilb), os da fórmula (SEQ ID No: 5):

Ac-D-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-A5-A6-HAA-A7-Pro-D-AlaNH2 (Illb) na qual: A5 e A7 são tal como definido para (Ilb); A6 é Gly ou um L- ou D-aminoácido básico; HAA é tal como definido para (Ilb); e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são especialmente preferidos.

De entre os análogos peptídicos de fórmula (Illb), aqueles onde HAA é Npg que pode ser N-alfa-metilado, são preferidos.

Exemplos de sais com ácidos farmaceuticamente aceitáveis são aqueles com ácidos minerais, tais como por exemplo o cloridrato, bromidreto, sulfato, fosfato, borato, hidrogenossulfato, di-hidrogenofosfato ou nitrato e aqueles com ácidos orgânicos, tais como por exemplo o acetato, oxalato, tartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, citrato, pamoato, malato, ascorbato, benzoato, p-toluenossulfonato ou nafíalenossulfonato.

Exemplos de sais com bases farmaceuticamente aceitáveis são aqueles com metais álcali ou de terra alcalina tais como sódio, potássio, cálcio ou magnésio, e aqueles com bases orgânicas tais como aminas, trometamol, N-metilglutamina e semelhantes.

Os péptidos de acordo com o presente invento podem ser preparados através das técnicas bem conhecidas de química peptídica tais como por exemplo síntese peptídica em solução ou síntese peptídica em fase sólida. Em geral, estas técnicas envolvem a adição passo-a-passo de um ou mais aminoácidos - que podem ser adequadamente protegidos - a uma cadeia peptídica em formação.

De preferência, os péptidos de acordo com o invento são sintetizados utilizando síntese peptídica passo-a-passo em fase sólida (1,2) com protecção de Ν-α-Fmoc. Por exemplo, os péptidos são montados numa resina de 4-metilbenzilhidrilamina (Península Laboratories, UK) ou numa resina de aminometil (Península Laboratories, UK). A prolina C-terminal é introduzida como ácido 4-(Boc-Proliloximetil)fenil-acético. A subsequente remoção do grupo protector Boc é alcançada com ácido trifluoroacético seguido de lavagem com diclorometano e dimetilformamida (DMF) bem como neutralização de di-isopropiletilamina. É também possível utilizar uma resina "Rink" (resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometilfenoxi) utilizando uma estratégia Fmoc de síntese (2). A síntese compreende os passos de montagem, clivagem e purificação tal como descrito abaixo: I. Montagem

Para todos os péptidos é utilizado o seguinte procedimento de desprotecção/ligação: -24- 1- Lavagem com DMF (3 vezes - 1 min.) 2- Piperidina a 25% em DMF (1 min.) 3- Piperidina a 25% em DMF (duas vezes - 15 min.) 4- Lavagem com DMF (7 vezes - 1 min.)

Para cada passo são utilizados 15 ml de solvente por grama de resina peptídica. A ligação de todos os aminoácidos (excesso de três vezes) é efectuada em DMF na presença de BOP, Hobt e DIEA (3). Cada passo de ligação é controlado quanto ao acabamento através do teste de nihidrina (4) e é efectuada dupla ligação se necessário. Se, após a segunda ligação o teste se mantiver positivo, a resina é acetilada (ácido acético anidrido, excesso de 10 vezes e DIEA).

Geralmente, é efectuado um tratamento de ácido trifluoroacético (TFA) antes do passo de desprotecção/clivagem. II. Clivagem

Os péptidos são clivados da resina e completamente desprotegidos através de um tratamento com ácido fluorídrico líquido (HF) ou TFA. São utilizados classicamente 10 ml de HF ou TFA por grama de resina peptídica a 0°C durante 45 min. ou 2,5 horas, respectivamente, na presença de p-cresol e etanoditiol (para péptidos contendo triptofano) como limpadores.

Após evaporação do HF, a mistura reaccional bruta é lavada com éter dietílico dissolvido em TFA, precipitada com éter dietílico e seca sob pressão reduzida. -25-

ϊ { «-JL

Se for necessário, antes da desprolecção de HF o pcptido c clivado da resina e subsequentemente amidado através de um tratamento com etilamina (5 ml de etilamina por grama de resina peptídica, -78°C, 20 horas).

Quando um grupo benzilo está presente no produto final, é utilizado TF A (10 ml por grama de resina peptídica, 0°C, 2,5 horas) para a clivagem/desprotecção final. A composição da mistura de clivagem de TFA em % de v é a seguinte: TFA: 83,3%

Etanoditiol: 2,1%

Tioanisol: 4,2% Água: 4,2%

Fenol: 6,2%

Após filtração da resina, o péptido é precipitado da mistura reaccional através de adição de uma grande quantidade de éter dietílico. Após várias lavagens com éter dietílico o péptido bruto é seco sob pressão reduzida. III. Purificação

Todos os péptidos são purificados através de cromatografia líquida de fase reversa. O procedimento geral de purificação é idêntico para cada péptido; no entanto o gradiente do solvente orgânico é ajustado dependendo do tempo de retenção inicial do péptido.

Condições gerais de purificação:

Equipamento:

Fase estacionária: Tamanho da coluna: Condições de eluição:

Temperatura Taxa de Fluxo: Detecção: Partição: KRONWALD SPERATIONSTECHNIK, sistema de cromatografia líquida de Pressão Média (Alemanha) equipado com coluna de Vidro. sílicaBondapackC18 (Waters) 15-25 pm, 100 A 40 x 340 mm Fase móvel: EluenteA: TFAaO,l%em água Eluente B: CH3CN/A 60/40 (volume) Ambiente 40 ml UV 210 nm 5 ml por fracção

Todas as fracções contendo o composto alvo são analisadas individualmente através de HPLC analítica. As fracções com uma pureza superior a 95% são reunidas e liofílizadas. No caso da pureza requerida não ser atingida após o primeiro passo de purificação, é efectuado um segundo passo de purificação e, se necessário, um terceiro passo de purificação. As condições de purificação para o segundo e terceiro passos são semelhantes às descritas acima excepto que é modificado o declive do gradiente para se aumentar a resolução.

Após a liofilização, todos os péptidos purificados estão presentes como o seu sal trifluoroacetato. O pó final correspondente a cada péptido é controlado através de HPLC analítica. A estrutura de cada composto é também avaliada através de análise do espectro de massa e o teor peptídico líquido é determinado através de absorção de UV.

Os péptidos de acordo com o presenle invento têm uma potente-afinidade para os receptores de LH-RH.

Esta afinidade foi determinada de acordo com o seguinte método:

Foram removidas e homogeneizadas pituitárias de ratos fêmea Sprague Dawley com um homogeneizador Potter num tampão HEPES 25 mM (pH 7,4) contendo 0,32 M de sacarose, 100 pg/l de PMSF (fenilmetilsulfonilfluoreto), 5,6 U/l de aprotinina e 10000 U/l de bacitracina. Os homogenatos foram centrifugados a 700 g durante 10 minutos e os sobrenadantes foram ainda centrifugados a 12500 g durante 30 minutos. Os sedimentos foram homogeneizados e centrifugados tal como acima descrito, mas no mesmo tampão sem sacarose.

Todos os passos de homogeneização, centrifugação e subsequente incubação foram efectuados a 4°C.

Foram incubadas alíquotas de fraeções membranares durante 2 horas em duplicado com concentrações crescentes de compostos de teste na presença de 20 a 70 pM de buserelina-[125I] (entre 1000 e 2000 Ci/mmol dependendo das fornadas de ligando). O ensaio foi terminado por filtração sob sucção (colector de 96 poços Brandel) através de filtros de fibra de vidro Whatman GF/B. Após lavagens repetidas, os filtros foram colocados em frascos de contagem com mistura de cintilação para medir a radioactividade de 125I. Para cada experiência, o ajustamento à curva da ligação específica residual contra as concentrações do composto de teste deu a concentração inibitória de 50% (CI50)· Cada composto foi testado em pelo menos 4 experiências.

Este ensaio de receptores de LH-RH caracterizou-se por 4 experiências de saturação utilizando concentrações crescentes de buserelina-[125I] na ausência ou presença de 1 μΜ de buserelina não marcada para determinação da ligação não específica. Os dados da ligação específica foram analisados de acordo com o método de Scatchard. No equilíbrio (2 horas de incubação), a constante de dissociação (Kd) e o número de locais de ligação para a buserelina-[125I] foram respectivamente iguais a 88 ± 6 pM e 15,6 ± 2,9 pM.

Para cada composto de teste, a constante inibitória (Ki) foi calculada a partir da CI50 de acordo com a equação de Cheng e Prussof: Ki = Cl5o/(l+[radioligando]/Kd). As Ki foram então transformadas em pKi(= -log Ki) para expressão final das escalas de afinidade. O ligando natural, a própria LH-RH, revela uma forte afinidade com uma CI50 experimental em tomo dos 10 nM, i.e., uma pKi igual a cerca de 8.

Os chamados superagonistas tais como buserelina, leuprorelina, triptorelina, histrelina ou deslorelina e os antagonistas tais como antide mostram uma ligação ainda mais forte aos receptores de LH-RH com uma CI50 no intervalo subnanomolar, i.e. pKi > 9. A afinidade dos péptidos de teste do invento para os receptores de LH-RH é dada na Tabela 1 abaixo:

Tabela 1: Afinidade para os receptores de LH-RH

Composto pKi (n) Composto pKi (n) Exemplo 1 8,83 (3) Exemplo 14 9,50(3) Exemplo 2 9,61 (3) Exemplo 15 9,23 (3) Exemplo 3 9,57 (3) Exemplo 16 10,17(3) Exemplo 4 10,01 (3) Exemplo 17 9,72 (3) -29-

Exemplo 5 8,86 (3) Exemplo 18 10,07 (3) Exemplo 6 9,33 (3) Exemplo 19 10,11 (3) __ Exemplo 7 8,20 (3) LH-RH 8.04 (4) Exemplo 8 8,73 (3) Goserelina 8.58 (4) Exemplo 9 8,63 (3) Antide 9,16(12) Exemplo 10 9,64(3) Leuprorelina 9,33 (4) _ _ Exemplo 11 9,34(3) Buserelina 9,35 (108) Exemplo 12 9,79(4) Triptorelina 9,85 (4) Exemplo 13 8,97 (3) Deslorelina 9,90 (4) Histrelina 9,98 (4) (n): número de determinações

Os péptidos de acordo com a fórmula geral (lia) exercem uma actividade agonista sobre os receptores de LH-RH in vivo, resultando na estimulação da secreção de LH pela pituitária, que, nos machos, estimula a secreção de testosterona pelos testículos.

Ratos macho adultos Sprague-Dawley receberam uma injecção subcutânea de várias doses de LH-RH, triptorelina ou leuprorelina, ou o seu oposto respectivo com Npg7 no lugar de Leu7: exemplo 1 ([Npg7]-LH-RH), exemplo 6 ([Npg7]-leuprorelina) ou exemplo 11 ([Npg7]-triptorelina), dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Duas horas depois, foram tiradas amostras de sangue para determinação da testosterona plasmática total através de radioimunoensaio directo (Immunotech). O Exemplo 1 foi um pouco mais de duas vezes mais activo que a própria LH-RH, e os outros compostos comportaram-se como os chamados "superagonistas" induzindo uma estimulação mais forte de secreção de testosterona a doses muito menores (eixo dos xx logarítmico) que LH-RH (Figura 1; 8 animais por ponto). A 20 ng/kg, a secreção de testosterona foi igualmente estimulada de forma máxima pelos quatro superagonistas (eixo dos yy em escala exponencial), mas a 10 ng/kg, os exemplos 6 e 11 foram um pouco mais de duas vezes mais activos que a leuprorelina e tnptorelina, respectivamente.

Nesta dose intermédia de 10 ng/kg, foram pesquisados vários exemplos com Npg7 ou Ada7 no lugar de Leu7 de acordo com o invento quanto à actividade agonística (Tabelas 2 e 3). Quando disponível em Bachem (França) ou Sigma (França), o correspondente agonista padrão com Leu7 foi testado para comparação. Em todos os seis casos, ambos os exemplos modificados com Npg7 e Ada7 foram mais activos, por uma ligeira ou grande margem dependendo do composto oposto de Leu7 (Tabela 2). Em dois casos, a substituição por Ada7 foi mais favorável que por Npg7 (exemplos 27 e 28). Inversamente, Npg7 conduziu a agonistas mais potentes que Ada7 em duas outras estruturas (exemplos 6 e 11).

Essas descobertas ilustram que o aumento da hidrofobicidade geral do aminoácido na posição 7 dos análogos de LH-RH é um meio geral para se alcançar uma maior potência in vivo. Dependendo do resto da molécula, outras características da cadeia lateral na posição 7, tais como impedimento estereoquímico, modulam o resultante ganho de actividade.

Um aumento na hidrofobicidade, tal como exemplificado com Npg7, foi compatível com várias mudanças nas posições 3 e 6 para dar vários agonistas numa variação de potência semelhante à da leuprorelina ou triptorelina (exemplos 5, 9, 13, 20, 21, 22 ou 25; Tabelas 2 e 3). A N-metilação de Npg7 foi também compatível com uma actividade agonística muito forte (exemplo 23; Tabela 3).

Tabela 2: Estimulação da secreção de testosterona

Composto Dose (ng/kg) Testosterona plasmática total (nmol/1) n Veículo (PBS) - 2,7 ± 0,3 46 -31 - [D-Alaú]-LH-RH 10 6,4 ± 1,9* 8 Exemplo 3 10 16,7 ± 1,9*** 8 [D-Ala6,Pro9NEt]-LH-RH 10 30,6 ± 7,2*** 16 Exemplo 4 10 33,8 ±5,8*** 16 Exemplo 28 10 44,9 ± 6,0*** 16 [D-Ala6,Pro9NEt]-LH-RH 10 16,7 + 4,3*** 16 Exemplo 10 10 23,5 ± 4,0*** 16 Exemplo 27 10 28,0 + 4,1*** 16 Leuprorelina 10 33,5 + 3,5*** 22 Exemplo 6 10 48,6 + 4,3*** 22 Exemplo 29 10 36,2 ± 4,5*** 16 Triptorelina 10 20,3 + 2,5*** 22 Exemplo 11 10 30,8 ±3,5*** 22 Exemplo 30 10 24,8 ±4,1*** 15 Deslorelina 10 11,8 ±3,5** 6 Exemplo 12 10 20,5 ± 5,2*** 6 Exemplo 5 10 21,2 ±6,6** 6 Exemplo 9 10 30,9 ±3,6*** 8 Exemplo 13 10 22,9 ± 4,2*** 6 * ρ<0,05; ** ρ<0,01; *** ρ<0,001 em comparação com ο veículo sozinho n: número de animais

Tabela 3: Estimulação da secreção de testosterona

Composto Dose Testosterona plasmática n (ng/kg) total (nmol/1) Veículo (PBS) _ 4,3 ±1,2 16 Exemplo 20 10 24,9 ± 5,0** 8 Exemplo 21 10 32,4 ±7,0** 8 -32- /ρ . ,u. /“» |

Exemplo 22 10 34,8 ± 4,5*** 8 Exemplo 23 10 49,4 ± 4,6*** 8 Exemplo 24 10 14,3 + 4,3* 8 Exemplo 25 10 27,3 ± 6,9** 8 Exemplo 26 10 12,2 ±2,7 8 * p<0,05; ** ρ<0,01; *** ρ<0,001 em comparação com o veículo sozinho n: número de animais

Em conclusão, os exemplos 6 e 23 por um lado, e o exemplo 28 por outro lado, são os melhores exemplos até à data de agonistas de LH-RH mais potentes que os actuais análogos terapêuticos de LH-RH, obtidos através do aumento da hidrofobicidade do aminoácido na posição 7, respectivamente com Npg ou Ada.

Os péptidos de acordo com a fórmula geral (Ilb) exercem uma actividade antagonística sobre os receptores de LH-RH in vivo, resultando na inibição da ovulação na fêmea.

Ratos fêmea adultos Wistar são primeiro monitorizados quanto a ciclicidade estrogénica através de esfregaços vaginais diários. Após pelo menos 2 ciclos regulares de 4 dias, recebem através de injecção subcutânea o veículo sozinho (0,5 ml de uma mistura de propilenoglicol e água: 20/80 vol/vol) ou o antagonista de LH-RH de acordo com a fórmula (Ilb) dissolvido neste veículo, cerca das 14:00 horas do dia de pró-estrogénio. Todos menos um animal tratado com veículo ovularam espontaneamente tal como demonstrado pela recuperação de numerosos ovócitos nos oviductos na manhã seguinte. -33-

Quando eficazes, os antagonistas de LH-RH bloqueiam totalmente a ovulação. Antide, um antagonista de LH-RH padrão comercialmente disponível (em Bachem, França) revelou uma inibição relacionada com a dose da ovulação (Tabela 4). A análise de regressão semi-logarítmica deu uma concentração inibitória de 50% (CI5o) igual a 0,99 pg/rato. Quando Leu7 foi substituído por Npg7 na estrutura do antide (exemplo 15), a potência inibitória foi marcadamente aumentada a 0,5 e 0,25 pg/rato, resultando numa CI50 de 0,26 pg/rato. Variações de aminoácidos básicos nas posições 6 e 8 foram compatíveis com Npg para darem antagonistas mais potentes que o antide, tal como observado com a actividade máxima ou sub-máxima dos exemplos 16, 17,18 ou 19 a uma dose de 1 pg/rato (Tabela 4). O Exemplo 17 foi especialmente activo, mas os seus efeitos não estavam relacionados com a dose no intervalo de doses estudado. Por isso, a introdução de um aminoácido hidrófobo na posição 7 é favorável para alcançar propriedades antagonísticas de LH-RH mais fortes, tal como melhor exemplificado até à data pelo aumento de 4 vezes na potência de anti-ovulação do antide através da substituição de Leu7 por Npg7 (exemplo 15).

Tabela 4: inibição da ovulação

Tratamento Dose (pg/rato) Número de fêmeas em ovulação/número total de fêmeas tratadas % de inibição Veículo 38/39 - Antide 10 0/8 100% 5 0/11 100% 2,5 2/6 67% -34- 1 5/16 69% 0,5 4/5 20% [Npg7]-antide 1 1/5 80% (Exemplo 15) 0,5 0/5 100% 0,25 4/10 60% 0,1 5/5 0% Exemplo 16 1 0/5 100% 0,25 4/5 20% Exemplo 17 1 0/12 100% 0,75 0/7 100% 0,5 4/7 43% 0,25 1/5 80% Exemplo 18 1 1/5 80% 0,25 4/5 20% Exemplo 19 1 0/5 100% 0,25 3/5 40%

Em conclusão de ambos os estudos agonísticos e antagonísticos in vivo, mostrou-se que a substituição de Leu7 por um aminoácido não aromático mais hidrófobo, tal como Npg ou Ada, aumentava sistematicamente a potência dos análogos existentes. Para além disso, análogos intimamente relacionados possuindo um aminoácido hidrófobo na posição 7 sem um oposto de Leu7 directo para comparação, apresentavam níveis interessantes de actividade per se.

Portanto, a utilização de Npg, Ada ou de qualquer outro aminoácido hidrófobo na posição 7 de uma sequência análoga a LH-RH correspondente à definição de fórmula geral (I) é reivindicada como característica geral para se obter novos agonistas ou antagonistas de LH-RH com elevada ou maior potência in vivo. -35- Ά,β Não se observam sinais de toxicidade com os péptidos do invento a doses farmaceuticamente activas.

Assim, os péptidos do invento e seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados no tratamento ou prevenção de várias queixas ou doenças em que a actívidade agonista ou antagonista de LH-RH é necessária. O alvo principal de análogos de LH-RH é a glândula pituitária, mas foram relatadas acções directas sobre as próprias gónadas (testículos e ovários), sobre o timo e algumas linhas celulares linfóides, sobre mastócitos e sobre tumores da mama, próstata ou pancreáticos.

Os agonistas de LH-RH de acordo com a fórmula (lia) exercem sobre qualquer alvo sensível a LH-RH, uma actívidade estimuladora através de administrações agudas de curto prazo ou pulsáteis ou um efeito inibidor através de administrações repetidas ou contínuas que induzem a dessensibilização e a sub-regulação dos receptores de LH-RH. No caso do eixo hipotálamo-pituitária-gónadas, a administração prolongada resulta numa castração chamada "química".

Os antagonistas de LH-RH de acordo com a fórmula (Ilb) exercem primeiramente um efeito inibidor sobre qualquer alvo sensível a LH-RH, mas são também úteis na obtenção ou no planeamento de uma libertação estimuladora de ressalto de LH e FSH quando o tratamento é descontinuado.

Devido a este potencial ambivalente dos agonistas e dos antagonistas de LH-RH, todos os análogos de acordo com a fórmula (I) podem encontrar uma utilização terapêutica apropriada em humanos bem como em animais, dependendo das doses, regimes de tratamento e vias de administração, -36- em endocrinologia reprodutora e no tratamento ou prevenção de tumores benignos ou malignos dependentes de hormonas sexuais, sós ou em combinação com outros agentes hormonais ou antitumorais. Os tumores benignos ou malignos independentes de hormonas sexuais sensíveis a LH-RH também podem regredir após tratamento com os análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I), sós ou em combinação com agentes antitumorais. Também podem ser modificados mecanismos imunitários através de análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I), sós ou em combinação com agentes imunomoduladores ou imunosupressores tais como glucocorticóides, ciclosporina, rapamicina, tacrolimus, seus derivados e semelhantes. Os análogos de LH-RH de acordo com o invento são portanto muito valiosos no tratamento e prevenção de doenças autoimunes, rejeição de enxertos ou doenças atópicas, e no tratamento de distúrbios linfoproliferativos benignos ou malignos.

Os análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I) são especialmente úteis, sós ou em combinação com esteróides sexuais ou gonadotrofinas, na inibição, planeamento e início da ovulação em programas de fertilização in vitro e no tratamento de infertilidade masculina e feminina ou estados hipogonadios. Inversamente, podem também ser utilizados em contracepção masculina ou feminina ou tratamento de estados hipergonadios, sós ou em combinação com esteróides sexuais ou gonadotrofinas. Isto aplica-se a homens e mulheres, mas também a animais selvagens ou domésticos em utilizações tais como melhoramento ou controlo da actuação reprodutora, ou como ferramenta para se optimizar estratégias de melhoramento.

Os análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I) são também especialmente úteis em homens para tratar cancro da próstata avançado, mas também podem ser utilizados como uma terapia de primeira linha nesta indicação e na hipertrofia benigna da próstata, sós ou em combinação com inibidores da acção dos androgénios, i.e. antiandrogénios tais como acetato de ciproierona, acetato de osaterona, acetato de clormadinona, flutamida, nilutamida ou bicalutamida e semelhantes, ou inibidores da 5a-reductase tais como finasteride, epristeride ou turosteride e semelhantes, ou inibidores de C17.2oliase tais como abiraterona e semelhantes.

Os análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I) são também especialmente úteis no tratamento ou prevenção de cancro da mama em mulheres e em homens, especialmente tumores positivos para receptores de estrogénios, sós ou em combinação com antiestrogénios tais como tamoxifeno, raloxifeno ou droloxifeno e semelhantes ou com inibidores da aromatase tais como atamestano, formestano, letrozole, anastrozole e semelhantes, ou com inibidores de Ci7.2oliase tais como abiraterona e semelhantes, mas também de alguns tumores negativos para receptores de estrogénios que respondam aos efeitos directos dos análogos de LH-RH ou indirectamente à sua actividade supressora das gónadas.

Outras condições ginecológicas, tais como hiperplasia do endométrio, leiomioma, adenomioma, endometriose, síndroma do ovário poliquístico, hirsutismo e doença benigna da mama (dor, quistos ou fíbrose), podem também ser prevenidas por ou beneficiar de tratamento com os análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I), sós ou em combinação com antiestrogénios (citados acima), progestinas tais como acetato de ciproterona, acetato de osaterona, acetato de clormadinona, acetato de nomegestrol, promegestona, demegestona, trimegestona e semelhantes, ou as suas formulações de combinação de substituição contraceptivas ou pós-menopausa com estrogénios tais como estradiol ou etinilestradiol. Os péptidos do invento também podem interferir com a gestação induzindo aborto ou desencadeando o trabalho de parto, sós ou em combinação com estrogénios (citados acima), antiprogestinas tais como mifepristona ou análogos de prostaglandina tais como sulprostona. -38- -38-

* ί.

Indicações semelhantes podem ser encontradas em medicina veterinária para animais macho ou fêmea domésticos ou selvagens que possam necessitar da utilização de análogos de LH-RH de acordo com a fórmula (I).

Outro aspecto do presente invento são portanto composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz de pelo menos um péptido de fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, só ou misturado com excipientes farmaceuticamente adequados.

Outro aspecto do invento refere-se a um método de tratamento e/ou prevenção das doenças de cima que compreende a administração a doentes ou a animais necessitados deste de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um péptido de fórmula (I) ou de um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Outro aspecto do invento refere-se à utilização dos péptidos de fórmula (lia), ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um medicamento com áctividade agonista de LH-RH. Também dentro do âmbito do invento está a utilização dos péptidos de fórmula (Ilb), ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de um medicamento com actividade antagonista de LH-RH.

Os péptidos do invento são de preferência administrados através de administração parentérica, embora também sejam eficazes formulações orais desde que a dosagem seja apropriadamente aumentada.

Os sistemas de distribuição preferidos para os agonistas de LH-RH de fórmula (lia) em indicações supressoras de pituitária-gónadas a longo prazo são os dispositivos implantáveis de libertação lenta, ou micro ou nano-partículas ou cápsulas poliméricas biodegradáveis injectáveis, ou micro ou nano-emulsões, com doses unitárias dos péptidos ou dos seus sais apropriados variando de 1 mg a -39- 100 mg por doente humano durante uma duração de acção que varia de 1 mês a 1 ano. A administração de longo prazo de antagonistas de LH-RH de fórmula (Ilb) necessitará geralmente de dosagens maiores nas mesmas formulações de libertação lenta, variando de 10 mg a 1 g para 1 semana a 1 ano de actividade. As doses animais serão adaptadas com base no peso corporal dependendo da espécie selvagem ou doméstica a ser tratada pelos agonistas ou antagonistas de LH-RH de acordo com a fórmula (I).

Todos os outros meios de administração parentérica são adequados para distribuição imediata, atrasada ou planeada dos péptidos do invento: injecções de uma dose com agulha subcutâneas, intramusculares, intravenosas, intragonadais ou intratumorais, ou perfusões prolongadas contínuas, pulsáteis ou planeadas ou microinfiisões utilizando a tecnologia de bombeamento apropriada; microinjecção subcutânea de pressão de ar; cremes, géis ou pessários vaginais; enemas ou supositórios rectais; cremes, géis, loções, soluções, adesivos ou dispositivos iontoforéticos transdérmicos; vapor nasal ou dispositivo de inalação de pó seco; soluções, géis, cremes oftálmicos ou lentes de contacto; inalação pulmonar de micro ou nano-partículas ou gotículas geradas manualmente ou com um dispositivo de pulverização ou nebulização apropriado. A dose unitária destas administrações parentéricas variará em humanos de 0,001 mg a 10 mg/dia para agonistas de LH-RH de fórmula (lia) e de 0,01 a 100 mg/dia para antagonistas de LH-RH de fórmula (Ilb), uma a 16 vezes por dia (no caso de administração pulsátil). A administração oral de péptidos de acordo com o invento é de preferência efectuada utilizando formulações de libertação gastro-resistentes e entéricas ou colónicas atrasadas que podem ser pílulas ou comprimidos revestidos contendo dois ou mais componentes, cápsulas de gelatina endurecida, macro-, micro- ou nano-contas poliméricas especiais contendo-os, ou qualquer dispositivo desenhado para os proteger da degradação gastrointestinal e para os libertar quando necessário. Todas as formulações a serem tomadas oralmente tais como soluções, suspensões, xaropes, géis e semelhantes, ou formulações linguais, sublinguais ou mastigáveis são adequadas desde que a dosagem seja aumentada.

Sobretudo, o tratamento oral eficaz pode ser alcançado com qualquer uma das formulações de cima com doses unitárias de péptidos de fórmula (I) variando de 1 mg a 1 g por doente humano, de uma a 16 vezes por dia (no caso de administração pulsátil)..

Todas as formulações orais ou parentéricas acima mencionadas dos péptidos de acordo com o invento e seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem conter um ou vários excipientes farmaceuticamente apropriados, um ou mais inibidores de proteases, e um ou vários estimuladores da absorção conforme necessário para a via de administração específica. O pó bruto dos péptidos puros de acordo com o invento ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis também pode ser utilizado, especialmente na forma liofilizada para uma rápida aplicação sublingual. O invento será agora descrito com referência aos seguintes exemplos, que não se pretende que limitem o invento em nenhum aspecto. Nestes exemplos, os materiais de partida utilizados estavam comercialmente disponíveis ou foram sintetizados, tal como mencionado abaixo:

Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Tyr-(OBut)-OH, Fmoc-Trp-OH e

Fmoc-His(Trt) foram adquiridos a Propeptide (França).

Fmoc-P-Nal-OH e Fmoc-pCIPhe foram sintetizados como -41 -

Ί racematos. Estes aminoácidos e os seus acetiletilésteres correspondentes foram enzimaticamente resolvidos utilizando subtilisina (5);

Outros aminoácidos protegidos por Fmoc foram adquiridos a Bachem (Suíça), Novabiochem (Suíça), American Peptide CO. (USA) ou Neosystem (França). A adamantilalanina foi sintetizada tal como descrito por Kim Quang Do et cd., (6).

EXEMPLO 1: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 O Exemplo 1 foi sintetizado numa resina Rink utilizando uma estratégia de Fmoc tal como acima mencionado na síntese geral dos péptidos do invento. A clivagem foi efectuada com TFA na presença de limpadores. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 40% de eluente B (CH3CN/0,í% de TFA 60/40 v/v) durante 30 min.

Obteve-se 68 mg de material purificado (rendimento aproximado de 24%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1195,3 verificado: 1195,7.

Teor peptídico líquido de 73,9%; pureza de 97,2%; tempo de retenção de 16,4 min. EXEMPLO 2: -42- pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Npg-Arg-Pro-NEt A síntese foi efectuada numa resina Boc-Pro-PAM. 0 segundo aminoácido, arginina, foi também incorporado através de uma estratégia de Boc. Os aminoácidos subsequentes foram incorporados através de uma estratégia de Fmoc. Após a ligação do aminoácido N-terminal, o péptido foi clivado da resina e convertido em etilamida através de aminólise utilizando etilamina (5 ml de etilamina por grama de resina peptídica durante 20 horas, -78°C).

Após a clivagem o péptido protegido foi extraído com metanol, seco e desprotegido com HF tal como descrito. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 60% de eluente B durante 30 min. Obteve-se 15 mg de material purificado (rendimento aproximado de 8%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1166,3 verificado: 1166,8.

Teor peptídico líquido de 72,7%; pureza de 95,0%; tempo de retenção de 15,1 min. EXEMPLO 3: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 66 mg de material purificado (rendimento aproximado de 27%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1209,4 verificado: 1209,5.

Teor peptídico líquido de 72,6%; pureza de 95,2%; tempo de retenção de 14,5 min. EXEMPLO 4: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 60% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 8 mg de material purificado (rendimento aproximado de 7%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1180,3 verificado: 1181,0.

Teor peptídico líquido de 69,5%; pureza de 96,9%; tempo de retenção de 17,7 min. EXEMPLO 5: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 123 mg de material purificado (rendimento aproximado de 36%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1251,4 verificado: 1251,9.

Teor peptídico líquido de 71,7%; pureza de 95,7%; tempo de retenção de 13,9 min. EXEMPLO 6: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada em dois passos, o primeiro utilizando um gradiente linear de 15 a 50% de eluente B durante 30 min., e o segundo -45- Âj> /«4'. utilizando um gradiente linear de 15 a 40% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 49 mg de material purificado (rendimento aproximado de 20%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1222,4 verificado: 1223,6 (MH+).

Teor peptídico líquido de 73,6%; pureza de 95,3%; tempo de retenção de 14,6 min. EXEMPLO 7: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Npg-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada em dois passos, o primeiro utilizando um gradiente linear de 30 a 60% de eluente B durante 30 min., e o segundo utilizando um gradiente linear de 25 a 60% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 13 mg de material purificado (rendimento aproximado de 4%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1265,5 verificado: 1266,0. -46-

Teor peptídico líquido de 71,1%; pureza de 97,8%; tempo dc retenção de 15,1 min. EXEMPLO 8: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Npg-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 20 a 80% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 13 mg de material purificado (rendimento aproximado de 4%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1236,4 verificado: 1237,5 (MH4).

Teor peptídico líquido de 68,5%; pureza de 96,2%; tempo de retenção de 13,9 min. EXEMPLO 9: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A síntese foi efectuada tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 25 a 80% de eluente B durante 30 min. -47-

Obteve-se 61 mg de material purificado (rendimento aproximado de 16%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1285,5 verificado: 1286,2 (MH+).

Teor peptídico líquido de 71,8%; pureza de 96,8%; tempo de retenção de 14,9 min. EXEMPLO 10: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 20 a 80% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 6 mg de material purificado (rendimento aproximado de

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1256,4 verificado: 1257,4 (MH+).

Teor peptídico líquido de 63,2%; pureza de 96,9%; tempo de retenção de 13,9 min. ,;0 -48- ,;0 -48- / CI-#

^ V EXEMPLO 11: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 20 a 80% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 22 mg de material purificado (rendimento aproximado de 7%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1324,5 verificado: 1325,5 (MH4}.

Teor peptídico líquido de 71,6%; pureza de 97,1%; tempo de retenção de 13,1 min. EXEMPLO 12: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 20 a 80% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 10 mg de material purificado (rendimento aproximado de 5%). -49- -49-

ι | ί.· |

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1295,4 verificado: 1296,3 (MH+).

Teor peptídico líquido de 71,3%; pureza de 98,4%; tempo de retenção de 13,8 min. EXEMPLO 13: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nal-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 75% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 205 mg de material purificado (rendimento aproximado de 50%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1335,6 verificado: 1336,2 (MH4).

Teor peptídico líquido de 74,8%; pureza de 95,6%; tempo de retenção de 14,9 min. EXEMPLO 14: pGlu-His-Trp- Ser-T yr-D-Nal-Npg-Arg-Pro-NEt

-50- A montagem e a clivagem foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 25 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 82 mg de material purificado (rendimento aproximado de 22%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1306,5 verificado: 1307,2 (MH*).

Teor peptídico líquido de 76,0%; pureza de 97,4%; tempo de retenção de 15,8 min. EXEMPLO 15:

AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-NicLys-D-NicLys-Npg-IprLys-Pro- D-Ala-NHz A síntese foi efectuada numa resina de 4-metilbenzidrilamina. D-alanina e prolina foram introduzidas utilizando uma estratégia de Boc tal como acima descrito para a síntese geral dos péptidos do invento. Os outros aminoácidos foram incorporados através de uma estratégia de Fmoc tal como descrito acima. A síntese iniciou-se com Boc-D-Ala-OH.

Os péptidos foram desprotegidos e clivados da resina utilizando HF tal como descrito acima. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 70% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 49 mg de material purificado (rendimento aproximado de 31%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1605,3 verificado: 1605,5.

Teor peptídico líquido de 67,6%; pureza de 98,3%; tempo de retenção de 15,5 min. EXEMPLO 16:

AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Npg-Arg-Pro-D-Ala- A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 15, sendo a arginina introduzida utilizando uma estratégia de Boc. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 30 a 60% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 16 mg de material purificado (rendimento aproximado -52- de 9%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1444,9 verificado: 1444,6.

Teor peptídico líquido de 67,1%; pureza de 97,0%; tempo de retenção de 16,8 min. EXEMPLO 17:

AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Npg-IprLys-Pro-D-Ala- A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 15. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 60% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 55 mg de material purificado (rendimento aproximado de 29%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1459,9 verificado: 1459,3.

Teor peptídico líquido de 69,8%; pureza de 96,4%; tempo de retenção de 11,2 min. EXEMPLO 18:

AcD-Nal-D-pCIPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-HCit-Npg-IprLys-Pro-D- -53- Λ # L· /Ο

I

Ala-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 15. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 30 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 40 mg de material purificado (rendimento aproximado de 17%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1473,2 verificado: 1473,2.

Teor peptídico líquido de 69,8%; pureza de 95,7%; tempo de retenção de 15,9 min. EXEMPLO 19:

AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-HCit-Npg-Arg-Pro-D-Ala- NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 16. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 30 a 60% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 55 mg de material purificado (rendimento aproximado de 21%). -54-

•/f!

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1459,1 verificado: 1459,2.

Teor peptídico líquido de 68,2%; pureza de 96,6%; tempo de retenção de 15,7 min. EXEMPLO 20: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Pal-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 5 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 74 mg de material purificado (rendimento aproximado de 29%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1287,3 verificado: 1287,3.

Teor peptídico líquido de 72,1%; pureza de 98,6%; tempo de retenção de 12,5 min. EXEMPLO 21: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-4Pal-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2 -55-

A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 30% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 7 mg de material purificado.

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1287,3 verificado: 1287,2.

Teor peptídico líquido de 64,3%; pureza de 98,4%; tempo de retenção de 12,2 min. EXEMPLO 22: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-HPhe-Npg-Arg-Pro-Gly-NH2

A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 70% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 94 mg de material purificado (rendimento aproximado de 36%).

Análise do espectro de massa - modo ES': -56- -56- Γ

Pt * a ¢-,,, faro esperado: 1300,3 verificado: 1300,2.

Teor peptídico líquido de 74,2%; pureza de 97,5%; tempo de retenção de 15,5 min. EXEMPLO 23: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-MeNpg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 20 a 80% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 50 mg de material purificado (rendimento aproximado de 17%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1237,5 verificado: 1237,4.

Teor peptídico líquido de 73,7%; pureza de 95,0%; tempo de retenção de 16,2 min. EXEMPLO 24: pGlu-His-1 Nal- Ser-T yr-D-Leu-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 70% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 68 mg de material purificado (rendimento aproximado de 7%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1234,5 verificado: 1234,2.

Teor peptídico líquido de 73,3%; pureza de 98,5%; tempo de retenção de 15,5 min. EXEMPLO 25: pGlu-His-2Nal-Ser-Tyr-D-Leu-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 10 a 65% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 17 mg de material purificado (rendimento aproximado 58- 58- Λ , | \ ‘4^

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1234,5 verificado: 1234,2.

Teor peptídico líquido de 71,5%; pureza de 98,0%; tempo de retenção de 14,0 min. EXEMPLO 26: pGlu-His-Bal-Ser-Tyr-D-Leu-Npg-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 20 a 70% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 41 mg de material purificado (rendimento aproximado de 16%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1240,5 verificado: 1240,4.

Teor peptídico líquido de 89,0%; pureza de 97,4%; tempo de retenção de 15,6 min. EXEMPLO 27: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Ada-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 90 mg de material purificado (rendimento aproximado de 14%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1335,6 verificado: 1335,5.

Teor peptídico líquido de 76,3%; pureza de 97,8%; tempo de retenção de 17,0 min. EXEMPLO 28: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Ada-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 50% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 150 mg de material purificado (rendimento aproximado -60-

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1259,5 verificado: 1259,0.

Teor peptídico líquido de 72,9%; pureza de 97,4%; tempo de retenção de 14,1 min. EXEMPLO 29: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Ada-Arg-Pro-NEt A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 2. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 70% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 100 mg de material purificado (rendimento aproximado de 15%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1301,6 verificado: 1301,5

Teor peptídico líquido de 72,7%; pureza de 97,3%; tempo de retenção de 17,7 min. EXEMPLO 30: -61 -

fr

pGlu-His-T rp-Ser-T yr-D-T rp-Ada-Arg-Pro-Gly-NH2 A montagem e a clivagem do péptido foram efectuadas tal como descrito para o Exemplo 1. A purificação foi efectuada utilizando um gradiente linear de 15 a 70% de eluente B durante 30 min.

Obteve-se 30 mg de material purificado (rendimento aproximado de 11%).

Análise do espectro de massa - modo ES+: esperado: 1403,6 verificado: 1403,2.

Teor peptídico líquido de 82,9%; pureza de 95,0%; tempo de retenção de 16,0 min.

REFERÊNCIAS (1) G. BARANY e R.B. MERRIFELD (1979)

The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2, Capítulo 1. (2) E. ATHERTON e R.C.SHEPPARD (1989)

Solid Phase peptide synthesis, IRL Press, OXFORD (3) D. Le NGUEN, A. HEITZ e B. CASTRO (1987) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1915 E. KAISER, R.L. COLESCOTT, C.D. BOSSINGER e P.I. COOK (1970)

Anal. Biochem., 34, 595 P.N. RAO, J.E. BURDETT Jr., J.W. CESSAD, C.M. Dl NUNNO, D.M. PETERSON e H.K. KIM (1987)

Int. J. Pept. Protein Res., 29, 118 KIM QUANG DO, P. THANEI, M. CAVIEZEL e R. SCHWYZER (1979)

Helvetica Chimica Acta, 62, 956-964

LTSTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: Laboratoire Theramex (B) RUA: 6, Avenue du Princc Iiéréditairc Albcrt (C) CIDADE: Mónaco (E) PAÍS: Mónaco (F) CÓDIGO POSTAL: 98000 (G) TELEFONE: 377 92 05 08 08 (H) TELEFAX: 377 92 05 70 00 (ii) TÍTULO DO INVENTO: ANÁLOGOS PEPTÍDICOS DE LH- RH, SUAS UTILIZAÇÕES E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO-OS. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é pGlu; D-pGlu; Sar; AcSar; Pro; AcPro, ForPro, OH-Pro, Ac-OH-Pro, desidro-Pro; Ac-desidro-Pro; Ser, D-Ser; Ac-D-Ser; Thr; D-Thr; Ac-D-Thr; ou um D-aminoácido aromático opcionalmente acilado" -64- -64-

^ΪΙίί»·.··' & (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é uma ligação directa; His; ou um D-aminoácido aromático" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota== "Xaa é um L- ou D-aminoácido aromático" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBul), Ser(OBzl) ou Thr" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é um L-aminoácido aromático ou um L- ou D-aminoácido básico" (ix) APRESENTAÇAO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBul); D-Asp(OBul); D-Glu(OBu‘); D-Thr(OBul); D-Cys(OBu‘); D-Ser(OR0 onde R! é uma porção açúcar; um aza-aminoácido; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (CrC6)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Ci-C8)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo; um D-aminoácido aromático; D-ciclohexadienil-Gly; D-peridronaftil-Ala; D-peridrodifenil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é um aminoácido hidrófobo não aromático com 5 a 20 átomos de carbono” (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAYE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é um L- ou D-aminoácido básico" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é GlyNH2; D-AlaNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é um (Ci-C4)alquilo opcionalmente substituído" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (iii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido <ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é pGlu, Sar ou AcSar" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é His" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3, 4,7 (D) OUTRAS INF ORMAÇÕES .-/nota^ "Xaa é tal como definido para SEQ ID No: 1" -66-

(ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é um L-aminoácido aromático"

APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBu‘); D-Asp(OBu‘); D-Glu^OBu*); D-Thr(OBul); D-Cys(OBul); D-Ser(ORi) onde Ri é uma porção açúcar; um aza-aminoácido; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (CpC^alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (CrC8)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo; um D-aminoácido aromático; D-ciclohexadienil-Gly; D-peridronaftil-Ala; D-peridrodifenil-Ala; ou um D-aminoácido básico" (ix) APRESENT AÇ AO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é um L- aminoácido básico" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é GlyNH2, azaGlyNH2 ou um grupo -NHR2 onde R2 é tal como definido para SEQID No: 1" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (iv) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1, 3,4, 5,7, 8 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota- "Χαα é tal como definido para SEQ ID No: 1" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é uma ligação directa ou um D-aminoácido aromático" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBu‘); D-Asp(OBul); D-Glu(OBul); D-Thr(0-Bu‘); D-Cys(0-Bul); D-Ser(0-Ri) onde Ri é uma porção açúcar; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Ci-Cg)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo; um D-aminoácido aromático; D-ciclohexadienil-Gly; D-peridronafitil-Ala; D-peridrodifenil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é GlyNH2 ou D-AlaNH2" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear -68- (v) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é pGlu " (ix) APRESENTAÇAO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3, 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é tal como definido para SEQID No: 2" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é Gly; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Cj-C8)alquilo; ou um D-aminoácido aromático" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é GlyNH2 ou um grupo -NHC2H5"

Xaa 10

DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Xaa His Xaa Ser Tyr Xaa Xaa Arg Pro 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (vi) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é Ac-D-Nal" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 2 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é D-pCIPhe” (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é D-Pal" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5, 7, 8 _ (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é tal como definido para SEQ ID No: 3" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é Gly ou um L- ou D-aminoácido básico" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é D-AlaNH2" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (vii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é tal como definido para SEQID No: 1" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Npg pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C4)alquilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Npg Xaa Pro Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (viii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1,2, 3,4, 5,6, 8,10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Xaa é tal como definido para SEQ ID No: 2" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota= "Npg pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C4)alquilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Npg Xaa Pro Xaa 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ix) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 8,10 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Xaa é tal como definido para SEQID No: 3" (ix) APRESENTAÇÃO: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES :/nota= "Npg pode ser N-alfa-substituído por um grupo (C]-C4)alquilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor " (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Npg Arg Pro Xaa 1 5 10

Lisboa, 13 de Novembro de 2001 /& W-c*' ίΓ' ^^

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Análogo peptídico de LH-RH em que Ada7 ou Npg7 são substitutos de Leu7; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
2. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 1, de fórmula (SEQID No: 1): A1 - A2-A3 - A4-A5-A6-H AA-A7-Pro-Z (I) na qual: AI é pGlu; D-pGlu; Sar; AcSax; Pro; AcPro, ForPro, OH-Pro, Ac-OH-Pro, desidro-Pro; Ac-desidro-Pro; Ser, D-Ser; Ac-D-Ser; Thr; D-Thr; Ac-D-Thr; ou um D-aminoácido aromático que pode ser acilado; A2 é uma ligação directa; His; ou um D-aminoácido aromático; A3 é um L- ou D-aminoácido aromático; A4 é Ala, Ser, D-Ser, MeSer, Ser(OBu‘), Ser(OBzl) ou Thr; A5 é um L-aminoácido aromático ou um L- ou D-aminoácido básico. A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBul); D-Asp(OBu‘); D-Glu(OBul); D-Thr(OBu‘); D-Cys(OBul); D-Ser(ORt) onde R] é uma porção açúcar; um aza-aminoácido; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (C,-C6)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (CrC8)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo; -2- 2È Jfo e /<£(, ίφΛ-ΐΐ « um D-aminoácido aromático; D-ciclohexadienil-Gly; D-peridronaftil-Ala; D-peridrodifenil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico; HAA é Ada ou Npg; A7 é um L- ou D-aminoácido básico; Z é GlyNH2; D-AlaNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é um (Q-C^alquilo que pode ser substituído por um hidroxi ou um ou vários átomos de flúor, um (C3-C6)cicloalquilo ou um radical heterocíclico seleccionado a partir de morfolinilo, pirrolidinilo e piperidilo; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
3. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 2, de fórmula (SEQ IDNo: 2): AI -A2-A3-A4-A5-A6-HAA-A7-Pro-Z (lia) na qual: AI é pGlu, Sar ou AcSar; A2 é His; A3 e A4 são tal como definido para (I) na reivindicação 2; A5 é um L-aminoácido aromático; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBu); D-Asp(OBu‘); D-Glu(OBu‘); D-Thr(OBu‘); D-Cys(OBu‘); D-Ser(OR0 onde Ri é uma porção açúcar; um aza-aminoácido; D-His que pode ser substituído no anel imidazole por um grupo (Ci-Cô)alquilo ou (C2-C7)acilo; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (CrC8)alquilo ou (C3-C6)cicloalquilo; -3- ,r*\ i um D-aminoácido aromático; D-ciclohexadienil-Gly; D-peridronaftil-Ala; D-peridrodifenil-Ala; ou um D-aminoácido básico; HAA é tal como definido para (I) na reivindicação 2; A7 é um L-aminoácido básico; Z é GlyNH2; azaGlyNH2; ou um grupo -NHR2 onde R2 é tal como definido para (I) na reivindicação 2; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
4. Análogo peptídico de acordo com 3, de fórmula (SEQ ID No: 4): (IHa) pGlu-His-A3-Ser-Tyr-A6-HAA-Arg-Pro-Z na qual: A3 e HAA são tal como definido para (lia) na reivindicação 3; A6 é Gly; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Ci-C4)alquilo; ou um D-aminoácido aromático; Z é GlyNH2 ou um grupo -NHC2H5; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
5. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 4, em que A3 é Trp; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
6. Análogo peptídico de acordo com uma das reivindicações 3 a 5, em que HAA é Npg que pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Q-C4)alquilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
7. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 6, cm que HAA é Npg que pode ser N-alfa-metilado; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
8. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 2, de fórmula (SEQ ID No: 3): A1 - A2-A3 -A4-A5-A6-HAA-A7-Pro-Z (Ilb) na qual: AI é tal como definido para (I) na reivindicação 2; A2 é uma ligação directa ou um D-aminoácido aromático; A3, A4 e A5 são tal como definidos para (I) na reivindicação 2; A6 é Gly; D-Pro; D-Ser; D-Thr; D-Cys; D-Met; D-Pen; D-(S-Me)Pen; D-(S-Et)Pen; D-Ser(OBu‘); D-Asp(OBu‘); D-Glu(0-Bul); D-Thr(0-Bu‘); D-Cys(0-But); D-Ser(O-R0 onde Ri é uma porção açúcar; um D-aminoácido alifático com uma cadeia lateral de (Ci-Cg)alquilo ou (C3-C6)ci-cloalquilo; um D-aminoácido aromático; D-ciclohexadienil-Gly; D-peridronaftil-Ala; D-peridrodifenil-Ala; ou um L- ou D-aminoácido básico; HAA e A7 são é tal como definidos para (I) na reivindicação 2; Z é GlyNH2 ou D-AlaNH2; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
9. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 8, de fórmula (SEQ ID No: 5): Ac-D-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-A5-A6-HAA-A7-PiO-D-AlaNII2 (Illb) na qual: A5 é tal como definido para (Ilb) na reivindicação 8; A6 é Gly ou um L- ou D-aminoácido básico; HAA e A7 são tal como definidos para (Ilb) na reivindicação 8; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
10. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que HAA é Npg que pode ser N-alfa-substituído por um grupo (Ci-C4)alquilo que pode ser substituído por um ou vários átomos de flúor; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
11. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 10, em que HAA é Npg que pode ser N-alfa-metilado; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
12. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 3, que é pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Npg-Arg-Pro-NEt.
13. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 3, que é pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Npg-Arg-Pro-NEt.
14. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 3, que é pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Ada-Arg-Pro-NEt.
15. Análogo peptídico de acordo com a reivindicação 8, que é seleccionado a partir do grupo que consiste em: AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-NicLys-D-NicLys-Npg-IprLys-Pro- D-AlaNH2 AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Npg-Arg-Pro-D-AlaNH2 AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Npg-IprLys-Pro-D- AlaNH2 AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-HCit-Npg-IprLys-Pro-D- AlaNH2, e AcD-Nal-D-pClPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-HCit-Npg-Arg-Pro-D- AlaNH2.
16. Análogo peptídico de LH-RH, que é pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-MeNpg-Arg-Pro-NEt.
17. Composição farmacêutica que contém uma quantidade eficaz de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, ou de um sal farmaceuticamente aceitável deste.
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17 para administração oral ou parentérica.
19. Utilização de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um medicamento para o tratamento de infertilidade, estados hipogonadios ou hipergonadios, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um esteróide sexual ou uma gonadotrofina.
20. Utilização de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um agente contraceptivo, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um esteróide sexual ou uma gonadotrofina. -7-
21. Utilização de um péptido de acoido com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de cancro da próstata ou de hipertrofia benigna da próstata, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um inibidor da acção dos androgénios, um inibidor da 5a-reductase ou um inibidor de Cn-C2oliase.
22. Utilização de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de cancro da mama, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um anti-estrogénio, um inibidor da aromatase ou um inibidor de Ci7-C2oliase.
23. Utilização de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de tumores benignos ou malignos relacionados com hormonas sexuais, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um agente hormonal ou anti-tumoral.
24. Utilização de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de tumores benignos ou malignos independentes de hormonas sexuais mas sensíveis a LH-RH, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um agente anti-tumoral.
25. Utilização de um péptido de acordo com uma das reivindicações 1 a 16 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de distúrbios linfoproliferativos benignos ou malignos, em que o referido péptido é utilizado só ou em combinação com um agente imunomo-dulador ou com um agente imunossupressor. -8-
26. Utilização de um péptido de fórmula (lia) ou (Illa) de acordo com uma das reivindicações 3 a 7,12 a 14 ou 16 para a preparação de um medicamento com actividade agonista de LH-RH.
27. Utilização de um péptido de fórmula (Ilb) ou (Illb) de acordo com uma das reivindicações 8 a 11 ou 15 para a preparação de um medicamento com actividade antagonista de LH-RH. Lisboa, 13 de Novembro de 2001 fc-ÇLrO ^-- ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA