CN101495484A - 具有抗肿瘤活性的喜树碱衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗肿瘤活性的式(I)的新型喜树碱衍生物、其制备方法、其作为抗肿瘤药物的用途和含有这些衍生物的药物组合物。

Description

具有抗肿瘤活性的喜树碱衍生物
本发明涉及具有抗肿瘤活性的新型喜树碱衍生物、其制备方法、作为抗肿瘤药物的用途和含有这些衍生物的药物组合物。
发明背景
喜树碱是从喜树(Camptotheca acuminata)(珙桐科(Nyssaceae))中提取出的一种生物碱，在1966年由Wall和Wani(J.Am.Chem.Soc.1966，88，3888-3890)初次叙述。尽管喜树碱具有广谱的抗肿瘤活性，特别是抗结肠肿瘤和其他实体瘤以及白血病的活性，但是由于其毒性大(其特别是表现为出血性膀胱炎、胃肠道毒性和骨髓抑制的形式)，因此不能用于治疗。
为了获得低毒和高溶解度的化合物，已合成了许多喜树碱类似物。目前，两种药物即CPT-11和托泊替康被应用于临床实践中。其他衍生物，如贝洛替康、卢比替康、依沙替康、吉马替康、培加替康、勒托替康、Karenitecin、阿非替康、高喜树碱、二氟替康和许多其它衍生物正在进行临床试验。化合物CPT-11是10-羟基-7-乙基喜树碱(通常被称为SN-38)的高度可溶性前药，被批准用于治疗许多实体瘤和腹水(结肠直肠、皮肤、胃、肺、宫颈、卵巢、非霍奇金淋巴瘤)。
托泊替康是一种在生理溶液中可溶的化合物，有抗肺、胃、肝脏、卵巢、乳腺、前列腺、食管、直肠的肿瘤、软组织肉瘤、头和颈部肿瘤、成胶质细胞瘤、慢性和急性髓细胞性白血病的活性。然而，托泊替康显示出明显的诸如中性白细胞减少和血小板减少的副作用。
勒托替康是一种更易溶的衍生物，具有抗颈、卵巢、乳腺、结肠直肠肿瘤和肺微小细胞瘤(microcytoma)的活性。然而，勒托替康也具有血液毒性。
卢比替康是可口服使用的有效对抗胰腺、卵巢和乳腺肿瘤的前药。
与所有的I型拓扑异构酶抑制剂一样，喜树碱及其类似物能够有效对抗耐受常规药物、包括II型拓扑异构酶抑制剂的肿瘤；在整个细胞周期中保持高拓扑异构酶水平；不诱导多药耐药性(Pgo或MRP)或酶介导的解毒代谢。
目前的研究集中在比目前使用的药物毒性要低的新的I型拓扑异构酶抑制剂上。
开环喜树碱衍生物具有高的蛋白结合(尤其是与白蛋白结合)作用，且在肿瘤组织中分布低。因此，该产品在体内蓄积且对肿瘤的影响较小。
相反，内酯型衍生物的高亲脂性促进了喜树碱衍生物对细胞膜尤其是红细胞的粘附，影响了组织/血浆分布比率。为此，研究集中于两种可选择的方法：a)设计仍具有良好溶解性的蛋白结合力低的产品，b)设计即使在极低的剂量下也有治疗作用的高效产品。
在7-、9-、10-和11-位上的修饰通常被证明具有良好的耐受性，同时不影响DNA-I型拓扑异构酶-喜树碱三元复合物的稳定性，这种复合物的形成是该化合物抗肿瘤活性的原因。
证明具有20R构型的产物没有活性或者与20S构型的产物相比活性极低，20S构型与天然构型一致。
通常认为5-位上的修饰不利于三元复合物的形成，而据报道在吡啶酮环D和E上的修饰对产物的活性有害。
发明内容
本发明的第一方面涉及通式I的喜树碱衍生物、其可药用的盐、异构体、对映异构体、非对映异构体以及相应的混合物：
Figure A20078002829700071
其中：
R是烷基、氨基烷基、羟基烷基、腈、烷氧基氨基(alkoxymino)、芳氧基氨基(aryloxymino)、甲硅烷基烷基；
R1是氢、羟基、烷氧基、氨基烷基；
R2是氢、羟基、烷氧基、氨基烷基、任选地被保护的羟基；
其中直链或者支链的烷基、烷氧基、氨基烷基或烷氧基氨基可包含1-8个，优选1-4个碳原子，而芳氧基氨基可包含5至10个碳原子。
本发明的化合物蛋白结合率低、溶解性好，并且即使在极低的剂量下也具高的药效。
在下面的流程图中说明了制备本发明化合物的优选合成路线，其基本涉及以下步骤：
a)前体羟基的保护；
b)在5-位用N，N-双保护的肼进行衍生化；
c)任选地将吡啶酮环转化成硫代吡啶酮环；
d)在环化的同时除去保护基团；
e)任选地将吡唑环芳构化。
Figure A20078002829700081
在该流程图中，R、R1和R2具有上述含义，且PG是羟基保护基团。
羟基优选地是通过易裂解的酰基(优选三氯乙酸酯和Troc)或甲硅烷基(优选三乙基甲硅烷基)来进行保护的。
在5-位用被保护的肼进行的衍生化可通过用强有机碱如LiHMDS处理前体化合物，并将所得的碳负离子与偶氮二甲酸酯如偶氮二甲酸二叔丁酯或偶氮二甲酸二苄酯反应来获得。吡啶酮环到硫代吡啶酮环的转化可通过与2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，2，3，4-二硫杂磷杂乙烷-2，4-二硫化物(通常被称为Lawesson’s试剂)(Cava P.M.等人，Tetrahedron 1985，41，5061；Cherkasov RA等人，Tetrahedron 198541，2567；Ghattas AAG等人，SulfurLett.1982，1，69；Yde B等人，Tetrahedron 1984，40，2047)或等价的试剂反应而得到。优选Lawesson’s试剂。
任选地转化成硫代吡啶酮的目的是为了在肼被去保护时促进关环。然而，已经观察到即使没有活化吡啶羰基(例如形成硫代羰基)，所述关环反应也能自发地立即发生。
当羟基保护基团为甲硅烷基且氮上的那些基团为氨基甲酸酯时，通常用三氟乙酸将其去除。在一种可供选择的方法中，步骤b)和步骤c)的顺序可以颠倒。
在用广谱肿瘤细胞进行的细胞毒性试验中测试了本发明的化合物。例如，报道了式(I)中的两个化合物对NCI-H460细胞系(NSCL癌)的细胞毒性数据，该试验用喜树碱以及药物托泊替康和SN-38作为对照：
Figure A20078002829700091
在测定活性浓度和损伤的持久性的DNA裂解试验中对最具活性的化合物进行了评价(见“实施例”部分)。与对照标准品(特别是托泊替康和喜树碱)相比，式(I)的衍生物令人吃惊地在保持有效细胞毒活性的同时更持久地阻断了DNA复制。
另一方面，本发明涉及含有式(I)化合物和可药用的载体及赋形剂的药物组合物。适于化合物(I)的口服或胃肠外给药的药物形式可以是固体(优选胶囊、片剂和颗粒剂)，或者可以是液体(优选可注射或输液溶液)。
被适宜配制的本发明化合物可用于治疗实体瘤和白血病，特别是肺、卵巢、乳腺、胃、肝、前列腺的肿瘤、软组织肉瘤、头部和颈部、食管、胰腺、结肠、直肠的肿瘤、成胶质细胞瘤、慢性和急性髓细胞性白血病。
实施例
实施例I 20-OTES-喜树碱
在惰性气氛下，将喜树碱(0.100g，0.287mmol)混悬于无水二甲基甲酰胺(3ml)中，并向所得的悬浮液中加入咪唑(0.98g，1.44mmol)。将该混合物搅拌10分钟，随后向其中滴入氯化三乙基甲硅烷(TES-Cl)(0.193ml，1.15mmol)，然后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.040g，0.287mmol)。在46小时后，将该反应混合物在真空下蒸发(TLC监测到反应物完全消失，展开剂CH2Cl2/MeOH＝30/1)。随后将固体重新溶解于CH2Cl2中并用H2O和饱和NH4Cl对其进行洗涤。将水相用二氯甲烷(2×10ml)进行萃取。合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤并将其在真空下浓缩，从而得到淡黄色固体形式的所需产物(0.133g，0.287mmol)。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.37(s，1H，Ar，H-7)，8.25(d，1H，J＝8.4Hz，Ar)，7.92(d，1H，J＝8.0Hz，Ar)，7.82(t，1H，J＝8.0Hz，Ar)，7.65(t，1H，J＝8.4Hz，Ar)，7.57(s，1H，H-14)，5.67(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，5.29(s，2H，H-5)，5.25(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，2.00-1.84(m，2H，H-19)，1.03-0.93(m，12H)，0.80-0.71(m，6H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ171.7，157.6，152.5，151.5，149.0，145.9，130.9，130.4，130.0，128.4，128.1，128.0，127.9，118.9，94.4，75.3，66.0，50.0，33.2，7.9，7.2，6.4。
实施例II 5-二叔丁氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱的制备
在惰性气氛下，将喜树碱20-OETS(0.100g，0.216mmol)搅拌溶解于无水THF(6ml)中，然后将其冷却至-78℃并向其中滴入1.0M LiHMDS的THF溶液(0.281ml，0.281mmol)。在20分钟后，向其中加入在无水THF(2ml)中的偶氮二甲酸二叔丁酯(DTBAC)(0.075g，0.324mmol)。在-78℃下4小时后，TLC(己烷/AcOEt＝3/1)监测到反应物消失。观察到形成两种非对映异构体。通过加入饱和NH4Cl将该反应淬熄。将水相用CH2Cl2(3×15ml)萃取，合并有机相，将其用Na2SO4干燥，过滤并将其在真空下浓缩。将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，己烷/AcOEt＝3/1)，由此得到两种异构体的混合物(0.145g，0.210mmol，97％)。通过进一步进行色谱处理分离两种异构体。按洗脱的次序：
第一种非对映异构体：1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.80(br s，1H，Ar)，8.23(d，1H，J＝8.4Hz，Ar)，8.01(br d，1H，Ar)，7.90-7.71(m，2H，Ar)，7.70-7.45(m，2H，Ar+H-14)，6.52(br s，1H，H-5)，5.61(d，1H，J＝16.8Hz，H-17)，5.23(d，1H，J＝16.8Hz，H-17)，2.03-1.81(m，2H，H-19)，1.79-1.08(br s，18H)，1.06-0.92(m，12H)，0.80-0.70(m，6H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ171.7，157.8，155.5，155.5，152.0，152.0，151.2，149.4，145.0，132.1，130.6，130.0，128.7，128.4，127.9，119.9，98.2，82.7，81.5，79.7，75.2，65.7，33.2，28.3，27.6，7.7，7.2，6.4。
第二种非对映异构体：1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.79(br s，1H，Ar)，8.23(d，1H，J＝8.4Hz，Ar)，8.01(br d，1H，Ar)，7.85-7.76(m，2H，Ar)，7.65(br t，1H，J＝8.4Hz，Ar)，7.52(s，1H，H-14)，6.54(br s，1H，H-5)，5.61(d，1H，J＝16.8Hz，H-17)，5.22(d，1H，J＝16.8Hz，H-17)，2.03-1.82(m，2H，H-19)，1.76-1.08(br s，18H)，1.04-0.92(m，12H)，0.80-0.70(m，6H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ171.5，157.9，155.5，155.5，152.3，152.0，151.2，149.4，145.1，132.1，130.6，130.0，128.7，128.4，127.9，119.9，98.2，82.9，81.5，79.6，75.2，65.8，33.3，28.3，27.4，7.8，7.2，6.4。
实施例III 5-二叔丁氧基羰基肼基-20-OH-喜树碱第一种非对映异构体的制备
在惰性气氛下，将5-二叔丁氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱(0.050g，0.072mmol)的第一种非对映异构体搅拌溶解于无水THF(4ml)中，随后向其中滴入Et3N·3HF(0.088ml，0.542mmol)。使该反应混合物在室温下反应35小时，用TLC(己烷/AcOEt＝3/2)监测到反应物消失。在真空下蒸发掉溶剂，将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，己烷/AcOEt＝3/2)，从而得到淡黄色固体形式的所需化合物(0.041g，0.071mmol，98％)。
通过从CH2Cl2/戊烷＝1/50中结晶来进一步对产物进行纯化。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.77(br s，1H，Ar)，8.16(br d，1H，J＝8.0Hz，Ar)，7.97(br s，1H，Ar)，7.86-7.50(m，4H，Ar)，6.51(br s，1H，H-5)，5.66(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，5.24(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，3.86(br s，1H，OH)，2.00-1.80(m，2H，H-19)，1.79-1.13(br s，18H)，1.03(t，3H，J＝7.6Hz，Me)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ173.7，157.9，155.5，155.5，152.1，151.3，150.7，149.6，145.7，132.3，130.7，129.9，128.7，127.9，127.6，120.0，97.9，82.8，81.6，79.7，72.7，66.1，31.8，28.3，27.7，7.7。
实施例IV 5-二叔丁氧基羰基肼基-20-OH-喜树碱第二种非对映异构体的制备
在惰性气氛下，将5-二叔丁氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱(0.050g，0.072mmol)的第二种非对映异构体搅拌溶解于无水THF(4.5ml)中，随后向其中滴入Et3N·3HF(0.088ml，0.542mmol)。使该反应混合物在室温下反应35小时，用TLC(己烷/AcOEt＝3/2)监测到反应物消失。在真空下蒸发掉溶剂并将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，己烷/AcOEt＝3/2)，从而得到淡黄色固体形式的所需化合物(0.040g，0.069mmol，96％)。
通过从CH2Cl2/戊烷＝1/50中结晶来进一步对产物进行纯化。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.79(br s，1H，Ar)，8.22(br d，1H，J＝8.4Hz，Ar)，7.99(br s，1H，Ar)，7.88-7.50(m，4H，Ar)，6.53(br s，1H，H-5)，5.65(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，5.26(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，3.80(br s，1H，OH)，2.00-1.80(m，2H，H-19)，1.79-1.13(br s，18H)，1.03(t，3H，J＝7.2Hz，Me)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ173.6，157.9，155.4，155.4，152.1，151.3，150.8，149.5，145.6，132.3，130.8，129.8，128.7，127.9，127.8，119.8，98.0，83.0，81.5，79.7，72.7，66.3，31.8，28.3，27.7，7.8。
实施例V 5-二苄氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱的制备
在惰性气氛下，将喜树碱20-OETS(0.100g，0.216mmol)搅拌溶解于无水THF(6ml)中，然后将其冷却至-78℃并向其中滴入1.0M LiHMDS的THF溶液(0.281mL，0.281mmol)。在20分钟后，加入在无水THF(2ml)中的偶氮二甲酸二苄酯(0.097g，0.324mmol)。在-78℃下3小时后，将其温度升至25℃并用TLC(己烷/AcOEt＝3∶1)监测到反应物消失。观察到形成两种非对映异构体。在将其在室温下放置90分钟后，通过加入饱和NH4Cl来将该反应淬熄。将水相用CH2Cl2(3×5ml)萃取，合并有机相，将其用Na2SO4干燥，过滤并将其在真空下浓缩。将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，己烷/AcOEt＝4/1，然后7/2)，从而得到淡黄色的固体(0.161g，0.212mmol，98％)。通过进一步用色谱法进行处理分离两种异构体。按洗脱的次序：
第一种非对映异构体：1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.70(br s，1H，Ar)，8.39(br s 1H，Ar)，8.22(br d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.95(br d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.83(br t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.65(br t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.64-7.00(m，11H，Ar+H-14)，6.49(br s，1H，H-5)，5.57(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，5.47-4.44(m，5H)，1.98-1.82(m，2H，H-19)，1.02-0.89(m，12H)，0.80-0.70(m，6H)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ171.6，158.0，156.3，156.3，153.0，152.2，151.0，149.6，144.8，135.3，132.1，130.6，130.0，128.6-127.8(11C)，119.9，98.4，79.5，75.2，68.4，67.9，65.6，33.0，7.9，7.2，6.4。
第二种非对映异构体：1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.85(br s，1H，Ar)，8.58(br s 1H，Ar)，8.20(br s，1H，Ar)，7.93(br s，Ar)，7.81(br t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.63(br t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.56-6.90(m，11H，Ar+H-14)，6.52(br s，1H，H-5)，5.55(d，1H，J＝16.8Hz，H-17)，5.44-4.71(m，5H)，1.98-1.80(m，2H，H-19)，1.05-0.90(m，12H)，0.81-0.70(m，6H)。13CNMR(CDCl3，100MHz)δ171.5，157.9，156.4，156.4，152.9，152.4，150.9，149.4，144.8，135.3，132.1，130.6，129.9，128.6-127.8(11C)，119.9，98.5，79.3，75.2，68.4，67.8，65.6，32.9，7.8，7.2，6.4。
实施例VI 5-二苄氧基羰基肼基-20-OH-喜树碱第一种非对映异构体的制备
在惰性气氛下，将5-二苄氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱的第一种非对映异构体(0.140g，0.184mmol)搅拌溶解于无水THF(6ml)中，随后向其中滴入Et3N·3HF(0.225ml，1.380mmol)。使该反应混合物在室温下反应52小时，用TLC(己烷/AcOEt＝1/3)监测到反应物消失。在真空下蒸发掉溶剂，将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，己烷/AcOEt＝1/1，然后2/3)，从而得到淡黄色固体形式的所需化合物(0.113g，0.175mmol，95％)。通过从CH2Cl2/戊烷＝1/50中结晶来进一步对产物进行纯化。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.67(br s，1H，Ar)，8.39(br s 1H，Ar)，8.12(br d，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.95(br s，1H，Ar)，7.74(br t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.65-6.66(m，12H，Ar+H-14)，6.48(br s，1H，H-5)，5.55(d，1H，J＝16.0Hz，H-17)，5.42-4.44(m，5H)，3.86(br s，1H，OH)，1.92-1.72(m，2H，H-19)，0.95(t，3H，J＝7.6Hz，Me)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ173.5，158.0，156.2，156.0，153.0，150.9，150.9，149.5，145.3，135.4，132.2，130.7，129.8，128.7-127.8(11C)，119.9，98.2，79.6，72.7，68.5，68.0，65.9，31.6，7.8。
实施例VII 5-二苄氧基羰基肼基-20-OH-喜树碱第二种非对映异构体的制备
在惰性气氛下，将5-二苄氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱的第二种非对映异构体(0.140g，0.184mmol)搅拌溶解于无水THF(6ml)中，随后向其中滴入Et3N·3HF(0.150mL，0.921mmol)。使该反应混合物在室温下反应55小时，用TLC(己烷/AcOEt＝3/2)监测到反应物消失。在真空下蒸发掉溶剂，将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，己烷/AcOEt＝1/1)，从而得到淡黄色固体形式的所需化合物(0.113g，0.175mmol，95％)。通过从CH2Cl2/戊烷＝1/50中结晶来进一步对产物进行纯化。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.71(br s，1H，Ar)，8.34(br s 1H，Ar)，8.18(br s，1H，Ar)，7.94(br s，1H，Ar)，7.79(br t，1H，J＝7.6Hz，Ar)，7.70-6.70(m，12H，Ar+H-14)，6.52(br s，1H，H-5)，5.53(d，1H，J＝16.4Hz，H-17)，5.44-4.48(m，5H)，3.87(br s，1H，OH)，1.90-1.70(m，2H，H-19)，0.99(t，3H，J＝7.6Hz，Me)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ173.4，158.0，156.3，156.1，153.0，151.0，150.9，149.6，145.3，135.5，132.3，130.8，129.8，128.7-127.8(11C)，119.8，98.4，79.5，72.7，68.5，67.8，66.0，31.6，7.7。
实施例VIII 4，5-二氢-三唑并[5，4-c]16a-脱氧喜树碱TFA盐的制备
在惰性气氛下，将5-二叔丁氧基羰基肼基-20-OTES-喜树碱(0.225g，0.324mmol，1∶1的非对映异构体混合物)搅拌溶解于无水1，2-二氯乙烷(DCE)(8ml)中，随后向其中滴入三氟乙酸(TFA)(0.895ml，11.67mmol)。使该反应混合物在室温下反应20小时，用TLC(己烷/AcOEt＝1/3)监测到反应物消失，然后将其回流4小时。在真空下蒸发掉溶剂，将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，CH2Cl2/MeOH＝30/1)，从而得到三氟乙酸盐形式的所需化合物。用快速色谱(SiO2，甲苯/AcOEt＝1/1)对该两种非对映异构体1∶1的混合物进一步进行纯化。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ10.61(br s，0.5H，N5-NH＝C16a)，10.39(br s，0.5H，N5-NH＝C16a)，8.67(s，1H，Ar，H-7)，8.22-8.15(m，1H，Ar)，7.96-7.92(m，1H，Ar)，7.88-7.78(m，1H，Ar)，7.69-7.60(m，2H，Ar)，6.38-6.36(m，1H，Ar，H-5)，5.72-5.62(m，1H，Ar，H-17)，5.32-5.20(m，2H，Ar，H-17+N5H)，4.08-3.86(br s，1H，OH)，1.96-1.74(m，2H，H-19)，1.05-0.98(t，3H，J＝7.6Hz，Me)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ173.8(0.5C)，173.4(0.5C)，159.1，159.0，156.7(q CF3COOH)，156.5(qCF3COOH)151.5，151.3，150.7，150.5，150.1，149.9，144.8，144.7，134.0，133.8，131.6，131.5，129.9，129.8，128.7，128.7，128.4，128.4，128.2，128.2，127.1，126.9，120.5，120.3，99.1(2C)，78.9，78.6，72.7，72.7，66.0(2C)，31.7(2C)，7.7，7.7。
实施例IX-三唑并[5，4-c]16a-脱氧喜树碱的制备
在惰性气氛下，将4，5-二氢-三唑并[5，4-c]16a-脱氧喜树碱TFA盐(0.020g，0.042mmol)搅拌溶解于无水CH2Cl2(4ml)中，随后向其中加入2，3-二氯-5，6-二氰基-对-苯醌(DDQ)(0.025mg，0.110mmol)。使该反应混合物在室温下反应31小时，用TLC(CH2Cl2/MeOH＝30/1)监测到反应物消失。通过加入H2O来将该反应淬熄。将水相用CH2Cl2(3×15ml)进行萃取，合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤并将其在真空下浓缩。将残余物用快速色谱进行纯化(SiO2，CH2Cl2/甲醇＝45/1)，从而得到黄色固体(0.014g，0.039mmol，94％)。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.89(s，1H，Ar，H-7)，8.20(d，1H，J＝8.4Hz，Ar)，8.00(d，1H，J＝8.4Hz，Ar)，7.88(t，1H，J＝8.4Hz，Ar)，7.79(s，1H，Ar H-14)，7.69(t，1H，J＝8.4Hz，Ar)，5.70(d，1H，J＝17.2Hz，H-17)，5.28(d，1H，J＝17.2Hz，H-17)，3.83(br s，1H，OH)，2.00-1.74(m，2H，H-19)，1.08(t，3H，J＝7.6Hz，Me)。13C NMR(CDCl3，100MHz)δ172.6，157.4，152.5，150.8，148.9，143.7，134.9，132.5，132.4，130.0，129.5，128.7，127.5，122.6，121.4，101.2，72.4，66.0，31.6，7.7。
实施例X 细胞生长抑制试验
在包含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养来自于人类大细胞肺肿瘤的H460细胞。在药物接触1或72小时后，用细胞生长抑制试验来测定细胞敏感度。收集对数生长的细胞并将其一式两份地接种到6孔板中。在接种24小时后，使细胞与药物接触，在与药物接触72小时后，为了测定IC50，用Coulter计数器对其进行计数。IC50被定义为与未经处理的对照生长相比，抑制50％细胞生长的浓度。
实施例XI I型拓扑异构酶依赖性DNA断裂试验
用751-bp BamHI-EcoRI DNA SV40精制凝胶来测定DNA断裂(Beretta GL，Binaschi M，Zagni AND，Capuani L，Capranico G.用与异种位点选择性DNA-结合蛋白结构域融合的酶将IB型拓扑异构酶限制到DNA位点。Cancer Res 1999；59：3689-97)。DNA片段仅在3’位被标记。该DNA断裂反应(20,000cpm/样品)是在20ml 10mM Tris-HCl(pH7.6)、150mM KCl、5mM MgCl2、15μg/ml BSA、0.1mM二硫苏糖醇和人重组酶(全长top1)中在37℃下保持30分钟来进行的。在42℃下，用0.5％的SDS和0.3mg/mL的蛋白酶K将反应阻断45分钟。在将其与10μM药物一起培养30分钟后，在不同时间加入0.6M NaCl来对DNA损伤的持久性进行检验。在沉淀后，将DNA重悬于变性缓冲液(80％甲酰胺、10mM NaOH、0.01M EDTA和1mg/mL染料)中，然后将其接种于变性凝胶(在TBE缓冲液中的7％的聚丙烯酰胺)中。用PhosphoImager 425型(MolecularDynamics)(Dallavalle S，Ferrari A，Biasotti B等人，具有体外和体内抗肿瘤活性的新型7-氧化亚氨基甲基喜树碱衍生物.J Med Chem 2001；44：3264-74)测定全部的DNA断裂水平。
DNA损伤的持久性(％)
Figure A20078002829700181

Claims (8)

1.通式(I)的化合物、其可药用的盐、异构体、对映异构体、非对映异构体以及相应的混合物：
Figure A2007800282970002C1
其中：
R是烷基、氨基烷基、羟基烷基、腈、烷氧基氨基、芳氧基氨基、甲硅烷基烷基；
R1是氢、羟基、烷氧基、氨基烷基；
R2是氢、羟基、烷氧基、氨基烷基、任选地被保护的羟基；
其中直链或者支链的烷基、烷氧基、氨基烷基或烷氧基氨基可包含1至8个，优选1至4个碳原子，而芳氧基氨基可包含5至10个碳原子。
2.如权利要求1所述的式(I)的化合物，其选自：
a)4，5-二氢-三唑并[5，4-c]16a-脱氧喜树碱，
b)三唑并[5，4-c]16a-脱氧喜树碱。
3.制备式(I)化合物的方法，其基本包括下面流程图中所示的步骤(a)-(e)：
Figure A2007800282970003C1
其中：
a)前体羟基的保护；
b)在5-位用N，N-双保护的肼进行衍生化；
c)任选地将吡啶酮环转化成硫代吡啶酮环；
d)在环化的同时除去保护基团；
e)任选地将吡唑环芳构化；
且其中R、R1和R2具有上述含义，PG是羟基保护基团。
4.如权利要求3所述的式(I)化合物的制备方法，其中步骤(b)和(c)的次序被颠倒。
5.包含式(I)化合物和可药用的载体及赋形剂的药物组合物。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其为适于口服或胃肠外给药的形式。
7.如权利要求1-2所述的化合物或如权利要求5-6所述的组合物用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述药物被用于治疗实体瘤和白血病，特别是肺、卵巢、乳腺、胃、肝、前列腺的肿瘤、软组织肉瘤、食管、胰腺、头部和颈部的肿瘤、成胶质细胞瘤、慢性和急性髓细胞性白血病。
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