DE2424287A1

DE2424287A1 - Peptide mit lh-rh/fsh-rh-wirkung und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2424287A1
Application number: DE2424287A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Geiger; Wolfgang Dr Koenig; Juergen Dr Sandow
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-05-18
Filing date: 1974-05-18
Publication date: 1975-12-04
Also published as: BE829269A

Description

Peptide mit LH-RH/FSH-RH-Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung Das luteotrope Hormon (LH) und follikelstimulierende Hormon (FSH) ausschüttende Reieasinghormon LH-RH/FSH-RH der Struktur Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (I) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (Biochem. Hiophys Res. Commun. 43, 1334 (1971 wurde bereits in vielen Positionen modifiziert. Dabei fund man, daß durch Ersatz von Gly in der Position 6 durch D-Alanin (Biochemistry 12, 4616 (1973)) oder durch Ersatz von Gly-NH2 in der Position 10 durch Äthylamid, Propylamid oder Isopropylamid (J.Med.Chem. 16, 1144 (1973)) die Aktivität gesteigert wird.
Durch Ersatz von Arginin durch Lysin oder Ornithin (J.Med. Chom.
15, 623 (1972)),von Tyrosin durch Phenylanalin (J.Med.Chem. 16, 827 (1973)),vou Serin durch Alanin (Biochem. Biophys. Res.
Commun. 49 1467 (2972))oder Threonin (J.Med. Chem. 16, 1140-43 (1973))wurde die Wirkung zwar nicht verstärkt, aber doch zu einem Prozentsatz von etwa 10 - 50 % erhalten.
Durch Veränderung der Position 7 wurden bisher nur schwächer wirksame Derivate erhalten, wobei vom Isoleucin über Norleucin, Valin, Alanin und Glycin die Wirksamkeit von 4so/o auf 9% abfiel (Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 698 (1972))c.
Gegenstand der Erfindung sind Peptide der allgemeinen Formol Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-X-Arg-Pro-Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 worin X Ser(But), Thr(But), Asp(OBu@), Glu(0But), Orn(Boc) oder Lys(Boc) und Y Glycinamid oder eine NH-Alkyl-gruppe in der der Alkylrest 1 - 3 C-Atome enthält und gegebenenfalls durch OH oder Halogenatome substituiert sein kann, bedeuten und gegebenenfalls Trp durch Pentamethylphenylalanin, Ser durch Ala oder Thr, Tyr durch Phe, Gly durch D-Ala, D-Leu oder @, 6 Dimethylglycin, Arg durch Orn, Lys oder Homoarginin ersetzt sein kann.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptide das dadurch gekennzeichnet ist, daß man diese entweder a) durch in der Peptidchemie übliche Fragmentkondensation von Peptidbruchstücken nach dem Kondensationsschema 1 - 6 + 7 -10, 1 - 3 + 4 - 10 oder 1 - 2 + 3 - 10 oder b) durch stufenweisen Aufbau herstellt, wobei andere funktionelle Gruppen durch abhydrierbare, oder im alkalischen oder schwach saurem Medium abspaltbare Schutzgruppen intermedlär blockiert werden.
Nachdem durch Veränderung in Position 7 nur schwächer wirksame Derivate entstehen, war der Befund, daß durch Ersatz von Leucin durch die für X angegebenen Aminosäurereste die Wirkung verstärkt wird und darüber hinaus ein deutlicher Depot-effekt festzustellen ist, sehr überraschend. Besonders wirksame LH-RH-Analoga werden erhalten, wenn in den erfindungsgemäßen Verbinrdungen in 6-Position zusätzlich ein Austausch im angegebenen Sinne vorgenommen wird und/oder Y in der allgemeinen Formel eine gegebenenfalls substituierte NH-Alkylgruppe bedeutet.

Als erfindungsgemäße Verbindungen kommen insbesondere folgende LH-RH-Analoga in Betracht:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

rGle- His- Trp- Ser- Tyr- Gly- X- Arg- Pro- Gly- NH2

D-Ala X-

D-Leu . X

X NH-C2H5

D-Ala- X NH-C2H5

Phe X NH-C2H5

Thr D-Leu- X NH-CH2-CF3

Ala D-Ala- X NH-CH2-CH2-CH

D-Leu- X Lys NH-C2H5

Ala D-Ala- X Orn NH-C2H5

Y W X NH-C2H5,

wobel x die oben genannte Bedeutung hat, V für L-Pentamethylphenyalanin und W für #.#-Dimethylglyoin stoht.

Bei der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen dürfen nur Methoden verwendet werden, unter denen die sauer leicht abspaltbaren tert.-Butylreste nicht abgespalten werden.
Bei der Fragmentkupplung nach a) verwendet man vorzugsweise die ohne Racemisierung verlaufende Azidkupplung oder die DCC 1-Hydroxybenzotriazol- bzw. DCC 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3.-benzotriazin-Methode. Man kann auch aktivierte Ester von Fragmenten einsetzen.
Für die stufenweise Kondensation von Aminosäuren nach b) eignen sich besonders gut aktivierte Ester von Benzyloxycarbonylaminosäuren, wie z.B. N-Hydroxysuccinimidester oder 2.4.5-Trichlorphenylester und 4-Nitrophenylester. Die Aminolyse der beiden letzteren Aktivester läßt sich sehr gut durch N-Hydroxyverbindungen, die in etwa die Azidität der Essigsäure besitzen, katalysieren.
Als intermediäre Aminoschutzgruppen bieten sich abhydrierbare Gruppen wie z.B. der Benzyloxycarbonylrest oder schwach sauer abspaltbare Gruppen wie z.B. der 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- oder 2-(3.5.-Dimethoxyphenyl)-isopropyloxycarbonylrest an. Die Guanidofunktion des Arginins kann ungeschützt bleiben oder durch eine Nitrogruppe blockiert werden, welche bei der nächstfolgenden Hydrierung abgespalten wird. Die OIT-Gruppen des Serins und Tyrosins können durch abhydrierbare Gruppen des Benzyltyps geschützt werden. Die phenolische OII-Gruppe des Tyresins kann aber auch durch den basisch abspaltbaren ithoxycarbonylrest geschützt werden. Alle hier aufgeführten Schutzgruppen lassen sich selektiv zu den tert.-butylhaltigen Gruppen in Position 7 abspalten.

Folgende Reaktionsschemata können beispielsweise nach a) angewendet werden: Reaktionsschema 1

0 Bis rTrs Ser r Gly Ärg- g v-iTi ° tFlVw

Z % 0 Jl- ;r--OWe Z 0 c/KlOLl

ncc/ nccl 1 1

OBt aQBt

Z ~ Oi;.e Z Etoc

G1C/

I30e Etoc

z OEt

i;Et ~ r7

OEtj £i-iCpr--

DC:C/ BOBt

sIOJ Stoo

/ I-t; z L,

CE

~ - EOBt ~ ~

Reaktionsschema 2

-

PGlu His Trp Ser Tyr Gly X Arg Pro-r\TIi-W

e zl

Z OOBtX gTr

Z OOBtB 011

Z /Oh h OBU

DCG/ Z Ol-SuH

IIOE-t;

zl

z Z --- /----- OBu Z

z1

z ---- L -OK H ----

zyziHOBt 1

Reaktionsschema 3

CGlu Bis Trp Ser Tyr D-Ala X Arç Pro-l~~

Z -OTcp 1-

I-I03t

Z- tWoEb E ~

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen gegenüber den 7-Leucin-LH-RH-Verbindungen im Ovulationstest eine mehr als doppelt so starke Wirkung. Sie stellen neuartige Arzneimittel dar, die bei Hypothalasmus- und Hypophysen-Insuffizienz die Ausschüttung des luteinisierenden und des follikelstilulierendell Hormone aus dem Hypophysenvorderlappen bewirken und werden deshalb zur Behandlung von weiblicher und männlicher Sterilität verwendet, soweit diese hypothalamisch-hypophysären Ursprungs ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gelöst in physiologischer Kochsalzlösung intravenös, intramuskulär oder subcutan applizierbar, können intranasal in Form von Nasentropfen oder Nasenspray angewendet werden.
Beispiel 1 (analog Reaktionsschema 1): @Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Lys(Boc)-Arg-Pro-Gly-NH2 a) H-Lys(Boc)-Arg-Pro-Gly-NH2.2HCl Zu einer Lösung von 6.7 g (10 mMol) H-Arg-Pro-Gly-NH2 -ditosylat und 1.35 g (10 mMol) HOBt in 30 ml Dimethylformamid gibt man 1.3 ml N-Äthylmorpholin und 5.6 g Z-Lys)Boc)-OTcp. Nan rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur, engt die Lösung ein und verteilt den Rückstand zwischen Essigester und 2n Sodalösung. Die Essigesterphase wird abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Ather verrieben. Ausb. 7.5 g amorphe Substanz. Die Substanz wird in 100 ml Methanol gelöst.
Dazu gibt man eine Dpatelspitze Pd/BaSO4-Katalysator und hydriert indem man unter Rühren Wasserstoff durch die Lösung leitet. Der pH der Lösung wird mit Hilfe eines Autotitrators durch Zugabe von in methanolischer Salzsäure auf 4.5 gehalten. Der Katalysator wird nach beendigter Hydrierung abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit äther verrieben und abgesaugt.
Ausb. 5.45 amorphe Substanz. Da die Substanz dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich ist, wird folgende Säulenreinigung durchgeführt: AuSbau der Säule: 400 ml Eisessig, 800 ml n-Butanol und 4 Liter Wasser werden geschüttelt. 300 ml der oberen Phase werden mit 240 g Sephadex i;a 20(R) verrührt. Dabei wird das gesamte Lösungsmittel aufgesaugt. Diese so vorbehandelte Saulenfüllung wird in einer entsprechenden Menge der unteren Phase suspendiert.
Man läßt 3 Stunden quellen und füllt die Säule (lm x 4 cm).
Mit der unteren Phase wird eluiert.
An der oben beschriebenen Säule wird die Substanz auf zwei mal in je 2.7 g Portionen chromatographiert.
Ausbeute an chromatographisch reiner Substanz: 3.5 g amorphe Substanz, (61 % bezogen auf H-Arg-Pro-Gly-NH2-ditosylat) [#]20D = -21.3° (C=1, in Methanol) b) Z-Trp-Ser-OMe Zu einer Lösung von 16.9 g (50 mMol) Z-Trp-OH, 7,7 g (50 mMol) H-Ser-OMe.HCl und 6.65 g (50 mMol) HOBt in 100 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man 6.4 ml N-Athylmorpholin und bei 0° eine Lösung von 10.5 g DCC in 50 ml Tetrahydrofuran. Man rührt 1 Stunde bei 0°C und 2 Stunde-n bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheinander mit gesättigter NaHCO3 -Lösung, KHSO4 -Lösung, gesättigter NaHCO3 -Lösung und Wasser ausgeschüttelt. Die Essigesterphase wird über Na2 SO4 -getrocknet und eingeengt. Das zurückbleibende Öl wird in 120: ml Isopropanol gelöst. Beim Stehen im Kühlschrank kristallisiert die Substanz aus. Ausbeute : 15.6 g (71 %), Schmp. 143-145° [a]25D = -16.8° (c=1, Dimethylacetamid) c) Z-Trp-Ser-OH 4.4 g (10 mMol) Z-Trp-Ser-OMe werden in 30 ml Dioxan/Wasser (4:1) gelöst und mit einer Spatelspitze Thymolphthalein versetzt. Nun titriert man unter Rühren mit-ln NaOH bis zur bleibenden Blaufärbung. Verbraucht werden 10 mi. Dazu gibt man 10 ml in HCl und dampft das Reaktionsgemisch ein. Ber Rückstand wird zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther vorrichen. Ausb. 3.2 g (75 %).
Aus Essigester/Petroläther wird umkristallisiert. Ausb. 3 g (70 %). Schmp. 1480, [JD20,= -11.1° (c=1, Dimethylacetamid) d) Z-Tyr(Etoc)-Gly-OEt Zu einer Lösung von 38,74 g (0.l Mol) Z-Tyr(Etoc)-OH, 13.5 g (0,1 Mol) HOBt und 14 g (0.1 Mol) H-GLy-OEt.HCl in 250 ml Getrahydrofuran und 50 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° 12.8 ml N-Äthylmorpholin und 21 g DCC, gelöst in 50 ml Dimethylformamid. Nan läßt 1 Stunde bei 00C und 3 Stunden bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab una engt das Filtrat ein. Das resultierende Öl wird in Essigester gelost und die Lösung nacheinander mit gesättigter NaHCO3 -Lösung, KHSO4-Lösung, gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser ausgeschüttelt.
Die Essigesterphase wird über Na2SO4 getrocknet und etwas eingeengt. Nit Petroläther wird aus dem Essigester eine kristalline Substanz gefällt. Ausbeute: 41.47 g (88 %), Schmp. 1530 [α]25D = -16.2° (C=1, Dimethylacetamid) e) Z-Trp-Ser-Tyr(Etoc)-Gly-OEt 7.57 g (16 mMol) Z-Tyr(Etoc)-Gly-OEt werden in 200 ml Methanol und 40 ml Dimethylacetamid gelöst und wie in Versuch la katalytisch hydriert. Ausbeute: 4.75 g (79 %). Die oben gewonnenen 4.75 g (12.7 mMol) H-Tyr(Etoc)-Gly-OEt-HCl werden zusammen mit 5.39 g (12.7 mMol) Z-Trp-Ser-OH und 1.7 g HOBt in 40 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man unter Rühren bei 0° 1.5p ml N-Äthylmorpholin und 2.67 g DCC, gelöst in wenig Dimethylformamid. Man läßt 85 Stunden bei 20C stehen, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein.
Aufgearbeitet wird wie bei Versuch- ld. Der Rückstand wird mit äther verrieben. Ausbeute: 7.23 g (76 %), Schmp. 1550 [α]25D = -9.7° (c=1, Dimethylacetamid) f) #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH 5.-24 g (7.03 mMol) Z-Trp-Ser-Tyr(Etoc)-Gly-OEt werden in Methanol wie in Versuch la katalytisch hydriert. Ausbeute: 4.4 g (97 %).
Die oben gewonnenen 4.4 g (6.8 mMol) H-Trp-Ser-Tyr-(Etoc)-Gly-OEt .HCl werden zusammen mit 2.25 g (7.44 mMol) #Glu-His-OH.2H2O und 1.83 g (13.5 niMol) HOBt in 20 ml Dimethylformamid gelöst.
Zu dieser Lösung gibt man bei 0°C 0.88 ml (6.8 mMol) N-Äthylmorpholin und eine Lösung von 1.5 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Stunde bei 0° rühren und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat-eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Der Äther wird abdekan@iert. Nun wird mit einer Mischung aus Methanol/Wasser (1:1) gelöst und an dem stark baisischen Ionenaustauscher Serdolit Blau(R) chromatographiert. Das Eluat wird eingeengt; und der Rückstand in Methanol gelost. Die methanolische Lösung iaßt man in Äther unter Rühren eintropfen.
Das ausfallende amorphe -Material wird abgesaugt. Ausb. 3.4 g.
Obige 3.4 g #Glu-His-Trp-Ser-Tyr(Etoc)-Gly-OEt werden in Methanol/Wasser (1:1) gelöst und mit 6.5 ml in NaOH versetzt.
Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird mit In HCl neutralisiert und eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und über Dowex 50 (200-400 mesh) chromatographiert. Eluiert wurde zunächst mit Wasser und anschließend erschöpfend mit 0.1 molarer Essigsäure.
Danach wurde mit 0.1 molarer wässriger Pyridinlösung eluiert.
Die Fraktionen, die das gewünschte Hexapeptid enthielten, wurden eingeengt und aus Methanol Äther umgefällt.
Ausbeute 500 mg (C 0.6mMol @ ca. 10 % bezogen auf H-Trp-Ser-Tyr(Etoc)-Gly-OEt), [α]20D = -7.9° (c=1, Eisessig) g) #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Lys(Boc)-Arg-Pro-Gly-NH2 Zu einer Lösung von 380 mg #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH(0.5 mMol), 314 mg (0.5 mMolI) H-Lys(Boc)-Arg-Pro-Gly-NH2.2 HCl und 135 mg (1 mMol) HOBt in 5 ml Dimethylacetamid gibt man 0.065 ml N-Äthylmorpholin und bei 0° 110 mg DCC. Man läßt anschließend 1 Stunde bei 0° rühren und 28 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man gibt dann nochmals 110 mg DCC zu, läßt 24 Stunden stehen, saugt den Niederschlag ab, engt das Filtrat ein- und verreibt den Rückstand mit Äther. Das feste Produkt wird abgesaugt (880 mg3. Zur Reinigung wird die Rohsubstanz analog Beispiel la chromatographiert. Es werden 151 mg einer chromatographisch reinen Substanz erhalten (23 ), Aminosäureanalyse : Ser (0.72), Glu)1.02). Pro (0.98), Gly (2.00), Tyr (0.97), Lys (1.09), Bis (0.91), Arg (1.03).
Beispiel 2 (analog Reaktionsschema 3): #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5 a) Z-Arg(Z2)-Pro-NH-C2H5 Zu einer Lösung von 8.9 g (50 mMol) H-Pro-NH-C2H5 HCl, 28.9 g (50 mMol) Z-Arg(Z2)-OH und 6.75 g (50 mMol) HOBt in 150 ml Methylenchlorid gibt man bei 0 6.5 ml N-Athylmorpholin und 11 g DCC, läßt 1 Stunde bei OOC rühren und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird nacheinander mit gesättigeter NaHCO3-Lösung, 2n H2SO4 ; gesättigter NaHCO3-Lösung und mit Wasser ausgeschüttelt, über @a2SO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Isopropanol gelöst. Mit Petrolätler wird daraus ein Öl ausgefällt, das über Nacht kristallisiert. Ausbeute 27.8 g (80 %), Schmp. 82-85° [α]22D = -30.0° (c=1, Methanol) b) H-Arg-Pro-NH-C2H5.2 HCl 39.7 g (56.7 mMol) Z-Arg(Z2)-Pro-NH-C2H5 werden in Methanol analog Beispiel la katalytisch hydriert-.,-Ausbeute 17.9 g (85 %), [α]20D = -26.0° (c=1, Methanol) c) H-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-G2H5.2HCl Zu einer Lösung von 1.85 g (5 mMol) H-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl, 675 mg (5 mMol) HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 0,65 ml N-Äthylmorpholin und 2.8 g (5 mMol) Z-Lys(Boc)-OTcp. Man läßt 5 Stunden bei Raumtemperatur rühren, engt ein und verteilt den Rückstand zwischen Essigester und gesättigter NaHCO3-Lösung.
Die Essigesterlösung wird nochmals mit NaHCO3-Lösung ausgeschüttelt, mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Mit Diisopropyläther wird verrieeben und am Hochvakunm getrocknet. Ausb. 3.4 g amorphe Substanz. Diese Substanz wird nun analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert. Ausb. 2.4 g amorphe Substanz (80 %). Dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich (durch drei Nebenprodukte verunreinigt).
d) H-D-Ala-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung v-on 2.o4 g (4 mMol) H-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5 .2HCl und 540 mg (4 mMol)HOBt in 15 ml Dimethylformamid gibt man 0.52 ml N-Äthylmorpyholin und 1.6 g Z-D-Ala-OTop. Man läßt 1 Stunde be Raumtemperatur rühren und engt ein. Der Rückstand wird zwischen gesättigter NaHCO3-Lösung und Essigester verteilt.
Die Essigesterphase wird ncch ein mal mit gesättigter NaHC03 Lösung ausgeschüttelt, mit Na2SO4 - getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausbeute 2.8 g amorphe Substanz, die analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert wird. Da die Substanz stark verunreinigt ist, wird sie analog Beispiel la säulcuchromatographisch gereinigt. Ausbeute an amorpher, aber dünnschichtchrematographisch einheitlicher Substanz: 1.22 g (45 % bezogen auf eingesetztes H-Lys(Soc)-Arg-Pro-NH-C2H5-2HCl) o) Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH Zu einer Suspension von 5.- g (20 mMOl) Il-Tyr(3zl)-OH in 60 ml Dimethylacetamid gibt man 7.68 g Z-Ser-OOBt und rührt 6 Stunden bei Raumtemperatur. Von Ungelöstem wird abgesaugt und das auf OOC abgekühlte Filtrat mit 300 ml Wasser versetzt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Dimethylacetamid/ Wasser-Mischung (1:10) und Wasser gewanchen und mit in R2SO4 verrührt. Nun wird wieder abgesaugt und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Aus Essigester/Petroläther wird umkristallisiert.
Ausbeute 7.35 g (75 %), Schmp. 166°, [α]20D = +20.9° (c=1, Methanol f) Z-Ser-Tyr(Bzl)-COBt Zu einer Lösung von 4.92 g (10 mfol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH und 1.63 g (10 mMol) HOOBT in 50 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man bei 0°C 2.1 g DCC, laßt 1 Stunde bei 0°C und 1 Stunde bei Raumstemperatur rühren, gibt 20 ml Dimethylformamid zu,' saugt vom Niederschlag ab und wäscht mit Dimethylformamid nach. Das Filtrat wird eingeengt und der' Rückstand mit Isopropanol verrieben und abgesaugt.
Mit Isopropsnol und Petroläther wird gewaschen.
Ausbeute 4.5 g (71 %), Schmp. 175-177° g) H-Ser-Tyr-D-Ala-L-s)Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 1.22 g (1.82 mMol) H-D-Ala-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl in 20 ml Dimethylformamid gibt man 0.237 ml N-Äthylmorpholin und 1.15 g (1.82 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-00Bt.
Man läßt über Nacht bei 40C stehen und fällt anderntags mit Wasser und 2n Sodalösung eine Substanz aus, die abgesaugt und getrocknet wird. Ausbeute 1.4 g. Analog Beispiel la wird diese Substanz in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute l28 g amorphe Substanz (76 5 bezogen auf Z-Ser-Tyr(Bzl)-OOBt). Die Substanz ist dünnschichtohromatographisch nicht einheitlich (durch 3 Nebenprodukte verunreinigt).
h) #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Lys(Bec)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 695 mg (ca. 1.39 # in 10 ml Dimethylformamid gibt man bei -30°C 1 ml 5.5 n HCl/ Dioxan und 0.17 ml tert.-Butylnitrit. Man läßt auf -150°C kommen und rührt 45 Minuten bei dieser Temperatur. Dann kühlt nm auf -40°C ab, gibt 1.28 g (1.39 mKol) H-Ser-Tyr-D-Als-Lys(Boc)-Arg Pro-NH-C2H5.2HCl und 1.07 ml Äthylmorpholin zu und läßt über Nacht bei @°C stehen. Anderntags wird eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Das Rohprodukt wird drei mal analog Beipiel la chromatographisch gereinigt. Ausb. 100 mg chromatographisch einheitliches Produkt, [α]20D = -32.2° (c=1, Wasser).
Laut Aminosäureanalyse hat das Produkt einen Peptidgehalt von 60%.Aminosäureanalyse: Ser (0.65), Glu (1.1), Pro (1.07), D-Ala (1.1), Tyr (0.88), Lys (1.00), His (1.1), Arg (-0.78).
Beispiel 3 (analog Reaktionsschema 2, leicht variiert): #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl a) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Cly-OBut Zu einer Lösung von 24.7 g (50 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-0H, 6.75 g (50 mMol) HOBt und 8.4 g (50 mMol) H-Gly-OBu5.HCl in 100 ml Dimethylformamid gibt man 6.5 ml N-Äthylsorpolin und bei OOC 11 g DCC, gelöst in wenig Dimethylformamid. Nan rührt 1 Stunde bei OOC und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Wasser und, Essigester verteilt. Die Essigesterphase wird mit KHSO4-Lösung, gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Aus Essigester/Petroläther wird umgefällt. Ausbeute 26.8 g (88 %), Schmp. 123-125° b) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OH 20 g (33 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OBut werden in 100 ml 90-prozentiger wässriger Trifluoressigsäure gelöst. Man läßt 90 Minuten bei Raumtemperatur stehen und engt ein. Der Hiickstand wird mit äther verrieben, abgesaugt und getrocknet. Aus Essigester umkristallisiert. Ausbeute 10.1 g (56 %), Schmp. 197-198°, [α]22D = -18.1° (c=1, Methanol) c) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gl7y-OTep Zu einer Lösung von 5.49 g (10 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OH und 1.97 g 2.4.5-Trichlorphenol in 40 ml Totrahydrofuran und 15 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° 2.2- g DCC. Man rührt 2 Stunden bei OOC und 3 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend saugt man den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird mit Pctroläther verrieben und abgesaugt. Nit Isopropanol wird aufgekocht, abgekühlt und abgesaugt. Ausb. 6.3 g (85 '), Schmp. 152-160°, [α]22D = -2.9° (c=1, in Dimethylacetamid).
d) H-Ser-Tyr-Gly-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Suspension von 2.4 g (4 mMol) H-Lys(Boe)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl und 540 mg HOBt in 30 ml Dimethylformamid gibt man 0.52 ml N-Äthylmorpholin und 2.92 g (4 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OTcp, läßt über nacht bei Raumtemperatur rühren, engt ein, verreibt den Rückstand zwei mal mit 2n Sodalösung und 1 mal mit Wasser-, destilliert mit abs. Alkohol nach und verreibt den Rückstand mit Diisopropyläther. Zum Schluß wird am Hochvakuum getrocknet. Es werden 3.5 g einer amorphen Substanz erhalten, die analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert werden. Ausbeute 3.4 g.
Die Rohsubstanz wird analog Beispiel la säulenchromatographisch gereinigt. Ausbeute an amorpher, dünnschichtchromatographisch einheitlicher Substanz: 1 g, [α]20D = -36.0° (c=l, Methanol).
e) #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 250 mg (ca. 0.5 mMol) #Glu-Hos-Trp-NH-NH2 in 3 ml Dimethylformamid gibt man bei -30°C 0.37 ml 5.4n HCl/ Dioxan und 0.07 ml Tert.-butylnitrit. Man läßt 20 Minuten bei -100C rühren, kühlt auf -400C ab und gibt 0.39 ml N-Äthylmorpholin und eine Lösung von 453 mg H-ser-Tyr-Gly-Lys(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl in 3 ml Dimethylformamid zu. Man läßt über Nacht bei 00C reagieren, destilliert das Lösungsmittel im Hochvakuum ab und verreibt den Rückstand mit Äther. Analog Beispiel la wird die Rohsubstanz 2 mal säulenchromatographisch gereinigt. Ausbeute an dünnschichtchromatographisch einheitlicher Substanz 106 mg, [α]20D = -45.5° (c=1, Wasser).
Laut UV-Messung und Aminosäureanalyse hat das Produkt einen Peptidgehalt von ca. 80 %.
Aminosäureanalyse: ,Ser (0.62), Glu (1,00), Pro (1.02), Gly (1.00) Tyr (0.97), Lys (0.99), is (1.00), Arg (0.92) Beispiel 4 (analog Reaktionsschema 2): #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Orn(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5 a) H-Orn(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 2.23 g (6 mMol) H-Arg-Pro-NH-C2 115 2HC1 und 810 mg HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man bei OOC 1.56 ml N-Athylmorpholin und 3.27 g Z-Oro(Boc)-OTcp. Nach 3 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird eingeengt, der Rückstand 2 mal mit gesättigter NaHCO3@Lösung verrieben, in Essigester gelöst, noch einmal mit gesättigter NaHCO3-Lösung ausgeschüttelt, über Na2 SO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 3.2 g einer amorphon Substanz. Dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich (durch etwa 5 Nebenprodukte vorunreinigt).
b) H-Ser-Tyr-Cly-Orn(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5-2HCl Zu einer Lösung von 3.2 g (5.5 mMol) H-Orn(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5 .2HCl, 3.0 g (5.5 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OH und 740 mg (5.5 mMol) HOt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 1.43 ml N-Äthylmorpholin und 1.2 g DCC. Man läßt 2 Stunden bei 0° rühren und 3 Tage bei 40C stehen. Der Kiederschlag wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand 2 mal mit gesättigter NaHCO3-Lösung vorrieben. Aus Methylenchlorid/Äther wird umgefällt. Es werden 2.3 g amorphe Substnz erhalten, die analog Beispiel la in methanol katalytisch hydriert werden. Ausbeute 2.1 g.
Die Substanz wurde analog Beispiel la säulenchromstographisch gereinigt Ausbeute 830 mg dünnschichtchromatographisch einheitlicher, amorpher Substanz. [α]20D = -31.3° (c=1, Methanol).
c) [Glu-Nis-Trp-Ser-Tyr-Gly-Orn(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5-discetat 250 mg (ca 0.5 mMol) #Glu-His-Trp-NH-NH2 werden analog Beispiel 3e mit 496.5 mg H-Ser-Tyr-Gly-Orn(Boc)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl umgesetzt.
Analog Beispiel la wird das Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Die Fraktionen, die die Substanz enthalten,werden eingeengt und in Wasser über Dowex 1x2 (Acetatform) chromatographiert; Das so hergestellte Acetat wird noch einmal analog Beispiel la säulenchromatographiert. Ausbeute 173 mg [α22D = -49.5° (c=1, Wasser). Laut UV-Spektrum hat die Substanz einen Peptidgebalt von etwa 85 %.
Aminosäureanalyse : Ser (0.67), Glu (1.02), Pro (1,01), Gly i.oo), Tyr (0.95 ), Orn (0.99 ), His ( 1.01 ), Arg (0.93).
Beispiel 5 (analog Reaktionsschema 2): #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Glu(OBut)-Arg-Pro-NH-C2H5-diacetat a) H-Glu(OBut)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 2.23 g (6 mMol) H-Arg-Pro-NH-C2H5 .2HCl und 810 mg HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 1.56 ml N-Äthylmorpholin und 3.1 g Z-Glu(OBut)-OTcp. Nach 5 Stunden wird eingeengt, der Rückstand in Essigester gelöst und 3 mal mIt, gesättigter NaHCO3-Lösung ausgeschüttelt, mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert. Ausbeute 2.7 g (78 ) einer amorphen Substanz.
Dünnschichtchromatographisch nicht einheitlich (durch etwa 5 Nebenprodukte verunreinigt).
b) H-Ser-Tyr-Gly-Glu(OBu5)-Arg-Pro-NH-C2H5 Zu einer Lösung von 2.7 g (4.7 mNol) H-Glu(OBut)-Arg-Pro-IIH-C2H5 .2 HCl,2.5 g (4.7 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OH und 635 mg HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 1.22 ml N-Äthylmorpholin und bei 0°C 1.06 g DCC. Man läßt 1 Stunde bei 0°C rühren und über Nacht bei Raumtemperatur s-tehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwei mal mit NaHCO3-Lösung verrieben, in Essigester gelöst, mit Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Aus Isopropanol/Äther wird umgefällt.
Es werden 3.4 g einer amorphen Masse gewonnen, die analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert werden. Das Rohprodukt wird analog Beispiel la säulenchromatographisch gereinigt. Ausbeute an amorpher, dünnschichtchromatographisch einheitlicher Substanz 1.8 g (44 % bezogen auf H-Glu(OBut)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl), [α]20D = -21.3° (c=1, Methanol) c) #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Cly-Glu(OBut)-Arg-Pro-NH-C2H5-diacetat 500 mg (ca 1 mMol) #Glu-Hos-Trp-NH-NH2 werden analog Beispiel 3e mit 863,9 mg (linNol) H-Ser-Tyr-Gly-Glu(OBu5)-Arg-Pro-NH-C2H5 .2HCi'umgeetzt. Analog Beispiel 4c wird das Rohprodukt gereinigt.
Ausbeute 408 mg , []20 = -43.7° (c=l, Wasser).
Laut UV-Spektrum hat die Substanz einen Peptidgehalt von 87 o/o.
Aminosäureanalyse: Ser ( 0.65 ), Glu ( 2.05 ); Pro ( 0.99 ), Gly'( 1.00 ), Tyr ( 0.96 ), His ( 1.00 ), Arg ( 0.91 ).
Beispiel 6 (analog Reaktionsschema 2): #Glu-Hos-Trp-Ser-Tyr-Gly-Ser(Bu5)-Arg-Pro-NH-C2H5 a) H-Ser(Bu5)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 2.23 g (6 mMol) N-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl und 810 mg HOBt in 10 ml Dimethylformamid gibt man 1.56 ml N-Äthylmorpholin und 3.12 g Z-Ser(But)-OTcp und rührt 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Essigester gelöst und die Lösung 2 mal mit gesättigter NaHCO3-Lösung ausgeschüttelt, über Na2SO4 getrochnet und eingeengt.
Der Rückstand wird mit äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es werden 2.3 g amorphe Substanz erhalten, die analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert werden.
Ausbeute 2.7 -g (81 0) amorphe Substanz. Dünnschichtchromatographisckl nicht einheitlich (durch etwa 5 Nebenprodkukte verunreinigt).
b) H-Ser-Tyr-Gly-Ser(But)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl Zu einer Lösung von 2.8 g (5.5 mMol) N-Ser(But)-Arg-Pro-NH-C2H5 .2HCl, 3.0 g Z-Ser-Tyr(Bzl)-Gly-OH (5.5 mMol) und 740 mg HOBt in 10 ml Dimethylformanid gibt man 1.43 ml N-Ä.thylmorpholin und bei 0° 1.2 g DCC. Man läßt 2 Stunden bei OOC rühren und über das Wochende bei 40C stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand 2 mal mit gesättigter NaHCO3-Lösung verrieben. Die Substanz wird abgesaugt und getrocknet. Es werden 2.6 g Substanz erhalten, die analog Beispiel la in Methanol katalytisch hydriert werden. Analog Beispiel la wird die Rohsubstanz säulenchromatographisch gereinigt.
Ausbeuto 885 mg (20 % bezogen auf H-Ser(But)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl) amorphe, dünnschichtchromatographisch einheitliche Substanz, [α]20D = -31.2° (c=1, Methanol) c) #Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Ser(But)-Arg-Pro-NH-C2H5-diacetat 250 mg (ca. 0.5 mMol) #Glu-His-Trp-NH-NH2 werden analog Beispiel 3e mit 410.9 mg (0.5 mMol) H-Ser-Tyr-Gly-Ser(But)-Arg-Pro-NH-C2H5.2HCl umgesetzt. Analog Beispiel 4c wird das Rohprodukt gereinigt. Ausb. 191 mg, [α]D20 = -53.2° (c=1, Wasser). Laut UV-Spektrum hat die Substanz einen Peptidgehalt von 78 %.
Aminosäureanalyse: Ser ( 1.4 ), Glu ( 1.02 ), Pro ( 0.98 ), Gly ( 1.00 ), Tyr ( 0.95 ), His ( 1.01 ), Arg (0.95 )

Claims

Patentansprüche 1.)Peptide der allgemeinen Formel # Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-X-Arg-Pro-Y 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 worin X Ser(But), Thr(But), Asp(OBut),Glu(OBut), Orn(Boc) oder Lys(Boc) und Y Glycinamid oder eine NH»Alkyl-Gruppe in der der Alkylrest 1 - 3 C-Atorne enthält und gegobenenfalls durch OH oder Halogenatome substituiert sein kann, bedeuten und gegebenenfalls Trp durch Peutamethylphonylalanin, Ser durch Ala oder Thr, Tyr durch Phe, Gly durch D-Ala, D-Leu oderα,α Dimethylglycin, Arg durch Orn, Lys oder Homoarginin ersetzt sein kann.

2.) #Glu-His-Trp-Sor-Tyr-Gly-Ser(But)-Arg-Pro-NHC2H5 3.) #Glu-His-Trp-Sor-Tyr-Gly-Glu(OBut)-Arg-Pro-NHC2H5 4.)Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man, diese entweder a) durch in der Peptidchemie übliche Fragmentkondensation von Peptidbruchstücken nach dem Kondensationsschema 1 - 6 + 7 - 10, 1 - 3 + 4 - 10 oder 1 - 2 + 3 - 10 oder b) durch'stufern"eisen Abbau herstellt, wobei andere funktionelle Gruppen durch abhydrierbare, oder im alkalischen oder schwach saurem Medium abspaltbare Schutzgruppen intermediär blockiert werden.

5.)Pharmazeutische Präparate bestehend aus oder enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1 6.)Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen gemäß Anspruch 1 gegebenenfalls mit pharmazeutisch iiblichen Trägerstoffen und/oder Stabilisatoren in eine für therapeutische Zwecke geeignete Anwendungsform bringt.