ES2350711T3 - Derivados de camptotecina con actividad antitumoral. - Google Patents
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Abstract
Compuestos de fórmula general (I): **Fórmula** en la que: R es alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, sililalquilo; R1 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, aminoalquilo; R2 es hidrógeno, alcoxi, aminoalquilo, hidroxilo opcionalmente protegido con grupos acilo o grupos sililo; en los que los grupos alquilo, alcoxi o aminoalquilo pueden contener de 1 a 8 átomos de carbono, en una cadena lineal o ramificada; las sales farmacéuticamente aceptables, enantiómeros y diastereómeros de los mismos.
Description
La presente invención se refiere a nuevos derivados de camptotecina que tienen actividad antitumoral, a procedimientos para la preparación de los mismos, al uso de los mismos como fármacos antitumorales y a composiciones farmacéuticas que los contienen. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La camptotecina es un alcaloide extraído de Camptotheca acuminata (Nyssaceae), descrita por primera vez por Wall y Wani en 1966 (J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890). La camptotecina, aunque está dotada de una actividad antitumoral de amplio espectro, especialmente contra el tumor de colon y otros tumores sólidos y leucemias, no se usa en terapia por su elevada toxicidad, que se manifiesta particularmente en forma de cistitis hemorrágica, toxicidad gastrointestinal y mielosupresión.
Se han sintetizado numerosos análogos de camptotecina con el fin de obtener compuestos que tengan una baja toxicidad y una elevada solubilidad. Actualmente, se usan dos fármacos en la práctica clínica, concretamente CPT-11 y topotecán. Otros derivados, tales como belotecán, rubitecán, exatecán, gimatecán, pegamotecán, lurtotecán, karenitecina, afeletecán, homocamptotecina, diflomotecán, y muchos otros, se están sometiendo a experimentación clínica. El compuesto CPT-11 es un profármaco muy soluble para 10-hidroxi7-etilcamptotecina (comúnmente conocido como SN-38), aprobado para el tratamiento de muchos tumores sólidos y ascitis (colorrectal, piel, estómago, pulmón, cuello uterino, ovario, linfoma no Hodgkin).
El topotecán es un compuesto soluble en solución fisiológica, activo contra los tumores de pulmón, estómago, hígado, ovario, mama, próstata, esófago, recto, sarcomas de tejidos blandos, cabeza y cuello, glioblastoma y leucemias mielocíticas crónicas y agudas. El topotecán muestra, sin embargo, importantes efectos secundarios, tales como neutropenia y trombocitopenia.
El lurtotecán es un derivado más soluble, que tiene actividad en tumores del cuello, ovario, mama, colorrectal y microcitoma pulmonar. Sin embargo, el lurtotecán también tiene toxicidad hemática.
El rubitecán es un profármaco para el uso oral eficaz contra tumores del páncreas, ovario y mama.
La camptotecina y sus análogos, como sucede con todos los inhibidores de topoisomerasa I, son eficaces contra tumores resistentes a fármacos convencionales, incluyendo inhibidores de topoisomerasa II; mantienen altos niveles de topoisomerasa durante todo el ciclo celular; no inducen resistencia multifármaco (Pgo o MRP) o metabolismo de destoxificación mediado por la enzima.
Ahora, la investigación se centra en nuevos inhibidores de la topoisomerasa I que tienen una toxicidad menor que la de los fármacos usados actualmente.
Los derivados de camptotecina de anillo abierto muestran una alta unión a proteínas (en particular con albúmina) y una baja distribución en los tejidos tumorales. Como consecuencia, el producto se acumula en el cuerpo y los tumores se ven poco afectados.
Por el contrario, la alta lipofilia de la forma de lactona promueve la adhesión de derivados de camptotecina a las membranas celulares, particularmente eritrocitos, afectando a la relación de distribución de tejido/plasma. Por esta razón, la investigación se está centrando en dos estrategias alternativas: a) diseño de productos de baja unión a proteínas que sigan teniendo buena solubilidad; b) diseño de productos muy potentes que tengan efecto terapéutico incluso a dosis extremadamente bajas.
Las modificaciones en las posiciones 7, 9, 10 y 11 normalmente demostraron ser bien toleradas sin afectar a la estabilidad del complejo ternario ADN-Topoisomerasa I-camptotecina, cuya formación es responsable de la actividad antitumoral de los compuestos.
Los productos con configuración 20R demostraron ser inactivos o mucho menos activos que los productos con configuración 20S -que coincide con la configuración natural.
Como norma, las modificaciones en la posición 5 se consideran desfavorables para la formación del complejo ternario, mientras que se ha notificado que las modificaciones en los anillos de piridona D y E son perjudiciales para la actividad del producto.
En los documentos US5972955, US6214836 B1 y US6177439 B1, respectivamente, se desvelan análogos de camptotecina 5-sustituidos con sustituyentes 5-amino, 5-alquilo y 5alcoxi. Se establece que los compuestos poseen una potente actividad anticancerosa y actividad antiviral. En Heterocycles 1994, vol 38, páginas 81-94, se desvelan análogos de camptotecina modificados en el anillo A, el anillo B y el anillo C. Uno de los análogos desvelados en ese documento tiene un grupo alquilideno en la posición C-5. DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se refiere a derivados de camptotecina de fórmula general I:
en la que:
R es alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, sililalquilo;
R1 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, aminoalquilo;
5 R2 es hidrógeno, alcoxi, aminoalquilo, hidroxilo opcionalmente protegido; en los que los grupos alquilo, alcoxi o aminoalquilo pueden contener de 1 a 8, preferentemente de 1 a 4, átomos de carbono, en una cadena lineal o ramificada; las sales farmacéuticamente aceptables, isómeros, enantiómeros, diastereómeros de los mismos y mezclas correspondientes.
10 Los compuestos de la invención muestran una baja unión a proteínas y tienen una buena solubilidad y alta potencia incluso a dosis muy bajas. La ruta sintética preferida para la preparación de los compuestos de la invención se ilustra en el siguiente esquema y sustancialmente implica las siguientes etapas: a) protección de los grupos hidroxi precursores
15 b) derivatización en la posición 5 con hidrazina N,N-diprotegida c) conversión opcional del anillo de piridona en el anillo de tiopiridona d) eliminación de los grupos protectores con ciclación concomitante e) aromatización opcional del anillo de pirazol
En el Esquema, R, R1 y R2 tienen los significados descritos anteriormente, y PG es un grupo protector de hidroxi. 5 Preferentemente, los hidroxilos están protegidos por medio de grupos acilo fácilmente escindibles, preferentemente tricloroacetato y Troc, o grupos sililo, preferentemente trietilsililo.
La derivatización en la posición 5 con hidrazina protegida puede obtenerse por tratamiento del precursor con una base orgánica fuerte, tal como LiHMDS, y haciendo reaccionar el carbanión resultante con un aza dicarboxilato, tal como di-t-butoxi aza
10 dicarboxilato o dibenciloxi aza dicarboxilato. La conversión del anillo de piridona en el anillo de tiopiridona puede obtenerse por reacción con 2,4-disulfuro de 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,2,3,4ditiafosfetano (conocido comúnmente como reactivo de Lawesson) (Cava P.M. y col., Tetrahedron 1985, 41, 5061; Cherkasov RA y col. Tetrahedron 1985 41, 2567; Ghattas AAG y col., Sulfur Lett. 1982, 1, 69; Yde B y col., Tetrahedron 1984, 40, 2047) o con un reactivo
15 equivalente. Se prefiere reactivo de Lawesson. El propósito de la conversión opcional en tiopiridona es promover el cierre del anillo una vez que la hidrazina se ha desprotegido. Sin embargo, se ha observado que dicha reacción de cierre es espontánea e inmediata incluso sin la activación del carbonilo de la piridina, por ejemplo, en forma de tiocarbonilo.
20 Cuando los grupos protectores de hidroxi son sililos y los del nitrógeno son carbamatos, habitualmente se eliminan con ácido trifluoroacético. En un procedimiento alternativo, las etapas b) y c) pueden invertirse. Los compuestos de la invención se ensayaron en un ensayo de citotoxicidad en un amplio espectro de células tumorales. A modo de ejemplo, se indican los datos de citotoxicidad
sobre la línea celular NCI-H460 (cáncer NSCL) referentes a dos compuestos de fórmula (I), usando camptotecina y los fármacos Topotecán y SN-38 como referencias:
- Nombre
- Fórmula NCl-H460 CI50 (µg/ml) Recuento de células
- Camptotecina
- PF = 348,36 C20H16N2O4 0,115 ± 0,0174
- Topotecán
- PF = 421 C23H23N3O5 0,63 ± 0,44
- SN38
- PF = 392,42 C22H20N2O5 0,0865 ± 0,0049
- IDN 6132
- PF = 363,38 C20H17N3O4 17 ± 4,25
- IDN 6137
- PF = 358,36 C20H14N4O3 3,8 ± 1,08
Los compuestos más activos se evaluaron en un ensayo de escisión de ADN midiendo la concentración activa y la persistencia del daño (véase la sección "Ejemplos"). Sorprendentemente, los derivados de fórmula (I) mostraron una mayor persistencia en el bloqueo de la replicación del ADN que los patrones de referencia (particularmente topotecán y camptotecina), manteniendo al mismo tiempo una actividad citotóxica eficaz.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de fórmula (I) junto con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral o parenteral de los compuestos (I) pueden ser sólidas, preferentemente cápsulas, comprimidos y gránulos, o líquidas, preferentemente soluciones inyectables o para infusión.
Los compuestos formulados adecuadamente de la invención pueden usarse para el tratamiento de tumores sólidos y leucemias, en particular tumores de pulmón, ovario, mama, estómago, hígado, próstata, sarcomas de tejidos blandos, cabeza y cuello, esófago, páncreas, colon, recto, glioblastoma y leucemias mielocíticas crónicas y agudas. EJEMPLOS EJEMPLO de Referencia I -20-OTES-camptotecina
Se suspendió camptotecina (0,100 g, 0,287 mmol) en dimetilformamida anhidra (3 ml), en una atmósfera inerte, y a la suspensión resultante se le añadió imidazol (0,980 g, 1,44 mmol). La mezcla se agitó durante 10 minutos y después se le añadió gota a gota cloruro de trietilsililo (TES-Cl) (0,193 ml, 1,15 mmol), seguido de la adición de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,040 g 0,287 mmol). Después de 46 h, la mezcla de reacción se evaporó al vacío, (control por TLC de la completa desaparición del reactivo, eluyente CH2Cl2/MeOH = 30/1). Posteriormente, el sólido se disolvió de nuevo en CH2Cl2 y se lavó con H2O y NH4Cl saturado. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 x 10 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío, obteniendo de esta manera el producto deseado (0,133 g, 0,287 mmol) en forma de un sólido de color amarillo pálido.
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,37 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,25 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,92 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,82 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,65 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,57 (s, 1 H, H14), 5,67 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,29 (s, 2 H, H-5), 5,25 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 2,001,84 (m, 2 H, H-19), 1,03-0,93 (m, 12 H), 0,80-0,71 (m, 6 H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 171,7, 157,6, 152,5, 151,5, 149,0, 145,9, 130,9, 130,4, 130,0, 128,4, 128,1, 128,0, 127,9, 118,9, 94,4, 75,3, 66,0, 50,0, 33,2, 7,9, 7,2, 6,4. EJEMPLO de Referencia II -Preparación de 5-di-t-butoxicarbonilhidrazino-20-OTEScamptotecina
La camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) se disolvió en THF anhidro (6 ml) con
agitación en una atmósfera inerte, después se enfrió a una temperatura de -78ºC y se le añadió gota a gota una solución 1,0 M de LiHMDS en THF (0,281 ml, 0,281 mmol). Después de 20 min, se añadió azodicarboxilato de di-terc-butilo (DTBAC) (0,075 g, 0,324 mmol) en THF anhidro (2 ml). Después de 4 h a -78ºC, la desaparición del reactivo se controló por TLC (Hexano/EtOAc = 3/1). Se observó la formación de los dos diastereómeros. La reacción se interrumpió mediante la adición de NH4Cl saturado. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3 x 15 ml) y las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Hexano/EtOAc = 3/1), obteniendo de esta manera una mezcla de los dos isómeros (0,145 g, 0,210 mmol, 97%). Los dos isómeros se separaron mediante una cromatografía adicional. En orden de elución:
1er
diastereómero: RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,80 (s a, 1 H, Ar), 8,23 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 8,01 (d a, 1 H, Ar), 7,90-7,71 (m, 2 H, Ar), 7,70-7,45 (m, 2 H, Ar + H-14), 6,52 (s a, 1 H, H-5), 5,61 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 5,23 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 2,031,81 (m, 2 H, H-19), 1,79-1,08 (s a, 18 H), 1,06-0,92 (m, 12 H), 0,80-0,70 (m, 6 H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 171,7, 157,8, 155,5, 155,5, 152,0, 152,0, 151,2, 149,4, 145,0, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,7, 81,5, 79,7, 75,2, 65,7, 33,2, 28,3, 27,6, 7,7, 7,2, 6,4. 2º diastereómero: RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,79 (s a, 1 H, Ar), 8,23 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 8,01 (d a, 1 H, Ar), 7,85-7,76 (m, 2 H, Ar), 7,65 (t a, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,52 (s, 1 H, H-14), 6,54 (s a, 1 H, H-5), 5,61 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 5,22 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 2,03-1,82 (m, 2 H, H-19), 1,76-1,08 (s a, 18 H), 1,04-0,92 (m, 12 H), 0,80-0,70 (m, 6 H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 171,5, 157,9, 155,5, 155,5, 152,3, 152,0, 151,2, 149,4, 145,1, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7,128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,9, 81,5, 79,6, 75,2, 65,8, 33,3, 28,3, 27,4, 7,8, 7,2, 6,4.
1er
Se disolvió 5-di-t-butoxicarbonilhidrazino-20-OTES-camptotecina (0,050 g, 0,072 mmol), primer diastereómero, en THF anhidro (4 ml) con agitación en una atmósfera inerte y posteriormente se le añadió gota a gota Et3N·3HF (0,088 ml, 0,542 mmol). La mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 35 h a temperatura ambiente, controlando por TLC la desaparición del reactivo (Hexano/EtOAc = 3/2). El disolvente se retiró por evaporación al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Hexano/EtOAc = 3/2), obteniendo de esta manera el compuesto deseado (0,041 g, 0,071 mmol, 98%) en forma de un sólido de color amarillo pálido.
El producto se purificó adicionalmente por cristalización en CH2Cl2/Pentano = 1/50.
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,77 (s a, 1 H, Ar), 8,16 (d a, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,97 (s a, 1 H, Ar), 7,86-7,50 (m, 4 H, Ar), 6,51 (s a, 1 H, H-5), 5,66 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,24 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 3,86 (s a, 1 H, OH), 2,00-1,80 (m, 2 H, H-19), 1,79-1,13 (s a, 18 H), 1,03 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 173,7, 157,9, 155,5, 155,5, 152,1, 151,3, 150,7, 149,6, 145,7, 132,3, 130,7, 129,9, 128,7, 127,9, 127,6, 120,0, 97,9, 82,8, 81,6, 79,7, 72,7, 66,1, 31,8, 28,3, 27,7, 7,7. EJEMPLO de Referencia IV -Preparación del 2º diastereómero de 5-di-tbutoxicarbonilhidrazino-20-OH-camptotecina
Se disolvió 5-di-t-butoxicarbonilhidrazino-20-OTES-camptotecina (0,050 g, 0,072 mmol), 2º diastereómero, en THF anhidro (4,5 ml) con agitación en una atmósfera inerte y posteriormente se le añadió gota a gota Et3N·3HF (0,088 ml, 0,542 mmol). La mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 35 h a temperatura ambiente, controlando por TLC la desaparición del reactivo (Hexano/EtOAc = 3/2). El disolvente se retiró por evaporación al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Hexano/EtOAc = 3/2), obteniendo de esta manera el compuesto deseado (0,040 g, 0,069 mmol, 96%) en forma de un sólido de color amarillo pálido.
El producto se purificó adicionalmente por cristalización en CH2Cl2/Pentano = 1/50.
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,79 (s a, 1 H, Ar), 8,22 (d a, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,99 (s a, 1 H, Ar), 7,88-7,50 (m, 4 H, Ar), 6,53 (s a, 1 H, H-5), 5,65 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,26 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 3,80 (s a, 1 H, OH), 2,00-1,80 (m, 2 H, H-19), 1,79-1,13 (s a, 18 H), 1,03 (t, 3 H, J = 7,2 Hz, Me). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 173,6, 157,9, 155,4, 155,4, 152,1, 151,3, 150,8, 149,5, 145,6, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7, 127,9, 127,8, 119,8, 98,0, 83,0, 81,5, 79,7, 72,7, 66,3, 31,8, 28,3, 27,7, 7,8. EJEMPLO de Referencia V -Preparación de 5-dibenciloxicarbonilhidrazino-20-OTEScamptotecina
La camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) se disolvió en THF anhidro (6 ml) con agitación en una atmósfera inerte, después se enfrió a una temperatura de -78ºC y se le añadió gota a gota una solución 1,0 M de LiHMDS en THF (0,281 ml, 0,281 mmol). Después de 20 min, se añadió azodicarboxilato de dibencilo (0,097 g, 0,324 mmol) en THF anhidro (2 ml). Después de 3 h a -78ºC, se dejó que la temperatura alcanzara 25ºC y la desaparición del reactivo se controló por TLC (Hexano/EtOAc = 3/1). Se observó la formación de dos diastereómeros. Después de 90 min a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió mediante la adición de NH4Cl saturado. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3 x 15 ml) y las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Hexano/EtOAc = 4/1 y después 7/2), obteniendo de esta manera un sólido de color amarillo pálido (0,161 g, 0,212 mmol, 98%). Los dos isómeros se separaron mediante una cromatografía adicional. En orden de elución:
1er
diastereómero: RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,70 (s a, 1 H, Ar), 8,39 (s a, 1 H, Ar), 8,22 (d a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,95 (d a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,83 (t a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,65 (t a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,64-7,00 (m, 11 H, Ar + H-14), 6,49 (s a, 1 H, H-5), 5,57 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,47-4,44 (m, 5 H), 1,98-1,82 (m, 2 H, H-19), 1,02-0,89 (m, 12 H), 0,80-0,70 (m, 6 H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 171,6, 158,0, 156,3, 156,3, 153,0, 152,2, 151,0, 149,6, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 130,0, 128,6-127,8 (11 C), 119,9, 98,4, 79,5, 75,2, 68,4, 67,9, 65,6, 33,0, 7,9, 7,2, 6,4. 2º diastereómero: RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,85 (s a, 1 H, Ar), 8,58 (s a, 1 H, Ar), 8,20 (s a, 1 H, Ar), 7,93 (s a, Ar), 7,81 (t a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,63 (t a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,56-6,90 (m, 11H, Ar + H-14), 6,52 (s a, 1 H, H-5), 5,55 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 5,44-4,71 (m, 5 H), 1,98-1,80 (m, 2 H, H-19), 1,05-0,90 (m, 12 H), 0,81-0,70 (m, 6 H). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 171,5, 157,9, 156,4, 156,4, 152,9, 152,4, 150,9, 149,4, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 129,9, 128,6-127,8 (11 C), 119,9, 98,5, 79,3, 75,2, 68,4, 67,8, 65,6, 32,9, 7,8, 7,2, 6,4.
1er
1er
Se disolvió el diastereómero de 5-dibenciloxicarbonilhidrazino-20-OTEScamptotecina (0,140 g, 0,184 mmol) en THF anhidro (6 ml) con agitación en una atmósfera inerte y posteriormente se le añadió gota a gota Et3N·3HF (0,225 ml, 1,380 mmol). La mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 52 h a temperatura ambiente, controlando por TLC la desaparición del reactivo (Hexano/EtOAc = 1/3). El disolvente se retiró por evaporación al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Hexano/EtOAc = 1/1 y después 2/3), obteniendo de esta manera (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) el compuesto deseado en forma de un sólido de color amarillo pálido. El producto se purificó adicionalmente por cristalización en CH2Cl2/Pentano = 1/50.
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,67 (s a, 1 H, Ar), 8,39 (s a, 1 H, Ar), 8,12 (d a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,95 (s a, 1 H, Ar), 7,74 (t a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,65-6,66 (m, 12 H, Ar + H-14), 6,48 (s a, 1 H, H-5), 5,55 (d, 1 H, J = 16,0 Hz, H-17), 5,42-4,44 (m, 5 H), 3,86 (s a, 1 H, OH), 1,92-1,72 (m, 2 H, H-19), 0,95 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 173,5, 158,0, 156,2, 156,0, 153,0, 150,9, 150,9, 149,5, 145,3, 135,4, 132,2, 130,7, 129,8, 128,7-127,8 (11 C), 119,9, 98,2, 79,6, 72,7, 68,5, 68,0, 65,9, 31,6, 7,8.
Se disolvió el 2º diastereómero de 5-dibenciloxicarbonilhidrazino-20-OTEScamptotecina (0,140 g, 0,184 mmol) en THF anhidro (6 ml) con agitación en una atmósfera inerte y posteriormente se le añadió Et3N·3HF (0,150 ml, 0,921 mmol). La mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 55 h a temperatura ambiente, controlando por TLC la desaparición del reactivo (Hexano/EtOAc = 3/2). El disolvente se retiró por evaporación al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Hexano/EtOAc = 1/1), obteniendo de esta manera el compuesto deseado (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) en forma de un sólido de color amarillo pálido. El producto se purificó adicionalmente por cristalización en CH2Cl2/Pentano = 1/50.
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,71 (s a, 1 H, Ar), 8,34 (s a, 1 H, Ar), 8,18 (s a, 1 H, Ar), 7,94 (s a, 1 H, Ar), 7,79 (t a, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,70-6,70 (m, 12 H, Ar + H-14), 6,52 (s a, 1 H, H-5), 5,53 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 5,44-4,48 (m, 5 H), 3,87 (s a, 1 H, OH), 1,90-1,70 (m, 2 H, H-19), 0,99 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 173,4, 158,0, 156,3, 156,1, 153,0, 151,0, 150,9, 149,6, 145,3, 135,5, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7-127,8 (11 C), 119,8, 98,4, 79,5, 72,7, 68,5, 67,8, 66,0, 31,6, 7,7. EJEMPLO VIII -Preparación de sal TFA de 4,5-dihidro-triazolo[5,4-c]16adesoxocamptotecina
Se disolvió 5-di-t-butoxicarbonilhidrazino-20-OTES-camptotecina (0,225 g, 0,324 mmol, mezcla diastereomérica 1:1) en 1,2-dicloroetano anhidro (DCE) (8 ml) con agitación en una atmósfera inerte y posteriormente se le añadió gota a gota ácido trifluoroacético (TFA) (0,895 ml, 11,67 mmol). La mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 20 h a temperatura ambiente, controlando por TLC la desaparición del reactivo (Hexano/EtOAc = 1/3), y después se calentó a reflujo durante 4 h. El disolvente se retiró por evaporación al vacío y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 30/1), obteniendo de esta manera el compuesto deseado (0,084 g, 0,178 mmol, 55%) en forma de la sal trifluoroacetato. La mezcla 1:1 de los dos diastereómeros se purificó adicionalmente por cromatografía ultrarrápida (SiO2, Tolueno/EtOAc = 1/1).
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 10,61 (s a, 0,5 H, N5-NH=C16a), 10,39 (s a, 0,5 H, N5NH=C16a), 8,67 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,22-8,15 (m, 1 H, Ar), 7,96-7,92 (m, 1 H, Ar), 7,88-7,78 (m, 1 H, Ar), 7,69-7,60 (m, 2 H, Ar), 6,38-6,36 (m, 1 H, Ar, H-5), 5,72-5,62 (m, 1 H, Ar, H-17), 5,325,20 (m, 2 H, Ar, H-17 + N5H), 4,08-3,86 (s a, 1 H, OH), 1,96-1,74 (m, 2 H, H-19), 1,05-0,98 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 173,8 (0,5 C), 173,4 (0,5 C), 159,1, 159,0, 156,7 (c, CF3COOH), 156,5 (c, CF3COOH) 151,5, 151,3, 150,7, 150,5, 150,1, 149,9, 144,8, 144,7, 134,0, 133,8, 131,6, 131,5, 129,9, 129,8, 128,7, 128,7, 128,4, 128,4, 128,2, 128,2, 127,1, 126,9, 120,5, 120,3, 99,1 (2 C), 78,9, 78,6, 72,7, 72,7, 66,0 (2 C), 31,7 (2 C), 7,7, 7,7.
EJEMPLO IX -Preparación de triazolo[5,4-c]16a-desoxocamptotecina
La sal TFA de 4,5-dihidro-triazolo[5,4-c]16a-desoxocamptotecina (0,020 g, 0,042 mmol) se disolvió en CH2Cl2 anhidro (4 ml) con agitación en una atmósfera inerte y posteriormente se le añadió gota a gota 2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona (DDQ) (0,025 mg, 0,110 mmol). La mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 31 h a temperatura ambiente, controlando por TLC la desaparición del reactivo (CH2Cl2/MeOH = 30/1). La reacción se interrumpió mediante la adición de H2O. La fase acuosa se extrajo con CH2Cl2 (3 x 15 ml) y las fases orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 45/1), obteniendo de esta manera un sólido de color amarillo (0,014 g, 0,039 mmol, 94%).
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 8,89 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,20 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 8,00 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,88 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,79 (s, 1 H, Ar H-14), 7,69 (t, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 5,70 (d, 1 H, J = 17,2 Hz, H-17), 5,28 (d, 1 H, J = 17,2 Hz, H-17), 3,83 (s a, 1 H, OH), 2,001,74 (m, 2 H, H-19), 1,08 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me). RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 172,6, 157,4, 152,5, 150,8, 148,9, 143,7, 134,9, 132,5, 132,4, 130,0, 129,5, 128,7, 127,5, 122,6, 121,4, 101,2, 72,4, 66,0, 31,6, 7,7. EJEMPLO X -Ensayo de inhibición del crecimiento celular
Se cultivaron células H460 de tumor de pulmón de células grandes en medio RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 10%. La sensibilidad de las células se determinó por un ensayo de inhibición del crecimiento celular después de 1 ó 72 h de exposición a fármaco. Las células en crecimiento logarítmico se recogieron y se sembraron por duplicado en placas de 6 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se expusieron a los fármacos y se contaron con un contador Coulter 72 horas después de la exposición a los fármacos para la determinación de los valores de CI50. CI50 se define como la concentración inhibidora del 50% del crecimiento celular en comparación con el crecimiento de controles no tratados. EJEMPLO XI -ensayo de ruptura de ADN dependiente de Topoisomerasa I
Las rupturas de ADN se determinaron usando un gel purificado ADN de SV40 BamHI-EcoRI 751-bp (Beretta GL, Binaschi M, Zagni AND, Capuani L,Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain. Cancer Res 1999; 59:3689-97). Los fragmentos de ADN sólo se marcaron en 3'. La reacción de ruptura de ADN (20.000 cpm/muestra) se realizó en 20 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, 15 µg/ml de BSA, tiotreitol 0,1 mM y la enzima recombinante humana (top1 de longitud completa) durante 30 min a 37ºC. Las reacciones se
bloquearon usando SDS al 0,5% y 0,3 mg/ml de proteinasa K durante 45 min a 42ºC. La
persistencia del daño en el ADN se ensayó en momentos diferentes añadiendo NaCl 0,6 M
después de 30 min de incubación con una concentración 10 µM del fármaco. Después de la
5 precipitación, el ADN se resuspendió en tampón de desnaturalización (formamida al 80%,
NaOH 10 mM, EDTA 0,01 M y 1 mg/ml de colorante) antes de sembrarse en gel
desnaturalizante (poliacrilamida al 7% en tampón TBE). Todos los niveles de ruptura de ADN
se midieron por medio de un PhosphoImager modelo 425 (Molecular Dynamics) (Dallavalle S,
Ferrari A, Biasotti B, y col. Novel 7-oxyiminomethyl camptothecin derivatives with potent in vitro 10 and in vivo antitumor activity. J Med Chem 2001; 44:3264-74).
Persistencia del daño en el ADN (%)
- Compuestos
- Tiempo (min)
- 0
- 1 5 10
- Topotecán
- 100 65 20 10
- Camptotecina
- 100 58 23 20
- SN38
- 100 60 33 28
- IDN 6132
- 100 45 32 20
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Compuestos de fórmula general (I):
imagen1 5 en la que: R es alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, sililalquilo; R1 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, aminoalquilo; R2 es hidrógeno, alcoxi, aminoalquilo, hidroxilo opcionalmente protegido con grupos acilo o grupos sililo;10 en los que los grupos alquilo, alcoxi o aminoalquilo pueden contener de 1 a 8 átomos de carbono, en una cadena lineal o ramificada; las sales farmacéuticamente aceptables, enantiómeros y diastereómeros de los mismos. - 2. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1, que se selecciona15 entre el grupo que consiste en: a) 4,5-dihidro-triazolo[5,4-c]16a-desoxocamptotecina, b) triazolo[5,4-c]16a-desoxocamptotecina.
- 3. Un procedimiento para la preparación de los compuestos de fórmula (I), comprendiendo 20 el procedimiento sustancialmente las etapas (a)-(e) que se muestran en el siguiente esquema:
imagen1 imagen1 en el que: a) protección de los grupos hidroxi precursores; b) derivatización en la posición 5 con hidrazina N,N-diprotegida;5 c) conversión opcional del anillo de piridona en el anillo de tiopiridona; d) eliminación de los grupos protectores con ciclación concomitante; e) aromatización opcional del anillo de pirazol;y en el que R, R1 y R2 tienen los significados definidos anteriormente, mientras que PG es un grupo protector de hidroxi.10 - 4. El procedimiento para la preparación de compuestos de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 3, en el que se invierte el orden de las etapas (b) y (c).
- 5. Una composición farmacéutica que contiene un compuesto de fórmula (I) junto con 15 vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.
- 6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, que está en una forma adecuada para la administración oral o parenteral.20 7. El uso de un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o de una composición de acuerdo con las reivindicaciones 5-6 para la preparación de un fármaco para el tratamiento de tumores.
- 8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho fármaco se usa para el 5 tratamiento de tumores sólidos y leucemias.
- 9. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 7 y 8, en el que los tumores sólidos y leucemias se seleccionan entre tumores de pulmón, ovario, mama, estómago, hígado, próstata, sarcomas de tejidos blandos, esófago, páncreas, cabeza y cuello, glioblastoma y10 leucemias mielocíticas crónicas y agudas.
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