PT2044078E - Derivados da camptotecina com actividade antitumoral - Google Patents

Description

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Descrição "DERIVADOS DA CAMPTOTECINA COM ACTIVIDADE ANTITUMORAL" A presente invenção refere-se a novos derivados da camptotecina com actividade antitumoral, bem como aos processos para a respectiva preparação, ao seu uso como fármacos antitumorais e às composições farmacêuticas que os contêm.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A camptotecina é um alcaloide extraído da Camptotheca acuminata (Nyssaceae), inicialmente descrito por Wall e Wani em 1966 (J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890). A camptotecina, embora dotada de um amplo espectro de actividade antitumoral, especialmente nos casos de tumores do cólon, bem como de outros tumores sólidos e leucemias, não é utilizada na terapia devido à sua elevada toxicidade, a qual se manifesta, particularmente, sob a forma de cistites hemorrágicas, toxicidade gastrointestinal e mielossupressão. Têm sido sintetizados vários análogos da camptotecina a fim de obter compostos que apresentem baixa toxicidade e elevada solubilidade. Actualmente são utilizados na prática clínica dois fármacos: o CPT-11 e o topotecano. Outros derivados, tais como o belotecano, rubitecano, exatecano, gimatecano, pegamotecano, lurtotecano, karenitecina, afeletecano, homocamptotecina, diflomotecano e muitos outros, estão a ser submetidos a ensaios clínicos. O composto CPT-11 é um pró-fármaco de elevada solubilidade para a 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (geralmente conhecido por SN-38), aprovado para o tratamento de muitos tumores sólidos e ascites (colo-rectal, pele, estômago, pulmão, colo uterino, ovário, linfoma não-Hodgkin). O topotecano é um composto solúvel em soro fisiológico, activo contra tumores do pulmão, estômago, 2 fígado, ovário, mama, próstata, esófago, recto, sarcomas de tecidos moles, cabeça e pescoço, glioblastoma e leucemias mielóides agudas e crónicas. No entanto, o topotecano apresenta importantes efeitos secundários, tais como a neutropenia e a trombocitopenia. 0 lurtotecano é um derivado mais solúvel, com actividade em tumores do pescoço, ovário, mama, colo-rectal e carcinoma pulmonar microcítico. Contudo, o lurtotecano também apresenta hematotoxicidade. 0 rubitecano é um pró-fármaco para uso oral, eficaz contra tumores do pâncreas, do ovário e da mama. A camptotecina e seus análogos, como é o caso de todos os inibidores da topoisomerase tipo I, são eficazes contra os tumores resistentes aos fármacos convencionais, incluindo os inibidores da topoisomerase tipo II, mantêm elevados níveis de topoisomerase durante todo o ciclo celular e não induzem nem uma resistência multifármaco (Pgo ou MRP) nem a destoxificação metabólica regulada pela enzima. A pesquisa centra-se, agora, nos novos inibidores da topoisomerase I que apresentam uma menor toxicidade relativamente aos fármacos utilizados actualmente.

Os derivados da camptotecina de anel aberto apresentam uma elevada capacidade de ligação às proteínas (em particular a albumina) e baixa distribuição nos tecidos tumorais. Em consequência, o produto acumula-se no organismo e os tumores são pouco afectados.

Pelo contrário, a elevada lipofilicidade da forma lactona promove a adesão dos derivados da camptotecina às membranas celulares, particularmente dos eritrócitos, afectando a relação de distribuição tecido/plasma. Por esta razão, a investigação está a incidir em duas estratégias alternativas: a) desenvolvimento de produtos de baixa ligação às proteínas mas mantendo uma boa solubilidade; b) desenvolvimento de produtos muito potentes, que tenham um 3 efeito terapêutico mesmo quando administrados em doses extremamente baixas.

As modificações nas posições 7-, 9-, 10- e 11- provaram, geralmente, ser bem toleradas, sem afectar a estabilidade do complexo ternário ADN-Topoisomerase I-camptotecina, cuja formação é responsável pela actividade antitumoral dos compostos.

Os produtos com configuração 20R provaram ser inactivos ou muito menos activos do que os produtos com configuração 20S, que é a configuração natural.

Por norma, as modificações na posição 5 consideram-se desfavoráveis para a formação do complexo ternário, enquanto as modificações nos anéis D e E da piridona são prejudiciais para a actividade do produto.

Os análogos da camptotecina com substituição na posição 5 por grupos amino, alquilo e alcoxi estão descritos nas publicações US5972955, US6214836 BI e US6177439 Bl, respectivamente. Os compostos possuem uma potente actividade anticancerígena e antiviral. Os análogos da camptotecina com modificações nos anéis A, B e C estão descritos no Heterocycles 1994, vol 38, páginas 81-94. Um dos análogos descrito nesse documento apresenta um grupo alquilideno na posição C5.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a invenção refere-se a derivados da camptotecina com a fórmula geral I: 4

(D em que: R é alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, sililalquilo; RI é hidrogénio, hidroxi, alcoxi, aminoalquilo; r2 é hidrogénio, alcoxi, aminoalquilo, hidroxilo opcionalmente protegido; em que os grupos alquilo, alcoxi e aminoalquilo podem conter 1 a 8, de preferência 1 a 4, átomos de carbono, numa cadeia linear ou ramificada; os sais farmaceuticamente aceitáveis, isómeros, enantiómeros, diastereómeros dos mesmos e respectivas misturas.

Os compostos da invenção apresentam uma baixa ligação às proteínas, boa solubilidade e elevada potência, mesmo em doses muito baixas. A rota de síntese preferida para a preparação dos compostos da invenção está ilustrada no esquema abaixo e envolve essencialmente os seguintes passos: a) protecção dos grupos precursores hidroxi b) derivatização em 5- com hidrazina N,N-diprotegida c) conversão opcional do anel piridona em anel tiopiridona d) remoção dos grupos protectores com a ciclização concomitante e) aromatização opcional do anel pirazol 5

a)

b)

R1 R „ -NHBoc BocN

<»)

e)

No esquema, R, RI e R2 têm os significados acima descritos e PG é um grupo protector de hidroxi.

De preferência, os hidroxilos estão protegidos por meio de grupos acilo facilmente cliváveis, de preferência tricloroacetato e Troe, ou por grupos sililo, de preferência trietilsililo. conhecido como A derivatização na posição 5- com hidrazina protegida pode ser obtida tratando o precursor com uma base orgânica forte, como a LiHMDS, e fazendo reagir o carbanião resultante com um aza dicarboxilato, como o di-t-butoxi-aza-dicarboxilato ou dibenziloxi-aza-dicarboxilato. A conversão do anel piridona em anel tiopiridona pode ser obtida pela reacção com o 2,4-bis(4-metoxifenil)-1,2,3,4-ditiofosfatano-2,4-dissulfureto (mais 1 6 reagente de Lawesson) (Cava P.M. et al., Tetrahedron 1985, 41, 5061; Cherkasov RA et al Tetrahedron 1985 41, 2567; Ghattas AAG et al, Sulfur Lett. 1982, 1, 69; Yde B et al, Tetrahedron 1984, 40. 2047) ou com um reagente equivalente. Dá-se preferência ao reagente de Lawesson. O objectivo da conversão opcional para tiopiridona é promover o fecho do anel logo que a hidrazina fique desprotegida. No entanto, tem sido observado que essa reacção de fecho ocorre de forma espontânea e imediata, mesmo sem a activação do carbonilo da piridina, por exemplo, como tiocarbonilo.

Quando os grupos protectores de hidroxi são sililos e os de azoto são carbamatos, utiliza-se geralmente o ácido trifluoroacético para os eliminar. Num procedimento alternativo, as etapas b) e c) podem ser invertidas.

Os compostos da invenção foram testados num ensaio de citotoxicidade, num amplo espectro de células tumorais. A titulo exemplificativo, indicam-se os dados de citotoxicidade sobre a linhagem celular NCI-H460 (carcinoma NSCL) referentes a dois compostos de fórmula (I), usando a camptotecina e os fármacos Topotecan e SN-38 como referência:

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Os compostos mais activos foram avaliados num ensaio de clivagem de ADN, medindo-se a concentração activa e a persistência dos danos (ver secção "Exemplos"). Surpreendentemente, os derivados da fórmula (I) mostraram uma maior persistência no bloqueio da replicação do ADN quando comparados com os padrões de referência (particularmente o topotecano e a camptotecina) , mantendo, ao mesmo tempo, uma actividade citotóxica eficaz.

Para além disso, a invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm um composto de fórmula (I) 8 juntamente com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As formas farmacêuticas adequadas para a administração oral ou parentérica dos compostos (I) podem ser sólidas, de preferência cápsulas, comprimidos e grânulos, ou líquidas, de preferência soluções injectáveis ou destinadas a perfusão.

Os compostos da invenção, formulados de forma adequada, podem ser usados no tratamento de tumores sólidos e leucemias, em particular os tumores de pulmão, ovário, mama, estômago, fígado, próstata, sarcomas de tecidos moles, da cabeça e do pescoço, esófago, pâncreas, cólon, recto, glioblastoma e leucemias mielóides crónicas e agudas.

EXEMPLOS EXEMPLO de Referência I - 20-OTES-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, a camptotecina (0,100 g, 0,287 mmol) é suspensa em dimetilformamida anidra (3 ml) e, à suspensão resultante, adiciona-se imidazol (0,980 g, 1,44 mmol). A mistura é agitada durante 10 minutos, após o que se adiciona cloreto de trietilsililo (TES-C1) (0,193 ml, 1,15 mmol) gota a gota, seguido de 4-dimetilamino-piridina (DMAP) (0,040 g 0,287 mmol). Após 46 h, a mistura da reacção é evaporada sob vácuo (controlo por TLC do total desaparecimento do reagente, eluente CH2Cl2/MeOH = 30/1). Em seguida, o sólido volta a ser dissolvido em CH2C12 e lavado com H20 e NH4C1 saturado. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (2 X 10 ml). As fases orgânicas são combinadas e secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo, obtendo-se, desta forma, o produto pretendido (0,133 g, 0,287 mmol) no estado sólido, de cor amarela pálida. RMN ΤΗ (CDC13, 400 MHz) δ 8,37 (s, 1 H, Ar, H-7), 8,25 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,92 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,82 (t, 1 H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,65 (t, 1 H, J = 8,4 Hz,

Ar), 7,57 (s, 1 Η, H-14), 5,67 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 9 5,29 (s, 2 Η, H-5), 5,25 (d, 1 H, J = 16,4 Hz, H-17), 2,00-1,84 (m, 2 Η, H-19), 1, 03-0, 93 (m, 12 H) , 0,80-0,71 (m, 6 H) . RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171,7, 157, 6, 152,5, 151,5, 149, 0. 145, 9, 130, 9, 130,4, 130, 0. 128,4, 128,1, 128,0. 127, 9, 118, 9, 94,4, 75, 3, 66, 0. 50, 0. 33, 2, 7, 9, 7,2, 6, 4. EXEMPLO de Referência II - Preparação da 5-di-t-butoxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, a camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) é dissolvida sob agitação em THF anidro (6 ml) e, em seguida, arrefecida até -78°C, após o que se junta, gota a gota, uma solução 1,0 M de LiHMDS em THF (0,281 ml, 0,281 mmol). Após 20 min, junta-se azodicarboxilato de di-terc-butilo (DTBAC) (0,075 g, 0,324 mmol) em THF anidro (2 ml) . Depois de permanecer 4 h a -78°C, o desaparecimento do reagente é monitorizado por meio de TLC (Hexano/EtOAc = 3/1). Observa-se a formação dos dois diastereómeros. A reacção é interrompida por adição de NH4CI saturado. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (3 x 15 ml) e as fases orgânicas são combinadas, secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/EtOAc = 3/1), obtendo-se, assim, uma mistura dos dois isómeros (0,145 g, 0,210 mmol, 97%). Os dois isómeros são separados por cromatografia adicional. Por ordem de eluição: 1° diastereómero: RMN ΤΗ (CDC13, 400 MHz) δ 8,80 (sl, 1 H, Ar), 8,23 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 8,01 (dl, 1 H, Ar), 7,90-7,71 (m, 2 H, Ar), 7,70-7,45 (m, 2 H, Ar + H-14), 6,52 (sl, 1 Η, H-5), 5,61 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 5,23 (d, 1 H, J = 16,8 Hz, H-17), 2,03-1,81 (m, 2 Η, H-19), 1,79-1,08 (sl, 18 H) , 1, 06-0, 92 (m, 12 H) , 0, 80-0,70 (m, 6 H) . RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171,7, 157,8, 155,5, 155,5, 152,0. 152,0. 151,2, 149,4, 145, 0. 132,1, 130, 6, 130,0. 128,7, 128,4, 127, 9, 119, 9, 98,2, 82,7, 81,5, 79, 7, 75, 2, 65, 7, 33,2, 28,3, 10 27, 6 , 7, 7, 7,2, 6, 4 • 2 ° diastereómero: RMN ΧΗ (CDCl 3, 400 MHz) δ 8 ,79 (s 1,1 H, Ar), 8,23 (d, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 8,01 (dl , 1 H, Ar) , 7,85-7,76 (m, 2 H, Ar) , 7, 65 (tl, 1 H, J = 8,4 Hz, Ar) , 7,52 (s, 1 H, H-14) , 6,54 (sl, 1 H, H- 5) , 5, 61 (d, 1 H, J = 16, 8 Hz, H -17) , 5,22 (d, 1 H, J = 16, 8 Hz, H-17) , 2, 03- 1, 82 (m, , 2 H, Η—19) , 1,7 6-1 , 08 (sl, 18 Η) , 1, 04-0, . 92 (: m, 12 H) , 0, , 80-0,70 (m, 6 H) . RMN 13C (CDC13, 100 MH; 2) δ 171 , 5, 157, 9, 155, 5, 155 ,5, 152, 3, 152,0. 151 ,2, 149, 4, 145, 1, 132,1 r 130 , 6, 130 . 0.12 8.7, 128,4, 127 . 9, i: 19.9, 98.2, 82 .9, 81 .5, 79.6 , 75 .2, 65, 8, 33,3 r 28,3, 27,4, 7,8, 7.2, 6, 4 . EXEMPLO de Referência III - Preparação do Ia diastereómero de 5-di-t-butoxicarbonil-hidrazino-20-OH-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, o primeiro diastereómero de 5-di-t-butoxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina (0,050 g, 0,072 mmol) é dissolvido sob agitação em THF anidro (4 ml), após o que se junta, gota a gota, Et3N*3HF (0,088 ml, 0,542 mmol). Deixa-se a mistura reagir durante 35 h à temperatura ambiente, sendo o desaparecimento do reagente (Hexano/EtOAc = 3/2) controlado por TLC. O solvente é evaporado sob vácuo e o resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/EtOAc = 3/2), obtendo-se, desta forma, o composto pretendido (0,041 g, 0,071 mmol, 98%) no estado sólido, de cor amarela pálida.

Em seguida, o produto é purificado por cristalização a partir de CH2Cl2/Pentano = 1/50. RMN 3H (CDCI3, 400 MHz) δ 8 1-1 co l> , 1 H, Ar) , 8, 16 (dl, . 1 H, J = 8,0 Hz, Ar) , 7 , 97 (sl, 1 H, Ar), 7,86- -7, 50 (m, 4 H, Ar) , 6 i, 51 (sl, 1 H, H-5) , 5,66 (d, 1 H, J = 16 ,4 Hz, H-17) , 5 ,24 (d, 1 H, J = 1 6,4 Hz, H-17), 3,86 (sl, 1 H, OH) , . 2,00 -1, 80 (m, 2 H, H- -19) , 1, 79-1,13 (sl, 18 H) , 1, 03 (t, 3 H, J = : 7, 6 Hz , Me ) · RMN 13c (CDCI3, 100 MHz) δ 173, 7, 11 157,9, 155,5, 155,5, 152,1, 151,3, 150,7, 149,6, 145,7, 132,3, 130,7, 129, 9, 128,7, 127, 9, 127, 6, 120,0. 97, 9, 82,8, 81,6, 79,7, 72,7, 66,1, 31,8, 28,3, 27,7, 7,7. EXEMPLO de Referência IV - Preparação do 2 a diastereómero de 5-di-t-butoxicarbonil-hidrazino-20-OH-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, o 2° diastereómero de 5-di-t-butoxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina (0, 050 g, 0,072 mmol) é dissolvido sob agitação em THF anidro (4,5 ml), após o que se junta, gota a gota, Et3N*3HF (0,088 ml, 0,542 mmol). Deixa-se a mistura reagir durante 35 h à temperatura ambiente, sendo o desaparecimento do reagente (Hexano/EtOAc = 3/2) controlado por TLC. O solvente é evaporado sob vácuo e o resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/EtOAc = 3/2), obtendo-se, desta forma, o composto pretendido (0,040 g, 0,069 mmol, 96%) no estado sólido, de cor amarela pálida.

Em seguida, o produto é purificado por cristalização a partir de CH2Cl2/Pentano = 1/50. RMN ΤΗ (CDC13, 400 MHz) δ 8 ,79 (sl , 1 H, Ar) OO 22 a 1—1 > 1 H, J = 8,4 Hz, Ar) , v , 99 (sl, 1 H, Ar) , 7,8 8-7, 50 (m, 4 H, Ar) r 6, 53 (sl, 1 H, H—5) , 5, 65 (d, 1 H, J = 16 ,4 Hz, H -17) , 5, 26 (d, 1 H, J = 1 6, 4 Hz, H—17), 3, 80 (sl , 1 H, OH) , 2,00 -1,* 50 (m, 2 Η, H- -19) , 1, 79-1 ,13 (s: L, 18 H) , 1, 03 (t, 3 H, J = 7 ,2 Hz , Me) . RMN 13c (CDCI3, 100 MHz) δ 173, 6, 157, 9 , 155,4 r 155, 4, 152, 151, 3, 150, 8, 149, 5, 145, 6, 132, 3 , i: 30,8 r 129, 8, 12 8, -7, 127 , 9, 127 ,8, 119 ,8, 98, 0. 83, 0 • 81, 5, 1 '9, 7, 72,7, 66, 3, OO \—1 OO , 28 ,3, 27, 7 7 ' f ' r 8. EXEMPLO de Referência V - Preparação da 5-dibenziloxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, a camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) é dissolvida sob agitação em THF anidro (6 ml) e, em seguida, arrefecida até -78°C, após o que se junta, gota a gota, uma solução 1,0 M de LiHMDS em 12 THF (0,281 ml, 0,281 mmol) . Após 20 min, junta-se azodicarboxilato de dibenzilo (0,097 g, 0,324 mmol) em THF anidro (2 ml). Depois de permanecer 3 h a -78°C, deixa-se a temperatura chegar aos 25°C e o desaparecimento do reagente é monitorizado por meio de TLC (Hexano/ EtOAc=3/l). Observa-se a formação dos dois diastereómeros. Após 90 min à temperatura ambiente, a reacção é interrompida pela adição de NH4C1 saturado. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (3 x 15 ml) e as fases orgânicas são combinadas, secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/EtOAc = 4/1 e depois 7/2), obtendo-se, desta forma, um produto no estado sólido, de cor amarela pálida (0,161 g, 0,212 mmol, 98%) . Os dois isómeros são separados por cromatografia adicional. Por ordem de eluição:

Ia diastereómero: RMN 3H (CDC13, 400 MHz; ) δ 8,70 (sl, 1 H, Ar), 8, 39 (sl 1 H, Ar), 8,22 (dl , 1 H, J = 7,6 Hz, Ar' ), 7,95 (dl, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar) , 7, 83 (tl, 1 H, J 7,6 Hz , Ar) , 7, 65 (tl, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar) , 7, 64- 00 (m, 11 H, Ar + H-14), 6,49 (Sl, 1 H, H-5) , 5, 57 , 1 H, J = 16 ,4 Hz, H-17) , 5,47 -4,44 (m, 5 Η) , 1,98- 82 (m, 2 H, H-l9), 1,02- -0, 89 (m, 12 H) , 0,80-0,70 (m, 6 H) . RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ 171,6, 158,0. 156, 3, 156, 3, 153, 0. 152,2, 151, 0. 149, 6, 144,8, 135, 3, 132,1, 130, 6, 130,0. 128, 6-127, 8 (11 C) , 119,9, 98,4, 79, 5, 75, 2, 68,4, 67, 9, 65, 6, 33, 0. 7, 9, 7,2, 6, 4 . 2a diastereómero: RMN 3η (CDC13, 400 MHz) δ 8,85 (sl, 1 H, Ar) , 8,5: 3 ( :si i H, Ar) r 8,2 :o (sl, 1 H, Ar) , 7,93 (s 1, Ar) , 7, 81 (tl, 1 H, J = = 7, 6 Hz, Ar), 7, 63 \—1 1—1 -P H, J = 7, 6 Hz , Ar) f 7,56 -6 , 90 (m, 11H, Ar + \—1 1 6, 52 (sl , 1 H, H-5) , 5 , 55 (d , i H, J = 16,8 Hz, \—1 1 5, 44- 4,7 1 (m, 5 H), 1 > KD CO 1 1, 80 (m, 2 Η, H- -19) , 1 LO 0 1 1 o, 90 (m, 12 H) , , 0,81 -0 ,70 (m , 6 H) . RMN 13C (CDC13, 100 MH z) δ 171 ,5, 157, 9, 15 16, 4, 156,4, 152 9 r J r 152,4, 13 150, 9, 149, 4, 144,8, 135, 3, 132, 1, 130, 6, 129, 9, 128, 6-127,8 (11 C) , 119, 9, 98,5, 79, 3, 75,2, 68,4, 67,8, 65, 6, 32, 9, 7,8, 7,2, 6, 4. EXEMPLO de Referência VI - Preparação do Ia diastereómero de 5-dibenziloxicarbonil-hidrazino-20-OH-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, o Io diastereómero de 5-dibenziloxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina (0,140 g, 0,184 mmol) é dissolvido sob agitação em THF anidro (6 ml), após o que se junta, gota a gota, Et3N*3HF (0,225 ml, 1,380 mmol) . Deixa-se a mistura reagir durante 52 h à temperatura ambiente, sendo o desaparecimento do reagente (Hexano/EtOAc = 1/3) controlado por TLC. O solvente é evaporado sob vácuo e o resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/EtOAc = 1/1 e depois 2/3), obtendo-se, desta forma, o composto pretendido (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) no estado sólido, de cor amarela pálida. Em seguida, o produto é purificado por cristalização em CH2Cl2/Pentano = 1/50. RMN 3H (CDC13, 400 MHz) δ 8, 67 (sl , 1 H , Ar) , 8, 39 (sl 1 H, r Ar) , 8,12 (dl, 1 H, J = 7,6 Hz, Ar) , 7, 95 (sl , 1 H, Ar) , 7,74 (tl, 1 H, J = 7 , 6 Hz, Ar) , 7, 65-6, 66 (m, 12 : H, Ar + H- -14), 6 ,48 (sl, 1 H, H -5) , 5, 55 (d, 1 H, J = 16 ,0 Hz, H- 17) , 5, 42- 4,44 (m, 5 H) t 3, í )6 (sl, 1 H , OH) , 1,92 -1, 72 (m, 2 H, r H-19) , o, 95 (t, 3 H , J = 7,6 Hz, Me) . RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ 173 ,5, 158,0 t 156 ,2, 156 ,0, 153, 0 , 150, 9, 150 ,9, 149, 5, 145 ,3, 135,4, 132 ,2, 130,7, 12! 2,8, 128,7- 127 ,8 (11 C) , 119, 9, 98, 2, 79,6, 72 ,7, 68,5, 68, 0 , 65, 9, 31, 6, 7,8 e EXEMPLO de Referência VII - Preparação do 2a diastereómero de 5-dinenziloxicarbonil-hidrazino-20-OH-camptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, o 2° diastereómero de 5-dibenziloxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina (0,140 g, 0,184 mmol) é dissolvido sob agitação em THF anidro (6 ml), após o que se junta, gota a gota, Et3N*3HF (0,150 ml, 14 0,921 mmol). Deixa-se a mistura reagir durante 55 h à temperatura ambiente, sendo o desaparecimento do reagente (Hexano/EtOAc = 3/2) controlado por TLC. O solvente é evaporado sob vácuo e o resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, Hexano/EtOAc = 1/1), obtendo-se, desta forma, o composto pretendido (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) no estado sólido, de cor amarela pálida. Em seguida, o produto é purificado por cristalização a partir de CH2Cl2/Pentano = 1/50. RMN ΧΗ (CDC13, 4 C >0 MHz; ) δ 8,71 ( sl , 1 H, Ar) , 8 ,34 (sl \—1 Ar) , 8 ,18 (sl, 1 H, Ar ), 7,94 (s ;i, 1 H, Ar) , 7, 79 (tl, \—1 J = 7, 6 Hz, Ar ) , 7,7 0- Oh <\ 0 12 H, Ar + H-14 ) , 6,52 (sl, 1 H, H -5), 5,53 (d, 1 H, J = 16, 4 Hz, H- 17) , 5, 44- 4,48 (m, 5 H), r 3,87 (sl r 1 H, OH) , 1, 90 -1 ,70 (m ., 2 H, H- 19) , 0, 99 (t, 3 H, J = 7, 6 Hz, Me ) . RMN 13, 0 (CDCI3, 100 MH z) δ 173, 4, 1! 58 , .0, 156, 3, 156, 1, 153,0, 1 51, 0, 150 , 9, 14 9, 6, 145, 3, 1. 35, ,5, 132, 3, 130, 8, 129, 8, 128 ,7-: 127, 8 l m C) , 119, co > LD CO ,4 , 79,5, 72 > > Oh co ,5, Oh OO 6 6 ',0, 31 , 6, 7,7 EXEMPLO VIII - Preparação de sal TFA de 4,5-dihidro-triazol[5,4-c]16a-deoxocamptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, o 5-di-t- butoxicarbonil-hidrazino-20-OTES-camptotecina (0,225 g, 0,324 mmol, mistura diastereomérica 1:1) é dissolvido sob agitação em 1,2-dicloroetano anidro (DCE) (8 ml), após o gue se junta, gota a gota, ácido trifluoroacético (TFA) (0,895 ml, 11,67 mmol). Deixa-se a mistura reagir durante 20 h à temperatura ambiente, sendo o desaparecimento do reagente (Hexano/EtOAc = 1/3) controlado por TLC, e, em seguida, é aguecida sob refluxo durante 4 h. O solvente é evaporado sob vácuo e o resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, CH2Cl2/MeOH = 30/1), obtendo-se, desta forma, o composto pretendido (0,084 g, 0,178 mmol, 55%) na forma de trifluoroacetato (sal). A mistura 1:1 dos dois diastereómeros é purificada ainda mais por meio de 15 cromatografia flash (Si02, Tolueno/EtOAc = 1/1). RMN ΤΗ (CDC13i , 400 MHz ) δ 10,61 1—1 CG 0,5 H, Nó- NH=C16a ), 10, 39 (sl , 0,5 H , N5-NH=C16a), 8, 67 (s, 1 H, Ar, H-7), 8 ,22-8, 15 (m, 1 H, Ar), 7, 96-7, 92 (m, 1 H, Ar) , 7, 88- 7,78 (m , 1 H, Ar) , 7,69-7, 60 (m, 2 H, Ar) , 6, 38-6,3 6 (m , 1 H, Ar, H-5) , 5,72-5 , 62 (m, 1 H, Ar, H-17) , 5, 32-5,2 0 (m , 2 H, Ar, H-17 + N5H), 4,08-3 ,86 (sl, 1 H, OH), 1,96-1 , 74 (m, 2 Η, H- -19) , 1,05-0 , 98 (t, 3 H, J = 7,6 Hz, Me) . RMN 13c (CDC13, 100 MHz) δ 173, 8 (0, 5 C), 173,4 (0 .5 C), 159 ,1, 159,0, 156,7 (q CF 3COOH), 156 >,5 (q CF3COOH) 151,5, 151 ,3, 150,7, 150,5 , 150, 1, 149, 9, 144,8, 144, 7, 134,0, 133 ,8, 131,6, 131,5 , 129, 9, 129, 8, 128,7, 128, 7, 128,4, 128 ,4, 128,2, 128,2, 127,1 , 126,9, . 12 2 0,5, 120,3, 99, ] - (2 C) , 78 ,9, 78, 6, 72,7, 72,7, 66, 0 (2 C) , 31,7 (2 C) , 7,7, 7,7. EXEMPLO IX - Preparação de triazol[5,4-c]16a-deoxocamptotecina

Em ambiente de atmosfera inerte, o sal TFA de 4,5-dihidro-triazol[5,4-c]16a-deoxocamptotecina (0,020 g, 0,042 mmol) é dissolvido sob agitação em CH2C12 anidro (4 ml), após o que se junta 2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona (DDQ) (0,025 mg, 0,110 mmol). Deixa-se a mistura reagir durante 31 h à temperatura ambiente, sendo o desaparecimento do reagente (CH2Cl2/MeOH = 30/1) controlado por TLC. A reacção é interrompida por adição de H20. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (3 x 15 ml) e as fases orgânicas são combinadas, secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas sob vácuo. O resíduo é purificado por cromatografia flash (Si02, CH2Cl2/MeOH = 45/1), obtendo-se, desta forma, um produto no estado sólido, de cor amarela (0,014 g, 0,039 mmol, 94%). RMN XH (CDCI3, 400 MHz) δ 8,89 (s, 1 H, Ar, H-7) , 8, 20 (d, 1—1 J = 8,4 Hz, Ar), 8,00 (d, 1 H, J = 8 ,4 Hz, Ar ) , OO OO c+ 1 H, J = 8,4 Hz, Ar), 7,79 (s, 1 H, Ar H-14), 7, 69 (t, 1-1 J = 8,4 Hz, Ar), 5,70 (d, 1 H, J = 17,2 Hz, H- -17 ) , 16 5,28 (d, 1 H, J = 17,2 Hz, H-17), 3,83 (sl, 1 H, OH), 2,00-1,74 (m, 2 Η, H-19), 1,08 (t, 3 H, J= 7,6 Hz, Me). RMN 13C (CDC13, 100 MHz) δ 172, 6, 157,4, 152,5, 150,8, 148, 9, 143,7, 134,9, 132,5, 132,4, 130,0, 129,5, 128,7, 127,5, 122,6, 121,4, 101,2, 72,4, 66,0, 31,6, 7,7. EXEMPLO X - Ensaio de inibição do crescimento celular

Foram cultivadas células H460 de tumor de pulmão de células grandes em meio RPMI-1640 contendo soro fetal bovino a 10%. A sensibilidade das células foi determinada por um ensaio de inibição do crescimento celular após 1 ou 72 h de exposição ao fármaco As células em crescimento logarítmico foram recolhidas e cultivadas em duplicado em placas 6 poços. Vinte e guatro horas após o cultivo, as células foram expostas aos fármacos e, após 72 horas de exposição, foram contadas com um contador Coulter para determinação dos valores de CI50. Define-se CI50 como a concentração inibidora de 50% do crescimento celular relativamente ao crescimento de controlos não tratados.

EXEMPLO XI - ensaio de ruptura de ADN dependente da Topoisomerase I

As rupturas de ADN foram determinadas usando um gel purificado SV40 BamHI-EcoRI 751-bp (Beretta GL, Binaschi M, Zagni AND, Capuani L, Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein domain. Câncer Res 1999; 59:3689-97). Os fragmentos de ADN só foram marcados em 3'. A reacção de ruptura do ADN (20.000 cpm/amostra) foi realizada em 20 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), KC1 150 mM, MgCl2 5 mM, 15 gg/ml de BSA, tiotreitol 0,1 mM, e a enzima recombinante humana (topl de comprimento completo) durante 30 min a 37°C. As reacções foram bloqueadas usando SDS a 0,5% e 0,3 mg/ml de proteinase K durante 45 min a 42°C. A persistência dos danos no ADN foi 17 avaliada em momentos diferentes, juntando NaCl 0,6 M após 30 min de incubação com 10 μΜ do fármaco. Depois da precipitação, o ADN voltou a ser suspendido em tampão de desnaturação (formamida a 80%, NaOH 10 mM, EDTA 0,01 Me 1 mg/ml de corante) antes da cultura em gel desnaturante (poliacrilamida a 7% em tampão TBE) . Todos os níveis de ruptura do ADN foram avaliados por meio de um Phospholmager modelo 425 (Molecular Dynamics) (Dallavalle S, Ferrari A, Biasotti B, et al. Novel 7-oxyiminomethyl camptothecin derivatives with potent in vitro and in vivo antitumor activity. J Med Chem 2001; 44:3264-74).

Persistência dos danos no ADN (%)

Compostos Tempo (min) 0 1 5 10 Topotecano 100 65 20 10 Camptotecin a 100 58 23 20 SN38 100 60 33 28 IDN 6132 100 45 32 20 18

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente destina-se apenas à conveniência do leitor. Estas não formam parte do documento de Patente Europeia. Mesmo tendo tomado um enorme cuidado na compilação das referências, não podem ser excluídos erros ou omissões, pelo que o EPO renuncia a todas as responsabilidades que daí possam advir.

Documentos de patente citados na descrição • US 5972955 A [0014] • US 6214836 BI [0014] • US 6177439 Bl [0014]

Documentos excepto patentes citados na descrição • Wall ; Wani. J. Am. Chem. Soc., 1966, vol. 88, 3888-3890 [0002] • Heterocycles, 1994, vol. 38, 81-94 [0014] • Cava P.M. et al. Tetrahedron, 1985, vol. 41, 5061 [0020] • Cherkasov RA et al. Tetrahedron, 1985, vol. 41, 2567 [0020] • Ghattas AAG et al. Sulfur Lett., 1982, vol. 1, 69 [0020] • Yde B et al. Tetrahedron, 1984, vol. 40, 2047 [0020] • Câncer Res, 1999, vol. 59, 3689-97 [0046] • J Med Chem, 2001, vol. 44, 3264-74 [0046]

Lisboa, 11/11/2010

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula geral (I):

(i) em que: R é alquilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, nitrilo, sililalquilo; Rl é hidrogénio, hidroxi, alcoxi, aminoalquilo; R2 é hidrogénio, alcoxi, aminoalquilo, hidroxilo opcionalmente protegido com grupos acilo ou sililo; em que os grupos alquilo, alcoxi e aminoalquilo podem conter 1 a 8 átomos de carbono, numa cadeia linear ou ramificada; os respectivos sais, enantiómeros e diastereómeros farmaceuticamente aceitáveis.

2. Um composto de fórmula (I), tal como reivindicado na reivindicação 1, que é seleccionado do grupo constituído por: a) 4,5-dihidro-triazol[5,4-c]16a-deoxocamptotecina, b) triazol[5,4-c]16a-deoxocamptotecina.

3. Um procedimento para a preparação dos compostos de fórmula (I), o qual engloba substancialmente as etapas (a)-(e) indicadas no seguinte esquema: 2

b)

em que: a) protecção dos grupos hidroxi precursores; b) derivatização da posição 5- com hidrazina N,N-diprotegida; c) conversão opcional do anel piridona em anel tiopiridona; d) remoção dos grupos protectores com a ciclização concomitante; e) aromatização opcional do anel pirazol; 3 em que R, RI e R2 têm os significados acima definidos e PG é um grupo protector de hidroxi.

4. Um procedimento para a preparação dos compostos de fórmula (I), de acordo com a reivindicação 3, no qual a ordem das etapas (b) e (c) é invertida.

5. Uma composição farmacêutica que contém um composto de fórmula (I) juntamente com veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

6. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, cuja forma seja adequada para administração oral ou parentérica.

7. 0 uso de um composto de acordo com as reivindicações 1-2, ou de uma composição de acordo com as reivindicações 5-6, para a preparação de um fármaco destinado ao tratamento de tumores.

8. 0 uso de acordo com a reivindicação 7, em que o dito fármaco é usado no tratamento de tumores sólidos e leucemias.

9. 0 uso de acordo com as reivindicações 7 e 8, em que os tumores sólidos e as leucemias são seleccionados entre tumores do pulmão, ovário, mama, estômago, fígado, próstata, sarcomas de tecidos moles, esófago, pâncreas, cabeça e pescoço, glioblastoma e leucemias mielóides crónicas e agudas. Lisboa, 11/11/2010