EA026251B1 - Способ восстановления и регенерации мышц - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам восстановления мышц или снижения повреждения мышечной ткани, предусматривающим введение субъекту терапевтически эффективных количеств агонистов рецептора ретиноевой кислоты гамма (RARγ).

Description

Правительственная поддержка

Настоящее изобретение было подготовлено при правительственной поддержке в виде гранта № ^81Х^Н-07-1-0212. предоставленного Сухопутными войсками США. Правительство обладает определенными правами на изобретение.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для восстановления и регенерации мышц.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Повреждения мышц включают в себя такие острые повреждения скелетных мышц, как ушибы (гематомы), разрывы, ишемию, растяжения и полные разрывы. Эти повреждения могут вызывать очень сильную боль и могут делать недееспособным пораженного индивидуума, предотвращая его способность ходить на работу или даже принимать участие в ежедневных обычных действиях.

Скелетные мышцы могут повреждаться вследствие многочисленных причин, включающих в себя перегрузку, травму, инфекции и прекращение кровообращения. Как правило, мышцы характеризуются адекватной способностью к восстановлению, особенно, у молодых людей, но этот процесс восстановления может становиться неэффективным у пожилых людей или после повторяющихся циклов перегрузки, травмы или других процессов. В этих случаях мышцы утрачивают свою функцию и силу сокращения и могут замещаться рубцовой тканью (соединительной тканью), которая вследствие отсутствия сократительной способности вызывает потерю мышечной функции. Современные виды терапии включают массаж, ультразвуковое воздействие, гипербарическую доставку кислорода и такие медикаментозные типы лечения, как фенотерол и инсулиноподобный фактор роста-1. Эти виды терапии могут обеспечивать некоторые положительные результаты, но они далеки от идеальных в отношении эффективности и результативности. Кроме того, современные виды терапии не направлены специфически на основные механизмы восстановления и регенерации мышечных клеток.

Соответственно существует необходимость в способах и композициях, которые могут быстро и эффективно вызывать восстановление и регенерацию мышц.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу восстановления или регенерации мышцы у субъекта, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества агониста рецептора ретиноевой кислоты (КАК) субъекту, причем субъект характеризуется наличием поврежденной мышечной ткани. Согласно некоторым вариантам осуществления агонист КАК представляет собой агонист ΚΑΚγ.

Один аспект настоящего изобретения относится к способу восстановления мышцы у субъекта, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества агониста рецептора ретиноевой кислоты гамма (ΚΑΚγ) субъекту с поврежденной мышечной тканью, чтобы тем самым восстановить или регенерировать поврежденную мышечную ткань. Другой аспект настоящего изобретения относится к способу снижения повреждения мышечной ткани у субъекта, страдающего миопатией, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества агониста ΚΑΚγ указанному субъекту. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение является местным или системным. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают в течение периода времени повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида у субъекта, которая является результатом возникновения поврежденной мышечной ткани. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают позже, чем через 3 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают приблизительно через 4 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают приблизительно через 5 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают через приблизительно 6 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают приблизительно через 7 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение начинают приблизительно через 5 дней и продолжают по меньшей мере до 7 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов введение продолжают по меньшей мере до 9 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов аго- 1 026251 нист ΚΑΚγ выбирают из группы, состоящей из следующего: СО-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СО-394, СО-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СО-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота); СО-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ВМ§270394 (3-фтор-4-[(К)-2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); ВМ8-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3-(3,5-ди-трет-бутилфенил)-3-оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2-карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов поврежденная мышечная ткань является результатом физической травмы или несчастного случая, заболевания, инфекции, перегрузки, прекращения кровообращения или мышечной атрофии или истощения. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов поврежденная мышечная ткань представляет собой дистрофическую мышцу или стареющую мышцу. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов поврежденная мышечная ткань является результатом мышечной атрофии/истощения. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов субъект представляет собой млекопитающее. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов субъект представляет собой мышь. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов субъект представляет собой человека. Согласно одному варианту осуществления описанных в настоящем документе способов способ дополнительно предусматривает введение противовоспалительного средства субъекту.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлена гистограмма данных, полученных в гистологическом анализе скелетной мышечной ткани через 4 недели после повреждения. Для оценки и количественного анализа изменений структуры скелетной мышечной ткани получали изображения окрашенных трихромом серийных срезов и их использовали для определения относительных количеств мышечного волокна, жировой и фиброзной тканей в многочисленных заданных областях с помощью программного обеспечения 1тадеРго. Проанализированные области представляли собой сетки размером 9x9 каждая (приблизительно 3x3 мм), которые включали в себя исходный участок повреждения (2x2 мм). Следует отметить, что повреждение мышцы вызывала снижение общей площади мышечного волокна и одновременное увеличение площади фиброзной и жировой тканей. Напротив, обработка СО 1530 в значительной степени восстанавливала состав тканей.

На фиг. 2 представлено графическое представление данных, полученных в гистоморфометрическом анализе композиции поврежденной мышцы.

На фиг. 3 представлены названия и химические структуры некоторых типичных агонистов ΚΆΚγ.

На фиг. 4 представлена серия гистограмм с данными, полученными из экспериментальных результатов, которые показывают, что местная концентрация ΚΑ вначале снижается и затем временно повышается после повреждения мышцы.

На фиг. 5 представлена серия линейных графиков из экспериментальных результатов, которые показывают, что местная ΚΑ концентрация вначале снижается и затем временно повышается после повреждения мышцы.

На фиг. 6 представлена гистограмма данных, полученных в гистологическом анализе скелетной мышечной ткани через 4 недели после повреждения после указанных периодов обработки с помощью агониста ΚΑΚγ. На графике слева заштрихованный сегмент показывает мышцу. Сегмент сразу справа от него показан как незаштрихованный (белый) и показывает жировую ткань. Сегмент справа от него, заштрихованный, показывает фиброзную ткань.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Аспекты настоящего изобретения обнаружили, что стволовые клетки-предшественники могут быть индуцированы с тем, чтобы подвергаться мышечной дифференцировке, посредством кратковременного или хронического воздействия агонистов рецептора ретиноевой кислоты гамма (ΚΑΚγ). Соответственно согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу восстановления или регенерации поврежденной мышечной ткани субъекта, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества агониста рецептора ретиноевой кислоты (ΚΑΚ) субъекту, причем субъект характеризуется наличием поврежденной мышечной ткани.

Используемый в настоящем документе термин поврежденная мышечная ткань относится к мышечной ткани, такой как скелетная или сердечная мышца, которая была изменена, например, при физической травме или несчастном случае, заболевании, инфекции, перегрузке, прекращении кровообращения или генетическими факторами или факторами окружающей среды. Поврежденная мышечная ткань может быть дистрофической мышцей или стареющей мышцей. Типичные симптомы повреждения мыш- 2 026251 цы включают в себя без ограничения отек, гематому или покраснение, открытые порезы как последствие повреждения, боль в состоянии покоя, боль, когда конкретная мышца или сустав используется по отношению к этой мышце, слабость мышцы или сухожилий и неспособность вообще использовать мышцу.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения поврежденная мышечная ткань является результатом мышечной атрофии/истощения. Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения поврежденная мышечная ткань является результатом физической травмы.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения поврежденная мышца представляет собой скелетную мышцу.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения заболевание, являющееся результатом поврежденной мышечной ткани, представляет собой миопатию. Без ограничения миопатия может быть врожденной миопатией или приобретенной миопатией. Типичные миопатии включают без ограничения дистрофии, миотонию (нейромиотонию), врожденные миопатии (например, непрогрессирующую миопатию, врожденную непрогрессирующую миопатию, центронуклеарную миопатию (или миотубулярную миопатию)), митохондриальные миопатии, семейный периодический паралич, воспалительные миопатии, метаболические миопатии (например, гликогеноз и нарушение накопления липидов), дерматомиозит, полимиозит, миозит с включенными тельцами, оссифицирующий миозит, рабдомиолиз и миоглобинурии.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения миопатия представляет собой дистрофию, выбранную из группы, состоящей из мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, мышечной дистрофии Беккера, рефлекторной симпатической дистрофии, дистрофии сетчатки, колбочковой дистрофии, миотонической дистрофии, дистрофии роговицы и любой их комбинации.

Не желая быть связанными с теорией, описанные в настоящем документе способы снижают и/или ингибируют образование рубцовой ткани в поврежденной мышечной ткани. Соответственно согласно некоторым вариантам осуществления образование рубцовой ткани в поврежденной мышечной ткани снижается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% (полное снижение) относительно исходного содержания.

Согласно некоторым вариантам осуществления количество жировой ткани и/или соединительной ткани в поврежденной мышечной ткани снижается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% (полное снижение) относительно исходного содержания.

Вновь, не желая быть связанными с теорией, описанные в настоящем документе способы приводят к увеличению количества тяжелой цепи миозина (МНС) в поврежденной мышечной ткани. Соответственно согласно некоторым вариантам осуществления количество тяжелой цепи миозина (МНС) в поврежденной мышечной ткани увеличивается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более, относительно исходного содержания.

Кроме того, описанные в настоящем документе способы увеличивают количество положительных в отношении МНС удлиненных миоцитоподобных клеток. Соответственно согласно некоторым вариантам осуществления количество положительных в отношении МНС удлиненных миоцитоподобных клеток в поврежденной мышечной ткани увеличивается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере, в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более, относительно исходного содержания.

Обсуждаемые в настоящем документе стволовые клетки-предшественники могут индуцироваться или стимулироваться, чтобы подвергаться мышечной дифференцировке, посредством кратковременного или хронического воздействия агонистов рецептора ретиноевой кислоты гамма (ΚΑΚγ). Соответственно наблюдается увеличение миогенных регуляторный факторов. Миогенные регуляторные факторы представляют собой факторы транскрипции типа основная спираль-петля-спираль (ЬНЬН), которые регулируют миогенез. См., например, Реггу, К. & Кибшск, М. (2000). Мо1еси1аг тескашктк геди1айп§ туодешс беЮпшпаОоп апб бШегепбабоп, Ргоп( Вю8а 5: Ό750-67 (2000), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Типичные миогенные регуляторные факторы включают в себя без ограничения МуоИ (Му13), Му£5, миогенин и МКР4 (Му£6). МуоИ является одним из наиболее ранних маркеров миогенного коммитирования. МуоИ экспрессируется в активированных миосателлитоцитах, но не в покоящихся миосателлитоцитах. Хотя МуоИ маркирует коммитирование миобластов, развитие

- 3 026251 мышцы не прекращается полностью у мышиных мутантов, у которых отсутствует ген МуоЭ. Вероятно, это обусловлено функциональной избыточностью Му£5.

Соответственно согласно некоторым вариантам осуществления содержание по меньшей мере одного миогенного регуляторного фактора в поврежденной мышечной ткани увеличивается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере, в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более, относительно исходного содержания.

Согласно некоторым вариантам осуществления количество по меньшей мере одного ламинина в поврежденной мышечной ткани увеличивается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз или более относительно исходного содержания.

Агонисты рецептора ретиноевой кислоты (КАК)

Используемый в настоящем документе термин агонист КАК представляет собой любое соединение, которое способно трансактивировать любой рецептор ретиноевой кислоты с ΕΌ50 менее чем 1000 нМ, менее чем 500 нМ, менее чем 250 нМ, менее чем 200 нМ, менее чем 100 нМ, менее чем 50 нМ, менее чем 25 нМ, менее чем 20 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 0,1 нМ, менее чем 0,01 нМ или менее чем 0,001 нМ.

Ретиноидные рецепторы классифицируют на два семейства, рецепторы ретиноевой кислоты (КАК) и ретиноидные X рецепторы (КХК), каждый из которых состоит из трех отдельных подтипов: α, β и γ. Каждый подтип семейства генов КАК кодирует различное количество изоформ, возникающих вследствие дифференциального сплайсинга двух первичных РНК транскриптов. Полностью транс-ретиноевая кислота (АТКА) и ее другие встречающиеся в природе ретиноидные аналоги (9-цис-ретиноевая кислота, полностью транс-3-4-дидегидроретиноевая кислота, 4-оксоретиноевая кислота и ретинол) являются плейотропными регуляторными соединениями, которые связываются с ретиноидными рецепторами. Например, АТКА связывается с приблизительно равной аффинностью со всеми тремя подтипами КАК, но не связывается с рецепторами КХК. Наоборот, для этих рецепторов 9-цис-ретиноевая кислота является естественным лигандом.

Используемый в настоящем документе термин трансактивация относится к способности агониста КАК активировать транскрипцию гена, где транскрипция гена инициируется связыванием лиганда с конкретным рецептором ретиноевой кислоты, подлежащим исследованию, т.е. КАКа, ΒΛΡβ или КАК'. Определение способности соединения трансактивировать рецептор ретиноевой кислоты может быть проведено способами, известными специалистам в настоящей области техники. Примеры таких способов можно найти в Вегпагй е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Ке8. Соттип., 186: 977-983 (1992) и Ар£е1 е! а1., Ргос. №й. δει. Асай. (И8А), 89: 7129-7133 (1992), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов агонист КАК представляет собой селективный агонист КАК'. Используемый в настоящем документе термин селективный агонист КАК' относится к соединению, которое способно селективно связываться с рецептором КАК' и стимулировать активацию КАК'. Как правило, селективные агонисты КАК' будут связываться с рецептором КАК' при значительно более низких концентрациях, чем рецепторы КАКа и КАКв. Например, селективный агонист КАК' будет связываться с рецептором КАК' с селективностью более чем в 5 раз, более чем 10 раз, более чем 20 раз, более чем 30 раз, более чем 40 раз, более чем 50 раз, более чем 60 раз, более чем 70 раз, более чем 80 раз, более чем 90 раз или более, чем рецепторы КАКа и КАКв.

Селективность соединения как агониста КАК' может быть определена с помощью рутинных анализов связывания лиганда, известных специалистам в настоящей области техники, таких как описанных в АрГе1 е! а1., Ргос. Ыа!. δει. Асай. (И8А), 89: 7129-7133 (1992); М. Тепу е! а1., 1. Мей. Сйет., 40: 2445-2451 (1997); и Публикации международной РСТ заявки № АО 1996/30009, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов агонист КАК представляет собой селективный агонист КАК'/β. Используемый в настоящем документе термин селективный агонист КАК'/β относится к соединению, которое селективно связывается с рецепторами КАК' и КАКβ, стимулируя активацию как КАК', так и КАКβ и не влияя на активацию рецепторов КАКа.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов агонист КАК представляет собой агонист КАК, который является по меньшей мере гамма-селективным и не взаимодействующим с КАКа. Используемый в настоящем документе термин агонист КАК, который является, по меньшей мере, гамма-селективным и не взаимодействующим с КАКа относится к соедине- 4 026251 нию, которое является селективным для КАКу или селективным для КАКу/β.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов агонист КАК представляет собой пан-агонист КАК. Используемый в настоящем документе термин панагонист КАК относится к соединению, которое связывается с рецепторами КАКа, ΚΑΚβ и ΚΑΚγ со сходной аффинностью, стимулирую активацию КАКа, КАКв и КАКу.

Типичные КАК агонисты включают в себя без ограничения следующее: СИ-271 (6-(4-метокси-3трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СИ-394, СО-437 (6-(4-гидрокси-3трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СО-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота); СО-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ВМ8-270394 (3-фтор-4-[(К)-2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); ΒΜδ-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3-(3,5-ди-трет-бутилфенил)-3-оксопропенил] бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2-карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.

Другие КАК агонисты, пригодные для настоящего изобретения, описаны, например, в патенте США № 5624957; № 5760084; № 6331570; № 6300350; № 5700836; № 5726191; № 5498795; № 5130335; публикации международной заявки № \УО 1997/037648, № \νϋ 2007/068579 и № \νϋ 2007/068580; заявке на выдачу патента Франции № РК2739557, опубликованной 11 апреля 1997; и патентной публикации Японии № 62/053981, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в их полноте. Дополнительные агонисты КАК, пригодные для настоящего изобретения, включают те, которые описаны в ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Соттип. 179: 1554-1561 (1992), ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Соттип. 186: 977-984 (1992), Ιηί. 1. Сапсег 71: 497 (1997), 8кш РЬагтасо1. 8: 292-299 (1995), 1. Меб. СЬет. 39: 2411-2421 (1996), Сапсег Кез. 55: 4446-4451 (1995), Сапсег ЬеЬегз 115: 1-7 (1997), 1. Меб. СЬет. 32: 834840 (1989), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Фармацевтически приемлемые соли

Используемый в настоящем документе термин фармацевтически приемлемые соли относится к общепринятым нетоксическим солям или солям четвертичного аммония агонистов КАК, например, из нетоксических органических или неорганических кислот. Эти соли могут быть получены ш з11и в способе производства среды для введения или лекарственной формы, или путем проведения отдельной реакции очищенного агониста КАК в форме его свободного основания или кислоты с подходящей органической или неорганической кислотой или основанием, и выделения образованной таким образом соли в ходе последующего очищения. Общепринятые нетоксические соли включают те, которые получают из таких неорганических кислот, как серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и подобное; и соли, полученные из органических таких кислот, как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, пальмитиновая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глютаминовая, бензойная, салициловая, сульфаниловая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изотионовая и подобное. Смотрите, например, Вегде е1 а1., РЬагтасеийса1 8аЬз, 1. РЬагт. §сь 66:1-19 (1977), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки в его полноте.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов репрезентативные соли включают в себя следующие соли: гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, фосфат, нитрат, ацетат, сукцинат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат и лаурилсульфонат и подобное.

Пролекарства

Используемый в настоящем документе термин пролекарство относится к соединениям, которые могут превращаться посредством определенных химических или физиологических способов (например, ферментативные способы и метаболический гидролиз) в агонист КАК. Таким образом, термин пролекарство также относится к предшественнику биологически активного соединения, который является фармацевтически приемлемым. Пролекарство может быть неактивным при введении субъекту, т.е. являться сложным эфиром, но оно превращается ш νίνο в активное соединение, например, путем гидролиза до свободной карбоновой кислоты или свободного гидроксила. Соединение-пролекарство часто предлагает преимущества в отношении растворимости, тканевой совместимости или замедленного высвобождения в организме. Предусматривается, что термин пролекарство также включает в себя любые связанные ковалентными связями носители, которые высвобождают активное соединение ш νίνο при введении такого пролекарства субъекту. Пролекарства активного соединения могут быть получены путем модификации функциональных групп, присутствующих в активном соединении таким образом, чтобы модификации отщеплялись, либо при рутинной манипуляции, либо ш νίνο, до исходного активного соединения. Пролекарства включают в себя соединения, причем гидрокси, амино или меркаптогруппа связана с

- 5 026251 любой группой так, что при введении пролекарства активного соединения субъекту, отщепляется для образования свободной гидрокси, свободной амино или свободной меркаптогруппы соответственно. Примеры пролекарств включают в себя без ограничения ацетатные, форматные и бензоатные производные спирта или ацетамидные, формамидные и бензамидные производные аминной функциональной группы в активном соединении и подобное. Смотрите Нагрег, Эгид йа(еп0а0оп в 1иекег, ей. Ргодгекк ίη Эгид Кекеагсй 4:221-294 (1962); ΜοΐΌζο\νίο1ι е( а1., АррПсаОоп оГ Рйук1са1 Огдашс Ргшщр1ек ίο Ргойгид Эейдп в Е. В. Косйе ей. Эейдп оГ Вюрйагтасеи0са1 Ргорегйек (йгоидй Ргойгидк апй Апа1одк, АРНА Асай. Рйагт. 8сг 40 (1977); ВюгеуеШЫе Сатегк ш Эгид ш Эгид Эейдц Тйеогу апй АррНсайоп, Е. В. Косйе, ей., АРНА Асай. Рйагт. 8ск (1987); Эейдп оГ Ргойгидк, Н. Випйдаагй, Е1кеу1ег (1985); \Уапд е( а1. Ргойгцд арргоасйек (о (йе ипргоуей йейуегу оГ рер11йе йгид в Сигг. Рйагт. Эейдп. 5(4):265-287 (1999); Раи1ей1 е( а1. (1997) 1тргоуетеп1 ш рерПйе йюауаПайПйу: РерОйоиптеОск апй Ргойгцд 8(га(ед1ек, Айу. Эгид. Эейуегу Кеу. 27:235-256; М^ζеη е( а1. (1998) Тйе Ике оГ Ек1егк ак Ргойгидк Гог Ога1 Оейуегу оГ в-йас(ат апййюйск, Рйагт. Вю(есй. 11:345-365; Са1дпаиЙ е( а1. (1996) Эейдшпд Ргойгидк апй Вюргесигкогк I. Сатег Ргойгидк Ргас(. Мей. Сйет. 671-696; Акдйагпе.)ай, 'Лтргоушд Ога1 Эгид Тгапкрой, в Тгапкрог( Ргосеккек ш Рйагтасеи0са1 8ук(етк, С. Ь. Атгйоп, Р. I. Ьее апй Е. М. Торр, Ейк., Магсе11 Эеккег, р. 185-218 (2000); Ва1ап( е( а1., Ргойгидк Гог (йе йтргоуетеШ оГ йгид айкогрОоп У1а йОГегеп( гои(ек оГ айш1тк1гайоп, Еиг. 1. Эгид Ме(ай. РйагтасокшеЕ, 15(2): 143-53 (1990); Вайтапе апй 8шко, 0гуо1уетеп( оГ тийгр1е (гапкрог(егк т 1йе ога1 айкогрОоп оГ пис1еоыйе апа1одиек, Айу. Эгид Эейуегу Кеу., 39(1-3): 183-209 (1999); Вгоупе, РокрйепуФш (Сегейух), С1ш. №игорйагтасо1. 20(1): 1-12 (1997); Випйдаагй, ВюгеуегыЫе йе^^νаί^ζаΐ^οη оГ йтдк-ргшар1е апй аррйсайййу (о итргоуе (йе (йегареиОс еГГес1к оГ йгидк, Агсй. Рйагт. Сйетг 86(1): 1-39 (1979); Випйдаагй Н. 1тргоуей йгид йейуегу йу (йе ргойгцд арргоасй, Соп(го11ей Эгид Эейуегу 17: 179-96 (1987); Випйдаагй Н. Ргойгидк ак а теапк (о итргоуе (йе йейуегу оГ рер11йе йгидк,АгГу. Эгид Эейуегу Кеу. 8(1): 1-38 (1992); НеЬйег е( а1. Отргоуей ога1 йгид йейуегу: ко1иЫ1йу ИтйаОопк оуегсоте йу (йе ике оГ ргойгидк, Айу. Эгид Оейуегу Кеу. 19(2): 115-130 (1996); Иетйег е( а1. Эеыдп оГ ргойгидк Гог Отргоуей дак(гспп(ек0па1 айкогрОоп йу 1п(ек0па1 еηζуте (агдейпд, Ме(йойк Еηζутο1. 112 (Эгид Еηζуте ТагдеОпд, Р1. А): 360-81, (1985); Ращийаг Ό, е( а1., Вю1одюа11у КеуегыЫе Рйокрйа(е-Рго(есОуе Сгоирк, Рйагт. 8е(, 72(3): 324-325 (1983); Ргеетап 8, е( а1., ВюгеуегыЫе Рго(есОоп Гог (йе Рйокрйо Сгоир: Сйетгса1 8(аЫИ(у апй Вй оасОуаОоп оГ ОИ4-асе(оху-йе1^у1) Ме(йу1рйокрйопа(е уйй Сагйохуек(егаке Сйет. 8ос., Сйет. Соттип., 875-877 (1991); Рглк апй Випйдаагй, Ргойгидк оГ рйокрйа(ек апй рйокрйопа(ек: Ыоуе1 ИрорйШс а1рйаасу1охуа1ку1 ек(ег йепуаОуек оГ рйокрйа(е- ог рйокрйопа(е соп(аОйпд йгидк такктд (йе педаОуе сйагдек оГ (йеке дгоирк, Еиг. 1. Рйагт. 8ск 4: 49-59 (1996); Сапд\\аг е( а1., Рго-йгид, то1еси1аг к(гис(иге апй регси(апеоик йейуегу, Эек. Вюрйагт. Ргор. Ргойгидк Апа1одк, [8утр.] МееОпд Эа(е 1976, 409-21. (1977); ЫаШуат апй ^оой, РетсШшк: а сиггеп( ге\ае\у оГ (йен с1писа1 рйагтасо1оду апй (йегареиОс ике, Эгпдк 45(6): 866-94 (1993); 8тйайайи апй Тйаккег, Ргойгидк оГ апОсапсег адеп(к, Айу. Эгид Эейуегу Кеу. 19(2): 241-273 (1996); 81е11а е( а1., Ргойгидк. Эо (йеу йауе айуап1адек ш сйтса1 ргасйсе?, Эгпдк 29(5): 455-73 (1985); Тап е( а1. Эеуе1ортеп( апй орОи'ШаОоп оГ ап0-Н1У пис1еоыйе апа1одк апй ргойгидк: А ге\ае\у оГ (йе1г се11и1аг рйагтасо1оду, к(гис(иге-асОуЦу ге1а0опк1йрк апй рйагтасоктейск, Айу. Эгид ЭеИуегу Кеу. 39(1-3): 117151 (1999); Тау1ог, Отргоуей раккгуе ога1 йгид йейуегу У1а ргойгидк, Айу. Эгид Эейуегу Кеу., 19(2): 131148 (1996); Уа1еп0по апй Вогсйагйр Ргойгцд к(га(ед1ек (о епйапсе (йе 0цек0па1 айкогрОоп оГ рерОйек, Эгид Эйсоуегу Тойау 2(4): 148-155 (1997); \У1ейе апй Кпаик, Сопсер(к Гог (йе йеыдп оГ ап0-Н1У пис1еоыйе ргойгидк Гог (геаОпд серйайс Н1У шГесйоп, Айу. Эгид Эейуегу Кеу.: 39(1-3):63-80 (1999); ^а11ег е( а1., Ргойгидк, Вг. 1. С1ш. Рйагтас. 28: 497-507 (1989), содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки в его полноте.

Фармацевтические композиции

Для введения субъекту агонисты КАК могут быть представлены в фармацевтически приемлемых композициях. Эти фармацевтически приемлемые композиции содержат терапевтически эффективное количество одного или нескольких агонистов КАК, составленных вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями (добавками) и/или разбавителями. Подробно описанные ниже фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть, в частности, приготовлены для введения в твердой или жидкой форме, включая в себя формы, адаптированные для следующего: (1) пероральное введение, например, кисели (водные или неводные растворы или суспензии), средства для зондового питания, леденцы, драже, капсулы, пилюли, таблетки (например, те, которые направлены для буккальной, сублингвальной и системной абсорбции), болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык; (2) парентеральное введение, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции в виде, например, стерильного раствора или суспензии, или состава с замедленным высвобождением; (3) местное нанесение, например, в виде крема, мази или пластыря с контролируемым высвобождением или наносимого на кожу спрея; (4) интравагинально или интраректально, например, в виде пессария, крема или пены; (5) сублингвально; (6) офтальмологически; (7) трансдермально; (8) трансмукозально или (9) назально. Кроме того, соединения могут быть имплантированными пациенту или введены с помощью инъекции с применением системы доставки лекарственного средства. Смотрите, например, игсцФагГ е( а1., Апп. Кеу. Рйагтасо1. Тохюо1. 24: 199-236 (1984); Ьеу1к, ей. Соп1го11ей Ке1еаке оГ Рекйсгйек апй Рйагтасеи0са1к (Р1епит Ргекк, №\у Уогк, 1981); патент США № 3773919

- 6 026251 и патент США № 353270960, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Используемый в настоящем документе термин фармацевтически приемлемый относится к тем соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые, по результатам тщательной медицинской оценки, являются подходящими для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, в соответствии с целесообразным соотношением риск/польза.

Используемый в настоящем документе термин фармацевтически приемлемый носитель означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или инертный носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, технологическое вспомогательное вещество (например, смазывающее средство, тальк, стеарат магния, кальция или цинка или стеариновая кислота) или инкапсулирующий растворитель материал, вовлеченный в переносе или транспортировке целевого соединения из одного органа или части организма к другому органу или части организма. Каждый носитель должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не вредным для пациента. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают в себя следующее: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) смазывающие средства, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк; (8) вспомогательные вещества, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль (РЕС); (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) забуференные растворы с определенным рН; (21) сложные полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; (22) объемообразующие средства, такие как полипептиды и аминокислоты; (23) компоненты сыворотки, такие как сывороточный альбумин, ΗΌΕ и ЬВЬ; (22) С₂-С_|2 спирты, такие как этанол; и (23) другие нетоксические совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах. В составе также могут присутствовать смачивающие средства, красители, контролирующие высвобождение средства, оболочки, подсластители, пищевые добавки, ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты. Такие термины, как вспомогательное вещество, носитель, фармацевтически приемлемый носитель или подобное, используются в настоящем документе взаимозаменяемо.

Используемая в настоящем документе фраза эффективное количество относится к количеству активного средства (например, агониста КАКу), достаточному для получения необходимого изменения или эффекта (например, примирование мезенхимальных стволовых клеток в направлении миогенной дифференцировки ίη νίίτο).

Используемая в настоящем документе фраза терапевтически эффективное количество означает такое количество соединения, материала или композиции, содержащей агонист КАК, которое является эффективным для получения некоторого необходимого терапевтического эффекта по меньшей мере в субпопуляции клеток у животного при целесообразном соотношении риск/польза, применимом для любого медицинского лечения. Например, количество вводимого субъекту агониста КАКу, которое является достаточным для получения статистически значимого, поддающегося измерению восстановления или регенерации мышц.

Используемый в настоящем документе термин восстановление относится к процессу, с помощью которого повреждения мышечной ткани ослабляются или полностью устраняются. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один симптом повреждения мышечной ткани ослабляется по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%. Симптомы мышечного повреждения описаны, например, в 8кс1с1а1 Ми8с1е Иатаде апб Кераи Тйбик, Р.М., еб., Нитап Кшебск (2008), содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах способности специалистов в настоящей области техники. Как правило, терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от анамнеза, возраста, состояния, пола субъекта, а также тяжести и типа медицинского состояния у субъекта, и введения других фармацевтически активных средств.

Используемый в настоящем документе термин вводить относится к введению композиции субъекту с помощью способа или пути, который дает в результате, по меньшей мере, частичную локализацию композиции в необходимом месте так, чтобы произвести необходимый эффект. Пути введения, подходящие для способов по настоящему изобретению, включают в себя как местное, так и системное введение. Как правило, местное введение приводит к тому, что большее количество агониста КАК (или обработанных агонистом КАК клеток) доставляется к конкретному участку по сравнению со всем организ- 7 026251 мом субъекта, тогда как, системное введение приводит к доставке агониста КАК (или обработанных агонистом КАК клеток), по существу, ко всему организму субъекта. Одним способом местного введения является введение с помощью внутримышечной инъекции.

В контексте введения обработанной агонистом КАК клетки термин введение также включает в себя трансплантацию такой клетки субъекту. Используемый в настоящем документе термин трансплантация относится к способу имплантации или переноса по меньшей мере одной клетки субъекту. Термин трансплантация включает в себя, например, аутотрансплантацию (удаление и перенос клетки(ок) из одного участка на пациенте в тот же или другой участок на том же пациенте), аллотрансплантацию (трансплантацию между представителями одного вида) и ксенотрансплантацию (трансплантации между представителями различных видов). Специалисту в настоящей области техники хорошо известны способы имплантации или трансплантации мезенхимальных стволовых клеток для восстановления и регенерации мышц, которые пригодны для настоящего изобретения. Смотрите, например, патент США № 7592174 и патентную публикацию США № 2005/0249731, содержания которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Более того, агонист КАК может быть приготовлен в форме мазей, кремов, порошков или других составов, подходящих для местных составов. Поскольку молекулярная масса агонистов КАК, как правило, меньше чем 500 дальтон, то эти составы могут доставлять агонист из кожи к лежащей глубже мышечной ткани. Соответственно такие составы могут содержать одно или несколько средств, которые усиливают проникновение активного ингредиента через кожу. Для местных нанесений агонист КАК может быть включен в раневые повязки и/или покрывающие кожу композиции.

Описанное в настоящем документе соединение или композиция может быть введена любым подходящим путем, известным в настоящей области техники, включающим в себя без ограничения местные или парентеральные пути, включающие в себя внутривенное, внутримышечное, подкожное, трансдермальное, респираторное (аэрозольное), пульмонарное, назальное, ректальное и местное (включающее в себя буккальное и сублингвальное) введение.

Типичные способы введения включают в себя без ограничения инъекцию, инфузию, инстилляцию, ингаляцию или прием внутрь. Инъекция включает в себя без ограничения внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, интравентрикулярную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, внутрикожную, внутрисуставную, подкапсулярную, подпаутинную, интраспинальную, интрацереброспинальную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Согласно предпочтительным вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов композиции вводят с помощью внутривенной инфузии или инъекции.

Используемый в настоящем документе термин субъект означает человека или животного. Обычно животное представляет собой позвоночное, такое как примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. Приматы включают в себя шимпанзе, яванских макак, паукообразных обезьян и макак, например, резус. Грызуны включают в себя мышей, крыс, лесных сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают коров, лошадей, свиней, оленя, бизона, буйвола, виды семейства кошачьих, например, домашнюю кошку, виды семейства псовых, например, собаку, лису, волка, виды птиц, например, курицу, эму, страуса, и рыбу, например, форель, сом и лосось. Пациент или субъект включает в себя любой подкласс вышеперечисленного, например, все из указанных выше, за исключением одной или нескольких групп или видов, таких как люди, приматы или грызуны. Согласно определенным вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов субъект является млекопитающим, например приматом, например человеком. Термины пациент и субъект в настоящем документе используются взаимозаменяемо. Субъект может быть мужского или женского пола.

Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающее может быть человеком, не относящимся к человеку приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, без ограничения этими примерами. Млекопитающие, отличные от человека, могут быть предпочтительно использованы в качестве субъектов, которые представляют животные модели нарушений, связанных с аутоиммунным заболеванием или воспалением. Кроме того, описанные в настоящем документе способы и композиции могут быть использованы для лечения одомашненных животных и/или домашних животных.

Субъект может быть субъектом, у которого ранее диагностировали или определили как страдающего или обладающего нарушением, характеризующимся мышечным повреждением или мышечной атрофией/истощением.

Субъект может быть субъектом, который не получает в настоящий момент лечение с помощью агониста КАК.

Субъект может быть субъектом, у которого ранее диагностировали заболевание, которое лечат с помощью терапевтического режима, содержащего агонист КАК, причем заболевание не является заболеванием, характеризующимся мышечным повреждением или мышечной атрофией/истощением.

Соответственно согласно некоторым вариантам осуществления способ лечения предусматривает регулирование терапевтического режима субъекта так, чтобы снижался по меньшей мере один симптом

- 8 026251 мышечного повреждения. Без ограничения терапевтический режим может быть отрегулирован путем модулирования частоты введения КАК и/или путем изменения участка или способа введения.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов способ дополнительно предусматривает диагностику субъекта в отношении мышечного повреждения или мышечной атрофии/истощения перед лечением субъекта для восстановления или регенерации мышц.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов способ дополнительно предусматривает выбор субъекта с мышечным повреждением или мышечной атрофией/истощением перед лечением субъекта для восстановления или регенерации мышц.

Комбинированная терапия

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов агонист КАК вводят субъекту вместе с терапией, выбранной из массажа, воздействия ультразвука, гипербарической доставки кислорода. В дополнение и/или альтернативно, агонист КАК может быть введен субъекту в комбинации с фармацевтически активным средством. Типичное фармацевтически активное соединение включает без ограничения те, которые можно найти в Наткои'к Ргтар1ек οί йИегий Мелете, 13*Εάίΐίοη, Εάδ. Т.К. Наткой е1 а1. МсОга\\-НП1 Ν.Υ., ΝΥ; РЬукЫаик Эекк Кекегеиее, 50* Εάίΐίοη, 1997, Огайе11 Νον 1егкеу, МеЙ1са1 Есоиотюк Со.; РЬагтасо1одюа1 Вак1к οί ТЬегареийск, 8* Εάίΐίοη, Ооойтаи ηηά Ойтаи, 1990; υи^ΐеά δΐаΐек Рйагтасоре1а, ТЬе №йоиа1 Рогти1агу, И8Р XII ΝΡ XVII, 1990; текущее издание Оοοάтаη аЮ Ойтаи'к ТЬе РЬагтасо1одюа1 Вак1к οί ТЬегареийск; и текущее издание ТЬе Мегск Iηάеx, полное содержание которых включено в настоящий документ в его полноте.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов фармацевтически активное средство включает средства, известные в настоящей области техники для лечения воспаления или связанными с воспалениями нарушений или инфекций. Типичные противовоспалительные средства включают в себя без ограничения нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (ГОАГО - такие как аспирин, ибупрофен или напроксен, кортикостероиды (такие как презнизон), противомалярийное лекарственное средство (такое как гидрохлорохин), метотрексат, сульфасалазин, лефлуномид, анти-ТОТ¹ лекарственные средства, циклофосфамид и микофенолат.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов фармацевтически активное средство представляет собой фактор роста. Типичные факторы роста включают в себя без ограничения следующее: факторы роста фибробластов (ΡΟΡ), ΡΟΡ-1, ΡΟΡ-2, ΡΟΡ-4, тимозины, плазмоцитарные факторы роста (РЭОР). связывающие инсулин факторы роста (ЮР), ЮР-1, ЮР-2, эпидермальный фактор роста (ΕΟΡ), трансформирующий фактор роста (ТОР), ТОР-альфа, ТОР-бета, хрящевой индуцирующий фактор-А и -В, остеоидные индуцирующие факторы, остеогенин, морфогенные протеины кости и другие факторы роста кости, коллагеновые факторы роста, связывающий гепарин фактор роста-1 или -2 и их биологически активные производные.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов фармацевтически активное средство представляет собой средства анти-интерферона. Без ограничения средства анти-интерферона включают антитела к интерферону или их фрагменты или производные. Типичные антитела к интерферону включают в себя без ограничения те, которые описаны в КоииЫот, Ь. & Ε11<οιτ, К.В. СуЮктек ак Шегареийс 1агде1к ш δί·Ε. №ιΙ Кеу РЬеита1о1 6, 339-647; Υаο, Υ. еΐ а1. №и1гаЬ/аСои οί 1йейегои-а1рЬа/Ье1а-1Ыис1Ые деиек аЮ άονηкΐ^еат еГГес! ш а рЬаке I йгта1 οί аи аи11-1и1егГегои-а1рЬа тоиос1оиа1 аиΐ^Ьοάу ш кукЮпис 1ирик егуЙютаЮкик. Аг1Ьг1Ск КЬеит 60, 1785-96 (2009); и 2адшу, Ό. еΐ а1. КМйрЬа 1<ίιτοίά νасс^ηе-^ηάисеά иейгаЬ/тд аηйЬοά^ек ргеуей сйтса1 таийейайоик ш а 1ирик йаге тигше тοάе1. Ргос №ιΐ1 Асаά δα И8А 106, 5294-9 (2009), те, которые описаны в патенте США № 4902618; № 5055289; № 7087726 и № 7741449, и те, которые описаны в патентной публикации США № 10/440202; № 11/342020 и № 12/517334, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов фармацевтически активное средство представляет собой фенотерол или инсулиноподобный фактор роста-1.

Агонист КАК и фармацевтически активное средство могут быть введены субъекту в одной фармацевтической композиции или в различных фармацевтических композициях (в одно время или в разные моменты времени). При введении в различные моменты времени агонист КАКу и фармацевтически активное средство могут быть введены в пределах 5 мин, 10 мин, 20 мин, 60 мин, 2 ч, 3 ч, 4, ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч от введения другого средства. Когда агонист КАК и фармацевтически активное средство вводят в различных фармацевтических композициях, то пути введение могут быть различными.

Дозировка

Количество агониста КАК, которое могут комбинировать с материалом носителя для получения лекарственной формы для однократного введения, будет, как правило, таким количеством агониста КАК, которое производит терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов, это количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 до 99% агониста КАК, предпочтительно от приблизительно 5% до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от 10% до приблизительно 30%.

Токсичность и терапевтическая эффективность могут быть определены с помощью стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения ΕΌ50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ΕΌ50 (дозы, терапевтически эффективной

- 9 026251 у 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и он может быть выражен как соотношение ΕΌ50/ΕΌ50. Композиции, которые проявляют большие терапевтические индексы, являются предпочтительными.

Используемый в настоящем документе термин ΕΌ обозначает эффективную дозу и используется в связи с животными моделями. Термин ЕС обозначает эффективную концентрацию и используется в связи с животными моделями.

Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы для составления диапазона дозировки для применения у людей. Дозировка таких соединений находится предпочтительно в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ΕΌ50 с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может варьировать в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения.

Терапевтически эффективная доза может быть оценена изначально на основании анализов клеточных культур. Доза может быть сформулирована на животных моделях для достижения диапазона циркулирующей концентрации в плазме, которая включает в себя 1С50 (т.е. концентрацию терапевтического средства, которая достигает половины от максимального ингибирования симптомов), что определяется в клеточной культуре. Содержания в плазме могут быть измерены, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Эффекты любой конкретной дозировки могут подвергаться мониторингу с помощью подходящего биоанализа.

Дозировка может быть определена лечащим врачом и отрегулирована при необходимости, чтобы соответствовать наблюдаемым эффектам лечения. Как правило, композиции вводят так, чтобы агонист ΚΑΚγ вводили в дозе от 1 мкг/кг до 150 мг/кг, 1 мкг/кг до 100 мг/кг, 1 мкг/кг до 50 мг/кг, 1 мкг/кг до 20 мг/кг, 1 мкг/кг до 10 мг/кг, 1 мкг/кг до 1 мг/кг, 100 мкг/кг до 100 мг/кг, 100 мкг/кг до 50 мг/кг, 100 мкг/кг до 20 мг/кг, 100 мкг/кг до 10 мг/кг, 100мкг/кг до 1 мг/кг, 1 мг/кг до 100 мг/кг, 1 мг/кг до 50 мг/кг, 1 мг/кг до 20 мг/кг, 1 мг/кг до 10 мг/кг, 10 мг/кг до 100 мг/кг, 10 мг/кг до 50 мг/кг, или 10 мг/кг до 20 мг/кг. Следует понимать, что представленные в настоящем документе диапазоны включают все промежуточные диапазоны, например, диапазон 1 мг/кг до 10 мг/кг включает в себя 1 мг/кг до 2 мг/кг, 1 мг/кг до 3 мг/кг, 1 мг/кг до 4 мг/кг, 1 мг/кг до 5 мг/кг, 1 мг/кг до 6 мг/кг, 1 мг/кг до 7 мг/кг, 1 мг/кг до 8 мг/кг, 1 мг/кг до 9 мг/кг, 2 мг/кг до 10 мг/кг, 3 мг/кг до 10 мг/кг, 4мг/кг до 10 мг/кг, 5 мг/кг до 10 мг/кг, 6 мг/кг до 10 мг/кг, 7 мг/кг до 10мг/кг, 8 мг/кг до 10 мг/кг, 9 мг/кг до 10 мг/кг и подобное. Следует также понимать, что диапазоны, являющиеся промежуточными для представленных выше, также находятся в пределах настоящего изобретения, например, в диапазоне 1 мг/кг до 10 мг/кг, доза находится в таком диапазоне, как 2 мг/кг до 8 мг/кг, 3 мг/кг до 7 мг/кг, 4 мг/кг до 6 мг/кг и подобное.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиции вводят в такой дозировке, что агонист КАК или его метаболит характеризуется ίη νίνο концентрацией менее чем 500 нМ, менее чем 400 нМ, менее чем 300 нМ, менее чем 250 нМ, менее чем 200 нМ, менее чем 150 нМ, менее чем 100 нМ, менее чем 50 нМ, менее чем 25 нМ, менее чем 20, нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 0,5 нМ, менее чем 0,1 нМ, менее чем 0,05, менее чем 0,01, нМ, менее чем 0,005 нМ, менее чем 0,001 нМ через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч, 3 ч, 4 ч, 5 ч, 6 ч, 7 ч, 8 ч, 9 ч, 10 ч, 11 ч, 12 ч или более времени введения.

В отношении длительности и частоты лечения, как правило, врачи-клиницисты наблюдают за субъектами для определения, когда лечение обеспечивает терапевтическую пользу, и для определения, увеличивать или уменьшать дозировку, увеличивать или уменьшать частоту введения, прервать лечение, возобновить лечение или произвести другое изменение в режиме лечения. Схема дозировки может варьировать от одного раза в неделю до ежедневного введения в зависимости от ряда клинических факторов, таких как чувствительность субъекта к агонисту КАК.

Необходимая доза может быть введена каждый день или каждый третий, четвертый, пятый или шестой день. Необходимая доза может быть введена однократно или быть разделенной на поддозы, например, 2-4 поддозы, и введена в течение период времени, например, с подходящими интервалами через день или по другой подходящей схеме. Такие поддозы могут быть введены как унифицированные лекарственные формы. Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе аспектов введение является хроническим, например, одна или несколько доз ежедневно в течение периода времени, составляющего недели или месяцы. Примеры схем дозировки представляют собой введение ежедневно, дважды в день, трижды в день или четыре или более раз в день в течение периода, составляющего 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев или 6 месяцев или более.

Согласно одному варианту осуществления введение агониста КАК субъекту в описанных в настоящем документе способах осуществляют за один или несколько раз. Согласно одному варианту осуществления однократное введение или многократное введение осуществляют за период времени обнаруживаемой повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида, которая возникает естественно ίη νίνο в ответ на повреждение (например, причиненное повреждение или физиологическое изменение, которое приводит к мышечному повреждению) мышечной ткани (например, в день 4 или день 5 после нанесения повреждения). Согласно одному варианту осуществления введение включает в себя один раз, который

- 10 026251 имеет место вначале периода времени. Согласно одному варианту осуществления введение включает в себя несколько раз, которые имеют место в пределах определенного периода времени. Согласно одному варианту осуществления введение имеет место или включает в себя один раз, который имеет место после периода времени, который происходит больше, чем через 3 дня после возникновения повреждения. Согласно одному варианту осуществления введение имеет место или включает в себя один раз, который происходит приблизительно через 4 дня после возникновения повреждения. Согласно одному варианту осуществления введение имеет место или включает в себя один раз, который происходит приблизительно через 5 дней после возникновения повреждения. Согласно одному варианту осуществления введение имеет место или включает в себя один раз, который происходит приблизительно через 6 дней после возникновения повреждения. Согласно одному варианту осуществления введение имеет место или включает в себя один раз, который происходит приблизительно через 7, или приблизительно 8 дней после возникновения повреждения. Также предусматриваются комбинации этих количеств ведения. Например, введение приблизительно в день 4 и затем в один или несколько из следующих дней 5, 6, 7 и 8. Согласно одному варианту осуществления введение имеет место приблизительно в день 5 и день 7. Может быть также проведено продолжительное введение в течение пролонгированного периода времени (например, до получения удовлетворительного выздоровления).

Согласно одному варианту осуществления введение перекрывает или включает в себя период времени повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида (например, введение начинается до повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида и продолжается в этот период и/или в течение этого периода). Согласно одному варианту осуществления от введения воздерживаются до повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида в ответ на повреждение мышечной ткани (например, введение начинают после дня 3 или в день 4, 5, 6, 7, 8 или 9 или позже). Согласно одному варианту осуществления введение начинают после дня 3 (например, дня 4 или 5), и продолжают вплоть до по меньшей мере дня 9 (например, до дня 11). Согласно одному варианту осуществления введение осуществляют каждый день или через день в течение указанных периодов времени введения. Согласно одному варианту осуществления введение осуществляют по меньшей мере в день 5, 7 и 9.

Предварительно обработанные стволовые клетки

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к популяции стволовых клеток, причем популяцию получают путем контактирования по меньшей мере одной стволовой клетки с эффективным количеством агониста КАК. Используемый в настоящем документе термин популяция стволовых клеток означает одну или несколько стволовых клеток. Такие стволовые клетки могут быть выделены (например, для контактирования ίη νίίτο или ех νίνο). Такое контактирование позволяет клеткам регенерировать мышечную ткань, а также поддерживать миогенную дифференциацию других клеток (например, клеток хозяина, которому вводят предварительно обработанные клетки). Согласно одному варианту осуществления контактирование осуществляется с агонистом ΚΑΚγ, для выделения мезенхимальных стволовых клеток, для обеспечения этой способности. Согласно одному варианту осуществления предварительная обработка осуществляется ίη νίίτο и занимает по меньшей мере приблизительно 3 дня. Хотя более короткие периоды предварительной обработки (например, 2,5 дня, 2 дня, 1,5 дня, 1 день, 12 ч) могут также произвести сходные возможности. Такие предварительно обработанные клетки, которые индуцируются таким образом, называют в настоящем документе предварительно обработанные. Все описанные в настоящем документе предварительно обработанные клетки включены в настоящее изобретение.

Термин контактирование или контакт, используемый в настоящем документе в связи с контактированием стволовой клетки, включает в себя воздействие на стволовую клетку подходящими культуральными средами, которые содержат агонист КАК. Стволовая клетка может быть приведена в контакт с агонистом КАК в клеточной культуре, например, ίη νίίτο или ех νίνο. Используемый в настоящем документе термин ех νίνο относится к клеткам, которые удаляют из живого организма и культивируют вне организма (например, в пробирке для анализа). Ех νίνο клетки могут затем быть введены при модификации донору.

Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов настоящего изобретения стволовая клетка представляет собой стволовую клетку человека. Согласно некоторым вариантам осуществления стволовая клетка представляет собой плюрипотентную или мультипотентную стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам осуществления стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (ίΡδ) клетку или стабильно перепрограммированную клетку, которая представляет собой промежуточную плюрипотентную стволовую клетку и может быть дополнительно перепрограммированной в ίΡδ клетку, например, частичные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (также имеющие название ρίΡδ клетки). Согласно некоторым вариантам осуществления плюрипотентная стволовая клетка, 1Р8С или р1Р§С представляет собой генетически модифицированную плюрипотентную стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам осуществления стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку.

Как правило, стволовая клетка для применения в способах, анализах, системах, наборах и для создания оценочных листов может быть получена или может происходить из любого доступного источника.

- 11 026251

Соответственно стволовая клетка может быть получена или может происходить из позвоночного или беспозвоночного. Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения стволовая клетка представляет собой стволовую клетку млекопитающего.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения стволовая клетка представляет собой стволовую клетку примата или грызуна.

Согласно некоторым вариантам осуществления аспектов настоящего изобретения стволовую клетку выбирают из группы, состоящей из следующего: стволовая клетка шимпанзе, яванского макака, паукообразной обезьяны, макака (например, макака-резуса), мыши, крысы, лесного сурка, хорька, кролика, хомяка, коровы, лошади, свиньи, оленя, бизона, буйвола, представителя семейства кошачьих (например, домашней кошки), представителя семейства псовых (например, собаки, лисы и волка), птицы (например, курицы, эму и африканского страуса) и рыбы (например, форели, сома и лосося).

Используемый в настоящем документе термин дифференциация относится к клеточному развитию клетки от незрелой стадии в направлении более зрелой (т.е. менее незрелой) клетки.

Используемый в настоящем документе термин индуцированная плюрипотентная стволовая клетка или 1Р8С или ίΡδ клетка относится к клетке, полученной из полной реверсии или перепрограммирования состояния дифференцировки дифференцированной клетки (например, соматической клетки). Используемая в настоящем документе термин 1Р8С представляет собой полностью перепрограммированную клетку и представляет собой клетку, которая подверглась полному эпигенетическому перепрограммированию.

Используемый в настоящем документе термин перепрограммирование относится к способу, который изменяет или меняет направление на обратное состояние дифференцировки дифференцированной клетки (например, соматической клетки). Другими словами, перепрограммирование относится к способу направления дифференцировки клетки обратно к более недифференцированному или более незрелому типу клетки. Полное перепрограммирование включает полную реверсию, по меньшей мере, некоторых их наследственных паттернов модификации нуклеиновой кислоты (например, метилирование), конденсации хроматина, эпигенетических изменений, геномного импринтинга и т.д., которые возникают в ходе клеточной дифференцировки, когда зигота развивается во взрослую форму. Перепрограммирование отличается от простого поддержания существующего недифференцированного состояния клетки, которая уже является плюрипотентной или поддержания существующего менее чем полностью дифференцированного состояния клетки, которая уже является мультипотентной клеткой (например, гематопоэтическая стволовая клетка). Перепрограммирование также отличается от стимуляции самообновления или пролиферации клеток, которые уже являются плюрипотентными или мультипотентными, хотя композиции и способы настоящего изобретения могут также быть использованы для таких целей.

Используемый в настоящем документе термин стабильно перепрограммированная клетка относится к клетке, которую получают из частичного или неполного перепрограммирования дифференцированной клетки (например, соматической клетки). Стабильно перепрограммированная клетка используется взаимозаменяемо в настоящем документе с р1Р8С. Стабильно перепрограммированная клетка не подверглась полному перепрограммированию и, таким образом, не характеризовалась глобальным ремоделированием эпигенома клетки. Стабильно перепрограммированная клетка представляет собой плюрипотентную стволовую клетку, и она может быть дополнительно перепрограммирована в 1Р8С, как этот термин определен в настоящем документе, или альтернативно может быть дифференцирована по различным линиям. Согласно некоторым вариантам осуществления частично перепрограммированная клетка экспрессирует маркеры из всех трех эмбриональных зародышевых листков (т.е. всех трех листков эндодермальных, мезодермальных или эктодермальных листков). Маркеры эндодермальных клеток включают в себя Са!а4, РохЛ2, ΡΌΧ1, Ыоба1, 8ох7 и 8ох17. Маркеры мезодермальных клеток включают в себя Вгасйусшу, С8С, ЬЕР1, Мох1 и Пс1. Маркеры эктодермальных клеток включают в себя спрЮк ΕΝ1, СРЛР, ΙδΙοΙ 1, Ь1М1 и Νβδίίη. Согласно некоторым вариантам осуществления частично перепрограммированная клетка представляет собой недифференцированную клетку.

Термин ремоделирование эпигенома относится к химическим модификациям генома, которые не изменяют геномную последовательность или генную последовательность пар оснований в клетке, но изменяют экспрессию.

Термин глобальное ремоделирование эпигенома относится к событиям, где происходят химические модификации генома, где отсутствует память о предыдущей экспрессии гена из дифференцированной клетки, из которой получают перепрограммированную клетку или 1Р8С.

Термин неполное ремоделирование эпигенома относится к событию, где происходит химические модификации генома, где существует память о предыдущей геномной экспрессии гена из дифференцированной клетки, из которой получают стабильно перепрограммированную клетку или р|Р8С.

Используемая в настоящем документе термин эпигенетическое перепрограммирование относится к изменению паттерна генной экспрессии в клетке посредством химических модификаций, которые не изменяют геномную последовательность или генную последовательность пар оснований в клетке.

Используемый в настоящем документе термин эпигенетический относится к выражению на основании генома. Химические модификации ДНК, которые не изменяют генную последовательность, но

- 12 026251 воздействуют на генную экспрессию и также могут наследоваться. Эпигенетические, также имеющие название посттрансляционные модификации или РТМ в отношении ДНК являются важными, например, в импринтинге и клеточном перепрограммировании. Эти модификации включают в себя, например, ДНК метилирование, убиквитинилирование, фосфорилировнаие, гликозилирование, сумоилирование, ацетилирование, δ-нитрозилирование или нитрозилирование, цитруллирование или деиминацию, неддилирование, Θί'ΊοΝΛο. ΛΌΡ-рибозилирование, гидроксилирование, прикрепление ГаНО, прикрепление Шт1 (модификатор укладки убиквитина), пренилирование, миристиолирование, 8-пальмитоилирование, тирозиновую сульфатацию, формилирование и карбоксилирование.

Используемая в настоящем документе термин плюрипотентная относится к клетке со способностью, при а различных условиях, дифференцироваться в клеточные типы, характерные для всех трех зародышевых клеточных листков (эндодерма, мезодерма и эктодерма). Плюрипотентные клетки характеризуются, в первую очередь, их способностью дифференцироваться во все три зародышевых листка, с использованием, например, анализа образования тератомы у голых мышей. Плюрипотентность также подтверждается с помощью экспрессии маркеров эмбриональных стволовых (Е§) клеток, хотя предпочтительным тестом на плюрипотентность является демонстрация способности дифференцироваться в клетки каждого из трех зародышевых листков. Согласно некоторым вариантам осуществления плюрипотентная клетка представляет собой недифференцированную клетку.

Используемый в настоящем документе термин плюрипотентность или плюрипотентное состояние относится к клетке со способностью дифференцироваться во все три эмбриональных зародышевых листка: эндодерму (ткань пищеварительного тракта), мезодерму (включающую в себя кровь, мышцы и сосуды) и эктодерму (например, кожу и нервы) и, как правило, характеризуется потенциалом к делению ίη νίίτο в течение длительного периода времени, например, больше чем один год или более чем 30 пассажей.

Термин мультипотентные при применении в отношении мультипотентной клетки относится к клетке, которая способна дифференцироваться в несколько, но не все из клеток, происходящих из всех трех зародышевых листков. Таким образом, мультипотентная клетка представляет собой частично дифференцированную клетку. Мультипотентные клетки являются хорошо известными в настоящей области техники, и примеры мультипотентных клеток включают в себя взрослые стволовые клетки, такие как например, гематопоэтические стволовые клетки и нейрональные стволовые клетки. Мультипотентная означает, что стволовая клетка может образовывать многие типы клеток в данной линии, но не клетки других линий. Например, мультипотентная стволовая клетка крови может образовывать многие различные типы клеток крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и т.д.), но не может образовывать нейроны.

Термин мультипотентность относится к клетке со степенью универсальности возможностей развития, которая меньше, чем у тотипотентных и плюрипотентных клеток.

Термин тотипотентность относится к клетке со степенью дифференцировки, описывающей способность создавать все клетки взрослого организма, а также экстраэмбриональные ткани, включающие в себя плаценту. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота) является тотипотентной, равно как и ранние отщепленные клетки (бастомеры).

Термин дифференцированная клетка означает любую первичную клетку, которая не является, в своей нативной форме, плюрипотентной, как этот термин определен в настоящем документе. Термин дифференцированная клетка также включает в себя клетки, которые являются частично дифференцированными, такие как мультипотентные клетки, или клетки, которые являются стабильно неплюрипотентными частично перепрограммированными клетками. Следует отметить, что помещение многих первичных клеток в культуру может привести к некоторой утрате полностью дифференцированных характеристик. Таким образом, простое культивирование таких клеток включено в термин дифференцированные клетки и не представляет эти не являющиеся дифференцированными клетки (например, недифференцированные клетки) или плюрипотентные клетки. Переход дифференцированной клетки в состояние плюрипотентности нуждается в стимуле перепрограммирования помимо стимулов, которые приводят к частичной утрате дифференцированного характера культуры. Перепрограммированные клетки также обладают характерной способностью к пролонгированному пассированию без прекращения потенциала роста, по отношению к клеткам, исходным для первичной клетки, которые, как правило, характеризуются способностью только к ограниченному числу делений в культуре. Согласно некоторым вариантам осуществления термин дифференцированная клетка также относится к клетке более специализированного клеточного типа, полученной из клетки менее специализированного клеточного типа (например, из недифференцированной клетки или перепрограммированной клетки), где клетка подверглась процессу клеточной дифференцировки.

Используемый в настоящем документе термин соматическая клетка относится к любой клетке, отличной от зародышевой клетки, клетке, присутствующей или полученной из предимплантационного зародыша, или клетке, которая является результатом пролиферации такой клетки ίη νίίτο. Другими словами, соматическая клетка относится к любым клеткам, образующим тело организма, в отличие от зародышевых клеток. У млекопитающих зародышевые клетки (также известные как гаметы) представляют собой сперматозоиды и яйцеклетки, которые сливаются в ходе оплодотворения для получения клетки,

- 13 026251 называемой зиготой, из которой развивается весь зародыш млекопитающего. Каждый другой клеточный тип в теле млекопитающего, за исключением сперматозоидов и яйцеклеток, клеток, из которых они происходят (гаметоцитов) и недифференцированных стволовых клеток, представляет собой соматическую клетку: внутренние органы, кожа, кости, кровь и соединительная ткань, все они состоят из соматических клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления соматическая клетка представляет собой неэмбриональную соматическую клетку, под которой подразумевается соматическая клетка, которая не присутствует или получена из зародыша и не является результатом пролиферации такой клетки ίη νίΐτο. Согласно некоторым вариантам осуществления соматическая клетка представляет собой взрослую соматическую клетку, под которой подразумевают клетку, которая присутствует или получена из организма, отличного от зародыша или плода или является результатом пролиферации такой клетки ίη νίΐτο. Если не указано иное, способы перепрограммирования дифференцированной клетки может быть проведен как ίη νίνο, так и ίη νίΐτο (где ίη νίνο используют на практике, когда дифференцированная клетка присутствует внутри субъекта, и где ίη νίΐτο применяют на практике с использованием выделенной дифференцированной клетки, содержащейся в культуре). Согласно некоторым вариантам осуществления, где дифференцированную клетку или популяцию дифференцированных клеток культивируют ίη νίΐτο, дифференцированная клетка может быть культивирована в органотипической культуре срезов, такой, которая как описана, например, в Μοηοβίκΐ-Ροζζο с1 а1., (2004), Се11 Т188ие Кее, 316(3);295-303, которая включена в настоящий документ в его полноте посредством ссылки.

Используемый в настоящем документе термин взрослая клетка относится к клетке, обнаруживаемой по всему организму после эмбрионального развития.

В контексте клеточной онтологии термин дифференцироваться или дифференцировка представляет собой относительный термин, означающий, что дифференцированная клетка представляет собой клетку, которая развилась еще дальше по пути развития, чем ее клетка-предшественник. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления перепрограммированная клетка, как этот термин определен в настоящем документе, может дифференцироваться до клеток-предшественников с линиеспецифической рестрикцией (таких как мезодермальная стволовая клетка), которые, в свою очередь, могут дифференцироваться в другие типы клеток-предшественником еще дальше по этому пути (такие как тканеспецифический предшественник, например, предшественник кардиомиоцита), и затем до дифференцированной клетки на конечной стадии, которая играет характерную роль в определенном тканевом типе, и может сохранять или нет способность пролиферировать далее.

Термин эмбриональные стволовая клетка используют для обозначения плюрипотентных стволовых клеток внутренней клеточной массы эмбриональной бластоцисты (смотрите патенты США № 5843780, 6200806, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Такие клетки могут аналогично быть получены из внутренней клеточной массы бластоцист, полученных из переноса ядра соматической клетки (смотрите, например, патенты США № 5945577, 5994619, 6235970, которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Отличительные характеристики эмбриональной стволовой клетки определяют фенотип эмбриональной стволовой клетки. Соответственно клетка характеризуется фенотипом эмбриональной стволовой клетки, если она обладает одной или несколькими из уникальных характеристик эмбриональной стволовой клетки, такие, чтобы клетку можно было отличить от других клеток. Типичные отличительные характеристики эмбриональной стволовой клетки включают в себя без ограничения профиль генной экспрессии, пролиферативную способность, способность к дифференцировке, кариотип, чувствительность к конкретным условиям культивирования и подобное.

Термин фенотип относится к одной или ряду общих биологических характеристик, которые определяют клетку или организм при конкретном наборе условий и факторов окружающей среды, вне зависимости от фактического генотипа.

Используемая в настоящем документе термин выделенная клетка относится к клетке, которая была выделена из организма, в котором она исходно обнаруживается, или потомку такой клетки. Необязательно клетку культивировали ίη νίΐτο, например, в присутствии других клеток. Необязательно позже клетку вводили во второй организм или повторно вводили в организм, из которого она (или клетка, из которой она происходит) была выделена.

Используемый здесь термин выделенная популяция в отношении к выделенной популяции клеток относится к популяции клеток, которую выделили и отделили от смешанной или гетерогенной популяции клеток. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенная популяция представляет собой по существу чистую популяцию клеток по сравнению с гетерогенной популяцией, из которой клетки были выделены или обогащены.

Термин по существу чистый по отношению к конкретной клеточной популяции относится к популяции клеток, которая является по меньшей мере приблизительно на 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95% чистой по отношению к клеткам, составляющим общую клеточную популяцию. Иными словами, термины по существу чистый или по существу очищенный по отношению к популяции клеток относятся к популяции клеток, которая содержит меньше чем приблизительно 20%, более предпочтительно меньше чем приблизительно 15%, 10%,

- 14 026251

8%, 7%, наиболее предпочтительно меньше чем приблизительно 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее чем 1% клеток, которые не являются указанными клетками или их потомством, как определено терминами в настоящем документе.

Термины обогащение или обогащенный используются взаимозаменяемо в настоящем документе и означают, что выход (фракция) клеток одного типа увеличивается по меньшей мере на 10% выше фракции клеток этого типа в исходной культуре или препарате.

Термины обновление, или самообновление, или пролиферация используются взаимозаменяемо в настоящем документе и относятся к способу создания клеткой большего количества копий самой себя (например, дупликации) клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления перепрограммированные клетки способны обновлять себя путем деления в такие же недифференцированные клетки (например, плюрипотентный или неспециализированный тип клеток) в течение продолжительных периодов, и/или от многих месяцев до многих лет. В некоторых случаях пролиферация относится к распространению перепрограммированных клеток с помощью повторного деления отдельных клеток на две одинаковые дочерние клетки.

Термин среда для клеточной культуры (также имеющая название в настоящем документе культуральная среда или среда) согласно настоящему документу представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую питательные вещества, которые сохраняют жизнеспособность клеток и поддерживают пролиферацию. Среда для клеточной культуры может содержать любое из следующего в подходящей комбинации: соль(и), буфер(ы), аминокислоты, глюкоза или другой сахар(а), антибиотики, сыворотка или заменитель сыворотки и другие компоненты, такие как пептидные факторы роста и т.д. Среды для клеточной культуры, которые обычно используются для конкретных типов клеток, являются известными специалистам в настоящей области техники.

Используемый в настоящем документе термин линии описывает клетку с общим предком или клетки с общим исходом развития. Исключительно в качестве примера клетка, которая характеризуется эндодермальным происхождением или является эндодермальной линией, означает, что клетка произошла из эндодермальной клетки и может дифференцироваться по путям со специфической для эндодермальной линии рестрикцией, таким как один или несколько путей развития, которые дают в результате окончательные эндодермальные клетки, которые в свою очередь могут дифференцироваться в клетки печени, тимуса, поджелудочной железы, легкого и кишечника.

Стволовая клетка (например, выделенная стволовая клетка, такая как эмбриональная стволовая клетка, выделенная из субъекта) может быть приведена в контакт с агонистом ΚΑΚ в течение любого количества времени. Например, стволовая клетка может быть приведена в контакт с агонистом ΚΑΚ в течение 12 ч, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 1 недели или более. Согласно одному не ограничивающему примеру агонисты ΚΑΚ (растворенные в этаноле или ΌΜδΘ) добавляют к М8С культурам в конечной концентрации от 10 нМ до 3 мкМ и объем раствора агониста ΚΑΚ, добавленного к культуре, составляет 0,1%.

Не желая быть связанными с теорией, контактирование стволовой клетки с агонистом ΚΑΚ индуцирует или стимулирует направленную в сторону определенной линии дифференциацию стволовой клетки в конкретную линию. Например, контактирование стволовой клетки с агонистом ΚΑΚ может индуцировать или стимулировать дифференциацию в линию, выбранную из группы, состоящей из мезодермальной, эндодермальной, эктодермальной, нейрональной, мезенхимальной и гематопоэтической линии.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения индуцированная/стимулированная линия представляет собой мезенхимальную линию.

Согласно некоторым вариантам осуществления индуцированную мезенхимальную линию выбирают из группы, состоящей из следующего: миогенная, остеогенная, хондрогенная, образующая сухожилия, образующая связки, образующая строму костного мозга, адипогенная и дермогенная.

Используемый в настоящем документе термин мезенхимальная стволовая клетка представляет собой мезенхимальную клетку, характеризующуюся способностью самовоспроизводиться и дифференцироваться в одну или несколько мезенхимальных клеток. Как и мезодермальная клетка, мезенхимальные стволовая клетка является плюрипотентной, способной к дифференцировке в остеобласты, клетки хряща, миобласты, жировые клетки, клетки стромы, клетки сухожилия и подобное. В то время как самовоспроизводящиеся и плюрипотентные мезодермальные клетки утрачивают эти способности в процессе развития, мезенхимальные стволовые клетки, как известно, персистируют в течение длительного времени в теле взрослого организма после того, как он прошел свое развитие.

Используемый в настоящем документе термин мезенхимальные клетки представляет собой остеобласты, клетки хряща, миобласты, жировые клетки, клетки стромы, клетки сухожилия и другие клетки, которые образуют мезенхимальную ткань, и мезенхимальные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в них. Все из мезенхимальных клеток, возникающих в ходе эмбриогенеза, мезенхимальных клеток у отдельных животных и мезенхимальных клеток, образованных путем дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток ίη νίίτο или ίη νίνο включены в термин мезенхимальные клетки.

- 15 026251

Стволовые клетки могут происходить или быть получены из любого источника, доступного для практикующего специалиста.

Мезенхимальные стволовые клетки могут быть получены с помощью ряда способов, хорошо известных в настоящей области техники. Смотрите, например, патент США № 5486358; № 6387367 и № 7592174 и публикацию заявки на выдачу патента США № 2003/0211602, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Мезенхимальные клетки могут включать в себя аутологичные мезенхимальные стволовые клетки, т.е. клетку или клетки, взятые из субъекта, который нуждается в лечении (т.е. донор и реципиент являются одним индивидуумом). Аутологичные мезенхимальные стволовые клетки характеризуются преимуществом в том, что позволяют избежать какого-либо иммунологически обусловленного отторжения клеток. Альтернативно, клетки могут быть гетерологичными, например, взятыми от донора. Второй субъект может быть того же вида или другого. Как правило, когда клетки происходят от донора, то они будут происходить от того донора, который является достаточно иммунологически совместимым с реципиентом, т.е. не будет подвергаться отторжению трансплантата, для уменьшения или устранения необходимости в подавлении иммунитета. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки берут из ксеногенного источника, т.е. не относящегося к человеку млекопитающего, которое было подвергнуто генетической инженерии, чтобы стать достаточно иммунологически совместимым с реципиентом, или видом реципиента. Способы определения иммунологической совместимости известны в настоящей области техники и включают в себя тканевое типирование для оценки совместимости донор-реципиент в отношении детерминант НЬА и АВО. Смотрите, например, Тгапзр1ап1аΐίοη 1ттипо1оду. ВасЬ апй Лис1йпс1о55. ЕЙ8. (\УПсу. Ιοίιη & §оп8, 1псогрога1ей 1994).

Согласно некоторым вариантам осуществления мезенхимальная стволовая клетка происходит из дедифференцированной соматической клетки (перепрограммированной клетки). Например, соматическая клетка дедифференцировалась до плюрипотентной стволовой клетки, например, с помощью прямого перепрограммирования клетки эндодермального происхождения. Не желая быть связанным с теорией, дедифференцированная клетка характеризуется морфологией, которая сходная с более примитивным типом клеток, из которого она происходит, например, мезенхимальную морфологию.

Согласно некоторым вариантам осуществления мезенхимальная стволовая клетка представляет собой редифференцированную мезенхимальную стволовую клетку. Используемый в настоящем документе термин редифференцированная мезенхимальная стволовая клетка относится к мезенхимальной стволовой клетке, которая является дифференцированной от дедифференцированной мезенхимальной стволовой клетки.

Согласно некоторым вариантам осуществления мезенхимальные стволовые клетки находятся в их стабилизированном состоянии, например, клетки брали из субъекта и обрабатывали таким образом, чтобы обеспечить их хранение в течение некоторого периода времени. Например, клетки могут быть заморожены, например, с использованием способов, известных в настоящей области техники для замораживания первичных клеток, так чтобы клетки были жизнеспособными при оттаивании. Например, способы, известные в настоящей области техники для замораживания и оттаивания зародышей для создания живых млекопитающих, могут быть адаптированы для применения в настоящих способах. Такие способы могут включать в себя применение жидкого азота, например, с одним или несколькими криопротекторами, например, средствами, которые предотвращают повреждение клетки при замораживанииоттаивании.

Популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная из субъекта или донора, может быть по существу чистой. Чистота популяция может быть определена и ей можно управлять с использованием известных в настоящей области техники способов. Например, могут быть использованы способы с использованием сортировки активированных флуоресценцией клеток.

Не желая быть связанными с теорией, любые подходящие среды для клеточной культуры могут быть использованы для ίη уйго или ех У1уо способов настоящего изобретения. Например, М8С могут храниться в α-МЕМ среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения мезенхимальные стволовая клетка представляет собой происходящую из костного мозга мезенхимальную стволовую клетку (ВМ8С).

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения мезенхимальные стволовая клетка представляет собой происходящую из мышиного костного мозга мезенхимальную стволовую клетку.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения мезенхимальные стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку человеку (ЬМ8С).

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что обработанные агонистом КАК стволовые клетки могут быть использованы для восстановления или регенерации мышцы. Соответственно согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу восстановления или регенерации мышцы у субъекта, причем способ предусматривает введение популяции стволовых клеток субъекту, причем по меньшей мере одна клетка в популяции была приведена в контакт с агонистом КАК.

- 16 026251

Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает стадии: (ί) контактирование по меньшей мере одной стволовой клетки с агонистом ΚΑΚ и (ίί) введение указанных стволовых клеток субъекту, причем субъект характеризуется поврежденной мышечной тканью.

После контактирования по меньшей мере 1 стволовой клетки с агонистом ΚΑΚ в течение необходимого времени обработанная стволовая клетка может быть введена сразу же или может храниться в течение периода времени перед введением субъекту. Без ограничения период времени может находиться в диапазоне от минут до дней.

Количество обработанных агонистом ΚΑΚ стволовых клеток, подлежащее введению субъекту, может находиться в диапазоне от одной клетки до свыше 10.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу восстановления или регенерации мышцы у субъекта, причем способ предусматривает введение популяции стволовых клеток субъекту, причем часть стволовых клеток предварительно обрабатывают с помощью агониста ΚΑΚγ, как описано в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления часть предварительно обработанных стволовых клеток составляет приблизительно 50% (соотношение 1:1). Применение популяций предварительно обработанных стволовых клеток с более высокими соотношениями (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, предварительно обработанная стволовая клетка:необработанная стволовая клетка), а также с более низкими соотношениями (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, предварительно обработанная стволовая клетка: необработанная стволовая клетка) также рассматривается как применимое в настоящем способе. Например, часть предварительно обработанных стволовых клеток может составлять приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% или 45%. Часть предварительно обработанных стволовых клеток может также составлять приблизительно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%.

Способ восстановления или регенерации мышцы предусматривает введение композиции, содержащей предварительно обработанные и необработанные стволовые клетки, субъекту в участок повреждения мышцы, чтобы тем самым восстановить или регенерировать мышцу в этом участке. Согласно одному варианту осуществления повреждение представляет собой сложное повреждение тканей. Сложное повреждение тканей представляет собой участок повреждения многочисленных тканей и может включать в себя одну или несколько из повреждения мышечной, костной тканей, ткани сухожилия, связки и жировой ткани. Предусматриваются различные комбинации. Согласно одному варианту осуществления сложное повреждение тканей включает в себя мышцу и кость. Согласно одному варианту осуществления сложное повреждение тканей включает в себя мышцу и по меньшей мере одну дополнительную ткань (например, связки, сухожилия, хрящ, кость, кожу, жировую ткань и кровеносные сосуды). Согласно одному варианту осуществления сложное повреждение тканей включает в себя мышцу и по меньшей мере две дополнительные ткани (например, две или более из связок, сухожилий, хряща, кости, кожи, жировой ткани и кровеносных сосудов). Согласно одному варианту осуществления повреждение дополнительной ткани затрагивает кость. Согласно одному варианту осуществления сложное повреждение тканей включают в себя мышца и по меньшей мере три дополнительные ткани (например, три или более из связок, сухожилий, хряща, кости, кожи, жировой ткани и кровеносных сосудов). Согласно одному варианту осуществления повреждение дополнительной ткани затрагивает кость. Согласно одному варианту осуществления сложное повреждение тканей включает в себя мышцу и по меньшей мере четыре дополнительные ткани. Согласно одному варианту осуществления повреждение дополнительной ткани включает в себя кость. Типы дополнительных тканей, отличные от описанных в настоящем документе, могут также быть подвержены повреждению в сочетании с повреждением мышцы.

Как обсуждалось выше, авторы настоящего изобретения обнаружили, что стволовые клеткипредшественники могут быть индуцированы для подвергания дифференцировке мышцы с помощью кратковременного или хронического воздействия агонистов рецептора ретиноевой кислоты гамма (ΚΑΚγ). Соответственно согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способам индуцирования или стимулирования направленной на определенную линию дифференцировки стволовой клетки в одну конкретную линию, причем способ предусматривает контактирование стволовой клетки с агонистом рецептора ретиноевой кислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения конкретную линию выбирают из группы, состоящей из следующего: мезодермальная, эндодермальная, эктодермальная, нейрональная, гематопоэтическая линии и любые их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения конкретная линия представляет собой мезенхимальную линию.

Согласно некоторым вариантам осуществления этого и других аспектов настоящего изобретения мезенхимальную линию выбирают из группы, состоящей из следующего: миогенная, остеогенная, хондрогенная, образующая сухожилия, образующая связки, образующая строму костного мозга, адипогенная и дермогенная.

Наборы

Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к набору для восстановления или регенерации мышцы. Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит агонист ΚΑΚ. Со- 17 026251 гласно некоторым вариантам осуществления набор дополнительно содержит популяцию стволовых клеток. Агонист КАК может быть предварительно составлен в виде фармацевтического состава для введения или ингредиенты для составления в виде фармацевтического состава могут быть обеспечены в наборе.

Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит агонист КАК, причем агонист составляют для местного нанесения.

Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит популяцию стволовых клеток, причем по меньшей мере одна клетка в популяции была предварительно обработана путем контактирования клеток с агонистом КАК.

В дополнение к указанным выше компонентам набор может включать в себя информационный материал. Информационный материал может быть описательным, инструктивным, маркетинговым или другим материалом, который относится к описанным в настоящем документе способам и/или применению соединения для описанных в настоящем документе способов. Например, информационный материал описывает способы введения состава субъекту. Набор может также включать в себя устройство доставки.

Согласно одному варианту осуществления информационный материал может включать в себя инструкции по введению состава подходящим образом, например, в подходящей дозе, лекарственной форме или способом введения (например, описанной в настоящем документе дозе, лекарственной форме или способом введения). Согласно другому варианту осуществления информационный материал может включать в себя инструкции для определения подходящего субъекта, например, человека, например, взрослого человека. Информационный материал наборов не ограничивается в его форме. Во многих случаях информационный материал, например, инструкции, представлены в печатной форме, например, напечатанный текст, рисунок и/или фотография, например, этикетка или напечатанный лист. Тем не менее, информационный материал может также быть представлен в других форматах, таких как текст азбукой Брейля, машиночитаемый материал, видеозапись или аудиозапись. Согласно другому варианту осуществления информационный материал набора представляет собой ссылку или контактную информацию, например, физический адрес, электронный адрес, гиперссылку, веб-сайт или телефонный номер, где пользователь набора может получить действительную информацию о состава и/или его применении в описанных в настоящем документе способах. Безусловно, информационный материал может также быть представлен в любой комбинации форматов.

Согласно некоторым вариантам осуществления отдельные компоненты состава могут быть представлены в одном контейнере. Альтернативно, может быть желательным предоставить компоненты состава отдельно в двух или более контейнерах, например, один контейнер для олигонуклеотидного препарата, и, по меньшей мере, другой для соединения носителя. Различные компоненты могут быть скомбинированы, например, согласно инструкциям, представленным в наборе. Компоненты могут быть скомбинированы согласно описанному в настоящем документе способу, например, для получения и введения фармацевтической композиции.

В дополнение к составу композиция набора может включать в себя другие ингредиенты, такие как растворитель или буфер, стабилизатор или консервант и/или второе средство для лечения описанного в настоящем документе состояния или нарушения. Альтернативно, другие ингредиенты могут быть включены в набор, но в композициях или контейнерах, отличных от состава. Согласно таким вариантам осуществления набор может включать в себя инструкции для смешивания состава и других ингредиентов или для применения олигонуклеотида вместе с другими ингредиентами.

Агонисты КАК могут быть представлены в любой форме, например, жидкой, высушенной или лиофилизированной форме. Предпочтительно, чтобы состав являлся по существу чистым и/или стерильным. Когда состав представлен в жидком растворе, жидкий раствор предпочтительно представляет собой водный раствор, причем стерильный водный раствор является предпочтительным. Когда состав представлен в виде высушенной формы, восстановление, как правило, осуществляют путем добавления подходящего растворителя. Растворитель, например, стерильная вода или буфер, может необязательно быть представлен в наборе.

Согласно некоторым вариантам осуществления набор содержит отдельные контейнеры, разделители или компартменты для состава и информационного материала. Например, состав может содержаться в бутылке, флаконе или шприце и информационный материал может содержаться в прокладке из пластмассы или пакете. Согласно другим вариантам осуществления отдельные элементы набора содержаться в одном неразделенном контейнере. Например, состав содержится в бутылке, флаконе или шприце, к которым прикреплен информационный материал в форме этикетке.

Согласно некоторым вариантам осуществления набор включает в себя множество, например, группу отдельных контейнеров, каждый из которых содержит одну или несколько унифицированных лекарственных форм состава. Например, набор включает в себя множество шприцев, ампул, пакетов из фольги или блистерных упаковок, каждая из которых содержит дозу для однократного введения состава. Контейнеры наборов могут быть воздухо- и/или водонепроницаемыми.

Определения

Если иное не указано или не подразумевается контекстом, следующие термины и фразы включают

- 18 026251 в себя значения, представленные ниже. Если явно не указано иное или не очевидно из контекста, термины и фразы ниже не исключают значение, которое термин или фраза приобрела в настоящей области техники, к которой оно принадлежит. Определения представлены для помощи в описании конкретных вариантов осуществления описанных в настоящем документе аспектов и они не подразумеваются для ограничения заявленного изобретения, поскольку объем настоящего изобретения ограничивается только формулой изобретения. Более того, если иное не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать в себя формы множественного числа и термины во множественном числе должны включать в себя формы единственного числа.

Используемый в настоящем документе термин содержащий или содержит используется в отношении композиций, способов и их соответствующего компонента(ов), которые являются существенными для настоящего изобретения, все еще является открытым для включения неспецифических элементов, существенных или нет.

Используемый в настоящем документе термин состоящий, по существу, из относится к таким элементам, которые необходимы для настоящего варианта осуществления. Термин разрешает присутствие дополнительных элементов, которые не существенно влияют на основную и новую или функциональную характеристику(и) этого варианта осуществления настоящего изобретения.

Термин состоящий из относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам, как описано в настоящем документе, которые исключают любой элемент, не перечисленный в этом описании варианта осуществления.

Формы единственного числа включают в себя формы множественного числа, если контекст ясно не указывает иное. Аналогично, подразумевается, что слово «или» включает в себя «и», если контекст ясно не указывает иное.

Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем документе могут быть использованы при практическом применении или тестировании настоящего раскрытия, подходящие способы и материалы описаны ниже. Термин содержит означает включает в себя. Сокращение е.д. происходит от латинского ехешрП дгаБа. и используется в настоящем документе для обозначения неограничивающего примера. Таким образом, сокращение е.д. является синонимом термина например.

Все термины понижать, сниженный, снижение, повышать или ингибировать используются в настоящем документе, как правило, для обозначения снижения на статистически значимое количество. Тем не менее, во избежание неопределенности, сниженный, снижение или снижать или ингибировать означает снижение по меньшей мере 10% по сравнению с исходным содержанием, например, снижение по меньшей мере приблизительно на 20%, или по меньшей мере приблизительно на 30%, или по меньшей мере приблизительно на 40%, или по меньшей мере приблизительно на 50%, или по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно на 90% или вплоть до этого и включая в себя 100% снижение (например, отсутствие содержания по сравнению с исходным образцом) или любое снижение от 10 до 100% по сравнению с исходным содержанием.

Все термины увеличенный, увеличивать или усиливать или активировать используются в настоящем документе, как правило, означает увеличение на статистически значимое количество; во избежание какой-либо неопределенности, термины увеличенный, увеличивать или усиливать или активировать означает увеличение по меньшей мере на 10% по сравнению с исходным содержанием, например, увеличение по меньшей мере приблизительно на 20%, или по меньшей мере приблизительно на 30%, или по меньшей мере приблизительно на 40%, или по меньшей мере приблизительно на 50%, или по меньшей мере приблизительно на 60%, или по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 90% или вплоть до и включая в себя 100% увеличение или любое увеличение от 10 до 100% по сравнению с исходным содержанием, или увеличение по меньшей мере приблизительно в 2 раза, или по меньшей мере приблизительно в 3 раза, или по меньшей мере приблизительно в 4 раза, или по меньшей мере приблизительно в 5 раза или по меньшей мере приблизительно в 10 раза или любое увеличение от 2 раз до 10 раз или более по сравнению с исходным содержанием.

Термин повышенный означает увеличение на статистически значимое количество; во избежание какой-либо неопределенности, термин повышенный означает увеличение по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз или более по сравнению с исходным содержанием.

Термин статистически значимое или значительно относится к статистической значимости и, как правило, означает два стандартных отклонения (28Ό) выше или ниже исходного содержания. Термин относится к статистическому доказательству того, что имеет место разница. Это определяется как веро- 19 026251 ятность принятия решения отклонить нулевую гипотезу, когда нулевая гипотеза фактически верна. Решение часто принимается с использованием р-значение.

Используемый в настоящем документе термин ех νίνο относится к клеткам, которые были удалены из живого организма и культивированы вне организма (например, в пробирке для анализа).

Если иное не определено в настоящем документе, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящей заявкой, должны иметь значения которые являются в большинстве случаев понятными для специалистов в настоящей области техники. Кроме того, если иное не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать в себя формы множественного числа и термины в множественном числе должны включать в себя формы единственного числа.

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реактивами и т.п., описанными в настоящем документе, и что они могут изменяться. Используемая в настоящем документе терминология представлена только с целью описания конкретных вариантов осуществления, а не для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.

За исключением рабочих примеров или если указано иное, все используемые в настоящем документе числа, выражающие количества ингредиентов или условия реакций, нужно понимать как модифицированные во всех случаях с помощью термина приблизительно. Термин приблизительно при использовании в описанном настоящем изобретении в отношении процентов означает ±1%.

С одной стороны, настоящее изобретение относится к описанным в настоящем документе композициям, способам и их соответствующему компоненту(ам), как существенным для настоящего изобретения, все еще открыто для включения неспецифических элементов, существенных или нет (содержащий). Согласно некоторым вариантам осуществления другие элементы, подлежащие включению в описание композиции, способа или его соответствующего компонента ограничены теми, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику(и) настоящего изобретения (состоящий, по существу, из). Это применяется в равной степени к стадиям в описанном способе, а также композициям и компонентам в них. Согласно другим вариантам осуществления подразумевается, что настоящие изобретения, композиции, способы и их соответствующие компоненты, описанные в настоящем документе, являются исключающими любой элемент, не признаваемый существенным элементом к компоненту, композиции или способу (состоящий из).

В объеме, не указанном в настоящий момент, специалистам в настоящей области техники будет понятно, что любой один из различных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в настоящем документе, может быть дополнительно модифицирован для включения признаков, показанных в любом из других вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе.

Все упомянутые патенты, патентные заявки и публикации в точности включены в настоящий документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые должны быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации представлены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничего в этом отношении не должно быть истолковано как допущение того, что авторы настоящего изобретения не наделены правом предшествовать такому раскрытию на основании предыдущего изобретения или по какойлибо другой причине. Все заявления относительно даты или представления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не составляют допущения относительно правильности дат или содержания этих документов.

Настоящее изобретение может быть таким, как определено в любом одном из следующих пронумерованных параграфов.

1. Способ восстановления или регенерации мышцы у субъекта, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества агониста рецептора ретиноевой кислоты гамма (КАК,') субъекту с поврежденной мышечной тканью для восстановления или регенерации тем самым поврежденной мышечной ткани.

2. Способ по параграфу 1, при котором указанное введение представляет собой местное или системное.

3. Способ по любому из параграфов 1-2, при котором введение начинают в течение периода времени повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида у субъекта, которая является результатом возникновения поврежденной мышечной ткани.

4. Способ по любому из параграфов 1-3, при котором введение начинают позже чем через 3 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

5. Способ по параграфу 4, при котором введение начинают приблизительно через 4 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

6. Способ по параграфу 4, при котором введение начинают приблизительно через 5 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

7. Способ по параграфу 4, при котором введение начинают приблизительно через 6 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

- 20 026251

8. Способ по параграфу 4, при котором введение начинают приблизительно через 7 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

9. Способ по параграфу 4, при котором введение начинают приблизительно через 5 дней и продолжают по меньшей мере до 7 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

10. Способ по параграфу 9, при котором введение продолжают по меньшей мере до 9 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.

11. Способ по любому из параграфов 1-10, при котором агонист ΚΑΚγ выбирают из группы, состоящей из следующего: СИ-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2нафталинкарбоновая кислота); СИ-394, СИ-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2нафталинкарбоновая кислота); СИ-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7] дец-1 -ил-2нафталинил)бензойная кислота); СИ-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ВМ8-270394 (3-фтор-4-[(К)-2гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино] бензойная кислота); ВМ8-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3-(3,5-ди-трет-бутилфенил)-3оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.

12. Способ по любому из параграфов 1-11, при котором поврежденная мышечная ткань является результатом физической травмы или несчастного случая, заболевания, инфекции, перегрузки, прекращения кровообращения или мышечной атрофии или истощения.

13. Способ по любому из параграфов 1-11, при котором поврежденная мышечная ткань представляет собой дистрофическую мышцу или стареющую мышцу.

14. Способ по любому из параграфов 1-11, при котором поврежденная мышечная ткань является результатом мышечной атрофии/истощения.

15. Способ по любому из параграфов 1-14, при котором субъект представляет собой млекопитающее.

16. Способ по любому из параграфов 1-15, при котором субъект представляет собой мышь.

17. Способ по любому из параграфов 1-15, при котором субъект представляет собой человека.

18. Способ по любому из параграфов 1-17, дополнительно предусматривающий введение противовоспалительного средства субъекту.

19. Способ восстановления или регенерации мышцы у субъекта, предусматривающий введение плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток, которые предварительно обработали с помощью агониста ΚΑΚγ, субъекту в участок повреждения мышцы, чтобы тем самым восстановить или регенерировать мышцу в этом участке.

20. Способ по параграфу 19, при котором повреждение мышцы представляет собой сложное повреждение тканей.

21. Способ по параграфу 20, при котором сложное повреждение тканей включает в себя повреждение мышцы и кости.

22. Способ по любому из параграфов 19-21, при котором предварительно обработанные стволовые клетки вводят в комбинации с необработанными стволовыми клетками.

23. Способ по параграфу 22, при котором предварительно обработанные стволовые клетки и необработанные стволовые клетки вводят в соотношении 1:1.

24. Способ по любому из параграфов 19-23, при котором предварительно обработанные стволовые клетки предварительно обработали агонистом ΚΑΚγ в течение периода приблизительно 3 дней.

25. Способ по параграфу 19, при котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

26. Способ по любому из параграфов 19-25, при котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой мезенхимальные стволовые клетки.

27. Способ по любому из параграфов 19-26, при котором введение является местным.

28. Способ по любому из параграфов 19-27, при котором введение осуществляют путем трансплантации клеток субъекту.

29. Способ по любому из параграфов 19-28, при котором плюрипотентные стволовые клетки являются аутологичными или гетерологичными субъекту.

30. Способ по любому из параграфов 19-29, при котором плюрипотентные стволовые клетки являются клетками млекопитающего.

31. Способ по любому из параграфов 19-30, при котором плюрипотентные стволовые клетки являются клетками грызуна.

32. Способ по любому из параграфов 19-30, при котором плюрипотентные стволовые клетки являются клетками человека.

33. Способ по любому из параграфов 19-32, дополнительно предусматривающий введение противо- 21 026251 воспалительного средства субъекту.

34. Способ по любому из параграфов 19-33, при котором агонист КАКу выбирают из группы, состоящей из следующего: СИ-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СИ-394, СИ-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СИ-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота); СИ-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ВМ8-270394 (3-фтор-4-[(К)-2-гидрокси-2-(5,5,8,8тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино] бензойная кислота); ВМ8-189961 (3-фтор-4[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3-(3,5-ди-трет-бутилфенил)-3-оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2-карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.

35. Способ по любому из параграфов 19-34, при котором поврежденная мышца является результатом физической травмы или несчастного случая, заболевания, инфекции, перегрузки, прекращения кровообращения или мышечной атрофии или истощения.

36. Способ по любому из параграфов 19-34, при котором поврежденная мышечная ткань представляет собой дистрофическую мышцу или стареющую мышцу.

37. Способ по любому из параграфов 19-34, при котором поврежденная мышца является результатом мышечной атрофии/истощения.

38. Способ индуцирования или стимулирования миогенной дифференцировки выделенных мезенхимальных стволовых клеток ίη νίίτο, предусматривающий контактирование мезенхимальных стволовых клеток с эффективным количеством агониста рецептора ретиноевой кислоты гамма (КАКу).

39. Способ по параграфу 38, при котором контактирование осуществляют в течение периода времени, выбранного из группы, состоящей приблизительно из 12 ч, приблизительно 1 дня, приблизительно 2 дней и приблизительно 3 дней.

40. Способ индуцирования или стимулирования направленной на определенную линию дифференцировки плюрипотентной стволовой клетки в мезенхимальную линию, причем способ предусматривает контактирование плюрипотентной стволовой клетки с эффективным количеством агониста рецептора ретиноевой кислоты гамма (КАКу).

41. Способ по параграфу 40, при котором плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку.

42. Способ по любому из параграфов 40-41, при котором плюрипотентная стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку.

43. Способ по любому из параграфов 40-42, при котором мезенхимальную линию выбирают из группы, состоящей из следующего: миогенная, остеогенная, хондрогенная, образующая сухожилия, образующая связки, образующая строму костного мозга, адипогенная и дермогенная.

44. Способ по любому из параграфов 40-43, при котором плюрипотентная стволовая клетка является клеткой млекопитающего.

45. Способ по любому из параграфов 40-44, при котором плюрипотентная стволовая клетка является клеткой грызуна.

46. Способ по любому из параграфов 40-45, при котором плюрипотентная стволовая клетка представляет собой клетку человека.

47. Способ по любому из параграфов 40-46, при котором агонист КАКу выбирают из группы, состоящей из следующего: СИ-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2нафталинкарбоновая кислота); СИ-394, СИ-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2нафталинкарбоновая кислота); СИ-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7] дец-1 -ил-2нафталинил)бензойная кислота); СИ-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ВМ8-270394 (3-фтор-4-[(К)-2гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино] бензойная кислота); ВМ8-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3-(3,5-ди-трет-бутилфенил)-3оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.

48. Композиция, содержащая мезенхимальные стволовые клетки, причем часть мезенхимальных стволовых клеток предварительно обработали путем контактирования с агонистом КАКу, чтобы тем самым создать предварительно обработанные мезенхимальные стволовые клетки.

49. Композиция по параграфу 43, в которой часть предварительно обработанных мезенхимальных стволовых клеток выбирают из группы, состоящей из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% и 90%.

50. Композиция, содержащая популяцию плюрипотентных стволовых клеток, причем по меньшей

- 22 026251 мере одну клетку популяции приводили в контакт с агонистом ΚΑΚγ, чтобы тем самым создать предварительно обработанную плюрипотентную стволовую клетку.

51. Композиция по параграфу 50, в которой плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную клетку.

52. Композиция по любому из параграфов 50-51, в которой плюрипотентная стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку.

53. Композиция по любому из параграфов 50-52, в которой стволовая клетка представляет собой выделенную стволовую клетку.

54. Композиция по любому из параграфов 50-53, в которой стволовая клетка представляет собой клетку млекопитающего.

55. Композиция по любому из параграфов 50-54, в которой стволовая клетка представляет собой клетку мыши.

56. Композиция по любому из параграфов 50-54, в которой стволовая клетка представляет собой клетку человека.

57. Композиция по любому из параграфов 50-56, в которой агонист ΚΑΚγ выбирают из группы, состоящей из следующего: ί'Ό-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); ί'Ό-394. СО-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СО-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота); СО-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2нафталинил]этенил]бензойная кислота); ΒΜδ-270394 (3-фтор-4-[(К)-2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино] бензойная кислота); ΒΜδ-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси2- (5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)3- (3,5-ди-трет-бутилфенил)-3-оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2-карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.

58. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из параграфов 50-57 и фармацевтически приемлемый носитель.

59. Набор для восстановления или регенерации мышцы, содержащий по меньшей мере одно из следующего:

агонист ΚΑΚγ;

агонист ΚΑΚγ и стволовую клетку; или композицию по любому из параграфов 48-58.

60. Набор по параграфу 59, причем стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку.

61. Набор по любому из параграфов 59-60, в котором стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку.

62. Набор по любому из параграфов 59-61, в котором агонист ΚΑΚγ составляют в фармацевтическую композицию.

63. Набор по любому из параграфов 59-62, в котором агонист ΚΑΚγ составляют для местного применения.

64. Набор по любому из параграфов 59-63, в котором стволовая клетка представляет собой выделенную стволовую клетку.

65. Набор по любому из параграфов 59-64, в котором стволовая клетка представляет собой клетку млекопитающего.

66. Набор по любому из параграфов 59-65, в котором стволовая клетка представляет собой клетку грызуна.

67. Набор по любому из параграфов 59-65, в котором стволовая клетка представляет собой клетку человека.

68. Набор по любому из параграфов 59-67, в котором агонист ΚΑΚγ выбирают из группы, состоящей из следующего: СО-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СО-394, СО-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СО-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота); СО2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ΒΜδ-270394 (3-фтор-4-[(К)-2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино] бензойная кислота); ΒΜδ-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3(3,5-ди-трет-бутилфенил)-3-оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2-карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.

- 23 026251

69. Набор по любому из параграфов 59-68, дополнительно содержащий инструкции по применению.

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами. Эти примеры представлены с целью способствовать пониманию настоящего изобретения и не рассматриваются как его ограничение.

Примеры

Пример 1

Способы

Выделение и культивирование происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток (М8С). М8С выделяли как описано ранее (ссылка) с минимальной модификацией. Кратко, клетки костного мозга мыши (1-2 х 10 ), собранные из длинных трубчатых костей 4-6 недельных мышей высевали на 100 мм культуральные чашки, инкубировали в течение 3 ч при 37°С, чтобы позволить прикрепиться адгезивным клеткам, и затем промывали дважды с помощью РВ8 для удаления неадгезивных клеток. Происходящие из костного мозга М8С формировали адгезивные колонии через 12-15 дня культивирования. Первичные культуры пассировали для распространения колониеобразующих клеток (пассаж 1). Клетки затем субкультивировали снова, когда они достигали 70% конфлюентности. Клетки хранили в α-МЕМ (ОЛсо ВКЬ; 1пуйгодеп Согр.), содержащем 20% фетальной бычьей сыворотки (РВ8; ЕсцШесй-Вю 1пс.), 2 мМ Ь-глютамина, комбинацию 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Вюйшйк 1пс.) и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола (ОЛсо ВКЬ; 1пуйгодеп Согр.) перед первым пассажем. После первого пассажа клетки хранили в 10%РВ8, α-МЕМ, если иное не указано.

Экспрессирующие ΌδΚΕΌ М8С выделяли из В6.Сд-Тд(САО-О8Кей*М8Т)Шаду/.Т мышей Цах М1се). Экспрессирующие ОРР М8С получали из трансгенных мышей, несущих Н2К-ОРР (Попиша е1 а1. Оепе515 42:17-22(2005)).

Клеточная трансплантация. М8С (1х10⁵) с предварительной обработкой с помощью агониста КАК или без нее суспендировали в 10 мкл бессывороточном ЭМЕМ и помещали на мышечный дефект, образованный, как описано в настоящем документе.

Гистологические процедуры. Для обследования структуры мышечной ткани образцы фиксировали в 4% РРА и погружали в парафин. Пять мкм серийных срезов окрашивали или Н&Е (1Шр://\у\у\у.П1с\уог1йсо1п/_рго1осо15/5рес1а1_51ат5/НЕ_Мауег.1Пт) или раствором красителя трихрома Массона (1и1р://\у\у\уа11с\уог1йсот/_рго1осо15/5рес1а1_51ат5/1па55оп_1пс11го1пе.1ит). Для обнаружения жировой ткани 4% РРА фиксированные образцы уравновешивали в 20% сахарозы в РВ8, погружали в ОСТ соединение и затем делали срезы с помощью криостата. Десять мкл криосрезов высушивали, регидратировали и затем окрашивали с помощью красителя масляный красный О (1Шр://\у\у\у.П1с\уог1й.со1п/_рго1осо15/5рес1а1_51ат5/оП_гей_о.1ит).

Иммунофлуоресцентный анализ. Для обнаружения различных антигенов в срезах ткани 5 мкм парафиновых срезов подвергали депарафинизации, регидратировали и затем обрабатывали с помощью 0,1% пепсина в 0,02 н НС1 в течение 15 мин при 37°С. Срезы отмывали трижды в РВ8-Т и блокировали в 10% нормальной козьей сыворотке с 0,3% В8А. Срезы инкубировали с 1^ым антителом, отмывали трижды с помощью РВ8-Т и затем инкубировали со 2^ым антителом. Список антигенов, антител и их разведений приведен ниже.

МуоО:анти-МуоЭ; §с-760 (8ап1а Сиг/, 1:100), антикроличий А1еха Р1оиг 488 (1пуйгодеп, 1:500)

Му£5: анти-Му£5; кс-302 (8ап1а Сиг/, 1:100), антикроличий А1еха Р1оиг 488 (1пуйгодеп, 1:500)

Анти-ламинина 2; АЬХ-804-190 (Еп/о ЬКе 8с1епсе, 1:250), антикрысиный А1еха Р1оиг 594 (1пуйгодеп, 1:500)

Тяжелая цепь миозина (МНС): анти-МНС; МР-20 (Оеуе1ортеШа1 81иФе5 НуЬпйота Вапк, 1:25), антимышиный А1еха Р1оиг 588 (1пуйгодеп, 1:500)

Остеокальцин (ОС): анти-ОС; М173 (Такага, 1:500), антикроличий А1еха Р1оиг 594 (1пуйгодеп, 1:500)

Зеленый флуоресцентный белок (ОРР): биотинилированный анти-ОРР; ΝΡ100-1678 (№уи5, 1:250), стрепатавидин А1еха Р1оиг 488 (1пуйгодеп, 1:500)

Местное и системное введение агониста КАК. Системное введение агониста КАК проводили с помощью зондового питания, как описано ранее (8Ытопо е1 а1. 1. Опйор. Ке8. 28:271-277, 2010). Местную доставку агониста КАК осуществляли путем инъекции агониста КАК (растворенного в ЭМ8О) с использованием шприца Гамильтона 87943 с иглой 26О.

Результаты

Исследовали дифференциальные эффекты ретиноидных агонистов на миогенную дифференциацию в культурах, происходящих из костного мозга мышей мезенхимальных стволовых клеток (ВМ8С). ВМ8С получали из бедренных костей и большеберцовых костей 6 недельных мышей с помощью стандартных способов и хранили в 5% РВ8 ЭМЕМ в течение 7 дней в присутствии 0,1% ЭМ8О (инертный носитель: контроль), 1 мкм полностью транс-ретиноевой кислоты (КА) (коммерчески доступной от 81дта), 1 мкм альфа-агониста КАК (полученный от ΝιιΡ.\ Рйагтасеийсак) или 30 нМ гамма-агониста КАК (СЭ1530,

- 24 026251 коммерчески доступного). Многие удлиненные многоядерные мышечные клетки формировались только в обработанных гамма-агонистом КАК культурах.

Клетки из линии мезенхимальных стволовых клеток культивировали в течение 10 дней в присутствии или отсутствии гамма-агониста КАК (СЭ1530, 100 нМ). Культуры обрабатывали для иммуноокрашивания с помощью антител МуоЭ или МуГ5 или окрашивали с помощью ядерного красителя ΌΆΡΙ. Контрольные необработанные клетки содержали не обнаруживаемые количества МуоЭ и МуГ5, но оба белка ясно присутствовали в обработанных гамма-агонистом культурах. Результаты указывают на увеличение содержаний МуоЭ и МуГ5 под воздействием гамма-агониста КАК в культурах мезенхимальных стволовых клеток (М8С).

Модель мышечного дефекта использовали для исследования стимуляции восстановления мышцы путем введения гамма-агонистов КАК. Дефект круглой формы создавали с помощью прижигания электрическим током в икроножных или передних мышцах голени у 8 недельных мышей, приводя к возникновению 2,0х2,0х2,0 мм дефекта.

Дефекты круглой формы создавали в ткани икроножной мышцы 8 недельных мышей, как описано выше (один мышечный дефект/мышь). Мыши получали кукурузное масло (инертный носитель) или 300 мкг гамма-агониста КАК (СО1530)/день с помощью зондового питания в день 8, 10 и 12 после повреждения. Ткань собирали для гистологического анализа в день 14. Мышечные дефекты у контрольных мышей были в значительной степени заполнены рубцовой фиброзной и соединительной тканями ко дню 14. Эти рубцовые ткани были полностью отрицательными в отношении тяжелой цепи миозина (МНС), что обнаружено с помощью иммуноокрашивания. Наоборот, участки мышечного дефекта у обработанных гамма-агонистом КАК мышей были заполнены многочисленными удлиненными миоцитоподобными клетками и многие из этих клеток были положительными в отношении МНС. Результаты указывают на стимуляцию мышечного восстановления с помощью системного введения гамма-агониста КАК.

После создания 2x2x2 мм дефекта в центре передней мышцы голени, как описано выше (один мышечный дефект/мышь), мыши получали кукурузное масло (инертный носитель) или 300 мкг гаммаагониста КАК/день с помощью зондового питания в день 8, 10 и 12 после повреждения. Ткани собирали для гистологического анализа через 2 и 4 недели. Макрофотографии поврежденной мышечной ткани, собранной от получавших контроль и гамма-агонист КАК (СЭ1530) мышей, получали через 4 недели после повреждения. В контролях дефект был ясно виден как белое пятно. Наоборот, практически не было видимого признака исходного дефекта у получавших гамма-агонист КАК мышей. Гистологический анализ выявил, что дефекты мышечной ткани у контрольных мышей заполнялись смесями жировой и фиброзной ткани через 2 и 4 недели. Отложение фиброзной ткани также наблюдалось между мышечными волокнами. Тем не менее, у получавших гамма-агонист КАК мышей мышечные дефекты были заполнены мышечными волокнами, выровненными вдоль основной продольной оси передней мышцы голени. Результаты указывают на полное восстановление мышечных дефектов путем системного введения гамма-агониста КАК с течением времени

Гистологический анализ скелетной мышечной ткани проводили через 4 недели после повреждения. Серийные поперечные срезы образов мышечной ткани, собранные через 4 недели после повреждения (такие же образцы, как обсуждалось непосредственно выше), окрашивали с помощью трихрома Массона или обрабатывали для иммуноокрашивания с помощью антител к ламинину (внеклеточный белок, распространенный вокруг мышечных клеток). В контролях начальный участок повреждения очень слабо восстанавливался и в значительной степени заполнялся жировой тканью и фиброзной соединительной тканью, которая не окрашивалась с помощью антител к ламинину. Наоборот, повреждение мышцы было почти полностью восстановлена у получавших гамма-агонист животных; восстановленная ткань сильно окрашивалась с помощью антител к ламинину. Для оценки и количественного определения изменений структуры скелетной мышечной ткани получали изображения окрашенных трихромом серийных срезов и относительные количества мышечного волокна, жировой и фиброзной тканей определяли в многочисленных заданных областях с помощью программного обеспечения 1тадеРго. Проанализированные области представляли собой сетки размером 9x9 каждая (приблизительно 3x3 мм), которые включали в себя исходный участок повреждения (2x2 мм). Повреждение мышцы вызывало снижение общей площади мышечного волокна и одновременно увеличивало площади фиброзной и жировой тканей. Наоборот, обработка с помощью СО1530 в значительной степени восстанавливала состав тканей. Относительное количество мышцы, которое определили, показано графически на фигуре 1.

Для подтверждения того, что КАК-гамма необходим для восстановления и регенерации мышцы, мышечные повреждения создавали у дикого типа (№Т) и КАК-гамма-нулевых мышей, как описано выше. Животные затем получали лечение с помощью гамма-агонистов или инертного носителя (кукурузное масло). Образцы ткани собирали через 4 недели после повреждения, делали срезы и окрашивали с помощью раствора красителя трихрома Массона. В соответствии с обсуждаемыми выше результатами, лечение гамма-агонистом индуцировало эффективное восстановление мышцы у №Т мышей. Тем не менее, оно характеризовалось минимальными эффектами у КАК-гамма-нулевых мышей, у которых участок мышечного дефекта заполнялся клетками жировой и немного соединительной ткани и выстилался фиб- 25 026251 розными клетками. Эти данные указывают на то, что: (1) эффекты восстановления мышцы с помощью гамма-агонистов опосредованы КАК-гамма; и (2) КАК-гамма необходим для восстановления скелетной мышечной ткани.

Исследовали эффекты различных ретиноидных агонистов на восстановление скелетной мышцы. Получали макрофотографии участков повреждения мышцы во временной точке 4 недели. Гистоморфометрический анализ композиции поврежденных мышц показан на фиг. 2. Дефекты повреждения мышцы создавали у 8-недельных мышей, как описано выше. Мыши получали кукурузное масло (контроль), 300 мкг пан-агониста ретиноевой кислоты (КА), 900 мкг ΝΡΧ195183 (агонист КАК-альфа) или 300 мкг СЭ1530 (агонист КАК-гамма) в день 8, 10 и 12 с помощью зондового питания. Через четыре недели после повреждения образцы ткани собирали, обрабатывали для гистологического анализа и подвергали гистоморфометрического количественного определения. У контрольных животных и получавших агонист КАК-альфа или КА животных участки повреждения были все еще ясно видимыми как большие беловатые пятна вследствие замещения мышцы жировой тканью. Тем не менее, у получавших КАК-гамма животных участки повреждения были, по существу, невидимыми через 4 недели, поскольку они были заполнены восстановленной мышечной тканью. Для количественного определения ответов серийные срезы тканей на восстановленном участке окрашивали с помощью трихрома и анализировали для количественного определения относительных количеств мышечной, жировой и фиброзной тканей в определенных участках с помощью программного обеспечения 1тадеРго, как описано выше. Проанализированные области были сетками размером 9x9 каждая (приблизительно 3x3 мм), которые содержали исходный участок повреждения (2x2 мм). Результаты показаны на фиг. 2. На графике показаны средние значения от девяти срезов от трех мышей. Нормальная являлось производным от состава мышечной ткани неповрежденной нормальной мышцы. Как ожидалось, мышцы у контрольных животных состояли из 90% мышечной ткани, 7% фиброзной ткани и следовое количество жировой ткани. Повреждение мышцы вызывало сильное снижение площади мышечных волокон от 90 до 33%, и наблюдались соответствующие увеличения площадей жировой и фиброзной тканей. Лечение с помощью КА умеренно повышало площадь мышечных волокон от 33% (контроль) до 54%, но наблюдалось значительное увеличение площади фиброзной ткани. Агонист КАК-альфа ΝΡΧ195183 не улучшал тканевый состав. Наоборот, композиция восстановленных тканей у получавших СЭ1530 животных была практически нормальной.

Исследовали эффекты агонистов КАК-гамма с различной структурой скелета на восстановление мышцы. В обсуждаемых выше экспериментах показали, что гамма-агонист СЭ1530 сильно усиливал восстановление мышцы и что экспрессия КАК-гамма необходима для такого эффекта. Для дальнейшего подтверждения этих данных и определения возможных более активных гамма-агонистов, исследовали три других структурно различных селективных агониста КАК-гамма (ВМ8270394, паловаротен и СЭ437) в восстановлении мышцы. Повреждение мышц лапы создавали, как описано выше. Каждая группа мышей получала один из различных агонистов (100 мкг/зонд/день) или инертный носитель в день 8, 10 и 12 от повреждения. Ткани собирали через 4 недели после операции и исследовали, как описано выше. У контрольных животных участки повреждения мышцы были ясно видимыми в виде беловатых пятен и наблюдалось минимальное восстановление мышцы; кроме того фиброзная рубцовая ткань присутствовала в поврежденной мышце. Наоборот, каждый гамма-агонист индуцировал эффективное восстановление мышцы; среди трех исследуемых агонистов, ВМ8270394 был наиболее эффективным и полностью восстанавливал нормальную структуру мышцы. Результаты показывают, что гамма-агонисты являются очень эффективными в запуске восстановления мышцы.

Исследовали эффекты местного введения агониста КАК-гамма на восстановление мышцы. Хотя основные побочные эффекты системного введения гамма-агонистов не обнаруживали в экспериментах по восстановлению мышцы, может быть необходимым доставить их местно в определенных клинических ситуациях. Для исследования эффективности этих лекарственных средств при местном введении, повреждение мышцы создавали, как описано выше, и 3 мкг СЭ1530 вводили инъекцией подкожно вокруг участка повреждения в день 8 и 10 после операции. Инертный носитель вводили инъекцией контрольным животным и ткани собирали через 4 недели и исследовали, как описано выше. У контрольных животных участки повреждения были отчетливо видимыми и в значительной степени были заполнены жировой тканью. У получавшей СЭ1530 группы, тем не менее, мышечные дефекты были практически полностью восстановлены. Молекулярная масса гамма-агонистов составляла, в общем, менее чем 500, и, следовательно, лекарственные средства могли быть доставлены из кожи к более глубоким мышечным тканям в форме мазей или других составов (в дополнение к местной инъекции).

Экспрессирующие ОРР мышиные мезенхимальные стволовые клетки обрабатывали инертным носителем (контроль) или 100 нМ СЭ1530 в течение дней в культуре, смешивали с матригелем и 1 мкг гЬВМР2 и затем трансплантировали голым мышам. Через недели после имплантации эктопические тканевые массы собирали для анализа. Образование массивной эндохондральной кости наблюдали у контрольных животных; иммуноокрашивание анти-ОРР и анти-ОС (остеокальцином) выявило, что трансплантированные М8С имели вклад в образование кости. Тем не менее, эктопическая эндохондральная кость не была сформирована у мышей, трансплантированных с предварительно обработанными гам- 26 026251 ма-агонистом М8С; эти клетки присутствовали, как показали с помощью положительного СРР окрашивания, но были отрицательными по отношению к ОС окрашиванию и часто были выстроены в линию. Некоторые клетки сливались или находились в процессе слияния. Таким образом, обработка гаммаагонистом эффективно примирует М8С, чтоб вызвать путь миогенной дифференцировки. Эти результаты показывают, что агонист КАК-гамма представляет собой примирующий фактор для миогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (М8С).

Для дополнительного исследования способности гамма-агонистов примировать М8С в направлении миогенной линии дефекты повреждения мышцы создавали у голых мышей, как обсуждалось выше, и экспрессирующие ИзКеб М8С, предварительно обработанные с помощью гамма-агониста в течение трех дней (или оставленные необработанными) трансплантировали мышам. Через две недели после трансплантации присутствующие в участках повреждения ткани собирали и обследовали под флуоресцентным стереомикроскопом. Ткани затем обрабатывали для гистологических анализов. Флуоресцентная стереомикроскопия выявила сильный сигнал красной флуоресценции, присутствующий в участках повреждения мышцы, где имплантировали предварительно обработанные гамма-агонистом М8С, но флуоресценцию от небольшой до нулевой наблюдали в участках, в которые имплантировали контрольные необработанные М8С (А, левые панели). Окрашивание с помощью масляного красного О выявило присутствие избыточной жировой ткани в участках повреждения, в которые имплантировали контрольные М8С (В, слева), но отсутствие этих клеток в участках, в которые имплантировали предварительно обработанные гамма-агонист М8С (В, справа). Иммунофлуоресцентный анализ выявил, что ИзКеб-положительные и предварительно обработанные гамма-агонистом М8С вносили свой вклад в образование экспрессирующей МНС восстановленной мышечной ткани (С, справа), но их отсутствие в контроле. (ИзКеб, красный цвет; МНС, зеленый; ИАР1, пурпурный). В описанных выше экспериментах системное введение гаммаагонистов индуцировало восстановление дефектов повреждения мышцы за 4 недели. Следует отметить, что сходные дефекты почти полностью восстанавливались за период 2 недель после трансплантации примированных гамма-агонистом М8С. Следовательно, применение предварительно обработанных гамма-агонистом М8С могло представлять очень эффективную процедуру для быстрого восстановления повреждений мышцы.

Эти результаты показывает восстановление повреждения мышцы с помощью примированных гамма-агонистом М8С.

Пример 2

Способы

Если иное не указано, то все способы проводили, как описано в примере 1, или с помощью известных в настоящей области техники стандартных процедур.

Иммунологический анализ клеток и тяжелой цепи миозина человека проводили путем инкубации срезов с биотинилированным античеловеческим ТКА-1-85 (1:250 разведение, К&И № по каталогу ВАМ3195) и антителом к ламинину (1:250, Еп/у, АЬХ-804-190), отмывали и затем инкубировали с А1еха Ииог 488 к стрептавидину и А1еха Р1иог 594 к крысиному 1дО.

Результаты

Восстановление повреждения мышцы с помощью предварительно обработанной гамма-агонистом мезенхимальной стволовой клетки, происходящей из жировой ткани человека.

Описанный ниже опыт показал, что предварительно обработанные агонистом КАКу стволовые клетки не только регенерируют мышечную ткань сами по себе, но также поддерживают миогенную дифференциацию клеток хозяина. В этом случае, эти клетки теперь называют предварительно обработанные вместо примированных мезенхимальных стволовых клеток, чтобы соответствовать принятому определению термина примировать, как его используют в настоящей области техники для обозначения подвержение клеток к вовлечению в миогенез.

Для исследования эффектов предварительной обработки мезенхимальной стволовой клетки человек с помощью гамма-агониста КАК, дефект круглой формы создавали во внешней мышце голени ΝΟΌ мышей (ХОИ.Сд-Кад11т1Мот РгГ11т18б//8/), как описано выше. Необработанные или обработанные КАК-гамма мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из жировой ткани человека, трансплантировали в участок (5000 клеток на участок). Ткань собирали через 2 недели после операции и подвергали гистологическим анализам с помощью окрашивания трихромом Массона срезов мышцы, в которую трансплантировали предварительно обработанные КАК-гамма М8С, и мышце, в которую трансплантировали контрольные М8С, а также с помощью иммунофлуоресцентного анализа тяжелой цепи миозина (МНС, антиген к полученной от человека клетке и ядро (ИАР1) мышцы, в которую трансплантировали предварительно обработанные КАК-гамма М8С и мышцы, в которую трансплантировали контрольные М8С.

Предварительно обработанная КАК-гамма М8С человека явно облегчала восстановление поврежденной мышечной ткани. В то время как предварительно обработанные КАК-гамма М8С человека вносили вклад в регенерацию мышечной ткани, М8С, которые не были предварительно обработаны, были в основном исключены из мышечной ткани.

Для исследования того, является ли предварительная обработка КАК гамма-агонистом эффектив- 27 026251 ным на другом типе мезенхимальных стволовых клеток, мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из жировой ткани человека (ΖβηΒίο, № по каталогу Αδί','-Ε) обрабатывали с помощью 1 мкМ СЭ1530 или инертного носителя в течение 3 дней ίη νίίΓΟ, и затем трансплантировали в модельную систему мышечного повреждения. Дефект круглой формы создавали в передней мышце голени 6-недельных N80 мышей (ΝΘΌ 5θίά (тяжелая комбинированная иммунная недостаточность) гамма мышь, ίαχ мыши #005557), как описано выше ^ОО.Сд-РгМс^¹'¹ 112гд'^т|№||/5хЛ). Необработанные или обработанные ΚΑΚгамма мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из жировой ткани человека, трансплантировали в участок (10000 клеток на участок). Ткань собирали через 2 недели после операции и подвергали гистологическим анализам (окрашивание трихромом Массона срезы мышцы, в которую трансплантировали ΚΑΚ-гамма примированные М8С и мышцы, которой трансплантировали контрольные М8С, а также с помощью иммунофлуоресцентного анализа ламинина, антигена полученных от человека клеток и ядра (ΌΑΡί) мышцы, в которую трансплантировали предварительно обработанные агонистом ΚΑΚγ М8С, и мышцы, в которую трансплантировали контрольные М8С.

Предварительно обработанная ΚΑΚ-гамма М8С человека явно облегчала восстановление поврежденной мышечной ткани. В то время как наблюдалось, что предварительно обработанные ΚΑΚγ М8С человека были наиболее распространены вокруг мышечных волокон, необработанные клетки были в основном исключены из мышечной ткани. Эти результаты показывают, что применение предварительно обработанных агонистом ΚΑΚγ стволовых клеток, таких как М8С, представляет собой эффективную терапию для восстановления мышцы, а также, что стволовые клетки (например, М8С) из различных источников могут быть использованы для этой терапии.

Восстановление осложненной травы ткани (мышца+кость) с помощью примированных (обработанных агонистом ΚΑΚ-гамма) или непримированных М8С

Тяжелое повреждение мышцы часто сопровождается повреждениями другой ткани, такой как кость, сухожилие и нерв. С помощью использования упрощенной модели сложного повреждения, обработанные агонистом ΚΑΚγ М8С исследовали в отношении предпочтительной направленности на поврежденную мышечную ткань.

Сложное повреждение ткани (кости и мышцы) создавали у 2-месячных мышей путем разрезания малоберцовой кости и окружающей мышечной ткани. После этого смесь 1:1 предварительно обработанных агонистом ΚΑΚγ М8С и контрольных необработанных предварительно М8С трансплантировали вблизи участка повреждения. М8С получали либо из экспрессирующих 0ΡΡ (предварительно обработанных) или ΌδΚΕΌ (необработанных) клеток костного мозга мышей. Поврежденную ткань собирали через 1 неделю после операции, делали срезы и исследовали распределение в них предварительно обработанных и необработанных предварительно М8С с использованием антител к 0ΡΡ и ΌδΚβά соответственно. Гистологический анализ с помощью НЕ окрашивания выявило, что поврежденная костная и мышечная ткани находились все еще в процессе восстановления. Удивительно, в то время как большинство примированных М8С обнаруживали в мышечной ткани, большинство примированных клеток были всегда ассоциированы с костной тканью. Наблюдалось, что некоторые из экспрессирующих ΌδΚβά предварительно обработанных агонистом ΚΑΚγ М8С формировали типичные многоядерные скелетномышечные клетки.

Наблюдалось, что предварительно обработанные агонистом ΚΑΚγ и необработанные М8С нацеливались на различные тканевые участки повреждения. Результаты показывают, что предварительно обработанные агонистом ΚΑΚγ М8С селективно нацеливаются на поврежденную мышечную ткань. Предварительно обработанные агонистом ΚΑΚγ М8С будут применимыми для восстановления поврежденной мышечной ткани, когда другие ткани также являются поврежденными. Ранее сообщалось, что системное введение агониста ΚΑΚγ не только ингибирует гетеротопическое окостенение, но замедляет срастание перелома (§Ышопо с1 а1., №Лигс МеЛсше 17, 454-460 (2011)). Кроме того, эти результаты явно подтверждают, что комбинированная трансплантация предварительно обработанных и необработанных М8С в подходящем соотношении представляет собой эффективную терапию сложного повреждения тканей.

Необходимость в передаче сигнала ΚΑΚγ в восстановлении мышцы

Приведенные выше результаты показывают, что дефект мышечной ткани слабо восстанавливался у ΚΑΚγ нулевых мышей. Для дополнительного подтверждения этих данных использовали другую широко используемую модель мышечной дегенерации. 1 мкг кардиотоксина вводили инъекцией в мышечную ткань передней мышцы голени мышей дикого типа и ΚΑΚγ нулевых мышей. Мышечную ткань собирали через две недели после инъекции кардиотоксина, получали срезы и исследовали с помощью окрашивания трихромом Массона. Обнаружено, что мышечная ткань, в которую вводили кардиотоксин, была, в основном, восстановлена незрелыми мышечными волокнами ко 2 неделе у контрольных мышей дикого типа. Наоборот, обнаружили, что мышечная ткань ΚΑΚγ нулевых мышей, была слабо восстановлена.

Положительная регуляция местной передачи сигнала ретиноевой кислоты после повреждения мышцы

Переднюю мышцу голени мышей с репортером передачи сигнала ретиноевая кислота (ΚΑΚΕ-Ε;κΖ мышей) разрезали или ложно оперировали. Мышечную ткань собирали в день 1, 4 или 7 и окрашивали с

- 28 026251 помощью Х-да1. Наблюдалось, что репортерная активность возрастала через 4 дня после повреждения, позволяя предположить вовлечение этого пути передачи сигнала в восстановление мышечной ткани.

Общую РНК мышечной ткани собирали в 8 ч, через 2 дня и 4 дня и подвергали ПЦР-РВ для анализа генной экспрессии, связанной с передачей сигнала ΚΑΚ. Наблюдалось, что экспрессия ΑΒΌΗ2, позднего ограничивающего фермента, который производит ΚΑ из его предшественника, положительно регулировалась через 4 дня после повреждения, возвращаясь к нормальным уровням экспрессии ко дню 11. Наоборот, наблюдалось, что Сур26Ы (Сур26В), фермент, который расщепляет ΚΑ, временно положительно регулировался в день 2 после повреждения. Результаты показаны на фиг. 4 и 5 и показывают, что местная концентрация ΚΑ вначале снижалась, а затем временно повышалась после повреждения мышцы.

Эффект регулирования времени лечения на восстановление мышечной ткани

Мышечные дефекты создавали, как описано выше. Мышей лечили с помощью агониста ΚΑΚ-гамма (СЭ1530) в дни 1-3 или дни 5-7. На фотографиях показано окрашивание НЕ мышечных тканей через 4 недели после повреждения. Мышечные дефекты у не получавших лечение контрольных животных в значительной степени замещались жировой и фиброзной тканью. Лечение в день 1-3 с помощью агониста ΚΑΚ-гамма снижало образование жировой и фиброзной рубцовой ткани, но оставляло частичный дефект. Наоборот, мышечные дефекты были полностью заполнены заново образованными мышечными волокнами в группе, получавшей лечение в день 5-7. Таким образом, регулирование времени лечения является очень важным для более быстрого и лучшего восстановления мышечной ткани. Передача сигнала ΚΑΚ-гамма должна быть усилена, когда увеличивается сигнал эндогенного ретиноида. Предложенный режим лечения представляет собой местное или системное введение агониста ΚΑΚ-гамма в день 5 и 7 после повреждения мышцы. Дополнительное усиление точности регулирования времени лечения может быть достигнуто с помощью измерения местной концентрации ретиноевой кислоты с помощью Ь8/М8/М8.

Мышечные дефекты создавали, как описано выше. Мышам давали 100 нг агониста ΚΑΚγ (СЭ1530) через день в течение периода дней 1-5, дней 5-9 и дней 1-9. Группа мышей дней 1-5 получала СЭ1530 в день 1, 3 и 5. Группа дней 5-9 получала СЭ1530 в день 5, 7 и 9. Группа дней 1-9 получала СЭ1530 в день 1, 3, 5, 7 и 9. Мышцы затем сравнивали с обработанной инертным носителем поврежденной мышцей, а также интактной мышечной (неповрежденной мышечной) тканью. Исследовали окрашивание НЕ мышечных тканей через 4 недели после повреждения. Наблюдалось, что мышечные дефекты у не получавшего лечение контрольного животного в значительной степени замещались жировой и фиброзной тканью (группа инертного носителя). Лечение в дни 1-5, так и в дни 1-9 с помощью агониста ΚΑΚγ, снижало образование жировой и фиброзной рубцовой ткани, но оставляло большую вдавленность. Качество и количество заново образованной мышечной ткани были лучше в группе лечения дней 5-9, которая характеризовалась намного сниженной вдавленностью.

Гистоморфометрический анализ поврежденной мышечной ткани

Серийные срезы ткани на восстановленном участке окрашивали с помощью трихрома Массона и анализировали для количественного определения относительных количеств мышечной, жировой и фиброзной тканей в определенных областях с помощью программного обеспечения 1тадеРго, как было описано. Результаты показаны на фиг. 6. Анализ изображений подтвердил, что мышечная ткань группы лечения дней 5-9 содержит минимальное количество жировой и фиброзной ткани среди всех поврежденных групп. Это показывает, что регулирование времени лечения очень важно для более быстрого и лучшего восстановления мышечной ткани, и что более благоприятные результаты получают при терапевтическом усилении передачи сигнала ΚΑΚγ (например, путем введения агониста ΚΑΚγ) во время повышенной передачи сигнала эндогенного ретиноида, а не ранее.

Claims (29)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ восстановления мышцы у субъекта с поврежденной мышечной тканью, включающий местное или системное введение терапевтически эффективного количества агониста рецептора ретиноевой кислоты гамма (ΚΑΚγ) указанному субъекту.
2. 2. Способ по п.1, в котором введение начинают позже чем через 3 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.
3. 3. Способ по п.2, в котором введение начинают через 4 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта, или через 5 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта, или через 6 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта, или через 7 дней после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.
4. 4. Способ по п.2, в котором введение начинают через 5 дней и продолжают по меньшей мере до 7 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.
5. 5. Способ по п.4, в котором введение продолжают по меньшей мере до 9 дня после возникновения поврежденной мышечной ткани у субъекта.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором поврежденная мышечная ткань является результатом физической травмы или несчастного случая, заболевания, инфекции, перегрузки, прекращения кровообра- 29 026251 щения или мышечной атрофии или истощения.
7. 7. Способ по любому из пп.1-5, в котором поврежденная мышечная ткань представляет собой дистрофическую мышцу или стареющую мышцу.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором поврежденная мышечная ткань является результатом миопатии.
9. 9. Способ по п.8, в котором миопатия представляет собой воспалительную миопатию.
10. 10. Способ по п.8, в котором миопатия представляет собой оссифицирующий миозит.
11. 11. Способ по п.8, в котором миопатия представляет собой мышечную дистрофию.
12. 12. Способ по любому из пп.1-8, в котором у субъекта повреждена скелетная мышца.
13. 13. Способ снижения повреждения мышечной ткани у субъекта, страдающего миопатией, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества агониста ΚΑΚγ указанному субъекту.
14. 14. Способ по п.13, в котором у субъекта повреждена скелетная мышца.
15. 15. Способ по п.13, в котором повреждающей мышцы миопатией является воспалительная миопатия.
16. 16. Способ по п.13, в котором повреждающей мышцы миопатией является оссифицирующий миозит.
17. 17. Способ по п.13, в котором повреждающей мышцы миопатией является мышечная дистрофия.
18. 18. Способ по любому из пп.1-17, в котором субъект выбран из млекопитающего, представляющего собой мышь или человека.
19. 19. Способ по любому из пп.1-18, дополнительно предусматривающий введение субъекту противовоспалительного средства.
20. 20. Способ по любому из пп.1-19, в котором: (ί) агонист ΚΑΚγ представляет собой селективный агонист ΚΑΚγ; (ίί) агонист ΚΑΚγ представляет собой селективный агонист ΚΑΚγ/β; (ίίί) агонист ΚΑΚγ имеет по меньшей мере в 5 раз более высокую связывающую аффинность к рецептору ΚΑΚγ относительно рецептора ΚΑΚα или (ίν) агонист ΚΑΚγ имеет по меньшей мере в 5 раз более высокую связывающую аффинность к рецепторам ΚΑΚγ относительно рецепторов ΚΑΚα.
21. 21. Способ по любому из пп.1-20, в котором агонист ΚΑΚγ выбирают из группы, состоящей из следующего: СИ-271 (6-(4-метокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СИ-394, СИ-437 (6-(4-гидрокси-3-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота); СИ-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота); СИ-2247; паловаротен (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойная кислота); ВМ8-270394 (3-фтор-4-[(Κ)-2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); ВМ8-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота); СН-55 (4-[(Е)-3-(3,5-дитрет-бутилфенил)-3-оксопропенил]бензойная кислота); 6-[3-(адамантан-1-ил)-4-(проп-2-инилокси)фенил]нафталин-2-карбоновая кислота; 5-[(Е)-3-оксо-3-(5,5,8,8-тетрагидронафталин-2-ил)пропенил]тиофен-2-карбоновая кислота; и их энантиомеры, производные, пролекарства и фармацевтически приемлемые соли.
22. 22. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой (4-[(1Е)-2-[5,6,7,8-тетрагидро5,5,8,8-тетраметил-3-(1Н-пиразол-1-илметил)-2-нафталинил]этенил]бензойную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль.
23. 23. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой СИ-271 (6-(4-метокси-3трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота) или его фармацевтически приемлемую соль.
24. 24. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой СИ-394 или его фармацевтически приемлемую соль.
25. 25. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой СИ-437 (6-(4-гидрокси-3трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-илфенил)-2-нафталинкарбоновая кислота) или его фармацевтически приемлемую соль.
26. 26. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой СИ-1530 (4-(6-гидрокси-7-трицикло[3.3.1.13.7]дец-1-ил-2-нафталинил)бензойная кислота) или его фармацевтически приемлемую соль.
27. 27. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой СИ-2247 или его фармацевтически приемлемую соль.
28. 28. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой ВМ8-270394 (3-фтор-4-[(Ю-2гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота) или его фармацевтически приемлемую соль.
29. 29. Способ по п.21, в котором агонист ΚΑΚγ представляет собой ВМ8-189961 (3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота) или его фармацевтически приемлемую соль.