PT2418220T

PT2418220T - Anticorpos contra interferão alfa e suas utilizações

Info

Publication number: PT2418220T
Application number: PT111836029T
Authority: PT
Inventors: King David; Witte Alison; Passmore David; Williams Denise; m cardarelli Josephine
Original assignee: Squibb & Sons Llc
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2017-10-04
Also published as: KR20070011243A; AU2009206187A1; NZ547157A; EP1711207A4; DK2418220T3; JP5047626B2; AU2004299833B2; US8722870B2; US20070014724A1; EP1711207B1; CA2546054C; US20170369568A1; EP2418220A3; HUE035520T2; US20110300145A1; EP1711207A2; KR20110140137A; IL175586A0; CN102344491B; CN1889978A

Description

DESCRIÇÃO ANTICORPOS CONTRA INTERFERÃO ALFA E SUAS UTILIZAÇÕES Antecedentes da Invenção

Os interferões de tipo I (IFN) (IFN - a., IFN-β, IFN-co, IFN-ι) são uma família de citocinas estruturalmente relacionadas com efeitos antivirais, antitumorais e imunomoduladores (Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone e Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140). O locus do IFNa humano inclui duas subfamílias. A primeira subfamília consiste em, peio menos, 14 genes não alélicos e 4 pseudogenes com, pelo menos, 75% de homologia. A segunda subfamília, all ou ómega (ω), contém 5 pseudogenes e 1 gene funcional que exibe 70% de homologia com os genes de IFNa. Gs subtipos de IFNa têm atividades específicas diferentes mas possuem o mesmo espectro biológico (Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad Sei. USA 78:2848) e têm o mesmo recetor celular (Agnet M. et al. (1983) em "Interferon 5"

Editado por I. Gresser p. 1-22, Academic Press, Londres).

Todos os interferões humanos de tipo I ligam a um recetor de superfície da célula (recetor IFN alfa, IFNAR) consistindo em duas proteínas transmembranares, IFNAR-· 1 e IFNAR-2 (Uze et. al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391; Pestka et al. (1987) Annu Rev. Biochem. 56:727; E-ogensen et al. (1999) J. Interferon Citokine Res. 19:1069). IFNAR-1 é essencial para a ligação de alta afinidade e especificidade diferencial do complexo IFNAR (Cutrone (2001) supra). Ao passo que as diferenças funcionais para cada um dos subtipos de IFN de tipo I não foram identificadas, pensa-se que cada um pode exibir interações diferentes com os componentes do recetor IFNAR conduzindo a resultados de sinalização potencialmente diversos (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:13448). Em particular, os estudos que utilizam formas mutantes de IFNAR1 e IFNAR2 sugeriram que os interferões alfa e beta sinalizam de forma diferente através do recetor interagindo de forma diferente com as cadeias respetivas (Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585).

Os estudos funcionais iniciais dos IFNs de tipo I versaram sobre a defesa inata contra as infeções virais (Haller et ai. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et ai. (1981) Methods Enzymol. 78:181). Estudos môiis recentes, contudo, implicam os IFNs de tipo I como cítocínas imunorreguladoras potentes na resposta imune adaptativa. Especif icamente foi demonstrado que os IFNs de tipo I facilitcim a diferenciação de células T naif ao longo da via Thl (Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1655), para potenciar a produção de anticorpos (Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1179) e para suportar a atividade funcional e sobrevivência das células T de memória (Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947).

Trabalho recente realizado por um número de grupos sugere que o IFN-α pode potenciar a maturação ou ativação de células dendríticas (DCs) (Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et ai. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499; Paquette et ai. (1998) J. Leukoc, Biol. 64:358). Além disso, a expressão aumentada dos interferões de tipo I foi descrita em numerosas doenças autoimunes (Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192; Hopkins e Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; Arvin e Miller (1984) Arthritis Rheum. 27: 582), Os exemplos mais estudados sobre isto são a diabetes melitus dependente de insulina (IDDM) (Foulis (1987) supra), lúpus eritematoso sistémico (SLE) (Hooks (1982) supra; Blanco et al. (2001)

Science 294:1540; Ytterberg e Schnitzer (1982) Arthritis

Rheum. 25:401; Batteux et al. (1999) Eur. Citokine Netw. _:509), e tiroidite autoimune (Prummel e Laurberg (2003)

Thyroid 13:547; Mazziotti et al. (2002) J. Endocrinol. Invest. 25:624; You et al. (1999) Chin. Med. J. 112:61; Koh et al. (1997) Thyroid 7:891), que estão todas associadas a níveis elevados de IFN o;, e artrite reumatoide (RA) (Hertzog (1988), Hopkins e Meager (1988), Arvin e Miller (1984), supra) na qual o IFN-β pode desempenhar um papel ainda mais significativo.

Além disso, tem sido reportado que a administração de interferão oc exacerba a doença subjacente em pacientes com psoríase, tiroidite autoimune e esclerose múltipla e induz uma síndrome tipo SLE em pacientes com um historial prévio de doença autoimune. Também foi demonstrado que o interferão α induz glomerulonefrite em ratinhos normais e acelera o despoletar de doença autoimune espontânea dos ratinhos NZB/W. Além disso, demonstrou-se que, em alguns casos, a terapêutica com IFN-α conduz a efeitos secundários indesejados, incluindo febre e distúrbios neurológicos. Deste modo, existem situações patológicas nas quais a inibição da atividade de IFN-α pode ser benéfica para o paciente e existe uma necessidade de agentes eficazes na inibição da atividade de I FM - o:. A Patente U.S. 2003/0166228 Al descreve a geração de anticorpos monoclonais neutralizadores anti-IFN-α com reatividade contra vários subtipos de IFN-a.

Tsukui et al. (Microbiology and Irnmunology, Volume 30, N.c 11, 1986, páginas 1129-1139) descrevem um anticorpo monoclonal com reatividade a subtipos de interferão-a humano úteis para purificação de interferão derivado de leucócito.

Meager et al. (Journal o£ Interferon Research, Volume 6, N,° 6, 1986, páginas 729-736) descrevem um anticorpo monoclonal, LO-22, com especificidade para subtipos de interferão-o:,

Sumário âa Invenção A presente invenção providencia um anticorpo monoclonal ant.i interferão alfa isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada CDR1 que compreende uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 1, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcidos conservativas; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID MO: 4, a. modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de amínoácidos conservativas ,· (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 10, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de amínoácidos conservativas; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 13, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de amínoácidos conservativas; e (f) urna região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NQ: 16, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcidos conservativas; e em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe IFN Linfoblastoide, IFNoí6 , IFNcx2b, IFNa2a, IFNal, IFN Leucocitário, IFNal6, IFNoíIQ, IFNaS, IFNcxS, IFNoí14 , IFNal7, IFNa7 and IFNa4, mas não inibe a atividade biológica, de IFN beta ou IFN ómega, A presente invenção também proporciona um anticorpo monoclonal isoladG, ou porção de ligação antigénio do mesmo, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é entre 80% e 99% homóloga a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é entre 80% e 99% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SSQ ID NOS: 22; e em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe IFN Linfoblastoide, IFNa6, IFNa2b, IFNa2a, IFNal, IFN Leucocitário, IFNal6, IFNalO, IFNa8, IFNaS, IFNal4, IFNal?, lFNa7 and IFNa4, mas não inibe a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega. A invenção também abrange moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos ou porções de ligaçâG a antigénio dos mesmos em qualquer dos anticorpos mencionados ac ima.

Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer isotipo. Anticorpos preferidos são do isotipo IgGl ou IgG4. Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos de comprimento complete compreendendo regiões variáveis e constantes, ou podem ser fragmentos de ligação a antigénio dos mesmos, tais como um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento Fab. A invenção também abrange imunoconjugados dos anticorpos da invenção, nos quais o anticorpo está ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioativo. A invenção também abrange moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo da invenção, no qual o anticorpo está ligado a uma segunda fração funcional tendo uma especificidade de ligação diferente da do anticorpo. São também proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação a antigéniG do mesmo, ou imunoconjugado ou molécula biespecífica do mesmo. Tais composições farmacêuticas compreendem o agente ativo e um portador farmaceuticamente aceitável.

Noutro aspeto, a presente invenção inclui um método ex vivo de inibir a atividade biológica do interferão alfa, compreendendo colocar em contacto o interferão alfa com um anticorpo anti interferão alfa da invenção, tal que a atividade biológica do interferão alfa seja inibida.

Noutro aspeto, a presente invenção inclui um anticorpo da invenção para utilização num método de tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferão alfa num indivíduo, em que a doença ou distúrbio é lúpus eritematoso sistémico, esclerose múltipla, diabetes melitus dependente de insulina, doença inflamatória do intestino, psoríase, tiroidite autoimune, artrite reumatoide e glomerulonefrite, rejeição de transplante ou doença de enxerto contra hospedeiro.

Noutro aspeto, a presente invenção inclui um método para preparar um anticorpo anti IFN alfa, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo: (i) proporcionar um anticorpo, ou porção de ligação antigénio do mesmo, compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 1; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 7; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 13; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 16. (ii) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro de pelo menos uma região variável para criar o pelo menos um anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo pelo menos uma alteração de aminoácido; (iii) expressar o anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo como uma proteína,* (iv) avaliar a atividade de ligação do anticorpo alterado ou porção de ligação a antigénio do mesmo; e (v) identificar um anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que liga especificamente a IFN alfa, inibe IFN Linfoide, IFNa6, IFNa2b, IFNcx2a, IFNal, IFN Leucocitãrio, IFNalô, IFNalO, IFNa8, IFNa5, IFNcxl4, IFNal7, lFNa7 and IFNa4, mas não inibe a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 25) e sequência de aminoãcidos (SEQ. ID N.° 19) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 13H5. As regiões CDR1 (SEQ. ID N.c' 1), CDR2 (SEQ. ID N.° 4) e CDR3 (SEQ. ID N.° 7) são delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J são indicadas. A Figura 1B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 28) e sequência de aminoãcidos (SEQ. ID N.° 22) da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 13H5. As regiões CDR1 (SEQ. ID N.° 10), CDR2 (SEQ. ID N.° 13) e CDR3 (SEQ. ID N.° 16) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J são indicadas. A Figura 2A mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 26) e sequência de aminoãcidos (SEQ. ID N.° 20) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 13H7. As regiões CDR1 (SEQ. ID N.° 2), CDR2 (SEQ. ID N. 0 5) e CDR3 (SEQ. ID N.° 8) são delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J são indicadas. A Figura 2B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 29) e sequência de aminoãcidos (SEQ. ID N.° 23) da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 13H7. As regiões CDR1. (SEQ. ID N.° 11), CDR2 (SEQ. ID N.° 14) e CDR3 {SEQ. ID N.° 17) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J são indicadas. A Figura 3A mostra a sequência, de nucleótidos (SEQ. ID N.° 27) e sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 21) da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7H9. As regiões CDR1 (SEQ. ID N.° 3), CDR2 (SEQ. ID N.° 6) e CDR3 (SEQ. ID N.° 9) são delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J são indicadas. A Figura 3B mostra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 30) e sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 24) da região variável da. cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7H9. As regiões CDR1 (SEQ. ID N.° 12), CDR2 (SEQ. ID N,° 15) e CDR3 (SEQ. ID N.° 18) são delineadas e as derivações da linha germinativa V e J são indicadas. A Figura 4 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 13H5 (SEQ. ID N'.° 19) e 7H9 (SEQ. ID N.° 21) com a sequência de aminoácidos 1-18 da linha germinativa humana VH (SEQ. ID N.° 31). A Figura 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 13H7 (SEQ. ID M.° 20) com a sequência de aminoácidos 4-61 da linha germinativa humana VH (SEQ. ID N.° 32). A Figura 6 mostra o alinhamento da sequência de

aminoácidos da região variável da cadeia leve de 13H5 (SEQ. ID N.° 22), 13H7 (SEQ. ID N.° 23) e 7H9 (SEQ. ID N.° 24) com a sequência de aminoácidos A27 da linha germinativa humana VK (SEQ. ID K.° 33). A Figura 7 é um gráfico que mostra competição de ligação de 125 I-IFNa2a a células Daudi que expressam IFNAR por IFNa2a não rotulado (·) versus potenciação da ligação de 125I-IFNa2a por mAb 13H5 (▼) . Um anticorpo controlo isotipo não teve efeito na ligação (♦). A Figura 8 é um gráfico que mostra a ligação de 125I- 13H5 às células Daudi na presença de IFNa2a () mas não na ausência de IFNa2a (▲) . A ligação dependente de IFNa específica de 13H5 é representada por círculos (*). A Figura 9 é um gráfico que mostra os resultados de ensaios ADCC de lise celular de células Raji por células mononucleares humanas frescas na presença de 13H5 (), 13H5 + IFNa(T), um anticorpo controlo isotipo + IFNa(A), ou um anticorpo controlo positivo (·) . A lise só foi observada com o controlo positivo.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados que ligam a IFN alfa e que são capazes de inibir a atividade biológica de múltiplos subtipos de IFN alfa, mas não a atividade biológica do subtipo 21 do IFN alfa, ou IFN beta ou IFN ómega. Os anticorpos da invenção são capazes de inibir a expressão à superfície de marcadores celulares induzidos por IFN alfa, inibindo a expressão de IP-10 induzida por IFN alfa e inibindo o desenvolvimento de células dendríticas mediado pelo plasma de pacientes com lúpus eritematoso sistémico (SLE). A invenção providencia anticorpos isolados, métodos de fabricar tais anticorpos, imunoconjugados e molécula biespecíficas que compreendem tais anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. A invenção também se refere a métodos ex vivo de utilizar os anticorpos para inibir a atividade de 11¾ alfa, e a anticorpos para utilização num método de tratamento de urn distúrbio autoimune, ou num método de inibir ou prevenir a rejeição de transplantes ou no tratamento da doença do enxerto contra hospedeiro.

De modo a que a presente invenção possa ser mais rapidamente compreendida, são primeiro definidos certos termos. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

Os termos "interferão alfa" e "IFN alfa" são utilizados alternadamente e pretende-se que se refiram a proteínas de IFN alfa CGdíficadas por um gene funcional do locus do gene do interferão alfa com 75% ou mais de identidade de sequência com o IFN alfa 1 (número de Genbank NP___076 918 ou proteína codificada pelo número de Genbank NM__024013) . Exemplos de subtipos de IFN alfa incluem IFN alfa 1, alra 2a, alra 2o, alra 4, alfa 5, arfa 6, alta 7, alfa 8, alfa 10, alfa 13, alfa 14, alfa. 16, alfa 17 e alfa 21. 0 termo "interferão alfa" pretende-se que abranja formas recombinantes dos vários subtipos do IFN alfa, bem como preparações que ocorrem naturalmente que compreendem proteínas do IFN alfa, tais como IFN leucócito e IFN linfoblastoide. Não se pretende que o termo IFN alfa abranja só o IFN ómeaa, apesar de uma composição que compreende ambos IFN alfa e IFN ómega ser abrangida pelo termo IFN alfa. 0 termo "recetor do IFN alfa", como utilizado aqui, pretende-se que se refira a membros da família de recetores do IFN alfa de moléculas que são recetores do ligando IFN alfa. Exemplos de recetores do IFN alfa são o recetor 1 do IFN alfa e recetor 2 do IFN alfa. 0 termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentadoras de antigénio, células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células ctnteriores ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta no dano seletivo a, destruição de, ou eliminação por parte do corpo humano de patogénios invasores, células ou tecidos infetados com patogénios, células cancerígenas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.

Uma "via de transdução do sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução do sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula a outra porção de uma célula. Como utilizada aqui, a frase "recetor de superfície celular” inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um "recetor de superfície celular·' da presente invenção é o recetor 1 do IFN alfa ou o recetor 2 do IFN alfa. 0 termo "anticorpo", como é referido aqui, inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antigénio (isto é, "porção que liga ao antigénio") ou cadeias únicas do mesmo. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína que compreende, pelo menos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfído, ou uma porção de ligação a antigénio das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável da cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é compreendida por três domínios, CHi, CH2 e CH3 · Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável da cadeia leve (abreviada aqui como VL) e por uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve ê compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabi1idade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR) , intercaladas com regiões que estão mais conservadas, designadas regiões estrutura (FR) . Cada VH e VTj é composta de três CDRs e quatro FRs, organizadas a partir do terminal arrdno até ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina cios tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico. 0 termo "porção que liga ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), como utilizado aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio (por exemplo, IFN alfa). Foi demonstrado que a função de ligação do antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção que liga ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL, e CHi; (ii) um fragmento F(ab')2í um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfido na região dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VK e CHi; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braçjo de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, apesar dos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH/ serem codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que lhes permite serem fabricados como uma única cadeia proteica na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv) ,· ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science. 242 :423-426,- e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883) . Tais anticorpos de cadeia única também se pretende que sejam abrangidos pelo termo "porção que liga ao antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas daqueles habilitados na arte, e os fragmentos são classificados confGrme a utilidade da mesma forma que gs anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", como utilizado aqui, pretende- se que se refira a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente a IFN alfa é substancialmente livre de anticorpos que ligam especificamente a outros antigénios que não o IFN alfa). Um anticorpo isolado que liga especificamente a IFN alfa pode, contudo, ter reatividade cruzada com outros antigénios, tai s como moléculas de IFN alfa de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente li\^re de outro material e/ou químicos celulares.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como utilizado aqui, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única.. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidci.de de ligação única e afinidade por una epítopo particular. 0 termo "anticorpo humano", como utilizado aqui, pretende-se que inclua anticorpos com regiões variáveis nas quais tanto as regiões estrutura como CDR são derivadas das sequências da imunoglobulina da linha germínativa humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada das sequências da imunoglobulina dei linha germínativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências da imunoglobulina da linha germínativa humana, (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese in vitro aleatória ou específica do local ou por mutaçâG SGmãtica in vivo) . Contudo, o termo "anticorpo humano", como utilizado aqui, não se pretende que inclua anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas da linha germínativa de outras espécies de mamíferos, tais como ratinho, fGram enxertadas em sequências de estrutura humanas. 0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveis nas quais ambas as regiões CDR e estrutura são derivadas das sequências da imunoglobulina da linha germinativa humana. Numa modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgénico não humano, por exemplo, um ratinho transgénico, com um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo humano recombinante", como utilizado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um ratinho} que é transgénico ou transcromossómico para genes da imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dos mesmos (descritos com mais detalhe em baixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformados para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfetoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos recombinante, combinatória e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a. excisão de sequências de gene da imunoglobulina humana para outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões estrutura e CDR são derivadas de sequências da imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas modalidades, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências da Ig humana, mutagénese somática in vivo) e, assim, as sequências de amínoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de terem derivado de, e relacionadas com, sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpo humano in vivo.

Como utilizado aqui, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes da regíâG constante da cadeia pesada.

Como utilizado aqui, um anticorpo que "inibe a atividade biológica." de um subtipo do IFN alfa pretende-se que se refira a um anticorpo que inibe a atividade daquele subtipo em, pelo menos, 10%, ma is preferencialmente, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, quando comparado com o nível de atividade na ausência do anticorpo, por exemplo, utilizando um ensaio funcional, tal como aquele descrito nos Exemplos, tal como o ensaio de proliferação de células Daudi. Em alternati\^a, um anticorpo que "inibe a atividade biológica" de um subtipo do IFN alfa pode referir-se a um anticorpo que inibe a atividade daquele subtipo com uma ECS0 inferior a 200 nM ou menos, mais preferencialmente 100 nM ou menos, ainda mais preferencialmente 50 nM ou. menos e ainda. mais preferencialmente 10 nM ou menos.

Como utilizado aqui, um anticorpo que "inibe substancialmente a atividade biológica" de um subtipo do IFN alfa, ou de um IFN beta ou IFN ómega, pretende-se que se refira a um anticorpo que inibe a atividade daquele subtipo por menos de 10%, mais preferencialmente por menos de 5% e ainda mais preferencialmente por essencialmente quantidades indetetáveis. Em alternativa, um anticorpo que "não inibe a atividade biológica" de um subtipo do IFN alfa pode referir-se a um anticorpo que inibe a atividade daquele subtipo com uma EC50 de 300 nM ou superior.

Como utilizado aqui, "ligação específica" refere-se a ligação de anticorpo a um antigénio pré-determinado. Tipicamente, o anticorpo liga com uma constante de dissociação (KD) de 10~8 M ou inferior, e liga ao antigénio pré-determinado com uma K.D que é, pelo menos, duas vezes inferior à sua KD para ligação a um antigénio não específico (por exemplo, BSA, caseína) que não o antigénio pré-determinado ou um antigénio estreitamente relacionado. As frases -um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo específico de um antigénio" são utilizadas alternadamente aqui com o termo "um anticorpo que liga especif icamente a. um antigénio". 0 termo "Ka380C" ou "Ka", como utilizado aqui, pretende-se que se refira à taxa de associação de uma interação anticorpo-antigénio particular, ao passo que o termo "Kdis" ou "Kd", como utilizado aqui, pretende-se que se refira à taxei de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. 0 termo "KD", como utilizado aqui, pretende-se que se refira à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de ICd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M) . Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na arte. Um método preferido para determinar a KD de um anticorpo é utilizando a ressonância de plasmão de superfície, preferencialmente utilizando um sistema biGssensor tal como um sistema Biacore®.

Como utilizado aqui, o termo "alta afinidade" por um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo com uma KD de !0“8 M ou inferior, mais preferencialmente 10”9 M ou inferior e mesmo mais preferencialmente 10"iU M ou inferior. Contudo, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, a ligação de "alta afinidade" por um isotipo IgM refere-se a um anticorpo com uma KD de 10"'' M ou inferior, mais preferencialmente 10~8 M ou inferior.

Como utilizado aqui, o termo "sujeito" inclui qualquer animal humano ou não humano. 0 termo "animal não humano" inclui tGdos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas nãc· humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. Vários aspetos da invenção são descritos em maior detalhe nas subsecções seguintes.

Anticorpos Anti-IFN alfa

Os anticorpos da invenção são caracterizados por atributos ou propriedades funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplo, em formas de realização particulares, os anticorpos ligam especificamente a múltiplos subtipos do IFN alfa, tais como IFN alfa 2a e IFN alfa 2b. Preferencialmente, um anticorpo da invenção liga a IFN alfa 2a e/ou alfa 2b com alta afinidade, por exemplo, com uma KD de IO"8 M ou inferior ou 10'9 M ou inferior ou mesmo 10'10 M ou inferior. Numa forma de realização preferida, o anticorpo liga a IFN alfa 2a humana e IFN alfa 2b humana. A afinidade da ligação e cinética dos anticorpos da invenção pode ser examinada por, por exemplo, análise Biacore, conforme descrito nos Exemplos.

Além disso, noutras formas de realização, os anticorpos da invenção exibem várias propriedades funcionais. Por exemplo, os anticorpos podem ser capazes de inibir a atividade biológica de múltiplos subtipos do IFN alfa, mas podem não inibir substancialmente a atividade biológica do IFN alfa 21. Os anticorpos da invenção também podem não inibir substancialmente a atividade biológica do IFN beta ou IFN ómega. Os anticorpos também podem ser capazes de inibir a expressão à superfície induzida pelo IFN de marcadores celulares, tais como CD38 ou classe I do MHC, em células sanguíneas mononucleares periféricas humanas normais. Os anticorpos também podem ser capazes de inibir a expressão induzida pelo IFN de IP-10 por células sanguíneas mononucleares periféricas humanas normais. A inibição da atividade biológica de subtipos do IFN alfa, IFN beta e/ou IFN ómega pode ser avaliada utilizando ensaios funcionais tais como aqueles descritos nos Exemplos, tais como um ensaio de proliferação de células Daudi.

Ainda adicionalmente, os anticorpos podem ser capazes de inibir o desenvolvimento das células dendríticas mediado pelo plasma de pacientes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) . 0 desenvolvimento das células dendríticas pode ser avaliado examinando a expressão dos marcadores de superfície celular, tais como CD38, classe I do MHC e/ou CD123, conforme descritos nos Exemplos,

Em determinadas formas de realização preferidas, um anticorpo da invenção inibe a atividade biológica do IFN alfa através de um mecanismo de ação não competitivo, isto é, o anticorpo não compete pela ligação do IFN alfa a IFNAR. Em vez disso, tal anticorpo torna-se associado com IFNAR da superfície celular na presença do IFN alfa e inibe a sinalização celular através do IFNAR. Noutras formas de realização preferidas, um anticorpo com estas propriedades de ligação pode não exibir atividade ADCC significativa. Os ensaios para examinar estas propriedades funcionais do anticorpo são conhecidos 11a arte, tais como os ensaios descritos nos Exemplos 8 e 9. Por exemplo, a capacidade do anticorpo de inibir a ligação de IFN alfa radiomarcado a células que expressam IFNAR pode ser examinada. A incapacidade do anticorpo de inibir a ligação de IFN alfa radiomarcado a IFNAR é indicativa de um mecanismo de ação não competitivo. Para examinar ainda este mecanismo de ação, a ligação do anticorpo radiomarcado, na presença ou ausência de IFN alfa, às células que expressam IFNAR pode ser testada. A ligação do anticorpo radiomarcado a células que expressam IFNAR na presença, mas não na ausência, do IFN alfa é indicativa deste mecanismo de ação.

Numa forma de realização preferida, os anticorpos da invenção ligam ao complexo IFN alfa-IFNAR com uma afinidade superior (por exemplo, KD) do que IFN alfa isolado (um ou mais subtipos) e/ou a IFNAR isolado. Por exemplo, en determinadas formas de realização, os anticorpos da invenção ligam ao complexo IFN alfa-IFNAR com uma KD de IO'8 M ou afinidade superior, uma KD de IO"9 M ou afinidade superior, ou uma KD de 10"lú M ou afinidade superior.

Noutra forma de realização preferida, os anticorpos da invenção são biespecíficos por IFN alfa (um ou mais subtípos) e IE’NAR (IFNAR1 e/ou IFNAR2) , o que significa que os anticorpos se associam com ambos IFN alfa e IFNAR (IFNARl e/ou IFNAR2). Em conformidade, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem, pelo menos, uma primeira especificidade de ligação por IFN alfa e uma segunda especificidade de ligação por IFNARl, em que, por exemplo, a segunda especificidade de ligação por IFNARl pode ser formada pela associação do anticorpo com IFN alfa. A invenção também inclui moléculas biespecíficas que compreendem, pelo menos, uma especificidade de ligação por IFN alfa e uma segunda especificidade de ligação por IFNAR2, em que, por exemplo, a segunda especificidade de ligação por IFNAR2 pode ser formada por associação do anticorpo com IFN alfa.

Anticorpos Monoclonais 13H5, 13H7 e 7H9

Os anticorpos revelados aqui incluem os anticorpos monoclGnais humanos 13H5, 13H7, e 7H9, isolados e estruturalmente caracterizados, conforme descrito nos Exemplos. As sequências de aminoácidos VH de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 19, 20, e 21, respetivamente. As sequências de aminoácidos VL de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 22, 23 e 24, respetivarnente. É divulgado no presente documento um anticorpo isolado monoclGnal, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 19, 20, and 21; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 22, 23, e 24; em que o anticorpo inibe a atividade biológica do i n t e r £ e r ão a 1 £ a..

Combinações de cadeias pesada e leve preferidas incluem: (a) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 19; e (b) uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ. ID N.° 22; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:23; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; and (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:24, São também divulgados anticorpos que compreendem as CDRls, CDR2s, e CDR3s da cadeia pesada e cadeia leve de 13H5, 13H7, e 7H9, ou combinações dos mesmos. As sequências de aminoácidos das CDRls VH de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID M.°s 1, 2, e 3. As sequências de aminoácidos das

CDR2s VH de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID

N.°s 4, 5, e 6. As sequências de aminoácidos das CDR3s VH de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 7, 8, e 9. As sequências de aminoácidos das CDRls VL de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 10, 11, e 12. As sequências de aminoácidos das CDR2s VL de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 13, 14, e 15. As sequências de aminoácidos das CDR3s VL de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 16, 17, e 18. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema Kabat (Kabat. E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins o£ Immunological Interest, 5a edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos U.S.,

Publicação NIH N.° 91-3242).

Também é divulgado no presente documento um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo compreendendo: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoãciidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1,2, e 3; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 5, e 6; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7, 8, e 9; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 11, e 12; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 13, 14, e 15; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 17, e 18; em que o anticorpo inibe a atividade biológica do interferão alfa.

Também é divulgado um anticorpo que compreende: ia) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada que compreende a SEQ. ID K.° 1; (b) uma CDR2 de região variável da cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 4; (c) uma CDR3 de região variável da cadeia pesada que compreende a SEQ. ID N.° 7; (d) uma CDR1 de região variável da cadeia leve que compreende a SEQ. ID N.° 10; (e) uma CDR2 de região variável da cadeia leve que compreende a SEQ. ID N.° 13; e (f) uma CDR3 de região variável da cadeia leve que compreende a SEQ. ID N.° 16.

Também é divulgado um anticorpo que compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 5? (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 8; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 11; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 14; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 17.

Também é divulgado um anticorpo que compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 3; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ id NO: 6; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 9; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 12; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 15; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 18.

Anticorpos Homólogos

Um anticorpo da invenção pode compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências de aminoácidos do anticorpo 13H5 conforme descrito no presente documento, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-IFN alfa da invenção.

Por exemplo, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (a.) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoãcidos que é pelo menos 80% homóloga com a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 19; (b) a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoãcidos que é pelo menos 80% homóloga com a sequência de aminoãcidos de SEQ ID NO: 22; (c) o anticorpo inibe uma CDR3 de regíâG variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7; e opcionalmente (d) o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades: (i) o anticorpo não inibe substancialmente a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega; (ii) o anticorpo inibe a expressão à superfície induzida por IFN de CD38 ou MHC Classe I sobre células mononucleares do sangue periférico; (iii) o anticorpo inibe a expressão induzida por IFN de IP-1G por células mononucleares do sangue periférico; (iv) o anticorpo inibe o desenvolvimento de células dendríticas mediado por plasma de lúpus eritematoso sistémico (SLE).

Noutras formas de realização, as sequências de aminoãcidos de Vh e/ou Vi podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às sequências estabelecidas acima. Pode ser obtido um anticorpo tendo regiões Vh e Vi tendo homologia elevada (isto ê, 80% ou superior) ã.s regiões Vh e Vi de SEQ ID NOs: 19 e 22, respetivamente, através de mutagénese (por exemplo, mutagénese dirigida ao local ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando SEQ ID NOs: 19 e/ou 22, seguido por testagem do anticorpo alterado para a função retida (isto ê, as funções estabelecidas em (c:) e (d) acima) utilizando os ensaios funcionais descritos no presente documento.

Conforme utilizado no presente documento, a percentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos é equivalente à identidade de sequência entre as duas sequências. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto ê, % homologia = n.° de posições idênticas/n.° total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que necessitam ser introduzidos para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser alcançada utilizando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitantes abaixo. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduos em massa PAM120, ma penal ização de comprimento de lacuna de 12 e uma penalização de lacuna de 4. Além disso, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e uma massa de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e uma massa de comprimento de 1,2, 3, 4, 5, ou 6 .

Adicionalmente ou alternativamente, as sequências proteicas da invenção podem adicionalmente ser utilizadas como uma "sequência, de pesquisa" para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Podem ser realizadas pesquisas proteicas BLAST com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoâcidos homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, pode ser utilizado Gapped BLAST conforme descrito em Altschul et al., (19S7) Nucleic Acids

Res. 25(17):3339-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, podem ser utilizados os parâmetros por defeito dos respetivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Veja-se http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticorpos com Modificações Conservativas

Em determinadas formas de realização, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destas sequências de CDR compreendem sequências de aminoãcidGS especificadas com base no anticorpo 13H5 conforme descrito no presente documento, ou modificações conservativas do mesmo, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas do anticorpo 13H5.

Consequentemente, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou. porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende um anticorpo monoclonal anti interferâo alfa, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende: (a.) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma modificação conservativa de SEQ ID NO: 1, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoácido conservativas; (b) uma CDR.2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma modificação conservativa de SEQ ID NO: 4, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoácido conservativas; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa de SEQ ID NO: 10, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoácido conservativas; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa de SEQ ID NO: 13, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoácido conservativas; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa de SEQ ID NO: 16, si modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoácido conservativas; e em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe IFN Linfoblastoide, IFNo:6, IFNa2b, IFNc*2a, IFNcxl, IFN Leucocitãrio, IFNal6, IFNalO, IFNofS, IFNa5, IFNal4, IFNoí17 , IFNa7 e IFNa4, mas não inibe substancialmente a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega. 0 anticorpo pode opcionalmente exibir pelo menos uma das seguintes propriedades: (i) o anticorpo não inibe substancialmente a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega; (ii) o anticorpo inibe a expressão à superfície induzida por IFN de CD38 ou MHC de Classe I sobre células mononucleares do sangue periférico; (iii) o anticorpo inibe a expressão induzida por IFN de IP-10 por células mononucleares do sangue periférico; (iv) o anticorpo inibe o desenvolvimento de células dendríticas mediado por plasma de lúpus eritematoso sistémico (SLE).

Conforme utilizado no presente documento, o termo "modificações de sequência conservativas" pretende referir modificações de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoãcidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e eliminações ade aminoãcidos. As modificações podem ser introduzidas num anticorpo da invenção através de técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagénese dirigida ao local e mutagénese mediada por PCR. AS substituições de aminoãcidos conservativas são aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoãcidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoãcidos com cadeias laterais básicas por exemplo, lisina, arginína, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspãrtico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais apoiares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Consequentemente, um ou mais resíduos de aminoãcidos dentro das regiões de CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido a partir da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado para a função retida (isto é, as funções estabelecidas acima) utilizando os ensaios funcionais descritos no presente documento.

Anticorpos que Ligam ao Mesmo Epítopo que Anticorpos Anti-IFN Alfa da Invenção

Também são divulgados anticorpos que ligam ao mesmo epítopo que os vários anticorpos de IFN alfa humanos da invenção proporcionados no presente documento, tais como outros anticorpos humanos que ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos 13H5, 13H7, e 7H9 anticorpos descritos no presente documento. Tais anticorpos podem ser identificados com base na sua capacidade de competição cruzada (por exemplo, inibição competitiva da ligação de, de uma forma estatisticamente significativa,) com outros anticorpos da invenção, tais como 13H5, 13H7 ou 7H9, em ensaios de ligaçãG a IFN alfa padrão. Por exemplo, conforme demonstrado nos Exemplos através de análise Biacore, 13H5 liga com afinidade elevada a IFN alfa 2a. e IFN alfa 2b. Consequentemente, são divulgados anticorpo, preferentemente anticorpo humanos, que competem pela ligação a IFN alfa 2a e IFN alfa 2b com outro anticorpo da invenção (por exemplo, 13H5, 13H7 ou 7H9). A capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação de, por exemplo, 13H5, 13H7 ou 7H9 a IFN alfa 2a ou IFN alfa 2b demonstra que o anticorpo de teste pode competir com esse anticorpo para ligar a IFN alfa 2a ou IFN alfa 2b; um tal anticorpo pode, de acordo com a teoria nâo limitante, ligar ao mesmo epítopo ou a um relacionado (por exemplo, estruturalmente semelhante ou espacialmente proximai) em IFN alfa 2a ou IFN alfa 2b que o anticorpo com o qual compete. Numa foram de realização preferida, o anticorpo que liga ao mesmo epítopo em IFN alfa 2a ou IFN alfa 2b que, por exemplo, 13H5, 13H7, ou 71-19, é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.

Anticorpos Manipulados e Modificados

Um anticorpo da invenção pode ser adicionalmente preparado utilizando um anticorpo tendo uma ou mais das sequências Vh e/ou Vi divulgadas no presente documento como material de partida para manipular um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas a partir do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser manipulado modificando um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas regiões variáveis (isto ê, Vh e/ou VL) , por exemplo dentro de uma ou ma is regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado modificando resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

Um tipo de manipulação de regiões variáveis que pode ser realizado é enxerto de CDR. Os anticorpos interatuam com antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoãcidos que estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. Por este motivo, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequências foram das CDRs. Dado que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos construindo vetores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado em sequências estruturais a partir de um anticorpo com diferentes propriedades (veja-se, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. N.° 5.225.539 de Winter, e as Patentes U.S. N.°s. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et al.)

Como tal, é divulgado no presente documento um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoãcidos selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1,2, e 3, SEQ ID NO: 4, 5, e 6 e SEQ ID NO: 7, 8, e 9, respetivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo as sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:10, 11, e 12, SEQ ID NO: 13, 14, e 15 e SEQ ID NO: 16, 17, e 18, respetivamente. Consequentemente, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de Vh e VL dos anticorpos monoclonais 13H5, 13H7 ou 7H9, mas podem conter diferentes sequências estruturais a partir destes anticorpos.

Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dcidos de ADN públicas ou referências publicadas que incluem sequências génicas de anticorpos de linha germinal. Por exemplo, podem ser encontradas sequências de ADN de linha, germinal para genes de região variável de cadeias pesada e leve na base de dados de sequências germinais humanas "VBase" (disponível na Internet em www.mrc- cpe.cam.ac.uldvbase), bem como em Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N.° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776--798,- e Cox, J.P. L. et al. (1994) "A Directorv of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immuno'1.. 24:827-836.

Sequências estruturais preferidas para utilização nos anticorpos são aquelas que são estruturalmente semelhantes às sequências estruturais utilizadas por anticorpo selecionados da divulgação, por exemplo, semelhantes às sequências estruturais VH 1-18 ou 4-61 e VK A27 utilizadas pelos anticorpos monoclonais preferidos da invenção. As sequências de CDR1,2 e .3 de Vh, e as sequências de CDR1,2 e 3 de Vi podem ser enxertadas em regiões estruturais que têm a mesma sequência que a encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinal qua partir do qual deriva a sequência estrutural, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões estruturais que contêm uma ou mais mutações conforma comparado com as sequências germinais. Por exemplo, foi constatado que em determinados casos é benéfico mutar resíduos dentro das regiões estruturais para manter ou potenciar a capacidade de ligação a antigénio do anticorpo (veja-se por exemplo., as Patentes U.S. N.°s. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen et 31) .

Outro tipo de modificação de região variável é mutar resíduos de amínoãeidos dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de Vh e/ou Vi para desta forma melhorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. Pode ser realizada mutagénese dirigida ao local ou mutagénese mediada por PCR para introduzir a(s) mutação(ões) e pode ser avaliado o efeito sobre a ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, em ensaios in vitro ou in vivo confGrme descrito no presente documento e proporcionado nos Exemplos. São preferentemente introduzidas modificações conservativas. As mutações podem ser substituições, adições ou eliminações de aminoácidos, mas são preferentemente substituições. Além disso, são tipicamente alterados não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR.

Como tal, noutra forma de realização, a invenção proporciona anticorpos anti-IFN alfa isolados, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região CDR1 de Vh compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo uma, duas ou três substituições, eliminações ou adições conforme comparado com SSQ ID MO: 1; (b) uma região CDR2 de

Vh compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo uma, duas ou três substituições, eliminações ou adições conforme comparado com to SEQ ID NO: 4; (c) uma região CDR3 de Vh compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo uma, duas ou três substituições, eliminações ou adições conforme comparado com SEQ ID NO: 7; (d) uma região CDR1 de Vx compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo uma, duas ou três substituições, eliminações ou adições conforme comparado com SEQ ID MO: 10; (e) uma região CDR2 de Vx compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo uma, duas ou três substituições, eliminações ou adições conforme comparado com to SEQ ID MO: 13; e (f) uma região CDR3 de compreendendo uma sequência de aminoãcidos tendo uma, duas ou três substituições, eliminações ou adições conforme comparado com SEQ ID NO: 16.

Os anticorpos manipulados da invenção incluem aqueles nos quais foram realizadas modificações a resíduos estruturais dentro de Vh e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações estruturais são realizadas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é realizar "mutação reversa" de uma ou mais modificações estruturais à correspondente sequência de linha germinal. Mais especificamente, um anticorpo que tenha sido submetido a mutação somática pode conter resíduos estruturais que diferem da sequência de linha germinal a partir da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando as sequências estruturais do anticorpo com as sequências germinais a partir das quais o anticorpo é derivado. Por exemplo, para for 13H5, o resíduo de aminoácido n.° 81 (dentro de FR3) de Vh é uma leucina enquanto este resíduo na correspondente sequência de linha germinal VH 1-18 é uma metionina (veja-se a Figura 4). Para devolver as sequências de região estrutural à sua configuração de linha germinal, as mutações somáticas podem ser submetidas a "mutação reversa" até à sequência de linha germinal através de, por exemplo, mutagénese dirigida ao local ou mutagénese mediada por PCR (por exemplo, o resíduo 81 da Vh de 13H5 pose ser submetido a "mutação reversa" de leucina a metionina). Tais anticorpos submetidos a "mutação reversa" destinam-se também a ser abrangidos pela invenção.

Outro tipo de modificações estruturais envolve mutar um ou mais resíduos dentro da região estrutural, ou inclusive dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopGS de células T para desta forma reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem é também referida como "desimunização" e é descrita em mais detalhe na Publicação de Patente U.S. N.° 20030153043 por Carr et ai.

Para além ou como alternativa a modificações realizadas dentro das regiões estruturais ou CDR, os anticorpos da invenção podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como semivida no soro, fixação a complemento, ligação a recetor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antigénio. Adicionalmente, um anticorpo da invenção pGde ser quimicamente modificado (por exemplo, podem ser unidas uma ou mais frações químicas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar a sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas formas de realização é descrita em mais detalhe abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é a do índice EU de Kabat.

Numa forma de realização, a região de dobradiça de CHI é modificada tal que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Patente U.S. N.° 5.677.425 por Bodmer et al. 0 número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CHI é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias pesada e leve ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

Noutra forma de realização, a região de dobradiça de Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a semivida biológica do anticorpo. Mais especificamente, são introduzidas uma ou mais mutações de aminoãcido 11a região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc tal que o anticorpo tem ligação a proteína de Staphylococcus A (8pA) em relação à ligação a SpA do domínio de dobradiça Fc nativo. Esta abordagem é descrita em mais detalhe na Patente U.S. N.° 6.165.745 por Ward et al.

Noutra forma de realização, o anticorpo ê modificado para aumentar a sua semivida biológica. São possíveis várias abordagens. Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais das seguintes mutações: T252L, T254S, T256F, conforma descrito na Patente U.S. N.° 6.277.375 de Ward.

Alternativamente, para aumentar a semivida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CHI ou CL para conter um epítopo de ligação a recetor de salvação tomado a partir de duas ansas de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes U.S. N. 5.869.046 e 6.121.022 por Presta et al.

Ainda noutras formas de realização, a região Fc é alterada substituindo pelo menos um resíduo de aminoãcido com um resíduo de aminoãcido diferente para alertar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoãcido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 pode ser substituído com um resíduo de aminoãcido diferente tal que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligando efetor mas mantenha a capacidade da ligação a antigénio do anticorpo parental 0 ligando efetor ao qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um recetor Fc ou o componente Cl do complemento. Esta bordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes 'li.S. M.°s. 5.624.821 e 5.648.260, ambas por Winter et al.

Noutro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoãcido diferente tal que o anticorpo tenha ligação a Clq alterada e/ou reduzida ou abolida ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) abolida. Esta abordagem é descrita em mais detalhe na Patente U.S. N.° 6.194.551 por Idusogie et al.

Noutro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das posições de aminoácido 231 e 239 são alterados para desta forma alterar a capacidade do anticorpo de fiar ao complemento. Esta abordagem é descrita em mais detalhe na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

Ainda, noutra forma de realização, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo por um recetor Fcy modificando um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301,303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é descrita em mais detalhe na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgG 1 humana para FcyRl, FcyRII, FcyRlII e FcRn foram mapeados e foram descritas variantes com ligação melhorada (veja-se Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). As mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas como melhorando a ligação a FcyRIII. Adicionalmente, os seguintes mutantes de combinação foram mostrados como melhorando a ligação a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S 2 9 8A/E3 3 3A/K3 3 4A.

Ainda noutra forma de realização, é modificada a glieosilação de um anticorpo. Por exemplo, pode ser fabricado um anticorpo n4ao glicosilado (isto é, o anticorpo carece de glieosilação). A glieosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo pelo antigénio. Tais modificaç4oes de hidratos de carbono podem ser alcançadas, por exemplo, alterando um ou mais sítios de glieosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser realizadas uma ou mais substituições de anticorpo que resultem na. eliminação de uma ou mais sítios de glieosilação estruturais de região variável para desta forma eliminar a glieosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo pelo antigénio. Uma tal abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes U.S. N.°s 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.

Adicionalmente ou alternativamente, pode ser fabricado um anticorpo que tenha um tipo alterado de glieosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosilo ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac bifurcadas aumentadas. Tais padr4aoes de glieosilação alterada foram demonstrados como aumentando a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser alcançadas, pGr exemplo, expressando o anticorpo numa célula hospedeira com maquinaria de glieosilação alterada. Foram descritas na técnica células com maquinaria de glieosilação alterada e podem ser utilizadas como células hospedeiras nas quais expressar anticorpos recombinantes da invenção para desta forma produzir um anticorpo com glieosilação alterada. Por exemplo, o documento EP 1,176,195 por Hanai et al, descreve uma linha celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma fucosil transferase, tal. que os anticorpos expressos numa tal célula exibem hipofucosilação. A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linha celular CEO variante, células Lecl3, com capacidade reduzida de ligar fucose a hidratos de carbono ligandos a Asn(297), resultando também em hipofucosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (veja-se também Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740), A Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al, descreve linhas celulares manipuladas para expressar glicosil transferases modificadoras de glicoproteínas ípor exemplo., beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que os anticorpos expressos nas linhas celulares mêtnipuladas expressem estruturas GlcNac bifurcadas aumentadas, o que resulta em aumento da atividade ADCC dos anticorpos (veja-se também Umana et ai. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).

Outra modificação dos anticorpos no presente documento que é contemplada pela invenção é a peguilaçâo. UM anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumentar a semivida biológica (por exemplo, no soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, é tipicamente feito reagir com polietilenoglicol (PEG), tal como um derivado de éster ou aldeído reativo de PEG, sob condições nas quais um u mais grupos PEG se unem ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferentemente, a peguilaçâo é levada a cabo por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero hidrossolúvel reativo análogo). Conforme utilizado no presente documento, o termo "polietilenoglicol" destina-se a abranger quaisquer das formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como (C1-C10) alcoxi- ou ariloxi- polietilenoglicol ou polietilenGglicol-maleimida. Em determinadas formas de realização, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. São conhecidos na técnica métodos para peguilar proteínas e podem ser aplicados aos anticorpos da invençãG. Veja-se por exemplo, os documentos EP 0 154 316 por Nishimura et al. e EP 0 401 384 por Ishikawa et al,

Anticorpos modificados com estabilidade aumentada São também divulgadas formas modificadas do anticorpo 13H5 que exibem estabilidade aumentada quando comparado com o tipo selvagem de 13H5. Conforme de scrito com ma.ror detalhe no Exemplo 10, o anticorpo 13H5 contém um local de desamidaçâo no Asn-55 dentro de CDR2 da cadeia VK. A sequência de aminoácidos neste local, das posições 55 a 58 é N G N T (resíduos de aminoácidos 55-58 da 5EQ. ID N.° 19). Em conformidade, em certas modalidades, a sequência de aminoácidos da cadeia VH de 13H5 é mutada na posição 55 de asparagina para um aminoácido diferente. Além disso ou em alternativa, as posições dos aminoácidos à volta de Asn-55 que influenciam a desamidaçâo podem ser mutadas. Substituições de aminoácidos preferidas na posição 55 incluem ácido aspártico e glutamina, com a glutamina a ser mais preferida. A sequência de aminoácidos de 13H5 com uma substituição N55D é mostrada na SEQ. ID N.° 34. A sequência de aminoácidos de 13H5 com uma substituição N55Q é mostrada na SEQ. ID N.° 35. Noutra modalidade, Asn-57 da cadeia VH de 13H5 também é mutada, junto com mutação de Asn5 5. IJma substituição de aminoácidos preferida na posição 57 é glutamina. A sequência de aminoácidos e 13H5 com substituições N55Q e N57Q é mostrada na SEQ. ID M.° 36.

Estes três anticorpos mutados exibem estabilidade aumentada, em condições de desamidaçâo forçada, quando comparado com o tipo selvagem de 13H5, conforme descrito em maior detalhe no Exemplo 11.

Noutra modalidade, a glicina na posição do aminoácido 56 é mutada para uma alanina (G56A) , uma vez que foi determinado a partir de péptidos modelo que a taxa de desamidação é aproximadamente 20 vezes inferior com uma alanina adjacente â asparagina, do que uma glicina adjacente à alanina (ver, por exemplo, Ahern, T. e Manning, M.C., editores. Stability of Protein Pharmaceuticals, Pharmaceutical Biotechnology, volume 2, capítulo 1, páginas 1-30). Assim, a mutação G56A representa um equilíbrio entre a reatividade diminuída e alteração estrutural mínima a. sequência de tipo selvagem, aumentando assim a estabilidade enquanto mantém a atividade. A sequência de aminoãcidos de 13H5 com uma substituição G56A é mostrada na SEQ. ID N.° 3 7 .

Em conformidade, em várias modalidades, a invenção providencia um anticorpo IFN alfa da invenção com uma substituição de aminoãcido em Asn-55, Gly-56 e/ou Asn-57 da CDR2 da cadeia VH de 13H5, a sequência de tipo selvagem a qual é apresentada na SEQ. ID N.° 19. Anticorpos mutados preferidos compreendem uma região variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoãcidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 34, 35, 36 e 37. Preferencialmente, a cadeia VK do anticorpo está emparelhada com a cadeia VK de 13H5, conforme apresentado na SEQ. ID N.° 22. Métodos de Fabricar Anticorpos por Engenharia

Conforme discutido anteriormente, os anticorpos anti-IFN alfa com sequências VH e VL reveladas aqui podem ser utilizadas para criar novos anticorpos anti-IFN alfa modificando as sequências VH e/ou VL, ou a região (ões) constante anexas a elas.

Consequentemente, noutro aspeto da divulgação, as características estruturais de um anticorpo anti-IFN alfa, por exemplo 13H5, 13H7 ou 7H9, são utilizadas para criar anticorpos anti-IFN alfa estruturalmente relacionados que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tais como ligar a IFN alfa. Por exemplo, uma ou mais regiões CDR de 13H5, 13H7 ou 7H9, ou mutações dos mesmos, podem ser combinadas recombinantemente com regiões estruturais conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-IFN alfa adicionais, manipulados por recombinação da invenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na secção anterior. 0 mõiterial de partida para o método de engenharia é uma ou mais das sequências VH e/ou VL providenciadas aqui, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo fabricado por engenharia, não é necessário preparar realmente (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo com uma ou mais das sequências VH e/ou VL providenciadas aqui, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Em vez disso, a informação contida na sequência (s) é utilizada como o material de partida para criar uma sequência(s) de "segunda geração" derivada da sequência(s) original e depois a sequência(s) de "segunda geração" é preparada e expressa como uma proteína.

Consequentemente, noutra forma de realização, a invenção proporciona um método para preparar um anticorpo anti-IFN alfa que compreende: (i) providenciar: (i) uma sequência do anticorpo da região variável da cadeia pesada que compreende uma (a) sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ. ID N.° 1; (b) uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ. ID N.° 4; e (c) uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ. ID N.° 7; e uma sequência de anticorpo da região variável da cadeia leve que compreende (d) uma sequência de aminoácidos CDR1 da SEQ. ID N. ° 10; (e) uma sequência de aminoácidos CDR2 da SEQ. ID N.° 13; e (f) uma sequência de aminoácidos CDR3 da SEQ. ID N.° 16; (ii) alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo da região variável da cadeia pesada e/ou da sequência de anticorpo da região variável da cadeia leve para criar, pelo menos, uma sequência de anticorpo alterada; e

Uii) expressar a sequência de anticorpo alterada como uma proteína, (iv) avaliar a atividade de ligação do anticorpo alterado ou porção de ligação a antigénio do mesmo; e (v) identificar um anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que liga especificamente a IFN alfa, inibe IFN Linfoblastoide, IFNoí6, IFNa2b, IFNa2a, IFNai, IFN Leucocitário, IFNal6, IFNalO, IFNaS, IFNaS, IFNai4, lFNal7, IFNa7 e IFNa4, mas não inibe substancialmente a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega.

Podem ser utilizadas técnicas de biologia molecular padrão para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada.

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas utilizando ensaios padrão disponíveis na arte e/ou descritos aqui. Por exemplo, a capacidade do anticorpo de se ligar a IFN alfa pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, tais como aqueles apresentados nos Exemplos (por exemplo, ELISAs e/ou Biacores). A capacidade do anticorpo de inibir várias atividades funcionais do interferão alfa pode ser determinada utilizando ensaios tais como aqueles descritos nos Exemplos (por exemplo, proliferação das células Daudi, expressão de marcador celular induzida pelo IFN, expressão induzida pelo IFN de IP-10 etc.).

Em certas modalidades dos métodos de fabrico por engenharia dos anticorpos, podem ser introduzidas mutações aleatoriamente ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência que codifica o anticorpo anti-IFN alfa (por exemplo, sequência que codifica ο 13H5) e os anticorpos anti-IFN alfa modificados resultantes podem ser classificados de acordo com a atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme descrito aqui. Os métodos mutacionais foram descritos na arte. Por exemplo, a Publicaoão PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criar e classificar as mutações de anticorpo utilizando mutagénese de saturação, montagem de ligação sintética, ou uma combinação das mesmas. Em alternativa, a Publicação PCT WO 03/074679 por bazar et al. descreve métodos de utilizar métodos de classificação computacionais para otimizar as propriedades físico-químicas dos anticorpos.

Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos da Invenção

Outro aspeto da invenção pertence às moléculas de ácido nucleico que cGdificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisato celular, ou numa. forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "entregue substancialmente puro" quando purificado separado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, através de técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandeamento CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na arte. Ver, F. Ausubel, et al, ed. (1987} Current Protocola in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode ou não conter sequências intrónicas. Numa modalidade preferida., o ácido nucleico é uma molécula de ADNc. Ácidos nucleicos da invenção podem er obtidos utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Para os anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de ratinhos transgénicos portadores de genes da imunoglobulina humana, conforme descrito mais em baixo) , os ADNc que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo feitas pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação por PCR ou técnicas de clonagem de ADNc padrão. Para os anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, utilizando técnicas de exibição de fago), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.

Moléculas de ácidos nucleicos divulgadas no presente documento incluem aquelas que codificam as sequências VH e VL dos anticorpos monoclonais 13H5, 13H7, ou 7H9. As sequências de ADN que codificam as sequências VH de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 25, 26, e 27, respetivamente. As sequências de ADN que codificam as sequências VL de 13H5, 13H7, e 7H9 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 28, 29, e 30, respetivamente.

Assim que os fragmentos de ADN que codificam os segmentos de VH e VL são obtidos, estes fragmentos de ADN podem ser adicionalmente manipulados através de técnicas de ADN recombinante padrão, por exemplo, para converter os genes da região variável em genes de cadeia do anticorpo de comprimento inteiro, para genes do fragmento Fab ou para um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de ADN que codifica VL ou VH está operativamente ligado a outro fragmento de ADN que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "operativamente ligado", conforme utilizado neste contexto, pretende-se que signifique que os dois fragmentos de ADN são unidos de modo que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de ADN permanecem na estrutura. 0 ADN isolado que codifica a região VH pode ser convertido num gene de cadeia pesada de comprimento inteiro ligando operativamente o ADN que codifica a VH a outra molécula de ADN que codifica regiões constantes da cadeia pesada (CHI, CI-I2 e CH3) . As sequências dos genes da região constante da cadeia pesada humana são conhecidas na arte (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos U.S., Publicação NIH N.0 91-3242) e fragmentos de ADN que abrangem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais preferencialmente é uma região constante IgGl ou IgG4. Para um gene da cadeia pesada de fragmento Fab, o ADN que codifica a VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de ADN que codifica apenas a região constante CHI da cadeia pesada. 0 ADN isolado que codifica a região VL pode ser convertido num gene de cadeia leve de comprimento inteiro (bem como um gene da cadeia leve de Fab) ligando operativamente o ADN que codifica a VL a outra molécula de ADN que codifica a região constante da cadeia leve, CK. As sequências dos genes da região constante da cadeia leve humana são conhecidas na arte (ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição. Departamento de Saúde e Serviços Humanos U.S., Publicação NIH N.° 91-3242) e os fragmentos de ADN que abrangem estas regiões podem ser obtidos através de amplificação por PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda, mas mais preferencialmente é uma região constante capa.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de ADN que codificam a VH e VL são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoâcidos (Gly^-Ser) 3, de modo que as sequências VK e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990)

Nature 348:552-554).

Produção de Anticorpos Monoclonais da Invenção

Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica padrão de hibridização de células somáticas de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495.

Apesar dos procedimentos de hibridizaçâo de células somáticas serem preferidos, em princípio, podem ser empregues outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais, por exemplo, transformação vira.1 ou oncogénica de linfócitos B. 0 sistema animal preferido para preparar hibrídGmas é o sistema murino. A produção de hibridoma no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para o isolamento de esplenocitos imunizados para fusão são conhecidos na arte. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado conforme descrito anteriormente. 0 ADN que codifica as imunoglobulinas da cadeia leve e pesada pode ser obtido a partir do hibridoma murino de interesse e fabricado por engenharia para conter sequências de imunoglobulina não murinas (por exemplo, humanas) utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na arte (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 816 567 para Cabilly et al) . Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR marinas podem ser inseridas numa estrutura humana utilizando métodos conhecidos na arte (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 225 539 pa.ra Winter, e Patentes U.S. N,°s 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 e β 180 370 para Queen et al).

Numa modalidade preferida, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra o IFN alfa podem ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossõmicos que transportam partes do sistema imune humano em vez do sistema do ratinho. Estes ratinhos transgénicos ou transcromossõmicos incluem ratinhos referidos aqui como ratinhos HuMAb e ratinhos KM, respetivamente, e são coletivamente referidos aqui como "ratinhos com Ig humana". O ratinho HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci do gene da imunoglGbulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia leve κ e cadeia pesada humana (μ e γ) desorganizadas, juntamente com mutações dirigidas que inativam os loci de cadeia κ e μ endógeno (ver, por exemplo, Lonberg, et al (1994) Nature 368(6474): 856-859). Em conformidade, os ratinhos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de ratinho, e em resposta à imunização, os transgenes introduzidos da cadeia leve e pesada humana passam por uma alteração de classe e mutação somática para gerar monoclonal IgGic humano de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad Sei. 764:536-546). A preparação e utilização de ratinhos HuMab, e as modificações genõmicas transportadas por estes ratinhos, são adicionalmente descritas em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acid Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) Internationa1 Immuno1ogy 5:647-656; Tuai1lon et ai. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3720-3724; Choi et ai. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et ai. (1994) International

Immunology 6:579-591; e Fishwild, D. et ai. {1996) Nature Biotechnology 14:845-851, conteúdo de todos os quais é por este meio especificamente incorporado por referência na sua totalidade. Ver ainda, Patentes U.S. N.°s 5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425? 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299; e 5 770 429; todos para Lonberg e Kay; Patente U.S. N.° 5 545 807 para. Surani et al; Publicações PCT N.°s WO 92/03918, WG 93/12227, WO 94/25585, WQ 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT N.° WO 01/14424 para Korman et al..

Noutra forma de realização, os anticorpos humanos da invenção podem ser criados utilizando um ratinho que transporta sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, tais como um ratinho que transporta um transgene da cadeia pesada humana e um transcromossoma da cadeia leve humana. Tais ratinhos, referidos aqui como "ratinhos KM", são descritos em detalhe na Publicação PCT N.° WO 02/43478 para Ishida et al.

Além disso, sistemas alternativos de animal transgénico que expressara os genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na arte e podem ser utilizados para criar anticorpos anti-IFN alfa da invenção. Por exemplo, pode ser utilizado um sistema transgénico alternativo referido como o Xeno ratinho (Abgenix, Inc.); tais ratinhos são descritos, pGr exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584 e 6 162 963 para Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas animais alternativos transcromossómicos que expressam os genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na arte e podem ser utilizados para criar anticorpos anti-IFN alfa da invenção. Por exemplo, podem ser utilizados os ratinhos que transportam tanto um transcromossoma da cadeia pesada humana e um transcromossoma da cadeia leve humana, referido como "ratinhos TC"; tais ratinhos são descritos em Tomizuka. et ai. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 97:722-727. Além disso, as vacas que transportam os transcromossomas de cadeia leve e pesada humana foram descritos na arte (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser utilizados para criar anticorpos anti-IFN alfa da invenção,

Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados utilizando métodos de exibição de fago para classificar bibliotecas de genes da imunoglobulina humana. Tais métodos de exibição de fago para isolar anticorpos humanos estão estabelecidos na arte. Ver, por exemplo: Patentes U.S. N,°s 5 223 409; 5 403 484; e 5 571 698 para Ladner et al? Patentes U.S, N.°s 5 427 908 e 5 580 717 para Dower et al; Patentes U.S. N.°s 5 969 108 e 6 172 197 para McCafferty et al; e Patentes U.S. N.°s 5 885 793; 6 521 404; 6 544 731; 6 555 313; 6 582 915 e 6 593 081 para Griffiths et al.

Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados utilizando ratinhos SCID nos quais as células imunes humanas foram reconstituídas de modo que uma resposta de anticorpo humano pode ser gerada no momento da imunização. Tais ratinhos são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N.°s 5 476 996 e 5 698 767 para Wilson et al. Imunização de Ratinhos com Ig Humana

Quando os ratinhos com Ig humana da invenção são utilizados para criar anticorpos humanos, tais ratinhos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou recombinante do antigénio do IFN alfa, conforme descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859? Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851; e Publicação PCT N.° WO 98/24884 e WO 0.1/14424. Preferencialmente, os ratinhos terão 6-16 semanas de idade no momento da primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada de IFN linfoblastoide (25-100 pg) , preparada tratando uma linha de células linfoblastoides com vírus de modo que a linha de células produz uma preparação de IFN alfa que contém múltiplos subtipos de IFN alfa (mas não IFN õmega) pode ser utilizada para. imunizar os ratinhos com Ig humana por via intraperitoneal. Em alternativa, podem ser utilizadas misturas de formas recombinantes de subtipos do IFN alfa como o imunogene.

Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos para IFN alfa são descritos no Exemplo 1 a seguir. A experiência cumulativa com vários antigênios mostrou que os ratinhos transgénicos respondem quando inicialmente imunizados por via intraperitoneal (IP) com antigénio em adjuvante completo de Freund, seguido de imunizações por via IP semana sim, semana não (até um total de 6) com antigénio em adjuvante incompleto de Freund. Contudo, adjuvantes sem ser o de Freund também sâo eficazes. Além disso, verifica-se que células inteiras na ausência de adjuvante são altamente imunogénicas. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do protocolo de imunização com amostras de plasma que são obtidas por sangrias retro orbitais. 0 plasma pode ser classificado por ELISA (como descrito em baixo), e os ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-IFN alfa podem, ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados por via intravenosa com antigénio 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que possa ser necessário realizar 2-3 fusões por cada imunização. Entre 6 e 24 ratinhos são tipicamente imunizados para cada antigénio. Para os ratinhos HuMab, normalmente são utilizadas ambas as estirpes HCo’7 e HCol2. Além disso, ambos transgenes HCo7 e HCO12 podem ser criados juntos num único ratinho com dois transgenes da cadeia pesada humana diferentes (HCo7/HCol2). Em alternativa ou além disso, pode ser utilizada a estirpe de ratinho KM, conforme descrito no Exemplo 2.

Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos da Invenção

Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos da invenção, os esplenocitos e/ou células dos nódulos linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linha de células imortalizada apropriada, tal como uma linha de células de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem ser classificados em relação à produção de anticorpos específicos de antigénio. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplénios de ratinhos imunizados podem ser fundidas com um sexto do número de células P3X63-Ag8.653 de mieloma de ratinho não secretoras (ATCC, CRL 1580) com 50% PEG. As células são colocadas em placas a aproximadamente 2 x 105 numa placa de microtitulação de fundo raso, seguido de incubação durante duas semanas em meio seletivo contendo 20% de soro de clone fetal, 18% meio condicionado !,653!', 5% origem (IGEN) , 4 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 5mM HEPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml estreptomicina, 50 mg/ml gentamicina e IX HAT (Sigma; o HAT ê adicionado 24 horas depois da fusão). Apôs aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído com HT. Os poços individuais podem depois ser classificados por ELISA em relação a IgM monoclonal humana e anticorpos IgG. Assim que ocorre crescimento extensivo de hibridoma, o meio pode ser observado normalmente após 10-14 dias. 0 anticorpo que segrega hibridomas pode ser recolocado em placa, classificado de novo, e se ainda positivo para a IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados, pelo menos, duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem depois ser cultivadGS ín vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanos, podem ser crescidos hibridomas selecionados em frascos de centrífuga de dois litros para purificação do anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Geração de Transfetomas gue Produzem Anticorpos Monoclonais da Invenção

Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos num transfetoma. de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfeção de genes, tal como é bem conhecido na arte (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, os ADN que codificam cadeias pesada e leve parciais ou de comprimento inteiro, podem ser obtidos por técnicas padrão de biologia molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de ADNc utilizando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os ADN podem ser inseridos em vetores de expressão de modo que os genes estão operativamente ligados a sequências controlo transcricionais e translacionais. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende-se que signifique que o gene do anticorpo está ligado num vetor de modo que as sequências controlo transcricionais e translacionais dentro do vetor sirvam a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene do anticorpo. 0 vetor de expressão e sequências controlo da expressão são escolhidos de modo a serem compatíveis com a célula hospedeira, de expressão utilizada. 0 gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão utilizando métodos padrão (por exemplo, ligação de locais de restrição de complementaridade no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ou ligação sem ponta se não estiverem presentes locais de restrição). As regiões variáveis da cadeia leve e pesada dos anticorpos descritas aqui podem ser utilizadas para criar genes de anticorpo de comprimento inteiro de qualquer isotipo de anticorpo inserindo-os em vetores de expressão que jã codificam as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada do isotipo desejado de modo o que segmento de VH está operativamente ligado ao segmento (s) de C.’H dentro do vetor e o segmento de VL está operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Além disso ou em alternativa, o vetor de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia do anticorpo pode ser clonado num vetor de rrtGdo que o péptido sinal é ligado em estrutura ao terminal amino do gene de cadeia do anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (isto é, um péptido sinal de uma proteína não imunoglobulina).

Além dos genes de cadeia, do anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem transportar sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia do anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência reguladora" pretende-se que inclua promotores, potenciadores e outros elementos de controlo de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia dc· anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, e, C-oeddel {Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado por aqueles habilitados na arte que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção das sequências reguladoras, pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejado, etc. As sequências reguladoras preferidas para a expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que dirigem níveis elevados de expressão proteica em células de mamíferos, tais corno promotores e/ou potenciadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus de símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP) e polioma. Em alternativa, podem ser utilizadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor ubiquitina ou promotor β-globina. Além disso, elementos reguladores compostos de sequências provenientes de diferentes fontes, tais como o sistema promotor SRc*, que contém sequências do promotor precoce SV40 e a repetição terminal longa de vírus da leucemia das células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466- 472) .

Além dos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. 0 gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, Patentes U.S. N.°s 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017, todas por Axel et al) . Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G41S, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da dihidrGfolato redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplif icação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias leve e pesada é/são transfetado(s) numa célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfeção" pretende-se que abranjam uma ampla variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procarionte ou eucarionte, por exemplo, eletroporação, precipitação cálcio-fosfato, ou transfeção DEAE-dextrano. Apesar de ser teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procariontes ou eucariontes, a expressão de anticorpos em células eucariontes, e mais preferencialmente células hospedeiras de mamíferos, é o mais preferido porque tais células eucariontes, e, em particular as células de mamíferos, são mais passíveis do que as células procariontes de montar e segregar um anticorpo imunologicamente ativo adequadamente dobrado. A expressão procariótica dos genes de anticorpo foi reportada como sendo ineficaz para a produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, Μ. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology TGday 6:12-13) . Células hospedeiras de mamífero preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem células de ovário de Hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Froc. Natl. Acad Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para utilização com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão do gene GS revelado nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338,841. Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são crescidas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos padrão de purificação de proteína.

Caracterização de Anticorpo que Liga a Antigénio

Os anticorpos da invenção podem ser testados pela ligação a. IFN alfa por, por exemplo, ELISA padrão ou análise Biacore. Brevemente, para os ELISAs, as placas de microtitulação são revestidas com IFN alfa (por exemplo, a forma recombinante de diferentes subtipos do IFN alfa, ou IFN Iinfoblastoi.de ou leucócito) a 0,25 pg/ml em PBS, e depois bloqueadas com 5% albumina de soro bovino em PBS. Diluições de anticorpo (por exemplo, diluições de plasma a partir de ratinhos imunizados com IFN alfa) são adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadcLS com PBS/Tween e depois incubadas com reagente secundário (por exemplo, para anticorpos humanos, um reagente policlonal específico de Fc da IgG cabra-anti-humana) conjugado com fosfatase alcalina durante 1 hora a 3 70 C. Após a lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml), e analisadas a 0D de 405-650. Preferencialmente, os ratinhos que desenvolvem os títulos mais altos serão utilizados para fusões.

Um ensaio ELISA, conforme descrito anteriormente, também pode ser utilizado para hibridomas que mostram reatividade positiva com imunogene IFN alfa. Hibridomas que ligam com avidez elevada a IFN alfa são subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células parentais (por ELISA), pode ser escolhido para fazer um banco de 5-10 frascos de células armazenados a -140 °C, e para purificação de anticorpo.

Para purificar anticorpos anti-IFN alfa, hibridomas selecionados podem ser crescidos em frascos de centrífuga de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ) , A igG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para garantir pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a concentração pode ser determinada por OD 280 utilizando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80 °C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-IFN alfa selecionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL) . Podem ser realizados estudos de competição utilizando anticorpos monoclonais não rotulados e anticorpos monoclonais biotinilados utilizando placas de ELISA revestidas com IFN alfa, conforme descrito anteriormente. A ligação de mAb biotinilados pode ser detetada com uma sonda de estreptavidina-fosfatase alcalina.

Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, podem ser realizadas ELISAs de isotipos utilizando reagentes específicos para anticorpos de um isotipo particular. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 1 pg/ml de imunoglobulina anti-humana durante a noite a 4o C. Após bloqueio com 1% BSA, as placas são reagidas com 1 pg /ml ou menos de anticorpos monoclonais teste ou controlos ísGtípos purificado, à temperatura ambiente durante uma a duas horas. Os poços podem depois ser reagidos com igGl humana ou com sondas conjugadas de fosfatase alcalina específicas da IgM humana. As placas sâo desenvolvidas e analisadas conforme descrito anteriormente.

IgGs humanas anti-IFN alfa podem ainda ser testadas em relação à reatividade com antigénio do IFN alfa por Western blotting, Em suma, podem ser preparados extratos celulares de células que expressam o IFN alfa e sujeitos a eletroforese em, gel de poliacrilamida dodec.il sulfato de sódio. Depois da eletroforese, os antigénios separados são transferidos para membranas de nitrGcelulose, blGqueados com 10% soro bovino fetal, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação da IgG humana pode ser detetada utilizando fosfatase alcalina IgG anti-humana e desenvolvida com tabletes de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Imunoconj ugados

Num outro aspeto, a presente invenção apresentei um anticorpo anti-IFN alfa, ou um fragmento do mesmo, conjugado com uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, um fãrmaco (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são referidos aqui como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas." Uma citotoxina ou agente eitotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial às (por exemplo, mata) células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, v i ncr i s t i na, vi nb1a s t i na, co1qui c i na, doxorrub i c i na, daunorrubicína, dihídroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmGS. Agentes terapêuticos também incluem, pGr exemplo, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilances (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromornanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti mitóticos (pGr exemplo, vincristina e vinblastína).

Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas com um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e derivados das mesmas. Um exemplo de um anticorpo conjugado com caliqueamicina está comercialmente disponível (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

As citoxinas podem ser conjugadas com anticorpos da invenção utilizando tecnologia ligante disponível na arte. Exemplos de tipos de ligante que têm sido utilizados para conjugar uma citotoxina com um anticorpo incluem, mas não se limitam a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfidas e ligantes contendo péptidos. Pode ser escolhido um ligante que é, por exemplo, suscetível de clivagem por pH baixo dentro do compartimento lisossomal ou suscetível de clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecido tumoral tais como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).

Para discussão adicional sobre tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugar agentes terapêuticos com anticorpos, ver também Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Câncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Câncer

Gell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Câncer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R, J. (2002) Curr. Opin. Investia, Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados com um isótopo radioativo para gerar produtos radiofarmacêutieos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados com anticorpos para fins de diagnóstico ou terapêutico incluem, mas não se limitam a, iodo1J1, índio111, ítrio90 e iutécio177, Os métodos para preparar radioimunoconjugados estão estabelecidos na arte. Exemplos de radioimunoconjugados estão disponíveis comercialmente, incluindo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals)) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals)), e podem ser utilizados métodos semelhantes para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos da invenção.

Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, e a fração do fãrmaco não é para ser interpretada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração do fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo que possui uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interferão-γ; ou, modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2”), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante da colónia de macrófagos granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulante da colónia de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento. Técnicas para conjugar tal fração terapêutica com os anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al. , i! Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (editores), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., " Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Edição), Robinson et al. (editores), páginas 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy; A Review ", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (editores), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (editores), páginas 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Citotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119--58 (1982).

Moléculas Biespecíficas

Num outro aspeto, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem um anticorpo anti-IEN alfa, ou um fragmento do mesmo, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porção que liga ao antigénio do mesmo, pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro péptido ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligando por um recetor) para gerar uma molécula biespecífica que liga a, pelo menos, dois locais de ligação diferentes ou moléculas alvo. 0 anticorpo da invenção pode, de facto, ser derivado ou ligado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecífícas que ligam a mais de dois lGcais de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas também se pretendem que estejam abrangidas pelo termo "molécula biespecífica", conforme utilizado aqui. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por emparelhamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, péptido ou mimético de ligação, de modo que resulta uma molécula biespecífica.

Em conformidade, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que compreendem, pelo menos, uma primeira especificidade de ligação por IFN alfa e uma segunda especificidade de ligação por um segundo epítopo alvo. Numa forma de realização particular, o segundo epítopo alvo pode ser um recetor Fc, por exemplo, FcyRI humano (CD64) ou um recetor Fca humano (CD89). Por este motivo, a invenção incluí moléculas biespecíficas capazes de se ligar tanto a células efetoras que expressam FcyR, FcaR ou FcsR (por exemplo, monócitos, macrõfagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), como a células alvo que expressam o IFN alfa. Estas moléculas biespecíficas têm como alvo células que expressam o IFN alfa a célula efetora e despoletam atividades de células efetoras mediadas pelo recetor Fc, tais como a fagocitose de células que expressam o IFN alfa, citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC), libertação de citocina, ou geração de anião superóxido.

Numa forma de realização na qual a molécula biespecífica é muitiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além de uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-IFN alfa. Numa forma de realização, a terceira especificidade de ligação é uma porção do fator anti potenciaçãG (EF), por exemplo, uma molécula que liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e, por isso, aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção do fator anti potenciação" pode ser um anticorpo, fragmentG funcionai de anticorpo ou um ligandG que liga a uma dada molécula, por exemplo, um antigénio ou um recetor, e resulta, por isso, numa potenciação do efeito dos determinantes de ligação pelo recetor Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção do fator anti potenciação" pode ligar um, recetor Fc ou um antigénio da célula alvo. Em alternativa, a porção do fator anti potenciação pode ligar a uma entidade que é diferente da entidade à qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligaram. Por exemplo, a porção do fator anti potenciação pode ligar uma célula T citotõxica (por exemplo, através de CD2, CD3, CD8, CD2 8, CD4, CD4 0, ICAM-1 ou outra célula imune que resulta numa resposta imune aumentada contra a célula alvo).

Numa forma de realização, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação, pelo menos, um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia única. 0 anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo tal como um Fv ou uma construção de cadeia única, conforme descrito em Ladner et a 1Patente U.S. N.° 4 946 778.

Numa forma de realização, a especificidade de ligação por um recetor Fcy é providenciada por um anticorpo monoclonal, a ligação do qual não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG). Como utilizado aqui, o termo "recetor IgG" refere-se a qualquer dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de recetores transmembranares ou solúveis que são agrupadas em três classes de recetores Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), e FcyRIII (CD16). Numa forma de realização preferida, o recetor Fcy pode ser um FcyRI humano de alta afinidade. 0 FcyRI humano é uma molécula com 72 kDa, que mostra alta afinidade por IgG monomérica (108 -1Q9 M"1) . A produção e caracterização de certos anticorpos monoclonais anti-Fcy preferidos são descritas por Fanger et al. na Publicação PCT N.° WO 88/00052 e na Patente U.S, N.° 4 954 617. Estes anticorpos ligam a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num local que é distinto do local de ligação Fcy do recetor e, assim, a sua ligação não é substancialmente bloqueada por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis nesta invenção são mAb 22, rnAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. 0 hibridoma que produz mAb 32 está disponível a partir da Coleção Americansi de Culturas Tipo, Acessão ATCC N.° HB9469. Noutras modalidades, o anticorpo anti recetor Fcy é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 são descritas em Grazíano, R.F et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 e na Publicação PCT N.° WO 94/10332. 0 anticorpo H22 que produz a linha de células foi depositado na Coleção Americana de Culturas Tipo sob a designação HA022CL1 e tem a Acessão N.° CRL 11177.

Ainda noutras formas de realização preferidas, a especificidade de ligação por um recetor Fc é providenciada por um anticorpo que liga a um recetor IgA humano, por exemplo, um recetor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), a ligação do qual é preferencialmente não bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA). 0 termo "recetor IgA" pretende-se que inclua o produto do gene de um of-gene (FcaRI) localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido por codificar vãriGS isoformas transmembranares em alternativa juntas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monocitos/macrõfagos, granulócitos eosinof ílicos e neutrofílicos, mas não em populações de células não efetoras. FcaRI tem afinidade média (~5 x 10' M_±) para ambas IgAl e IgA2, que é aumentada no momento da exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16: 423-440). Foram descritos quatro anticorpos monoclonais específicos de FcaRI, identificados como A3, A.59, A62 e A77, que ligam

FcaRI fora do domínio de ligação do ligando IgA (Monteiro, R.C. et al, (1992) J Immunol. 148:1764).

FcaRI e FeyRI são recetores gatilho preferidos para utilização nas moléculas biespecíficas da invenção porque são (1) expressos primariamente em células efetGras imunes, por exemplo, monócitcs, PMNs, macrófagos e células dendríticas,· (2) expressos em níveis elevados (por exemplo, 5,000- 100,000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); (4) medeiam a apresentação potenciada de antigénio dos antigénios, incluindo auto-antigénios, dirigidos a eles.

Ag passo que são preferidos anticorpos monoclonais humanos, outros anticorpos que podem ser empregues nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando as especificidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação de anti-FcR e anti-IFN alfa, utilizando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, pode ser utilizada uma variedade de agentes de emparelhamento ou de reticulaçãc· para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, 3SF- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(2- ãcido nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenedimaleimida (oPDM), N-sucinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosucinimitíil 4- (N-maleimidometil) ciclohaxa.no-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N.° 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), e Glennie et al. (1987) J Immunol. 139: 2367-2375) . Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estas podem ser conjugadas através da união sulfidrilo das regiões dobradiça do terminal C das duas cadeias pesadas. Numa modalidade particularmente preferida, a região dobradiça é modificada para conter um número estranho de resíduos sulfidrilo, preferencialmente um, antes da conjugação.

Em alternativa, ambas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x proteína de fusão Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única que compreende um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender, pelo menos, duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N.° 5 260 203; Patente U.S. N.° 5 455 030; Patente U.S. N.° 4 881 175; Patente U.S. N.° 5 132 405; Patente U.S. N.° 5 091 513; Patente U.S. N.° 5 476 786; Patente U.S. N.° 5 013 653; Patente U.S. N.° 5 258 498; e Patente U.S. N.° 5 482 858. A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição do crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios deteta geralmente a presença dos complexos proteína-anticorpo de particular interesse empregando um reagente rotuladG (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detetados utilizando, por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou um fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Em alternativa, os complexos podem ser detetados utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser rotulado radioativamente e utilizado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B,, Principies of Radioimmunoassays, 7o Curso de Formação sobre Técnicas de ensaio de Radioligando, A Sociedade de Endocrinologia, Março, 1986) . 0 isótopo radioativo pode ser detetado por tais meios como a utilização de um contador y ou um contador de cintilação ou por autoradiografia.

Compo s i _ç õ e s Fa rmac êu t i c a s

Num outro aspeto, a presente invenção providencia uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção que liga ao antigénio(s) dos mesmos, da presente invenção, formulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficas) que ligam a epítopos diferentes no antigénio alvo ou que têm atividades complementares.

As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas na terapêutica de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapêutica de combinação pode incluir um anticorpo anti-IFN alfa da presente invenção combinado com, pelo menos, um outro agente anti-IFN alfa (por exemplo, um agente imunossupressor).

Como utilizado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção que são fisiologicamente compatíveis.

Prefereneialmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido num material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem desativar o composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não causa quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver, por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1- 19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodrídico e fosforoso, bem como de ácidos orgânicos nãc· tóxicos tais como ácidos alifáticos mono e dicarboxílico, ácidos alcanóicos substituídos com fenil, ácidos alcanóicos hidroxi, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio e cálcio, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'- dibenziletilenediamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenediamina e procaína.

Uma composição farmacêutica da invenção também, pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio e sulfito de sódio; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propilgalato e alfatocoferol; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido tetra-acético etilenediamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico e ácido fosfórico.

Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões, e pela utilização de tensioativos.

Estas composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes humidificadores, agentes emulsionantes e agentes de dispersão. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto através dos procedimentos de esterilização, supra, como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol e ácido fenolsórbico. Também pode ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares ou cloreto de sódio nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetãvel pode ser causada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções gu dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na arte. Exceto até onde quaisquer meios ou agentes convencionais são incompatíveis com o composto ativo, é contemplada a utilização dos mesmos nas composições farmacêuticas da invenção. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

As composições terapêuticas tipicamente têm de ser estéreis e estáveis nas condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, iipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração elevada do fármaco. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e peia utilização de tensioativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina..

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, conforme necessário, seguido de microfiltração de esterilização. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos enumerados anteriormente. fio caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e 1iofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma SGlução estéril previamente filtrada do mesmo. A quantidade do ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do sujeito a ser tratado, e do modo particular de administração. A quantidade do ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem será, em gerai, aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, em 100%, esta quantidade oscilará entre cerca de 0,01% a cerca de 99% do ingrediente ativo, preferenciaimente de cerca de 0,1% a cerca de 70%, mais preferencialmente de cerca de 1% a cerca de 30% do ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para providenciarem a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, como utilizado aqui, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada do composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção é ditada por, e diretamente dependente, de (a) características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido, e (b) as limitações inerentes na arte de fabricG de compostos tais como o composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

Para. administração do anticorpo, a dosagem oscila de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais vulgarmente de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg do peso corporal, 1 mg/kg do peso corporal, 3 mg/kg do peso corporal, 5 mg/kg do peso corporal ou 10 mg/kg do peso corporal ou dentro do intervalo de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar envolve a administração uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, uma vez cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez cada 3 meses ou uma vez cada três a 6 meses. Os regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-IFN alfa da invenção incluem 1 mg/kg do peso corporal ou 3 mg/kg do peso corporal por administração intravenosa, sendo o anticorpo dado utilizando um dos seguintes esquemas de dosagem: (i) cada quatro semanas para seis dosagens, depois cada três meses; (ii) cada três semanas; (iii) 3 mg/kg do peso corporal uma vez seguido de 1 mg/kg do peso corporal cada três semanas.

Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrado cai nos intervalos indicados. O anticorpo é normalmente administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, trimestralmente ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, conforme indicado medindo os níveis no sangue do anticorpo para o antigénio alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 pg/ml e, em alguns métodos, de cerca de 25-300 pg/ml.

Em alternativa, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação prolongada, em cujo caso é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos exibem a meia-vida mais longa, seguidos dos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Nas aplicações profiláticas é administrada uma dosagem relativamente baixa em intervalos relativamente infrequentes durante um período longo de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas. Nas aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é, por vezes, necessária até a progressão da doença ser reduzida ou terminada, e preferencialmente até o paciente exibir uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da dGença. Depois disso, pode ser administrado ao paciente um regime profilático.

Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregues, ou do éster, sal ou amida das mesmas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular a ser empregue, da duração do tratamento, de outros fârmacos, de compostos e/ou materiais utilizados em combinação cgití as composições particulares empregues, da idade, do sexo, do peso, da condição física, do estado de saúde global e historial clínico do paciente a ser tratado, e de fatores afins bem conhecidos nas artes médicas.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-IFN alfa da invenção preferencialmente resulta numa diminuição da severidade dos sintomas da doença, num aumento da frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou numa prevenção do enfraquecimento ou incapacidade devido ao estado de doença. Por exemplo, no caso de lúpus eritematoso sistémico (SLE), uma dose terapeuticamente eficaz preferencialmente previne a deterioração adicional dos sintomas físicGS associados com o SLE, tais como, por exemplo, dor ou fadiga. Uma dose terapeuticamente eficaz preferencialmente também previne ou retarda o despoletar do SLE, tal como pode ser desejado quando os sinais iniciais ou preliminares da doença estão presentes. Da mesma forma, inclui o retardamento da progressão crónica associada com o SLE. Os testes de laboratório utilizados no diagnóstico do SLE incluem químicas (incluindo a medição dos níveis de IFN alfa), hematologia, serologia e radiologia. Em conformidade, qualquer ensaio clínico ou bioquímico que monitoriza quaisquer dos antecedentes pode ser utilizado para determinar se um tratamento particular é uma dose terapeuticamente eficaz para tratar o SLE. Alguém com habilitação comum na arte seria capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do sujeitG, a severidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou via de administração selecionada.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodGS conhecidos na arte. Como será apreciado pelo artesão habilitado, a via. e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. As vias de administração preferidas para os anticorpos da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradêrmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias parentéricas de administração, por exemplo por injeção ou infusão. A frase "administração parentérica", como utilizado aqui, significa modos de administração que não sejam administração entérica e tópica, normalmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradêrmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intra-esternal.

Em alternativa, um anticorpo da invenção pode ser administrado por uma via não parentérica, tal como uma νίει de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de entrega microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido polilãtico, Muitos métodos para. a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos daqueles habilitados na arte. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.

Robinson, editor, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na arte. Por exemplo, numa modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivos revelados nas Patentes U.S. N.°s 5 399 163; 5 333 851; 5 312 335; 5 064 413; 4 941 880; 4 790 824; ou 4 596 556.

Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. N.° 4 487 603, que revela uma bomfea de micro-infusão implantãvel para dispensar a medicação a uma taxa controlada; Patente U.S. N.° 4 486 194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente U.S. N.° 4 44 7 233, que revela uma bomba. de infusão de medicação para entrega da medicação a uma taxa de infusão precisa Patente U.S. N.° 4 447 224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para entrega contínua do fármaco; Patente U.S. N.° 4 439 196, que revela um sistema de entrega do fármaco osmõtico com compartimentos multi-cãmara; e Patente U.S. N.° 4 475 196, que revela um sistema de entrega do fármaco osmótico. Muitos outros tais implantes, sistemas de entrega, e módulos são conhecidos daqueles habilitados na arte.

Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar a distribuição in vivo adequada. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrGfílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a BBB (se desejado) , eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de fabricar lipossomas, ver, por exemplo, Patentes U.S. N.°s 4 522 811; 5 374 548; e 5 399 331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais frações que sãc· seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, potenciando, assim, a entrega do fármaco alvo (ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685).

Frações de alvo exemplares incluem folatc· ou biotina (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 416 016 para Low et al.) ; manosidas (Umezawa et al, , {1988) Biochem, Biophys. Res. Commun, 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357:140; M. Qwais et al, (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); recetor da proteína A tensioativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); pl2Q (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunome thods 4:273.

Utilizações e Métodos da Invenção

Os anticorpos monoclonais anti-IFN alfa. e derivados/conjugados relacionados e composições da presente invenção têm uma variedade de utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo. Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para detetar proteína do IFN alfa, seja in vitro ou in vitro, utilizando ensaios de ligação anticorpo/antigénio padrão (por exemplo, ELISA, RIA) . Além disso, estas moléculas podem ser administradas a um sujeito, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios nos quais o IFN alfa desempenha um papel. Como utilizado aqui, o termo "sujeito" pretende-se que inclua animais tanto humanos como não humanos. Sujeitos preferidos incluem pacientes humanos que exibem distúrbios autoimunes. 0 termo "animais não humanos" da invenção inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cão, gato, vaca, cavalo, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

As composições de anticorpo da invenção podem ser utilizadas no tratamento de doenças autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistémico (SLE), esclerose múltipla (MS), doença inflamatória intestinal (IBD; incluindo a doença de Crohn, colite ulcerativa e doença celíaca), diabetes melitus dependente de insulina (IDDM), psoríase, tiroidite autoimune, artrite reumatoide (RA) e glomerulonef.ri te. Além disso, as composições de anticorpo da invenção podem ser utilizadas para inibir ou prevenir a rejeição de transplantes ou no tratamento da doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD).

Anticorpos da invenção podem ser inicialmente testados em relação â atividade de ligação associada com a utilização terapêutica in vitro. Por exemplo, as composições da invenção podem ser testadas utilizando os ensaios Biacore, ELISA e de citometria de fluxo descritos nos Exemplos a seguir. Além disso, a atividade destas moléculas pode ser testada, por exemplo, com um ensaio de proliferação de células após exposição ao IFN alfa, conforme descrito nos Exemplos a seguir. Métodos adequados para administrar os anticorpos e composições da presente invenção são bem conhecidos na arte, e foram descritos em môiior detctlhe previamente. Também podem ser determinadas dosagens adequadas dentro da habilitação na arte e dependerão da idade e do peso do sujeito e do fármaco particular utilizado. Dosagens exemplares foram descritas em maior detalhe previamente.

Os anticorpos anti-IFN alfa da invenção também podem ser coadministrados com outros agentes terapêuticos, conforme descrito anteriormente.

Como indicado anteriormente, com fins de terapêutica, uma composição de anticorpo humano e um veículo farmaceuticamente aceitável são administrados a um paciente numa quantidade terapeuticamente eficaz. Uma combinação de uma composição de anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável é dita ser administrada numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é "fisiologicamente significativo" se a sua presença resulta numa alteraçãG detetável na fisiologia de um paciente recetor. Um agente terapêutico orientado é "terapeuticamente eficaz" se entrega uma proporção mais elevada da dose administrada ao alvo pretendido do que acumula no alvo no momento da administração sistémica do agente não orientado equivalente.

Também se encontram dentro do âmbito da invenção kila que compreendem as composições (por exemplo, anticorpos humanos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas) da invenção e instruções para utilização. 0 kit pode ainda conter, pelo menos, um reagente adicional, tal como um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano com uma atividade complementar que inibe a atividade do IFN alfa mas que é diferente do primeiro anticorpo humano). A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não deveriam ser interpretados como limitantes,

Exemplos

Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra o IFN Alfa Antigénio: 0 IFNcx humano natural que contém múltiplos subtipos purificados a partir de uma linha de células de linfoblastoides humanos estimulados viralmente, resultando na produção de múltiplos subtipos do IFN alfa, mas não IFN ómega, foi utilizado como o antigénio.

Ratinhos EM™ Transcromossômicos Transgénicos:

Anticorpos monoclonais completamente humanos para IFN alfa foram preparados utilizando a estirpe KM dos ratinhos transcromossômicos transgénicos, que expressam genes de anticorpo humano. Nesta estirpe de ratinho, o gene endógeno da cadeia leve capa de ratinho foi interrompido homozigoticamente conforme descrito em Chen et al, (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene endógeno da cadeia pesada de ratinho foi interrompido homozigoticamente conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT N.° WO 01/09187 para ratinhos HuMab. 0 ratinho transporta um transgene da cadeia leve capa humana, KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. 0 ratinho também transporta um transcromossoma da cadeia pesada humana, SC20, conforme descrito na Publicação PCT N.° WQ 02/43478.

Imunizações de Ratinho KM™:

Para. gerar anticorpos monoclonais completamente humanos psira IFN alfa, os ratinhos KM™ foram imunizados com IFNa humana natural contendo múltiplos subtipos purificados a partir de uma linha de células de linfoblastoides humanos viralmente estimulada. Os esquemas de imunização gerais são descritos em Lonberg, N. et al (1994) Nature 368: 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação PCT N.° WO 98/24884. Os ratinhos tinham 6-16 semanas de idade no momento da primeira, infusão de antigénio. Uma preparação natural purificada (25-100 pg) do antigénio do IFN alfa (isto é, purificada a partir de células de linfoblastoides viralmente estimuladas) foi utilizada para imunizar os ratinhos KM™ por via intraperitoneal (IP) ou subcutânea (Sc).

Os ratinhos transcromossômicos transgénicos fGram imunizados por via intraperitoneal (IP) ou subcutânea (Sc) com antigénio duas vezes em adjuvante completo de Freund, seguido de imunização IP durante 2-4 semanas (até um total de 8 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund. A resposta imune foi monitorizada por sangrias retro orbitais. 0 plasma foi classificado por ELISA (conforme descrito a seguir), e os ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-IFNa foram utilizados para fusões. Os ratinhos foram reforçados por via intravenosa com antigénio 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço.

Seleção de Ratinhos KM™ que Produzem Anticorpos Anti-IFNa:

Para selecionar ratinhos KM™ que produzem anticorpos que ligam a IFNa, os soros de ratinhos imunizados foram testados por ELISA conforme descrito por Fishwild, D. et al. (1996). Em suma, as placas de microtitulação foram revestidas com IFNcx natural purificado a partir de células de linfoblastoides a 1-2 pg /ml em PBS, 50 μΐ/poço, incubado a 4 °C durante a noite depois bloqueado com 200 μΐ/poço de 5% soro de galinha em PBS/Tween (0,05%). As diluições de plasma de ratinhos imunizados com IFNa foram adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um anticorpo policlonal IgG Fc cabra-anti-humano conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e a densidade ótica para cada poço foi determinada utilizando um espectrofotõmetro configurado para um comprimento de onda de 415nm com uma correção de fundo a 495nm. Os ratinhos que desenvolveram os títulos mais elevados de anticorpos anti-IFNa foram utilizados para as fusões. As fusões foram realizadas conforme descrito a seguir e os sobrenadant.es do hibridoma foram testados em relaçãG à atividade do anti-IFNa pGr ELISA.

Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos para IFNa:

Os esplenocitos foram isolados a partir de ratinhos KM™ e fundidos com uma linha de células de mieloma de ratinho com base em protocolos padrão utilizando PEG. Os hibridomas resultantes foram depois classificados pela produção de anticorpos específicos de antigénio.

Suspensões de célula única dos linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fundidas com um quarto do número de células de mieloma de ratinho não secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) ou células de mieloma de ratinho nâo secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) utilizando 50% PEG (Sigma). As células foram colocadas em placas a uma densidade de cerca de lxl05/poço em placas de microtitulação de fundo raso e incubadas durante aproximadamente 2 semanas em meio seletivo contendo 10% soro bovino fetal, 10% meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% origem (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com glicose, L-glutamina e piruvato de sódio elevados) maís 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml gentamicina e lx HAT (Sigma, CRL P-7185) . Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual HAT foi substituído com HT. Os poços individuais foram depois classificados por ELISA (descrito anteriormente) para anticorpos anti-IFNalgG humanos.

Meio condicionado do anticorpo que segrega hibridomas identificado por ELISA foi testado num ensaio de proliferação de células Daudi (descrito a seguir) pela capacidade de bloquear os efeitos antiproliferativos de IFNoí. Os hibridomas com maior atividade neutralizadora no ensaio de classificação Daudi foram subclonados, pelo menos, duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis resultantes foram depois cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo monoclonal em meio de cultura de tecido. A classificação pelo ensaio de proliferação de células Daudi foi repetida para confirmar a atividade dos subclones. Os subclones com maior atividade no ensaio Daudi foram redimensionados para produzir meio condicionado suficiente (tipicamente 1L) para purificação de monoclonal anti-IFNa para caracterização adicional. Classificação de Hibridomas para Neutralizar Anticorpo anti-Ifna: Ensaio de Proliferação De Daudi: 0 interferão alfa inibe a proliferação de células Daudi (linfoma de Burlcítts, ATCC n.° CCL-213) numa forma dependente da. dose. Um anticorpo neutralizador, que bloqueia ει ligação do interferão ao seu recetor, restaurará a proliferação. As curvas de dose resposta para os efeitos antiproliferativos do IFNa linfoblastoide natural nas células Daudi foram determinadas e uma concentração suficiente para inibir o crescimento das células Daudi em 50% (EC50) foi calculada. 0 meio condicionado hibridoma foi misturado com células Daudi em meio de cultura (RPMI 1640 suplementado com 10% FCS, Ix 2-ME, L-glutamina e penicilina

estreptomicina) com e sem a adição de IFNa numa placa de cultura de células com 96 poços, de fundo raso. A mistura final dos reagentes foi como se segue: 1 xlO4 células Daudi + 10% hibridoma supernate +/- IFNa a EC5Q por 100 ul/poço. Os poços foram incubados a 37°C, 5% C02, 72 horas. A proliferação foi testada com a adição de MTS (Promega), 20 ul/poço e densidade ótica a 4 90nm foi lida após 3 horas adicionais de incubação. 0 número de células viáveis foi proporcional à leitura da densidade ótica. A percentagem de inibição das células Daudi foi calculada para hibridoma supernate + IFNa relativo ao hibridoma supernate isolado e comparado com um meio controlo com e sem IFNa. Hibridomas foram ordenados de acordo com a potência do IFNa em bloquear e os hibridomas neutralizadores mais ativos foram selecionados para sub-clonagem.

Os clones de hibridoma 13H5, 13H7 e 7H9 fGram selecionados para análise posterior.

Exemplo 2: Caracterização Estrutural dos Anticorpos

Monoclonais Humanos 13H5, 13H7 e 7H9

As sequências de ADNc que codificam as regiões variáveis da cadeia leve e pesada dos anticorpos monoclonais 13H5, 13H7, e 7H9 foram obtidas a partir dos hibridomas 13H5, 13H7, e 7H9, respetivamente, utilizando técnicas de PCR padrão e foram sequeneiadas utilizando técnicas de sequenciação de ADN padrão.

As sequências de aminoácidos e de nucleótidos da região variável da cadeia pesada de 13H5 são mostradas na Figura IA e nas SEQ. ID N.° 25 e 19, respetivamente.

As sequências de aminoácidos e de nucleótidos da região variável da cadeia leve de 13H5 são mostradas na

Figura 1B e nas SEQ. ID N.° 28 e 22, respetivamente. A comparação da sequência de imunogiobulina da cadeia pesada de 13H5 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunogiobulina da linha germinativa humana demonstrou que a cadeia pesada da 13H5 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 1-18, um segmento D não determinado, e um segmento JH da linha germinativa humana JH4b. 0 alinhamento da sequência VH de 13H5 para a sequência da linha germinativa VH 1-18 é mostrado na Figura 4. Análise adicional da sequência VK de 13H5 utilizando o sistema Kabat da região determinante CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia pesada como mostrado nas Figuras IA e 4, e nas SEQ. ID N.°s 1, 4 e 7, respetivamente. A comparação da sequência da imunogiobulina da cadeia leve de 13H5 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunogiobulina da linha germinativa humana demonstrou que a cadeia leve de 13H5 utiliza um segmento VL de linha germinativa humana VK A2 7 e um segmento JK. da linha germinativa humana JK 1. 0 alinhamento da sequência VL de 13H5 para a sequência da linha germinativa VK A27 é mostrado na Figura 6. Análise adicional da sequência VL de 13H5 utilizando o sistema Kabat da região determinante CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia leve como mostrado nas Figuras 1B e 6, e nas SEQ. ID N.°s 10, 13 e 16, respetivamente.

As sequências de aminoácidos e de nucleótidos da região variável da cadeia pesada de 13H7 são mostradas na Figura 2A e nas SEQ. ID N.° 26 e 20, respetivamente.

As sequências de aminoácidos e de nucleótidos da região variável da cadeia leve de 13H7 são mostradas na Figura 2B e nsis SEQ. ID N.° 2 9 e 23, respetivamente. A comparação da sequência da imunogiobulina da cadeia pesada de 13H7 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunogiobulina da linha germinativa humana demonstrou que a cadeia pesada de 13H7 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VII 4-61, um segmento D da linha germinativa humana 3-10, e um segmento JH da linha germinativa humana JH4b. 0 alinhamento da sequência VH de 13H7 com a sequência da linha germinativa VH 4-61 é mostrado na Figura 5. Análise adicional da sequência VK de 13H7 utilizando o sistema Kabat da região determinante C'DR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia pesada como mostrado nas Figuras 2A e 5, e nas SEQ. ID N.°s 2, 5 e 8, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina da cadeia leve de 13H7 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunoglobulina da linha germinativa humana demonstrou que a cadeia leve de 13H7 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK A2 7 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 2. 0 alinhamento da sequência VL de 13H7 com a sequência da linha germinativa VK A27 é mostrado na Figura 6. Análise adicional da sequência VL de 13H7 utilizando o sistema Kabat da região determinante CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia leve como mostrado nas Figuras 2B e 6, e nas SEQ. ID N.°s 11, 14 e 17, respetivamente.

As sequências de aminoácidos e de nucleõtidos da região variável da cadeia pesada de 7H9 sâo mostradas na Figura 3A e nas SEQ. ID N.° 27 e 21, respetivamente.

As sequências de aminoácidos e de nucleótidos da região variável da cadeia leve de 7H9 são mostradas na Figura 3B e nas SEQ. ID N.° 30 e 24, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina da cadeia pesada de 7H9 com as sequências conhecidas da cadeia pesada da imunoglobulina da linha germinativa humana demonstrou que a cadeia pesada de 7H9 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 1-18, um segmento D da linha germinativa humana 6-6, e um segmento JH da linha germinativa humana JH4b. Q alinhamento da sequência VH de 7Η9 com a sequência da linha germinativa VH 1-18 ê mostrado na Figura 4. Análise adicional da sequência VH de 7H9 utilizando o sistema Kabat da região determinante CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD 3 da cadeia pesada como mostrado nas Figuras 3A e 4, e nas SEQ. ID N.°s 3, 6 e 9, respetivamente. A comparação da sequência da imunoglobulina da cadeia leve de 7H9 com as sequências conhecidas da cadeia leve da imunoglobulina da linha germinativa humana demonstrou que a cadeia leve de 7H9 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VIC A27 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 1. 0 alinhamento da sequência VL de 7H9 com a sequência da linha germinativa VK A27 é mostrado na Figura 6. Análise adicional da sequência VL de 7H9 utilizando o sistema Kabat da região determinante CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 da cadeia leve como mostrado nas Figuras 3B e 6, e nas SEQ. ID N.°s 12,15 e 18, respetivamente.

Exemplo 3: Anticorpos Monoclonais Humanos anti-IFN Alfa Inibem a Atividade Biológica de Múltiplos Subtipos de Interferão Alfa

Conforme descrito no Exemplo 1, o interferão alfa inibe a proliferação de células Daudi (linfoma de BurJcítts, ATCC n.° CCL-213) de um modo dependente da dose. Um anticorpo neutralízador, que bloqueia a ligação do interferão ao seu recetor, restaurará a proliferação. Ao utilizar este ensaio de proliferação de células, a especificidade dos anticorpos humanos anti-IFN alfa purificados foi examinada testando o blGqueio do IFNoí linfoblastoide natural, interferão leucócito natural, subtipos do IFN alfa 13 recombinante, IFN beta e IFN ómega.

As células Daudi foram crescidas em meio de cultura (RPMI 1640 suplementado com 10% FCS, Ix 2-ME, L-glutamina e penicilina estreptomicina) com e sem a adição de IFNa numa placa de cultura de células com 96 poços, de fundo raso.

Cada interferão tipo I testado foi testado a ΕΟΰ0 © misturado com uma titulação em série de 2 vezes de cada anticorpo, tipicamente de 50 ug/ml (312 nM) até 381 pg/ml (2,4 pM). A mistura anticorpo/IFN foi adicionada às células Daudi numa placa com 96 poços com fundo a uma densidade final de 1 xlO4 células Daudi/lOOul/poço e incubada a 37°C, 5% C02, 72 horas. A proliferação foi. testada com a adição de MTS (Promega), 20 ul/poço, e densidade ótica a 49Qnm foi medida após incubação durante 3 noras. 0 número de células viáveis foi proporcional à leitura da densidade ótica. A percentagem de bloqueio do interferão foi calculada em relação à proliferação das células Daudi na ausência de IFN ( = 100% de bloqueio) e na presença de IFN isolado ( = 0% de bloqueio). Os anticorpos foram pontuados de acordo com o grau de bloqueio, resultando num perfil de especificidade de subtipo do IFNa para cada anticorpo testado. Uma EC50 foi derivada com o programa PRISM™ utilizando uma regressão não linear; dose resposta sigmoide; ajuste de curva de declive variável. Os resultados demonstraram que o anticorpo humano 13H5 anti-IFN alfa inibe a ação de múltiplos subtipos do interferão alfa, particularmente, IFNoíS, 2b, 2a, 1, 16, 10, 8, 5 e 14, mas não IFNoí21, ΙΡΝβ ou IFNcú. 13H5 é um inibidor de baixo nível dos subtipos 17, 7 e 4 do IFN alfa. Os valores de EC50 e a % de bloqueio do interferão são mostrados no Quadro 1, a seguir.

Quadro 1: Inibição do Anticorpo de Múltiplos Subtipos do IFN Alfa

Exemplo 4: Inibição Da Indução do IFN Alfa de Marcadores de Superfície Celular por Anticorpos Anti-IFN Alfa A adição de IFN alfa 2b ao meio de cultura de células é conhecida por induzir a expressão dos marcadores de superfície celular CD38 e classe I do MHC em células sanguíneas mononucleares periféricas normais (PBMNC). A atividade do anticorpo humano anti-IFN alfa 13H5 foi testada pela inibição da expressão de marcadores de superfície celular induzida pelo interferão em culturas de células humanas primárias e testadas por análise FACS. 0 anticorpo monoclonal anti-IFNa 13H5 e controlos isotipos foram diluídos para 20 ug/ml cada em meio de cultura PBMNC (RPMI 164 0 + 10% FBS + 1% soro humano) . 0 anticorpo foi dispensado 1,5 ml/poço em frascos de cultura com tampas de expulsão T25 e misturado com um volume igual de ou 400 iu/ml leucócito IFN, IFN alfa 2b ou IFN ω, diluído em meio de cultura ou com meio isolado. PBMNC foram isoladas de sangue humano normal utilizando tubos de heparina Vacutainer® CPT™ revestidos de acordo com as recomendações do fabricante (Becton Dickinson & Co). As células foram ressuspensas em meio de cultura (RPMI 1640 + 10% FBS + 1% soro humano) para 2xl06 células/ml e foram adicionadas em igual volume às misturas Ab/IFN de modo que o teste final contém; 6xl06 PBMNC + 5 ug/ml Ah + /- 100 iu/ml IFN por 6 ml de meio. Os frascos foram incubados a 370C, 5% C02 durante 24 ou 4 8 horas. 0 meio condicionado foi colhido de cada frasco e as células da suspensão foram recuperadas por centrifugação a 1000 rpm num rotor Sorvall RTH-750. As células em sedimentos foram retidas em gelo e o sobrenadante foi congelado a -8Q°C para ELISA. As células aderentes foram recuperadas do frasco com uma lavagem em PBS (2 ml) , seguida de 15 minutos de incubação em verseno (3ml). O frasco foi descartado no final da incubação em verseno e o frasco foi finalmente enxaguado com lavagem em PBS (2 ml) . Cada uma das lavagens em PBS e o verseno foi combinado com as células recuperadas da colheita do meio condicionado. A suspensão de células agrupadas foi centrifugada a 1000 rpm num rotor Sorvall RTH-750, o sedimento resultante foi ressuspensa a 300 ul. em tampão de coloração (PBS + 0,1M EDTA + 2% FBS + 1% HS) e dispensadas 100 ul/poço numa placa com 96 poços com fundo em V. A placa foi centrifugada a pulso a 2800 rpm num rotor Sorvall RTH-750 e as células em sedimentos foram ressuspensas 25 μΐ/poço em anticorpos rotulados com fluorocromo como se segue: (1) anti-MHC I-FITC de ratinho + anti-CD38-PE de ratinho, e (2) controlos isotipos, IgG-FITC de ratinho ·+· IgG-PE de ratinho. A placa foi incubada em gelo durante 45 minutos, protegida da luz. As células foram lavadas três vezes com a adição de 200 ul de tampão de coloração seguido de centrifugação a pulso e finalmente ressuspensa em 200 μΐ de 2% paraformaldeído em PBS. A coloração de células monócitos foi analisada por citometria de fluxo com o Becfcon Dickinson FACScalibur™, os portões foram desenhados no gráfico da dispersão para a frente contra dispersão lateral para remover células contaminantes da análise. Os resultados demonstraram que o anticorpo monoclonal humano 13H5 inibe o IFN leucócito e o IFNa2b recombinante induziu alterações na expressão de CD38 e classe I do MHC nas PBMNC normais. 0 anticorpo monoclonal humano 13H5 não bloqueia alterações mediadas pelo IFNco na expressão do marcador de superfície celular de CD38 e classe I do MHC. Estes resultados são mostrados nos Quadros 2 e 3 a seguir.

Quadro 2: Percentagem de alteração na expressão de classe I do MHC induzida peio IFN em PBMNC normais

Quadro 3: Percentagem de alteração na expressão de CD38 induzida pelo IFN em PBMNC normais

Exemplo 5: Inibição da Expressão da Indução do IFN de IP-10 pelos Anticorpos Anti-IFN Alfa A adição de IFN alfa 2b aos meios de cultura de células é conhecida por induzir a expressão de IP-10 em células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMNC) normais. A atividade do anticorpo humano anti-IFN alfa 13H5 foi testada em relação à inibição da expressão induzida pelo interferão de IP-10 em culturas de PBMNC normais por um ensaio de ligação ELISA.

Uma cultura de PBMNC foi preparada conforme descrito no Exemplo 4, condicionada com IFN leucócito, IFN alfa 2b, ou IFN ω. 0 meio condicionado foi analisado por expressão IP-10/CXCL10 utilizando um kit de ELISA sandwich quantitativo (Quantikine®, R&D Systems} a. uma. diluição de 1:30 de acordo com as recomendações do fabricante. Os resultados demonstraram que o anticorpo monoclonal humano 13H5 inibe o IFN leucócito e o IFNa2b recombinante induziu a. expressão de IP-10 na cultura de PBMNC normais, mas não bloqueia a expressão de IP-10 induzida pelo IFNo. Estes resultados são mostrados no Quadro 4.

Quadro 4: Inibição do anticorpo da expressão de IP-10 induzida pelo IFN em PBMNC normais _

Exemplo 6: Caracterização da Afinidade do Anticorpo Monoclonal Humano Anti-IFN Alfa.

Neste exemplo, o anticorpo monoclonal 13H5 foi examinado pela sua afinidade de ligação por IFN alfa 2a recombinante e IFN alfa 2b utilizando a análise Biacore.

Anticorpos purificados a 10 ug/rnl foram capturados num chíp CM5 revestido com Prot-G. Concentrações de antigénio de 80 nM para 10 nM em tampão de corrida HBS-EP foram passadas pelo chip a uma taxa de 25 ul/min. 0 tempo de associação permitido foi de 5 minutos, seguido de um período de dissociação de 10 minutos. A ligação de fundo e não específica do antigénio a ambos chip e anticorpos foi eliminada detetando a ligação à superfície com IgG humana de controlo isotipo capturado (Sigma) e tampão. A regeneração do chip foi conseguida com uma taxa de fluxo de 100 ul/min durante 0,4 minutos utilizando 20 mM NaOH + 400mM NaCl. As curvas de associação e de dissociação foram ajustadas a um modelo de ligação de Langmuir utilizando o programei BIAevaluation (Biacore AB) . Os resultados sáo mostrados a seguir no Quadro 5.

Quadro 5: Características de ligação do anticorpo monoc1ona1 13 H5

Exemplo 7; Inibição de Anticorpo do Desenvolvimento das Células Dendríticas Mediado pelo Plasma De SLE 0 plasma do SLE induz o desenvolvimento das células dendríticas a partir de monócitos humanos normais. Neste exemplo, anticorpos monoclonais humanos anti-IFN alfa purificados foram testados pela inibição do desenvolvimento das células dendríticas, como avaliado pela capacidade dos anticorpos de inibirem a indução dos marcadores de superfície celulares CD38, classe I do MEC e CD123 pelo plasma de SLE.

Uma camada inflamatória de 25 ml foi diluída quatro vezes com PBS. A amostra foi separada em 4 tubos cónicos de 50 ml, e 15 ml de meio de separação de linfócitos (ICN Biomedicals) foi colGcado por baixo como uma camada. Após uma volta de 30 minutos a 500 x g, a camada inflamatória contendo as PBMCs foi removida e lavada com PBS. As células foram ressuspensas em meio de cultura a 4xl0b células/ml. Os monócitos fGram isolados incubando PBMC (2,0 x 10v células/ 5 ml / frasco de 25c:m2) durante 1,5 horas a 37°C em meio de cultura e depois lavando as células não aderentes duas vezes. Após a segunda lavagem as células foram cultivadas em meios contendo 1% soro humano inativado pelo calor. Vinte e cinco porcento de plasma de pacientes com SLE mais/menos anticorpos neutralizadores e controlos isotipos (30 ug/ml) foram adicionados aos frascos de cultura; IFN alfa 2b (100 & 10 iu./ml) mais 25% plasma humano normal foi utilizado como um controlo positivo para a indução de marcador. Os frascos foram incubados a 37°C, 5% C02 durante três a sete dias. As células dendríticas foram depois recuperadas do meio condicionado, com PBS e tratamento de verseno se necessário, antes de serem coradas conforme descrito para o bloqueio da indução de marcador em cultura de PBMNC (conforme descrito no Exemplo 4 anterior), A coloração das células dendríticas foi analisada por citometria de fluxo com a Becton Dickinson FACScalibur™. Os portões foram desenhados no gráfico dispersão para a frente contra dispersão lateral para remover as células contaminantes da análise. 0 anticorpo monoclonal humano 13H5 anti-IFN alfa inibe o processo dependente do IFN alfa do desenvolvimento de células dendríticas, conforme demonstrado pela expressão normalizada dos marcadores de superfície celular de classe I do MEC, CD38, e CD123 na presença de 13H5. Os resultados são mostrados a seguir no Quadro 6, em que (A), (B), (C) e (D) sumarizam os resultados para quatro amostras representativas de dadores com SLE.

Quadro 6: Inibição da maturação das células dendríticas

Exemplo 8: Mecanismo de Ação do Anticorpo Monoclonal 13H5

Neste exemplo, várias experiências de ligação que utilizam citocina radiomarcada e anticorpo com células que expressam IFNAR foram conduzidas de modo a determinar o mecanismo de ação do 13H5.

Ng primeiro conjunto de experiências, o IFNa2a recombinante foi radio-ioduretado com uma atividade específica de 29,3 Ci/mmol (tubos Pierce IODO-GEN®) e foi determinada para ligar especificamente a células Daudi com uma KD de aproximadamente 1 nM, Para examinar a ligaçâG de competição deste ligando às células, placas de fibra de vidro foram bloqueadas com 200 μΐ/poço de tampão de leite durante a noite a 4o C. As células Daudi foram dispensadas a 2 x 10b células/poço em meio RPMI 1640 e foram misturadas com i2:3I-IFNa (2 nM) , mais uma série de diluições de 3 vezes do competidor, seja 13H5, um anticorpo controlo isotipo ou IFNoí não rotulado (30 nM para 14 pM) . A placa foi incubada durante 2 horas a 4o C num agitador antes de ser lavada com RPMI e seca ao ar. Os filtros foram transferidos para tubos de vidro e analisados em relação à radioatividade.

Os resultados representativos de várias experiências são mostrados na Figura 7. 0 ligando não rotulado foi utilizado como um controlo positivo e observou-se que bloqueava especificamente a ligação de 12bI-IFNa com uni IC50 de aproximadamente 0,5 nM. 0 anticorpo 13H5, contudo, não bloqueou a ligação do ligando icduretado mas, em vez disso, observou-se que potência o sinal radioativo associado com as células tratadas, contrastando com o comportamento do anticorpo controlo isotipo, que não teve qualquer efeito na ligação do 12í:I-IFNa às células. Este resultado indica que o 13H5 tem um mecanismo não competitivo de ação e neutraliza a atividade biológica por bloqueio da sinalização, mas não por blGqueio da ligaçãG do ligando. 0 resultado anterior também sugere que ο 13H5 pode ficar associado com a superfície da célula na presença do IFNo:. Urna vez que cada molécula do 13H5 tem a capacidade de se ligar a duas moléculas do IFNa, é possível que estes acontecimentos também resultassem na ligação de um segundo ligando à membrana celular. Esta hipótese é suportada pela observação de que a radioatividade associada com a célula foi potenciada em aproximadamente 2 vezes em concentrações do anticorpo e ligando consistentes com uma razão de 1:1 do IFNa para os locais de ligação do 13H5.

Para examinar em maior detalhe o mecanismo de cLção do 13H5, a ligação do anticorpo às células Daudi foi testada utilizando anticorpo radiomarcado na presença ou ausência do IFNa:2a. A citocina foi utilizada numa concentração (10 nM) calculada para saturar a ligação de IFNAR com base em estudos prévios de ligação. 0 anticorpo 13H5 foi radio-ioduretado com uma atividade específica de 414 Ci/mmol (tubos Pierce I0D0-GEN®) . Para. examinar a ligação do anticorpo às células, placas de fibra de vidro foram bloqueadas com 200 μΐ/poço de tampão de leite durante a noite a 4o C. As células Daudi foram dispensadas a 2 x 1Q6 células/poço em meio RPMI 1640 e foram misturadas com uma série de diluições de 2 vezes de 12S-13H5 (20 nM para 20 pM) , mais/menos IFNof2a (10 nM) . A placa foi incubada durante 2 horas a 4o C num agitador antes de ser lavada com RPMI e seca ao ar. Os filtros foram transferidos para tubos de vidro e analisados em relação à radioatividade. Os valores de CPM medidos para a ligação de 12S-13H5 isolado foram subtraídos dos medidos na presença de IFNa2a de modo a determinar a ligação dependente de IFNa2a. Os resultados representativos de várias experiências são mostrados na Figura 8. Os resultados mostraram uma ligação saturável dependente da dose do 125-13H5 às células Daudi na presença de IFNa2a mas ligação negligenciável com a 125-13H5 isolada. A ligação específica do 13H5 dependente do IFNa está representada na Figura 8 por círculos e foi calculada subtraindo CPM para o anticorpo isolado (representando a ligação não específica) do CPM total para a ligação do 13H5 na presença de IFNa.

Assim, em suma, o mecanismo de ação do 13H5 é um mecanismo não competitivo no qual o complexo do IFNa ligado a 13H5 é capaz de ligar a IFNAR na superfície da célula e a atividade biológica do IFNa é neutralizada por bloqueio da sinalização através de IFNAR.

Exemplo 9: Ensaios de Citotoxicidade Mediados pela Célula Dependente De Anticorpo com 13H5

Uma vez que g 13H5 se pode associar com a superfície da célula na presença de IFNa, foi investigada a citotoxicidade mediada pela célula dependente de anticorpo (ADCC) utilizando um ensaio de libertação de 51 Cr. As células Raji foram utilizadas como alvos para lise por células mononucleares humanas frescas. As células mononucleares foram purificadas a partir de sangue inteiro heparinizado por centrifugação de densidade Ficoll Hypaque. As células alvo foram rotuladas com 100 mCi de 51 Cr por 10° células durante 1 hora antes de dispensar para placas de microtitulação com fundo em forma de U, 1Q4 células por poço, e combinando com células efetoras (razão efetora:alvo = 50:1) mais titulações de anticorpo. Após 4 horas de incubação a 37° C, o meio condicionado sobrenadante foi recolhido e analisado pela radioatividade. A libertação de radioatividade na ausência de anticorpo foi utilizada como um controlo de fundo e o tratamento com detergente das células alvo foi utilizado para determinar 100% de lise. A citotoxicidade foi calculada pela fórmula: % lise = (cpm experimental - cpm vazamento alvo)/(cpm lise detergente -cpm vazamento alvo) x 100%. A lise específica == % lise com 13H5 - % lise sem 13H5. Os ensaios foram realizados em triplicado.

Os resultados do ensaio ADCC, sumarizados na Figura 9, demonstram que ο 13H5 não teve atividade ADCC significativa sobre as células Raji, seja isolado ou na presença de IFNa2b. Da mesma forma, uma IgG correspondida por isótopo não exibiu atividade, ao passo que o controlo positivo (Rituximab) exibiu citotoxicidade robusta dependente da dose. Estes resultados indicam que a associação mediada pelo IFNoí do 13H5 com a superfície da célula de células que expressam IFNAR não é suficiente para mediar a ADCC.

Exemplo 10: Exame da Estabilidade de 13K5 O anticorpo 13H5 contém um local de desamidação potencial em Asn--55 na região CDR2 da cadeia pesada. A desamidação de resíduos de asparaginas é uma modificação comum dos polipeptídeos e proteínas obtidas utilizando tecnologia de ADN recombinante e pode resultar numa atividade biológica e/ou estabilidade diminuída, apesar de a desamidação não estar sempre correlacionada com a perda de ati\fidade biológica. A desamidação de asparaginas para formar ácido aspãrtico (e iso-Asp) resulta numa alteração da carga líquida, que pode ser detetada por métodos analíticos baseados na carga. Para examinar a desamidação de 13H5 em condições aceleradas (pH básico), foram utilizados métodos para deteção de variantes desamidadas do fragmento Fab por IEX-HPLC e focagem isoelêtrica capilar (cEIF),

Para acelerar a desamidação de 13H5, o anticorpo foi exposto a tampão a pH alcalino. Para o material de partida, uma alíquota de 102 μΐ do 13H5 (a 5,9 mg/ml para um total de 600 pg) foi adicionada a 498 μΐ de PBS e 6 μΐ de 1QQX solução-mãe de azido de sódio (2% solução) . Para a amostra de o tempo zero de PBS, 13 0 μΐ de material de partida foi combinado com 30 μΐ de PBS e a amostra foi colocada a -20° C até análise posterior. Para a amostra de tempo zero nos tampões de desamidação, 130 μΐ de material de partida foi combinado com 15 μΐ de 10X tampão de desamidação (10% bicarbonato de amónio, pH 8,5) e 15 μΐ de tampão de ajuste de pH (1M MES, pH 6,0) e colocado a -20° C até análise posterior. Para. a amostra do Dia 2 em PBS, 130 μΐ de material de partida foi combinado com 3 0 μΐ de PBS e incubado a 40° C durante 4 8 horas e depois a amostra foi colocada a -20° C até análise posterior. Para a amostra do Dia. 2 em condições de desamidação, 1.30 μΐ de material de partida foi combinado com 15 μΐ de 10X tampão de desamidação e incubado a 40° C durante 4 8 horas. Após 48 horas, 15 μΐ de tampão de ajuste de pH foi adicionado e a amostra foi colocada a -20° C até análise posterior.

Para preparar as amostras anteriores para análise, foi realizada digestão com papaína. As condições utilizadas da reação foram: 160 μΐ de amostra (130 pg do 13H5), 3,2 μΐ de 50 mM cisteína e 6,5 μΐ de enzima papaína a 1,0 mg/ml ern solução. As amostras foram colocadas a 40° C durante 4 horas e a reação foi parada pela adição de 4,8 μΐ de 1M iodoacetamida. Após a digestão com papaína, foi realizada uma SDS-PAGE não redutora para confirmar a presença, de fragmentos Fab e Fc.

Para realizar a IEX-HPLC nas amostras, todas as amostras foram primeiro dialisadas contra água durante 3 horas. Depois, 5 0 μΐ de cada amostra foi aplicada a HPLC com as seguintes condições de cromatGgrafia:

Coluna = coluna de intercâmbio fraco de catiões Dionex WCX-10

Tampão "A" =10 irtM MBS, pH 5,5 Tampão "B" = 10 mM MES, pH 5,5? 1,0 M NaCl Eluição = 4-25 % "B" por mais de 30 minutos a 0,8 ml/min Deteção = absorvância UV a. 280 nM Os resultados da análise IEX-HPLC são sumarizados no Quadro 7 a seguir, que mostra as áreas de pico para o Fab desamidado para as amostras de tempo zero e Dia 2 em condições de desarnidação:

Quadro 7

Para realizar a análise cIEF, as amostras foram primeiro dialisadas contra água durante 3 horas e depois aplicadas a cIEF utilizando métodos padrão de análise. Os resultados da análise cIEF são sumarizados no Quadro 8 a seguir, que mostra as áreas de pico para o Fab desamidado para as amostras de tempo zero e Dia 2 em condições de desarnidação:

Quadro 8

Para examinar a dependência do pH da desarnidação forçada, os dados IEX-HPLC para a amostra do Dia 2 em PBS (pH 7,0) foram comparados com a amostra do Dia 2 em condições de desarnidação. Os resultados são sumarizados no

Quadro 9 a seguir, que mostra as áreas de piso para o Fab desamidado para o dia 2 PBS e dia 2 em condições de desamidação: _Quadro 9

Estes dados suportam a teoria, existente de degradação da proteína, que prediz que a desamidação de polipeptídeos através de um mecanismo de alteração de beta-aspartilo ocorre a uma taxa crescente em condições de pH básico quando comparadas com pH neutro.

Exemplo 11: Preparação e Caracterização de Mutantes de 13H5 com Estabilidade Potenciada

Neste exemplo, foram preparados mutantes de 13H5 com uma substituição de aminoãcido em Asn-55 e a estabilidade destes mutantes foi examinada, no Dia 2 em condições de desamidação forçada, por análise cIEF conforme descrito no Exemplo 10. Os mutantes foram preparados por técnicas padrão de mutagénese de ADN recombinante. As sequências dos mutantes nas posições de aminoãcido 55-58 de VH, quando comparadas com ο 13H5 de tipo selvagem, foram como se segue: 13H5 de tipo selvagem: N G N T (resíduos de aminoácidos 55-58 da SEQ. ID N.0 19)

Mutante n.° 1: D G N T (SEQ. ID N.° 38)

Mutante n.° 2: Q G N T (SEQ. ID N.° 39)

Mutante n.c 3: Q G Q T (SEQ. ID N.° 40)

As sequências de aminoácidos de comprimento inteiro de VH dos mutantes n.° 1, n.° 2 en.° 3 são mostradas nas SEQ. ID N.°s 34, 35 e 36, respetivamente.

Os resultados da análise cIEF são mostrados a seguir no Quadro 10, que mostra as áreas de pico para o Fab desamidado para o tipo selvagem e mutantes no Dia 2 em condições de desamidação: __ __Quadro 10 :_

Os resultados demonstram que cada um dos três mutantes Asn-55 exibe maior estabilidade em condições de desamidação forçada do que o anticorpo 13H5 de tipo selvagem.

SUMÁRIO DA LISTA DE SEQUÊNCIAS

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 20030166228 AI [0006] • US 5225539 A, Winter [0064] [0100] • US 5530101 A [0064] [0067] [0100] • US 5585089 A [0064] [0067] [0100] • US 5693762 A [0064] [0067] [0100] • US 6180370 B, Queen [0064] [0067] [0100] • US 20030153043 A, Carr [0071] • US 5677425 A, Bodmer [0073] • US 6165745 A, Ward [0074] • US 6277375 B, Ward [0075] • US 5869046 A [0075] • US 6121022 A, Presta [0075] • US 5624821 A [0076] • US 5648260 A, Winter [0076] • US 6194551 B, Idusogie [0077] • WO 9429351 PCT, Bodmer [0078] • WO 0042072 A, Presta [0079] • US 5714350 A [0080] • US 6350861 B, Co [0080] • EP 1176195 A, Hanai [0081] • WO 03035835 PCT, Presta [0081] ® WO 9954342 A, Umana [0081] ® EP 0154316 A, Níshimura [0082] • EP 0401384 A, Ishikawa [0082] • WO 02092780 PCT; Short [0090] ® WO 03074679 PCT, Lazar [0090] ® US 4816567 A, Cabilly [0100] • US 5545806 A [0102] • US 5569825 A [0102] ® US 5625126 A [0102] • US 5633425 A [0102] • US 5789650 A [0102] • US 5877397 A [0102] • US 5661016 A [0102] • US 5814318 A [0102] • US 5874299 A [0102] • US 5770429 A [0102] • US 5545807 A, Surani [0102] • WO 9203918 A [0102] • WO 9312227 A [0102] • WO 9425585 A [0102] • WO 9713852 A [0102] • WO 9824884 A [0102] [0108] [0175] • WO 9945962 A [0102] • WO 0114424 A, Korman [0102] [0108] • WO 0243478 A, Ishida [0103] [0174] • US 5939598 A [0104] • US 6075181 A [0104] • US 6114598 A [0104] • US 6150584 A [0104] • US 6162963 A, Kucherlapati [0104] • US 5223409 A [0106] • US 5403484 A [0106] • US 5571698 A, Ladner [0106] • US 5427908 A [0106] • US 5580717 A, Dower [0106] • US 5969108 A [0106] • US 6172197 B, McCafferty [0106] • US 5885793 A [0106] • US 6521404 B [0106] ® US 6544731 B [0106] ® US 6555313 B [0106] ® US 6582915 B [0106] ® US 6593081 B, Griffiths [0106] ® US 5476996 A [0107] ® US 5698767 A, Wilson [0107] ® US 4399216 A [0115] ® US 4634665 A [0115] ® US 5179017 A [0115] • WO 8704462 A [0117] • WO 8901036 A [0117] ® EP 338841 A [0117] • US 4946778 A, Ladner [0134] ® WO 8800052 A, Fanger [0136] • US 4954617 A [0136] • WO 9410332 A [0136] ® US 5260203 A [0142] • US 5455030 A [0142] • US 4881175 A [0142] ® US 5132405 A [0142] • US 5091513 A [0142] • US 5476786 A [0142] ® US 5013653 A [0142] • US 5258498 A [0142] ® US 5482858 A [0142] • US 5399163 A [0164] • US 5383851 A [0164] ® US 5312335 A [0164] • US 5064413 A [0164] • US 4941880 A [0164] ® US 4790824 A [0164] ® US 4596556 A [0164] ® US 4487603 A [0164] • US 4486194 A [0164] • US 4447233 A [0164] ® US 4447224 A [0164] ® US 4439196 A [0164] ® US 4475196 A [0164] ® US 4522811 A [0165] ® US 5374548 A [0165] ® US 5399331 A [0165] ® US 5416016 A, Low [0165] • WO 0109187 A [0174]

Literatura de não patente citada na descrição • HARDY et al. Blood, 2001, vol. 97, 473 [0001] • CUTRONE ; LANGER,, J. Biol. Chem. , 2 001, vol. 276, 1714 0 [0001] ® STREULX et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1981, vol. 78, 2848 [0001] ® AGMET M. et al. Interferon 5. Academic Press, 1983,1-22 [0001] • UZE. Cell, 1990, vol. 60, 225 [0002] ® MOVICK et al. Cell, 1994, vol. 77, 391 [0002] • PESTKA et al. Annu Rev. Biochem., 1987, vol. 56,72 7 [0002] ® MOGEMSEN et al. J. Interferon Cytokine Res., 1999,vol. 19, 1069 [0002] ® COOK et al, J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 13448 [0002] ® LEWERENZ et al. J. Mol. Biol., 1998, vol. 282, 585[0002] ® HALLER et al. J. Exp. Med., 1981, vol. 154, 199 [0003] ® LIMDENMAOT et al. Methods Enzymol. , 1981, vol. 78, 181 [0003] ® BRINKMANN efc al. J. Exp. Med., 1993, vol. 178,1655 [0003] ® FINKELMAM et al. J. Exp. Med., 1991, vol. 174, 1179 [0003] ® SANTI^I et al. J. Exp. Med., 2000, vol. 191, 1777 [0003] [0004] ® TOUGH et al. Science, 1996, vol. 272, 1947 [0003] ® LUFT et al. J. Immunol., 1998, vol. 161, 1947 [0004] ® LUFT et al. Int. Immunol., 2002, vol. 14, 367 [0004] ® RADVANYI et al. Scand. J. Immunol., 1999, vol. 50,499 [0004] • PAQUETTE et al. J. Leukoc. Biol., 1998, vol. 64, 358[0004] ® FGULIS el al. Lancet, 1987, vol. 2, 1423 [0004] • HOOKS et al. Arthritis Rheum, 1982, vol. 25, 396 [0004] • HERTZOG et al. Clin. Immunol. Immunopathol.,1988, vol. 48, 192 [0004] • HOPKXNS ; MEAGER, Clin. Exp. Immunol. , 1988,vol. 73, 88 [0004] • ARVIM ; MILLER. Arthritis Rheum., 1984, vol. 27,582 [0004] • BLANÇO et al. Science, 2001, vol. 294, 1540 [0004] ® YTTERBERG ; SCHNITZER. Arthritis Rheum.,1982, vol. 25, 401 [0004] • BATTEUX et al. Eur. Cytokine Netw., 1999, 509 [0004] ® PRUMMEL ; LAURBERG. Thyroid, 2003, vol. 13,547 [0004] • MAZZIGTTI et al. J. Endocrinol. Invest., 2002, vol.25, 624 [0004] ® YOU et al. Chin. Med. J., 1999, vol. 112, 61 [0004] • KOH et al. Thyroid, 1997, vol. 7, 891 [0004] ® TSUKUI et al. Microbiology and Immunology, 1986, vol. 30 (11), 1129-1139 [0007] • MEAGIR et al. Journal of Interferon. Research, 1986, vol. 6 (6), 729-736 [0008] • WARD et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0026] • BIRD et al. Science, 1988, vol. 242, 423-426 [0026] [0097] • HUSTGM et al. Proc. Natl. Acad. Scí. USA, 1988, vol.85, 5879-5883 [0026] [0097] ® ΚΑΒΆΤ. E.A. et al. Sequences of Proteins of

Immunologicallnterest. U.S. Department of Health and HumanServices, 1991 [0048] • E. MEYERS ; W. MILLER. Comput. Appl. Biosci.,1988, vol. 4, 11-17 [0057] ® MEEDLEMAN ; WUNSCH. J. Mol. Biol., 1970, vol.48, 444-453 [0057] ® ALTSCHUL efc al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-10[00583 ® ALTSCHUL et al. Nucleic Acida Res., 1997, vol. 25(17)/ 3389-3402 [0058] • RIECHMANN, L. et al. Naturef 1998, vol. 332,323-327 [0064] • JONES, P. et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [00643 • QUEEN, C. efc al. Proc. ATatl. Acad. Scí. U.S.A., 1989, vol. 86, 10029-10033 [0064] • KABAT, E. A. et al. Sequences of Proteins of Immunologicallnterest. U.S. Department of Health and HumanServices, 1991 [00663 • TOMLINSON, I. M. efc al. The Repertoire of HumanGermlme VH Sequences Reveals about Fifty Groupsof VH Segments with Different Hypervariable Loops.iJ. Mol. Biol., 1992, vol. 227, 776-798 [0066]

• COX, J.P. L. efc al. A Directory of Human Germ-lineVK

Segments Reveals a Strong Bias in their Usage.Eur. J. Immunol., 1994, vol. 24, 827-836 [0066] • SHIELDS, R.L. efc al. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276,6591-6604 [00793 • SHIELDS, R.L. efc al. J. Biol. Chem., 2002, vol. 277,26733-26740 [0081] • UMANA efc al. Nat. Biotech., 1999, vol. 17, 176-180[0081] ® Stability of Protein Pharmaceuticals.

PharmaceuticalBiotechnology. vol. 2, 1-30 [0084] ® Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishingand Wiley Interscience, 1987 [0091] • KABAT, E. A. Sequences of Proteins of Immunologicallnterest. U.S. Department of Health and HumanServices, 1991 [0095] • MCCAFFERTY efc al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0097] • KOHLER; MILSTEI^. Nature, 1975, vol. 256, 495ÍQ098] • LONBERG et al. Nature, 1994, vol. 368 (6474),856-859 [0102] • LOKBERG, N. Handbook of Experimental Pharmacology.1994, vol. 113, 49-101 [0102] • HUS2AR, D. Intern. Rev. Immunol., 1995, vol. 13,65-93 [0102] • HARDING, F. ; LONBERG, N. Ann. N.Y. Acad. Sei.,1995, vol. 764, 536-546 [0102] • TAYLOR, L. et al. Nucleic Acids Research, 1992,vol. 20, 6287-6295 [0102] • CHEN, J. efc al. International Immunology, 1993, vol.5, 647-656 [0102] • TUAILLGN et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993,vol. 90, 3720-3724 [0102] • CHOI et al. Nature Genetics, 1993, vol. 4, 117-123[0102] • CHEN, J. et al. EMBO J., 1993, vol. 12, 821-830 [0102] • TUA1LLON et al. J. Immunol1994, vol. 152,2912-2920 [0102] • TAYLOR, L. et al. International Immunology, 1994,vol. 6, 579-591 [0102] • FISHWILD, D. et al. Nature Biotechnology, 1996, vol.14, 845-851 [0102] [0108] [0175] • TOMIZUKA et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000,vol. 97, 722-727 [0105] • KUROIWA et al. Nature Biotechnology, 2002, vol.20, 889- 894 [0105] • LOMBERG, N. et al. Nature, 1994, vol. 368 (6474),856-859 [0108] • MORRISON, S. Science, 1985, vol. 229, 1202 [0112] • GGEDDEL. Gene Expression Technology. Methodsin

Enzymology. Academic Press, 1990, vol. 185 [0114] ® ΤΆΚΕΒΕ, Y. et al. Mol. Cell. Biol., 1988, vol. 8,466-472 [0114] • BOSS, Μ. A. ; WOOD, C. R. Immunology Today,1985, vol. 6, 12-13 [0116] • URLAUB ; CHA8JN, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,19 30, vol . 77, 4216-4220 [0117] • R. J. KAUFMAN ; P. A. SHARP. Mol. Bíol. , 1982, vol. 159, 601-621 [0117] • SAITO, G. et al. Adv. Drug Deliv. Rev., 2003, vol. 55,199-215 [0127] • TRAIL, P.A. et al. Câncer Immunol. Immunother., 2003, vol. 52, 328-337 [0127] • ΡΆΥΜΕ, G. Câncer Cell, 2003, vol. 3, 207-212 [0127] • ALLEN, T.M. Nat. Rev. Câncer, 2002, vol. 2, 750-763 [0127] • PASTAN, I. ; KREITMAM, R. J. Curr. Opín. Investiq.Drugs, 2002, vol. 3, 1089-1091 [0127] • S1NTER, P.D. ; SPR1MGER, C.J. Adv. Drug Deliv.Rev., 2001, vol. 53, 247-264 [0127] • Monoclonal Antibodies For Immunotargeting QfDrugs In Câncer Therapy. ARNON et al. MonoclonalAntibodies And Câncer Therapy. Alan R. Liss, Inc,1985, 243-56 [0130] • Antibodies For Drug Delivery. HELLSTROM et al.Controlled Drug Delivery. Mareei Dekker, Inc, 1987,623-53 [0130] • Antibody Carriers Of Cytotoxic Agente In CancerTherapy: A Review. THORPE et al. Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinicai Applications.1985, 475-506 [0130] • Analysis, Results, And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy. Monoclonal Antibodies For Câncer DetectionAnd Therapy. Acadeinic Press, 1985, 303-16 [0130] • THORPE et al, The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates. Immunol. Rev.,1982, vol. 62, 119-58 [0130] • GRAZIANO, R.F. et alo J Immunol, 1995, vol. 155 (10) , 4996-5002 [01363 • MORTON, H.C. et alo Criticai Reviews in Immunology, 1996, vol. 16, 423-440 [0137] • MONTEIRO, R.C. et al. J Immunol, 1992, vol. 148,1764 [0137] ® KARPOVSKY et al. J. Exp. Med., 1984, vol. 160,1686 [0140] ® LlUf MA et al. Proc. Uatl. Acad. Sei. USA, 1985, vol. 82, 8648 [0140] • PAULUS. Behring Ins. Mitt., 1985, 118-132 [0140] • BREMNAN et al. Science, 1985, vol. 229, 81-83 [0140] ® GLENNIE et al. J. Immunol., vol. 139, 2367-2375 [0140] • Principies of Radioímmunoassays. WEINTRAUB, B.Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques. The Endocrine Society, March 1986 [0143] • BERGE, S.M. et al. J. Pharm. Sei., 1977, vol. 66,1-19 [0147] ® Sustained and Controlled Release Drug Delively Systems.Mareei Dekker, Inc, 1978 [0163] ® V.V. RANADE. J. Clin. Pharmacol., 1989, vol. 29,685 [0165] • UMEZAWA et al. Biochem, Biophys. Res. Comw.un,, 19 8 8 , vol. 153, 1038 [0165] • P.G. BLOEMAN et al. FEBS Lett., 1995, vol. 357,140 [0165] • M. OWAIS et al. Antimicrob. Agents Chemother,,1995, vol. 39, 180 [0165] • BRISCOE et al. Am. J. Physiol., 1995, vol. 1233, 134 [0165] ® SCHREIER et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 9090 [0165] ® M.L. LAUKKAMEN, FEBS Lett., 1994, vol. 346, 123 [0165] I.J. FIDLER. Immnnomethods, 1994, vol. 4, 273 [0165] • CHEH et al. EMBO J.f 1993, vol. 12, 811-820 [0174] ® F1SHW1LD et al. Nature Biotechnology, 1996, vol.14, 845- 851 [0174] • LONBERG, N. et al. Nature, 1994, vol. 368, 856-859 [0175]

Claims

reivindicações

1. Um anticorpo monoclonal anti interferão alfa isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada CDR1 que compreende uma modificação conservativa da SEQ. ID N.c 1, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcido conservativas ,· (b) uma região variável da cadeia pesada CDR2 que compreende uma modificação conservativa da SEQ. ID N.° 4, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcido conservativas; (c) uma região variável da cadeia pesada CDR3 que compreende a SEQ. ID K.° 7; (d) uma região variável da cadeia leve CDR1 que compreende uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 10, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcido conservativas; (e) uma região variável da cadeia leve CDR2 que compreende uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 13, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcido conservativas; e (f) uma região variável da cadeia leve CDR3 que compreende uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 16, a modificação compreendendo uma, duas ou três substituições de aminoãcido conservativas; e em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe IFN Linfoblastoide, IFNoí6, IFNa2b, IFNa2a, IFNal, IFN Leucocitário, IFNoí16, IFNalO, IFNa8, IFNa5, IFNal4, IFNal7, IFNa7 and IFNa4, mas não inibe a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega.

2. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com a reivindicação 1, que compreende: (a) uma CDR1 de região variável da cadeia pesada que compreende uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 1, a modificação compreendendo não mais de duas substituições de aminoácido conservativas; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 4, a modificação compreendendo não mais de duas substituições de aminoácido conservativas; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID MO: 7; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 10, a modificação compreendendG não mais de duas substituições de aminoácido conservativas; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 13, a modificação compreendendo não mais de duas substituições de aminoácido conservativas; and (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 16, a modificação compreendendG não mais de duas substituições de aminoácido conservativas.

3.0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, que compreende: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 1, a modificação compreendendo uma substituição de aminoácido conservativa; (b) uma CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 4, a modificação compreendendo uma substituição de aminoácido conservativa; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 10, a modificação compreendendo uma substituição de aminoãcido conservativa; (e) uma CDE2 de região variável de cadeia leve compreendendo the uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 13, a modificação compreendendo uma substituição de aminoácido conservativa; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo uma modificação conservativa da SEQ ID NO: 16, a modificação compreendendo uma substituição de aminoãcido conservativa.

4 „ Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoãcido que é entre 80% e 99% homóloga com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoãcido que é entre 80% e 99% homóloga com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 22,- e em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, inibe IFN Linfoblastoide, IFNa6. IFNoí2b. IFNcx2a. IFNcxl, IFN Leucocitário. IFNalÊ, IFNoíIO. IFNa8. IFNa5. IFNal4, IFNo:17, lFNa7 and IFNa4, mas não inibe a atividade biológica de IFN beta ou IFN õmega.

5. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo inibe a expressão à superfície de CD38 ou classe I do MEC induzida pelo IFN em células sanguíneas mononucleares periféricas.

6. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo inibe a expressão de IP-10 induzida pelo IFN por células sanguíneas mononucleares periféricas.

7. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo inibe o desenvolvimento de células dendríticas mediado pelo plasma do lúpus eritematoso sistémico (SLE).

8. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que é um anticorpo humano.

9. 0 anticorpo ou porção de ligação a. antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que é um anticorpo humanizado ou quimérico.

10. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que ê um anticorpo IgGl ou IgG4.

11. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a porção de ligação a antigénio é um fragmento Fab do anticorpo.

12. O anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a porção de ligação a antigénio é um anticorpo de cadeia única (scFv).

13. Uma composição que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, e um portador farmaceuticamente aceitável.

14. A composição de acordo com a reivindicação 13, que é liofilizada.

15. Um imunoconjugado que compreende o anticorpo, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ligado a um agente terapêutico.

16. 0 imunoconjugado de acordo com a reivindicação 15, em que o agente terapêutico é uma citotoxina.

17. 0 imunoconjugado de acordo com a reivindicação 15, em que o agente terapêutico é um isótopo radioativo.

18. Uma composição que compreende o imunoconjugado de acordo com a. reivindicação 15, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

19. Uma molécula biespecífica que compreende o anticorpo, ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ligado a uma segunda fração funcional com especificidade de ligação diferente do dito anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo.

20. Uma composição que compreende a molécula biespecífica de acordo com a reivindicação 19 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Uma molécula isGlada de ácido nucleico que codifica o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer urna das reivindicações 1 a 12.

22. Um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21.

23. Uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 22.

24. Um ratinho transgénico que compreende transgenes da cadeia leve e pesada da imunoglobulina humana, em que o ratinho expressa o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

25. Um hibridoma preparadG a partir do ratinho de acordo com a reivindicação 24, em que o hibridoma produz o dito anticorpo, ou porção de ligação a. antigénio do mesmo.

26. Um método in vitro de preparar um anticorpo anti-IFN alfa, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo: (i) proporcionar um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo: (a) uma CDR1 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1; (b) lima CDR2 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 4; (c) uma CDR3 de região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 7; (d) uma CDR1 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 10; (e) uma CDR2 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 13; e (f) uma CDR3 de região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 16. (ii) alterar pelo menos um resíduo de aminoãcido dentro de pelo menos uma região variável para criar o pelo menos um anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreendendo pelo menos uma alteração de aminoácido; (iii) expressar o anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo como uma proteína,· (iv) avaliar a atividade de ligação do anticorpo alterado ou porção de ligação a antigénio do mesmo; e (v) identificar um anticorpo alterado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que liga especificamente a IFN alfa, inibe IFN Linfoide, IFNa6, IFNcx2b, IFNa2a, IFNcxl, IFN Leucocitário, IFNalô, IFNal.0, IFNaS, IFNaS, IFNal4, I FNa 17, IFNa7 and IFNa4, mas não inibe a atividade biológica de IFN beta ou IFN ómega.

27, Um método ex vivo de inibir a atividade biológica do interferão alfa que compreende colocar o interferão alfa em contacto com o anticorpo ou porção de ligação a antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, de modo que a atividade biológica do interferão alfa é inibida.

28. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, para utilização num método de tratamento de uma doença ou distúrbio mediada pelo interferão alfa num sujeito em necessidade de tratamento, em que a dGença ou distúrbio é lúpus eritematoso sistémico, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, diabetes melitus dependente de insulina, psoríase, tiroidite autoimune, artrite reumatoide, glomerulonefrite, rejeição de transplantes ou doença do enxerto contra hospedeiro.