PT91470A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas antineoplasticas contendo uma mistura sinergica de um inibidor da proteinaquinase c com um antineoplastico - Google Patents

Description

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Descrição referente ã patente de invenção de BOSURINGiSR MWIEIM GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em 6800 Mannheim 31» Republica Federal Alemã, (inventoresi Prof. Hans Hermann G-runicke, Dr. med. Dieter Eerrmann, Dr. Johann Hofmann e Dr. phil. nat. Elmar Bosies, residentes na Alemanha Ocidental), para "PRO CasSO PARA A PREPARA Ca 0 DECOM- POSIÇÕES FARMACffiUTIGnS ANTINEOPL/S- TI CA 3 CONTENDO UMA MISTURA SIMiíRGI- CA DE UM INIBIDOE DA PROTEÍNA QUINA- SE C COM UK ANT IN BQPL/C ST I GO "

Descrição A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas contendo misturas sinergicas de antineoplás-ticos e a sua utilização como medicamentos antineoplãsticos. São especialmente objecto da presente invenção composições farmacêuticas contendo misturas sinérgi-cas que, como substâncias activas, contêm compostos que actuam como inibidores da proteínaquina se C em combinação com uma substância activa antineoplástica, como, por exemplo, com lípi-dos ou com os seus derivados, com compostos citostaticamente activos ou com compostos que funcionam como inibidores de fos-f olipa ses. *" 1 **

JÍspecialmente, a invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm combinações de inibidores de proteínaquina se C com compostos que actuam citostaticamente. À utilização de fãrmacos quimio terapêutico s é um princípio de tratamento desde ha muito tempo conhecido e largamente utilizada na terapia antineoplastica. Dstes farmacos quimioterapêuticos são empregados para destruir células malignas com um comportamento de desenvolvimento não travado, mas com o qual as células normais e saudáveis devem ser prejudicadas o menos possível. Gomo agentes quimioterapêuticos, interessam quase exclusivamente os compostos citostaticos que, em geral, actuam de maneira não específica toxicamente sobre células normais e malignas e inibem o crecimento das células, istes farmacos citostaticos têm uma largura de utilização terapêutica muito vasta, o que origina acções secundarias graves. ^ssas acções secundarias são, por exemplo, hemorragias, náuseas, vomitos, dispneia, alergias, alope-cias, perturbações do músculo do coração, perturbações do ritmo cardíaco, pericardite, neuropatias periféricas e centrais, dores, nefropatiàs, estomatites, diarreia, febre, alterações da pele, infecções, insuficiências cardíacas ou alterações do estado de consciência. Á presente invenção tem como objectivo aumentar a actividade de agentes quimioterapêuticos sern que isso seja acompanhado do aumento dos efeitos toxicos destas substâncias. Proporciona composições farmacêuticas que originam a diminuição das acções secundarias acima mencionadas no caso do tratamento com farmacos quimioterapêuticos. 0 seu objectivo é aumentar a possibilidade de utilização terapêutica destes agentes quimioterapêuti-cos. No caso dos agentes citostaticos, deve fortalecer-se a sua acoao anti-tumoral ou antiproliferativa, de modo que estes far·· macos citostaticos possam ser administrados etn doses menores e *· 2 ΐ

assim, se possa realizar a diminuição ou a atenuação das acçSes secundárias provocadas por estes agentes terapêuticos. á requerente descobriu agora surpreen-dentemente que compostos que inibem a proteínaquina se C, em combinação com substâncias activas antineoplásticas, como, por exemplo, lipídos, análogos de lípidos agentes citostáticos ou inibidores de fosfolipases possuem uma acção sinérgica, JÍm especial, a requerente descobriu que, com a combinação de citostáticos, se verifica uma intensificação do efeito antiprolifera-tivo ou antitumoral.

No sentido em que é utilizada na presente memória descritiva, sob a expressão "inibidores de proteína -quina se C", entenderu-se os compostos que diminuem os teores de proteínaquinase C ou das correspondentes iso-enzimas que dependem do cálcio e dos fosfolípidos em extractos isentos de células ou em células intactas (Nishizuka (l9§6), Science 233» 305 - 3125 Nature (1988), 334, 662 - 665)· :issas substâncias podem ser isoladas das substâncias naturais de acordo com processos correntes ou também serem preparadas sinteticamente. Para essa finalidade interessam, por exemplo, os seguintes compostos : quercetina (3,3*, 4’, 5,7-penta-hidroxi-flavona, P. Horn (19S5), J. Bio-chern. 148, 533 - 538)5 éster de forbol, por exemplo, 13-aceta-to de 12»0-tetra-deca-nonil-forbol (TPA, R. Ragazzi (1986),

Xnt. J. Câncer 37» 731 - 737)? tamoxifeno (CMBrien e col. (1985), Câncer Research 45» 2462 - 2465); estaurosporina (T. Tamaoki e col. (1986), Biochem. Biophys. Res. Comm. 135» 397 -- 402); ou análogos de lípidos, como, por exemplo, fosfolípidos que contêm enxofre, em especial, Ilmofosina ou lisoleciti-na, em especial, CT-l8-0CH^. - 3 - r

critos no Exemplo um composto actua ser utilizado para o ã o.

Com o auxílio dos processos gerais des-1, pode garantir-se experimentalmente que corno inibidor da proteínaquinase C e pode a finalidade de acordo com a presente inven A Ilmofosina e o seu processo de preparação são conhecidos por meio da Patente de Invenção Europeia EP-E-0 O5O 327. Este composto é aí designado, no Exemplo 33» com o nome sistemático de éster de monocolina do ácido 3-hexa-decil-mercapto-metoxi-propanol-l-fosfórico. A Ilmofosina pertence ao grupo dos assim chamados derivados de aIquil-lisolecitina e é conhecido como um composto com propriedades canceros-tática s. ΕΤ-18-OGH^, cujo nome sistemático e ^--hidroxi-7-metoxi-N,N,N-trimetil-3 > 5» 9-trioxa-4-fosfa-heptaco-san-l«amínio-ií—óxido, é conhecido através da memória descritiva da Patente de Invenção Alemã DE PS 26 19 686. Este composto é aí descrito como agente antitumoral.

Como inibidores da proteínaquinase C no sentido utilizado na presente memória descritiva, interessam, especialmente, e Ilmofosina e ET-18-0CH^. Outros compostos conhecidos são Quercetina, Tamoxifene e Estaurosporina e os seus derivados quimicamente modificados.

Ao grupo das substâncias activas anti-neoplásticas pertencem, entre outros, os lípidos ou os análogos de lípidos, como por exemplo, fosfoixpidos, lípidos existe tes naturalmente ou também preparados sinteticamente, que contêm um radical fosfato. Entre eles, contam-se os glicerofosfa-tidos e os esfingofosfatidos assim como os seus derivados. - h - 1«

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Do grupo dos derivados sintéticos podem mencionar-se, de maneira especial, as seguintes estruturas i : derivados de 1-0-alquil-fosfolípidos, como, por exemplo, BT-18-0CH (H. U. líeltzien e col·, em Bther Lipids, Biochemi-

J cal and Biomedical áspects; i3d. Mangold, H, El. e Paltauf, F; Academic Press, Nova Iorque, 277 “ 308); derivados de 1-3-al-qu.il-fosfolípidos, como, por exemplo, Ilmofosina (3-hexadecil--mercapto-2-m3toxi-metil-propil-l“f>osf ocolina ) ; derivados de alquil-, alcenil- e acilfosfocolina- e etanolamina, como, por exemplo, hexadecil-fosfocolina (HPC); analogos halogenados de derivados de alquil-glicerol, alcenil-glicerol e acil-glicerol (K. Brackerts (1987), lipids 22, 897 - 9°3)· âos lípidos acima mencionados ou analogos de lípidos pertencem também os lípidos que contêm um grupo de hidratos de carbono e se designam por glicolípidos. Dividem--se em cerebrosidos e gangliosidos. 3e o radical de galactose de um cerebrosido está esterificado com sulfato, então trata-sa de sulfatidos. Todos os lípidos que contêm esfingosina são designados por esfingolípidos.

Interessam também ainda lípidos neutros, como, por exemplo, triglicéridos e colesteridos, assim como os seus derivados. Deste grupo, são de mencionar, especialr.ente, os derivados de Q-alquilo e derivados halogenados de trietil-giicerina.

De entre o grupo das substâncias acti-vas antineoplasticas contam-se ainda, especialmente, os agentes quimioterapêuticos. Sob estas substâncias entendem-se substâncias estranhas ao organismos em seguida mencionadas que são apropriadas e são utilizadas para esse efeito para destruir ou perturbar microrganismos, parasitas (antibióticos) ou células de tumores (citostaticos). - 5 -

De entre eles, podem-se mencionar, especialmente, os agentes citostáticos ou os seus derivados dos seguintes grupos de citostáticos í alquilântios, como, por exemplo, Ciclofosfamida, Clorambucil, Melfalan, Busulfan, compostos de N-Lost, Mustargeno; agentes citostáticos de compostos metálicos, como, por exemplo, complexos metálicos da platina, de paladio ou de rutenio, por exemplo, cis-diamino-diclo-roplatina(II) (CDDP); ant imetabólitos, como, por exemplo, ι-ietotrexato, S-^lnorura cilo, Citvrrabinaí substâncias naturais, como, por exemplo, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, etc; antibióticos, como, por exemplo, Dactinomicina, Daunorubicina, Doxorubicina, Bleomicina, Mitomicina, etc; hormonas e antagonistas de hormonas, como, por exemplo, dietil-estil-bestrol, Testolactona, Tamoxifeno, AminoglutatimidaJ outros compostos, como, por exemplo, hidroxi-ureia ou Procarbacina, assim como corticóides, como, por exemplo, Prednisolona.

Como substâncias activas antineoplasti-cas, no sentido da presente invenção, interessam especialmente compostos complexos de platina, como, por exemplo, cis-dicloro--diamino-platina-(ll) ou (IV), Mustargénio e Doxorrubicina (.Adriamicina).

Pertencem ainda ao grupo das substâncias activas antineoplasticas os compostos que inibem fosfolipases, como, por exemplo, Mepacrina (s. L. Hofmann e col. (1982) Arch. Biochem. Biophys. 215> 237 - 244), antiflosgísticos, como, por exemplo, Indometa cina , etc, Neomicina, o psicofarma cos, Tri-fluorperacina, etc..

Bm casos especiais, pode também acontecer que um composto caia tanto no grupo das substâncias anti-neoplésticas ja conhecidas no sentido da definição acima mencionada, como também no grupo dos inibidores de proteínaquina-se C. Isto é o caso, por exemplo, da Ilmofosina e de jí)T-1S-0CH^, AÍsse facto, no entanto, não limita a possibilidade de combina- 6

ção com outras substâncias activas antineoplasticas, desde que pelo menos uma das substâncias activas funcione corno ini-bidor de proteínaquina se C. s A utilização de uma terapia de combinação com o auxílio das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção apresenta a vantagem da intensificação sinórgica da acção antitumoral das substâncias individuais. Dessa forma, verifica-se a possibilidade de redução das doses e, por consequência, da toxicidade das substâncias individuais com obtenção simultânea da actividade antitumoral no caso da combinação das substâncias individuais. Uma terapia de combina ção dos princípios terapêuticos individuais acima mencionados apresenta ainda a possibilidade de se dominarem as resistência aos fa'rmacos citostãticos em que interessam não só as resistên cias aos grupos de substâncias como também ãs resistências múltiplas (resistência pleiotrépica aos citostãticos).

No caso de se utilizar a terapia de combinação, é possível administrar as substâncias activas numa combinação fixa, isto I, numa única formulação farmacêutica em que estão contidas as substâncias activas, ou então escolher uma assim chamada combinação livre na qual as substâncias activas podem ser adaiinistradas sob a forma de formulações farmacêuticas separadas simultaneamente ou também uma depois da outra. Λ preparação destas composições farmacêuticas de combinação realiza-se de acordo com os processos correntes conhecidos na técnica galénica.

Se as substâncias activas são sólidas, então, as substâncias activas podem ser processadas de acordo com os processos usuais, de maneira a obterem-se composiçães farmacêuticas sólidas (comprimidos, pastilhas, grânulos, capsulas de gelatina), em que, por exemplo, se misturam as duas substâncias activas uma com a outra e se comprimem com as substâncias veiculares ou auxiliares correntes, conjuntamente, por 7

exemplo, para obtenção de comprimidos. Mas é também possível colocar à disposição as substâncias activas em conjunto com as substâncias auxiliares farmacêuticas apropriadas, separadas uma da outra, numa unidade de embalagem pronta para venda, em que a unidade de embalagem contém as duas substâncias activas em formulações farmacêuticas separadas.

Se as substâncias activas são colocadas à disposição sob a forma de soluções para injecção, então estas podem encontrar-se nas combinações de substâncias activas, sob a fornia liofilizada ou contidas já sob a forma dissolvida injectável pronta para utilizar.

No entanto, é também possível, em princípio, que cada formulação parentérica contenha uma substâncias activa que interessa numa unidade individual de embalagem posta à diposição, de modo que as soluções para injecção podem ser administradas eventualmente separadas uma da outra. No caso de existir incompatibilidade entre as substâncias activas umas com as outras, é esta forma de utilização o método preferido .

No caso da forma de apresentação parentérica, as substâncias activas podem também encontrar-se em substâncias eventualmente em conjunto com as substâncias auxiliares farmacêuticas correntes, por exemplo, sob a forma liofilizada e ser reconstituidas ou solubilizadas por adição de meios de injecção farmacêuticos correntes.

As composições farmacêuticas são utilizadas sob a forma líquida ou sólida para administração por via entérica ou parentérica. Neste caso, interessam todas as formas de administração correntes, por exemplo, comprimidos, cápsulas, drageias, xaropes, soluções, suspensões. m* 3 —

Como meio de injecção, interessa de pre ferência utilizar agua, que contém os aditivos correntes das soluções para injecção, tais como agentes estabilizantes, co-dissolventes e tampões. São aditivos deste tipo, por exemplo, manite, tampão de tartarato e de citrato, etanol, agentes com-plexantes como, por exemplo, acido etilenodiaminotetracético e os seus sais não tóxicos, assim como polímeros de elevado peso molecular, como poliéxido de etileno líquido para regular a viscosidade. Ás substâncias veiculares líquidas para as soluções para injecção devem ser esterilizadas e são, de preferência, embaladas em ampolas. Âs substâncias veiculares sóiidas são, por exemplo, amido, lactose, ácidos silícicos, ácidos gordos de elevado peso molecular, como ácido esteárico, gelatinas, agar-agar, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, gorduras de origem animal e vegetal, polímeros sólidos de elevado peso molecular, como polietilenoglicóis. Ás formas de apresentação para a administração por via oral apropriadas podem, caso assim se pretenda, conter substâncias apaladantes e edulcorantes. A dosagem pode depender de diferentes factores, como o modo de aplicação, a espécie, a idade e o estado individual, ás doses a administrar diariamente variam entre cerca de 0,05 e 100 mg/kg de peso corporal por componente individual. Por exemplo, no caso da combinação de CBDP e de quercetina, pode utilizar-se uma dose de 1 - 10 mg/kg, em especial, 3 mg/kg de CBDP, ou 10 - 50 mg de quercetina, em especial, 20 mg/lcg. Á quantidade das respectivas substâncias acti-vas por unidade de forma de apresentação varia entre 5 ® 1.000 mg.

No caso das composições farmacêuticas de combinação, a proporção entre as substâncias activas que actuam como inibidores da proteínaquinase 0 e os lípidos, aná- - 9 - logos dos lípidos, citostaticos ou inibidores da fosfolipase pode variar dentro de largos limites. Assim, por exemplo, são possíveis proporções molares compreendidas entre 1 ί 1.000 e 1.000 s 1, de acordo com a actividade das substâncias activas que interessam. No caso de combinação com citostaticos, prefere-se uma proporção compreendida entre 1 í 100 e 100 : 1. Es-pecialmente no caso da combinação de Ilmofosina ou de ET-lB--OCH^ com cis-diamino-dicloro-platina(li), interessa uma propo:? ção de 1 í 50 até 50 : 1, mas, de preferência, no entanto, de 1 í 1 até 50 * 1.

No sentido da presente invenção, intere^ sam, por exemplo, as seguintes composições farmacêuticas de combinação

Inibidor de proteína-quinase C A Actividade antineoplastica B Molar de Proporção A i B muercetina cis-DDP ca. de 100 i 1 Cjuertecina Mustargene ca. de 800 : 1 Tamoxifene cis-DDP ca. de 10 : 1 Estaurosporina cis-DDP ca. de ls 100 Ilmofosina cis-DDP ca. de 10 : 1 ET-18~0CH3 cis-DDP ca. de 10 s 1

Os seguintes Exemplos referem-se à actividade sinérgica de algumas composições farmacêuticas representativas e representam casos especiais de exemplos ma is caracte-rxsticos de composições de acordo com a presente invenção. — 10 —

IxmiPLOs iixemplo 1

Processo geral para o ensaio de compostos reXativamente à sua função como inibidores da proteínaauinase C a) Reagente

Soro de cavalo e DkiSk (meio essencial mínimo de Dulbecco modificado) foram adquiridos na firma Boe-hringer kannheim, República federal da Alemanha.

Cis-diamina-dicloro-platina(li) foi fornecido por Homburg Pharma, Frankfurt. £ Gama-32P.J-ATP (lO Ci/milimole) e 32P-ortofosfato foram fornecidos por RadioChemical Centre, Amersham, Reino Unido.

Filtro GF/F e celulose DB-52 foram fornecidos por vihatman, Clifton, NJ (kstados Unidos da América).

Luepptina, Aprotinina, Quercetina (3,3* , 4«,5,7-penta-hidróxi-flavona), Tamoxifeno, 13-acetato de 12-0--tetradecanoil-forbol (TPA), beta-glicerofosfato, Hxston Hl (Tipo III s), acido 3-N-moffolino-propano-sulfúnico (MOPS) , L-alfa-fosfatidil-L-serina e 1,2-sn-dioleína foram fornecidos por Sigma, hunique, Republica Federal da Alemanha.

Proteínaquinase C foi fornecida por kerck, Darmstadt, República Federal da Alemanha.

Tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS--HCl), ácido etilenoglicol-bis-(aminoetil)-tetracético (3GTA), - 11 «

dodecil-sulfato de sódio (Sps) e Triton X-100 foram fornecidos por Serva, Heidelberg. i

Mustargene (íI2) foi fornecido por Λ1- drich, Steinheim.

Bstaurosporina foi fornecida pelo Prof. Ratter, Ciba-Geigy, Basileia (Confederação Helvética).

Ilmofosina foi adquirida em Boehringer Mannheim, República Federal da lleraanha e foi sintetizada como foi descrito por Bosies e col. (Lipide (1987)» 22, 9^7 - 95l) ·

Para os ensaios, utilizou-se uma solução base de 100 microgramas/mililitro de Ilmofosina em DKDI-I ma is 10^a de soro de feto de vitelo (FCS) . A solução de base foi armazenada a 4°C.

Boxorrubicina (Adriamicina, Adriablasti-na) foram fornecidas por Farmitalia/Carlo Brba GmbH, Freiburg, República Federal da Alemanha. b) Inibição da Proteínaouinase C (PIC-C) - (Método In Vitro) Â proteína quina se 0 foi enriquecida a partir de células de ¥alker por cromatografia etn celulose~DBA3 dos extraetos de células procedendo de acordo com o método descrito por Kreuiter e col. (J. Biol. Chem. 260, 5979 ** 598^· (1985)).

No entanto, aos extraetos adicionou-se fluoreto de fenilmetano-sulfonilo 1 mM, 30 microgramas/milili-tro de Leupeptina e 2 microgramas/ml de Aprotinina. A actividade de proteínaquina se C foi 32 — o determinada pela medição de P->integração de /_ gama» Β_7”ΑΤΡ - 12

em EI Histona, de acordo com o método de Fabbro e col. (àvdh. Biochem. Biophys. 239» 102 - 111 (1985))· & mistura reaccional (125 microlitros) continha 0,5 jiCi de [_ gama- P_7-ÀTP, 40 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 1 mH de CaCl2, 700 jjH de ϊ»Τλ, 50 /iG de Histon, 6,75 microgramas de L»alfa«fosfatidil-L-serina e 0,675 micrograma de 1,2~s,n-dioleína. 0 tempo de reacçao foi igual a dez minutos a 32°C. Xnterrompeu-se a reacçao enzimatica por adição de 1 ml de acido tricloro-acético a 20^> (em peso/voiume), k proteí na foi colocada em cima de papel de filtro bhatman GF/p e contada com o auxílio de um contador de cintilações em fase líquida . c) Inibição da proteínac-uinase C* (PIÍ-C*) - (Método in Vivo) fosforilacão de proteína 56 de ribosomas

Incubaram-se células em BÍ>à£M com 0,5λ> de soro de cavalo (volume/volume) durante um intervalo de tempo de quinze horas e, em seguida, incub m-se em meio isento de fosfatos. Depois de uma hora, adicionaram-se 4 p.Ci/ml de 32„ ' P-ortofosfato e, depois de mais trinta minutos, 0,5 jM de TP/i (13-acetato de 12-0-tetradecanoil-forbol) e 59 solução p&i de ^uercetina. ãs células foram lisadas "em 59 mM de Tris- -HCi, pH 7,5, 25 mM de HC1, 5 mM de MgCl^, 0,33 M de sacarose,

1/á de Triton X-100 (em volume/volume) , 1 mM de cloreto de feniL -metano-sulfonilo, 20 yug/ml de Leupeptina, 2 ^jLg/ml de Aprotini- na e 80 mM de beta-glicerofosfa to.

Centrifugou-se o lisado depois de dez minutos a 0 C a 30.000 g durante dez minutos. Lavou-se a pele-te uma vez por ressuspensão com tampão de lise e, em seguida, centrifugou-se a 30,000 g. Reuniram-se os sobrenadantes e centrif ugaram»se a 100.000 g durante três horas. Ressuspenderam--se as peletes em ureia 8 molar e aqueceu-se à ebulição durante dez minutos. - 13 -

Analisaram-se os estractos por electro-forese a uma dimensão em gel~3B3 em geles de poliacrilamida a 15/- (Laemmli, Reino Unido (1970), Nature 227, 680 -685). Depois de se passar o gel para nitrocelulose, identificou-se a protex-na por adição de anti-soro anti-S6.

Ebcemplo 2

Quer cetina como inibidor da proteína quina se 0

Como se descreveu mais pormenorizadamente no Bxemplo 1, investigou-se a influência de Quercetina sobr3 a proteínaquinase C e sobre a multiplicação de células de carcinoma de Qalicer em cultura.

Solubilizou-se a Quercetina em sulfdx i-do de dimetilo (DMSO). A solução em DMSO foi adicionada à mistura reaccional até uma concentração final de DMSO igual a 1$. Adicionou-se uma quantidade equivalente de DMSO puro aos grupos de controlo. Investigou-se a influência da Quercetina sobre a multiplicação de células por adiçao da substância activa em DSI-íO ao meio de cultura até se obter uma concentração final de 0,1/-. /is células foram desenvolvidas em presença da substância activa durante quarenta e oito horas* 0 grupo de controlo recebeu simplesmente DMSO puro. 100$ de actividade da proteína- 32 qninase 0 corresponde a ií-4,8 picoloms/minuto de P tranferido para Hl. que a Que r ce t in a (ci50 = 25 p). A partir dos dados obtidos, conclui-se funciona como inibidor da proteínaquinase

Ik

Exemplo 3

Tamoxifeno como inibidor da proteínaquinase C

Procedendo de maneira análoga ã qu.e se descreveu no Sxemplo 2, investigou-se a influencia do Tamoxife-ne sobre a proteinaquinase C. á partir dos dados obtidos, foi possíveL determinar o valor de CI^0 como 11,20 micromolar.

Sxe pio 4 ijistaurosporina como inibidor da proteinaquina se descreveu no porina sobre

Procedendo de maneira análoga ã que se Sxemplo 2, investigou-se a influência de Sstauros a proteínaquinase C.

Foi possível determinar o valor de como sendo a 0,048 micromolar.

Exemplo 5

Ilmofosina como inibidor da proteinaquinase 0

Procedendo de maneira análoga â que se descreveu no Sxemplo 2, ensaiou-se o efeito da Ilmofosina sobrs a proteinaquinase C. 0 valor de CI^^ foi igual a 20 micromolar.

Sxemplo 6

ST-18-0CH 2

ooirio inibidor da proteínaquina se N

Procedendo de maneira análoga à que se descreveu no Sxemplo 2, ensaiou-se a influencia de BT-l8-QCH^ 15 -

sobre a proteína quina se C. ET-l8-0CH^ inibe a proteína quina se G tal como a Ilmofosina (CI,*q = 24,8 p&í).

Exemplo 7

Processo geral para a determinação do efeito sinérgico de uma combinação de inibidor de proteinaquinase C e uma substância activa antineoplatica a) Desenvolveram-se células de carciono-ma de ; alker de ratazana em suspensões de DtlEM (meio essencial mínimo de Dulbecco modificado) com uma proporção de lO^o (em volume/volume) de soro de cavalo e de tampão MOPS 25 mM (pH 7,35 a 20°C) a uma temperatura de 36,8°C. )

Obtiveram-se as curvas de actividade em função da dose para as substâncias activas individuais ou para as combinações de substâncias activas por adição das correspon dentes substâncias activas a uma suspensão de células de Ual-ker (lO5 células/ml). Depois de um tempo de incubação de quarenta e oito horas, contaram-se as células com o auxílio de um contador eléctrico (Coulter-Electronics, Luton, Reino Unido multiplicação das células (íi) foi calculada por meio da seguinte fórmulaí 11 = qt - - °0) 100 na qual C significa as células de controlo não tratadas, T significa o número de células tratadas e os índices 0 e t significam o número de células no instante inicial 0 e depois de quarenta e oito horas.

Determinou-se o efeito sinérgico das combinações de substancias activas de acordo com o método descrito por Chou e Talalay (Eur. J. Biochem. (1981), 115, 2O7 -- 216 e Advances Enzyme Regul. (1984), 22, 27 - 54). Os dados - 16 k

utilizados para o calculo referem-se a pelo menos três experiê cias diferentes. 0 programa de calculo foi fornecido por Else-vier Biosoftware, Cambridge, Reino Unido (analise do efeito da dose com microcomputadores). b) Integração de /-¾ 7 -timidina

Ensaiou-se o efeito citostãtico ou cito-téxico das substâncias activas e das combinações de substância activas sobre células de fibrossarcoma Methá com base na integração atenuada de /-¾_7 -timidina. As células foram suspen- » li sa s em DtiEii ate se obter· uma concentração ficai de 5 x 10 /ml na ausência de substância activa, 10^> de PC3, 50 micromolar de 2-mercapto-etanol, 100 ϋ/ml de penicilina, 100 microgramas/ ml de estreptomicina. As substâncias activas foram adicionadas num volume de 20 microlitros às células.

Por concentração, empregaram-se seis culturas com 0,2 ml e incubou-se em placas de microtitulação em clima hémido. As culturas foram desenvolvidas durante três horas com 1 microcurie (27 kBq/célula) de /”metil-^Ii_7 -timidi na (actividade específica 5 Ci/rnM) . As amostras foram em segui da colectadas e lavadas varias vezes. As placas do filtro foram secas e transferidas para vidros de cintilação. A integração radiactiva foi medida depois de adição de Rotiszint.

Exemplo 8

Efeito sinérgico de quercetina e cis-diamino-dicloro-platina (II) (cis-DDP)

Procedendo como se descreveu no Exemplo 7 a), ensaiou-se a influência de cis-DDP, de quercetina e de uma mistura de Quercetina/cis-DDP (proporção molar 100 : l) sobre células de sarcoma de Ualker de ratazanas. As células foram desenvolvidas em presença das respectivas substâncias - 17 -

activas durante o inoervalo de tempo de quarente e oito horas. Os resultados estão retinidos na Tabela 1.

Exemplo 9

Combinação sinérgica de Quercetina e de Mustargene

Procedendo como se descreveu no Exemplo 7 a), ensaiou-se a influência de Quercetina, Mustargene e de urna mistura de Quer ce tina/Mustargene (proporção molar 800 : l) sobre as células de sarcoma de lalker em ratazanas. Os resulta dos encontram-se indicados na Tabela 1.

Exemplo 10

Combinação sinérgica de Tamoxifene e de cis-DDP

Procedendo como se descreveu no Exemplo 7 a), investigou-se a influência de Tamoxifene, cis-DBP e de uma mistura de Tamoxifene/cis-DDP (proporção molar 10 : l) sobre células de sarcoma de IJalker de ratazanas. Os resultados encontram-se retinidos na Tabela 1.

Exemplo 11

Combinação sinérgica de Estaurosporina e de cis-DDP

Procedendo como se. descreveu no Exemplo 7 a), ensaiou-se a influência de Estaurosporina, de cis-DDP e de uma mistura de Estaurosporina/cis-DDP (proporção molar 1 : 100) sobre células de sarcoma de í/alker de ratazanas. Os resultados estão reunidos na Tabela 1.

Exemplo 12

Combinação sinérgica de Ilmofosina e de cis-DDP - 18

Procedendo como se descreveu no Exemplo 7 a), ensaiou-se a influência de Ilmofosina, de cis-ΓΠΡ e de uma mistura de Ilmofosina/cis-DDP (proporção molar 10 í l) sobre - células de sarcoma de Tíalker de ratazanas. Os resultados obtidos estão indicados na Tabela 1.

Exemplo 13

Combinação sinérgica de BT-lS-QCH^ e cis-DBP

Procedendo como se descreveu no Exemplo 7 a), investigou-se a influência de ET-lS-OCH^, cis-DBP e de uma mistura de ET-lS-OCH^/cis-BDP (proporção molar 10 : l) sobre células de sarcoma de walker de ratazanas. Tal como se descreveu no Exemplo 12, também neste caso se verifica uma actividade sinérgica (veja-se Tabela l). ΤΜΜΑΛ

Inibição da replicacão celular e fortifica proliferativo; determinação do valor de Cl çao52 do efeito anti-

Exem plo Inibidor de proteína quina se C Inibiç Proteína quina -se C CI5o jao Proliferação de célula s cl50 £s^ij oi50 Z*>L7( 1) Proliferação de células em combinação com cis-DDP U) Tipo de a ctividade 2,8 ί-iuer cetina 25 23 3,8 Sinergismo 2,9 tiuer cetina 25 23 Sinergismo 3,10 Tamolifene 11,20 12,44 2,24 Sinergismo 4,11 Estaurospo* rina 0,048 0,04 0,004 Sinergismo 5,12 Ilmofosina 0,56 20 2 Sinergismo 6,13 ET-18-0CH 24,8 5,8 1,7 Sinergismo ci s—.uDP y 1000 0,23 M - - 19 -

MOT/i S: 1) centração de inibidor I proteínaquina se G ou da

Como valor de Cl 50’ mtende-se a qual ee atinge uma inibição de 5G/; proliferação das células. con da 2) A base de cálculo relativamente ao efeito sinérgico realizou-se de acordo com 0 método de Chou e Talalay (Advances íinzyme Regul. 22^, 27 - 5^- (l9S4)).

Exemplo 14

Procedendo como se descreveu no processo geral do Exemplo 7 b), determinaranmse os valores de CI^q para uma combinação de Ilmofosina com CDDP e com Doxorrubicina. Os resultados estão reunidos na Tabela 2. T-ABELA 2

Inibição da Proliferação de Células de Tumores

Inibidor de PIC-C A Substância activa antineoplastica B Proporção A íB gi5o ZVe/mi_7 Ilmofosina CDDP 100 i 1 1,09 Ilmofosina Doxorrubicina 100 : 1 1,11 Ilmofosina - - 1,06

Exemnlo 15

Preparação de composições farmacêuticas

Os compostos A e B, escolhidos como substâncias activas, podem ser utilizados em diversas formulações galénicas. Os exemplos seguidamente indicados referem-se - 20 - a composições galénicas que contêm uma substância activa designada com a letra A como inibidor de proteínaquina se G e uma substância activa antineoplastica 4 designada com a letra B. a) Comprimidos

jfiistura I

Substância activa A 50 mg í-.aiido 180 mg

Sstearato de magnésio 20 mg

Mistura II Substância activa B 50 mg Diéxido de silício 100 mg La ctose 100 mg Aerosil 5 mg

As misturas ± e J.I são secas separadamente uma da outra e granuladas em húmido. Cm seguida, misturaram-—se uma com a outra com adição de 5 mg de talco e transformam— -se em comprimidos. b) Capsula s

Mistura I Substância activa A 50 mg La ctose 110 mg Amido de milho 20 mg Gelatina 8 mg Dstearato de megnésio 12 mg

Mistura II Substância activa B 200 mg Polivinil-pirrolidona 10 mg Amido de milho 100 mg Ceatina HR 10 mg

As duas misturas I e II são preparadas separadamente e granuladas de acordo com os processos usuais. Kum misturador apropriado, misturam-se os'dois granulados na proporção de mistura um com o outro e adiciona-se o talco, como pó, no misturador. Bm seguida, embala-se a mistura à maquina em capsulas de gelatina clura. 21 -

Claims (3)

1. \ C)

   Solução para injecções i m ou i. v. Urna solução para injecções i. v. pronta Lnistrar contêms Substânc 3ÍCS activa A 50 mg Substância activa B 100 mg Cloreto de sódio 20 mg A cela to de sódio 6 mg Água destil ,ada ate perfazer 5 ml Uma solução para injecções i. m. pronta para empregar contêm: .Substância activa A 100 mg substância activa B 100 mg Benzoato de benzilo 1 g Sol para injecções 5 ml - 1& » Processo para a preparação de composições farmacêuticas antineoplasticas contendo uma mistura sinergica de um inibidor de proteinaquina se C com um antineoplástico, para utilização na terapia antineoplãstica, caracterizado pelo facto de se incorporar pelo menos duas substâncias activas, uma das quais ê um inibidor da proteinaquina se G e a outra possui actividade antineoplástica, numa proporção molar de preferência compreendida entre cerca de Is 1000 e 1000:1, nas substâncias veiculares ou auxiliares farmacologicamente aceitãveis 22 -

   e se processar a mistura de maneira a ter a forma de apresentação apropriada para a administração por via oral ou parenté-rica.
2. - 2^ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a substância activa com activi-dade antineoçlastica ser um lípido, um composto semelhante a lípido, um citostãtico ou um composto com acçao de inibição da fosfolipase.
3. - 3& ~ Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caractei-izado pelo facto de a substância activa com actividade antineoplastica ser um citostãtico. - Z*s - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado peio facto de os citostãticos serem alquilan-tienos, compostos complexos metálicos, antimetabólitos, antibióticos, antagonistas de hormonas ou corticoides. - 5a - Prooesso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de os citostãticos serem Ciclofos-famida, Olorambucil, cis-diamino-dicloroplatina(li), Metotre-xato, 5-Flu.oru.ra cilo, Doxorubicina, Bleomicina ou Tamoxifeno. - 6& - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a caracterizado pelo facto de a substância 23 I at 9 activa que aotua como inibidor da proteinaquinase 0 ser escolhida do grupo constituído pelos lípidos, fosfolípidos, glico-lípidos ou lípidos neutros ou seus derivados. -> — Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de a substância activa que actua como inibidor da proteínaquinase C ser f^aecer-tina (3,3’, 4’, 5,7-penta-hidroxiflavona), Tamoxifeno, Ilmofo-sina (3-hexadecil-mercapto-2-metoximetil-propil-l-fosfato de mono colina), ώΤ-18-OCH^ (4-hidroxi-7~metoxi«N ,N ,N<»tr imetil--3,5, 9-trioxa-4«fosfa-hepta cosano-l-amínio-4-óxido) ou Stauros-porina. - 8* - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7» caracterizado pelo facto de se empregar Ilmofosina ou cis-diamino-dicloro-platina(Xl). Â requerente reivindica a prioridade do pedido alemõo apresentado em 18 de Agosto de 1988, sob o ns. P 38 27 974.6. Lisboa, 17 de Agosto de I9S9 ® ΑβΒΗΕΗ OSICUL· BA «1H2EBBABJ ETMiSfEILAjL·

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