FI103575B - Menetelmä terapeuttisesti vaikuttavien 6,9-bis(amino)bentso(g)isokinol iini-5,10-dionien valmistamiseksi - Google Patents

Description

103575

Menetelmä terapeuttisesti vaikuttavien 6,9-bis(amino) bentsofg]isokinoliini-5,10-dionien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää 6,9-bis(substituoitu amino)-5 bentso[g] is.okinoliini-5,10-dionien valmistamiseksi ja erityisesti yhdisteitä, joissa on 6,9-substituentteja, jotka ovat (aminoalkyyli)aminosubstituentteja. Näillä yhdisteillä on osoitettu olevan kasvaimia estävä aktiivisuus in vitro ja in vivo.

10

On esitetty tiettyjä 1,4-bis[(aminoalkyyli)amino]antra-seeni-9,10-dioneja, joilla on kasvaimia estävä aktiivisuus kliinisissä kokeissa. Erityisen mielenkiintoinen on ollut ametantroni, joka on 1,4-bis{(2-(2-hydroksietyyli-15 amino)etyyli]amino}antraseeni-9,10-dioni, ja mitoksantro-ni, joka on 5,8-dihydroksi-l,4-bis{[2-(2-hydroksietyyli-amino)etyyli]amino}antraseeni-9,10-dioni. (Zee-Cheng et ai., J.Med.Chem.. (1978), 21, 291-294; Cheng et ai., "Progress in Medicinal Chemistry", Ellis, G.P. ja West, 20 G.B., toimittajat; Elsevier: Amsterdam, 1983, s.20, 83, ja siinä esitetyt viitteet). Mitoksantroni on laajaspekt-rinen kasvainsoluja tuhoava aine, jonka aktiivisuus on samanlainen kuin doksorubisiinin, joka on antrasykliini-antibiootti. Kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että mit-25 oksantronilla on erityisesti lupaava aktiivisuus hoidettaessa pitkälle edistynyttä rintasyöpää, akuuttia leuke- ! miaa ja imukudoskasvainta (Legha, Drugs of Today. (1984) , • · *. * 20, 62 9). Vaikka eläinkokeet ovat osoittaneet vähentynyt- ·// tä kardiotoksisuutta verrattuna doksorubisiiniin, jonkin ’·* ' 30 verran kliinistä kardiotoksisuutta on havaittu myös mitoksantronilla, enimmäkseen potilailla, joita on aikai- «I* v 1 semmin hoidettu doksorubisiinilla (R.Stuart Harris et :: : ai., Lancet. (1984), 219 ja siinä esitetyt viitteet).

• · 35 Ametantronin on ilmoitettu olevan eläimillä noin 10-ker-taa tehottomampi ja vähemmän kardiotoksinen kuin mitok-santronin. Koska viivästynyt toksisuus on havaittu vain mitoksantronilla kahden i.p.:sti annostetun lääkkeen 2 103575 jälkeen rotilla, joilla ei ole kasvainta, annosten ollessa yhtä tehokkaat kuin kasvaimia estävät annokset, on arveltu, että 5,8-dihydroksi-substituutio mitoksantronis-sa saattaisi olla syynä myöhemmin tapahtuneisiin kuole-5 miin (Corbett et ai., Cancer Chemother.Pharmacol..

(1981), 6, 161).

Lisäksi sekä mitoksantronilla että ametantronilla on merkittävä myelodepressiivinen toksisuus ja molemmat yhdis-10 teet osoittavat ristiresistenssiä solukudostyypeille, mikä kehittää resistenssiä doksorubisiinille mikä johtuu glykoproteiini P:n yli-ilmentymisestä. Tällainen resistenssi, jota nimitetään monilääkeresistenssiksi, koskee monia kasvaimia estäviä antibiootteja, joiden joukossa 15 ovat amsakriini- ja podofyllotoksiinijohdannaiset, ja se on yksi terapeuttisiin epäonnistumisiin johtavista pääsyistä hoidettaessa kiinteitä kasvaimia mainituilla antibiooteilla.

20 Tästä johtuen on tarve etsiä uusia kasvaimia estäviä ant-raseenidioniaineita, joilla on korkeampi terapeuttinen indeksi kuin mitoksantronilla ja jotka ovat tehokkaita sekä estettäessä että hidastettaessa tällaisten kasvainten kasvua, jotka ovat vastaanottavampia kemoterapeutti-25 selle hoidolle (kuten keuhko-, rinta- ja paksunsuolenkas- • vaimet) , ja jotka vastustavat kasvainsolutyyppejä, jotka • · kehittävät monilääkeresistenssiä.

» · • · • · ·

Etsittäessä antraseenidionien turvallisempia, aktiivisia ... 3 0 analogeja, on tutkittu ilman huomattavaa parannusta yh- • · · ’;*/ disteitä, joissa on hydroksisubstituentteja ja/tai (ami- « · · ’·* noalkyyli) aminosivuket juja vaihtelevissa asemissa ant- raseeni-9,10-dioni-rungossa (Cheng et ai., Drugs of the Future, (1983), 8, 229).

Potts et ai. esittivät atsa- ja diatsa-antraseeni-9,10-dioneja, kuten 6,9-bis(etoksikarbonyyliamino)bentso[g]- 35 3 103575 kinoliini-5,10-dionin (1), 6,9-bis(etoksikarbonyyliami-no) bentso[g] isokinoliini-5,10-dionin (2.), 6,9-bis(etoksi-karbonyyliamino)bentso(g]kinatsoliini-5,10-dionin (3.) , (Synthesis, 1983, 31). Näiden yhdisteiden esitettiin 5 olevan verrattavissa kasvaimia estäviin l,4-bis[(aminoal-kyyli)amino]antraseeni-9,10-dioneihin, kuitenkaan yhtään tulosta kasvaimia estävästä aktiivisuudesta ei esitetty yhdellekään edellä mainituista yhdisteistä. 6,9-dihydrok-sibentso[g]isokinoliini-5,10-dionin l-[(aminoalkyyli)ami-10 no] johdannaiset (4.), jotka ovat sukua mitoksantronille, on esitetty DNA-välittäjinä, mutta ne olivat täysin vailla minkäänlaista kasvaimia estävää in vitro- tai in vivo-aktiivisuutta (Croisy-Delcey et ai., Eur.J.Med. Chem., (1988), 23, 101-106).

15 6,9-bis[(aminoalkyyli)amino]bentso[g]kinoliini-5,10-dio-nit, joilla on kaavat 5a-d (katso taulukko I), on esitetty julkaisussa J.Med.Chem. (1985), 28., 1124-1126, jossa niitä verrattiin 5,8-bis[(aminoalkyyli)amino]-1-atsa-20 antraseenidioneihin.

Samalla tavalla kuin tässä jäljempänä taulukossa II esitetään, on tunnetussa tekniikassa esitetty, että yhdisteet 5 ovat selvästi vähemmän aktiivisia kuin vastaavat 25 karbosykliset analogit (6).

• * · • · • ·

Itse asiassa, kuten taulukossa II esitetään, yhdisteet 5a ja 5b ovat vähemmän sytotoksisia kuin analogit 6a ja 6b. Lisäksi yhdiste 5a, joka on heikosti sytotoksinen in vit-... 30 ro, on inaktiivinen in vivo ja se on sekä vähemmän aktii- vinen että vähemmän tehokas kuin karbosyklinen analogi • · · ♦ ♦ · - *. 6a.

Vaikka heteroatomin liittäminen on yleinen menetelmä lää-35 kekemiassa, sen vaikutus täytyy arvioida tapaus tapaukselta .

4 103575 Tässä antraseenidionien atsa-analogien tietyssä tapauksessa tunnettu tekniikka selvästi osoittaa, että typpi-atomin liittäminen antraseenidionirunkoon on haitallista kasvaimia estävän aktiivisuuden kannalta; itse asiassa 5 atsa-substituoidut antraseenidionit ovat vähemmän syto-toksisia kuin vastaavat antraseenidionit ja inaktiivisia in vivo.

Näin ollen alan ammattimies ei olisi harkinnut heteroato-10 mien liittämistä antraseenidionirunkoon mahdollisena keinona saada tehokkaampia kasvaimia estäviä aineita.

On hyvin tunnettua, että kasvaimia estävän mitoksantronin (J.Med.Chem., (1978), 21, 291-294), löytämiseksi suori- 15 tettiin seulonta useiden analogien joukosta käyttäen hiiren leukemian P388 kokeellista mallia, sen jälkeen tätä mallia on pidetty kasvaimia estävän aktiivisuuden ennusteena ihmisillä ainakin tähän luokkaan kuuluvilla kasvaimia estävillä antibiooteilla. Monet muut kliinisesti ak-20 tiiviset, kasvaimia estävät antibiootit ovat aktiivisia hiiren leukemioilla P388 ja L1210, kuten m-amsakriini ja doksorubisiini.

Lisäksi mitoksantronilla on havaittu hyvä aktiivisuus 25 muilla merkittävillä kokeellisilla kasvaimilla, kuten ·*·*; hiiren Lewis-keuhkosyövässä ja ihmisen nisäsyövässä MX1.

• ·

Il » • ·

Olemme nyt havainneet, että keksinnön mukaisesti valmis- » I « tetut yhdisteet 6,9-bis[(aminoalkyyli)amino]bentso[g]- ... 30 isokinoliini-5,10-dionit ovat aktiivisia kasvaimia estä- • · · *·’ ’ vinä aineina, ne ovat erittäin tehokkaita hiiren leukemi- • · · 1 • · · oita L1210 ja P388 vastaan ja Lewis-keuhkosyöpää ja ihmi-:*· · sen nisäsyöpää MX1 vastaan.

5 103575

Taulukko I

Tunnetut yhdisteet O NHC02Et O NHC02Et 10 O NHC02Et ” NHCOjEt 1 2

O NHC02Et OH O

q NHCOjEt OH o £« cm2ch2N(ch3>2 3

4b R- CM2CH2CH2N(Et>2 4c R= CH2CH2NHCH2CM2OH

O HHR O NHR

5i R= CH2CM2N(C1I3V2 6i R= CH2C1I2N(CH3)2 ... 2 5 5b R= CH2CH2N(Ei>2 6b R-CH2CH2N(Ei)2 • · ^ 5c R-CM2CM2CH2N(CH3)2 • · • · 5d R= cm2ch2nhcocm3 • · « • « · I I * 30 • · · • · · 103575 6

Taulukko II

Tunnettujen yhdisteiden 5 ja 6 kasvaimia estävä aktiivisuus hiiren leukemiaa L1210 vastaan (julkaisusta J.Med.

5 Chem. (1985), 28, 1124-1126) in vitro in vivo

ID50(Mg/ml) Annos (mg/kg) T/C

10 5a 0,16 50 130 5b 2,4 100 myrkyllinen 5c 1,7 6a 0,08 30 150 6b 0,30 15

Keksinnön mukaisilla yhdisteillä on kaava I

O MH-R

20 Ι^^ΙΤ^Ί *11 m

O NH-R

25 jossa R on C2-C4-alkyyli-OR] tai C2-C4-alkyyli-NR2R3, joissa :*·*: R, on vety, -S(02)CH3 tai -CH2CH2OR4, R2 on H, Q-Cj-alkyyli, ·*·*: -COOC(CH3)3, -CH2CH20R4 tai -COCH3, R3 on H tai C,-C6-alkyyli • « tai R2 ja R3 yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat « sitoutuneet, muodostavat pyrrolidino-, morfolino- tai ... 30 atsiridinorenkaan ja R„ on H tai -CH,. Yhdisteet esiin- • · · I I · ·., tyvät vapaina emäksinä ja niiden farmaseuttisesti hy- • · · väksyttävien happojen kanssa muodostettuina suoloina.

» ·

Keksintö koskee myös kaavan I mukaisten yhdisteiden tau-35 tomeerisia muotoja, yksittäisä enantiomeereja ja diaste-reoisomeereja sekä näiden seoksia.

7 103575

Keksintö koskee myös kaavan I mukaisten yhdisteiden myrkyttömiä suoloja, jotka saadaan farmaseuttiseen ja vete-rinaariseen käyttöön hyväksyttävien happojen kanssa, kuten sellaisia, jotka saadaan lisäämällä epäorgaanisia 5 happoja, kuten kloorivety-, bromivety-, rikki-, fosfori-, pyrofosforihappoa, ja/tai orgaanisia happoja, kuten etikka-, propioni-, sitruuna-, bentsoe-, maito-, maleiini-, fumaari-, meripihka-, viini-, glutamiini-, asparagiini-, glukoni-, askorbiinihappoja, ja vastaavia.

10

Edullisia esimerkkejä C^Cj-alkyyliryhmistä ovat metyyli, etyyli, n-propyyli, sek.-propyyli, n-butyyli, sek.-butyy-li, tert.-butyyli, n-pentyyli, n-heksyyli.

15 Erityisiä esimerkkejä keksinnön mukaisista edullisista yhdisteistä ovat seuraavat: 6.9- bis{[2-(amino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5.10- dioni, 6.9- bis{(2-(4'-morfolino)etyyli]amino}bentso[g]isokino-20 liini-5,10-dioni, 6.9- bis{[2-(dimetyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]isokino-liini-5,10-dioni, 6.9- bis{[2-(dietyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]isokino-liini-5,10-dioni, 25 6,9-bis{[2-[di(sek.-propyyli)amino]etyyli]amino}bentso- ·' [g] isokinoliini-5,10-dioni, • · · ’· ·* 6,9-bis{ [2-(1' -pyrrol id ino) etyyli ] amino} bent so [g] isokino- • · · ·.* * liini-5,10-dioni, 6.9- bis{[2-(1'-atsiridino)etyyli]amino}bentso[g]isokino- ::: 30 liini-5,10-dioni, 6.9- bis{[2 - (metaanisulf onyylioksi) etyyli ] amino}bentso [g] - .* . isokinoliini-5,10-dioni, * 6,9-bis{[4-(amino)butyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5, 10-dioni, 35 6,9-bis{[3-(amino)propyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5.10- dioni, 6,9-bis{[2-[(2-hydroksietyyli)amino]etyyli]amino}bentso- 103575 8 [g]isokinoliini-5,10-dioni, 6.9- bis{[3-(dimetyyliamino)propyyli]amino}bentso[g]isoki-noliini-5,10-dioni, 6.9- bis{[2-hydroksi)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5 5,10-dioni, 6.9- bis{[2-(2-hydroksietoksi)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5, 10-dioni, 6.9- bis{[2-(metyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5 ,10-dioni, 10 6,9-bis{[2-(etyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]isokinolii ni-5 ,10-dioni, 6.9- bis{[2-(n-propyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5, 10-dioni, 6.9- bis{[2-(sek.-propyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]iso-15 kinoliini-5,10-dioni, 6.9- bis{[2-(guanidino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5.10- dioni, 6,9-bis{[(2-amino-2,2-dimetyyli)etyyli]amino}bentso[g]-isokinoliini-5,10-dioni.

20

Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa siten, että a) (i) pyridiini-3,4-dikarboksyylihappoanhydridi, jonka 25 kaava on

S fA

30

O

7 • « t · · '· **· saatetaan reagoimaan 1,4-dif luoribentseenin kanssa, jolloin saadaan kaavan 8a tai 8b mukainen yhdiste 35 9 103575

OF F

Il coon JL

ΊΓι tai 'Ύ ili

F OF

8a 8b ii) vaiheen i) tuote syklisoidaan savuavassa rikkiha-10 possa korotetussa lämpötilassa, jolloin saadaan kaavan 9 mukainen yhdiste

O F

15

O F

9 ja 20 iii) fluori korvataan lisäämällä kaavan R'-NH2 mukaista amiinia, jossa kaavassa R1 tarkoittaa samaa kuin R, tai b) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, jossa kaavassa R on C2-C4-alkyyli-NR2R3/ R2 on -CH2CH2R,, jossa R, 25 tarkoittaa samaa kuin edellä, ja R3 on H, · (i) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on — (CH2) p— ·' ·' 0S(02)CH3, jossa p on 2, 3 tai 4, saatetaan reagoimaan • 11 * kaavan H2N-(CH2) q-0-E mukaisen yhdisteen kanssa, jossa E on trialkyylisilaani-, (dialkyyli)aryylisilaani-, formyyli-: 30 tai asetyylisuojaryhmä ja q on 2, 3 tai 4, ja (ii) poistetaan suojaryhmä E, tai • · • · · « · · c) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, jossa kaavassa R2 on H, 35 (i) kaavan II mukainen 6,9-difluoribentso[g]isokino- liini-5,10-dioni 103575 10 O f

5 OF

saatetaan reagoimaan kaavan H2N-(CH2) P-N (COOR·,) R3 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa R3 on vety tai Cj-Ce-alkyyli, R5 on -C(CH3)3 ja p on 2, 3 tai 4, kaavan la mukaisen yhdisteen 10 valmistamiseksi O NH-R* N v IL ^-1 (Ib) 15 li O NH-R* jossa R' on - (CH2) p-N(COOR5) R3, ja ii) poistetaan ryhmä COOR.,, ja haluttaessa 20 d) poistetaan kohtien a) - c) mukaisesti saaduissa yhdisteissä mahdollisesti oleva suojaryhmä, ja e) muodostetaan kohtien a) - d) mukaisesti saatujen yh- 25 disteiden suola ja/tai solvatoidaan saatu yhdiste tai 1. erotetaan sen isomeerit.

* · · * · *·’ ’ Kaavan II mukaisen yhdisteen reaktio kaavan H2N-(CH2)P- N(COORb) R3 (V) mukaisen yhdisteen kanssa suoritetaan • · · ·.· * 3 0 yleensä käyttäen stökiometristä määrää tai pientä molaa- *·#: : rista ylimäärää kaavan V mukaista yhdistettä liuotti- ; messa, kuten metyleenikloridissa, kloroformissa, 1,1,1- • ♦ « • ·’ trikloorietaanissa, dimetoksietaanissa, tetrahydrofu- raanissa, dimetyylisulfoksidissa, dimetyyliformamidissa, 35 pyridiinissä, pikoliinissa ja näiden seoksissa tai halut taessa käytetään itse kaavan V mukaista yhdistettä liuottimena, mahdollisesti mukana käytetään epäorgaanista 11 103575 emästä, kuten alkali- tai maa-alkalikarbonaattia tai -vetykarbonaattia, tai orgaanista emästä, kuten trialkyy-liamiinia, lämpötilassa, joka on 0 °C:sta liuottimen palautuslämpötilaan.

5

Mieluimmin reaktio suoritetaan liuottimessa, kuten pyri-diinissä, kloroformissa tai dimetyylisulfoksidissa, käyttäen kaavan V mukaista yhdistettä kahdesta kymmeneen ekvivalenttia kaavan II mukaisen yhdisteen yhtä ekviva-10 lenttia kohti ja työskentely suoritetaan lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilasta 50 °C:seen.

Käyttökelpoista tietoa edellä mainittujen suojaryhmien poistamiseksi voi löytää julkaisusta Green, T.W., Wuts, 15 P.G.M, "Protective Groups in Organic Syntesis", 2.painos, John Wiley and sons, (1991).

Kaavan II mukainen 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini- 5,10-dioni voidaan valmistaa monivaiheisella menetelmäl-20 lä, johon sisältyy 1,4-difluoribentseenin Friedel-Crafts-asyloiminen pyridiini-3,4-dikarboksyylihappoanhydridillä, jolloin saadaan yhdisteet, joilla on kaavojen Vila ja Vllb mukaiset rakenteet:

F o F

2 5 oooh JL Il JL

i|f f\ Π Π

: OF F

(Vila) (Vllb) :T: 30 ./·*: Sen jälkeen kaavojen Vila ja Vllb mukaisille yhdisteille . voidaan suorittaa syklisointireaktio 30%:isessa savuavas- • · ♦ *; / sa rikkihapossa noin 140 °C:ssa, kaavan II mukaisen yh disteen saamiseksi.

35

Kaavan V mukaiset yhdisteet ovat tunnettuja, kaupallisesti saatavissa olevia tai ne voidaan valmistaa tunne- 103575 12 tuilla menetelmillä.

Kaavan V mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa esimerkiksi menetelmillä, jotka kuvataan julkaisuissa Synth.Comm., 5 (1990), 20, 2559 ja J.Med.Chem., (1990), 32, 97.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden biologisen aktiivisuuden arvioiminen suoritettiin in vitro ja in vivo, noudattaen USA:n kansallisen syöpäinstituutin (U.S. National Cancer 10 Institute) kehittämiä menetelmiä.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden sytotoksisen in vitro-aktiivisuuden arvioiminen suoritettiin käyttäen ihmisen paksunsuolen adenokarsinoomasolulinjaa (Lovo), joka eris-15 tettiin metastaasisesta kyhmystä, ja alalinjaa, jolla oli vaadittu resistenssi lukuisia kasvaimia estäviä aineita vastaan, joihin kuuluivat muun muassa doksorubisiini, VP-16 ja vinkristiini. Tällä alalinjalla (nimeltään Lovo/DX) havaitaan doksorubisiinin alentunut kerääntyminen ja pro-20 teiinin yli-ilmentyminen (Grandi, M., Geroni, C., Giuliani, F.C., British J.Cancer, (1986), 54. 515). Yhdisteet testattiin MTT-kokeen mukaisesti (Mosman, T., "Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay", J.Im-25 munol.Methods, (1983), 65, 55-63; Green, L.M. , "Rapid co- : lorimetric assay for cell viability; application to the • * · • V quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lympho- : kines", J. Immunol. Methods, (1984), 20/ 257-268) ja niitä verrattiin mitoksantroniin, ametantroniin ja doksorubi-30 siiniin. Tulokset on esitetty taulukossa III.

"· ^ Yleensä keksinnön mukaiset, tyypilliset yhdisteet olivat yhtä sytotoksisia kuin ametantroni ja mitoksantroni Lovo-solulinjassa, korkein sytotoksisuus (ylivoimainen mitoks-35 antroniin verrattuna) havaitaan yhdisteellä 6,9-bis{[2-(dimetyyliamino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dionilla (10a), joka on kuvattu kokeellisen osan esimer- 13 103575 kissa 4. Kun ametantronia tai mitoksantronia testattiin Lovo/DX-solulinjassa, resistenssi-indeksi R.I. (joka määritettiin resistentin solulinjan IC50-arvon suhteena sensitiivisen solulinjan IC50-arvoon) oli niinkin korkea 5 kuin 101,2 ja vastaavasti 29,0, mikä osoittaa, että tällä alalinjalla tosiaan oli vaadittu resistenssi mitoksantronia ja ametantronia vastaan. Toisaalta, kun keksinnön mukaiset tyypilliset yhdisteet testattiin samalla resistentillä alalinjalla, minkäänlaista ristikkäistä resistens-10 siä mitoksantronin ja ametantronin kanssa ei tapahtunut, kuten voidaan todeta yhdisteiden 10a. 12c. 10b. lOe ja lOd ollessa kyseessä, jotka yhdisteet on kuvattu kokeellisen osan esimerkeissä 4, 22, 5, 8 ja vastaavasti 7. Näillä yhdisteillä havaittiin yleensä tällä resistentillä 15 alalinjalla sama IC50-arvo kuin mikä saatiin ametantronil-le sensitiivisellä Lovo-solulinjalla. Erityisesti yhdiste 10a oli aktiivisempi kuin mitoksantroni Lovo/DX-solulin-jalla.

20 Nämä in vitro-tulokset antavat aihetta uskoa, että keksinnön mukaiset, tyypilliset yhdisteet voivat olla käyttökelpoisia monilääkeresistenssin välittämän kasvain-resistenssimekanismin voittamiseksi. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Sytotoksisuuden arvioiminen in vitro suoritettiin myös : hiiren L1210-leukemiasoluilla, käyttäen edellä mainittuja 2 • · · 3 : V soluja, joita säilytettiin suspensioviljelmissä (McCoy'n 4 : 5A kasvualusta, jota täydennettiin 10 %:lla hevosseeru- 5 mia, glutamiinilla, penisilliinillä ja streptomysiinil- 6 lä) , kasvatus tapahtui kosteutetussa ympäristössä, jossa oli 10 % hiilidioksidia ja 90 % ilmaa, lämpötila oli 37 7 .· . °c. Yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja 8 • · · 9 '· ’· lisättiin suspendoituihin soluihin sopivissa konsentraa- 10 tioissa. 72 tunnin jatkuvan altistuksen jälkeen, solukon- 11 sentraatio laskettiin käyttäen Coulter-laskijaa ja kasvun inhibitio laskettiin kaavalla: 103575 14 kasvun inhibitio-% = 1 -[käsiteltyjen solujen lkm/solujen lkm pelkässä DMSO:ssa] x 100.

IC50-arvo laskettiin kasvun inhibitioarvoista ja ne on 5 esitetty taulukossa IV, jossa niitä on verrattu tunnettuun yhdisteeseen i5a (taulukossa I on esitetty yhdisteen 5a rakenne).

Keksinnön mukaisten, tyypillisten yhdisteiden biologisen 10 in vivo-aktiivisuuden tutkimukset tehtiin käyttäen hiiren leukemioiden P388 ja L1210-malleja.

Hiiren P388-leukemiasolut injektoitiin intraperitoneaali-sesti (ip) tai intravenoosisti (iv) CD2Fl-hiiriin. Käsit-15 telyt aloitettiin noin 24 tuntia kasvaintransplantaation jälkeen ja lääkeannokset annettiin iprsti (P388 ip/ip) tai iv:sti (P388 iv/iv) etukäteen laadittujen ohjelmien mukaisesti, tavallisesti kolmen päivän (P388 iv/iv) tai neljän päivän (P388 ip/ip) jaksoissa. Tutkimuksia suori-20 tettiin 60 päivän ajan ja jokaisen eläimen kuolinpäivä rekisteröitiin. T/C-% määritettiin käyttäen jokaisen ryhmän keskimääräistä elinaikaa (mean survival time =MST) seuraavan kaavan mukaisesti: 25 T/C-% = [(MST käsitellyt)/(MST kontrolli)] x 100.

• * · \· Esimerkiksi keksinnön kahdella tyypillisellä yhdisteellä, nimittäin 6,9-bis{[2-(amino)etyyli]aminojbentso[g]isoki-noliini-5,10-dionilla lOi dimaleaattisuolana (lOi male-30 aatti), joka on kuvattu esimerkissä 12, ja 6,9-bis{[(2- i t · dimetyyliamino )etyyli] amino}bentso[g] isokinoliini-5,10- • · · dionilla 10a. joka on kuvattu esimerkissä 4, havaittiin m · aktiivisuus, joka oli ylivoimainen verrattuna mitoksant-roniin P388 iv/iv-mallissa. Keksinnön mukainen yhdiste 35 lOi sekä hydrokloridina (lOi»HC1) että dimaleaattisuolana (lOi«maleaatti), joka on kuvattu esimerkissä 12, oli ylivoimainen verrattuna mitoksantroniin myös P388 ip/ip-mal- 15 103575 lissa. Lisäksi edellä esitetyillä, keksinnön mukaisilla yhdisteillä havaittiin antileukeeminen aktiivisuus hyvin siedettyjen annosten laajalla alueella ja erityisesti ne olivat aktiivisia annoksilla, jotka olivat alle siedetyn 5 maksimiannoksen, antaen indikaation edullisemmalla terapeuttisella indeksillä verrattuna mitoksantroniin. Tulokset on esitetty taulukossa V ja taulukossa VI.

Keksinnön mukaisten, tyypillisten yhdisteiden kasvaimia 10 estävä aktiivisuus arvioitiin myös hiiren L1210-leukemia-mallilla.

L1210 leukemiasolut injektoitiin intraperitoneaalisesti (ip) CDFl-hiiriin ja käsittely aloitettiin noin 24 tuntia 15 kasvaintransplantaation jälkeen. Lääkeannokset annostettiin ip:sti etukäteen laadittujen ohjelmien mukaisesti neljän päivän jaksoissa. Tutkimuksia suoritettiin 60 päivän ajan ja jokaisen eläimen kuolinpäivä rekisteröitiin. T/C-% määritettiin käyttäen jokaisen ryhmän keskimääräis-20 tä elinaikaa (mean survival time =MST) seuraavan kaavan mukaisesti: T/C-% = [(MST käsitellyt)/(MST kontrolli)] x 100.

25 Tulokset on esitetty taulukoissa VII ja VIII.

• » • · · 1 Taulukosta VII ilmenee keksinnön mukaisten tyypillisten yh- :T: disteiden (nimittäin esimerkin 4 yhdisteen 10a. esimerkin 12 yhdisteen 10i»HCl ja 6,9-bis{[2-(2-hydroksietyyliami-30 no)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin 101.

joka valmistetaan esimerkissä 17 (dimaleaattisuola) ) yl- • · · lättävän ylivoimainen antileukeeminen aktiivisuus verrat- • · *. ·: tuna tunnettuun yhdisteeseen 5a.

35 Taulukosta VIII ilmenee taas selvästi suotuisa vertailu keksinnön mukaisen yhdisteen 10i«HCl erinomaisen anti-leukeemisen aktiivisuuden ja mitoksantronin välillä.

16 103575

Keksinnön mukaisten yhdisteiden aktiivisuus kiinteitä kasvaimia vastaan todettiin käyttäen hiiren Lewis-keuh-kosyöpä- ja ihmisen nisäsyöpä MX-l-malleja. Nämä kasvain-mallit sisältyvät kahdeksan transplantoidun kasvaimen ryh-5 mään, jota USA:n kansallinen syöpäinstituutti (U.S.-NC1) käyttää testausryhmänä valittaessa kliinisesti käyttökelpoisia kasvaimia estäviä aineita (R.K.Y. Zee Cheng ja C.C. Cheng, "Screening and evaluation of anticancer agents", Meth.and Find.Expl.Clin.Pharmacol., (1988) 10 10(2), 67-101). Esimerkiksi taulukossa IX esitetään yh den, keksinnön mukaisen tyypillisen yhdisteen, joka on 6.9- bis{[(2-amino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5.10- dionin dimaleaatti (lOi«maleaatti. esimerkki 12), aktiivisuusarvot näitä kahta kiinteää kasvainta vastaan.

15

Koska keksinnön mukaisilla tyypillisillä yhdisteillä saadaan hyvät tulokset hiiren leukemioiden P388 ja L1210, hiiren Lewis keuhkosyövän ja ihmisen nisäsyövän MX-1 in vivo-malleja vastaan, jotka kuten edellä osoitettiin en-20 nustavat hyviä tuloksia ihmisillä, tässä esitettyjen yhdisteiden odotetaan olevan toimivia ihmisen leukemioita ja kiinteitä kasvaimia vastaan.

Tästä syystä keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyt- 25 tää aktiivisina aineosina terapeuttisiin koostumuksiin, : .· syöpäkasvainten regression ja/tai lievityksen indusoimi- • seksi imettäväisillä, kun annostetaan määriä, jotka vaih- : televat noin 1 mg:sta noin 0,4 g:aan kehon painokiloa kohti. Edullinen annostusalue olisi noin 1 mg:sta noin 50 30 mg: aan kehon painokiloa kohti päivässä. Yksikköannoksia voitaisiin käyttää niin, että noin 70 kg painavalle poti- • laalle annostetaan noin 70 mg:sta noin 3,5 g:aan aktii- • · · "· '· viyhdistettä 24 tunnin aikana. Annos voidaan sovittaa täydentämään muita hoitoalueita, kuten säteilyhoitoa.

35

Farmaseuttinen koostumus voi olla tabletteina, kapseleina, liivatekapseleina, suppositorioina, lyofilisoituina 17 103575 jauheina ja liuoksina intravenoosia annostusta varten.

Biologinen arviointi in vitro: MTT-testi ihmisen paksunsuolen adenokarsinooman Lovo-soluilla.

5 MTT-testi suoritettiin sen mukaan, mitä Mosmann, T., julkaisussa J.Immunol.Methods, (1983), 65, 55-63 ja Green, L.M., julkaisussa J.Immunol.Methods, (1984), 70. 257-268 ovat esittäneet.

10 Välittömästi ennen käyttöä yhdisteet ja vertailustandar-dit liuotetaan sopivaan liuottimeen ja sen jälkeen laimennetaan edelleen täydelliseen kasvatusalustaan. Ihmisen paksunsuolen adenokarsinooman Lovo-solut ja alalinjan 15 doksorubisiinille resistentit solut (Lovo/DX) (2,5x101 so-lua/ml) maljataan 96-koloisille levyille ja esi-inkuboi-daan 24 tuntia kasvatusalustassa. Tämän ajanjakson jälkeen solut altistetaan lääkkeille 144 tunnin ajaksi, sen jälkeen lisätään tiatsolyyli-sini-tetratsoliumliuos (MTT 20 liuos) ja soluja inkuboidaan uudestaan 4 tuntia. Superna-tantti poistetaan ja 150 μΐ dimetyylisulfoksidia lisätään formatsaanikiteiden liuottamiseksi. Levy luetaan aallonpituudella 570 nm käyttäen mikrolevylukijaa ja inhibi-tiokonsentraatio, joka estää 50%:isesti solukasvun, (IC5c 25 jug/ml) lasketaan.

• · • · · • ’/ Tulokset on esitetty taulukossa III.

• · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · · » i · • · · 1 8 103575

Taulukko III

Keksinnön mukaisten tyypillisten yhdisteiden sytotoksinen aktiivisuus in vitro Lovo- ja Lovo/DX-soluilla MTT-testin mukaan.

O NH-* o%) O MH*

Yhdiste Esim. R = IC50 pg/ml±S.D. a)

LoVo LoVo/Dx R.I.b) 10a 4 0,045 0,085 1,9 - 12c 22 ^^n^ch3 0, 15±0,07 0,36±0,04 2,4 10b 5 0,29±0,05 0,69±0,1 2,4 10c 8 5,32±1,55 2,29±0,67 0,4 lOd 7 0,20±0,03 0,52±0,15 2,6 lOi 12 0,21±0,08 6,70+1,8 31,8 ( maleaat- · 2(Γ N: ooh ti ) . 12a 20 1,64±0,02 20,9±0,72 12,7 • · ______ ·· · *-- — • · · « · * * ^_____^ • ·♦ Il ~ 1 1 ~ - .

V * Mitoksantroni 0,01±0,009 0,29±0,1 29,0

Ametantroni 0,33±0,1 33,4±13,9 101,2 • · · ^^ m

Doksorubisiini 0,03±0,009 4,28±1,8 142,7 • · ♦ · * • · · ··. a) MTT-koe: lääkeainealtistus 144 tuntia b) R. I . = (IC50 LoVo/Dx)/(IC50 L0V0).

19 103575

Biologinen arviointi in vitro: Hiiren L1210-leukemia.

Hiiren L1210 leukemiasoluja pidettiin rutiininomaisesti 5 suspensioviljelmissä McCoy'n 5A kasvatusalustassa, jota oli täydennetty 10 %:lla hevosen seerumiglutamiinia, penisilliinillä ja streptomysiinillä, ja kasvatettiin kosteutetussa ympäristössä, jossa oli 10 % hiilidioksidia ja 90 % ilmaa, 37 °C:ssa.

10

Toksisuuden testaamiseksi in vitro jokainen yhdiste liuotettiin dimetyylisulfoksidiin ja lisättiin 1 ml:aan L1210-soluja (105 solua/putki), jolloin viljelmän lopullisiksi konsentraatioksi saatiin 0,01, 0,1 ja 1 μ<ζ lääket-15 tä/ml. 72 tunnin jatkuvan lääkeainealtistuksen jälkeen solukonsentraatio määritettiin Coulter-laskijalla. Kasvun inhibitio laskettiin jokaiselle lääkeaineelle käyttäen seuraavaa kaavaa.

20 Kasvun inhibitio-% = 1-[solujen lkm käsitellyillä/ solujen lkm pelkällä DMSO:lla] x 100.

Sen jälkeen kasvun inhibitiotietoja käytettiin laskettaessa IC50-arvoa (laskettu lääkeainekonsentraatio, joka 25 tarvitaan, solukasvun estymiseksi 50 %:lla kontrollista).

*· ·“ Tulokset on esitetty taulukossa IV.

• « · • · « • · • · »M • · · • · · • · · • · · « 1 · » · · • · · • I · 9 · • · · • 1 · 103575 20

Taulukko IV

Keksinnön raukaisten tyypillisten yhdisteiden sytotoksinen aktiivisuus in vitro L1210 leukemiaa vastaan verrattuna tunnettuun yhdisteeseen 5a.

5

Yhdiste Esim. IC^ (uq/ml) 10a 4 0,006 lOf 9 0,002 10i(a) 12 0,05 10 101(b) 17 0,06 5a(c) - 0,155 (a) Hydrokloridisuola: 10i«HCl (b) Dimaleaattisuola: 101»maleaatti 15 (c) Tunnettu yhdiste, joka on 6,9-bis{[2-(dimetyyliami- no)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni: A.P. Krapcho et ai., J.Med.Chem. (1985), 28, 1124-1126.

Biologiset tutkimukset in vivo: Hiiren P388 leukemia 20 (iv/iv, laak. 1.· 4.. 7.)

Hiiren P388 leukemiasoluja säilytettiin in vivo intrape-ritoneaalisilla (i.p.) sarjainjektioilla, joissa injektoitiin 106 solua DBA2-hiiriin. Testaustarkoituksiin CDF1-25 hiiret rokotettiin intravenoosisti (i.v.) ΙΟ6 P388 solulla ; .· ja käsittely aloitettiin 24 tuntia myöhemmin. Lääkeaineen ·· · : *ti i.v.-annos annettiin 1., 4. ja 7. päivänä. Hiiriä tark- ;*·*: kailtiin päivittäin myrkytysmerkkien ja eloonjäämisen ha- vaitsemiseksi. Jokaisen eläimen, joka kuoli tai tapettiin .···, 30 60 päivän aikana, kuolinpäivä merkittiin muistiin. Jokai- • » · selle käsittelyryhmälle laskettiin keskimääräinen elossa- • · · oloaika (median survival time = MST) ja T/C-% määritet- • · ·. tiin käyttäen seuraavaa kaavaa: 35 T/C-% = [(MST käsitellyt)/(MST kontrolli)] x 100.

Esimerkin 4 yhdisteen 6,9-bis{[2-(dimetyyliamino)etyyli]- 21 103575 amino}bervtso[g]isokinoliini-5,10-dionin (10a) ja esimerkin 12 yhdisteen 6,9-bis{[2-( amino)etyyli]amino)bentso- [g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaattisuolan (lOi»male-aatti) antileukeemisen aktiivisuuden tulokset verrattuna 5 mitoksantroniin on esitetty taulukossa V.

Taulukko V

Yhdisteiden 10a, lOi«maleaatti ja mitoksantronin (MITOX) kasvaimia estävä aktiivisuus hiiren P338 leukemiaa vas-10 taan (iv/iv lääk. 1., 4., 7.) 11.

Yhdiste21 Annos T/C-% 31 TOX4) LTS51 (mg/kg/päivä) (alue) 15 Kontrollit - 100 0/73 0/73 lOi «maleaatti 18 200,188 0/16 0/16 27 203(181-227) 2/32 0/32 20 10a 18 172,156 0/14 0/14 27 188,167 3/17 0/17 40 183,156 1/16 0/16 MITOX 2 162(154-167) 0/42 0/42 25 3 185(167-217) 4/78 0/78 • V 4 118 (89-133) 20/24 0/24 • # · • · • · — 1 1) CDFl uroshiiret transplantoitiin iv:sti 106 solua/hii-ri. Käsittely annettiin iv:sti 1., 4., 7. päivänä kas-30 vaimen transplantaation jälkeen (0. päivä).

• · · '-I1' 2) 10i«maleaatti ja MITOX liuotettiin steriiliin ve- • · · teen, 10a l%:iseen sitruunahappoon.

• · ’·.1·: 3) Käsiteltyjen hiirien keskimääräinen elinaika/ kontrollien keskimääräinen elinaika x 100.

35 4) Myrkytyskuolemien lukumäärä/hiirien kokonais lukumäärä.

103575 22 5) Pitkään elossa olevat: eläimillä ei kasvainta kokeen päättyessä (60 päivää).

Biologiset tutkimukset in vivo: Hiiren P388 leukemia 5 (ip/ip, lääk. 1., 5., 9.)

Hiiren P388 leukemiasoluja säilytettiin in vivo intrape-ritoneaalisilla (ip) sarjainjektioilla, joissa injektoitiin 106 solua DBA2-hiiriin. Testaustarkoituksiin CDF1-10 hiiret rokotettiin ip:sti ΙΟ6 P388 solulla ja käsittely aloitettiin 24 tuntia myöhemmin. Lääkeaineen i.p.-annos annettiin 1., 5. ja 9. päivänä. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin myrkytysmerkkien ja eloonjäämisen havaitsemiseksi. Jokaisen eläimen, joka kuoli tai tapettiin 60 päivän 15 aikana, kuolinpäivä merkittiin muistiin. Jokaiselle käsittelyryhmälle laskettiin keskimääräinen elossaoloaika (median survival time = MST) ja T/C-% määritettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: 20 T/C-% = [(MST käsitellyt)/(MST kontrolli)] x 100.

6.9- bis{[2-(amino)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini- 5.10- dionin (lOi ) dihydrokloridi- (lOi »HC1) ja dimaleaat-ti- (lOi»maleaatti) suolojen (esimerkki 12) antileukeemi- 25 sen aktiivisuuden tulokset verrattuna mitoksantroniin on : .· esitetty taulukossa VI.

• · · • · « • · · 1 · 23 103575

Taulukko VI

Yhdisteiden lOi»HC1. lOi»maleaatti ja mitoksantronin (MITOX) kasvaimia estävä aktiivisuus hiiren P338 leukemiaa vastaan (ip/ip, 1., 5., 9.) 11.

5 _

Yhdisteet21 Annos T/C-% 3) TOX4) LTS5) (mg/kg/päivä) (alue) (60 pv) 10i»HCl 3,1 144 0/8 0/8 10 6,25 196 1/8 0/8 12,5 239 0/8 0/8 25 367 0/8 2/8 lOi »maleaatti 25 185 0/8 0/8 15 37,5 260 1/8 1/8 MITOX 1,5 186(160-225) 6/26 1/26 3 173(142-205) 21/42 1/42 20 _ 1) CDF1 hiiret injektoitiin ip:sti 106 solua/hiiri. Käsittely annettiin i.p.rsti 1., 5., 9. päivänä kasvaimen transplantaation jälkeen (0. päivä).

2) lOi »HC1 ja lOi »maleaatti liuotettiin steriiliin ve- 25 teen ja MITOX suolaliuokseen.

. . 3) Käsiteltyjen hiirien keskimääräinen elinaika/ kontrollien keskimääräinen elinaika x 100.

• · 4) Myrkytyskuolemien lukumäärä/hiirien kokonaislukumäärä .

...^ 30 5) Pitkään elossa olevat eläimet kokeen päättyessä (60 • · · päivää).

• · · • · 1 · : Biologiset tutkimukset in vivo: Hiiren L1210 leukemia . : (ip/ip. lääk. 1., 5.. 9.) 35 a) Hiiren L1210 leukemiasoluja säilytettiin in vivo injektoimalla viikottain intraperitoneaalisesti (ip) 106 103575 24 solua BDFj-hiiriin. Testaustarkoituksiin hiiret rokotettiin i.p.:sti 106 L1210 solulla ja käsittely aloitettiin 24 tuntia myöhemmin. Haluttu lääkeaineannos annostettiin 1., 5. ja 9. päivänä. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin myr-5 kytysmerkkien ja eloonjäämisen havaitsemiseksi. Jokaisen eläimen, joka kuoli tai tapettiin 60 päivän aikana, kuolinpäivä merkittiin muistiin. Jokaiselle käsittelyryhmäl-le laskettiin keskimääräinen elossaoloaika (median survival time = MST) ja T/C-% määritettiin käyttäen seuraavaa 10 kaavaa: T/C-% = [(MST käsitellyt)/(MST kontrolli)] x 100.

Tulokset on esitetty taulukossa VII.

15 b) Hiiren L1210 leukemiasoluja säilytettiin in vivo injektoimalla viikottain intraperitoneaalisesti (ip) 105 solua DBA2-hiiriin. Testaustarkoituksiin CDFl-hiiret rokotettiin i.p.isti 105 L1210 solulla ja käsittely aloi-20 tettiin 24 tuntia myöhemmin. Haluttu lääkeaineannos annostettiin 1., 5. ja 9. päivänä. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin myrkytysmerkkien ja eloonjäämisen havaitsemiseksi. Jokaisen eläimen, joka kuoli tai tapettiin 60 päivän aikana, kuolinpäivä merkittiin muistiin. Jokaiselle 25 käsittelyryhmälle laskettiin keskimääräinen elossaoloaika : .· (median survival time = MST) ja T/C-% määritettiin käyt- • · · • täen seuraavaa kaavaa: T/C-% = [(MST käsitellyt)/(MST kontrolli)] x 100.

30 • 1 1

Tulokset on esitetty taulukossa VIII.

« · · · 25 103575

TAULUKKO VII

Yhdisteiden 10a. lOi«HC1 ja 101 kasvaimia estävä aktiivisuus in vivo L1210 leukemiaa vastaan (ip/ip, lääk. 1., 5., 9.) verrattuna tunnettuun yhdisteeseen 5a.

5

Yhdiste Esim. Annos3 T/C-% LTSf 10a(b) 4 50 151 10i.HCl(c) 12 25 265 5/6 12.5 265 4/6 10 101 •maleaatti<d) 17 25 415 1/6 12.5 313 2/6 5a(e) ·(b) - 50 129 (a) mg/kg, 1., 5. ja 9. päivä 15 (b) Yhdiste 10a ja 5a liuotettiin DMSOrhon (<35 %) ja veteen.

(c) Hydrokloridisuola liuotettiin veteen.

(d) Dimaleaattisuola liuotettiin veteen.

(e) Tunnettu yhdiste 6,9-bis{[2-(dimetyyliamino)etyy- 20 li]amino}bentso[g]kinoliini-5,10-dioni: A.P.Krapcho et ai., J.Med.Chem., (1985), 28, 1124-1126.

(f) Pitkään elossa olevat: eläimillä ei kasvainta kokeen päättyessä (60 päivää).

25 • 1 • · • · · • · • » · » · · • · « • · · • · · « · · « · • ♦ · 103575 26

Taulukko VIII

Yhdisteen lOi«HC1 ja mitoksantronin (MITOX) kasvaimia estävä aktiivisuus hiiren askiittista L1210 leukemiaa vastaan (ip/ip lääk. 1, 5, 9) 11.

5 _

Yhdiste21 Annos T/C-% 1 2 3 4 5 6 TOX4) LTS51 (mg/kg/päivä) lOi»HC1 6,25 156 0/8 0/8 10 12,5 175 0/8 1/8 25 250* 1/7 4/7 MITOX 1,5 188 0/8 1/8 3 194 1/8 1/8 15 1) CDF1 hiiret injektoitiin ip:sti 105 solua/hiiri. Käsittely annettiin ip:sti 1., 5., 9.päivänä kasvaimen transplantaation jälkeen (0. päivä).

20 2) lOi »HC1 liuotettiin steriiliin veteen ja MITOX

suolaliuokseen.

3) Käsiteltyjen hiirien keskimääräinen elinaika/ kontrollien keskimääräinen elinaika x 100.

4) Myrkytyskuolemien lukumäärä/hiirien kokonaisluku- 25 määrä.

. · 5) Pitkään elossa olevat eläimet: eläimillä ei ole kas- :***: vainta kokeen päättyessä (60 päivää).

* · ·*“· * Tämä arvo laskettiin kuolleilta hiiriltä.

• · ·

Biologiset tutkimukset in vivo: Kasvaimia estävä aktiivi- • * · 2 ’...^ suus hiiren Lewis-keuhkosvöpää ia ihmisen MX-1 nisäsvöpää • · · 3 *. vastaan.

4 • · • · · 5 a ) Hiiren Lewis-keuhkosyöpä 6 C57bl/6 naarashiiret transplantoitiin im (intralimbs, raajaan) 105 solulla. Hoito annettiin iv:sti (intravenoo-sisti) 1., 7. ja 15.päivänä kasvaimen transplantaatiosta 27 103575 (O.päivä). Jokaisen käsitellyn ryhmän keskimääräinen kas-vainpaino laskettiin, kuten Geran, R.I. et ai. ovat esittäneet julkaisussa Cancer Chemother.Rep., (1972), 3, 51-61 ja TWI-% laskettiin seitsemän päivää viimeisen lääke-5 ainekäsittelyn jälkeen, käyttäen kaavaa: TWI-% = 100 -[käsiteltyjen hiirien kasvaimen keskipaino/ ( kontrollien kasvaimen keskipaino)] x 100.

10 Taulukossa IX on esitetty keksinnön esimerkin 12 mukaisen yhdisteen 6,9-bis{[2-(amino)etyyli]amino}bentso[g]-isokinoliini-5,10-dionin (lOi) dimaleaattisuolan (lOi»ma-leaatti) tulokset.

15 b) Ihmisen MX-1 nisäsyöpä CD1 nu/nu naarashiiret transplantoitiin se (subkutaani-sesti) kasvainfragmenteilla (noin 1 mm x 1 mm x 1 mm). Käsittely annettiin iv:sti kerran viikossa kolmen viikon ajan, jolloin kasvaimen painoksi tuli keskimäärin 150 mg.

20 Kaikille yksittäisille kasvaimille painon, joka alussa oli (V0), muutos (kasvaimen suhteellinen paino) ilmoitettiin suhteena Vt/VQ kunakin mittauspäivänä (Vt). TWI-% laskettiin seitsemän päivää viimeisen lääkeainekäsittelyn jälkeen käyttäen kaavaa: 25 ; .1 TWI-% = 100-[(käsiteltyjen hiirien kasvaimen suh- • · · : · : teellinen keskipaino)/(kontrollien kasvaimien suh- teellinen keskipaino)] x 100.

30 Taulukossa IX on esitetty keksinnön mukaisen tyypillisen #·;·. yhdisteen 6,9-bis{ [ 2— (amino )etyyli] amino} bent so [g] isoki- • ♦ · noliini-5,10-dionin (lOi) diamaleaattisuolan (lOi »male-·.1·: aatti), joka on esimerkin 12 yhdiste, tulokset.

103575 28

Taulukko IX

Yhdisteen lOi «maleaatti aktiivisuus kiinteillä kasvaimilla 5 Kasvainmalli ja Yhdiste Optimiannos T/C-%a) TWI-%b TOXc) käsittelykaavio (mg/kg/pv)

Hiiren Lewis- lOi« 40 158 80 0/10 keuhkosyöpä maleaatti 60 182 95 1/10 10 im/iv 1., 8., 15.

MX-1 ihmisen lOi · 17 - 65 0/7 nisäsyöpä sc/iv maleaatti 26,6 - 58 0/7 15 q 7 pv.x3 40 - 64 1/5 a) Käsiteltyjen eläimien keskimääräinen elinaika/ kontrollien keskimääräinen elinaika x 100.

20 b) Kasvaimen painon inhibitio-%.

c) Toksisten kuolemien lukumäärä/hiirien kokonaislukumäärä .

Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit ja muunnokset, jotka 25 ovat aivan ilmeisiä alan ammattimiehille, kuvaavat kek-: .· sintöä. Asiaankuuluvat kaavat on kuvattu taulukoissa I

(edellä) ja X, XI ja XII.

• « « » i » » I « * · · • · · • · · » · · • · · 1 · • · ·

TAULUKKO X

29 103575 Ογ° o 7 O p

COOH N

8. ° F

8b O p

Γ\: 0 F

:':’· 9 • · · • · · • · · • · · 1 · • · · 30 103575

TAULUKKO XI

O NH-CH2CH2-NR,R2 O NH-CH2CH2-NR,R2 10a, R = R, = CH, b. R = R, = CH2CH3 c. R = R, = CH(CH3)2 d. R = R, = -CH2CH2CH2CH2-c. R - R, - -CH2CH2OCH2CH2-f, R = R, = -CH2CH2- p. R = H.R, = C02tBu h. R = CHj , R, = C02tBu

i. R = R, = H

j. R = H , R, = COCH3 k. R=H.R1 = CH3

l. R = H . R, = CH2CH2OH

m. r = h.r, = ch2ch2och3 n. R = H , R, = CH2CH3 : .1 o, R=H,R, = CH2CH2CH3 p, R = H ; R, = CH(CH3)2 ··· # · · • · « • · « • · · « · · 2 2 · ·

TAULUKKO XII

31 103575

O MH-CH2CH2-OR O NH-CH2CHrOR

11 a, R = H

b. R = S02CH3

c, R = CH2CH2OH

O NH- (CH2) n -NR]R2 -θψφ o NH-(CH2)n-NR,R2 • · • · · • · · • · !2a, n = 3, R = Ri = H • · » - 1

b. n = 4, R = R| = H

... c, n = 3, R = Rj = CHj • » i • · · • « · • « · 1 · • · · 103575 32

Esimerkki 1

Pvridiini-3.4-dikarboksvvlihapon anhvdridi (7)

Seosta, jossa oli pyridiini-3,4-dikarboksyylihappoa (15,0 5 g, 0,09 moolia) ja asetanhydridiä (30 ml), keitettiin palautus jäähdyttäen 2 tuntia. Ylimääräinen etikkahappo poistettiin tislaamalla ja anhydridi kerättiin ja puhdistettiin sublimoimalla (123 °C, 3 mmHg), saatiin yhdiste 7 valkoisena, kiinteänä aineena (10,1 g, 76 %), sul.p. 74-10 76 °C. ‘HNMR (CDCl,) 9,39 (S,1H), 9,24 (d,lH), 7,94 (d, 1H) .

Esimerkki 2 4-(21,51-difluoribentsovvlilnikotiinihappo (8a) ia 15 3-(21,51-difluoribentsovvli^ isonikotiinihappo f 8b)

Seosta, jossa oli yhdistettä 1_ (5,0 g, 0,033 moolia) ja aluminiumkloridia (17,5 g, 0,131 moolia) 1,4-difluori-bentseenissä, kuumennettiin öljyhauteessa 110 °C:ssa 22 20 tuntia. Ylimääräinen 1,4-difluoribentseeni otettiin talteen tislaamalla. Jäännös jäähdytettiin jäähauteessa ja reaktio sammutettiin jäävedellä (75 ml) ja kons.kloorive-tyhapolla (6,3 ml). Saostunut, kiinteä aine suodatettiin ja kuivattiin, saatiin valkoinen jauhe (7,7 g, 87 %). Tä-25 mä aine voidaan kiteyttää asetonitriilistä ja vedestä; . sul.p. 214-217 °C, 'HNMR (DMS0-d6) 9,15 (s) , 8,90 (d) , 8,80 (d) , 7,90 (d) , 7,5 (m), 7,4 (m).

• · ·***: Analyysi kaavalle C13H7F2N03 laskettu: C 59,32; H 2,69; N 5,32 30 saatu : C 59,03; H 2,55; N 5,18.

♦ · · • > · • · · • < « *. Esimerkki 3 * ♦ 6.9-dif luoribentsofal isokinoliini-5,10-dioni f9) 35 Ketohapon seosta, jossa oli yhdisteet 8a ja 8b (3,0 g, 0,011 moolia) savuavassa rikkihapossa (7,5 ml, 30%:inen S03), kuumennettiin öljyhauteessa 135-140 °C:ssa 3 tuntia.

33 103575 Jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, jonka jälkeen seos kaadettiin jäähän (200 ml) ja neutraloitiin natriumbikarbonaatilla. Uutettiin metyleenikloridilla, saatiin yhdiste 9 keltaisena, kiinteänä aineena (2,0 g, 72 %), sul.p.

5 199-200 °C, ΉΝΪ® (CDC13) 9,54 (s,lH), 9,12 (d,lH), 8,03 (d,lH), 7,57 (m,2H).

Analyysi kaavalle C13H5F2N02 laskettu: C 63,67; H 2,04; N 5,71 saatu : C 63,86; H 1,66; N 5,39.

10

Esimerkki 4 6,9-bis{f 2-(dimetvvliaminoletvvlilamino!bentsof aiisokino-liini-5.10-dioni (10a) 15 Seosta, jossa oli 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10- dionia 9 (20 mg, 0,08 mmoolia) ja N,N-dimetyylietyleeni- diamiinia (0,8 mmoolia, 0,8 ml 1 M liuosta pyridiinissä), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 48 tuntia. Suurimman osan pyridiinistä annettiin haihtua, lisättiin eetteriä 20 ja tuote 10a poistettiin suodattamalla (24 mg, 79 %), sul.p. 167-168 °C, 'HNMR (CDCl3) 11,06 (leveä t,lH), 10,97 (leveä t,lH), 9,63 (S,1H), 8,92 (d,lH), 8,13 (d,lH), 7,32 (m,2H), 3,54 (q,4H), 2,7 (t,4H), 2,38 (s,12H), massaspek- tri m/z (suhteellinen intensiteetti) 381 (2,0, M*) 59 25 (5,4), 59 (100), UVtojks. (2-metoksietanoli) 580 (olka, : 6200), 614 (10600), 661 (12700).

• · · • Analyysi kaavalle C21H27N502 jT; laskettu: C 66,12; H 7,13; N 18,36 saatu : C 66,22; H 7,10; N 18,20.

30 t · · *

Esimerkki 5 • · · *· ^ 6,9-bisf r2-(dietvvliamino1etvvli1amino>bentsora1isokino- liini-5,10-dioni (10b) 35 Liuokseen, jossa oli N,N-dietyylietyleenidiamiinia (684 mg, 5,9 mmoolia) pyridiinissä (2 ml), lisättiin yhdistettä 9 (202 mg, 0,82 mmoolia) pyridiinissä (2 ml). Purppu- 103575 34 ranpunaista seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 48 tuntia (tässä kohden TLC-analyysillä saatiin yksi sininen piste: piihappogeeli, 5 % MEOH/CHC1J . Ylimääräinen emäs ja pyridiini poistettiin haihduttamalla hitaassa typpi-5 kaasuvirtauksessa. Raakamateriaalia pidettiin sen jälkeen tyhjössä yön yli. Jäännökseen lisättiin jäävettä, jonka jälkeen kiinteä aine kerättiin suodattamalla ja kuivattiin (330 mg, 84 %) , sul.p. 142-144 °C. ‘HNMR (CDC13) 11,10 (t,1H), 11,00 (t,1H), 9,60 (S,1H), 8,92 (d,lH), 10 8,10 (d,1H), 7,25 (m,3H), 3,50 (m,1H), 2,82 (m,1H), 2,35 (m,3H), 1,10 (m,12H).

Analyysi kaavalle C25H35N502 laskettu: C 68,62; H 16,00; N 7,31 saatu : C 67,95; H 16,05; N 7,28.

15

Esimerkki 6 6,9-bis-f Γ 2 — Γ di f sek, -propvvl i) amino letvvl il amino Ibent-sordlisokinoliini-5,10-dioni (10c) 20 N,N-di-isopropyylietyleenidiamiinia (588 mg, 4,1 mmoolia) lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (100 mg, 0,41 mmoolia) metanolissa (1 ml) ja vedessä (1 ml). Seoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa 88 tuntia, jonka jälkeen se kaadettiin jääveteen. Sininen sakka otettiin 25 talteen suodattamalla. Kiinteä aine puhdistettiin pylväs- ; .· kromatografisesti piihappogeelillä. Aluksi eluointiainee- • · * ί na oli kloroformi, jonka jälkeen seokset, joissa oli 2 % ;’;*i ja 20 % metanolia kloroformissa. Viimeksi mainittujen eluointiaineiden konsentraatio tuotti 163 mg (81 %) tuo-30 tetta 10c. sul.p. 134-136 °C; 'HNMR (CDC13) 10,95-11,20 I I · (m,2H), 9,63 (s, 1H) , 8,92 (d,lH), 8,13 (d,lH), 7,33 (m, • « · 2H), 3,45 (2q,4H), 3,10 (h,4H), 2,82 (t,4H), 1,08 (d, V·: 24H) .

Analyysi kaavalle C2,H,3Ns02 35 laskettu: C 70,55; H 8,78; N 14,19 saatu : C 69,23; H 8,71; N 13,43.

35 103575

Esimerkki 7 6.9-bisf Γ2-(11-pyrrolidino)etvvli1aminolbentsoFqlisokino-liini-5,10-dioni (lOd) 5 Liuos, jossa oli 1-(2-aminoetyyli)pyrrolidiinia (690 mg, 6,0 mmoolia) pyridiinissä (2 ml), lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (202 mg, 0,82 mmoolia) pyridiinissä (2 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 49 tuntia. Ylimääräinen emäs ja pyridiini poistettiin käyt-10 täen hidasta typpivirtaa. Jäännöstä pidettiin yön yli tyhjössä. Jäännökseen lisättiin kylmää vettä ja tahmea, kiinteä aine erotettiin. Tuote uutettiin kloroformilla (3x35 ml), uutteet kuivattiin natriumsulfaatilla ja kloroformi poistettiin pyöröhaihduttimella, saatiin otsikos-15 sa mainittu yhdiste (260 mg, 73 %); TLC, piihappogeeli, 5 % MeOH/CHCl3, yksi sininen täplä; sul.p. 141-142 °C.

1HNMR (CDClj): 11,15 (t,lH), 11,00 (t,lH), 9,65 (s,lH), 8,90 (d,1H), 8,05 (d,lH), 7,35 (m,2H), 3,65 (m,4H), 2,90 (m,4H), 2,70 (m,8H), 1,85 (m,8H).

20 Analyysi kaavalle C25H31N502 laskettu: C 69,26; H 7,21; N 16,15 saatu : C 69,02; H 7,25; N 16,00.

Maleaattisuola: Typpiatmosfäärissä liuos, jossa oli ma-25 leiinihappoa (271 mg, 2,34 mmoolia) etanolissa (5 ml), . lisättiin suspensioon, jota sekoitettiin ja jossa oli yh- : ·* distettä lOd (450 mg, 1,04 mmoolia) etanolissa (20 ml).

t » · : Sekoitettiin kaksi tuntia, jonka jälkeen lisättiin hi- ·.· ' taasti eetteriä (25 ml) ja sakka suodatettiin ja kuivat- 30 tiin tyhjössä 40 °C:ssa, saatiin yhdisteen lOd hygros-kooppinen dimaleaattisuola (580 mg), sul.p. 164-166 °C. Analyysi kaavalle C33H3gN5O10»H2O .* . laskettu: C 57,96; H 6,04; N 10,24 saatu : C 57,85; H 5,99; N 10,14.

/ 35 103575 36

Esimerkki 8 6.9- bislΓ2 — f 4 *-morfolinoletvvli1 aminoIbentsofaiisokino-liini-5,10-dioni (10e1 5 Liuos, jossa oli 4-(2-aminoetyyli)morfoliinia (220 mg, I, 7 mmoolia) pyridiinissä (2 ml), lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (102 mg, 0,42 mmoolia) pyridiinissä (1 ml). Purppuranväristä seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 120 tuntia. Ylimääräinen amiini ja pyridiini 10 haihdutettiin hitaassa typpivirrassa ja jäännöstä pidettiin yön yli tyhjössä. Seos otettiin talteen kloroformiin, jonka jälkeen se suodatettiin. Poistamalla kloroformi saatiin sininen, kiinteä aine, joka antoi TLCrllä (piihappogeeli, 25 % MeOH/75 % CHC13 /muutama tippa ve-15 sipitoista ammoniumhydroksidia) yhden sinisen täplän (140 mg, 72 %) ; HNMR (CDC13) : 11,015 (m, 1H) , 10,90 (m, 1H) , 9,62 (d,lH), 8,90 (d,lH), 8,10 (d,lH), 7,25 (m,2H), 3,80 (m,8H), 3,55 (m,4H), 2,75 (t,4H), 2,50 (m,8H).

Analyysi kaavalle C?;H3;N.04 20 laskettu: C 64,22; H 6,68; N 11,98 saatu : C 63,95; H 6,78; N 11,89.

Esimerkki 9 6.9- bis-f Γ 2 — (11 -atsiridinol etvvli 1 amino}bentso fql isokino-25 liini-5,10-dioni (lOf) • · · • · · • · *. * Esimerkin 4 menetelmä toistettiin saattaen yhdiste 9 rea- • · · *w** goimaan N-(2-aminoetyyli)atsiridiinin kanssa ja jäännös, • · · ’·* ‘ joka saatiin pyridiinin haihduttamisen jälkeen, puhdis- 30 tettiin piihappogeelipylväskromatografisesti.

« · · • · * : Suurin sininen vyöhyke, joka eluoitiin seoksella, jossa ; oli 10 % CHjOHita CHCl3:ssa, kerättiin. Kiteytettiin me- tyleenikloridin ja ligroiinin seoksesta, saatiin tumman-35 sininen, kiinteä aine, sul.p. 100-103 °C; ^NMR (CDC13) : II, 23 (leveä, 1H), 11,15 (leveä, 1H), 9,73 (s,lH), 8,91 (d,1H), 8,12 (d,lH), 7,40 (d,lH), 7,38 (d,lH), 3,69 (q, 37 103575 4H), 2,60 (t,4H), 1,85 (m,4H), 1,24 (m,4H); massaspektri m/z (suhteellinen intensiteetti) 377 (100,M*) , 278 (72,7), 56 (12,6.

Analyysi kaavalle C21H23N502 5 laskettu: C 66,82; H 6,14; N 18,55 saatu : C 66,50; H 6,00; N 18,20.

Esimerkki 10 6,9-bislΓ 2-ΓΝ-(tert.-butoksikarbonvvlilamino1etvvli1ami-10 no > bent so Γ ql isokinoli ini-5,10-dioni (lOcrl

Liuosta, jossa oli yhdistettä 9. (0,10 g, 0,41 mmoolia) ja N-tert.-butoksikarbonyyli)etyleenidiamiinia (Synth.Comm., (1990), 20, 2559; 0,65 g, 4,10 mmoolia) pyridiinissä (4,0 15 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Lisäämällä vettä (20 ml), saatiin yhdiste lOq. joka suodatettiin, pestiin vedellä ja kuivattiin (0,17 g, 80 %), sul. p. 213-216 °C. Kiteyttämällä CHC13:CC1,-seoksesta, saatiin tummansininen, kiinteä aine, sul.p. 215-216 °C; 'HNMR 20 (CDC13) : 11,07 (leveä,1H), 10,96 (leveä,1H), 9,49 (s,lH), 8,90 (d,1H), 7,99 (d,lH), 7,32 (s,2H), 5,30 (leveä,2H), 3,58 (m,4H), 3,47 (m,4H), 1,56 (s,18H); massaspektri m/z (suhteellinen intensiteetti) 525 (100,M*) , 339 (51,9), 57 (87,7) .

2 5 Analyysi kaavalle C27H35N506 .. . laskettu: C 61,70; H 6,73; N 13,32 I. f saatu : C 61,18; H 6,29; N 12,88.

• · • · · V ‘ Esimerkki 11 3 0 6,9-bis-f Γ2 - (N-tert. -butoksikarbonvvli-N-metvvliamino) - • · · : etvvlilamino>bentsofqlisokinoliini-5.10-dioni (lohi « · « • · · • · * ·' : 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia (0,29 g, 1,18 mmoolia) lisättiin liuokseen, jota sekoitettiin ja 35 jossa oli N-(tert.-butoksikarbonyyli)-N-metyylietyleeni-diamiinia (0,824 g, 4,73 mmoolia) (J.Med.Chem. 1990, 3_3, 97) kuivassa pyridiinissä (5 ml). Reaktioseosta sekoitet- 103575 38 tiin typpiatmosfäärissä 24 tuntia huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen vielä 8 tuntia 50 °C:ssa. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja saatu sininen jäännös otettiin talteen CH2Cl2:lla (50 ml), pestiin 5%:isella NaHC03-5 liuoksella (2x30 ml) ja vedellä (30 ml). Yhdistetyt, orgaaniset faasit kuivattiin Na2S04:llä ja liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa. Sininen jäännös puhdistettiin pylväskromatografisesti (piihappogeeli, 230-400 mesh, 50 g, eluointlaineena CH2C12:AcOEt:MeOH-seos suh-10 teessä 93:5:2), saatiin 400 mg (61 %) sinisiä kiteitä, sul.p. 161,5-162,5 °C, sen jälkeen kun oli kiteytetty uudestaan CH2C12:heksaani-seoksesta. 'HNMR (CDC13) : 1,49 (s,18H) , 2,94 (s,6H) , 3,45-3,75 (m,8H), 7,25-7,55 (m,2H), 8,12 (d,1H), 8,95 (d,lH), 9,62 (s,lH), 10,95-11,23 (m,2H, 15 vaihtuva D20:n kanssa).

Esimerkki 12 6.9- bis-f Γ2 - (amino) etvvlil amino>bentso Toi isokinoliini- 5.10- dioni flOi) 20

Difluoridista 9: Typpiatmosfäärissä 1,2-diaminoetaania (8,72 ml, 130,5 mmoolia) lisättiin liuokseen, jota sekoitettiin ja jossa oli yhdistettä 9 (4,00 g, 16,3 mmoolia) pyridiinissä (80 ml). Seurasi heikosti eksoterminen reak-25 tio, jota hillittiin jäähdyttämällä vesihauteessa 20 °C: .. . ssa. Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 34 *. ; tuntia, sen jälkeen jäähdytettiin -5 °C:seen 30 minuutin • · · : ·* kuluessa, kiinteä aine erotettiin imusuodattamalla typpi- ♦ · · * virtauksessa ja kuivattiin yön yli tyhjössä 30 °C:ssa.

30 Saatu raakamateraali (6,07 g) kiteytettiin uudestaan liu- • i* *·.: · ottamalla metanoliin (20 ml) 40 °C.*ssa ja saostamalla uu- : destaan metyleenikloridilla (100 ml) ja n-heksaanilla .* · (300 ml), saatiin 5,12 g yhdistettä lOi sinisenä, kiin teänä aineena. ^NMR (CDC13) : 11,10-11,30 (2m,2H), 9,53 35 (S,1H) , 8,93 (d,1H) , 8,13 (d,lH), 7,35 (m,2H), 3,55 (q, 4H), 3,10 (t,4H). HPLC Lichrospher 100 RP18, 5 μιη; elu-ointiaineena: natriumheptasulfonaatti 2 g/1 H20:ta: 39 103575 CH3CN:dioksaani, suhteessa 75:20:5, pH 3 H3P04:llä; λ = 245 run; virtausnopeus 1 ml/min; RT = 8,80 minuuttia.

Maleaattisuola: Typpiatmosfäärissä vapaa emäs lOi (3,50 5 g, 10,8 mmoolia) liuotettiin seokseen, jossa oli etanolia (170 ml) ja metanolia (30 ml), kuumentamalla 50 °C:ssa 10 minuutin ajan, sen jälkeen lisättiin liuos, jossa oli ma-leiinihappoa (2,87 g, 24,7 mmoolia) etanolissa (30 ml). Kuumennettiin edelleen vielä 5 minuuttia 50 °C:ssa, jonka 10 jälkeen seoksen annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan ja sitten se jätettiin 4 °C:seen 2 tunnin ajaksi. Sakka erotettiin imusuodattamalla typpivirrassa ja kuivattiin 40 °C:ssa tyhjössä, saatiin 5,75 g raakaa dimaleaattia.

15 Suspensioon, jota sekoitettiin ja jossa oli tämä raakama-teriaali (5,71 g) vedessä (90 ml) 50 °C:ssa, lisättiin etanolia tipoittain, kunnes saatiin täysin liuennut seos (noin 300 ml), jonka jälkeen lisättiin etanolia vielä (400 ml) ja seoksen annettiin jäähtyä huoneen lämpöti-20 laan. 12 tunnin kuluttua sakka erotettiin imusuodattamalla, pestiin etanolilla (15 ml) ja dietyylieetterillä (10 ml) ja sen jälkeen kuivattiin tyhjössä 30 °C:ssa 5 tunnin ajan, saatiin 4,22 g yhdisteen lOi dimaleaattisuolaa, sul.p. 176-178 °C rypistyen, se ei sula edes 245 °C:ssa.

25 Analyysi kaavalle C17H19N502·2C4H404 · 1,5H20 laskettu: C 51,37; H 5,17; N 11,98 : saatu : C 51,31; H 4,99; N 11,93.

♦ * « 1HNMR (DMS0-d6): 10,92 (leveä,1H), 10,87 (leveä,1H), 9,45 : (s, 1H), 9,01 (m, 1H), 8,08 (m,lH), 7,59 (s,2H), 6,03 30 (s,4H), 3,76 (leveä,4H), 3,08 (m,4H). UV, 1,528 g vedessä *v’: (50 ml) nm (E 1 %): 641 (271), 597 (245), 313 (98), 273 (257), 246 (479).

Hydrokloridisuola: 35 a) Amiinista lOi: Liuoksen lävitse, jossa oli raaka amiini kloroformissa, johdettiin kloorivetykaasua, kunnes liuoksen sininen väri hävisi. Kiinteä aine suodatettiin ja 103575 40 kuivattiin, saatiin tummansininen, hygroskooppinen, kiinteä aine (0,174 g, 26 %) sul.p. 209-212 °C; *HNMR (DMS0-d6): 10,91 (leveä,2H), 9,44 (s,lH), 9,01 (d, 1H), 8,23 (leveä,4H), 8,09 (d,lH), 7,74 (s,2H), 3,84 (m, 5 4H), 3,02 (m,4H).

Analyysi kaavalle C17H19N502»2HC1*4H20 laskettu: C 44,94; H 6,43; N 15,41 saatu : C 44,52; H 5,29; N 14,53.

10 Vapaa amiini voitiin saada uudestaan lisäämällä kiinteää kaliumkarbonaattia NMR-näytteeseen. 1HNMR-analyysi osoitti vapaan amiinin esiintymisen.

b) Tert.-Boc-analogin lOq suojauksen poistaminen: Liuok-15 sen, jossa oli yhdistettä lOq (0,160 g, 0,30 mmoolia) kuivassa kloroformissa (10 ml), lävitse johdettiin kloo-rivetykaasua 30 minuutin ajan. Tummansininen, kiinteä aine suodatettiin ja kuivattiin (0,115 g, 95 %), sul.p. 213-215 °C, sen rakenne varmistettiin samalla tavalla 20 kuin yhdisteen lOi hydrokloridisuolan ^NMR-analyysillä.

Esimerkki 13 6,9-bisf Γ2-( asetvvliamino)etyylilamino~)bentsorq1 isokino-liini-5,10-dioni (lOi ) 25 .. . Esimerkin 12 menetelmä toistettiin käyttäen yhdistettä 9 • · « • · •§ ’ ja 1,2-diaminoetaania, saatiin raakareaktioseos, joka « · · : ·* siirrettiin piihappogeelipylvääseen. Pylvääseen lisättiin • · · *.* ' etikkahappoanhydridiä (30 ml) ja sen annettiin seistä 15 30 minuutin ajan. Suurin sininen fraktio 10j, joka eluoitiin • * · : seoksella, jossa oli CH3OH:CHCl3 suhteessa 1:4, kiteytet- tiin CHCl3:CH3OH-seoksesta, saatiin sininen, kiinteä aine . (0,240 g, 35 %), sul.p. 155-156 °C; ^NMR (DMS0-d6): 11,12 ’ : (t, 1H), 11,02 (t, 1H), 9,42 (s,lH), 8,95 (d,lH), 8,15 (le- 35 veä,2H), 8,03 (d,lH), 7,62 (s,2H), 3,57 (m,8H), 1,83 (s, 6H); massaspektri m/z (suhteellinen intensiteetti) 409 (2,5, M*), 337 (6,4), 86 (100).

41 103575

Analyysi kaavalle C12H23N504 laskettu: C 61,60; H 5,67; N 17,10 saatu : C 61,37; H 5,42; N 16,89.

5 Esimerkki 14 6.9- bisf f 2-(metwliamino)etvvli1aminolbentsoTglisokino-liini-5,10-dionin trihydrokloridi (10k)

Etanolipitoista HCl:ää (6,7 N, 2,0 ml) lisättiin liuok-10 seen, jossa oli 6,9-bis{[2-(N-tert.-butoksikarbonyyli-N-metyyliamino)etyyli]amino)bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia (lOh) (440 mg, 0,795 mmoolia) CHCl3:ssa (40 ml). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa typpiat-mosfäärissä 24 tuntia, sen jälkeen muodostuneet tumman-15 vihreät kiteet kerättiin suodattamalla, pestiin absoluuttisella etanolilla ja kuivattiin 40 °C:ssa tyhjössä, saatiin 945 mg (saanto 94 %) puhdasta tuotetta, sul.p. 188 °C haj. (DSC:n kehittyminen).

Alkuaineanalyysi kaavalle C19H26C13N502* 2H20 20 laskettu: C 46,51; H 6,03; N 14,14; Cl 23,60 saatu : C 45,75; H 6,06; N 14,04; Cl 21,32.

HPLC (Lichrosper 100 RP18, 5 pm; eluointiaineena K2HP04 25 mM, n-C7H15S03Na 2 mg/ml H20: ta:CH3CN:dioksaani suhteessa 80:15:5, pH 2,7 HC104:llä: λ 275 nm, virtaus 1 ml/min. ; 25 RT 20,11 minuuttia.

UV, 1,07 mg 20,0 ml:ssa vettä, nm (E 1 %): 641 (290), 597 • ·’ (267), 313 (106), 273 (278), 247 (486).

• · · : V* 1HNMR (D20): 2,75 (s,6H), 3,30-3,45 (m,4H), 3,80-3,95 (m, : 4H), 7,38 (a, 2H), 8,17 (d,lH), 8,85 (d,lH), 9,27 (s,lH).

30 : Esimerkki 15: 6.9- bisr ( 2-hvdroksietvvli ) amino! bentsofgl isokinoliini- .* . 5,10-dioni (11a) 35 Seosta, jossa oli difluoridia 9 (1,0 g, 4,1 mmoolia) ja 2-aminoetanolia (2,5 g, 40,8 mmoolia) pyridiinissä (7 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa 18 tunia. Seos 103575 42 kaadettiin veteen (50 ml) ja tuote 11a suodatettiin ja kuivattiin (1,26 g, 94 %) , sul.p. 236-239 °C. Kiteyttämällä uudestaan metanolista, saatiin tummansiniset neulaset, sul.p. 237-239 °C, 'HNMR (DMSO-d6) : 11,28 (t,lH), 5 11,19 (t,1H), 9,43 (s,lH), 8,94 (d,lH), 8,03 (d,lH), 7,56 (s,2H), 5,01 (t,2H), 3,69 (m,4H), 3,54 (m,4H).

Analyysi kaavalle C^HnN^O, laskettu: C 62,38; H 5,25; N 12,83 saatu : C 62,21; H 5,12; N 12,50.

10

Esimerkki 16 6,9-bis Γ(2-metaanisulfonyylioksietvvli)amino1bentso Γα 1 -isokinoliini-5.10-dioni (11b) 15 Liuosta, jossa oli yhdistettä 11a (0,30 g, 0,92 mmoolia) kuivassa pyridiinissä (4 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa typpiatmosfäärissä 10 minuuttia. Lisättiin metaa-nisulfonyylikloridia (0,24 g, 2,07 mmoolia) ja seosta sekoitettiin 20 minuuttia. Reaktioseos sammutettiin jääve-20 teen (20 ml) ja kiinteä aine suodatettiin. Kiteyttämällä kloroformin ja ligroiinin seoksesta saatiin sininen, kiinteä aine (0,294 g, 66 %), sul.p. 116-118 °C, HNMR (CDCIJ : 10,98 (leveä,2H), 9,59 (s,lH), 8,97 (d,lH), 8,09 (d,lH), 7,38 (d,1H), 7,34 (d,lH), 4,50 (t,4H), 3,83 (q, 25 4H), 3,09 (s,6H).

Analyysi kaavalle C19H21N3OeSj i. : laskettu: C 47,20; H 4,39; N 8,69 « · · ; saatu : C 46,80; H 4,31; N 8,48.

« · · • · · 30 Esimerkki 17 • · · '· 6,9-bisl Γ2-Γ (2-hydroksietvvli)amino1etvvli)aminolbentso- : : : Γα1isokinoliini-5,10-dioni (101) a) Mesylaatista (11b) 35 Liuosta, jossa oli yhdistettä 11b (0,40 g, 0,83 mmoolia) ja 2-(trimetyylisilyylioksi)etyyliamiinia (2,21 g, 16,5 mmoolia) pyridiinissä (5,0 ml), sekoitettiin huoneen läm- 43 103575

Potilassa typpiatmosfäärissä 48 tuntia. Pyridiini poistettiin typpivirtauksessa ja jäännös otettiin talteen me-tyleenikloridiin. Tämä liuos pestiin kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Liu-5 otin poistettiin ja jäljelle jäi sininen öljy, jota kuivattiin tyhjössä yön yli. Kromatografointi piihappogeeli-pylväässä johti Si-O-sidoksen lohkeamisiin ja saatiin yhdiste 101. Tämä tuote eluoitiin seoksella, jossa oli Et3N: CH30H:CHC13 suhteessa 1:5:5. Konsentroimalla saatiin yh-10 diste 101 öljynä; ^NMR (CDC13) : 11,19 (leveä, 1H), 11,06 (leveä,1H), 9,46 (s,lH), 8,83 (d,lH), 7,98 (d,lH), 6,98 (s,2H), 3,82 (m,4H), 3,52 (m,4H), 3,07 (m,4H), 2,96 (m, 4H). UV (2-metoksietanoli): 570 (olka, e=7200), 612 (e= 13200), 658 (€=14000).

15 b) Difluoridista (9)

Typpiatmosfäärissä 2-[(2-hydroksietyyli)amino]etyyliamii-nia (6,19 ml, 61,2 mmoolia) lisättiin suspensioon, jota 20 sekoitettiin ja jossa oli yhdistettä 9 (1,00 g, 4,08 mmoolia) pyridiinissä (30 ml) 0 °C:ssa. Yhden tunnin kuluttua reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja se jätettiin tähän lämpötilaan kolmen tunnin ajaksi. Reaktioseos siirrettiin kromatografiapylvääseen, 25 jossa oli piihappogeeliä (100 g), ja eluoitiin ensin .11 CHCl3:CH3OH-seoksessa (90:10), ja sen jälkeen CHCl3:CH3OH- • · · *. l’ seoksella (85:15) ja lopuksi CHCl3:CH3OH:NH,OH-seoksella • · · • ·* (85:15:1). Tuotteen sisältävät fraktiot yhdistettiin, • · · ·.* ' liuottimet poistettiin ja jäännös puhdistettiin toisen 30 kerran pylväskromatografisesti piihappogeelillä (95 g), • · « V · eluointiaineena oli CHC13 :CH30H:NH,OH. kons.-seokset, alkaen suhteesta 95:5:0 suhteeseen 80:20:2. Lopullinen puhdista-’ ; minen emäksisellä aluminiumoksidilla, laatu I (25 g), eluointiaineena CH2Cl2:EtOH-seos (96:4) tuotti 500 mg 35 jäännöstä, joka kiteytettiin etanolin (0,5 ml) ja mety- leenikloridin (10 ml) seoksesta, saatiin yhdiste 101 (142 mg) .

103575 44

Maleaattisuola: Vapaa amiini 101 (138 mg, 0,334 mmoolia) liuotettiin etanoliin (6 ml) typpiatmosfäärissä ja huoneen lämpötilassa lisättiin liuos, jossa oli maleiinihap-poa (87 mg, 0,75 mmoolia) etanolissa (3 ml). Kolmen tun-5 nin kuluttua jäähdytettiin 4 °C:seen ja saatiin siniset kiteet, jotka erotettiin imusuodattamalla typpivirtauk-sessa, pestiin etanolilla (1 ml) ja dietyylieetterillä (2 ml) ja kuivattiin tyhjössä 40 °C:ssa, saatiin yhdisteen 101 dimaleaattisuola (160 mg), sul.p. 132-133 °C, 1HNMR 10 (DMSO-d6): 10,94 (leveä,1H), 10,88 (leveä,1H), 9,47 (s, 1H), 9,02 (d,1H), 8,60 (leveä,2H), 8,09 (d,lH), 7,63 (s,2H), 6,01 (s,4H), 5,32 (leveä,2H), 3,89 (m,4H), 3,71 (m,4H), 3,26 (m,4H), 3,12 (m,4H). UV 1,355 mg H20:ssa (25 ml), nm (E 1 %): 641 (220), 598 (208), 312 (85), 272 15 (221), 246 (406).

Analyysi kaavalle C21H27N504 · 2C4H404 · H20 laskettu: C 52,52; H 5,57; N 10,64 saatu : C 52,49; H 5,56; N 10,61.

20 Esimerkki 18 6.9-bis(Γ2-(2-metoksietvvliamino)etyyli1 amino1bentsoΓ g1 -isokinoliini-5,10-dioni (lOm)

Liuosta, jossa oli yhdistettä 11b (0,15 g, 0,21 mmoolia) 25 ja 2-metoksietyyliamiinia (0,47 g, 6,20 mmoolia) pyri- ... diinissä (2,0 ml), sekoitettiin huoneen lämpötilassa typ- • · · 45 103575 saspektri m/z (suhteellinen intensiteetti) 441 (100, M*), 354 (57,4), 266 (50,5).

Analyysi kaavalle C23H31NsO, laskettu: C 62,57; H 7,09; N 15,86 5 saatu : C 62,51; H 6,92; N 15,47.

Esimerkki 19 6.9- bis-f Γ2- (2-hvdroksietoksi) etyyli 1 amino!bentsorolisoki-noliini-5,10-dioni (11c) 10

Liuos, jossa oli 2-(2-aminoetoksi)etanolia (446 mg, 4,25 mmoolia) pyridiinissä (1 ml), lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (100 mg, 0,41 mmoolia) pyridiinissä (1 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 45 tuntia.

15 Ylimääräinen amiini ja pyridiini poistettiin hitaalla typpivirtauksella ja jäännöksenä saatua kiinteää ainetta pidettiin tyhjössä yön yli- Kiinteään aineeseen lisättiin kylmää, kyllästettyä NaCl-liuosta ja tuote uutettiin kloroformilla (6x25 ml). Uutteet kuivattiin magnesiumsulfaa-20 tiliä ja konsentroitiin pyöröhaihduttimessa, saatiin 140 mg (82 %) tuotetta 11c. sul.p. 97-99 °C. ‘HNMR (CDC1,) : 11,15-11,35 (2m,2H), 9,60 (S,1H), 8,85 (d,lH), 8,08 (d, 1H), 7,30 (m,2H), 3,85 (m,8H), 3,57-3,75 (2m,9H), 2,75- 3,25 (leveä s,1H).

25

Esimerkki 20 I.I 6.9-bisf r3-faminolpropyvli1aminolbentsorq1isokinoliini- • · · 5.10- dioni (12a1 • · · • · * 30 l) Vapaa amiini: Liuos, jossa oli 1,3-diaminopropaania - V : (870 mg, 11,76 mmoolia) kloroformissa (3 ml), lisättiin • · · · seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (300 mg, 1,22 mmoolia) .·. : kloroformissa (6 ml). Purppuranväristä seosta sekoitet tiin 166 tuntia huoneen lämpötilassa. Seos suodatettiin 35 ja suolat pestiin kloroformilla. Liuotin poistettiin pyöröhaihduttimessa ja jäännöstä pidettiin tyhjössä yön yli, saatiin 290 mg (93 %) yhdistettä 12a. TLC:llä (piihappo- 103575 46 geeli, 25 % MeOH/75 % kloroformi/muutama tippa vesipitoista ammoniumhydroksidia) saatiin yksi sininen täplä, sul.p. 105 °C (pehmenee) 112-115 °c. ΉΝΜΕ (DMSO-d6) : 11,15 (m,lH), 11,05 (m,1H), 9,45 (s,lH), 8,90 (d,lH), 8,0 5 (d,lH), 7,55 (leveä s,2H), 3,55 (leveä m,4H), 4,65 (t, 4H), 3,75 (t,4H), 1,75 (t,4H).

Analyysi kaavalle C19H23N502 laskettu: C 64,57; H 6,56; N 19,81 saatu : C 65,00; H 6,50; N 19,78.

10 2) Maleaattisuola: Liuos, jossa oli maleiinihappoa (11 mg, 0,86 mmoolia) metanolissa, lisättiin seokseen, jossa oli yhdiste 12a (100 mg, 0,28 mmoolia) liuotettuna meta-noliin (2 ml) ja etyyliasetaattiin (2 ml). Lisäämällä 15 etyyliasetaattia saatiin sininen sakka, joka suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä (120 mg, 79 %) . 'HNMR (DMSO-dJ : 11,10 (t,1H), 11,00 (t,1H), 9,45 (s,lH), 8,95 (d,1H), 8,05 (d,1H), 7,75 (leveä,4H), 7,60 (s,2H), 6,0 (s,4H), 3,60 (m,4H), 2,95 (t,4H), 1,95 (m,4H).

20 Analyysi kaavalle C23H27N.,06 laskettu: C 58,84; H 5,80; N 14,92 saatu : C 58,75; H 5,70; N 14,85.

Esimerkki 21 25 6.9-bis(Γ 4-(amino)butvvli1 amino}bentsoΓο)isokinoliini- 5.10-dioni (12b^ • · • · ·♦ ♦ • · * • · 1) Vapaa amiini: Liuos, jossa oli 1,4-diaminobutaania * (960 mg, 10,9 mmoolia) kloroformissa (3 ml), lisättiin 30 seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (319 mg, 1,3 mmoolia) • · · *·* ' kloroformissa (6 ml) . Purppuranpunaista seosta sekoitet- • · · V * tiin huoneen lämpötilassa 217 tuntia (9 päivää). Saostu- .*·.· neet suolat poistettiin suodattamalla ja suodos konsent roitiin hitaassa typpivirtauksessa, saatiin vapaa amiini 35 12b (400 mg, 80 %). TCL (piihappogeeli, 25 %MeOH/75 % CHCl3/muutama tippa vesipitoista ammoniumhydroksidia): sul.p. 80 °C (pehmenee) 90-92 °C. ‘HNMR (DMSO- d6) : 11,15 47 103575 (m,1H), 11,05 (m,1H), 9,42 (s,lH), 8,90 (d,lH), 8,0 (d,1H), 7,5 (leveä s,2H), 3,45 (m,4H), 2,60 (m,4H), 1,70 (m,4H), 1,45 (m,4H).

Analyysi kaavalle C21H27N502 5 laskettu: C 66,12; H 7,13; N 18,36 saatu : C 64,26; H 6,95; N 17,42.

2) Maleaattisuola: Liuos, jossa oli maleiinihappoa (116 mg, 1 mmooli) etyyliasetaatissa (4 ml), lisättiin seok-10 seen, jossa oli yhdistettä 12b (124 mg, 0,40 mmoolia) me-tanolissa (6 ml) ja etyyliasetaatissa (8 ml). Sininen öljy erottui ja seosta pidettiin jääkaapissa yön yli. Liuottimet poistettiin dekantoimalla ja jäljelle jäänyt kiinteä aine pestiin hyvin etyyliasetaatilla, saatiin si-15 nistä, hyvin hygroskooppista, kiinteää ainetta 125 mg (63 %) . ‘HNMR (DMSO-d6) : 11,20 (m, 1H) , 11,10 (m,lH), 9,45 (s, 1H), 8,95 (d,1H), 8,05 (d,1H), 7,70 (leveä s,4H), 6,00 (s,4H) , 3,55 (m,4H), 2,85 (m,4H), 1,70 (m,8H).

Analyysi kaavalle C2,H35N5Ol0 20 laskettu: C 56,76; H 5,75; N 11,41 saatu : C 53,65; H 6,10; N 10,05.

Esimerkki 22 6.9-bislΓ 3-f dimetvvliaminolpropvvli1amino!bentso Γ aiisoki-25 noliini-5.10-dioni (12c) *· ♦ • · · • * ", *. Liuos, jossa oli 3-dimetyyliaminopropyyliamiinia (700 mg, « i « •#t** 6,9 mmoolia) pyridiinissä (2 ml), lisättin seokseen, jos- • · * sa oli yhdistettä 9 (100 mg, 0,41 mmooli) pyridiinissä (2 30 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 120 tuntia.

• »· : Ylimääräinen diamiini ja pyridiini poistettiin hitaassa • · * · typpikaasuvirtauksessa ja jäännöstä pidettiin tyhjössä .·’ : yön yli. Jäännös lisättiin kylmään veteen ja uutettiin kloroformilla (4x20 ml). Uute kuivattiin Na2S0,:llä ja 35 konsentroitiin pyöröhaihduttimellä. Sininen, kiinteä aine puhdistettiin pylväskromatografisesti piihappogeelillä. Aluksi eluoitiin seoksella, jossa oli 10 % metanolia ja 103575 48 90 % kloroformia, sen jälkeen seoksella, jossa oli 25 % metanolia ja 75 % kloroformia. Tuote eluoitiin lisäämällä pieniä määriä ammoniumhydroksidia eluointiseokseen, jossa oli 25 % metanolia ja 75 % kloroformia. Konsentroimalla 5 nämä eluoidut liuokset saatiin 92 mg (55 %) haluttua tuotetta 12c, sul.p. 107-109 °C. ‘HNMR (CDC13) : 11,00-11,20 (2m,2H), 9,63 (s,1H) , 8,93 (d,lH), 8,12 (d,lH), 7,37 (s, 2H), 3,55 (q,4H), 2,55 (m,4H), 2,35 (s,12H), 2,00 (m,4H).

10 Esimerkki 23 69-bisf Γ2-f etvvliaminoletvvli1 amino11 bentsoΓqlisokino-liini-5,10-dioni (lOn)

Liuos, jossa oli N-etyylietyleenidiamiinia (400 mg, 4,5 15 mmoolia) pyridiinissä (1 ml), lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (98 mg, 0,40 mmoolia) pyridiinissä (1 ml). Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 66 tuntia. Pyridiini ja ylimääräinen diamiini poistettiin hitaassa typpivirtauksessa ja jäännöksenä saatua ainetta pidettiin 20 tyhjössä yön yli. Sen jälkeen lisättiin kloroformia ja kloroformi pestiin kaksi kertaa kylmällä vedellä. Kloro-formiuute kuivattiin MgS04:llä ja liuotin poistettiin pyö-röhaihduttimella. Saatiin sininen, kiinteä aine, joka puhdistettiin pylväskromatografisesti piihappogeelillä 25 käyttäen eluointiin aluksi seosta, jossa oli 5 % metano- ··.·. lia ja 95 % kloroformia. Eluointiainetta muutettiin vä- « · hitellen siten, että seos sisälsi 5 %, 10 % ja sen jäi-• · · ' 9 · keen 50 % metanolia kloroformissa. Haluttu tuote eluoi- « · · *** * tiin käyttäen seosta, jossa oli 50 % metanolia, 48 % klo- 30 roformia ja 2 % ammoniumhydroksidia. Poistamalla liuotin ·.· * saatiin 32 mg (21 %) tuotetta 10η, sul.p. 101-102 °C.

V·': 'HNMR (CDC13) : 11,10 (m,lH), 11,00 (m,lH), 9,6 (s,lH), 8,9 (d,1H), 8,05 (d,1H), 7,3 (m,2H), 3,55 (m,4H), 3,0 (t,4H), ' 2,8 (q,4H), 1,15 (t,6H).

35 49 103575

Esimerkki 24 6.9- bis-f Γ 2- (propvvliaminol etvvlil amino!bentsoΓσΐ isokino-liini-5.10-dioni flOol 5 Liuos, jossa oli N-propyylietyleenidiamiinia (403 mg, 4,0 mmoolia) pyridiinissä (1 ml), lisättiin seokseen, jossa oli yhdistettä 9 (98 mg, 0,40 mmoolia) pyridiinissä (Imi). Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 24 tuntia ja se konsentroitiin hitaassa typpivirtauksessa.

10 Jäännöksenä saatua ainetta pidettiin tyhjössä yön yli. Jäännökseen lisättiin jäävettä ja vesikerros uutettiin kloroformilla (5x40 ml). Uutteet kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja kloroformi poistettiin pyöröhaihduttimella. Sininen, kiinteä aine puhdistettiin pylväskromatografi-15 sesti piihappogeelillä. Eluointiaineena käytettiin aluksi seosta, jossa oli 5 % metanolia ja 95 % kloroformia, ja sen jälkeen metanolimäärää lisättiin vähitellen 10 %:iin, 20 %:iin, 30 %:iin, 40 %:iin ja 50 %:iin. Haluttu yhdiste eluoitiin käyttäen seosta, jossa oli 60 % metanolia ja 40 20 % kloroformia ja joka sisälsi vähän ammoniumhydroksidia.

Poistamalla eluointiaine saatiin 50 mg (30 %) tuotetta 10ο, sul.p. 105-106 °C. ’HNMR (CDCl3) : 11,15 (m,lH), 11,05 (m,1H), 9,6 (s,1H), 8,9 (d,lH), 8,10 (d,lH), 7,3 (m,2H), 3,6 (m,m,4H), 3,0 (t,4H), 2,75 (t,4H), 1,6 (m,4H,H20:n 25 piikki lisätty), 0,95 (t,6H).

• · • · · · • Esimerkki 25 6.9- bisl Γ2- (isopropvvliaminol etvvlil amino!bentsoToi isoki-noliini-5.10-dioni flQp! 30

Liuos, jossa oli N-isopropyylietyleenidiamiinia (450 mg, • ♦ · 4,5 mmoolia) pyridiinissä (2 ml), lisättiin seokseen, • · · *. jossa oli yhdistettä 9. (110 mg, 0,45 mmoolia) pyridiinis- : sä (1 ml). Silmänräpäyksessä tuloksena oli permanganaatin 35 kaltainen väri. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 40 tuntia. Pyridiini ja ylimääräinen diamiini poistettiin hitaassa typpivirtauksessa ja jäännöstä pidettiin tyhjös- 103575 50 sä yön yli. Lisättiin kloroformia (20 ml) ja sen jälkeen jäävettä. Koska sininen väri oli vesikerroksessa, se uutettiin kloroformilla (4x25 ml). Yhdistetyt uutteet kuivattiin MgSO,:llä ja kloroformi poistettiin pyöröhaihdut-5 timella. Saatu sininen, kiinteä aine puhdistettiin pyl-väskromatografisesti piihappogeelillä käyttäen eluointi-aineena ensin kloroformia ja sen jälkeen seoksia, joissa metanolin määrä kloroformissa asteittain muuttui, ollen 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 40 % ja 50 %. Haluttu tuote eluoitiin 10 pylväästä seoksella, jossa oli 50 % metanolia, 49 % kloroformia ja 1 % ammoniumhydroksidia. Poistamalla eluoin-tiaineet saatiin 56 mg (30 %) haluttua tuotetta lOp. sul. p. 136-137 °C. ‘HNMR (CDC1,) : n,i (t,lH), 11,0 (t,lH), 9,6 (s,1H) , 8,9 (d,1H) , 8,1 (d,lH), 7,30 (m,2H), 3,6 (m, 15 4H), 3,0 (t,4H), 2,9 (m,2H), i,05 (d,6H).

• « • · • « • · ♦ « • « · • · « • · · ♦ · · « » ♦ ♦ · · • · · • · ·

Claims (18)

1. 51 103575
2. 1. Menetelmä terapeuttisesti vaikuttavien 5,9-bis-amino-bentso[g]isokinoliini-5,10-dionien valmistamiseksi, 5 joiden kaava I on O NH-R O NH-R jossa R on C^-C^-alkyyli-ORj tai C2-C4-alkyyli-NR2R3, joissa Rx on vety, -S(02)CH3 tai -CH2CH2OR4, R2 on H, C1-C6-alkyyli, -COOC(CH3)3, -CH2CH2OR4 tai -COCH3, R3 on H tai C^C^alkyyli 15 tai R2 ja R3 yhdessä typpiatomin kanssa, johon ne ovat sitoutuneet, muodostavat pyrrolidino-, morfolino- tai atsiridinorenkaan ja R4 on H tai -CH3, vapaina emäksinä tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa muodostettuina suoloina, tunnettu siitä, että 20 a) (i) pyridiini-3,4-dikarboksyylihappoanhydridi, jonka kaava on k oi> o ; l ... 30 saatetaan reagoimaan 1,4-difluoribentseenin kanssa, « · · *·’ * jolloin saadaan kaavan 8a tai 8b mukainen yhdiste • · · • t i OF F Il 1 COOH 1 « I I tai I N.s Jk F OF 8a 103575 52 ii) vaiheen i) tuote syklisoidaan savuavassa rikkihapossa korotetussa lämpötilassa, jolloin saadaan kaavan 9 mukainen yhdiste O F O F 10 9 ja iii) fluori korvataan lisäämällä kaavan R'-NH2 mukaista amiinia, jossa kaavassa R' tarkoittaa samaa kuin R, tai 15 b) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, jossa kaavassa R on C2-C4-alkyyli-NR2R3, R2 on -CH2CH2R4, jossa R4 tarkoittaa samaa kuin edellä, ja R3 on H, (i) kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on -(CH2)p-0S(02)CH3, jossa p on 2, 3 tai 4, saatetaan reagoimaan 20 kaavan H2N-(CH2 )q-0-E mukaisen yhdisteen kanssa, jossa E on trialkyylisilaani-, (dialkyyliJaryylisilaani-, formyy- li- tai asetyylisuojaryhmä ja q on 2, 3 tai 4, ja (ii) poistetaan suojaryhmä E, tai 25 c) kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, jossa J * ί kaavassa R-, on H, ;·; (i) kaavan II mukainen 6,9-difluoribentso[g]isokino- • ♦ ·*“· liini-5,10-dioni • · « · • 30 ° ? (II) : . O F 35 saatetaan reagoimaan kaavan H2N-(CH2) -N(C00R5 )R3 mukaisen yhdisteen kanssa, jossa R3 on vety tai Cx-C6-alkyyli, R5 on 53 103575 -C(CH3)3 ja p on 2, 3 tai 4, kaavan Ia mukaisen yhdisteen valmistamiseksi O NH-R’ 5 (la) O NH-R’ 10 jossa R' on -(CH2 )p-N(COOR5 )R3, ja ii) poistetaan ryhmä COOR5, ja haluttaessa d) poistetaan kohtien a) - c) mukaisesti saaduissa yhdisteissä mahdollisesti oleva suojaryhmä, ja 15 e) muodostetaan kohtien a) - d) mukaisesti saatujen yhdisteiden suola ja/tai solvatoidaan saatu yhdiste tai erotetaan sen isomeerit.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(amino)etyyli]ami-no}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola, edullisesti maleaattisuola tai hydrokloridisuola.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu m· m· m siitä, että valmistetaan 6,9-bis{ [2-(dimetyyliamino )etyy- • · I.I li]amino)bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola. • · » • · 1 2 3 · · 2 • · · 3
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2—(1'-pyrrolidino)etyy-: li]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola, : edullisesti maleaattisuola. 9 9
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(dietyyliamino)etyy-li]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola. 103575 54
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(4'-morfolino)etyy-li]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola.
8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6, 9-bis{[2-(1'-atsiridino)etyy-li]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola.
9. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-[(2-hydroksietyyli)-amino]etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola, edullisesti maleaattisuola.
10. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[3-(amino)propyyli]- amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola, edullisesti maleaattisuola.
11. 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[3-(dimetyyliamino)pro- pyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola.
12. 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[4-(amino)butyyli]ami- no}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola, edul-lisesti maleaattisuola. • · « · • · · • · ·
13. 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-[di(sek.-propyyli)- » · « *·’ amino] etyyli] amino}bentso[g] isokinoliini-5,10-dioni tai V * sen suola. "·. 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(metaanisulfonyyliok-si)etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola. 55 103575
14. 14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(2-hydroksietoksi)-etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola. 5
15. 15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(metyyliamino)etyy-li]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola, edullisesti hydrokloridisuola. 10
16. 16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(etyyliamino)etyyli] amino}bentso [g] isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola.
17. 17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 6,9-bis{[2-(n-propyyliamino)-etyyli]amino}bentso[g]isokinoliini-5,10-dioni tai sen suola. 20