ES2246165B1 - Uso combinado del pteroestilbeno y la quercetina para la fabricacion de medicamentos utiles en el tratamiento del cancer. - Google Patents
Uso combinado del pteroestilbeno y la quercetina para la fabricacion de medicamentos utiles en el tratamiento del cancer.Info
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Abstract
El crecimiento in vitro de células de melanoma B16-F10 (B16M-F10) es inhibido (56%) por exposiciones combinadas de corta duración (60 min/día) a PTER (40 {mi}M) + QUER (20 {mi}M) ({aprox} valores medios de concentraciones en plasma medidas dentro de la primera hora tras la administración i.v. de 20 mg de cada polifenol/kg {aprox}). La administración intravenosa combinada de PTER + QUER (20 mg/kg x día) a ratones inhibe (73%) el crecimiento metastático del melanoma B16M-F10 en el hígado, un lugar habitual de desarrollo de metástasis. La invención muestra que la asociación de PTER + QUER inhibe el crecimiento de metástasis de melanoma maligno y alarga la supervivencia del huésped portador.
Description
Uso combinado del Pteroestilbeno y la Quercetina
para la fabricación de medicamentos útiles en el tratamiento del
cáncer.
La invención se adscribe al ámbito farmacéutico,
en concreto al uso combinado de dos principios activos, el
pteroestilbeno y la quercetina, en la fabricación de medicamentos
útiles para el tratamiento del cáncer.
Diferentes compuestos fenólicos, incluido el
resveratrol (RESV), muestran potentes efectos antioxidantes y
pueden tener aplicaciones terapéuticas en enfermedades relacionadas
con el estrés oxidativo tales como el cáncer
(1-3).
La actividad anticancerígena del RESV fue
comunicada por primera vez por Jang et al. en 1997 (4). Los
mecanismos por los que el RESV ejerce sus efectos antitumorales
están siendo investigados activamente (3) y pueden incluir por
ejemplo: a) inhibición de las actividades ribonucleótido reductasa
(5), DNA polimerasa (6), proteína quinasa C (7), o
ciclooxigenasa-2 (8); b) inhibición de la
carcinogénesis mediada por especies reactivas del oxígeno (4) o de
la proliferación celular (9); y c) activación de la muerte celular
por apoptosis (10-13). Sin embargo, la inhibición
potencial del crecimiento canceroso mediada por el RESV está
fuertemente limitada debido a su baja biodisponibilidad (14). En
consecuencia, parecieron necesarias modificaciones estructurales de
la molécula del RESV al objeto de incrementar su biodisponibilidad
pero preservando su actividad biológica. El OH de 4' y la
estereoisomería en su conformación trans son absolutamente
necesarias para la inhibición de la proliferación celular (15). El
pteroestilbeno (PTER), un análogo del RESV presente en la
naturaleza pero aproximadamente 60-100 veces más
potente como agente antifúngico, muestra propiedades
anticarcinógenas similares (16). Además, los flavonoides están entre
los antioxidantes más potentes porque muestran uno o más de los
siguientes elementos estructurales: un grupo o-difenólico,
un doble enlace en 2-3 conjugado con la función
4-oxo, grupos OH en las posiciones 3 y 5. La
quercetina (QUER) combina estas tres propiedades e investigaciones
previas han confirmado que también tiene propiedades antitumorales,
probablemente debido a la estimulación inmune, la eliminación de
radicales libres, la alteración del ciclo mitótico de las células
tumorales, la modificación de la expresión génica, la actividad
antiangiogénica, o la inducción de la apoptosis, o una combinación
de estos efectos (2, 17). En concreto la QUER se ha descrito (US
2003/0054357) en el tratamiento del cáncer de próstata. Existen
patentes (WO02/34262) que ponen de manifiesto el efecto
antioxidante de ciertos flavonoides, en concreto de una combinación
de quercetina más catequina para su uso en el tratamiento y la
prevención de trastornos circulatorios o cardíacos, previniendo la
agregación plaquetaria.
Puesto que todavía no se ha demostrado que los
efectos anticancerígenos potenciales sean efectivos mediante la
administración sistémica, investigamos las propiedades
anticancerosas de una administración sistémica combinada de PIER y
QUER a concentraciones biodisponibles. Encontramos que su
asociación inhibe fuertemente el crecimiento del melanoma maligno
metastático B16-F10 (B16M-F10).
B16M-F10, melanoma
B16-F10; RESV, resveratrol; t-RESV,
trans-resveratrol; PTER, pteroestilbeno;
t-PTER, trans-pterostilbeno; QUER,
quercetina; HSE, endotelio sinusoidal hepático;
VCAM-1, molécula de adhesión celular vascular 1;
VLA-4, antígeno de activación muy tardía 4;
B16M-F10/Tet-Bcl-2,
melanoma B16 F10 que sobreexpresa Bcl-2;
LC-MS/MS, cromatografía líquida de alta presión y
espectrometría de masas; i.v., intravenosa/intravenosa-
mente; i.p., intraperitoneal; DS, desviación estándar.
mente; i.p., intraperitoneal; DS, desviación estándar.
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A los efectos de la invención por PTER y QUER se
debe entender también cualquier sal farmacéuticamente aceptable,
particularmente los sulfatos de ambos polifenoles, así como
cualquier otro derivado farmacéuticamente aceptable,
particularmente los glucurónidos de cualquiera de los susodichos
polifenoles.
La biodisponibilidad y la eficacia biológica
in vivo son factores críticos que deben correlacionarse
antes de sacar ninguna conclusión sobre los beneficios potenciales
para la salud de los polifenoles (14, 30, 33, 34). Como se muestra
en la Fig. 2, donde se estudió el efecto de t-RESV,
t-PTER, o QUER, la inhibición de la proliferación
de las células B16M-F10 in vitro fue más
potente en presencia de t-PTER + QUER. Las
concentraciones biodisponibles de PTER y QUER, medidas en plasma
después de la administración oral, no consiguieron inhibir el
crecimiento de células B16M-F10, incluso en los
casos en que las concentraciones de estos polifenoles fueron
constantes a lo largo del tiempo de cultivo, véase Ejemplo 2. Sin
embargo, las concentraciones biodisponibles de PTER o QUER, medidas
en plasma después de la administración i.v. (véase la Fig. 1),
inhibieron el crecimiento tumoral hasta en un 56%, incluso en los
casos en que ambos polifenoles estaban presentes sólo durante 60
minutos por cada 24 horas de cultivo (Fig. 2), sin incrementar la
tasa de muerte celular (la viabilidad celular siguió siendo >
95%, como en los controles, en todos los casos).
Basándonos en estos hechos, sobre las
diferencias de biodisponibilidad, y sobre los datos mostrados en la
Fig. 2, seleccionamos la combinación de PTER + QUER para estudiar
su efecto sobre la progresión metastática. Como se muestra en la
Tabla 3, se investigó el efecto de t-PTER, QUER,
t-RESV, o sus combinaciones sobre la interacción
in vitro entre las células B16M-F10 y el
endotelio vascular. De forma paralela al efecto sobre el crecimiento
tumoral (Fig. 2), la asociación entre PTER y QUER fue la que mostró
mejor capacidad para disminuir (en aproximadamente un 74%) la
formación de colonias tumorales en un ensayo de invasión in
vitro (Tabla 3).
Para demostrar que polifenoles naturales tales
como el t-PTER y la QUER inhiben el crecimiento
metastático in vivo de un tumor altamente maligno y aumentan
la supervivencia del portador, utilizamos la administración i.v.
diaria de dosis elevadas (20 mg/kg de peso corporal administrados
una sola vez al día). Sin embargo, en este punto se pueden
considerar diferentes protocolos posibles. Por ejemplo, si
demostrara ser más efectivo, y no tóxico para los seres humanos, se
podrían elevar las dosis. Además, nuestros resultados no descartan
posibles beneficios con el uso de la administración oral. De hecho,
el t-RESV inhibe la expresión de
VCAM-1 a concentraciones muy bajas (1 \muM) (14).
No obstante, como han señalado Goldberg y colaboradores (30) y
teniendo en cuenta el metabolismo in vivo de estos pequeños
polifenoles (ver por ejemplo 34-35),
investigaciones de esta naturaleza deberían centrarse en los
beneficios de sus conjugados (por ejemplo glucurónidos y sulfatos).
Es más, las dosis requeridas para inhibir el crecimiento de
metástasis puede depender del tipo de célula. Además, la asociación
de t-PTER + QUER podría ser útil también en otras
patologías relacionadas con el estrés oxidativo (por ejemplo
diabetes, arteriosclerosis, enfermedades neurodegenerativas, o el
corazón isquémico) (36) donde las dosis requeridas para obtener
beneficios podrían ser similares o completamente diferentes. En
conclusión, nuestros hallazgos ponen de manifiesto las aplicaciones
de las asociaciones de polifenoles en la terapia contra el cáncer.
Es más, puesto que la administración de polifenoles se puede
combinar con bioterapia, fármacos citotóxicos y/o radiaciones
ionizantes, los mecanismos descritos en la invención pueden tener
aplicaciones útiles para mejorar la terapia contra el melanoma
metastático y, posiblemente, contra otros tipos de tumores
malignos.
Los ratones (C57BU/6J, machos,
6-8 semanas) eran de Charles River España
(Barcelona). Los procedimientos y cuidado de animales se realizaron
en conformidad con normativas institucionales y cumpliendo leyes y
políticas nacionales e internacionales (Directiva 86/609, OJ L 358.
1 del Consejo de la Comunidad Europea, de 12 de diciembre de 1987)
y la "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"
("Guía para el Cuidado y la Utilización de Animales de
Laboratorio") del Instituto Nacional de la Salud (NIH, EE.UU.)
(Publicación del NIH nº 85-23, 1985). A todos los
animales se les alimentó siguiendo dietas concentradas de
laboratorio (Letica, Barcelona, España) permitiéndoles libre acceso
a los alimentos y sometiéndoles a un ciclo de 12 horas de luz/12
horas de oscuridad con temperatura ambiente a 22ºC. Los experimentos
se comenzaron a las 10.00 a.m. para minimizar los efectos de las
variaciones diurnas.
Para los estudios farmacocinéticos y para el
tratamiento diario se administró a los ratones i.v. (vía vena
yugular donde, previamente, se había fijado por medios quirúrgicos
un catéter permanente; la administración i.v. se realizó lentamente
durante 1 minuto), u oralmente (vía tubo intragástrico), 20 mg/kg de
t-PTER (disueltos en etanol 0,5 mVKg de peso de
animal) o QUER (disueltos en dimetilsulfóxido:solución salina
fisiológica, 1:0,5 0,15 mg/Kg de peso). En general, las
composiciones a base de una combinación de PTER y QUER pueden
contener como excipientes los anteriormente consignados o cualquier
otro farmacéuticamente aceptable. La presentación de dichas
composiciones pueden ser, de manera no limitativa, en forma de
sólidos como tabletas, cápsulas, pellets, píldoras, etc. y
presentaciones líquidas como gotas, jarabes, inyectables, etc...
Asimismo, los principios activos (PTER y QUER) de la composición
pueden presentarse en sus formas libres o en forma de sales
farmacéuticamente aceptables incluyendo los ésteres. El
t-PTER se sintetizó en nuestro laboratorio
siguiendo reacciones estandarizadas de Wittig y Heck
(www.orgsyn.org), mientras que la QUER se obtuvo de Sigma
Chemical Co. (San Luis, MO, USA). El
^{3}H-t-PTER (2,2 Ci/mmol),
marcado en las posiciones orto y para de los anillos bencénicos, se
preparó en nuestro laboratorio siguiendo un método similar al
utilizado para la deuteración de fenoles (18). La
^{14}C-QUER (50 mCi/mmol), marcada en la posición
4 del anillo C se obtuvo del NCI Radiochemical Carcinogen
Repository de Chemsyn Laboratories (Kansas City, MO, USA). La
radiactividad se midió utilizando un analizador Varisette 2700 TR
de Packard. La sangre se recogió por medio del catéter en
jeringuillas de 1 ml que contenían heparina sódica (0,05 ml de una
solución al 5% en NaCl al 6,9%). El plasma y los eritrocitos se
separaron como se ha descrito previamente (19).
La LC-MS/MS se llevó a cabo
utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Quattro
Micro (Micromass, Manchester, UK) equipado con una bomba
LC-10Advp, un sistema de control
SLC-10Avp y un autoinyector
SIL-10Advp de Shimadzu. Las muestras se analizaron
mediante cromatografía líquida de alta presión en fase reversa
utilizando una columna Prodigy ODS (100 x 2 mm) de Phenomenex
(Torrance, CA, USA), con un tamaño de partícula de 3 \mum. En
todos los casos se inyectaron en la columna 40 \mul. La
temperatura de la columna se mantuvo a 25ºC. Se utilizó el siguiente
sistema de gradiente, bombeado a través de la columna a 0,2
ml/minuto (min / %A / %B / %C) (A, metanol; B, 10% de acetonitrilo
y 90% de formiato amónico 10 mM pH 3,75; C, formiato amónico 10 mM
pH 3,75): 0/5/5/90, 10/5/5/90, 20/5/90/5, 30/100/0/0, 40/5/5/90.
Los espectros de masas en tándem de iones negativos obtenidos
mediante electrospray se registraron con el capilar de electrospray
fijado a 3,5 keV y a una temperatura del bloque de origen de 120°C.
Como gas nebulizador y de secado se utilizó nitrógeno con flujos de
300 y 30 l/h, respectivamente. Como gas de colisión para la
disociación inducida por colisión se utilizó argón a 1,5 x
10^{-3} mbares. Se realizó un ensayo basado en
LC-MS/MS con el seguimiento de múltiples reacciones
utilizando las transiciones m/z 255-240 para el
PTER y 300-151 para la QUER, los cuales representan
en ambos casos rutas de fragmentación favorables para estas
moléculas desprotonadas. Las curvas de calibración se obtuvieron
utilizando un patrón de PTER o QUER (0,01-100
\muM) y en cada caso se encontró que eran lineales con
coeficientes de correlación >0,99. Los límites de detección y
cuantificación de nuestro método fueron de 0,01 \muM.
Dependiendo de los hábitos dietéticos la ingesta
humana de flavonas y flavonoles (los flavonoides más comunes) es
\sim3-70 mg/día, de los que entre un 60 y un 70%
es de QUER [las principales fuentes incluyen té, vino, bayas,
manzanas y cebollas (28)]. Sin embargo, no hay informes sobre
estimaciones respecto a la ingesta de PTER, el cual está presente
por ejemplo en extractos del duramen de P. marsupium, y es
utilizado en la medicina ayurvédica para el tratamiento de la
diabetes, y en la uva negra (aunque los estudios cuantitativos han
demostrado que por cada 10 partes de RESV, hay sólo
1-2 partes de PTER) (16 y referencias contenidas en
ella). Como se muestra en la Fig. 1, después de la administración
i.v. a ratones de 20 mg/Kg de t-PTER o QUER (una
dosis que representa para un humano adulto de 70 kg de peso corporal
\sim1000 veces la cantidad máxima de PTER encontrada en un kg de
uva negra, y \sim20 veces la ingesta diaria máxima de QUER), su
concentración más elevada en plasma (\sim95 \muM de PTER y
\sim46 \muM de QUER 5 minutos después de su administración)
disminuye hasta \sim1 \muM en 120 minutos la QUER y 480 minutos
el PTER. Siguiendo un protocolo idéntico encontramos previamente que
la concentración más elevada de QUER en plasma
\sim43 \muM (5 minutos después de la administración i.v. a conejos) disminuye hasta \sim1 \muM en 60 minutos (14). Calculamos una semivida del RESV en plasma de ratón de \sim10,2 minutos (Estrela et al., datos no publicados). A partir de los datos de la Fig. 1 calculamos una semivida del PTER y la QUER de \sim77,9 y 20,1 minutos, respectivamente (véase la Fig. 1). Los niveles de PTER y QUER en sangre total de ratones no fueron significativamente diferentes de los mencionados anteriormente para el caso del plasma. Al menos 99% del PTER medido en plasma o sangre estaba en la forma trans.
\sim43 \muM (5 minutos después de la administración i.v. a conejos) disminuye hasta \sim1 \muM en 60 minutos (14). Calculamos una semivida del RESV en plasma de ratón de \sim10,2 minutos (Estrela et al., datos no publicados). A partir de los datos de la Fig. 1 calculamos una semivida del PTER y la QUER de \sim77,9 y 20,1 minutos, respectivamente (véase la Fig. 1). Los niveles de PTER y QUER en sangre total de ratones no fueron significativamente diferentes de los mencionados anteriormente para el caso del plasma. Al menos 99% del PTER medido en plasma o sangre estaba en la forma trans.
A modo de comparación, se administró también
oralmente t-PTER o QUER (20 mg/kg). Se administró
una mezcla de ^{3}H-t-PTER (5
\muCi/ratón) y t-PTER sin marcar o de
^{14}C-QUER (2 \muCi/ratón) y QUER sin marcar,
con el fin de diferenciar entre polifenoles libres no modificados y
sus metabolitos/conjugados generados in vivo. Para el
cálculo de las formas libres realizamos medidas mediante
LC/MS-MS (véase la metodología descrita
anteriormente en este documento). Tras aplicar las correcciones
correspondientes por diluciones, la radioactividad de las muestras
que contenían sólo PTER o QUER libres se sustrajo de la
radioactividad total medida en una muestra equivalente de plasma.
Como se muestra en la Tabla 1, después de la administración oral,
los niveles en plasma de PTER y QUER mostraron unos picos a los 60
y 10 minutos, respectivamente. Sin embargo, los niveles totales de
PTER y QUER (polifenoles libres sin modificar más sus metabolitos y
formas conjugadas) fueron muy diferentes. La concentración total de
PTER fue > 10 \muM entre los 30 y 240 minutos tras su
administración, mientras que los niveles de QUER total sólo
permanecieron > 1 \muM dentro de los primeros 10 minutos (Tabla
1). Durante estos periodos de tiempo, el PTER libre representó un %
pequeño del total (15-35%), mientras que la QUER
libre (exceptuando los primeros 5 minutos) fue casi indetectable
(0,5%) (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{150mm} Los animales se trataron con 20 mg/Kg de peso corporal de t-PTER o QUER. Para cada punto temporal se sacrificó un grupo de 6-7 ratones. No detectable = n.d. *P<0,01 comparando los datos obtenidos a los 10-1440 minutos con los hallados 5 minutos después de la administración del polifenol. \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de complementar la farmacocinética en
plasma/sangre evaluamos también la biodisponiblidad en tejidos
extravasculares del PTER y la QUER. Como se muestra en la Tabla 2,
después de su administración i.v. a ratones, el contenido más
elevado de PTER y QUER en cerebro, pulmón, hígado y riñón se
encontró dentro de los primeros 5 minutos tras la administración
(Tabla 2). Por ello, parece que ambos polifenoles no se acumulan
extravascularmente y que su presencia en diferentes tejidos (Tabla
2) es paralela en el tiempo a su biodisponibilidad en el torrente
sanguíneo (Fig. 1).
| \begin{minipage}[t]{150mm} Se trató a los animales con t-PTER o QUER (20 mg/Kg, que contenían 5 \mu Ci de ^{3}H-t-PTER o 2 \mu Ci ^{14}C-QUER). Para cada punto temporal se sacrificó un grupo de 4-5 ratones. No detectable = n.d. *P<0,01 comparando los datos obtenidos a los 10-60 minutos con los hallados 5 minutos después de la administración del polifenol. \end{minipage} |
Se cultivaron células B16M-F10
en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco Labs., Grand
Island, NY, USA), pH 7,4, suplementado con suero fetal al 10%
(Gibco), HEPES 10 mM, NaHCO_{3} 40 mM, 100 U/ml de penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina (20).
El melanoma B16M-F10, altamente
agresivo, es un modelo ampliamente utilizado para estudiar la
diseminación metastática y la invasión de tejidos (21), y por esta
razón se seleccionó para nuestros estudios. En el primer grupo de
experimentos se estudió el efecto in vitro de
t-PTER + QUER sobre el crecimiento de células
B16M-F10. Para reproducir las condiciones in
vivo después de la administración i.v., incubamos células
B16M-F10 en presencia de t-PTER (40
\muM) y/o QUER (20 \muM) durante un periodo limitado (60
minutos) (esto representa un valor aproximado a la media de las
concentraciones de PTER y QUER medidas en plasma durante la primera
hora tras la administración i.v. de 20 mg/kg de cada polifenol
(Fig. 2). A modo de comparación, utilizamos también
t-RESV (12 \muM; para seleccionar esta
concentración se siguió un criterio similar, véanse los datos
citados en la ref. 14). Los polifenoles se añadieron al medio de
incubación cada 24 horas y, como se indica, estuvieron presentes
sólo durante 60 minutos. Como se muestra en la Fig. 2, el
t-PTER y la QUER inhibieron el crecimiento de
B16M-F10 un 40 y un 19%, respectivamente. Sin
embargo, cuando ambos estuvieron presentes la inhibición del
crecimiento se incrementó hasta \sim un 56%, lo que sugiere un
efecto aditivo (en presencia de t-PTER + QUER \sim
77,7% de las células se acumularon en G0/G1, mientras que - 13,2% y
9,1% estaban en las fases S y G2/M, respectivamente; además, los
controles, que estaban creciendo exponencialmente, mostraron una
distribución del ciclo celular de \sim 58,0% en G0/G1, 22,4% en S
y 19,6% en G2/M; n=6 en ambos casos; la viabilidad celular siguió
siendo > 95% en todos los casos). En nuestras condiciones
experimentales el t-RESV no afectó
significativamente la tasa de crecimiento de células tumorales
(Fig. 2). Es más, el t-RESV no afectó
significativamente al % de inhibición del crecimiento de
B16M-F10 promovido por t-PTER +
QUER (Fig. 2).
También a modo de comparación, incubamos células
B16M-F10 en presencia de t-PTER +
QUER a concentraciones que representan un valor medio aproximado
del nivel total de cada polifenol medido en plasma en la primera
hora después de la administración oral (11 \muM de PTER y 1 \muM
de QUER) (véase la Tabla 1). Ambos polifenoles, como formas libres,
estuvieron presentes de forma constante en el medio de incubación.
Aunque tanto el PTER como la QUER sufren transformaciones
metabólicas después de la administración oral, el uso de formas
libres es un planteamiento válido puesto que no es esperable que
sus metabolitos/conjugados muestren una actividad antitumoral más
potente (veanse por ejemplo las refs. 29-30). Sin
embargo, en estas condiciones el t-PTER (11 \muM)
y/o QUER (1 \muM) no afectaron significativamente a las tasas de
control del crecimiento de las células B16M- F10 in vitro
(tasas similares de control que corresponden a las de la Fig. 2).
Los niveles totales de polifenoles libres añadidos al medio de
incubación no cambiaron a lo largo del tiempo de cultivo indicando
que las células cancerosas no metabolizaron el
t-PTER o la QUER.
Se utilizaron ratones C57BL/6J (machos de 10 a
12 semanas de edad) de IFFA Credo (L'Arbreole, Francia). El
endotelio sinusoidal hepático (HSE) se separó e identificó tal y
como se ha descrito previamente (20). Las células sinusoidales se
separaron en un gradiente de metrizamida al 17,5% (p/v). Los
cultivos de HSE se estabilizaron y se mantuvieron en DMEM libre de
pirógenos suplementado como se describió anteriormente para las
células B16M-F10. La adhesión diferencial de las
células endoteliales a la matriz de colágeno y el lavado permitieron
una eliminación completa de otros tipos de células sinusoidales (de
Kupffer, estrelladas, linfocitos) de los frascos de cultivo.
Las células B16M-F10 se marcaron
con acetoximetiléster de
2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(y-6)-carboxifluoresceína
(BCECF-AM; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) (se
incubaron, durante 20 minutos a 37ºC, 10^{6} células en 1 . ml de
DMEM tamponado con HEPES que contenía 50 \mug de
BCECF-AM y 5 \mul de DMSO). Después de lavar, las
células que contenían BCECF-AM se resuspendieron en
DMEM tamponado con HEPES sin rojo fenol a una concentración de 2,5
x 10^{6} células/ml y se añadieron (0,2 ml/pocillo) al cultivo de
células endoteliales (sembradas 24 horas antes), así como, a
pocillos de plástico y controles previamente tratados con colágeno.
Las placas se incubaron entonces a 37°C y, 20 minutos más tarde, se
lavaron los pocillos tres veces con medio fresco, para a
continuación leer su fluorescencia utilizando un Fluoroskan Ascent
FL (Labsystems, Manchester, UK). El número de células tumorales
adheridas se cuantificó mediante unidades arbitrarias de
fluorescencia basadas en el porcentaje con respecto al número
inicial de células B16M-F10 añadidas al cultivo de
HSE (20). El daño causado a las células B16M-F10
durante su adhesión in vitro al HSE se evaluó tal y como se
describió previamente (21) utilizando células tumorales marcadas con
calceína-AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). La
integridad de las células B16M-F10 cultivadas en
solitario se evaluó mediante la exclusión del azul tripano y
midiendo la actividad lactato deshidrogenasa liberada al medio
extracelular (22). Los otros reactivos utilizados en los
experimentos de citotoxicidad tumoral fueron de Sigma.
El TNF-\mu murino recombinante
(2 x 10^{7} U/mg de proteína) y el
interferón-\gammay murino recombinante
(IFN-\gamma; 10^{5} U/mg de proteína) se
obtuvieron de Sigma. Las soluciones concentradas (5 x 10^{5} U
TNF-\alpha/ml y 25x 10^{4} U
IFN-\gamma/ml) se diluyeron en solución salina
fisiológica estéril (NaCl al 0,9%), ajustada a pH 7,0, y almacenada
a 4°C.
El ensayo de invasión de la monocapa de células
endoteliales por células B16M-F10 se realizó de
acuerdo con el método de Ohigashi et al. (23) con algunas
modificaciones. Las células HSE se sembraron en placas de cultivo
con rejillas recubiertas con gelatina (1%). Cuando las células
alcanzaron la confluencia, se reemplazó el medio de cultivo con
medio de reciente preparación. Tras 2 horas de incubación, se
lavaron los cultivos con DMEM y luego se sembraron las células
B16M-F10 sobre las células de HSE, manteniendo el
cultivo durante 5 días. La capacidad de invasión de las células
B16M-F10 se midió contando el número de colonias por
1 cm^{2} formadas bajo la monocapa de HSE utilizando un
microscopio de contraste de fases.
El ensayo de la producción de H_{2}O_{2} se
basó en la oxidación del ácido homovanílico (ácido
3-metoxi-4-hidroxifenilacético),
dependiente de H_{2}O_{2} y mediada por la peroxidasa de
rábano, para dar un dímero altamente fluorescente (ácido
2,2'-dihidroxidifenil-5,5'-diacético)
(20). Con este propósito se cultivaron las células en presencia de
ácido homovanílico 100 \muM y 1 U de peroxidasa de rábano/ml. Se
obtuvo una relación lineal entre la fluorescencia
(\lambda_{excitación} = 312 nm y \lambda_{emisión} = 420 nm) y
la cantidad de H_{2}O_{2} en el intervalo de
0,1-12 nmoles por cada 2 ml de muestra de
ensayo.
Las determinaciones de nitrito y nitrato se
llevaron a cabo utilizando la metodología de Braman y Hendrix (24).
Brevemente, se determinaron los niveles de NO_{2}^{-} mediante
la detección por quimioluminiscencia de NO en presencia de
yoduro/ácido acético (que reduce el NO_{2}^{-}, y no el
NO_{3}^{-} , a NO). Las determinaciones de NO_{x}^{-} total
(NO_{2}^{-} más NO_{3}^{-}) se realizaron midiendo la
generación de NO en muestras sometidas a una solución en ebullición
de VCl_{3}/HCl (que reducirá tanto el NO_{2}^{-} como el
NO_{3}^{-} a NO). La determinación de los niveles de
NO_{3}^{-} se llevó a cabo sustrayendo el valor de
NO_{2}^{-} del valor del NO_{x}. La cuantificación se efectuó
utilizando una curva patrón obtenida a partir de cantidades
conocidas de NO_{2}^{-} y NO_{3}^{-}.
La expresión de las moléculas de adhesión
intercelular se analizó mediante citometría de flujo (25). A tal
efecto, se incubaron, durante 1 hora a 4ºC, células
B16M-F10 (1 x 10^{6}) con 1 \mug de un
anticuerpo monoclonal (tipo IgG2b de rata, clon PS/2 de Serotec,
Oxford, UK) contra el antígeno de activación muy tardía 4
(VLA-4) de ratón. El HSE (1 x10^{6} células) se
incubó con 2 \mug de un anticuerpo monoclonal (tipo IgG de rata,
kappa, clon M/K-2 de R & D Systems, MN, USA)
contra la molécula de adhesión celular vascular 1
(VCAM-1) de ratón. Se lavaron dos veces con PBS las
células B16M-F10 y de HSE y luego se trataron,
durante 1 hora a 4°C, con un anticuerpo de cabra contra
inmunoglobulinas de rata marcado con isotiocianato de fluoresceína
(Serotec).
Después de lavar dos veces con PBS, se
analizaron las células utilizando un separador celular activado por
fluorescencia (FACscan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). La
proliferación y/o viabilidad de las células B16M-F10
y de HSE no se vieron afectadas por estos anticuerpos monoclonales
(incluso tras añadir hasta 100 \mug de anticuerpo/ml de medio de
cultivo) (datos no mostrados).
Además del efecto de PTER + QUER sobre el
crecimiento tumoral, investigamos el potencial antimetastático.
Primero se estudió in vitro la interacción de células
B16M-F10 y el HSE. Basándonos en los resultados
obtenidos anteriormente, seleccionamos la exposición durante
periodos cortos (60 minutos) de las células metastásicas a los
polifenoles (a las concentraciones medidas en plasma después de su
administración i.v.). Puesto que la interacción de las células
metastáticas con las endoteliales y las de Kupffer activa la
liberación local de citoquinas proinflamatorias [facilitadoras de
la adhesión de las células cancerosas al endotelio y de la invasión
(14, 31)] investigamos el efecto de los polifenoles sobre la
adhesión de las células B16M-F10 al HSE en
presencia de TNF-\alpha e
IFN-\gamma, esta combinación de citoquinas induce
una activación máxima del HSE (ver la ref. 20 y las referencias
contenidas en ella) (Tabla 3). Tal como se ha descrito
anteriormente el t-RESV inhibe la adhesión de
células tumorales al endotelio (\sim47%) sin incrementar la
citotoxicidad inducida por el HSE sobre las células metastáticas
(14). Se encontró un efecto similar (\sim60% de inhibición de la
adhesión) en presencia de t-PTER (Tabla 3). Por el
contrario, la QUER incrementó la muerte de células
B16M-F10 inducida por el HSE (\sim48%) pero sin
afectar a la tasa de adhesión (Tabla 3). Como se muestra en la Tabla
3, combinando t-PTER + QUER obtuvimos el % más bajo
de adhesión de células B16M-F10 al HSE y el % más
alto de citotoxicidad en las células cancerosas adheridas.
Ensayando la invasión in vitro de las monocapas de células
hepáticas endoteliales por células B16M-F10,
encontramos una marcada disminución (\sim74%) en el número de
colonias formadas en presencia de t-PTER y QUER
(Tabla 3).
Se cocultivaron células HSE, cultivadas
previamente durante 24 horas [\pm polifenol(es),
añadido(s) a las 12 horas de la siembra y eliminados mediante
lavado 60 minutos más tarde], con células B16M-F1O
cultivadas previamente durante 72 horas [\pm
polifenol(es), como en la Fig. 2]. Se añadieron citoquinas
[100 unidades de TNF-\alpha/ml y 50 unidades de
IFN-\gamma/ml, véase (20)] o el vehículo
(solución salina fisiológica) a los medios de cultivo 12 horas antes
de comenzar con los cocultivos. La proporción de adhesión de las
células tumorales al HSE fue \sim 1:1 en los cultivos tratados
con citoquinas en ausencia de polifenoles (a este valor se le
asignó una tasa de adhesión del 100%). En los experimentos de
adhesión entre células B16M-F10 y endoteliales, 20
minutos después de la adición de las B16M-F10 al
HSE, se lavaron las placas tal como se ha descrito en la
metodología. En los ensayos de citotoxicidad inducida por el
endotelio sobre las B16M-F10, se determinó el daño
tumoral (expresado como el % de células tumorales que perdieron
viabilidad durante el período de 4-6 horas
incubación, véase la metodología) tras de 6 horas de incubación.
Durante el periodo de incubación de 6 horas el % de viabilidad de
las células de HSE fue 99-100% en todos los casos.
Todos los ensayos se llevaron a cabo en ausencia o en presencia de
t-RESV (12 \muM), t-PTER (40
\muM), y/o QUER (20 \muM). Los valores representan medias \pm
DS de 5-6 experimentos diferentes en cada caso.
^{*}P<0,05, ^{**}P<0,01 comparando las incubaciones en
presencia y en ausencia de polifenol(es).
La adhesión de células B16M-F10
al HSE induce la liberación de NO y H_{2}O_{2} del endotelio,
lo que causa muerte en parte de las células metastáticas (20).
Previamente observamos que el H_{2}O_{2} no era citotóxico en
ausencia de NO, sin embargo, la citotoxicidad tumoral inducida por
NO fue incrementada por H_{2}O_{2} debido a la formación de
potentes oxidantes tales como radicales OH y ^{-} ONOO por un
proceso dependiente de iones metálicos (20). Durante la interacción
de B16M-F10 y HSE en presencia de
t-PTER y QUER (ambos presentes x 60 minutos como en
la Tabla 3), el NO_{X} acumulado en el medio de cultivo durante
un período de 3 horas no fue significativamente diferente al de los
controles (7,5\pm1,3 nmoles/10^{6} células; n=6). Por otro lado,
el t-PTER y la QUER disminuyeron la generación de
H_{2}O_{2} de 70\pm12 nmoles/10^{6} células (controles) a
34\pm10 nmoles/10^{6} células (n=5-6 en ambos
casos, P>0,01). De ello se induce que el potencial antioxidante
de estos polifenoles debería contribuir, al menos parcialmente, a
frenar la citotoxicidad inducida por el HSE sobre las
B16M-F10. Aunque, obviamente, otros mecanismos
activados por t-PTER y/o QUER estan favoreciendo la
disminución de la actividad metastática (Tabla 3). En este sentido,
puesto que el H_{2}O_{2} puede actuar como mensajero
intracelular promoviendo el crecimiento (32), al menos en parte, la
inhibición del crecimiento tumoral inducida por
t-PTER y QUER (Fig. 2) podría explicarse por una
disminución de las señales intracelulares dependientes del
H_{2}O_{2}.
El aislamiento del RNA total se realizó con
trizol (Invitrogen, San Diego, CA, USA). El cDNA se obtuvo
utilizando un hexámero y el kit con transcriptasa inversa
MultiScribe siguiendo las instrucciones del fabricante (TaqMan RT
Reagents, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Para realizar
la PCR cuantitativa se utilizaron la polimerasa de DNA AmpliTaq
Gold (Applied Biosystems) con cebadores específicos: SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15
y SEQ ID NO: 16.
La cuantificación de la transcripción de cada
mRNA se llevó a cabo con SYBR Green I y un sistema de detección
iCycler (Biorad, Hercules, CA, USA), relativizándolo al mRNA de la
gliceraldehído-3P-deshidrogenasa
(GAPDH). Los cDNA diana se amplificaron en tubos separados
utilizando las siguientes condiciones: 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos
de amplificación (desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos;
apareamiento y extensión a 60°C durante 1 minuto por ciclo). El
incremento en la fluorescencia se midió a tiempo real durante la
etapa de extensión. Se determinó el ciclo umbral (C_{T}), y luego
se calculó la expresión relativa al gen como: cambio de expresión =
2^{-\Delta(\Delta C_{T})}, donde \DeltaC_{T} = C_{T} diana -
C_{T} GAPCH, y \Delta(\DeltaCT) =
\DeltaC_{T}tratado - \DeltaC_{T}control.
Se utilizó el sistema de expresión de genes
Tet-off (Clontech, Palo Alto, CA, USA) para
insertar el gen bcl-2 de ratón y transfectar las
células B16M-F10, tal y como se ha descrito
previamente (26) y siguiendo las instrucciones del fabricante. La
proteína Bcl-2 se cuantificó en la fracción
citosólica soluble mediante inmunoensayo enzimático (27) utilizando
un test basado en un anticuerpo monoclonal de Sigma (San Luis, MO,
USA) (se definió una unidad de Bcl-2 como la
cantidad de proteína Bcl-2 en 1000 células
B16M-F10 no transfectadas).
Se provocaron metástasis hepáticas mediante
inoculaciones i.v. (vena portal), en ratones anestesiados
(Nembutal, 50 mg/kg i.p.), de 4 x 10^{5} células
B16M-F10 viables suspendidas en 0,2 ml de DMEM. Los
ratones fueron sacrificados 10 días después de la inoculación por
dislocación cervical. Los hígados se fijaron por inmersión durante
24 horas a 22ºC en formaldehído al 10% en PBS (pH 7,4), y
posteriormente se incluyeron en parafina. La densidad de metástasis
(número medio de focos/100 mm^{3} de hígado detectados en quince
secciones de 10 x 10 mm^{2} por hígado) y el volumen de metástasis
(% medio de volumen hepático ocupado por metástasis) se
determinaron como se ha descrito anteriormente (22).
Los datos se presentan como media \pm DS
correspondientes al número indicado de diferentes experimentos. Los
análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando la prueba t de
Student y los valores de P <0,05 se consideraron
significativos.
Esta metodología permite el estudio bien in
vivo del efecto del PTER y la QUER. Con este propósito, se
inocularon en ratones células control B16M-F10 o
B16M-F10/Tet-Bcl-2
que sobreexpresaban Bcl-2. Ambos subgrupos de
células se cultivaron previamente en ausencia o en presencia de
t-PTER y QUER. Se cultivaron células
B16M-F10 durante 72 horas. Se añadió
t-RESV (12 \muM), t-PTER (40
\muM), y QUER (20 \muM) a las 6, 30 y 54 horas de tiempo de
cultivo, y estuvieron presentes en cada caso durante sólo 60
minutos. Luego se eliminaron de los frascos de cultivo mediante
lavado (3 veces con PBS) y se renovó el medio. Los niveles de
Bcl-2 en las células B16M-F10
control y tratadas con Tet-Bcl-2
fueron 24\pm5 y 105\pm14 unidades/mg de proteína,
respectivamente (n=5 en cada caso, P<0,01). El número de células
adheridas presentado en la tabla se calculó a los 60 minutos
postinyección (no se encontraron diferencias significativas cuando
las medidas se realizaron a 30, 120, 180, 240 o 360 minutos
postinyección, datos no mostrados). El número de células intactas
se calculó a las 6 horas postinyección. Los datos de experimentos
in vivo de microscopía son medias \pm DS correspondientes a
4-5 experimentos diferentes. El crecimiento de
metástasis en el hígado se evaluó como se indica en el apartado
correspondiente de la descripción, y en este caso los ratones se
trataron diariamente (x 10 días) con t-PTER y/o QUER
(20 mg/Kg de peso corporal) administrados i.v. (los datos son
medias \pm DS correspondientes a 25 ratones por grupo). Un
procedimiento similar e igual número de ratones por grupo se
utilizaron para evaluar la supervivencia de los animales
portadores. La prueba de significancia se refiere, en todos los
grupos, a la comparación entre los casos de PTER y/o QUER y los
casos sin adiciones (^{*}P<0,05 y ^{**}P<0,01), y también
a la comparación entre las células
B16M-F10/Tet-Bcl-2
con las células control B16M-F10 (^{+}P<0,05,
^{++}P<0,01). Como se muestra en la Tabla 4, el
t-PTER y la QUER diminuyeron los niveles
intracelulares de Bcl-2 y el número de células
B16M-F10 y
B16M-F10/Tet-Bcl-2
adheridas al endotelio. Sin embargo, dadas las diferencias en el
nivel de Bcl-2 entre ambos subgrupos celulares, el
t-PTER y la QUER sólo disminuyeron el % de células
adheridas e intactas en el caso de las células
B16M-F10 control (Tabla 4). En consecuencia, aunque
los ratones sin tratar, a los que se habían inoculado células
B16M-F10 o
B16M-F10/Tet-Bcl-2,
mostraron tasas similares de crecimiento metastático en el hígado y
una supervivencia similar del huésped, el efecto de la
administración diaria i.v. de t-PTER y QUER fue más
evidente en las células control B16M-F10: un 74% de
disminución en la densidad y volumen de metástasis y un incremento
de 2 veces en la supervivencia del huésped portador (Tabla 4). Esta
es la primera vez que la administración combinada in vivo de
polifenoles naturales induce una inhibición del crecimiento
metastático de un tumor altamente maligno y el aumento en la
supervivencia del portador. Como se observa en la mencionada Tabla
4, PTER y QUER, por separado, también disminuyen la densidad y el
volumen de la metástasis, pero su combinación produce un efecto
sinérgico sobre el tumor superior al 100% si tomamos como base la
acción respectiva de cada uno por separado. Por el contrario, por
separado, ninguno de estos compuestos incrementó significativamente
la supervivencia de las células huésped, frente a la duplicación de
la tasa de supervivencia observada mediante la acción combinada de
ambos
polifenoles.
polifenoles.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Fig. 1. Niveles en plasma y semivida del
pteroestilbeno y la quercetina después de su administración
intravenosa a ratones.
Los animales se trataron con
t-PTER (círculos vacíos) o QUER (círculos negros)
(20 mg/Kg de peso corporal). Los niveles en plasma se determinaron
como se explica en la descripción. Los resultados son medias \pm
DS correspondientes a 5-6 ratones por cada punto en
el tiempo, medido en minutos (abcisas). En el recuadro se
representa lo mismo a escala logarítmica.
Fig. 2. Inhibición in vitro del
crecimiento de células B16M-F10 mediante
exposiciones de corta duración a resveratrol (RESV), pteroestilbeno
(PTER) y/o quercetina (QUER).
Todos los puntos son medias \pm DS
correspondientes a 5-6 experimentos independientes.
{*}P<0,05, ^{**}P<0,01 por comparación con los valores
control.
<110> UNIVERSITAT DE VALENCIA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> "USO COMBINADO DEL PTEROESTILBENO
Y LA QUERCETINA PARA LA FABRICACIÓN DE MEDICAMENTOS UTILES EN EL
TRATAMIENTO DEL CÁNCER".
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CO-6684
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BAX 5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGCTGAGCGAGTGTCTCCGGCG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211>25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BAX 3'-5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCACAAAGATGGTCACTGTCTGCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BAK 5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGAGGGCAGAGGTGAGAGTICA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
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<223> BAK 3'-5'
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGTTGCTTCTGCTGGAGTAGTT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211>25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> Cebador
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<223> BAD 5'-3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGTGATCTTCTGCTCCACATCCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Cebador
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<223> BAD 3'-5'
\vskip1.000000\baselineskip
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<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACTTAGCACAGGCACCCGAGGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> BID 3'-5'
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<223> Bcl-2
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<223> Bcl-xL
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<223> Bcl-xL
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<221> Cebador
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<223>
Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa
5'-3'
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<213> Secuencia artificial
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Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa
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Claims (5)
1. Uso de una combinación de pteroestilbeno y
quercetina (PTER + QUER), incluyendo las sales y los derivados
farmacéuticamente aceptables de los mismos, para la fabricación de
un medicamento útil en el tratamiento del cáncer.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el medicamento fabricado contiene
además de PTER y QUER, cualquier excipiente farmacéuticamente
aceptable.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 o 2, caracterizado porque el medicamento fabricado está
destinado a ser administrado de forma oral.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 o 2, caracterizado porque el medicamento fabricado está
destinado a ser administrado de forma intravenosa.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4 caracterizado porque el medicamento fabricado es
particularmente útil en el tratamiento de tumores de crecimiento
intrahepático.
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