PT95646A - Processo para a preparacao de derivados de isotiazolo-quinolina e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

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Refs 4742.PS.01

MEMÓRIA DESCRITIVA

CAMPO TÉCNICO

Os compostos são derivados de isotiazolo-quinolina, que possuem actividade antineoplásica.

ANTECEDENTES DO INVENTO é conhecido que determinados derivados tricíclicos da quinolina e da naftiridina possuem actividades antibacterianas. Por exemplo, a patente U.S. nS 4767762, aqui incorporada por referência, descreve determinados derivados de isotiazolo-quinolina que possuem actividade antibacteriana. Contudo, destes e de outros novos derivados relacionados não se sabia até aqui que eram agentes ant ineoplásicos. A ADN-topoisomerase I e a ADN-topoisomerase II são enzimas, localizados no núcleo das células, que se ligam ao ADN e alteram a configuração ou topologia do ADN. Esses enzimas desempenham um papel chave na replicação, recombinaçâo e transcrição do ADN necessárias para o crescimento e a reprodução das células.

As topoisomerases também desempenham papéis críticos na manutenção de cromossomas e da estrutura nuclear. Recentemente, verificou-se que determinados agentes anti-tumorais clinicamente úteis formam complexos cliváveis com ADN-topoisomerasee ADN em células de tumores e induzem consideráveis quebras do ADN. Este dano sobre o ADN inicia uma sequência de acontecimentos que acaba por conduzir, em última instância, à morte da célula tumoral.

Antracenodionas, como a mitoxantrona e epipodofilotoxinas, como o etoposido e o teniposido, são exemplos de drogas anti-tumorais clinicamente importantes que se determinou afectarem a reacção de quebra-reunião de ADN de mamíferos, mediada por ADN-topoisomerases. Inesperadamente, verificou-se que os compostos do presente invento, que não estão relacionados com agentes anti-tumorais conhecidos, podem induzir a quebra de ADN mediada por topoisomerase II e possuem actividade citotóxica. 71 681

Ref: 4742.PG.01

SUMARIO DQ INVENTO com actividade 0 invento refere-se a compostos de Fórmula

que podem existir na sua forma tautomérica:

em que R é seleccionado de entre (a) alquilo inferior, (b) haloalquilo, (c) cicloalquilo inferior, (d) alquilamino, <e) um grupo aromático heterocíclico e (f) um grupo fenilo; W, X e Z são seleccionados, . independentemente uns dos outros, de entre (a) hidrogénio, (b) halogéneo e (c> alquilo inferior; Y é seleccionado de entre um grupo fenilo, um grupo que contenha N, um grupo bicíclico heterocíclico e ORiq, no R10 é hidrogénio, alquilo

J inferior ou um grupo fenilo; ou quaisquer dois de W, X, Y e Z formam, em conjunto, um grupo aromático ou um grupo heterocíclico condensado, substituído ou não substituído; e seus sais, ésteres, amidas e pró-drogas farmaceuticamente aceitáveis.

DESCRIÇÃO PORMENORIZftDft DQ INVENTO 0 inventa refere-se a compostos de Fórmula I e a um processo de tratamento de doenças neoplásicas que compreende administrar a um paciente que dela necessite uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula:

I

Ref: 474S.PS.01

R W o 0 Í5 II // que pode existir na sua -Forma tautomérica:

N II z I R W o oh em que V é um grupo que contém N, seleccionado de entre grupos amino com a fórmula seguinte:

Rg /

N \ R3 em que Rg e R3 são seleccionados, um independentemente do outro, de entre hidrogénio, alquilo inferior, arilalquilo, alquilamino, amino, aminoalquilo, alquilo inferior substiutído por hidróxi, um grupo heterocíclico contendo N e um grupo bicíclico heterocíclico ou, em alternativa, Rg e R3 podem formar, em conjunto, um grupo heterocíclico contendo N com um ou mais heteroátomos seleccionados de entre S, 0 e N, sendo os átomos restantes carbono. Quando Rg e R3 são tomados em conjunto, os grupos heterocíclicos preferidos são anéis heterocíclicos alifáticos, que têm a fórmula:

em que R4 é seleccionado de entre -<GHg)m- na qual m é 2 ou 3, e <CHg)nRgCHg na qual R5 é seleccionado de entre S, OeNenél ou -6- -6- ;

Ref: 4742.PG.01 S. Também incluídos estão os derivados substituídos desses grupos heterocíclicos nos quais o número de substituintes é um, dois ou trfs, sendo seleccionados, mas uns independentemente dos outros, de entre alquilo inferior, aminoalqui lo, alquilo inferior substituído por hidroxi, alcóxi inferior, hidroxi, halogéneo, alcanoílamino e um grupo amino que tem a fórmulas /

-N \ R7 na qual Rg, e R7 são seleccionados, um independentemente do outro, de entre hidrogénio, alquilo inferior, oc-aminoácido e resíduos polipeptídicos com 2-5 aminoácidos.

Em alternativa, Y é um grupo bicíclico heterocíclico, substituído ou não substituído, que tem a fórmula: \

J

na qual Aj é um heteroátomo seleccionado de entre S, 0 e N e Ag é seleccionado de forma independente de entre um ou mais dos seguintes: alquilo inferior, alquilo inferior substituído por hidroxi, um grupo fenilo, aminoalquilo, hidroxi, halogéneo, alcanoílamino e um grupo amino que tem a fórmula seguinte: r8 /

-N \ R9 -7- 71 681

Refs 4745.PS.01 na qual Rg e Rg são seleccionados, um independentemente do outro, de entre hidrogénio, alquilo inferior,tf-aminoácido e resíduos polipeptídicos com 5-5 aminoácidos. Y também pode ser um grupo fenilo que pode estar substituído por um a três substituintes seleccionados uns independentemente dos outros, de entre alquilo inferior, halogéneo, hidroxi, alquilo inferior substituído por hidroxi, amino, alquilamino e aminoalquilo ou Y pode ser ORjoi na qual Rjo é hidrogénio, alquilo inferior ou um grupo fenilo. W, X e Z são seleccionados, uns independentemente dos outros, de entre hidrogénio, halogéneo e alquilo inferior; ou quaisquer dois de W, X, Y e Z formam, em conjunto, um grupo aromático ou um grupo heterocíclico condensado, substituído ou não substituído. R é (a) alquilo inferior, (b) haloalquilo, (c) cicloalquilo inferior, (d) alquilamino, <e) um grupo heterocíclico aromático ou <f) um grupo fenilo. 0 presente invento também se refere a composições que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos de Fórmula I ou II e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Os compostos preferidos do invento sâo os que têm a Fórmula I na qual R é ciclopropilo, etilo, fenilo ou fenilo substituído, em que os substituintes do anel fenilo são um ou mais halogéneos ou hidroxi ou dois substituintes podem formar, tomados em conjunto, um anel metilenodioxi; W é hidrogénio; X e Z são halogéneo ou X é halogéneo e Z é hidrogénio; e Y é piperazinilo, piperazinilo substituído, piperadinilo, piperadinilo substituído, aminopirrolidinilo, aminopirrolidinilo substituído, morfolino, tiomorfolino ou fenilo susbtituído, como descrito acima. □s centros quirais dos compostos podem ter quer a configuração R quer a configuração S. São compostos representativos, preferidoss 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(1-piperazinil)-5,3,4,9-tetra-hidro--isot iazolot5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-<3-metil-l-piperazinil)-5,3,4,9-tetra--hidro-isot iazoloC5,4-b]quinolina-3,4-diona; 71 681 Ref: 4742 .PG .01

-8- 9-ciclopropi1-6,8-di-f luoro-7- <4-met i 1-1-piperazini 1) -2,3,4 ,9-tetra -h idra-isot iazoloC5,4-b3qui noli na-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluaro-7-(4-(2'-hidroxi)et il-l-piperazinil)--2, 3,4,9-tetra-hidro-isotiazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(1-piperidinil)-2,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-<4-hidroxi-l-piperidinil)-2,3,4,9- -tetra-hidro-isotiazoloE5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(1-morfolino)-2,3,4,9-tetra-hidro- -isot iazoloES,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-<1-t iomorfolino)-2,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(1-diazepini1)-2,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-c i cloprop il-6,8-d i fluoro-7-< 3-am i no-l-pirrolidinil)-2,3,4,9--tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropil-6,8-difluoro-7-(3-aminoetil-l-pirrolidini1)-2,3,4,9--tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b]quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(4-cloro-3-aminomet il-l-pirrolidinil) -2,3,4,9-tetra-h idro-isot iazoloES,4-b 3qui nolina-3,4,-d iona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(1-piperazinil>-2,3,4,9-tetra-hidro- -isot iazoloC5,4-bIquinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(3-et ilaminomet il-l-pirrolidinil)--2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloES,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(N-valil-3-amino-l-pirrolidinil>--2,3,4,9-1etra-hidro-isot iazoloES,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6,8-difluoro-7-(N-alanil-3-amino-l-pirrolidinil>- -2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloES,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-c i cloprop il-6,8-d i fluoro-7-(N-gli c il-3-am i no-1-pirrolidinil)--2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloES,4-b 3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(1-piperazinil)-2,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloES,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(3-met il-l-piperazinil)-2,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(4-met il-l-piperaz i nil)-2,3,4,9-tetra-hidro--isotiazoloC5,4-b 3qui nolina-3,4-diona; -9- 71 681

Refs 4745.PG.01 9-et i1-6,8-diflúor0-7-(4-(5'-hidroxi)et il-l-piperazinil)-5,3,4,9- -tetra-hidro-isotiazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i 1-6,8-0χ·ί luor 0-7- (1-piper idini l) -S ,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-etil-6,8-difluoro-7-(4-hidrox1-1-piperidinil)-5,3,4,9-tetra--hidro-isot iazoloCS,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-eti1-6,8-diflúor0-7-(1-morfolino)-5,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-eti1-6,8-difluoro-7-(i-tiomorfolino)-5,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloCS,4-b 3qui noli na-3,4-diona; 9-et il-6,8-d i fluoro-7-(1-d i azepinil)-S,3,4,9-t etra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-<3-amino-1-pirrolidinil)-S,3,4,9-tetra-hidro--isotiazoloCS,4-blquinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(3-aminometil-l-pirrolidinil)-5,3,4,9-tetra--hidro-isotiazoloCS,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-d i fluoro-7-(4-c1orο-3-am i nomet il-l-pirrolidinil)--5,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(1-piperazini1)-5,3,4,9-tetra-hidro--isot iazoloC5,4-b3quinaiina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(3-et ilaminomet il-l-pirrolidiniD-5,3,4,9--tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(N-vali1-3-amino-l-pirrolidinil)-S,3,4,9--1etra-hidro-isot iazoloCS,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-(N-alani1-3-amino-l-pirrolidiniD-5,3,4,9- -tetra-hidro-isot iazolaC5,4-b3quino1ina-3,4-diona; 9-et i1-6,8-difluoro-7-<N-glici1-3-amino-l-pirrolidinil)-S,3,4,9- -tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropil-6~fluoro-7-(l-piperazinil)-S,3,4,9-tetra-hidro--isotiazoloCS,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropil-6-fluoro-7-(3-met il-l-piperazini1)-5,3,4,9-tetra--hidro-isot iazoloCS,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-cicloprop il-6-fluoro-7-(4-met il-l-piperazinil)-5,3,4,9-tetra--hidro-isot iazoloE5,4-b3quino1ina-3,4-diona; 9-ciclopropi l-6-f luoro-7- (4- (5 'hidroxi) et i l-l-piperazini D-5,3,4,9--tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quino1ina-3,4-diona;

-ΙΟ 9-c. i c l oprop i 1 -6“f l uoro-7- í i -p i per i d i n i l) ~2,3,4,9-1 et r a~h i dro~ isotiazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-c i clop r op i1 -8" f l uor o·-·?- (4-h i tír α x i - í ~p i per i d i n i U -2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-c iclopropi l-6-fluoro-7- (1-morfolino) -2 ,3 ,4,9-tetra-hidro-isot iazoloCS ,4-b3quinol ina-3 ,4-diona; 9-c iclopropi 1-6-·f luora-7- (1-t iomorfal ino) -2,3,4,9-tetra-hidro-i sótiazolaC5,4-b]quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-8—f luoro-7-(1-diazepinil)-2,3,4,9-tetra-hidro-isotiazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-c iclopropi1-8—f luoro-(3-amino-l-pirrolidinil>-2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-cicloprop i1-6—f luoro-7-(3-aminomet i1-1-pirrolidini1)-2,3,4,9- tetra-hidro-isot iazoloCS,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-c i cloprop i1-6—f luoro-7-(4-cloro-3-ami nometil-l-p irrolid i ni1)- 2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-bUquinolina-3,4-diona; 9-cicloprop i1-6—f luoro-7-(1-p iperazinil)-2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloH5,4-bDquinolina-3,4-diona; 9-ciclopropi1-6—f luoro-7-(3-et ilaminomet il-l-pirrolidinil)-2,3,4,9- tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropil-6—fluoro-7-(N-valil-3-amino-l-pirrolidinil)-2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-bDquinolina-3,4-diona; 9-ciclopropil-6--fluoro-7-(N-alanil-3-amino-l-pirrolidinil)-2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; 9-ciclopropil-6--fluoro-7-(N-glicil-3-amino-l-pirrolidinil)-2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b3quinolina-3,4-diona; e sais, ésteres, amidas, ou pró-drogas destes sào representativos dos compostos pre-feridos.

Como aqui é usado o termo “halogéneo" refere-se a cloro (Cl) , bromo (Br) , fluoro (F) e iodo (I) . □ termo " alquilo inferior" refere-se a grupos alquilo inferior de cadeia linear ou ramificada que contêm 1-5 átomos de carbono e que incluem, mas náo lhes estào limitados, meti lo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, neopentilo e similares. Q termo "cicloalquilo inferior" refere-se a grupas ciclaalquilo C3 e C& que incluem, mas não lhes estão limitados,

-11- ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo e ciclo-hexilo. 0 termo "grupo fenilo" refere-se quer a anéis de benzeno nao substituídos quer a anéis de benzeno com um a três substituintes que não hidrogénio seleccionados, uns independentemente dos outros, do grupo que consiste de halogéneo, hidroxi, alcoxi inferior, alquila in-ferior, alquilo inferior susbtituído por hidroxi, amino alquilamino e aminoalquilo. 0 termo "arilalquilo" re-fere-se a um grupo aromático, tal como um grupo fenilo, que está ligado a um grupo alquilo inferior. Exemplos de grupos arilalquilo são os grupos benzilo e feniletilo. 0 termo "grupo aromático" refere-se a um grupo ciclíco a Cjo bue é aromático de acordo com a regra de Huckel, por exemplo fenilo e naftilo. 0 termo "condensado", tal como aqui é usado, refere-se a dois grupos cíclicos que têm dois átomos comuns a ambos os anéis. 0 termo "grupo heterocíclico", tal como aqui é usado, refere-se a um grupo cíclico com 5 a 7 átomos que contém um ou mais heteroátomos seleccionados de entre S, 0 ou N. 0 grupo cíclico pode estar não substituído ou pode estar substituído, quer num heteroátomo quer num átomo de carbono, com por exemplo, arilalquilo, alquilo inferior, aminoalquilo, alquilo inferior substituído por hidroxi, hidroxi, alcoxi inferior, halogéneo, amino, alquilamino, alcanoilamino, um a-aminoácido ou um polipéptido com 2-5 aminoácidos. 0 termo "grupo heterocíclico aromático" refere-se especificamente a um grupo cíclico com 5 a 7 átomos que contém um ou mais heteroátomos, tal como S, 0 ou N, sendo os átomos restantes de carbono, que é aromático de acordo com a regra de Huckel. Esses heterociclos podem estar não substituídos ou podem estar substituídos com, por exemplo, alquilo inferior, desde que nenhum desses substituintes interfira com a eficácia do composto. 0 termo "grupo heterocíclico que contém N" refere-se a um "grupo heterocíclico", tal como definido acima, no qual pelo menos um dos heteroátomos é azoto. 0 termo "grupo que contém N" refere-se ou um grupo amino que tem a fórmula seguintes -12- 71 S81

Refs 4742.P6.01 r2 /

-N \ R3 na qual Rg e R3 são seleccionados, um independentemente do outro de entre hidrogénio, alquilo inferior, arilalquilo, alquilo inferior substituído por hidroxi, alquilamino, amino, aminoalquilo, um grupo heterocíclico que contenha N, e um grupo bicíclico heterocíclico, ou na qual Rg e R3 formam, em conjunto, um grupo heterocíclico que contém N e que tem um ou mais heteroátomos seleccionados de entre 8, 0 e N, sendo os átomos restantes de carbono. Também incluídos estão derivados substituídos desses grupos heterocíclicos nos quais o número de substituintes é um, dois ou três, e são seleccionados, uns independentemente dos outros, de entre alquilo inferior, aminoalquilo, alquilo inferior substituído por hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi, halogéneo, alcanoílamino e um grupo amino que tem a fórmula R6 /

-N \ R7 na qual R5 e R7 são seleccionados, um independentemente do outro, de entre hidrogénio, alquilo inferior, <x-aminoácido e resíduos polipeptídicos com 2-5 aminoácidos. 0 termo "grupo bicíclico heterocíclico que contém N" refere-se a um grupo com a fórmula: \

na qual Aj é um heteroátomo seleccionado de entre S, 0 e N e Ag é seleccionado independentemente de entre um ou mais dos seguintes:

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Ref: 4742.P6.01 -13- alquilo inferior, alquilo inferior susbtituído por hidroxi, um grupo fenilo, hidroxi, halogéneo, aminoalquilo, alcanoílamino e um grupo amino que tem a fórmula seguinte:

RS /

-N \ r9 na qual Rg e Rg são seleccionados, um independentemente do outro, de entre hidrogénio, alquilo infeiro, oc-aminoácido e resíduos polipeptídicos com 2-5 aminoácidos. 0 termo "haloalquilo" refere-se a um grupo alquilo inferior, tal como definido acima, com pelo menos um substituinte halogéneo, por exemplo fluoroetilo. 0 termo "alquilo inferior substituído por hidroxi" refere-se a grupos alquilo inferiores, tal como definidos acima, que têm pelo menos um substituinte hidroxilo, por exemplo hidroxietilo. 0 termo "alcoxi inferior" refere-se a um grupo alquilo inferior, tal como definido acima, que está ligado através de um átomo de oxigénio. Os exemplos de grupos alcoxi inferiores incluem metoxi, etoxi , t-butoxi e similares. 0 termo "alquilamino" refere-se a grupos amino substituídos com um a três grupos alquilo inferiores que incluem, mas não lhes estão limitados, metilamino e etiImetilamino. Q termo "aminoalquilo" refere-se a grupos alquilo inferiores, tal como definido acima, que têm pelo menos um substituinte amino, que pode ter um ou dois substituintes alquilo inferior. Os exemplos de grupos aminoalquilo incluem aminoetilo, aminometilo, N,N-dimetilaminoetilo e similares. 0 termo "alcanoílamino" refere-se a um substituinte com a fórmula RnC(Q)NH-, na qual Rj^ é um grupa alquilo inferior, tal como definido acima e inclui, mas não lhes está limitado, acetilamino e pivaloílamino.

Os termos "oc-aminoácido" e "resíduo pol ipept ídico" referem-se a um único aminoácido ou a dois ou mais aminoácidos ligados por ligações amida (peptídicas). Os aminoácidos podem ser aminoácidos que ocorrem naturalmente, tais como valina ou glicina, ou podem ser -14- 71 681

Ref; 4742.PB.01 <x-aminoácidos sintéticos, tal como a ciclo-hexilalanina. Ds aminoácidos podem estar quer na configuração L, quer na configuração D, quer numa mistura dos dois isúmeros. Se não for especificado, os susbtituintes aminoácido serão opticamente activos e terão a configuração L. 0 termo "prá-droga" refere-se a compostos que se hidrolisam rapidamente no sangue para darem os compostos progenitores de Fórmula I ou II. 0 termo "doenças neoplásicas" refere-se a perturbações e a estados de doença caracterizados por crescimento proliferativo anormal de células, tais como leucemias; linfomas; mielomas; melanoma; sarcomas; blastomas e tumores, por exemplo da cabeça, tiróide, pescoço, cérebro, esófago, pulmões, mama, estômago, pâncreas, tracto genito-urinário; e similares. Agentes antineoplásicos são compostos químicos que são eficazes no tratamento de uma ou mais doenças neoplásicas quaisquer. A quimioterapia de doenças neoplásticas é descrita em "Boodmam and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", sétima edição, eds., A.B.Bilman, et al. pp 1240-1306 (1985).

Também estão incluídos no âmbito do presente invento, sais, ésteres e amidas farmaceuticamente aceitáveis, dos compostos de Fórmulas I e II. Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos compostos, ou separadamente, reagindo as funções base, ácido ou hidróxido livres com um ácido ou base orgânicos adequados.

Por "farmaceuticamente aceitável" entendem-se os sais e ésteres que, no âmbito de um julgamento médico seguro, são adequados para utilização em contacto com tecidos de seres humanos e animais inferiores sem toxicidade, irritação, resposta alérgica exageradas e similares, são comensuráveis com uma relação benefício/risco razoável e são eficazes no seu uso pretendido. São exemplos de sais de adição de ácidos, não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis os sais formados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido hidrobromico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico, ou com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malónico. -15- -15- â/~ 71 681

Ref: 4742.PS.01 □utros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem nitrato, bissulfato, borato, -formato, valerato, benzoato, oleato, palmitato, estearato, laurato, lactato, fumarato, ascorbato, p-toluenossul-fonato, mesilato, gluco-heptonato, lactobionato, laurilsul-fato, e similares ou sais de metais, tais como sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou amino-sais, tais como sais de amónio, trietilamina e similares e podem ser preparados de acordo com processos convencionais.

Os exemplos de ésteres não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula I incluem ésteres de alquilo a Cfc, nos quais o grupo alquilo é uma cadeia linear ou ramificada. Os ésteres aceitáveis também incluem ésteres de cicloalquilo em C5 a C7. Sao preferidos ésteres de alquilo a C4. Os ésteres dos compostos de fórmula I podem ser preparados de acordo com processos convencionais.

Os exemplos de amidas não-tóxicas, farmaceuticamente aceitáveis, dos compostos de fórmula I incluem amidas derivadas do amoníaco, alquilaminas primárias de Cj a C5 e aminas secundárias dialquílicas a Cg, nas quais os grupos alquilo são de cadeia linear ou ramificada. No caso de aminas secundárias, a amina também pode estar na forma de um heterociclo com 5 ou 6 membros que contenha um átomo de azoto. Sao preferidas as amidas derivadas do amoníaco, alquilamidas primárias de Cj a C3 e amidas secundárias dialquílicas Cj a Cg. As amidas dos compostos de fómula I podem ser preparadas de acordo com processos convencionais. Entende-se que as amidas dos compostos do presente invento incluem aminoácido derivados e peptídicos.

Os compostas do presente invento podem ser administrados oralmente, parenteralmente, por pulverizador de inalação, por via rectal ou topicamente em formulações na forma de dosagem unitária que contâm veículos, adjuvantes e veículos nao-tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, convencionais, conforme se deseje. 0 termo "parenteral", tal como aqui é usado, inclui injecções subcutâneas, injecção intravenosa, intramuscular e intrasternal ou técnicas de infusão. A dosagem diária dos compostos do presente invento pode ser adequadamente definida de acordo com o estado do paciente, pelos

ΜΛΑ* 71 681 Ref : 474E ·Ρ8 »01 Λ 7 -16-que t'ê'm experiência da arte, mas pode, em geral, ser administrada numa quantidade de cerca de 0,1 - 750 mg/kg de massa corporal, preferivelmente cerca de 0,25 - goo mg/kg e mais preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 300 mg de ingrediente activo por kg de massa corporal. As composições das unidades de dosagem podem conter essas quantidades ou seus submúltiplos para constituírem a dosagem diária. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinado com material veículo para produzir uma forma de dosagem individual variará na dependência do hospedeiro tratado e do modo específico de administração.

No entanto, entender-se-à que o nível de dose específico para qualquer paciente em particular dependerá de uma diversidade de factores, incluindo a actividade do composto específico empregado; a idade, massa corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de administração; a taxa de excreção; a utilização de qualquer combinação de drogas; e a gravidade da doença específica sob terapia.

Tal como aqui é usado, o termo "veículos farmaceuticamente aceitáveis" significa um material de encapsulação, diluente ou carga sólida ou líquida. Alguns exemplos de materiais que podem servir de veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tal como lactose, glucose e sacarose; amidos, tal como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo da semente de algodão, óleo de açafroa, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tal como propilenoglicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e poli(etilenoglicol); ésteres, tais como oleato de etilo e laurato de etilo; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogénios; solução salina isotónica; solução de Ringer; solução de álcool etílico e tampão fosfato, 71 681 Ref: 474E.P6.01

-17-bem como outras substâncias não-tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas. Agentes molhantes, emulsionantes e lubrificantes, tais como lauriIsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, saborizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com a vontade do formulador.

As preparações injectáveis, por exemplo suspensões aquosas ou oleaginosas, estéreis, injectáveis, podem ser formuladas de acordo com a arte conhecida usando agentes suspensores e agentes dispersantes ou molhantes adequadas. A preparação injectável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injectável estéril, num diluente ou solvente não-tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo na forma de uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão a água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, empregam-se convencionalmente óleos fixos estéreis, como solvente ou meio de suspensão. Para esse fim pode emprega!—se qualquer óleo fixo brando, incluindo mono- e diglicéridos sintéticos. Além disso, os ácidos gordos, tal como o ácido oleico, têm utilidade na preparação de injectáveis. □s supositórios para a administração rectal ou vaginal da droga podem ser preparados misturando a droga com um excipiente não irritante adequado, tal como manteiga de cacau e poli(etilenoglicol), que são sólidos à temperatura rectal e, portanto, irão fundir—se no recto ou na vagina, libertando a droga.

As formas de dosagem sólidas para a administração oral podem incluir cápsulas, comprimidos, pílulas, pós, pílulas esféricas ("prills"> e grânulos. Nessas formas de dosagem sólidas o composto activo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tal como sacarose, lactose ou amido. Essas formas de dosagem também podem compreender outras substâncias que nao diluentes inertes, como é prática normal, e.q. lubrificantes para comprimidos e outros adjuvantes da formação de comprimidos, tais como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos ou pílulas, as formas de dosagem também 71 S81

Refs 474S.P0.Oi -i8- podem compreender agentes tamponantes. Além disso, os comprimidos e as pílulas podem ser preparados com revestimentos entéricos ou outros revestimentos controladores de libertação.

As formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir emulsões, microemulsoes, soluçoes, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis, que contenham diluentes inertes comummente usados na arte, tal como água. Essas composiçoes também podem compreender adjuvantes, tais como agentes molhantes; agentes emulsionantes e suspensores? agentes e dulcorantes, saborizantes e perfumantes.

Caso se deseje, os compostos do presente invento podem ser incorporados em sistemas de libertação lenta ou de distribuição dirigida, tais como matrizes de polímeros, lipossomas e microesferas. Podem ser esterilizados, por exemplo, por filtração através de um filtro retentor de bactérias ou por incorporação de agentes de esterilização, na forma de composiç&es sãlidas estéreis que se possam dissolver em água esterilizada, ou noutro meio estéril, injectável, imediatamente antes do uso.

Os compostos activos também podem estar na forma micro- encapsulada com um ou mais excipientes, como referido acima.

As formas de dosagem para administração tápica ou transdermica de um composto deste invento incluem ainda unguentos, pastas, cremes, loções, geles, pós, soluções, pulverizadores, inaladores ou emplastros. Mistura-se o componente activo, sob condiçoes estéreis, com um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários, conforme seja preciso. As formulações oftálmicas, as gotas para os ouvidos, os unguentos para os olhos, os pós e as soluções também são contemplados como estando dentro do âmbito deste invento. □s unguentos, pastas, cremes e geles podem conter, para além de um composto activo deste inventa, excipientes tais como gorduras animais e vegetais óleos, ceras, parafinas, amido, tra-gacanto derivados da celulose, poli(etilenoglicois), silicones, bentonites, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ou suas misturas.

Os pós e pulverizadores podem conter, para além dos., compostos deste invento, excipientes tais como lactose, talco, 71 881

Ref: 474E.PG.01 -19- ácido silício, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e poliamida em pó, ou misturas destas substâncias. Os pulverizadores podem conter, além disso,.propulsores usuais, tais como clorofluoro-hidrocarbonetos.

Os emplastros transdermais têm a vantagem adicional de proporcionarem libertação controlada de um composto para o corpo.

Essas formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dispersando o composto no meio próprio. Também se podem usar intensificadores de absorção, para aumentar o fluxo do composto através da pele. A velocidade pode ser controlada quer providenciando uma membrana controladora da velocidade quer dispersando o composto numa matriz do polímera ou num gel.

Os compostos de acordo com este invento podem ser preparados pelos Esquemas I e II seguintes, nos quais W, X, Y, Z e R são como foram definidos para as Fórmulas I e II, e L é um grupo que se despede, de preferência um átomo de flúor ou de cloro, e Rjg e Rjg são grupos alquilo inferior ou um grupo fenilo. 71 681 Refi 474S.P6.01 Λ

-eo- ESQUEMA I

Cl R—N=C^6 SRl3

1. R—N=C—42. R13I

S

/ w o 0 71 681 Refí 474E.PS.01

-21-

De acordo com o esquema de reacção precedente, o ácido benzóico substituído (1) é convertida no seu cloreto de ácido (d) por tratamento com um agente de cloração, tal como cloreto de tionilo. A remoção do cloreto com semi-éster do ácido malónico, na presença de uma base tal como o n-butil-lítio, dá origem ao (S-cetoéster (3). 0 tratamento do β-cetoéster (3) com uma base, tal como o hidreto de sódio, num solvente aprótico, como o tetra-hidrofurano (THF) ou a Ν,Ν-dimetil-formamida (DMF) com um isotiocianato susbtituído (4), a uma temperatura entre 0o e 40°C, durante 3 a 36 horas, seguido pelaudição de um halogeneto de alquilo, tal como iodeto de meti lo, dá origem ao enaminocetoéster (5) . Esta última reacção pode ser conduzida à temperatura ambiente ou a uma temperatura elevada adequada, conforme se queira. A seguir, o enaminocetoéster (5) é ciclizado, por exemplo por tratamento com uma base forte, preferivelmente hidreto de sódio, para se obter o éster do ácido 1,4-di-hidro-4-oxo- quinolina-3-carboxílico (7). A ciclização é conduzida num solvente aprótico, tal como dimetoxietano, éter bis(2- metoxietí1ico), dimetiIformamida (DMF) , THF ou clorobenzeno e, preferivelmente, é conduzida a temperaturas de cerca de 20°C a cerca de 145°C, de preferência à temperatura de refluxo do solvente empregue.

Em alternativa, o éster do ácido 3-carbocíclico (7) pode ser preparado por tratamento do β-cetoéster (3) , na presença de uma base como o hidreto de sódio, num solvente aprótico, de preferência THF ou tolueno, com um iminoclorotioformato substituído no N por alquilo ou fenilo (6), à temperatura ambiente ou a uma temperatura elevada adequada, como desejado. A oxidação do éster do ácido 3-carboxílico (7), por exemplo com ácido metacloroperoxibenzóico (mCPBA), num solvente não polar, tal como cloreto de metileno ou clorofórmio dá origem ao sulfóxido (8). A reacção pode ser conduzida a uma temperatura de 0°C a 50°C. A reacção de (8) com hidrossulfureto de sódio, num solvente prótico, de preferência THF aquoso, a temperatura elevada, dá origem ao derivado 2-mercapto (9). 0 tratamento de (9) com ácido hidroxilamina-O-sulfónico, na presença de uma base, de -22- 71 681

Ref: 4742.PG.01 preferência bicarbonato de sódio, num solvente prótico, de preferência THF aquoso, dá origem ao derivado isotiazolo (10) . 0 deslocamento do grupo que se despede da posição 7 de (10), com uma amina, dá origem aos derivados isotiazolo substituídos por amino na posição 7 (I). A reacção pode ser conduzida a uma temperatura entre 20°C e 130°C, num solvente orgânica adequado, tal como piridina, cloreto de meti leno, clorofórmio ou l-metil-2-pirrolidinona. é desejável levar a cabo a reacção na presença de um aceitador de ácido, tal como trietilamina, carbonato de potássio e similares, com uma razão molar de 1,0 a 2,0 moles do aceitador de ácido por mole de composto de -Fórmula (10) . A amina também pode ser usada como aceitador de ácido, caso em que se usam 2 ou mais equivalentes deste reagente.

Em alternativa, o grupo que se despede da posição 7 do composto (7) é deslocado por um grupo amino, dando origem ao derivado 7-amino (11) . A reacção de deslocamento é levada a cabo como se descreveu acima. A reacção de (11) com hidrossul-Fureto de

sódio, num solvente prótico, de preferência THF aquoso, a temperatura elevada, dá origem ao derivado 2-mercapto (12) . G tratamento de (12) com ácido hidroxilamina-O-sulfónico, na presença de uma base, de preferência bicarbonato de sódio, num solvente prótico, de preferência THF aquoso, dá origem a compostos de fórmula I.

No caso em que Y é um grupo fenilo, o composto (11) é formado por acoplamento do composto (7) com um composto aril- -metal, por exemplo fenil-lítio, na posição 7, para substituir o grupo que se despede da posição 7 por um grupo fenilo. A reacção de acoplamento é levada a cabo num solvente inerte para a a reacção, i.e., um solvente que não interfere com a reacção de acoplamento do composto aril-metal com o composto (7). Neste caso, os compostos 11, 12 e I são representados por uma fórmula na qual o grupo Y é 7-fenilo ou fenilo substituído. Os solventes inertes para a reacção, adequados, incluem éteres, por exemplo éter dietílico, dimetoxietano e THF. Caso se deseje, podem usar— se co-solventes com os éteres. Esses co-solventes podem ser -23- 71 681

Ref: 474E.P6.01 benzeno tolueno tetramet ilet ilenoamina (TMEDA) e hexametilfasforicotriamida (HMPA) .

Os compostos aril-metal podem ser preparados por processos conhecidos. Por exemplo, podem ser preparados por troca directa lítio-halogéneo no halogeneto de arilo correspondente, usando n-butil-, sec-butil- ou t-butil-lítio seguido por transmetalaçâo com uma ampla diversidade de sais, por processos conhecidos tais como os descritos por E. Negishi em "Organometallics in Qrganic Synthesis", Vol. 1, página 104.

Os compostos deste inventa também se preparam conforme se descreve aqui, no Esquema II

ESQUEMA II

13 15

R12O2C M 14 W o

R R 16

I -54- 71 681

Reis 4745.PG.01

De acordo com o esquema de reacção precedente, -faz-se reagir um derivado aromático de uma amina (13) com o reagente 14 (no qual Rjg é definido no Esquema X e M é um grupo captador de electrões, tal como COgR^g, CN ou C(0)NRR', no qual Re R' são seleccionados de entre hidrogénio ou alquilo inferior), a temperaturas de S5°C a 50eC, num solvente orgânico adequado, tal como acetonitrilo, THF ou tolueno. A seguir, o produto desta reacção (15) é aquecido num solvente nao*polar com ponto de ebulição elevado, tal como éter difenílico ou uma mistura de bifenilo e éter fenílico, vendida sob a marca registada Dowtherm A®, da Dow Chemical Company, durante 1-3 horas, ou é aquecido a 1S0°C, em ácido polifosfórico, durante 1-3 horas. 0 tratamento de (16) com ácido hidroxilamina-O-sulfúrico como se descreveu acima para o composto (9), conduz então ao produto desejado (I). 0 precedente pode ser melhor entendido a partir dos exemplos seguintes, que sao apresentados com propósitos de ilustração e não se pretende que limitem o âmbito do conceito do invento. EXEMPLO 1 9-cicloprooi1-6,8-dilfuoro-7-(1-morfoiino)-5.3.4.9-tetra-hidro--isot i azo lo C 5 ^-blauinol ina-3,4-diona

Passo 1; Preparação de N-ciclopropiliminoclorotioformato de fenilo a) Adicionou-se dissulfureto de carbono (79,18 ml; 1,31 mmol) a uma solução de 51,8 g (1,30 mol) de hidróxido de sódio em 1,6 ml de água a 0°C. Depois de se agitar esta solução durante 10 minutos, a 0°C, adicionaram-se, gota a gota, 74 g (1,30 mol) de ciclopropilamina, ao longo de um período de 30 minutos. Aqueceu-

se a mistura reaccional a 65°C, durante E horas, e, a seguir, deixou-se em repouso durante a noite, à temperatura ambiente. A mistura reaccional solidificada adicionaram-se 119,8 ml (136 g; 1,55 mmol) de cloroformato de etilo, em pequenas porçães, ao longo de um período de uma hora. Durante a adição observou-se libertação de gás e houve produção de calor. Depois de completada a 71 681 Ref: 474E.PG.01

-25— adiçlo, aqueceu-se a mistura reaccional a 65°C, durante aproximadamente 7 horas e a seguir, agitou-se à temperatura ambiente, durante o fim-de-semana. A seguir, extraiu-se a mistura reaccional com éter dietílico e concentrou-se o extracto etéreo sob presão reduzida. Adicionaram-se mais uma alíquota de 6 ml (63 mmol) de cloro-formato de etilo e 0,5 ml de trietilamina e aqueceu-se a mistura reaccional, a 65°C, durante 3 horas.

Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e destilou-se o produto bruto, obtendo-se 67,5 g (51,83*/· de rendimento) de tio--isocianato de N-ciclopropilo, com p.e. de 53 - 58°C (~8 mmHg). b) Misturaram-se entre si o tio-isocianato de N~ -ciclopropilo (67 g; 676 mmol) do Passo la e 67,3 ml (0,97 equivalentes) de tiofenol, A temperatura ambiente. A essa mistura adicionaram-se 4 gotas de trietilamina. A seguir à adição da amina, a mistura reaccional tornou-se amarela-pálida e abservou-se libertação de calor durante 2 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional num banho de gelo e dissolveu-se o sólido resultante em clorofórmio. Removeu-se o clorfórmio sob pressão reduzida e adicionou-se hexano ao líquido residual. Arrefecendo a solução em hexano num banho de gelo, formou-se um precipitado que se filtrou e lavou com hexano, para dar 120 g (84,84¾ de rendimento) de N--ciclopropiliminomercaptotioformato, que se utilizou sem purificação. c) Combinaram-se o N-ciclopropiliminomercaptotioformato (65 g; 310 mmol) do Passo Ib ( um sólido branco) com 64,6 g (0,98 equivalentes) de pentacloreto de fósforo (um sólido branco) , à temperatura ambiente, e agitou-se. Depois de se agitar, à temperatura ambiente, durante 3 minutos, observou-se uma cor de laranja e, após l hora, a mistura reaccional era uma suspensão. A seguir, aqueceu-se a mistura reaccional numa placa de aquecimento, a 65°C, durante 6 horas. Removeram-se os subprodutos cloreto de hidrogénio e o cloreto de tiofosforilo, in vacuo. e destilou-se o líquido residual, obtendo-se 56 g (87,17*/· de rendimento) de N-ciclopropiliminoclorotioformato, na forma de um 71 681 Ref: 474S.P6.01

-26-óleo amarelo, com p.e. de 85 - 90°C (0,3 mmHg) .

Passo S: l-ciclopropi1-1.4-dl-hidro-3-etoxicarboni1-S-feniItio-6.7.8-trifluoroauinolina-4-ona

Agitou-se uma suspensão de 2,3,4,5- tetrafluorobenzoilacetato de etilo (SO g; 75,8 mmol), preparada como descrito por D.T.W. Chu e R.E. Maleczka, Jr. no J. Heterocvclic Chem. 24. 435-456 (1987), e hidreto de sódio (3,18 g de NaH a 60% em óleo mineral; 1,05 equivalentes), em E70 ml de tolueno, durante 40 minutos. A seguir, adicionou-se de uma só vez o N-ciclopropi 1 iminoclorot ioformato de fenilo (19,4 g; 1,31 equivalentes) do Passo 1 e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente, durante 1 hora, aquecendo-se depois a 100°C, durante 16 horas. Evaporou-se o solvente in vacuo e o óleo residual -foi sujeito a partição entre uma mistura de 1 parte de clorofórmio e 3 partes de solução aquosa saturada de cloreto de amómio. Separaram-se as fases e removeu-se o clorofórmio da fase orgânica, sob presão reduzida. 0 resíduo oleoso resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (150 g), eluindo com um gradiente de 30% - 50% de éter dietílico em cloreto de metileno, obtendo-se o composto do título, que se recristalizou a partir de acetato de etilo a 25% em hexanos para dar 14 g (44% de rendimento) do produto desejado, com p.f. de 135 - 137°0 RMN1H (CDCl3)<J: 7,87 (m, 1H, H5) ; 7,36-7,45 (m, 5H, Ph); 4,37 (q, 2H, 0CHs); £,88 (m, 1H, NCH) ; 1,35 (t, 3H, 0CHgCH3); 1,18 (d, EH, ciclopropil); 0,9£ (s largo, EH, ciclopropil).

Passo 3 i_1-ciclooropi l-l .4-di-hidro-3-etoxicarbonil-£- fenilsulfini1-6.7.8-trifluoroouinolina-4-ona

Aqueceu-se uma solução de 1-ciclopropil-l,4-di-hidro-3-etoxicarbonil-E-feniIt io-6,7,8-trifluoroquinolina-4-ona (13,3 g ; 31,7 mmol) do Passo E e de ácido 3-cloroperoxibenzóico (11 g de peroxi-ácido a 50 - 60% da Aldrich; 1,1 equivalentes), em 300 ml de clorofórmio, a 45°C, durante 1 hora, e continuou-se a agitação 71 681 Ref s 474E.P6.01

-27-à temperatura ambiente, durante 3 horas. Lavou-se a mistura reaccional por duas vezes, com solução aquosa 1 M de carbonato de sódio, e concentrou-se, sob pressão reduzida. 0 óleo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica-gel (400 g), eluindo com metanol a 10% em cloreto de metileno, obtendo-se 12 g (57% de rendimento) do composto do título, com p.f. de 190 - -191°C (após recristalizaçáo a partir de acetato de etilo a 30% em hexanos). RMN (CDCl3)<Ss 7,95-8,00 (m, 2H, Ph), 7,86-7,93 (m, 1H, H5) , 5,52-7,62 (m, 3H, Ph) ; 4,40-4,55 (m, 2H, OCHg)? 3,46 (m, 1H, NCH); 1,42 (t, 3H, OCHgCHg); 0,8-1,38 (m, 4H, ciclopropil).

Passo 4;_9-cicloproi1-6.7.8-trifluoro-2.3.4.9-tetra-hidro- isotiazoloC5.4-b3QUinolina-3.4-diona

Agitou-se uma suspensão de l-ciclopropil-3-etoxicarbonil--2-feniIsulfini1-6,7,8-trifluoroquinolina-4-ona (12 g; 27,6 mmol) do Passo 3 e de 4,6 g de hidrato de hidros- sulfureto de sódio (NaSH), em 300 ml de tetra-hidrofurano (THF), durante 40minutos, a 0°C. Adicionou-se uma solução de bicarbonato de sódio <4 g; 47,6 mmol) em 20 ml de água e agitou-se a solução acastanhada resultante durante 2 horas, a 0°C. A esta solução, que continha 1-ciclopropi1-3- etoxicarboni l-2-mercapto-6,7,, 8-tr if luoroquinol ina-4-ona bruta, adicionaram-se 7 g (61,9 mmol) de ácido hidroxilamina-0- -sulfónico, seguido de uma solução de 12 g (142 mmol) de bicarbonato de sódio em 60 ml de água. Aqueceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e continuou-se a agitação durante 2,5 horas. Evaporaram-se os solventes in vacuo e macerou-se o resíduo gomoso por tr§s vezes, com éter dietílico. Decantou-se o éter e obteve-se uma pasta amarela, que continha o sal de sódio do produto desejado. Suspendeu-se a pasta amarela em solução aquosa 2 M de ácido clorídrico. Filtrou-se o sólido insolúvel resultante, aqueceu-se em etanol e voltou-se a filtrar, obtendo-se 7,05 g (82% de rendimento) do composto do título, com p.f. de 243 - 245°C.RMN *H (CDCl3)<S: 9,6-9,9 (s largo, 1H, NH) ; 8,03-8,11 (m, 1H, H5); 3,82 (m, 1H, NCH); 1,2-1,4 <m, 4H, ciclopropil). 71 681 Ref: 4742.P6.01

-E8-

Passo 5 i 9-ciclopropil-6.8-difluoro-7-<l-morfQlino)-S.3.4.9- -tetra-hidro-isotiazolotS.4-bHauinolina-3.4-diona

Agitou-se uma solução de 9-ciclopropi1-6,7,8-trifluoro--2,3,4,9-tetra-hidro-isotiazoloCS,4-bHquinolina-3,4-diona (3,17 g;

10,E mmol) do Passo 4 e de S,7 ml (3 equivalentes) de morfolina, em 31 ml de piridina, à temperatura ambiente, durante 2 horas e, a seguir aqueceu-se a 90°C durante E,5 dias. Removeu-se o solvente, in vacuo. e suspendeu-se o resíduo em metanol. A suspensão em metanol -foi aquecida e -filtrada. Lavou-se o sólido amarelo com solução aquosa 1 M de ácido clorídrico, água e metanol e, a seguir, secou-se sob vácuo, obtendo-se 3,17 g <82% de rendimento) do composto do título, com p.f. >E50°C RMN 1H (CDCl3)<$: 7,85 (dd, 1H, H5) ; 3,85-3,9 (m, 4H, morfolina); 3,78 (m, 1H, NCH); 3,4£ (s largo, 4H, morfolina); 1,13-1,36 (m, 4H, ciclopropil). EXEMPLOS E - 18

Seguindo a síntese delineada no Exemplo 1, começando com ácido E,3,4,5-tetrafluorobenzóico e substituindo a morfolina pela amina apropriada no Passo 5, e substituindo o N- N- ciclopropiliminoclorotioformato de fenilo por -etiliminoclorotioformato de fenilo (preparado pelo processo descrito no Passo 1 do Exemplo 1, substituindo ciclopropilamina por etilamina), quando apropriado, no Passo E, prepararam-se os

Exemplos E - 18 (na forma de base livre, a nao ser que seja indicado de outro modo), como se apresenta na Tabela 1. A estrutura de cada um foi confirmada pelo ponto de fusão e por espectroscopia de RMN como se indica. -29- 71 681 Re-f: 4742.PG .01 TABELA 1: EXEMPLOS E - 18 NQ do Estrutura exemplo

Mina p.f.

Sinal de FMN 1 * do H 9 o

fi 'r A H MeSC^H ΎΧ

>250°C 8.11 0

0 *£Πδ

T1 >250°C 8.02

Μθ^

Ok

H >250°C 8.02

V^\

0 HO O,

h >250°C 8.04

O

>250°C 7.86 (CDC13) r*<

>250°C 8.03 # <S(ppm) para ο H5 em ácido trifluoroacético (TFA)/ácido deutério-acético (CD3COOD) 50/50, a não ser que seja indicado outro solvente. 71 681 Re-fs 4742.PG.01 -30- TABELA 1: EXEMPLOS 2-18, Continuação

No do exemplo 8

Estrutura O 0

Amina p.f.

Sinal de RMN * Ο 'λ

>250°C do 8.32

XxM- TT >250°C 8.03 9 o 10

αν

0 FA

OH >250°C 8.20

HO

Ó NH2 P NH2 ** >250°C 7.98 >250°C 7.94 * <S(ppm) para ο H5 em ácido trif luoroacét ico (TFA)/ácido deutéro-acético (CD3COOD) 50/50, a não ser que seja indicado outro solvente. ##preparado por correspondente. hidrólise do derivado NHC00C(CH3)3

71 681

Refs 474S.PB.01 -31- TABELA 1: EXEMPLOS 2 - 18, continuação

Estrutura Amina p.f. ΝΩ do exemplo 13

>250°C

Sinal do RMN

1 1 2 do R 8.11

m 14 . r^vT1 >250°C 7.82 (d6-DMSO)

F MeSO^H

Me >250°C 7.71 16

>250°C 7.81 (d6-DMSO)

>250°C 7.71 (dj-DMSO)

>250°C derivado NHCQDC(CH3>3 1 <y(ppm> para ο H5 em ácido tri-f luoroacét ico (TFA> /ácido deutério-acético (CD3COQD) 50/50, a não ser que seja indicado outro solvente 2 preparado por hidrólise do correspondente. -32— 71 681

Rsfs 474S.PG.01 EXEMPLO 19 9-ciclopropi1-6-fluoro-7-(1-piperazinx1)-5,3.4.9-tetra-hidrp-isotiazolo[5.4-b3quinolina-3.4-diona

Passo li S-ciclopropilamino-S-metiltio-S-tS7«4'.5'-trifluoro)-benzoilacrilato de etilo

Adicionou-se lentamente hidreto de sódio (1,3 g de NaH a 60% em óleo mineral, da Aldrich), a uma solução de 7,6 g (30,9 mmol) de 2,4,5-trifluorobenzoilacetato de etilo (preparado como descrito por D.T. Chu na Patente U.S. n9 4767762 - Exemplo la) e de 3,38 g (34,1 mmol) de N-ciclopropiltio-isocianato (preparado como descrito no Exemplo la deste pedido de patente) , em 50 ml de Ν,Ν-dimetil-formamida (DMF) , arrefecida num banho de gelo. Uma vez completa a adição de NaH, deixou-se aquecer a mistura reaccional até à temperatura ambiente e agitou-se à temperatura ambiente durante 22,5 horas. Adicionou-se iodeto de metilo (2,1 ml; 33,7 mmol) à mistura reaccional à temperatura ambiente e agitou—se a soluçào resultante à temperatura ambiente, durante 17 horas. Adicionou-se ácido acético glacial (1 ml) e removeu-se o solvente in vacuo. Dissolveu-se o resíduo em cloreto de meti leno e lavou--se a solução em cloreto de meti leno com salmoura, secou-se com sulfato de magnésio amido, filtrou-se e concentrou-se, sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna de sílica-gel, eluindo com acetato de etilo a 1,5% em cloreto de meti leno, obtendo-se 7 g (64% de rendimento) do composto do título

Passo_2j_1-ciclopropi 1-6 ,7-dif luoro-3-etoxicarboni 1-2- met iIt ioauinolina-4-ona A uma solução de 4,23 g (11,8 mmol) de 3-ciclopropilamino-3-metiIt io-H-(2',4',5'-trifluoro)benzoilacrila to de etilo, do Passo 1, em 40 ml de THF, adicionaram-se 480 mg de hidreto de sódio a 60% em óleo mineral. Aqueceu-se a mistura reaccional a 60°C, durante 24 horas e, a seguir, adicionaram-se —33- 71 681

Ref: 4742.PG.01 0,5 ml de ácido acético glacial. Removeram-se os solventes in vácuo e dissolveu-se o resíduo em clorofórmio. Lavou-se a solução em clorofórmio com água, secou-se com sulfato de magnésio anidro e concentrou-se in vácuo. Cristalizou-se o resíduo a partir de éter dietílico, obtendo-se 2,49 g (62,5% de rendimento) do composto do título, com p.f. de 137,5°C. Análise calculada para Ci6Hi5FeNQ3S+l/2Hs0! C 55,17; H 4,59; N 4,02. Determinado: C 55,41; H 4,51; N 3,89.

Passo 3:_l-cicloproDil-6.7-difluoro-3-etoxicarboni1-2-met i 1- -sulfinilauinolina-4-ona A uma solução de 2,225 g (6,56 mmol) de 1-ciclopropi1-6,7-difluoro-3-etoxicarboni1-2-metiItioquinolina-4-ona, do Passo 2, em 70 ml de cloreto de metileno, adicionaram-se 1,486 g (6,97 mmol) de ácido 3-cloroperoxibenzóico (Aldrich, a 80%). Depois de ser agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, diluiu-se a mistura reaccional com cloreto de metileno e lavou-se com solução aquosa diluída fria de bicarbonato de sódio. Secou-se a fase orgânica com sulfato de magnésio anidra e concentrou-se in vacuo. Cristalizou-se o resíduo a partir de éter dietílico, obtendo-se 2,09 g (89,75% de rendimento) do composto do titulo, com p.f. de 207°C. Análise calculada paraCikHigFgNO^S+lMHgO: C 53,41; H 4,31; N 3,89. Determinado : C 53,49; H 4,34; N 3,75.

Passo_4j_9-cicloproDi 1-6,7-di f luoro-2,3,4,9-tetra-hidro- isotiazoloC5.4-b]auinolina-3.4-diona A uma solução de 4 g (11, 268 mmol) de 1-ciclopropi1-6,7-difluoro-3-etoxicarboni1-2-metilsulfinilquinolina-4-ona, do Passo 3, em 200 ml de THF, adicionaram-se 14 ml de solução 1 N de hidrossulfureto de sódio em THF. Depois de ter sido agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, a mistura reaccional foi evaporada in vacuo. Dissolveu-se o resídua em água e removeu-se o material insolúvel por filtraç&o. Adicionaram-se 20 ml de solução 1 N de ácido clorídrico ao filtrado aquoso e extraiu-se a solução resultante com cloreto de metileno. Evaporou-se o cloreto de -34- 71 681

Ref: 4742.PG.01 metileno sob pressão reduzida, obtendo-se 3,1 g de 1-ci cloprop il-6,7-d i fluorο-3-etox i carbon il-2-mercap t oqui no1i na-4-ona bruta, que se dissolveu em 85 ml de THF. Â solução em THF adicionaram-se 7,2 g de bicarbonato de sódio sólido e 128 ml de água, seguido pela adição de 3,77 g de ácido hidroxilamina-G-sulfónico. Depois de ter sido agitada á temperatura ambiente durante 3 horas, diluiu-se a mistura reaccional com água e -filtrou-se. Suspendeu-se o bolo de -filtração sólido em metanol fervente e arrefeceu-se a suspensão e filtrou-se, obtendo-se 2,4 g (72,4% de rendimento a partir de 1-ciclopropi1-6,7-difluoro-3-etoxicarbonil-2-met ilsulfinilquino-lina-4-ona) do composto do título, com p.f. >250°C. Do filtrado aquosa, obtiveram-se mais 200 mg do composto do título, depois de acidificação com 85 ml de solução de ácido clorídrico IN e de filtração. Análise calculada para Ci3H8F2NsG2S+1/2H20: C 51,49; H 2,97; N 9,24. Determinada: C 51,46; H 2,70; N 9,20.

Passo 5; 9-ciclopropil-6-fluoro-7-(l-piperazinil)-S,3.4,9-tetra-hidro-isotiazoloC5. 4-b3guinolina-3,4-diona

Adicionaram-se 755 mg (8,78 mmol) de piperazina a uma suspensão de 436 mg <1,48 mmol) de 9-ciclopropil-6,7-difluoro--2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloC5,4-b]quinolina-3,4-diona, do

Passo 4, em 9 ml de piridina a 70°C. Formou-se uma soluçào límpida incolor. Depois de ter sido agitada a 70°C durante 2 dias, a mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente e foi filtrada. Lavou-se o sólido com éter dietílico e água fria, obtendo-se 480 mg (91% de rendimento) do composto do título, com p.f. >275°C. Análise calculada para C17H17FN4O2S: C 55,97; H 4,83; N 14,94. Determinada; C 55,84; H 4,83; N 15,36. EXEMPLOS 20 - 27

Seguindo a síntese delineada no Exemplo 19, substituindo a piperazina pela amina apropriada, e o tio-isocianato de N- 71 681

Rei: 4742.PB,01

-35-ciclopropilo por t io-isocianato de N-etilo (preparado pelo processa descrito no Passo 1 do Exemplo 1, susbtituindo a ciclopropilamina por etilamina), quando apropriado, prepararam-se os Exemplos 20-27 (na forma de base livre, a não ser que seja indicado de outro modo), como se apresenta na Tabela 2. A estrutura de cada um foi confirmada pelo ponto de fusão e por espectroscopia de RMN como se indica. -36- 71 681

Re-f: 4742.PG.01 TABELA Sí EXEMPLOS 20 - 27

NS do exemplo R Y p.f. Sinal de RMN do 1H* 20 HC1 Ά >250°C H-5 JH-8 7.56 7.91 (CD3COOD) 21 A CH3^ >250°C 7.51 7.88 (CD3COOD) 22 A 'iTY'** kA CH3 >250°C 7.86 8.22 23 A 1 0 hO >250°C 6.93 7.78 (dfi-DMSO) 24 A * Ό', CM X >250°C 7.32 8.03 25 A Á. MeNH >250°C 7.33 8.07 26 Et >250°C 6.97 7.81 (d6-DMSO) 27 Et 1 0 >250°C 6.79 8.06 # <S(ppm para ο H5 em -acét i co (CD3CQOD) ácido tri-fluaroacético 50/50, a não ser que (TFA)/ác i do-deut ér i 0-sejar indicado outro solvente. ##preparado por hidrólise do derivado NHCOOCíCHglg correspondente -37- 71 681

Ref: 474S.P6.01 EXEMPLO S8 ll-etil-E.3.4.11-tetra~hidro~isot iazoloCS.4-b3auinolina-3.4-diona

Passo ls N-et i 1-IM- (1-naf t i 1) -S-etoxicarboni l-3-mercaptoacr i lato de etilo

Aqueceu-se uma solução de 0,4E g <E,45 mmol) de N--etiInaftilamina (fornecida comercialmente pela Aldrich Chemical Company) e de 0,5 g (1,34 mmol) de E,4--bis (bis (etox-icarboni l) met i leno)-1,3-dit iatano (preparado como descrito por M.S. Raash no J. Ora. Chem. 35. 3470-83 (1970)) em 15 ml de tolueno contendo 0,7E ml de diazabicicloundecana (DBU), sob refluxo, durante 4,5 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e removeu-se o material de partida que não reagira por filtração, lavando-se com éter dietílico. Lavou- se o filtrado com 3 x S0 ml de solução aquosa a 5*/· de ácido clorídrico, E x E0 ml de água e salmoura, secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e concentrou-se, sob pressão reduzida, obtendo-se um óleo. 0 óleo foi purificado em sílica-gel, eluindo com éter dietílico/hexanos (1:1, v/v) , para dar 0,E35 g (477. de rendimento) de N-etil-N-(l-naftil)-S-etoxicarboni1-3- mercaptoacrilato de etilo.

Passo S: 4.1l-di-hidro-3-etoxicarbonil-l1-etil-S-mercaotobenzo- -Chlauinolina-4-ona

Combinou-se N-et il-N-(11-naft il)-S-etoxicarboni1-3- -mercaptoacrilato de etilo (0,3 g; 0,80 mmol) do Passo 1 com 4 ml de ácido polifosfórico e aqueceu-se a mistura, a 100°C, durante E horas. Depois de se arrefecer a mistura reaccional até à temperatura ambiente, adicionou-se gelo e extraiu-se a mistura resultante com S x E5 ml de cloreto de meti leno. Lavou-se o extracto combinado de cloreto de meti leno, com água, secou-se com sulfato de sódio anidro, filtrou-se e concentrou-se sob pressão reduzida, obtendo-se 0,1 g (33*/· de rendimento) do composto do -38- 71 681

Ref: 474E.PG.01

Passo3: 11-et i 1-5.3.4.11-tetra-hidro-isot iazoloCS .4-b3benzoEh:3- auinolina-3,4-diona

Os processos descritos nos Passos 3 e 4 do Exemplo 1 foram repetidos, substituindo a l-ciclopropil-l,4-di-hidro-3-etoxicarbonil-2-feniltio-6,7,8-trifluoroquinolina-4-ona por 0,1 g (0,3 mmol) de 4,ll-di~hidro-3-etoxicarbonil-ll-etil-2- mercaptobenzoChDquinolina-4-ona do Passo E supra, obtendo-se 55 mg (6EX de rendimento) do composto do título, com p.f. >250°Ci RMN *Η (CF3COOD/CD3COOD 50/50), Si 8,5 (d, 1H, H5). EXEMPLO 29 9-et i1-6,7-met ilenodioxi-S.3.4.9-tetra-hidro-isot iazoloCS.4-bJauinolina-3,4-diona

Repetiu-se o processo descrito no Exemplo E8 substituindo a N-etiInaftilamina por N-etil-3,4-metilenodioxianilina, obtendo-se o composto do título·, RMN *H (CF3COOD/CD3COOD 50/50), St 7,83 (d , 1H, H5) . EXEMPLO 30 9-et il-7-fenox i-S.3.4.9-tetra-hidro-isot iazoloC5.4-b3auinolina 3,4-diona

Repetiu-se o processo descrito no Exemplo E8, substituindo a N-etiInaftilamina por N-etil-3-fenoxianilina, obtendo-se o composto do título. EXEMPLO 31 - 159

Seguindo os processos descritos no Exemplo 1, começando com ácido E ,3,4,5-tetrafluorobenzóico e usando o iminoclorotioformato, N-fenilisotiocianato ou N-<4- piridil)isotiocianato apropriados no Passo 2 e a amina apropriada no Passo 5, prepararam-se os Exemplos 31 - 159, como se 71 681

Ref: 474E.PG.01

-39-apresenta na Tabela 3. Os compostos de N-metilamino são preparados a formilamino), partir de hidrólise do composto N-(N'-metil-N'-hidrolisando com ácido clorídrico diluído. ΎΨ 71 681 Ref: 4748 .PG.01 -40 TABELA 3*. EXEMPLOS 31 - 159 V 0 F'Vv^ r π 4 if 0 <*L 2 3^nh 1 Nq do exemplo NQ do exemolo R γ iC F I9 R Y R Y 31 V r\ —N N-Me Me 43 Et -O 32 V 44 Et -0 OH 33 V NH2 Me 45 Et — ^—°n 34 V O-%. 46 Et ΓΛ — N^N-Me Me 35 V NH2 α 47 Et O / 36 V -^o 48 Et NH2 Me 37 V Ν·*-0, 49 Et vo-\» 38 V N /Me N V^N M* 50 Et ^ NH2 α 39 Et /^λ ~ν^ν-Λ^οη 51 Et 40 Et /~λ 52 Et 41 Et r~\ -N, 0 \_/ 53 Et 42 Et Õ / 54 Et N ^Μθ N \^-N / \ Μθ Me -41- 71 681 Ref: 4742.PG.01 TABELA 3: EXEMPLOS 31 - 159, continuação

55 ^Q-f r\ -N NH V_t 65 “O~F VQ-nh2 56 -Q-f r~\ -N NH Me 66 ~Of 'Ολ« 57 -Q-f r~\ -N N—Ma \_t 67 -Q-F “"Κ>^ 58 -Of r\ V-y V^ch 68 _q_f _Q-Me Me 59 r\ V-/S 69 “O-11 "0 60 -Q~f /“Λ -N 0 S__/ 70 —®~F 61 “O-1" ó / 71 Me -Q"f s?'Vx w NHEt 62 -Q-f -O 72 -0~F α 63 -Q-f -Q CH 73 -^_F ^ 64 ~0~F -O- 74 NQ-F Ννη~Ό· • 75 V /Me /=\ c N^X^-N -LrF - V -42- 71 681 Re-f: 4742.PG.01 TABELA 3: EXEMPLOS 31 - 159, continuação

/~\ 76 77 78 79 80 81 82 83 84

r~\ N NH Me ΓΛ _^""V-ch N MH \_/ 'N. N—Me

ΓΛ ’V_/S

j v. W

86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96

NH2

w O /-\ —N N—Me H Me

NH2

NH2

N /

Me .Me \

Me 85 -43- 71 681 Ref: 474E.PG.01 TABELA 3: EXEMPLOS 31 - 159, continuação

/“Λ -N NH \_/ 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 r\ N NH S—J Me ΓΛ ”N N—Me

/ V N- n^Voh

/“\ •N^S

ΓΛ •N O

117 -44- 71 681 Re-fs 4742 .PG .01

Nq do exemplo TABELA 3: EXEMPLOS 31 - 159, continuação

/—\ -N NH \_t 118 119

/vF

M NH2 A/F NH2 r\ N NH Me 120 J \ -N N—Me \_t 130 S\sF __ -NH—( Ν' \ 121 /vF r~\ ·— N N—"\ . \_t VOH 131 ^F r-\ -N N—Me X 122 /^F /~\ 132 /^F so V/ 123 ^F ΓΛ -N 0 \_/ 133 NH2 Me 124 /vF Õ 1 134 /vF NHEt 125 •^-F -O' 135 ^vF ^£V\ X NH2 α 126 /VF i -Q OH 136 /vF 127 ^VF —nQ-ch 137 /VF Me \

Me

138 /V'F

Me -45- 71 681 Re-fs 4748.PG.01 NO do exemplo r TABELA 3: EXEMPLOS 31 - 159, continuação

γ_exemplo r_γ 139 NHMe —

r~\ N, NH 140 —NHMe 141 —NHMe ΓΛ "N NH Me r\ —N N—Me 142 —NHMe — 143 •NHMe

/“Λ N^S 144 —NHMe

Γ~\ N. O 145 -NHMe 146 —NHMe 147 —NHMe 148 -NHMe -o -Q OH-o- 149 —NHMe £^-NH2 150 —NHMe NH2 151 —NHMe _ /“\ -N Ν””Μθ 152 —NHMe H Me 153 —NHMe so 154 —NHMe NH2 Me 155 —NHMe ^ NHEl 156 —NHMe ^< NH2 α 157 —NHMe '^0 158 —NHMe 159 —NHMe 71 681

Re-f: 4742 .PB .01 -46- EXEMPLQS 160 - 197

Seguindo os processos descritos no Exemplo 1,partindo de ácido 3-clora-2,4,5-tri-f luorobenzóico e usando o iminoclorotio-formato apropriado no Passo 2 e a amina apropriada no Passo 5, prepararam-se os Exemplos 160 -197, como se apresenta na Tabela 4. iWHQPP 71 681 Ref: 4745.PB.01 -47- TABELA 4: EXEMPLOS 160 - 197

NQ do exemplo R Y N° do exemplo R Y 160 A r~\ — N 0 \_t 170 A -O-* 161 A ΓΛ -N NH V_> 171 A ^^-NH2 162 A r~\ -N NH Me 172 A Όλ* 163 A /“\ —N N—Me \_t 173 A νΟλ* 164 A r~\ -N N—Me Μθ 174 A / Ο 165 A /“λ S_/ V-OH 175 A Ο-™ 166 A r~\ 176 A ( ΝΗ2 α 167 A 177 A 1^^—ΝΗ2 Μθ 168 A -O A 178 "Ον ΝΗΜι A -Q

OH 169 -48- 71 681

Ref: 4742.PG.01 N2 do exemplo 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188

TABELA 4*. EXEMPLOS 160 - 197, continuação R 1 0 Fv6 X XXj y n; 18 .9 Cl 1 R Y 0 JL 2 3^nh 1 No do exemplo R Y Et r\ -N O s_/ 189 Et —O-™ Et r~\ -N NH N_/ 190 Et ^^-NH2 Et ΓΛ N NH Me 191 Et "Ολ,, Et / V -N. N—Me \_/ 192 Et "Ολ* Et ΓΛ -N N—Me Me 193 Et ο / Et r\ 194 Et δ ò / Et r\ 195 Et v£V\ ( NH2 α Et Cm 196 Et nhz Me Et -o 197 Et O'' ^ NHM Et _Q 71 681

Re-f: 4742.PB.01 -:49- EXEMPLOS 198 - 227

Seguindo os processos descritos no Exemplo 19, partindo de ácido 2,4,5-trifluarobenzóico e usando o tio-isocianato apropriado no Passo 1 e a amina apropriada no Passo 5, sintetizaram-se os Exemplos 198 - 227, como se apresenta na Tabela 5.

71 681

Re-f: 4742.PG.01 • -50” TABELA 5: EXEMPLOS 198 -'227 N° do exemplo 198 199 200 201 202 203

1 0 Ο ίχ6 Λ. Γ Η 4 Ιί 1 3 nmu R Υ 7 Τ* Η I9 R Υ 1 ιΝγι V 1 ΝΩ do exemplo R γ / V — Ν 0 V—/ 205 Λ —Ο-™ Λ /“Λ —ν^νη Me 206 ^Δ Όλ. Λ /~\ -Vy-VCH 207 ^Δ Όλ* Λ /“Λ 208 >Δ Ο / Λ / Ο X 209 Λ s£>\ ^ NH2 α Λ -Ο 210 Λ ^^—ΝΗ2 Μθ Λ -Q 204 -51- 71 681 Ref: 474S.P6.01 TABELA 5: EXEMPLOS 198 - SS7, continuaçlo

ΓΛ * c \_t 211

Et 220

Et

OH 212

Et r-\

N NH 221 Ε* NH2

Me 213 Et / \

222

Et

214 Et r~\ N. N—Me Me 223

Et

215

Et 224

Et

OH 216 Et r\ 225

Et

217 Et

Me 218 Et

227

Et

219

Et

-52- 71 681

Refs 4742.PG.01 EXEMPLO 228 9-cicloproDi1-6,8-difluoro-7-(3 (N-norvali1)amino-pirrolidini1)-2.3.4.9-tetra-hidro-isot iazoloC5.4-b3aui nolina-3,4-diona

Acoplou-se 3-amino-1-benziIpirrolididina (I. Sumio e T.

Matsuo, Kokai Japonesa JP 5328161, publicada em 16 de Março de 1978) a N-t-butoxicarboniInorvalina (Boc-nVal), utilizando processos convencionais de acoplamento com IM-hidroxisuccinimida. Removeu-se o grupo t-benzilo por hidrogenólise em metanol, usando catalisador de paládio em carbono. A seguir, fez-se reagir a 3-(N-Boc-norvalil)aminopirrolidina com 9-ciclopropil-6,7,8- trifluoro-2,3,4,9-tetra-hidro-isot iazoloCS,4-b3quinolina-3,4-dio-na, o produto do Passo 4 do Exemplo 1, como se descreveu no Passo 5 do Exemplo 1, substituindo a morfolina por 3-(N-Boc-norvalil)aminopirrolidina, obtendo-se 9-ciclopropi1-6,8-difluoro--7-(3'-(N-norvalil)amino-pirrolidinil)-2,3,4,9-tetra-hidro-iso-tiazoloE5,4-b3quinolina-3,4-diana, com o azoto do aminoácido protegido por um grupo Boc. 0 grupo protector Boc foi removido por hidrólise normal, usando ácido trifluoroacético e ácido clorídrico aquoso diluído. A condensação de grupos amino (como os que estão presentes em alguns dos compostos deste invento) com aminoácidos e péptidos pode ser efectuada em conformidade com processos de condensação convencionais, como, por exemplo, o processo da azida, o processo do anidrido ácido misto, o processo da DCC (diciclo-hexiIcarbodiimida), o processo do éster activo (processo do éster p-nitrofenílico, processo do éster da imida do ácido N-hidroxissuccínico, processa do éster cianometílico e similares), o processo K com reagente de Woodward, o processo com DCC-HOBT (1-hidroxi-benzotriazolo) e similares.

No "Peptide Synthesis", segunda edição, de M. Bodansky, Y.S. Klausner e M.A. Ondetti (1976) descrevem-se processos clássicos para reacçSes de condensação de aminoácidos. Está contemplado que a reacção de acoplamento de aminoácido possa ser executada antes ou depois de se ter incorporado no composto o -53- 71 681

Ref. 474S.P6.01 grupo que contém amino, por substituição do átomo do flúor da posição 7 do intermediário apropriado.

Tal como na síntese peptídica convencional, os grupos amino e carboxil de cadeia ramificada das posições alfa e omega de aminoácidos podem ser protegidos e desprotegidos caso seja necessário. Os grupos de protecção que se podem usar para grupos amino incluem, por exemplo, benziloxicarbonilo(Z), o- clorobenziloxicarbonil((S-Cl)Z), p-nitrobenziloxicarbonilo (Z(NQg)), p-metoxibenziloxicarbonilo(Z(OMe)) , t-butoxicarboni-lo(Boc), t-amiloxicarbonilo(AOC), isobornealoxicarbonilo, adamant ilox icarbonilo(Adoc), S-(4-b ifenil)-S-propilox icarbonilo-(Bpoc), 9-fluoreniImetoxicarbonilo(Fmoc), metiIsulfoniletoxicar- bonilo(Msc), trifluoroacetilo, ftalilo, formilo, S-nitrofeniIsul-fenilo(Nps), difenilfosfinotioilo (Ppt) e dimetilfosfino-tioilo <Mpt) . A exemplos do grupo de protecção para grupos carboxilo incluem, por exemplo, éster benzílico (OBzl), éster ciclo-hexílico, éster 4-nitrobenzílico (OBzlNOg) , éster t-butílico (QtBu), éster 4-piridiImetílico (OPic) e similares.

No decorrer da síntese de determinados compostos do presente invento podem proteger—se aminoácidos específicos que têm outros grupos funcionais que nao grupos amino e carboxilo na cadeia ramificada, tais como arginina, cisteína, serina e similares, caso seja necessário , com grupos protectores adequados. É preferível que, por exemplo, o grupo guanidino <NG) da arginina seja protegido com nitro, p-toluenossulfonilo (Tos), benziloxicarbonilo (Z), adamantiloxicarbonilo (Adc), p- metoxibenzenossulfonilo, 4-metoxi-2,6-dimet il-benzenossulfonilo (Mts) e similares, e que o grupo tiol da cisteína seja protegido com benzilo, p-metoxibenzilo, trifenilmetilo, acetomidometilo, etiIcarbamilo, 4-metiIbenzilo (4-MeBzl>, 2,4,6-trimetiIbenzilo (Tmb) e similares, e que o grupo hidroxi da serina seja protegido com benzilo (Bzl), t-butilo, acetilo, tetra-hidropiranilo (THp) e similares.

Usando o processo delineado no exemplo S28, ou qualquer um dos outros processo de condensação convencionais, listadas acima, 71 681 Rei. 4742.Ρθ.01

-54-podem preparar-se outros derivados com atninoácidos dos compostos deste invento que tem um grupo amino. Os exemplos de aminoácidos que podem ser acoplados, seja isolados seja em combinação com um e outro, incluem aminoácidos naturais, tais como a glicina, alanina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, valina e similares, bem como aminoácidos de síntese, tais como ciclo- hexilalanina, ciclo-hexiIglicina, ácido aminopentanóico e similares.

Actividade antitumoral

Determinou-se que os compostos do presente invento possuem actividade inibidora contra um enzima celular chave, a topoisomerase II e provocam cisão de ADN mediada pela topoisomerase II, com ela relacionada, em testes sem células, actividade que -foi correlacionada com citotoxicidade'. Esses compostos manifestam actividade citotóxica, in vitro. contra uma diversidade de linhas de células de leucemia e tumorais cultivadas e in vivo, em modelos cio tumor e de leucemia do ratinho. A actividade antitumoral foi testada utilizando o teste da cisão do ADN descrito abaixo.

Teste de Cisáo do ADN

0 teste de cisáo do ADN requer dois reagentes principais; ADN-topoisomerase II e ADN radiomarcado. A ADN-topisomerase II (topo II) foi isolada de timo de vitela, com é descrito por B.D. Holligan, et al. no J.Biol. Chem,, 560. 2475-2482 (1895).. Podem usa»—se enzima pura ou extractos parcialmente purificados enriquecidos em actividade da topo II. Usou-se o plasmídeo PBR322 como substrato do ADN. Esse plasmídeo, que se isolou na sua forma circular fechada, é primeiro linearizado, utilizando um enzima de restrição que corta o plasmídeo num só lugar. A seguir, marcou-se as extremidades recentemente expostas do plasmídeo com o radionuclideo ^P, utilizando técnicas padrão descritas por

71 Θ81

Ref! 474S.PG.01 -55- T.Maniatis, et al. em "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Press, p. 115 (1982) .

Primeiro, juntam-se o enzima e o ADN radiomarcado, adicionando-se depois a droga. Depois de um período de incubação de 30 minutos, param-se as misturas, usando SDS a 1%. A seguir, submetem-se as misturas a electroforese em gel de agarose que separa o ADN substrato linear, de comprimento total, de quaisquer pequenos fragmentos que possam tei—se formado em consequência da acção da droga. Os fragmentos mais pequenos progridem com maior mobilidade. A distribuição das espécies de ADN no gel é avaliada por autorradiografia, como é descrito por T.Maniatis, et al. em "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Press, p.115 (1982). A actividade de cisão do ADN é avaliada com base no grau de perda do substrato, no grau do ADN que aparece na forma de pedaços mais pequenos que progridem mais depressa no gel e na distribuição desses pedaços mais pequenos no gel. 0 último critério é importante uma vez que a cisão de ADN induzida pela droga, isto é, fragmentação mediada pelo enzima, resulta em padrões de bandas específicos, devido ao facto de o enzima se ligar a sequências específicas ao longo da molécula de ADN. Um padrao de bandas definido é, assim, indicativo de cisão mediada por topo II e correlaciona-se bem com actividade antitumoral. Os compostos do presente invento demonstram capacidade de induzirem esse tipo de clivagem. As potências dos compostos são estimados comparando a extensão da clivagem do ADN, a diversas concentrações de composto, com a clivagem detectável a concentrações conhecidas de etoposido e teniposido, dois agentes anti-tumorais que se sabe actuarem por indução da clivagem do ADN mediada por topo II. Na Tabela 5, listam-se concentrações de composto que clivam o ADN em fragmentos mais pequenos. -56- 71 681

Ref: 4742.PB.01 TABELA; 5 Clivagem de ADN mediada por Topoisoroerase II IMS do exemplo_Concentração (^o/ml) 1 32 (SB) 2 32 (SB) 3 32 (SB) 4 32 (SB) 5 64 (MB) 6 32 (SB) 7 32 (SB) 8 32 (MB) 9 32 (SB) 10 32 (SB) 11 32 (SB) 12 32 (SB) 14 64 (MB) 15 128 (MB) 16 32-64 (MB) 17 32-64 (WB) 19 64 (MB) ao 64 (MB) 22 128 (WB) 23 32-128 (WB) 25 64 (WB) E9 128 (WB) 32 64 (WB) SB= clivagem -forte; MB= clivagem moderada; WB= clivagem -fraca

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Teste de citotoxicidade in vitro

Os compostos do presente invento exibem potente actividade citotóxica in vitro contra linhas de tumores , tais como células

Hela e do carcinoma do pulmão, de Lewis, (LLCI) . Na Tabela 6 ilustra-se a citotoxicidade dos compostos do presente invento. As IC50 -foram medidas num teste colorimétrico referente a actividade citotóxica contra células cultivadas de acordo com o protocolo descrito abaixo:

Usa-se um teste de microtitulaçào de três dias para se medir a inibição do crescimento de células cultivadas expostas a uma gama de concentrações de droga. A actividade metabólica mede-se através da capacidade das células para reduzirem o corante de tetrazólio, MTT (brometo de 3-<4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) a um produto final corado quantificável, que absorve a 570 nm, no espectro do visível. As células sobreviventes reduzem o corante MTT.

Dissolvem-se compostos de teste em dimetiIsulfóxido (DMSO) e diluem-se, primeiro com solução salina equilibrada de Earle e, depois, com meio de cultura, até duas vezes a maior concentração de composto a ser testada. A partir desta reserva concentrada, preparam-se diluições de duas vezes em série, em placas de microtitulaçào com 36 alvéolos, contendo cada alvéolo duas vezes a concentração final desejada de composto. Cada concentração é testada em triplicado e é comparada com triplicados de controlo isentos de droga.

Cultivam-se as células no mesmo meio usado para diluir os compostos. Depois da colheita por tripsinização#, determinou-se as contagens de células viáveis e ajusta-se a densidade de células a 25 000 células/ml. A seguir, adiciona-se inóculo <0,1 ml) , contendo as células, a cada alvéolo, para uma concentração final de 2500 células por alvéolo. A adição do inóculo dilui os compostos em teste até à concentração final desejada.

Incubam-se as placas de microtitulaçào durante três dias, a 36°C, numa atmosfera humidificada contendo 5*/. de dióxido de carbono.

Após três dias, adicionam-se a cada alvéolo 20 microlitros -58~ 71 681

Ref: 4742.PG.01 de MTT 5 mg/ml em solução salina tamponada por fosfato. Volta-se a por as placas na incubadora durante duas a quatro horas, para deixar que as células sobreviventes reduzam o corante. 0 meio e o corante nao reduzido são removidos por aspiração. Adiciona-se DMSQ a cada alvéolo para dissolver o produto final corado, da redução do corante, insóluvel em água, de modo a que possa ser medido espectrofotometricamente a 570 nm. A IC5Q é determinada na forma da concentração de composto testado requerida para reduzir a absorvSncia a 570 nm a 50% dos valores dos controlos não tratados com a droga. * Faz-se a colheita das células aderentes por tripsinizaçao como se segue: 1. remover o meio por aspiração 8. lavar a monocamada celular por duas vezes, com solução salina equilibrada de Earle. 3. Adicionar tripsina (0,05%>/EDTA (0,53 mM). Para cada 25 cm3 usar aproximadamente 0,2 ml de solução, inclinar para cobrir a monocamada e, a seguir, escoar a tripsina, deixando apenas um filme fino de solução. Incubar à temperatura ambiente até que a monocamada de células se destaque. 4. Quando as células se tiverem destacado, determinando-o por observação visual e/ou com microscópio, adicionar meio contendo soro de vitela fetal para parar a acçao da tripsina e ressuspender as células. Triturar, para ajudar a dissociação de grumos de células. 5. Determinar o número de células por mililitro com um contador electrónico de células (e.g. um Contador

Coulter) ou misturando uma alíquota da suspensão de células com Azul de Tripano (0,4% em solução salina normal) e contar as células viáveis usando um hemocitómetro. -59- 71 681

Ref: 4745.PB.01

Citotoxicidade Dara TABELA 6 células tumorais. in vitro (IC50 MO/ml) exemplo Helaâ LLClb P38S.Dlc A549d HCT-8e 1 7,0 — — — — 5 3,9 0,99 - - - 3 - - 3,1 8,3 14,0 4 1,3 - - - - 5 4,0 - - - - 6 - - 6,3 15,5 - 7 - - 0,5 - - 8 3,9 - - - - 9 - - 5,05 3,9 - 10 - - 0,53 5,9 - 11 0,95 0,55 - - - IS - - <0,05 0,30 - 13 0,55 - - - - 14 4,0 1 ,5 - - - Etoposido 4,0 - 0,05 1 ,00 0,68 a. As células Hela foram adquiridas à ATCC, nS de catálogo CCL3. b. LLC1= carcinoma do pulmão, de Lewis. c. A P388D1 é uma linha de células de leucemia. d. A A549 é uma linha de células do cancro da mama humano. e. A HCT-8 é uma linha de células do cancro do cólon humano. Actividade antitumoral in vivo

Ds dados de in vivo apresentados na Tabela 7 foram determinados em ratinhos DBFj para dois modelos de cancro de murino, usando 6 a 10 animais por grupo de teste. No caso do carcinoma do pulmão, de Lewis (LL), os ratinhos foram inoculados subcutaneamente (SC) na região da axila, com uma punctura na área inguinal que tinha o tumor, no dia 0. 0 composto em teste é -60- 71 681

Re-f: 4742. PG . 01 administrado intraperitonealmente (IP> do dia 1 ao dia 9, no total de nove injecçães. Os tumores são pesados no dia 14 e a inibição de peso é expressa na -forma de média ponderai dos tumores tratado (T) e do controlo (C). No caso das células P388, da leucemia implanta-se numa suspensão de -fluído ascítico diluído (0,1 ml), contenda 1 x 1Q6 células, IP, nos ratinhos, no dia 0 e administra-se o composto em teste IP, do dia 1 ao dia 5, num total de cinco injecçôes. Controlou-se a sobrevivência durante 30 dias e expressou-se o tempo de vida aumentado na -forma da média do tempo de sobrevivência dos ratinhos tratado (T) e do controla (C) . TABELA 7; Actividade antitumoral in vivo NQ exemplo dose(ma/ka) LL(T/C)a P388 Leucemia (%T/C)b 1 250 108 1 125 108 1 62,5 100 1 31,25 104 3 250 0,35 160 3 125 0,59 160 3 62,5 0,75 145 3 31,5 0,81 145 5 10 142 5 5 129 5 2,5 125 5 12,5 117 10 100 117 10 50 133 10 25 133 10 12,5 129 -61- 71 681

Ref: 4742.PG.01 â. Determinado ao dia 14. b. Aumento médio do tempo de vida de ratinhos tratados comparados com o dos controlos.

Este invento foi descrito em termos de concretizações específicas apresentadas em pormenor. No entanto, deve ser entendido que essas concretizações são apresentadas apenas a título de ilustração e que o invento não se lhes fica necessariamente limitado. Podem fazei—se modificações e variações dentro do espírito e no âmbito das reivindicações que se seguem que serão imediatamente evidentes a partir desta descrição, tal como concluíram os que são peritos na arte.