PT1716119E

PT1716119E - Análogos de ansamicinas contendo benzoquinona para o tratamento do cancro

Info

Publication number: PT1716119E
Application number: PT48170484T
Authority: PT
Inventors: Yun Gao; Julian Adams; Asimina T Georges Evangelinos; Louis Grenier; Roger H Pak; James R Porter; James L Wright
Original assignee: Infinity Discovery Inc
Priority date: 2003-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2013-06-04
Also published as: US20110086110A1; IL175911A0; CN102643233A; RU2484086C2; US20120058982A1; EP1716119B1; RU2006126797A; US8003634B2; US20130203724A1; US7608613B2; US8252779B2; AU2004309395A1; US7282493B2; KR20060132660A; EP2492261A1; IL206984A0; EP1716119A1; WO2005063714A1; KR101154351B1; RU2484086C9

Description

1

DESCRIÇÃO

"ANÁLOGOS DE ANSAMICINAS CONTENDO BENZOQUINONA PARA O TRATAMENTO DO CANCRO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A geldanamicina é uma lactama macrocíclica que é um membro da família de ansamicinas contendo benzoquinona de produtos naturais. 0 isolamento, preparação e vários usos de geldanamicina são descritos na Patente U.S. n° 3,595,955. Tal como a maioria dos membros de ocorrência natural desta classe de moléculas, a geldanamicina é tipicamente produzida como um produto de fermentação da estirpe de Streptomyces hygroscopicus var. geldanus var. nova (Journal of Antibiotics Vol. 23, página 442 (1970)). Outros análogos e derivados de geldanamicina foram identificados ou sintetizados, e o seu uso como agentes antitumorais é descrito nas Patentes U.S. n° 4,261,989 e 5,387,584, e pedidos de PCT publicados WO 00/03737 e WO 03/072794. Um membro desta família que foi examinado em algum detalhe é 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina ("17-AAG"). A geldanamicina e seus derivados demonstraram ligar a HSP90 e antagonizar a atividade da proteína. A HSP90 é uma proteína altamente abundante que é essencial para viabilidade das células e exibe funções duais de chaperona (J. Cell Biol. (2001) 154:267-273, Trends Biochem. Sei. (1999) 24:136-141). Ela representa um papel fundamental na resposta de tensão celular interagindo com muitas proteínas após a sua conformação nativa ter sido alterada por várias tensões ambientais, como choque térmico, assegurando dobramento adequado da proteína e 2 impedindo a agregação não-especifica (Pharmacological Rev. (1998) 50:493-513). Além disso, resultados recentes sugerem que a HSP90 pode também representar um papel no tamponamento contra os efeitos de mutação, presumivelmente corrigindo o dobramento impróprio das proteínas mutantes (Nature (1998) 396:336-342). Porém, a HSP90 também tem um papel regulador importante sob condições fisiológicas normais e é responsável pela estabilidade conformacional e maturação de várias proteínas específicas do cliente, das quais cerca de 40 são conhecidas (ver, Expert. Opin. Biol Ther. (2002) 2(1): 3-24). Estas podem ser subdivididas em três grupos: recetores de hormonas de esteroide, serina/treonina ou tirosina cinases e uma coletânea de proteínas aparentemente não-relacionadas, incluindo p53 mutante e a subunidade catalítica de telomerase hTERT. Todas estas proteínas representam papéis reguladores em processos fisiológicos e bioquímicos na célula.

Os antagonistas de HSP90 estão a ser correntemente explorados num número grande de contextos biológicos onde um efeito terapêutico pode ser obtido para uma condição ou distúrbio inibindo um ou mais aspetos da atividade de HSP90. Embora o foco primário estivesse nos distúrbios proliferativos, como cancros, outras condições estão a mostrar níveis de tratamento usando o antagonista de HSP90. Por exemplo, o Pedido de Patente Publicado U. S. 2003/0216369, divulga o uso de inibidores de HSP90 para o tratamento de distúrbios virais. Os inibidores de HSP90 têm também estado implicados numa ampla variedade de outras utilidades, incluindo o uso como agentes anti-inflamatórios, agentes para tratar a autoimunidade, agentes para tratar o acidente vascular cerebral, isquemia, distúrbios cardíacos e agentes úteis que promovem a 3 regeneração dos nervos (ver, por exemplo, WO 02/09696 (PCT/US01/23640); WO 99/51223 (PCT/US99/07242); Patente U.S. 6,210,974 Bl; e Patente US 6,174,875). Há relatórios na literatura que relatam que distúrbios fibrogenéticos incluindo mas não limitados a escleroderma, polimiosite, lúpus sistémico, artrite reumatoide, cirrose hepática, formação de queloide, nefrite intersticial e fibrose pulmonar podem ser tratáveis usando inibidores de HSP90. (Strehlow, WO 02/02123; PCT/US01/20578) . A potência nanomolar de Geldanamicina e seletividade aparente para matar células tumorais, como também a descoberta que o seu alvo primário em células mamíferas é HSP90, estimulou interesse no seu desenvolvimento como um fármaco anticancro. Porém, a solubilidade extremamente baixa destas moléculas e a associação de hepatotoxicidade com a administração de geldanamicina levaram a dificuldades em desenvolver um agente aprovável para aplicações terapêuticas. Em particular, a geldanamicina tem solubilidade em água fraca, tornando difícil a libertação em doses terapeuticamente eficazes.

Mais recentemente, a atenção tem-se focado nos derivados de 17-amino de geldanamicina, em particular 17-AAG, que mostra hepatotoxicidade reduzida ao mesmo tempo mantendo ligação a HSP90. Ver Patentes. U. S. n° 4,261,989; 5,387,584; e 5,932,566. Como a geldanamicina, a 17-AAG tem solubilidade aquosa muito limitada. Esta propriedade requer o uso de um portador solubilizante, por exemplo, fosfolipídeo de ovo com DMSO, ou Cremophore® (BASF Aktiengesellschaft), um óleo de rícino polietoxilado; a presença de qualquer um destes portadores resulta em reações secundárias sérias em alguns pacientes. 4

Por conseguinte, resta uma necessidade em descobrir análogos mais solúveis de ansamicinas contendo benzoquinona e métodos específicos e gerais para criá-los, particularmente a geldanamicina e seus análogos, como a 17-AAG. 0 documento WO 95/01342 descreve derivados de ansamicina, sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos destes. Os compostos são úteis na inibição de produtos de oncogene e como agentes antitumorais e anticancerígenos. O documento WO 03/013430 descreve análogos de ansamicina de benzoquinona úteis para o tratamento do cancro e de outras doenças ou condições caracterizadas pela proliferação celular indesejada ou hiperproliferação. O documento GB 2,106,111 descreve derivados de macbecin e sua produção. Os derivados são úteis como agentes antibacterianos, antifúngicos ou antiprozoal. O documento WO 93/14215 descreve um processo para a fermentação e isolamento de 4,5-dihidrogeldanamicina e sua hidroquinona. Os compostos deverão ser úteis contra certos micro-organismos e têm utilidade como agentes imunossupressores contra doenças autoimunes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece formas reduzidas de ansamicinas contendo benzoquinona, e sais destas na forma isolada e em preparações farmacêuticas, e usos deles para tratar e modular distúrbios associados à hiperproliferação, como o 5 cancro. Em geral, a presente divulgação fornece formas de fármacos solúveis, estáveis de ansamicinas contendo benzoquinona. A presente divulgação fornece análogos reduzidos de ansamicinas contendo benzoquinona, tais como análogos de 17-amino de geldanamicina na forma isolada e em preparações farmacêuticas, em que a benzoquinona é reduzida numa hidroquinona e capturada numa forma estável ao ar e isolada, como um sal de HCI ou de H2S04. Alternativamente, as hidroquinonas podem ser capturadas como co-sais com um aminoácido como a glicina. Tais análogos são notavelmente solúveis em água (1-3 ordens de magnitude mais solúveis que a forma não-reduzida, por exemplo, 35 pg/mL para 17-AAG vs. 1-3 mg/mL para a hidroquinona de 17-AAG, e >200 mg/mL para sais de derivados de hidroquinona de 17-AAG) e estáveis; e eles podem ser isolados e formulados para administração humana sem os problemas associados à formulação, armazenamento e instabilidade das formas de origem não-reduzidas e outras formulações de ansamicinas.

Num aspeto, a presente invenção fornece um composto puro e

em que X- é uma base conjugada de um ácido farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, X- é selecionado do grupo que 6 consiste em cloreto, brometo, iodeto, H2P04-, HS04-, metilsulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, trifluorometilsulfonato e 10-canforsulfonato, 5-sulfonato de ácido naftaleno-1- sulfónico, 2-sulfonato de ácido etan-1-sulfónico, sal de ácido ciclâmico, sal de ácido tiociânico, naftaleno-2-sulfonato e oxalato.

Outro aspeto da presente invenção refere-se à preparação de um composto de fórmula 3 compreendendo: A combinação de um composto da fórmula 1:

com um agente redutor num solvente de reação, seguido por tratamento com um ácido farmaceuticamente aceitável para se obter o referido composto de fórmula 3:

em gue X- é uma base conjugada de um ácido farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 7 7 Figura 1

Figura 2

Figura 3 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-Sal de Acetato de Dimetilamino de Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de Acetato de Dimetilamino de Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3. ilustra um espetro de RMN do Co-sal de α -Aminoisobutirato de Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4 .

Figura 4 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-sal de α-Aminoisobutirato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4.

Figura 5

Figura 6 ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS do Co-sal de α-Aminoisobutirato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 4. ilustra um espetro de XH RMN do Co-sal de β-Alanina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 5.

Figura 7 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-sal de β-Alanina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 5.

Figura 8 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-sal de β-Alanina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 5. 8 ilustra um espetro de ΧΗ RMN do Co-Sal de Glicina de JV-Metilo da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 6. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-Sal de Glicina de N-Metilo da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 6. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de Glicina de N-Metilo da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 6. ilustra um espetro de ΤΗ RMN do Co-Sal de Carboxilato de Piperidina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 7. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-Sal de Carboxilato de Piperidina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 7. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de Carboxilato de Piperidina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 7. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de Carboxilato de Piperidina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 7. ilustra um espetro de ΤΗ RMN do Co-Sal de Glicina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 8 . ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do 9

Co-Sal de Glicina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 8.

Figura 18 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de Glicina da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 8.

Figura 19 ilustra um espetro de ΤΗ RMN do Co-Sal de 2-Amino-2-etil-butirato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 9.

Figura 20

Figura 21

Figura 22 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-Sal de 2-Amino-2-etil-butirato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 9. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de 2-Amino-2-etil-butirato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 9. ilustra um espetro de XH RMN do Co-Sal de 1-Amino-ciclopropanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o

Figura 23

Figura 24 procedimento descrito no Exemplo 10. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-Sal de 1-Amino-Ciclopropanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 10. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de 1-Amino- ciclopropanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 10.

Figura 25 ilustra um espetro de XH RMN do Co-sal de 10

Carboxilato da Hidroguinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 11.

Figura 26 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-sal de Carboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 11.

Figura 27 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-sal de Carboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o

Figura 28 procedimento descrito no Exemplo 11. ilustra um espetro de ΤΗ RMN do Co-Sal de 1-Amino-ciclopentanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o

Figura 29

Figura 30 procedimento descrito no Exemplo 12. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-Sal de 1-Amino-ciclopentanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Co-Sal de 1-Amino- ciclopentanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12.

Figura 31 ilustra um espetro de XH RMN do Co-sal de Piperidinocarboxilato de iV-metilo da

Figura 32

Figura 33

Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 13. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Co-sal-de Piperidinocarboxilato de iV-metilo da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 13. ilustra espetros de massa de uma análise de 11 LCMS do Co-sal de Piperidinocarboxilato de N-metilo da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 13.

Figura 34 ilustra um espetro de 1H RMN do Co-sal de Acetato de Ν,Ν,Ν-Trimetilomónio da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o

Figura 35 procedimento descrito no Exemplo 14. ilustra um espetro de ΤΗ RMN dos Derivados de Hidroquinona Estável ao Ar de Geldanamicina de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 15.

Figura 36 ilustra um espetro de 1H RMN do Sal de HC1 do Derivado da Hidroquinona de Geldanamicina de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 17.

Figura 37 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de HC1 da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 17 .

Figura 38 ilustra um espetro de ΤΗ RMN do sal de H2S04 do Derivado da Hidroquinona de Geldanamicina de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 18.

Figura 39 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de H2SO4 da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 18.

Figura 40 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal de H2SO4 da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 18.

Figura 41 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do 12

Sal p-Toluenossulfónico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 19.

Figura 42

Figura 43

Figura 44 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal p-Toluenossulfónico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 19. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal p-Toluenossulfónico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 19. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de d-Canforsulfónico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 20.

Figura 45 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal de d-Canforsulf ónico da

Figura 46

Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 20. ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal de d-Canforsulf ónico da

Figura 47

Figura 48

Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 20. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de H3P04 da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 21.

Figura 49 ilustra espetros de massa de uma análise de

LCMS do Sal de H3P04 da Hidroquinona de 17-AAG 13 preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 21.

Figura 50 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de MeS03H da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 22.

Figura 51 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal de MeS03H da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 22.

Figura 52 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de PhS03H da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 23.

Figura 53 ilustra espetros de massa de uma análise de LCMS do Sal de PhS03H da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 23.

Figura 54 ilustra um espetro de 1H RMN do carbamato cíclico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 25.

Figura 55 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do carbamato cíclico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 25.

Figura 56 ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS do carbamato cíclico da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 25.

Figura 57 ilustra um espetro de ΤΗ RMN da lactama de Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 26. 14 14 Figura 58 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS da lactama da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 26.

Figura 59 ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS da lactama da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 26.

Figura 60 ilustra um espetro de ΤΗ RMN de um derivado de 17-amino da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 27 .

Figura 61 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS de um derivado de 17-amino da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 27.

Figura 62

Figura 63 ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS de um derivado de 17-amino da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 27. ilustra um espetro de 2Η RMN de um derivado de 17-(3-amino-propano-l, 2-diol) da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o

Figura 64

Figura 65 procedimento descrito no Exemplo 28. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS de um derivado de 17-(3-amino-propano-l,2-diol) da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 28. ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS de um derivado de 17-(3-amino-propano-l,2-diol) da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 28 . 15 Figura 66

Figura 67

Figura 68

Figura 69

Figura 70 ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS de um derivado de BODIPY da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 29. ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS de um derivado de BODIPY da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 29. ilustra um espetro de ΤΗ RMN do Sal de HBr da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 31. ilustra cromatogramas de uma análise de LCMS do Sal de HBr da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 31. ilustra um espetro de massa de uma análise de LCMS do Sal de HBr da Hidroquinona de 17-AAG preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 31.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

VISAO GERAL

A presente invenção fornece formas puras e isoladas, reduzidas de análogos de ansamicinas contendo benzoquinona, sais e intermediários para as mesmas. A presente divulgação também fornece métodos para o uso destes compostos no tratamento de doenças ou perturbações caracterizadas por hiperproliferação celular indesejada, tais como os cancros, como também outras condições e distúrbios associados à atividade de HSP90 indesejada ou em que a HSP90 representa um papel nas células envolvidas na causa do distúrbio. A 16 presente divulgação fornece análogos reduzidos de ansamicinas contendo benzoquinona onde a benzoquinona é reduzida numa hidroquinona, e preferivelmente isolada e purificada na forma de sal. Numa forma de realização alternativa, um composto da presente divulgação é co-cristalizado com um sal de aminoácido. Tais análogos, seja com ou sem o sal de aminoácido, são notavelmente solúveis em água (1-3 ordens de magnitude de solubilidade maior que a forma não-reduzida, por exemplo, 35 pg/mL de 17-AAG vs. 1-3 mg/mL para a hidroquinona de 17-AAG e >200 mg/mL para o sal da hidroquinona), e estáveis à temperatura ambiente; e podem ser isolados e formulados para administração humana sem os problemas associados à formulação, armazenamento e instabilidade da forma de origem não-reduzida e outras formulações de ansamicinas.

DEFINIÇÕES

As definições dos termos aqui usados são intencionadas para incorporar as presentes definições reconhecidas do estado da técnica para cada termo nos campos químicos e farmacêuticos. Quando apropriado, exemplificação é fornecida. As definições aplicam-se aos termos tal como se fossem usados ao longo deste relatório descritivo, a menos que de outro modo limitado em circunstâncias específicas, ou individualmente ou como parte de um grupo maior.

Quando a estereoquímica não for especificamente indicada, todos os estereoisómeros dos compostos inventivos estão incluídos dentro do âmbito da invenção, como compostos puros como também misturas destes. A menos que de outro modo indicado, enantiómeros, diastereómeros, isómeros geométricos individuais, e combinações e misturas destes 17 são todos abrangidos pela presente invenção. Formas cristalinas polimórficas e solvatos estão também abrangidos dentro do âmbito desta invenção.

Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere-se às moléculas que contêm uma quantidade de ácido carboxilico e uma quantidade de amino. As quantidades de ácido carboxilico e de amino são como definidas abaixo. Aminoácidos tanto de ocorrência natural como sinteticamente derivados estão abrangidos pelo âmbito da presente invenção. Como aqui usado, o termo "ansamicina de benzoquinona" refere-se a um composto compreendendo uma lactama macrociclica, compreendendo ainda apenas uma lactama no anel e uma quantidade de benzoquinona no anel de lactama, em que a dita quantidade de benzoquinona tem pelo menos um substituinte de azoto, em que um dos referidos pelo menos um substituinte de azoto é parte da dita apenas uma quantidade de amida no anel de lactama. Exemplos específicos de ansamicinas de benzoquinona de ocorrência natural que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, geldanamicina e herbimicina. 0 termo "análogo de geldanamicina" refere-se a uma ansamicina de benzoquinona que pode ser derivada de geldanamicina por exemplo, através de manipulação química; por exemplo 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-AAG) ou 17-(2-dimetilaminoetil)amino-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG).

Como aqui usado, o termo "isolado" em conexão com um composto da presente invenção significa que o composto não está numa célula ou organismo e o composto está separado de alguns ou todos os componentes que tipicamente o acompanham 18 por natureza.

Como aqui usado, o termo "puro" em conexão a uma amostra isolada de um composto da presente invenção significa que a amostra isolada contém pelo menos 60% em peso do composto. Preferivelmente, a amostra isolada contém pelo menos 70% em peso do composto. Mais preferivelmente, a amostra isolada contém pelo menos 80% em peso do composto. Com mais preferência, a amostra isolada contém pelo menos 90% em peso do composto. Com a maior preferência, a amostra isolada contém pelo menos 95% em peso do composto. A pureza de uma amostra isolada de um composto da presente invenção pode ser avaliada por vários métodos ou uma combinação deles; por exemplo cromatografia de camada fina, cromatografia preparativa ou flash, espetrometria de massa, HPLC, análise de RMN e outros.

Certos compostos contidos nas composições da presente invenção podem existir nas formas geométricas ou estereoisoméricas em particular. Além disso, polímeros da presente invenção podem também ser oticamente ativos. A presente invenção contempla todos os compostos, incluindo cis- e trans-isómeros, R e S-enantiómeros, diastereómeros, (D)-isómeros, (L)-isómeros, as misturas racémicas destes, e outras misturas destes, como caindo dentro do âmbito da invenção. Átomos de carbono assimétricos adicionais podem estar presentes num substituinte como um grupo alquilo. Todos tais isómeros, como também misturas destes, pretendem estar incluídos nesta invenção.

Por exemplo, se um enantiómero particular do composto da presente invenção for desejado, ele pode ser preparado através de síntese assimétrica, ou por derivação com um 19 auxiliar quiral onde a mistura diastereomérica resultante é separada e o grupo auxiliar é clivado para fornecer os enantiómeros puros desejados. Alternativamente, quando a molécula contiver um grupo funcional básico, como amino, ou um grupo funcional acidico, como carboxilo, os sais diastereoméricos são formados com um ácido ou base oticamente ativos apropriados, seguido por resolução dos diastereómeros desse modo formados por cristalização fracionária ou por meios cromatográficos bem conhecidos na técnica, e recuperação subsequente dos enantiómeros puros. 0 termo "sal farmaceuticamente aceitável" ou "sal" refere-se a um sal de um ou mais compostos. Sais farmaceuticamente aceitáveis adequados de compostos incluem sais de adição de ácido que podem, por exemplo, ser formados misturando uma solução do composto com uma solução de um ácido farmaceuticamente aceitável, como ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succinico, ácido benzoico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fosfórico, ácido carbónico ou outros. Onde os compostos carregarem uma ou mais quantidades acídicas, sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados por tratamento de uma solução do composto com uma solução de uma base f armaceut icamente aceitável, como hidróxido de lítio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de tetraalquilamónio, carbonato de lítio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, amónia, alquilaminas, ou outros. 0 termo "ácido farmaceuticamente aceitável" refere-se aos ácidos inorgânicos ou orgânicos que não exibem qualquer toxicidade substancial. Exemplos de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados 20 a ácido hidroclórico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fenilsulfónico, ácido metanossulfónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido benzoico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fosfórico, ácido carbónico e outros. O termo "co-sal" ou "co-cristal" refere-se às composições em que a forma de sal reduzida da ansamicina está presente com pelo menos um outro sal, como um sal de um aminoácido. O termo "indivíduo" como aqui usado, refere-se a um animal, tipicamente um mamífero ou um humano que será ou foi objeto de tratamento, observação e/ou experiência. Quando o termo for usado em conjunto com administração de um composto ou fármaco então o indivíduo foi o objeto de tratamento, observação e/ou administração do composto ou fármaco.

Os termos "co-administração" e "co-administrar" referem-se tanto à administração simultânea (administração de dois ou mais agentes terapêuticos ao mesmo tempo) como à administração em tempo variado (administração de um ou mais agentes terapêuticos de cada vez diferente da administração de um agente ou agentes terapêuticos adicionais), desde que os agentes terapêuticos estejam até certo ponto ao mesmo tempo presentes no paciente. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado, significa que a quantidade do composto ativo ou do agente farmacêutico que suscita uma resposta biológica ou medicinal numa cultura de célula, sistema de tecido, animal ou humano a ser pesquisado por um investigador, veterinário, clínico ou médico inclui alívio dos sintomas da doença, condição ou distúrbio a serem tratados. 21 0 termo "composição" destina-se a abranger um produto compreendendo os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, de combinações dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas, particularmente co-sais tais como o sal de ansamicina reduzida (por exemplo, sulfato) com um sal de um aminoácido (por exemplo, glicina). 0 termo "distúrbio mediado por HSP90" ou "distúrbio mediado por células que expressam HSP90" refere-se a estados patológicos e doenças em que a HSP90 desempenha um papel. Esses papéis podem estar diretamente relacionados com a condição patológica ou podem estar indiretamente relacionados com a doença. A caracteristica comum a esta classe de condições é que a condição pode ser melhorada através da inibição da atividade, função ou associação com outras proteínas de HSP90. 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um meio que é utilizado para preparar uma forma de dosagem desejada de um composto. Um veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir um ou mais solventes, diluentes, ou outros veículos líquidos; auxiliares de dispersão ou de suspensão; agentes ativos de superfície; agentes isotónicos; agentes espessantes ou emulsionantes; conservantes; ligantes sólidos; lubrificantes; e semelhantes. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Edição, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Edição, A. H. Kibbe ed. (American Pharmaceutical Assoe. 2000), divulgam vários veículos usados na formulação de 22 composições farmacêuticas e as técnicas conhecidas para a sua preparação.

Descrição de certas formas de realização preferidas A presente invenção trata da necessidade de gerar formas solúveis de ansamicinas, particularmente os membros das famílias contendo benzoquinona, como a geldanamicina. Os membros destas classes de moléculas macrocíclicas tendem a ser muito insolúveis, levando a perfis pobres, como potenciais fármacos (por exemplo, 17-AAG tem uma solubilidade de cerca de 100 pg/mL em uma solução aquosa). A presente invenção resolve estes problemas proporcionando esquemas de reação gerais, que podem ser usados para criar análogos destas moléculas que têm uma melhor solubilidade. Os esquemas de reação incluem a redução da quinona de tais moléculas para formar uma hidroquinona, e a captura da mesma como um sal, tal como sal de HC1 ou H2S04. Surpreendentemente, por exemplo, o sal HC1 de hidroquinona de 17-AAG tem uma solubilidade > cerca de 200 mg/mL.

Compostos

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com o composto acima mencionado e as definições concomitantes, em que X- é cloreto.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com o composto acima mencionado e as definições concomitantes, em que X- é brometo. 23

Numa forma de realização, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um composto de qualquer um dos compostos acima mencionados e um aminoácido.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o aminoácido é selecionado a partir do grupo constituído por:

O

As composições da presente invenção existem na forma de sais da ansamicina reduzida, por exemplo, sais de HC1 ou H2SO4. Numa outra forma de realização, os compostos são co-cristalizados com outro sal, tal como um aminoácido, por exemplo, glicina. Em geral, nestas formas de realização, a proporção de aminoácidos de ansamicina pode variar, mas é de preferência de 2:1 a 1:2 de aminoácido: ansamicina.

Composições e Formulações A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos compostos acima mencionados e, pelo menos, um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada, e as definições concomitantes, compreendendo ainda um antioxidante. presente invenção mencionada, e as ainda um agente de

Em certas formas de realização, a relaciona-se com a composição acima definições concomitantes, compreendendo tampão.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada, e as definições concomitantes, compreendendo ainda um agente quelante de metal.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada, e as definições concomitantes, compreendendo ainda um antioxidante; e um agente tampão.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada, e as definições concomitantes, compreendendo ainda um antioxidante; e um agente quelante de metal.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada, e as definições concomitantes, compreendendo ainda um agente de tampão; e um agente quelante de metal. 25

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada, e as definições concomitantes, compreendendo ainda um antioxidante; um agente de tampão; e um agente quelante de metal.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido antioxidante é ascorbato, cloridrato de cisteina, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, tioglicerol, mercaptoacetato de sódio, sulfoxilato formaldeido de sódio, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, gaiato de propilo, ou alfa-tocoferol.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido antioxidante é ascorbato.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido agente de tampão é citrato, ascorbato, fosfato, bicarbonato, carbonato, fumarato, acetato, tartarato, malato, succinato, lactato, maleato, glicina ou outros a- ou β-aminoácidos que ocorrem naturalmente.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido agente de tampão é citrato. 26

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido agente quelante de metal é ácido citrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o seu sal, o DTPA (ácido dietileno-triamina-penta-acético) e o seu sal, EGTA e o seu sal, NTA (ácido nitriloacético) e o seu sal, sorbitol e o seu sal, o ácido tartárico e o seu sal, N-hidroxi iminodiacetato e seu sal, ácido hidroxietil-etileno-diamina-tetra-acético e o seu sal, ácido 1- e 3-propanodiamina tetra-acético e seus sais, ácido 1- e 3-diamino-2-hidroxi propano tetra-acético e seus sais, gluconato de sódio, ácido hidroxi etano difosfónico e o seu sal, ou ácido fosfórico e seu sal.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido agente quelante de metal é EDTA.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido agente de tampão é citrato, o referido antioxidante é ascorbato, e o referido agente quelante de metal é EDTA.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1. 27

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 0,05.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 1.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 1.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido citrato para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,05 a cerca de 2.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido citrato para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,2 a cerca de 1.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido 28 EDTA para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1; e a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 1.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 0,05; e a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 1.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto 3 de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1; a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 1; a razão molar do referido citrato para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,05 a 2.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 0,05; a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,01 a cerca de 1; a razão molar do referido citrato para o referido composto de fórmula 3 está no intervalo de cerca de 0,2 a 1. 29

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição farmacêutica de qualquer uma das composições acima mencionadas, compreendendo ainda um agente de solubilização.

Em certas formas de realização, a presente invenção relaciona-se com a composição acima mencionada e as definições concomitantes, em que o referido agente solubilizante é ésteres de ácidos gordos de polioxietileno sorbitano, estearatos de polioxietileno, álcool benzilico, álcool etílico, polietileno glicóis, propileno glicol, glicerina, ciclodextrina, ou poloxameros. Métodos de Realização

Uma variedade de metodologias pode ser adaptada para gerar os compostos da presente invenção. Em geral, os passos envolvem (1) a conversão da ansamicina num análogo 17-desmetoxi-17-amino (por exemplo, 17-AAG), (2) a redução da benzoquinona na ansamicina para dar uma hidroquinona, e (3) o tratamento da referida hidroquinona com um ácido de Bronsted, proporcionando assim um composto da presente invenção.

Uma molécula macrocíclica contendo benzoquinona, pode ser obtida através de fermentação de uma estirpe produtora do composto (por exemplo, ver WO 03/072794 e Patente U.S. 3,595,955). Em alternativa, a metodologia sintética ou semissintética pode ser usada para produzir a ansamicina (ver Patente U.S. 5,387,584 e WO 00/03737). Além disso, existem fornecedores comerciais de materiais de fermentação isolados, tais como a geldanamicina; por conseguinte, estes materiais estão facilmente disponíveis. 30

Em formas de realização preferenciais, a metodologia sintética é usada para criar análogos de um produto natural isolado a partir de um organismo, utilizando métodos conhecidos. Por exemplo, a geldanamicina é isolada a partir de uma cultura de fermentação de um microrganismo adeguado e podem ser derivatizada usando uma variedade de reações de funcionalização conhecidos na arte. Os exemplos representativos incluem reações de acoplamento catalisadas por metal, oxidações, reduções, reações com nucleófilos, reações com eletrófilos, reações periciclicas, instalação de grupos protetores, remoção dos grupos protetores, e semelhantes. Vários métodos são conhecidos na arte para gerar análogos das várias ansamicinas de benzoquinona (por exemplo, ver Patentes U.S. Nos. 4,261,989; 5,387,584; e 5,932,566 e J. Med. Chem. 1995, 38, 3806-3812). Estes análogos são facilmente reduzidos, utilizando métodos descritos a seguir, para se obter os derivados de 18,21-di-hidro da presente invenção.

Uma vez que o material de partida é obtido, a benzoquinona é reduzida para formar uma hidroquinona e, em seguida, é feita reagir com um ácido, por exemplo HC1, para gerar uma ansamicina de hidroquinona de amónio C-17, numa forma de sal estável ao ar. Numa forma de realização alternativa a base livre de hidroquinona reage com um haleto de ácido de um aminoácido, em lugar de um ácido de Bronsted para gerar derivados de co-sais de ansamicina de hidroquinona de amónio C-17 estáveis ao ar. Este método é exemplificado no Exemplo 3.

Uma variedade de métodos e condições de reação podem ser usados para reduzir a porção de benzoquinona na ansamicina. 31 0 hidrossulfito de sódio pode ser utilizado como o agente redutor. Outros agentes redutores que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, pó de zinco com anidrido acético ou ácido acético, ácido ascórbico e as reduções eletroquimicas. A redução da fração de benzoquinona do derivado de ansamicina pode ser conseguida utilizando hidrossulfito de sódio numa mistura de reação bifásica. Tipicamente, o análogo de geldanamicina é dissolvido num solvente orgânico, tal como EtOAc. Outros solventes que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, clorobenzeno, THF, MeTHF, éter dietílico, diglima, 1,2-dimetoxietano, MTBE, THP, dioxano, 2-etoxibutano, éter metil-butilico, acetato de metilo, 2-butanona, água e as suas misturas. Dois ou mais equivalentes de hidrossulfito de sódio, são, em seguida, adicionados como uma solução em água (5-30% (m/v), preferencialmente 10% (m/v)), para o recipiente de reação à temperatura ambiente. As soluções aquosas de hidrossulfito de sódio são instáveis e, por conseguinte, precisam de ser preparadas imediatamente antes da utilização. Uma mistura vigorosa da mistura bifásica garante taxas de reação razoáveis. A reação pode ser facilmente seguida neste passo por inspeção visual uma vez que o material de partida 17-AAG tem uma cor púrpura que irá desaparecer à medida que a reação prossegue até o produto hidro-17AAG, que é amarelo. No entanto, por HPLC/UV ou outros métodos de análise pode ser utilizado para monitorizar a reação. 32

Depois de completada a redução, o produto de mistura de reação em bruto pode ser utilizado no passo seguinte sem purificação a fim de minimizar a oxidação da hidroquinona. No entanto, a purificação, de preferência, por recristalização, pode ser realizada, se as condições forem controladas para manter a forma reduzida da benzoquinona. A ansamiacina contendo hidroquinona é instável e, na presença de pequenas quantidades de oxigénio ou de outros oxidantes, a porção de hidroquinona pode ser rapidamente oxidada para as espécies de quinona. Notavelmente, a hidroquinona, pode ser convertida numa espécie estável ao ar através da reação com um ácido, ou por reação com um halogeneto de ácido de um aminoácido. Nos exemplos, o grupo amino alilo C-17 é protonado para gerar uma variedade de análogos estáveis ao ar de geldanamicina de hidroquinona do sal de amónio C-17. Além disso, as hidroquinonas do sal de amónio C-17 formadas têm a vantagem de ser altamente solúveis em soluções aquosas (> 200 mg/mL), ao contrário da 17-AAG (<100 pg/mL). A hidroquinona de sal de amónio é formada pela adição de uma solução de um ácido, tal como HC1, num solvente orgânico, tal como EtOAc, DCM, IPA ou dioxano, na hidroquinona contendo ansamicina numa solução orgânica; os solventes podem ser independentemente acetona, diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, clorobenzeno, THF, MeTHF, éter dietílico, diglima, 1,2-dimetoxietano, MTBE, THP, dioxano, 2-etoxibutano, éter metil-butilico, acetato de metilo, 2-butanona, sob azoto. O sal de amónio da hidroquinona é recolhido por filtração, em casos em que o produto precipita a partir da solução. 33

Nos casos em que o sal de amónio de hidroquinona não precipita, a solução de reação é concentrada sob pressão reduzida para produzir o produto.

Uma variedade de ansamicinas de sais de amónio hidroquinona estáveis ao ar pode ser sintetizada utilizando ácidos orqânicos ou inorgânicos. Alguns ácidos que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a HC1, HBr, H2S04, ácido metanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido triflico, ácido canforsulfónico, ácido naftaleno-1,5-dissulfónico, ácido etan-1,2-dissulfónico, ácido ciclamico, ácido tiocianico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido oxálico, e semelhantes. Ver, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sei. 66:1-19. 0 ácido utilizado de preferência, deve ter um pKa suficiente para protonar o azoto da anilina. Assim, qualquer ácido com um pKa entre cerca de -10 e cerca de 7, de preferência cerca de -10 e cerca de 4, mais preferencialmente entre cerca de -10 e cerca de 1, e ainda mais preferencialmente entre cerca de -10 e cerca de -3 pode ser usado para gerar a hidroquinona do sal de amónio. A presente invenção proporciona ainda métodos para a recristalização dos compostos da presente invenção. Em tais métodos, a recristalização é conseguida por dissolução do composto na quantidade mínima de um solvente orgânico polar inerte, tal como MeOH, EtOH ou IPA, e adição lenta de um solvente orgânico miscível, tal como um éter alifático, acetato de etilo, acetato metílico, clorofórmio ou DCM, fazendo com que a solução se torne turva. A mistura é então deixada repousar durante um período de tempo adequado e é, opcionalmente, arrefecida, e o sólido resultante é 34 recolhido por filtraçao, lavado e seco sob pressão reduzida.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido agente redutor é hidrossulfito de sódio, zinco, ácido ascórbico, ou uma redução eletroquimica.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido agente redutor é hidrossulfito de sódio.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido solvente da reação é diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, clorobenzeno, THF, 2-MeTHF, éter dietilico, diglima, 1,2-dimetoxietano, MTBE, THP, dioxano, 2-etoxibutano, éter metil-butilico, acetato de etilo, acetato metilico, 2-butanona, água, ou suas misturas.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido solvente da reação é uma mistura de acetato de etilo e água.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido tem um pKa entre cerca de -10 e cerca de 7 em água.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido tem um pKa entre cerca de -10 e cerca de 4 em água. 35

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido tem um pKa entre cerca de -10 e cerca de 1 em água.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido tem um pKa entre cerca de -10 e cerca de -3 em água.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido é HC1, HBr, H2S04, ácido metanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido ρ-toluenossulfónico, ácido triflico, ácido canforsulfónico, ácido naftaleno-1,5-dissulfónico, ácido etan-1,2-dissulfónico, ácido ciclâmico, ácido tiociânico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ou ácido oxálico.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido é HC1.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido é HBr.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido é adicionado na forma de gás.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido ácido é dissolvido num solvente orgânico. 36

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido solvente orgânico é EtOAc, DCM, IPA ou dioxano, para a hidroquinona contendo ansamicina numa solução orgânica, tal como a acetona, diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, clorobenzeno, THF, 2-MeTHF, éter dietilico, diglima, 1,2-dimetoxietano, MTBE, THP, dioxano, 2-etoxibutano, éter metil-butílico, acetato de metilo, ou 2-butanona.

Composições Farmacêuticas

Quando os compostos de Fórmula 3, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis são utilizados como agentes anti-proliferativos, tais como agentes anticancerigenos, podem ser administrados a um indivíduo mamífero quer isoladamente ou em combinação com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis numa composição farmacêutica de acordo com a prática farmacêutica normalizada. Os compostos podem ser administrados por via oral ou parentérica, de preferência por via parentérica. A administração parentérica inclui administração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea e tópica, sendo o método preferido de administração por via intravenosa.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona composições farmaceuticamente aceitáveis que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos compostos acima descritos (Fórmula 3) , formulados em conjunto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser especialmente formuladas para a administração em forma sólida ou líquida, incluindo as adaptadas para o seguinte: (1) administração 37 parentérica, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, um solução ou suspensão estéril, ou uma formulação de libertação sustentada; e (2) administração oral, por exemplo, remédios líquidos (soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, os dirigidos para a absorção bucal, sublingual, e sistémica, bolos, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua. 0 método preferido de administração dos compostos da presente invenção é a administração parentérica (intravenosa). J. Pharm. Sei. 66:1-19)

Tal como referido em cima, certas formas de realização dos presentes compostos podem conter um grupo funcional básico, tal como amino ou alquilamino, e, portanto, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com ácidos farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" a este respeito, refere-se aos sais de adição de ácidos relativamente não-tóxicos, inorgânicos e orgânicos, de compostos da presente invenção. Estes sais podem ser preparados in situ no veículo de administração ou a forma de dosagem do processo de produção, ou fazendo reagir separadamente um composto purificado da invenção na sua forma de base livre com um ácido orgânico ou inorgânico adequado, e isolando o sal assim formado durante a purificação subsequente. Os sais representativos incluem os sais de bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naptilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, e laurilsulfonato e similares. (Ver, por exemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", 38

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção incluem os sais não tóxicos convencionais ou sais de amónio quaternários dos compostos, por exemplo, a partir de ácidos orgânicos ou inorgânicos não-tóxicos. Por exemplo, esses sais não tóxicos convencionais incluem os derivados de ácidos inorgânicos tais como cloridrato, bromidrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico, e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos tais como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenossulfónico, metanossulfónico, etanodissulfónico, oxálico, isotiónico e afins.

Noutros casos, os compostos da presente invenção podem conter um ou mais grupos funcionais acídicos e, portanto, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis com bases farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" nestes casos, refere-se aos sais de adição de base relativamente não-tóxicos, inorgânicos e orgânicos, de compostos da presente invenção. Estes sais podem ser igualmente preparados in situ no veículo de administração ou a forma de dosagem do processo de produção, ou por reação separada do composto purificado na sua forma de ácido livre com uma base adequada, tal como o hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um catião metálico farmaceuticamente aceitável, com amoníaco, ou com uma amina farmaceuticamente aceitável orgânica primária, secundária ou terciária. Sais alcalinos ou alcalino-terrosos representativos incluem os de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e de alumínio e semelhantes. As aminas 39 orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de base incluem etilamina, dietilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina e semelhantes. (Ver, por exemplo, Berge et al. supra)

Agentes molhantes, emulsionantes e lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, edulcorantes, aromatizantes e agentes perfumantes, conservantes, agentes de solubilização, tampões e antioxidantes podem também estar presentes nas composições.

Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteina, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, tioglicerol, mercaptoacetato de sódio e formaldeido-sulfoxilato de sódio; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol.

Exemplos de agentes de tampão farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a citrato, ascorbato, fosfato, bicarbonato, carbonato, fumarato, acetato, tartarato e malato.

Exemplos de agentes solubilizantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a ésteres do ácido gordo de polioxietileno-sorbitano (incluindo polissorbato 80), estearatos de polioxietileno, álcool benzilico, álcool 40 etílico, polietileno glicóis, propileno glicol, glicerina, ciclodextrina e poloxameros.

Exemplos de agentes de complexação farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, ciclodextrinas (alfa, beta, gama), especialmente ciclodextrinas beta-substituídas, tais como beta 2-hidroxipropil, beta-dimetil, beta 2-hidroxietil, beta 3-hidroxipropil, beta trimetil.

Exemplos de agentes guelantes de metais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o seu sal, DTPA (ácido dietileno-triamina-penta-acético) e o seu sal, EGTA e o seu sal, NTA (ácido nitriloacético) e o seu sal, sorbitol e o seu sal, o ácido tartárico e o seu sal, N-hidroxi iminodiacetato e seu sal, ácido hidroxietil-etileno-diamina-tetra-acético e o seu sal, ácido 1- e 3-propanodiamina tetra-acético e seus sais, ácido 1- e 3-diamino-2-hidroxi propano tetra-acético e seus sais, gluconato de sódio, ácido hidroxi etano difosfónico e o seu sal, ou ácido fosfórico e seu sal.

Os métodos de preparação destas formulações ou composições incluem o passo de fazer a associação de um composto da presente invenção com o veículo e, opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas fazendo uniformemente e intimamente a associação de um composto da presente invenção com veículos líquidos (formulação líquida), veículos líquidos, seguido por liofilização (formulação em pó para reconstituição com água esterilizada ou semelhantes), ou veículos sólidos finamente 41 divididos, ou ambos, e depois, se necessário, dar forma ou empacotar o produto.

As composições farmacêuticas da presente invenção adequadas para administração parentérica compreendem um ou mais compostos da invenção em combinação com uma ou mais soluções, dispersões, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis aquosas ou não aquosas isotónicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis, que podem ser reconstituídos em soluções ou dispersões injetáveis estéreis imediatamente antes da utilização, que podem conter açúcares, álcoois, antioxidantes, tampões, bacteriostatos, agentes quelantes, solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recetor pretendido ou agentes de suspensão ou de espessamento. Nos exemplos, os ingredientes ativos são combinados com os veículos farmaceuticamente aceitáveis, em solução e, em seguida, são liofilizados para se obter um pó seco. 0 pó seco é embalado na forma de dosagem unitária e depois é reconstituído para administração parentérica através da adição de uma solução estéril, tal como água ou soro fisiológico normal, ao pó.

Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tal como o azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso das dispersões, e pelo uso de tensioativos. 42

Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da ação de microrganismos sobre os compostos da presente invenção pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e outros semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Em alguns casos, a fim de prolongar o efeito de um fármaco, é desejável retardar a absorção do fármaco a partir da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pela utilização de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo tendo fraca solubilidade em água. A taxa de absorção do fármaco depende então da sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrado parentericamente é conseguida por dissolução ou suspensão do fármaco num veículo oleoso.

As frases "administração parentérica" e "administrado por via parentérica" tal como aqui utilizadas, significam modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, 43 transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraspinal e intrasternal.

As frases "administração sistémica", "administrado sistemicamente", "administração periférica" e "administrado perifericamente", como aqui utilizadas, significam a administração de um composto, fármaco ou outro material que não diretamente no sistema nervoso central, de tal forma que entre no sistema do paciente e, assim, esteja sujeito a metabolismo e outros processos semelhantes, por exemplo, a administração subcutânea.

Uma formulação preferida para os compostos da presente invenção é um tampão aquoso contendo ácido cítrico (de cerca de 5 mM a cerca de 250 mM, preferencialmente desde cerca de 25 mM a cerca de 150 mM) , ácido ascórbico (de cerca de 0,1 mM a cerca de 250 mM, de preferência de cerca de 0,1 mM a cerca de 50 mM) e edetato (ácido de cálcio-dissódico de etilenodiamino tetra-acético, EDTA, desde cerca de 0,2 mM a cerca de 20 mM, de preferência entre cerca de 1 mM a cerca de 3 mM) , com o pH a ser ajustado a cerca de 3,1 com hidróxido de sódio. Os componentes da formulação atuam como agente de tampão, antioxidante e quelante de metais, respetivamente. É importante que as formulações dos compostos da presente invenção proporcionem solubilidade e estabilidade redox para este sal de hidroquinona. Os compostos da presente invenção são significativamente solubilizados em pH mais baixo, quando a amina é protonada. A distribuição de espécies é importante uma vez que a forma ionizada é mais solúvel, enquanto a base livre (forma não ionizada) é menos solúvel. Portanto, uma formulação irá otimizar a 44 solubilidade, ao controlar o pH da solução. Um agente de tampão tal como o citrato, que tem uma elevada capacidade tampão numa gama de pH preferida é um tal componente de formulação preferido. De preferência, os agentes de tampão vão tamponar a formulação entre um pH de cerca de 1,5 a cerca de 5,0, mais preferivelmente entre um pH de cerca de 1,8 a cerca de 3,5, e ainda mais preferivelmente entre um pH de cerca de 3 a cerca de 3,3.

Os análogos hidroquinona da presente invenção, podem oxidar-se em repouso prolongado na solução. Os metais pesados, tais como o ferro e cobre, são capazes de catalisar reações de oxidação e podem ser encontrados em pequenas quantidades nos reagentes e material de laboratório típicos. A proteção da natureza oxidante de metais pesados pode ser proporcionada por agentes quelantes de metais, tais como o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético). Outros agentes quelantes conhecidos são, por exemplo, o ácido cítrico, DTPA (ácido dietileno-triamina-penta-acético) e o seu sal, de EGTA e o seu sal, NTA (ácido nitriloacético) e o seu sal, o sorbitol e o seu sal, o ácido tartárico e o seu sal, N-hidroxi iminodiacetato e seu sal, ácido hidroxietil-etileno-diamina-tetra-acético e seu sal, ácido 1- e 3-propanodiamina tetra-acético e seus sais, ácido 1- e 3-diamino-2-hidroxi propano tetra-acético e seus sais, gluconato de sódio, ácido hidroxi etano difosfónico e o seu sal, e ácido fosfórico e seu sal. oxigénio

Outro método importante de prevenir a oxidação é a de adicionar um antioxidante. Um antioxidante preferido é o ácido ascórbico (ascorbato). Este reagente protege compostos do efeito oxidante de oxigénio molecular 45 dissolvido no meio aquoso. Em certas formas de realização, o ácido ascórbico é usado como um componente em formulações dos análogos de hidroquinona da presente invenção.

As formulações da presente invenção incluem formulações que são capazes de armazenamento em prateleira, bem como as formulações utilizadas para administração direta a um paciente. Especificamente, as composições farmacêuticas/formulações da presente invenção são proporcionadas de uma forma mais concentrada do que a adequada para administração direta a um paciente. Tal composição é geralmente diluída numa bolsa IV para administração a um paciente. É importante em tal utilização que a formulação contida no saco IV seja estável durante cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas, mais preferivelmente estável durante cerca de 1 hora até cerca de 2 horas, mais preferivelmente estável durante cerca de 2 horas. A estabilidade tem de ser mantida durante todo o período em que o fármaco é administrado.

Além disso, é importante que a capacidade tampão da formulação diluída no saco IV seja suficiente para atingir esta estabilidade, embora não sendo uma concentração demasiado elevada que cause uma reação negativa no paciente. Se estiver presente demasiado, tal pode resultar num certo número de efeitos indesejáveis no doente. Métodos de Terapia e Tratamento A presente invenção proporciona a hidroquinona solúvel em água contendo compostos que oxidam rapidamente em análogos de geldanamicina benzoquinona 17-amino substituídos (por exemplo, 17-AAG), quer in vitro e in vivo, a um pH fisiológico. Como tal, os análogos de hidroquinona da presente invenção exibem atividades biológicas e perfis terapêuticos semelhantes assim como os análogos de geldanamicina 17-amino substituídos, e podem ser utilizados para todas as indicações terapêuticas conhecidas, para as quais os análogos de geldanamicina 17-amino substituídos são úteis em tratamento. Os análogos de geldanamicina 17-amino substituídos, e em particular a 17-AAG, são inibidores altamente potentes e seletivos de HSP90. A presente invenção proporciona adicionalmente um composto para utilização no tratamento, melhoria de um ou mais dos sintomas de, e na redução da gravidade de distúrbios hiperproliferativos, isto é o cancro, bem como de outros distúrbios ou condições mediados por HSP90. Uma vez que as composições da presente invenção são mais solúveis do que as formas oxidadas de benzoquinona, as composições são mais facilmente administradas, resultando em melhores resultados clínicos para qualquer um dos usos conhecidos das moléculas-mãe.

Os métodos de tratamento envolvem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção a um indivíduo que sofre de um distúrbio ou condição mediados por HSP90, tal como o cancro. As descrições das composições, formulações, dosagens, modos de administração e tratamento são descritos neste documento.

Determinados análogos de geldanamicina 17-amino substituídos foram sintetizados e a sua utilização como agentes anti-tumorais é descrita nas Patentes U.S. n° 4,261,989 e 5,387,584, 5,932,566 e publicação dos pedidos 47 de PCT WO 00/03737 e WO 03/072794. As relações entre estrutura e atividade de análogos de geldanamicina 17-amino substituídos têm elucidado ainda mais sobre as características químicas necessárias para a inibição de HSP90 (Ver, por exemplo, J. Med. Chem. (1995) 38:3806-3812, J. Med. Chem. (1995) 38:3813-3820, e Clin. Câncer Res. (1999) 5:3781) .

Entre os análogos de geldamicina 17-amino substituídos mais bem sucedidos está a 17-AAG, a qual tem mostrado uma ampla atividade anti-tumoral in vitro e in vivo e está atualmente em ensaios clínicos de fase múltipla I/II. A 17-AAG exibe citotoxicidade diferencial contra uma ampla gama de tipos de tumor no painel de linhas de células tumorais NC1 60. A média de IC50 sobre todas as linhas de células no painel é de 120 nM (Developmental Therapeutics Program Website: http://dtp.nci.nih.gov/, gráfico médio para o composto S330507).

Além disso, a 17-AAG tem demonstrado ter atividade contra uma série de linhas celulares, incluindo, mas não se limitando a, melanoma (Anti-Cancer Drugs (2004) 15: 377-388), cancro da próstata (Clin. Câncer Res. (2002) 8: 986-993), cancro da mama (Câncer. Res. (2001) 61: 2945-2952), cancro de pulmão das células não pequenas (Ann. Thorac. Surg. (2000) 70: 1853-1860), leucemias (Câncer Res. (2001) 61: 1799-1804), e cancro do cólon (J. Natl. Câncer Inst. (2003) 95: 1624-1633) .

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um composto para utilização no tratamento do cancro, compreendendo a administração a um mamífero necessitado, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos 48 compostos acima mencionados; ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições farmacêuticas acima mencionadas.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido cancro é um cancro do sistema hematopoiético, sistema imunológico, sistema endócrino, sistema pulmonar, sistema gastrointestinal, sistema musculoesquelético, sistema reprodutivo, sistema nervoso central, ou sistema urológico.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o cancro está localizado nos tecidos mieloides do mamífero, tecidos linfoides, tecidos pancreáticos, tecidos da tiroide, pulmões, tecidos do cólon, tecidos retais, tecidos anais, tecidos do fígado, pele, osso, tecidos do ovário, tecidos uterinos, tecidos cervicais, mama, próstata, tecidos testiculares, cérebro, tronco cerebral, tecidos meningiais, rim, ou bexiga.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o cancro está localizado em tecidos mieloides do mamífero, tecidos linfoides, mama, pulmão, ovário, ou próstata.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido cancro é o cancro da mama, mieloma múltiplo, cancro da próstata, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, carcinoma de células renais, melanoma maligno, cancro pancreático, 49 cancro do pulmão, carcinoma colorretal, cancro do cólon, cancro no cérebro, cancro renal, cancro de cabeça e pescoço, cancro da bexiga, cancro da tireoide, cancro da próstata, cancro do ovário, cancro cervical, ou sindrome mielodisplásica.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido cancro do mamifero é o cancro da mama, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, melanoma, mieloma múltiplo, cancro do pulmão, cancro do ovário ou cancro da próstata.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido mamifero é um primata, equino, canino, felino, ou bovino.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o referido mamifero é um ser humano.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o modo de administração do referido composto é a inalação, via oral, intravenosa, sublingual, ocular, transdérmica, retal, vaginal, tópica, intramuscular, intra-arterial, intratecal, subcutânea, bucal, ou nasal.

Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao método mencionado em cima, em que o modo de administração é a administração intravenosa.

Terapia de Combinação 50

Numa outra forma de realização, o presente invento proporciona um composto para utilização no tratamento em que os compostos e composições da invenção são usados em niveis subcitotóxicos em combinação com pelo menos um outro agente de modo a atingir a atividade seletiva no tratamento do cancro. Em certas formas de realização, os compostos da presente invenção são usados para reduzir os niveis celulares de proteínas cliente de HSP90 corretamente dobradas, que depois são eficazmente inibidas pelo que o segundo agente ou cuja degradação no proteassoma é inibida através de um inibidor de proteassoma, por exemplo, "Velcade". A ligação das proteínas cliente HSP90 estabiliza as proteínas cliente e mantém-nas numa forma inativa solúvel preparada para responder a estímulos de ativação. A ligação de um análogo de ansamicina de benzoquinona da presente invenção a HSP90 resulta no direcionamento da proteína cliente para o proteassoma, e subsequente degradação. Utilizando um agente que direciona e inibe proteassomas bloqueia a degradação de proteassoma que conduz a um aumento da apoptose celular e morte celular.

Alguns exemplos de agentes antineoplásicos que podem ser usados em combinação com os métodos da presente invenção incluem, em geral, agentes de alquilação; agentes antiangiogénicos; antimetabolitos; epidofilotoxinas; uma enzima anti-neoplásica; um inibidor de topoisomerase; procarbazina; mitoxantrona; complexos de coordenação de platina; antimicóticos; modificadores de resposta biológica e inibidores de crescimento; agentes terapêuticos hormonais/anti-hormonais e fatores de crescimento hematopoiéticos. 51

Classes exemplificativas de agentes antineoplásicos incluem ainda a família antraciclina de fármacos, fármacos vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleosídeos citotóxicos, epotilonas, discodermolídeo, a família pteridino de fármacos, dinenes e podofilotoxinas.

Membros dessas classes particularmente úteis incluem, por exemplo, carminomicina, daunorubicina, aminopterina, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, mitomicina C, porfiromicina, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurina, gemcitabina, citosina arabinosida, podofilotoxina ou derivados de podofilotoxina, tais como etoposido, fosfato de etoposido ou teniposido, melfalan, vinblastina, vincristina, leurosidina, Velcade, doxorrubicina, vindesina, leurosina, mesilato de imatinib, paclitaxel, taxol, e outros semelhantes. Numa forma de realização preferida, o agente antineoplásico é Velcade, doxorubicina, taxotere, docetaxel, paclitaxel, cis-platina, mesilato de imatinib, ou gemcitebina. Numa forma de realização preferida, o agente antineoplásico é Velcade ou doxorrubicina.

Outros agentes antineoplásicos úteis incluem estramustina, carboplatina, ciclofosfamida, bleomicina, gemcitibine, ifosamide, melfalano, hexametilmelamina, tiotepa, citarabina, idatrexato, trimetrexato, dacarbazina, L-asparaginase, camptotecina, CPT-11, topotecano, ara-C, bicalutamida, flutamida, leuprolida, derivados de piridobenzoindole, interferões e interleucinas. 0 agente quimioterapêutico e/ou a terapia de radiação podem ser administrados de acordo com protocolos terapêuticos bem conhecidos na técnica. Será evidente para os especialistas 52 na técnica que a administração do agente quimioterapêutico e/ou terapia de radiação podem ser variados, dependendo da doença a ser tratada e dos efeitos conhecidos do agente quimioterapêutico e/ou terapia de radiação nessa doença. Além disso, de acordo com o conhecimento do médico perito, os protocolos terapêuticos (por exemplo, quantidades de dosagem e tempos de administração) podem ser variados tendo em vista os efeitos observados dos agentes terapêuticos administrados (isto é, o agente antineoplásico ou radioterapia) no paciente, e tendo em vista as respostas observadas da doença aos agentes terapêuticos administrados.

Além disso, em geral, os compostos da presente invenção e o agente quimioterapêutico não têm que ser administrados na mesma composição farmacêutica, e podem, devido a diferentes caracteristicas fisicas e químicas ter de ser administrados por vias diferentes. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem ser administrados por via intravenosa, para gerar e manter bons níveis de sangue, enquanto o agente quimioterapêutico pode ser administrado por via oral. A determinação do modo de administração e a conveniência de administração, quando possível, na mesma composição farmacêutica, está bem dentro do conhecimento do médico especialista. A administração inicial pode ser feita de acordo com protocolos estabelecidos conhecidos no estado da técnica, e, em seguida, com base nos efeitos observados, a dosagem, modos de administração e os tempos de administração podem ser modificados pelo médico especialista. A escolha particular do agente quimioterapêutico ou radiação dependerá do diagnóstico dos médicos assistentes e 53 do seu discernimento do estado do paciente e do protocolo de tratamento apropriado.

Um composto da presente invenção, e um agente quimioterapêutico e/ou radiação podem ser administrados simultaneamente (por exemplo, ao mesmo tempo, essencialmente ao mesmo tempo ou dentro do mesmo protocolo de tratamento) ou sequencialmente, dependendo da natureza da doença proliferativa, da condição do paciente, e da escolha real do agente quimioterapêutico e/ou de radiação a serem administrados em conjunto (isto é, dentro de um único protocolo de tratamento) com um composto da presente invenção.

Se um composto da presente invenção, e o agente quimioterapêutico e/ou radiação não forem administrados simultaneamente ou essencialmente em simultâneo, então a ordem de administração ideal do composto da presente invenção, e o agente quimioterapêutico e/ou radiação, podem ser diferentes para diferentes tumores. Assim, em certas situações, o composto da presente invenção pode ser administrado primeiro, seguido pela administração do agente quimioterapêutico e/ou radioterapia; e em outras situações, o agente quimioterapêutico e/ou de radiação pode ser administrado primeiro, seguido pela administração de um composto do presente invento. Esta administração alternativa poderá ser repetida durante um único protocolo de tratamento. A determinação da ordem de administração, e o número de repetições de administração de cada agente terapêutico, durante um protocolo de tratamento, está bem abrangido pelo conhecimento do médico perito, após a avaliação da doença a ser tratada e da condição do paciente. Por exemplo, o agente quimioterapêutico e/ou 54 radiação podem ser administrados em primeiro lugar, especialmente se for um agente citotóxico, e, em seguida, o tratamento é continuado com a administração de um composto da presente invenção, seguido, quando determinado vantajoso, pela administração do agente quimioterapêutico e/ou radiação, e assim por diante até que o protocolo de tratamento esteja completo.

Assim, de acordo com a experiência e conhecimento, o médico praticante pode modificar cada protocolo para a administração de um componente (agente terapêutico, isto é, o composto da presente invenção, agente quimioterapêutico ou radiação) do tratamento de acordo com as necessidades individuais do paciente, à medida que o tratamento prossegue.

Dosagem

Quando os compostos da presente invenção forem administrados como produtos farmacêuticos, a humanos e animais, eles podem ser administrados per se ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, 0,1 a 99% (mais preferivelmente, de 10 a 30%) de ingrediente ativo em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Os níveis de dosagem efetiva dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz em alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. 55 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto particular da presente invenção empregue, ou um seu sal, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de metabolismo ou excreção do composto em particular a ser utilizado, a taxa e extensão de absorção, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com o composto em particular utilizado, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e historial médico do paciente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas.

Um médico ou veterinário com conhecimentos correntes na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar com doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que os requeridos, a fim de conseguir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado.

De um modo geral, uma dose adequada de um composto da invenção será a quantidade do composto que é a menor dose segura e eficaz para produzir um efeito terapêutico. Tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. Geralmente, as doses intravenosas dos compostos da presente invenção para um paciente irão variar entre cerca de 10 mg a cerca de 1000 mg por metro2 administradas duas vezes por semana, de preferência entre cerca de 75 mg a 750 mg por metro2 administradas duas vezes por semana, e ainda mais preferencialmente 100 mg a 500 mg por metro2 administradas duas vezes por semana. 56

Embora seja possível que um composto da presente invenção seja administrado individualmente, é preferível administrar o composto como uma formulação farmacêutica (composição). 0 paciente que recebe este tratamento é qualquer animal em necessidade, incluindo primatas, em particular humanos, e outros mamíferos tais como equinos, bovinos, suínos e ovinos; e aves de capoeira e animais de estimação em geral.

Um ou mais outros compostos ativos podem ser adicionados às formulações descritas acima, para proporcionar formulações de combinação para a terapia do cancro.

EXEMPLIFICAÇÃO

Sendo a invenção agora genericamente descrita, esta será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluídos apenas para fins de ilustração de certos aspetos e formas de realização da presente invenção, e que não se destinam a limitar a invenção. Além disso, os aminoácidos estão representados em forma zwitteriónica, e também pode ser ainda protonados e existir na forma de sais. 57

Exemplo 1

Preparação de Derivados de Hidroquinona Estáveis ao Ar da Família de Moléculas de Geldanamicina d m'

Esquema de Reação 1 0 composto da Fórmula (la) (1,0 equiv) é dissolvido em diclorometano (0,02 M) e agitado com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1:1; DCM: solução aquosa). A solução é agitada durante 30 minutos. A camada orgânica é, então, removida através de uma seringa e a solução aquosa é extraída mais uma vez com diclorometano. As soluções orgânicas combinadas são lavadas com salmoura e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de um cloreto de ácido (1,0 equiv) em diclorometano (0,001 M) . A mistura de reação é agitada durante 12 h e vertida sobre uma solução de diclorometano. A camada orgânica é então lavada com água adicional (2,0 mL); as camadas aquosas combinadas são então liofilizadas para produzir o produto. 58

Exemplo 2

Preparação de Derivados de Hidroquinona Estáveis ao Ar da Família de Moléculas de Geldanamicina

0 composto da Fórmula (la) (0,25 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em diclorometano (3 mL) e agitado com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,5 mL) . A solução é agitada durante 30 minutos. A camada orgânica é, então, removida através de uma seringa e a solução aquosa é extraída mais uma vez com diclorometano. As soluções orgânicas combinadas são diluídas com 3 mL de EtOAc, lavadas com salmoura e adicionalmente secas por remoção azeotrópica da água residual e EtOAc sob pressão reduzida (3 mL de um total de solvente removidos sob pressão reduzida) . A esta solução é adicionada uma solução de um ácido num solvente orgânico. A solução resultante é então arrefecida a -5 °C e um ácido (0,25 mmol) em tolueno (0,2 mL) é adicionado. Um sólido surge lentamente a partir da solução. MTBE (3 mL) é então adicionado e a mistura resultante é deixada a aquecer até à TA e é agitada a esta temperatura durante 50 minutos. 0 sólido é então recolhido por filtração sob vácuo, é lavado com MTBE (2x3 mL) , e é seco sob pressão reduzida para produzir o produto. 59

Exemplo 3

Preparação do Co-sal de Acetato de Dimetilamino da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (9,1 mg, 0,016 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 1,0 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,0 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto do ácido dimetilaminoacetilo (2,5 mg, 0,016 mmol, 1,0 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3, 0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 2 como um pó 60 fofo branco (7,1 mg, 0,011 mmol, 66% de rendimento). O material foi analisado por ΤΗ RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 4

Preparação do Co-sal de α-Aminoisobutirato da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (16,7 mg, 0,0285 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 1,5 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,5 mL) . A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto de ácido (4,4 mg, 0,0314 mmol, 1,1 equiv) em 0,2 0 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram 61 liofilizadas para se obter 3 como um pó fofo branco (15,1 mg, 0,0224 mmol, 79% de rendimento). O material foi analisado por 1R RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 5

Preparação do Co—sal de 3~AJ-an^-na da Hidroquinona de 17—AAG

O

17-Alilaminogeldanamicina (1) (16,7 mg, 0,0285 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 1,5 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,5 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraida com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida , adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (4,52 mg, 0,0314 mmo1, 1, 1 equiv) em O CM O mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraida e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram 62 liofilizadas para se obter 4 como um pó fofo branco (12 mg, 0,0237 mmol, 83% de rendimento). O material foi analisado por ΧΗ RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 6

Preparação do Co-sal de N-Metil Glicina da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (15,1 mg, 0,0258 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 1,5 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,5 mL) . A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraida com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (3,7 mg, 0, 0258 mmol, 1,0 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraida e em seguida lavada com 2,0 mL 63 de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 5 como um pó fofo branco (15,4 mg, 0,0234 mmol, 91 % de rendimento). O material foi analisado por ’ή RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 7

Preparação do Co-sal de Carboxilato de Piperidina da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (16 mg, 0,027 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 1,5 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,5 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,25 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (5,5 mg, 0,03 mmol, 1,1 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada 64 orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 6 como um pó fofo branco 1—1 i—1 mg, 0,019 mmol, 60% de rendimento). 0 material foi analisado por XH RMN em D20 e LC-MS. Exemplo 8

Preparação do Co-sal de Glicina da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (16,2 mg, 0,028 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 1,5 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (1,5 mL) . A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (3,4 mg, 0,03 mmol, 1,1 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada 65 orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 7 como um pó fofo branco (3 ,1 mg, 0,0051 mmol, 19% de rendimento; misturas 3:1 de regioisómeros de fenol). 0 material foi analisado por RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 9

Preparação do Co-sal de 2-Amino-2-etil-butirato da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (48 mg, 0,082 mmol, 1,0

equiv) foi dissolvida em 4,8 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (4,8 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 1 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (16,8 mg, 0,09 mmol, 1,1 equiv) em 1 mL de diclorometano. A 66 mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 8 como um pó fofo branco (24,7 mg, 0,034 mmol, 41% de rendimento) . O material foi analisado por 1H RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 10

Preparação do Co-sal de 1-Amino-Ciclopropanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (48 mg, 0,082 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 4,8 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (4,8 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 1 mL de

diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (14,1 mg, 0,09 mmol, 1,1 equiv) em 1 mL de diclorometano. A 67 mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 9 como um pó fofo branco (36,2 mg, 0,051 mmol, 62% de rendimento) . O material foi analisado por ΧΗ RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 11

Preparação do Co-sal de Carboxilato da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (24 mg, 0,041 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 2,4 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (2,4 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (7,8 mg, 0,045 mmol, 1,1 equiv) em 0,20 mL de 68 diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 10 como um pó fofo branco (25,8 mg, 0,038 mmol, 92% de rendimento). O material foi analisado por ΧΗ RMN em D2O e LC-MS.

Exemplo 12

Preparação do Co-sal de 1-Amino-ciclopentanocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG

17-Alilaminogeldanamicina (1) (48 mg, 0,082 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 4,8 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (4,8 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido 69 (17 mg, 0,09 mmol, 1,1 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 11 como um pó fofo branco (34,3 mg, 0,049 mmol, 60% de rendimento). 0 material foi analisado por ΧΗ RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 13

Preparação do Co-sal de N-Metil Piperidinocarboxilato da Hidroquinona de 17-AAG

O

17-Alilaminogeldanamicina (1) (21,8 mg, 0,038 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 2 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (2 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas 70 diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (8,1 mg, 0,041 mmol, 1,1 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 12 como um pó fofo branco (15,2 mg, 0,0213 mmol, 56% de rendimento). O material foi analisado por ΧΗ RMN em D20 e LC-MS.

Exemplo 14

Preparação do Co-sal de Acetato de N,N,N-Trimetilamónio da Hidroquinona de 17-AAG

1 13 17-Alilaminogeldanamicina (1) (113 mg, 0,19 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvida em 2 mL de diclorometano e agitada com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (2 mL). A solução púrpura escura ficou amarela após 5 min e a mistura foi agitada durante 25 min adicionais. A camada orgânica foi removida por meio de seringa e a solução aquosa foi extraída com um adicional de 0,30 mL de diclorometano. As soluções orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1,0 mL) e, em seguida, adicionadas 71 diretamente a uma solução de cloridrato de cloreto ácido (33 mg, 0,21 mmol, 1,1 equiv) em 0,20 mL de diclorometano. A mistura de reação foi agitada durante 2 h e vertida para um funil de decantação com 3,0 mL de água. A camada orgânica foi extraída e em seguida lavada com 2,0 mL de água adicional. As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas para se obter 13 como um pó fofo branco (78 mg, 0,11 mmol, 57% de rendimento). O material foi analisado por 1H RMN em CDC13/DMS0 de deutério (6:1) e LC-MS.

Exemplo 15

Preparação de Derivados de Hidroquinona de 17-AAG Estáveis ao Ar a partir de Geldanamicina

Geldanamicina (28) (0,14 g, 0,25 mmol, 1,0 equiv) é adicionada a um frasco de 10 mL, seguido por uma solução de alil-amina (0,075 mL, 1,0 mmol, 4 equiv.) em MeTHF (0,625 mL) . A pasta resultante é aquecida a 40 °C sob azoto durante 10 horas. A mistura de reação foi então arrefecida até à temperatura ambiente, diluída com 1,0 mL de MeTHF, lavada com uma solução saturada de NH4C1 (1,5 mL) e NaCl (1,5 mL) saturado. A camada orgânica foi então recolhida e 72 tratada com uma solução aquosa recém preparada de hidrossulfito de sódio (1 mL, 20% (m/m) ) com agitação vigorosa sob azoto durante 45 minutos. A camada aquosa foi em seguida removida e a camada orgânica foi então lavada com 1,5 mL de água desgaseifiçada. A solução orgânica foi, em seguida, seca por remoção azeotrópica de água utilizando MeTHF. Isto foi conseguido através da adição de 2 mL de MeTHF e então a concentração (cerca de 2 mL) da solução resultante sob pressão reduzida a 70 °C. A solução resultante é então arrefecida a 0 °C num banho de gelo e, em seguida, cloridrato de cloreto ácido de a-aminoisobutirico (0,04 g, 0,25 mmol, 1,0 equiv.) é adicionado sob azoto. A mistura de reação é agitada durante 3 horas, altura em que o sólido é recolhido por filtração e lavado com MeTHF (2X2 mL) . 0 sólido é então seco sob pressão reduzida para produzir o produto como um pó amarelo (171 mg, 0,2425 mmol, 97% de rendimento global).

Exemplo 16

Cristalização das Formas do Co-Sal de Hidroquinona de 17-AAG O composto 7 é dissolvido na quantidade mínima de MeOH e, em seguida, EtOAc é lentamente adicionado gota a gota, até a turbidez persistir. A mistura é então deixada em repouso durante 14 horas e depois o sólido é recolhido por filtração, lavado com EtOAc e seco sob pressão reduzida. 73

Exemplo 17

Cl

0 composto da Fórmula (1) (0,450 g, 0,768 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em diclorometano (50 mL) e agitado com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (50 mL) . A solução é agitada durante 30 minutos. A camada orgânica foi recolhida, seca sobre Na2S04, filtrada e transferida para um frasco de fundo redondo. A esta solução foi adicionada uma solução de HC1 em dioxano (4 N, 0,211 mL, 1,1 equiv.). A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto durante 30 minutos. Um sólido amarelo surge lentamente a partir da solução. O sólido amarelo foi purificado por forma de recristalização MeOH/EtOAc para render 0,386 g do IPI-504 (15) .

Exemplo 18

0 composto da Fórmula (1) (0,30 g, 0,5 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em MTBE (3 mL) e agitado com uma solução aquosa a 20% de hidrossulfito de sódio (2 mL). A solução é agitada durante 60 minutos. A camada orgânica foi recolhida, seca com salmoura, e transferida para um frasco de fundo redondo. Esta solução foi arrefecida a -5 °C e colocada sob atmosfera de azoto. A esta solução foi adicionada uma solução de H2S04 em etanol desnaturado (0,50 mmol de H2S04 em 0,5 mL de EtOH) gota a gota. A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto e aquecida à TA. A pasta amarela foi agitada durante um período adicional de 30 minutos à TA e depois foi concentrada. MTBE (7 mL) foi adicionado e a suspensão foi filtrada. O sólido amarelo que foi recolhido foi lavado com MTBE e seco sob pressão reduzida para produzir 0,30 g do produto desejado. 75

Exemplo 19

Θ T0ISO3

0 composto da Fórmula (1) (0,30 g, 0,5 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em DCM (6 mL) e agitado com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (3,5 mL). A solução é agitada durante 60 minutos. A camada orgânica foi recolhida, lavada com salmoura, e 1,2 mL (calc. 0,1 mmol de hidroquinona) são transferidos para um frasco de fundo redondo. Esta solução foi colocada sob azoto. A esta solução foi adicionada uma solução de ácido de p-toluenosulfónico em IPA desnaturado (0,100 mmol de p-toluenosulfónico em 0,25 mL de IPA) gota a gota. A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto durante 1 hora, altura em que a mistura foi concentrada e a massa em bruto foi ressuspensa a partir de EtOAc/MTBE. 0 sólido foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para produzir 0,068 g do produto desejado. 76

Exemplo 20

0 composto da Fórmula (1) (0,30 g, 0,5 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em DCM (6 mL) e agitado com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (3,5 mL). A solução é agitada durante 60 minutos. A camada orgânica foi recolhida, lavada com salmoura, e 1,2 mL (calc. 0,1 mmol de hidroquinona) são transferidos para um frasco de fundo redondo. Esta solução foi colocada sob azoto. A esta solução foi adicionada uma solução de ácido de d-canforsulónico em IPA desnaturado (0,100 mmol de d-canf orsulónico em 0,25 mL de IPA) gota a gota. A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto durante 1 hora, altura em que a mistura foi concentrada e a massa em bruto foi ressuspensa a partir de EtOAc/MTBE. O sólido foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para produzir 0,051 g do produto desejado. 77

Exemplo 21

0 composto da Fórmula (1) (0,30 g, 0,5 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em DCM (6 mL) e agitado com uma solução aquosa a 10% de hidrossulfito de sódio (3,5 mL). A solução é agitada durante 60 minutos. A camada orgânica foi recolhida, lavada com salmoura, e 1,2 mL (calc. 0,1 mmol de hidroquinona) são transferidos para um frasco de fundo redondo. Esta solução foi colocada sob azoto. A esta solução foi adicionada uma solução de H3P04 em IPA desnaturado (0,100 mmol de H3P04 em 0,25 mL de IPA) gota a gota. A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto durante 1 hora, altura em que a mistura foi concentrada e a massa em bruto foi ressuspensa a partir de EtOAc/MTBE. O sólido foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para produzir 0,050 g do produto desejado. 78

Exemplo 22

0 composto da Fórmula (1) (0,50 g, 0,8 miriol, 1,0 equiv) é dissolvido em DCM (8 mL) e agitado com uma solução aquosa a 15% de hidrossulfito de sódio (4 mL) . A solução é agitada durante 60 minutos. A camada orgânica foi recolhida, lavada com salmoura, e 2 mL (calc. 0,2 mmol de hidroquinona) são transferidos para um frasco de fundo redondo. Esta solução foi colocada sob azoto. A esta solução foi adicionada uma solução de MeS03H em IPA desnaturado (0,200 mmol de MeS03H em 0,4 mL de IPA) gota a gota. A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto durante 1 hora, altura em que a mistura foi concentrada e a massa em bruto foi ressuspensa a partir de EtOAc. O sólido foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para produzir 0,112 g do produto desejado. 79

Exemplo 23

0 composto da Fórmula (1) (0,50 g, 0,8 mmol, 1,0 equiv) é dissolvido em DCM (8 mL) e agitado com uma solução aquosa a 15% de hidrossulfito de sódio (4 mL) . A solução é agitada durante 60 minutos. A camada orgânica foi recolhida, lavada com salmoura, e 2 mL (calc. 0,2 mmol de hidroquinona) são transferidos para um frasco de fundo redondo. Esta solução foi colocada sob azoto. A esta solução foi adicionada uma solução de PhS03H em IPA desnaturado (0,200 mmol de PhS03H em 0,4 mL de IPA) gota a gota. A mistura resultante foi deixada a agitar sob azoto durante 1 hora, altura em que a mistura foi concentrada e a massa em bruto foi ressuspensa a partir de EtOAc. 0 sólido foi recolhido por filtração e seco sob pressão reduzida para produzir 0,118 g do produto desejado. 80

Exemplo 24

17-alil-amino-17-Demetoxigeldanamicina (10,0 g, 17,1 mmol) em acetato de etilo (200 mL) foi agitada vigorosamente com uma solução recentemente preparada de hidrossulfito de sódio aquoso a 10% (200 mL) durante 2 h à temperatura ambiente. A cor mudou de púrpura escura a amarelo brilhante, indicando uma reação completa. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio (15 g). 0 agente de secagem foi lavado com acetato de etilo (50 mL). 0 filtrado combinado foi acidificado com 1,5 M de cloreto de hidrogénio em acetato de etilo (12 mL) até um pH 2 durante 20 min. A pasta resultante foi agitada durante 1,5 h à temperatura ambiente. Os sólidos foram isolados por filtração, lavados com acetato de etilo (50 mL) e secos a 40 °C, 1 mm Hg, durante 16 h para se obter 9,9 g (91%) de um sólido esbranquiçado. Cloridrato de hidroquinona em bruto (2,5 g) foi adicionado a uma solução agitada de 5% a 0,01 N aq. de ácido clorídrico em metanol (5 mL). A solução resultante foi clarificada por filtração, em seguida, diluída com acetona (70 mL). Sólidos apareceram 81 após 2-3 min. A pasta resultante foi agitada durante 3 h à temperatura ambiente, depois durante lha 0-5 °C. Os sólidos foram isolados por filtração, lavados com acetona (15 mL) e secos.

Exemplo de Referência 25

17-alil-amino-17-Demetoxigeldanamicina (0,350 g, 0,598 mmol) em acetato de etilo (7 mL) foi agitada vigorosamente com uma solução recentemente preparada de hidrossulfito de sódio aquoso a 10% (7 mL) durante 1 h à temperatura ambiente. A cor mudou de púrpura escura a amarelo brilhante, indicando uma reação completa. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio (1 g) . O agente de secagem foi lavado com acetato de etilo (1 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram agitadas à temperatura ambiente e a estas adicionou-se trifosgénio (0,079 g, 0,239 mmol). Um precipitado foi formado e a mistura resultante foi deixada a agitar durante 2 horas. Nesse ponto, o sólido foi removido por filtração e a solução orgânica foi concentrada. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna para produzir 17 mg do produto desejado. 82

Exemplo de Referência 26 82

17-alil-amino-17-Demetoxigeldanamicina (0,825 g, 0,141 mmol) em acetato de etilo (17,5 mL) foi agitada vigorosamente com uma solução recentemente preparada de hidrossulfito de sódio aquoso a 10% (17,5 mL) durante 1 h à temperatura ambiente. A cor mudou de púrpura escura a amarelo brilhante, indicando uma reação completa. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio (1 g) . O agente de secagem foi lavado com acetato de etilo (1 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram agitadas à temperatura ambiente e a estas adicionou-se cloreto de bromoacetilo (0,222 g, 1,41 mmol). Um precipitado foi formado e a mistura resultante foi deixada a agitar durante 12 horas. Nesse ponto, o sólido foi removido por filtração e a solução orgânica foi concentrada. 0 material em bruto foi dissolvido numa mistura 1:1 de THF/Água (16 mL) . Na2C03 (10 equiv) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada vigorosamente durante 1 hora. A reação foi extinta com NaHC03 saturado, lavada com salmoura, seca sobre MgS04 e concentrou-se para se obter 1,1 mg do produto desejado. 83

Exemplo de Referência 27 83 0

tNHj &, W/% NííjS-jO* 3. HC3

mh

Geldanamicina (1,12 g, 2 mmol, 1 equiv) foi adicionado a D CM anidro (5 mL) . NH3 em MeOH foi adicionado a esta solução (9 mL, 100 mmol, 50 equiv) e deixou-se agitar durante 24 horas. Nesse ponto, a solução da reação foi diluída com DCM e extraiu-se com água, seguida por HC1 diluído. A camada orgânica foi recolhida lavada com salmoura, seca sobre Na2SC>4 e concentrada para se obter um sólido púrpura. Este sólido foi recristalizado duas vezes a partir de acetona/heptano para originar 0,239 de 17-amino-17-demetoxigeldanamicina. 17-amino-17-demetoxigeldanamicina (0,55 g, 1 mmol, 1 equiv) foi dissolvida em EtOAc (100 mL) . Uma solução recentemente preparada de hidrossulf ito de sódio aquoso a 10% (10 mL) foi adicionada e agitada durante 1 h à temperatura ambiente. A cor mudou de púrpura escura a amarelo brilhante, indicando uma reação completa. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio. 0 agente de secagem foi lavado com acetato de etilo (2 x 10 mL). O filtrado combinado foi acidificado com 1,5 M de cloreto de hidrogénio em acetato de etilo (1 mL) 84 até um pH 2 durante 20 min. A pasta resultante foi agitada durante 1,5 h à temperatura ambiente. Os sólidos foram isolados por filtração, lavados com acetato de etilo (10 mL) e secos sob vácuo para se obter o produto (0,524 g, 87% de rendimento).

Exemplo de Referência 28

Geldanamicina (0,500 g, 0,892 mmol, 1 equiv) foi dissolvido em THF (10 mL) de 3-amino-l, 2-propanodiol (0,813g, 8,92 mmol, 10 equiv.). A reação foi agitada durante 64 horas. A reação foi então temperada com HC1 diluído e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi recolhida seca sobre MgSCg e concentrada sob pressão reduzida. O material em bruto foi purificado utilizando cromatografia em coluna para produzir 27 mg da geldenamicina 17-amino substituída. A geldanmicina 17-amino (0,200 g, 0,323 mmol, 1 equiv) foi dissolvida em EtOAc (4 mL) e tratada com uma solução recentemente preparada de 10% de Na2S204 em água (4 mL) . Esta mistura foi agitada vigorosamente durante 1 hora. A camada orgânica foi então recolhida. A camada aquosa foi extraída com 2x5 mL de EtOAc. As camadas orgânicas foram 85 combinadas, lavadas com água, secas sobre Na2SC>4. A camada orgânica foi, em seguida, tratada com HC1 em EtOAc (1,6 M, 0,6 mL) e agitada durante 20 minutos. A solução de reação foi concentrada sob pressão reduzida para originar o produto (0,009 g).

Exemplo de Referência 29

Geldanamicina (0,022 g, 0,04 mmol, 1,5 equiv) e BODIPY-FL-EDA-HC1 (0,010 g, 0,026 mmol, 1 equiv) foram adicionados a D CM anidro (2 mL) . DIPEA (30 pL, 0,16 mmol, 6 equiv) foi adicionado e a solução de reação foi agitada sob azoto durante 72 horas. A reação foi então diluída com DCM, extraída com água, seca sobre Na2S04 e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto em foi purificado por cromatografia em coluna para se obter a benzoquinona 17-amino substituída. Este material foi dissolvido em EtOAc (20 mL) e tratado com uma solução recentemente preparada de 10% de Na2S204 em água (5 mL) . Esta mistura foi agitada vigorosamente durante 1 hora. A camada orgânica foi então recolhida. A camada aquosa foi extraida com 2x5 mL de EtOAc. As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com água, secas sobre Na2S04. A camada orgânica foi, em seguida, tratada com HC1 em EtOAc (1,6 M, 0,6 mL) e agitada durante 20 minutos. A solução da reação foi então 86 concentrada até à secura sob pressão reduzida. 0 produto em bruto foi purificado por novo procedimento de pasta do material a partir de EtOAc/MTBE. 0 sólido foi lavado com MTBE e seco sob pressão reduzida para produzir o produto (0,04 g) .

Exemplo 30

-HaPfÉOAS--2} HO®QAè, ÂcstoHâ

Acetato de etilo anidro (170 mL) foi adicionado a um frasco, seguido por 17-AAG (8,41 g, 1,44 mmol, 1 eguiv.). A mistura púrpura resultante foi agitada vigorosamente sob atmosfera de azoto. Uma solução recentemente preparada de 10% de Na2S204 (aq) (1,682 g em 170 mL de água desionizada, 10,1 mmol, 7 equiv) foi adicionada e a mistura foi agitada vigorosamente durante 70 min. A cor mudou de púrpura para laranja indicando uma reação completa. As camadas foram deixadas a separar-se e a camada aquosa inferior foi removida utilizando um fúnil de decantação. A camada orgânica foi seca com MgS04. O agente de secagem foi removido por filtração. 0 filtrado foi transferido para um frasco evaporador rotativo. O acetato de etilo (50 mL) foi utilizado, em porções, para lavar a almofada de MgS04 e o filtrado de lavagem também foi adicionado ao frasco evaporador rotativo. 87 A mistura cor de laranja-castanha foi concentrada no evaporador rotativo até se obter um óleo. 0 acetato de etilo remanescente foi removido sob vácuo.

Enquanto esta mistura foi concentrada, uma solução 5,3 M de HC1 em acetato de etilo foi preparada. Acetato de etilo (16,8 mL) foi adicionado a um frasco de Erlenmeyer e HC1 gasoso foi borbulhado na mistura em agitação durante 1 h (com arrefecimento, acetona/gelo húmido) para atingir a saturação. A solução foi então aquecida até à temperatura ambiente, sob um espaço de azoto. 0 óleo foi dissolvido em acetona (252 mL) e transferido para um frasco de reação equipado com um funil de adição, um agitador, um termómetro e uma atmosfera de azoto. 0 filtrado combinado e lavagem foram acidificados, durante 5 minutos até um pH final de 2,5. A pasta resultante foi agitada durante 18 min à temperatura ambiente e os sólidos foram, em seguida, isolados por filtração e lavados duas vezes com acetona (84 mL) . 0 sólido foi então seco sob pressão reduzida para produzir o produto.

Exemplo 31

17-alil-amino-17-Demetoxigeldanamicina (1,0 g, 1,71 mmol) em acetato de etilo (20 mL) foi agitada vigorosamente com uma solução recentemente preparada de hidrossulfito de sódio aquoso a 10% (2 g em 20 mL de água) durante 30 h à temperatura ambiente. A cor mudou de púrpura escura a amarelo brilhante, indicando uma reação completa. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio (1 g). O solvente da reação foi recolhido e o agente de secagem foi lavado com acetato de etilo (1 mL). O filtrado combinado foi arrefecido a 0 °C e acidificado com 1,5 M de brometo de hidrogénio em acetato de etilo até se formar um precipitado. A pasta resultante foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os sólidos foram isolados por filtração, lavados com acetato de etilo (1 mL) e secos a 40 °C, 1 mm Hg, durante 16 h para se obter 0,352 g (31 %) de um sólido esbranquiçado.

Exemplo 32

Preparação de 50 mM de Citrato, 50 mM de Ascorbato, pH 3,1, 2,44 mM de EDTA, como o Tampão da Formulação para os Compostos da Presente Invenção

Exemplo de Preparação da Formulação:

Para 1 L de preparação do tampão de formulação, 9,6 g de ácido cítrico (USP), 8,8 g de ácido ascórbico (USP) e 1,0 g de EDTA (ácido etilenodiamina-tetra-acético, sal dissódico de cálcio, di-hidratado, USP) foi adicionado com uma barra de agitação magnética revestida de teflon num frasco volumétrico de 1 L. A água esterilizada para injeção (USP) foi adicionada a 90-95% do volume final do frasco. A solução foi agitada vigorosamente para dissolver todos os 89 sólidos. 0 pH do tampão foi ajustado para 3,1 usando uma solução de NaOH. WFI foi adicionada ao volume final. 0 tampão foi filtrado a vácuo através de uma unidade de filtro de 0,2 micrómetros. Antes da utilização, a solução foi aspergida com azoto durante 1-2 h. O tampão da formulação foi armazenado sob azoto a 4 °C num recipiente fechado.

Preparação do Fármaco Formulado: O Fármaco foi formulado a 4 °C por dissolução controlada do composto sólido 15 com o tampão pré-refrigerado aspergido com azoto num recipiente com revestimento arrefecido a água sob um espaço superior de azoto. A solução do composto 15 formulada foi armazenada a 4 °C, sob um espaço superior de azoto.

Um exemplo da preparação do fármaco formulado em solução, é dado abaixo.

Um frasco volumétrico de 10 mL foi carregado com o composto sólido 15 (500 mg) e purgado com azoto. O tampão da formulação (citrato a 50 mM, ascorbato a 50 mM, EDTA a 2,44 mM, pH de 3,1) foi aspergido com azoto até que o teor de oxigénio dissolvido fosse de <0,5 mg/L e arrefeceu-se em gelo. Uma porção do tampão (cerca de 5-7 mL) foi adicionada ao frasco volumétrico e agitada vigorosamente até todo o sólido ser dissolvido. O tampão foi, então, adicionado até à marca de 10 mL do frasco volumétrico. A solução foi mantida fria sobre gelo tanto quanto possível. Uma seringa de 10 mL com uma seringa de filtro (membrana Millipore, Durapore, de 0,2 micrómetros) foi usada para filtrar a solução límpida, levemente bronzeada para um frasco de 90 vidro (USP Tipo I). A solução do composto 15 formulada foi armazenada a 4 °C, sob um espaço superior de azoto.

Um exemplo da preparação do fármaco formulado em forma sólida, é dado abaixo. 52,50 g de água esterilizada foram adicionados a um frasco de 100 mL equipado com uma barra de agitação magnética. 6,305 g de mono-hidrato de ácido cítrico foram adicionados ao frasco de 100 mL e a mistura resultante foi agitada até todo o ácido cítrico se ter dissolvido na solução. 5,284 g de ácido L-ascórbico foram então adicionados ao frasco de 100 mL e a solução foi agitada até que todo o ácido ascórbico se ter dissolvido numa solução. 0,600 g de edetato dissódico de cálcio foram então adicionados ao frasco de 100 mL, e a mistura resultante foi agitada até que todo o edetato de cálcio dissódico se ter dissolvido na solução. O pH da solução foi então ajustado para um pH de 3,1 por adição lenta de uma solução de hidróxido de sódio a 5 M em água. A solução foi então espargida com azoto filtrado (Millipak 20, Durapore de 0,22 micrómetros) durante 2 horas. 52,04 g da solução aspergida foram então arrefecidos a 0 0 C sob azoto, com agitação. 2,80 g do composto 15 foram adicionados e a mistura resultante foi agitada até que todo o composto 15 foi dissolvido. Esta solução foi esterilizada por filtração utilizando um filtro Durapore Millipak 200 com tamanho de poro de 0,22 micrómetros a 0 °C. 0 espaço superior do recipiente de receção, em seguida, foi lavado com azoto filtrado (Millipak 20, durapore de 0,22 micrómetros). 0 recipiente de receção foi então colocado num

liofilizador, o qual tinha sido pré-arrefecido a -40 °C. A 91 câmara do liofilizador foi mantida a - 40 °C durante 3 horas, a 1 atm. A pressão da câmara do liofilizador foi então em aumentada até 100 micrómetros ao longo de uma hora. Em seguida, a temperatura da câmara foi aumentada até -20 °C ao longo de 2 horas e o vácuo foi mantido a 100 micrómetros. A temperatura da câmara foi então aumentada até 0 °C ao longo de 2 horas e o vácuo foi mantido a 100 micrómetros. Em seguida, a temperatura da câmara foi aumentada até 0 °C ao longo de 2 horas e o vácuo foi mantido a 100 micrómetros. A temperatura da câmara foi então aumentada até +10 °C ao longo de 2 horas e o vácuo foi mantido a 100 micrómetros. Em seguida, a temperatura da câmara foi aumentada até +20 °C ao longo de 2 horas e o vácuo foi mantido a 100 micrómetros. A temperatura da câmara foi então aumentada até +20 °C ao longo de 48 horas e o vácuo foi mantido a 100 micrómetros. A câmara foi então aspergida com azoto e um batente foi fixado ao recipiente contendo a formulação. A formulação foi armazenada a -20 °C.

Exemplo 33

Preparação de 75 mM de Citrato, 170 mM de Ascorbato, pH 3,0, 2,44 mM de EDTA, 1% (p/v) de gama-ciclodextrina como o Tampão da Formulação para os Compostos da Presente Invenção

Exemplo de Preparação da Formulação:

Para 1 L de preparação do tampão de formulação, 14,4 g de ácido cítrico, 30 g de ácido ascórbico, 10 g de gama- ciclodextrina (ciclooxtamilose) e 1,0 g de EDTA foram adicionados com uma barra de agitação magnética revestida de teflon num frasco volumétrico de 1 L. A água 92 esterilizada para injeção foi adicionada a 90-95% do volume final do frasco. A solução foi agitada vigorosamente para dissolver todos os sólidos. O pH do tampão foi ajustado para 3,0 usando uma solução de NaOH (grau NF) . WFI foi adicionada ao volume final. O tampão foi filtrado a vácuo através de uma unidade de filtro de 0,2 micrómetros. Antes da utilização, a solução foi aspergida com azoto durante 1-2 h. O tampão da formulação foi armazenado sob azoto a 4 °C num recipiente fechado.

Preparação do Fármaco Formulado: O Fármaco foi formulado a 4 °C por dissolução controlada do composto sólido 15 com o tampão pré-refrigerado aspergido com azoto sob um espaço superior de azoto. A solução do composto 15 formulada foi armazenada a 4 °C, sob um espaço superior de azoto.

Exemplo 34

Preparação de 50 mM de Citrato, 25 mM de Ascorbato, 1% (v/v) de Polisorbato-80, 0,1% (p/v) de EDTA, pH 3,0, como o Tampão da Formulação para os Compostos da Presente Invenção

Exemplo de Preparação da Formulação:

Para 1 L de preparação do tampão de formulação, 9,6 g de ácido cítrico, 4,4 g de ácido ascórbico, 10 mL de polisorbato-80 e 1,0 g de EDTA (ácido etilenodiamina-tetra-acético, sal dissódico de cálcio, di-hidratado) foram adicionados com uma barra de agitação magnética revestida de teflon num frasco volumétrico de 1 L. A água esterilizada para injeção (WFI) foi adicionada a 90-95% do 93 volume final do frasco. A solução foi agitada vigorosamente para dissolver todos os sólidos. 0 pH do tampão foi ajustado para 3,0 usando uma solução de NaOH. WFI foi adicionada ao volume final. O tampão foi filtrado a vácuo através de uma unidade de filtro de 0,2 micrómetros. Antes da utilização, a solução foi aspergida com azoto durante 1-2 h. 0 tampão da formulação foi armazenado sob azoto a 4 °C num recipiente fechado.

Preparação do Fármaco Formulado: O Fármaco foi formulado por dissolução controlada do

composto sólido 15 com o tampão aspergido com azoto. A solução do composto 15 formulada foi armazenada a 4 °C, sob um espaço superior de azoto.

Exemplo 35

Materiais e Métodos para Análise In Vltro Culturas de Células

As linhas de células cancerígenas humanas SKBr3, MV4-11, K562, SK-MEL-28, LnCAP e MDA-MB-468 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). 0 mieloma múltiplo RPMI-8226 e as células MM1.s eram do Dr. Teru Hideshima (Jerome Lipper Multiple Myeloma Center, Dana Farber Câncer Institute, Boston, MA, EUA.). Todas as linhas de células foram determinadas como sendo livres de micoplasma. As células foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS inactivado pelo calor, 50 unidades/mL e estreptomicina a 50 unidades/mL de penicilina, e incubou-se a 37 °C em 5% de C02. As células 94 aderentes foram dissociadas com tripsina a 0,05% e 0,02% de EDTA em tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio, antes do plaqueamento para efeitos de experimentação.

Análise In Vitro

Citotoxicidade celular de MMl.s

Ensaio Alamar Blue. As células MMl.s (50.000 células/poço) foram incubadas durante 72 h com concentrações crescentes do composto de teste. Alamar blue foi adicionado aos poços e a fluorescência foi medida 4 h após a incubação a 37 °C.

Citotoxicidade celular de SKBr3

As células SKBr3 foram incubadas durante 72 h com concentrações crescentes do composto de teste. Para os estudos de viabilidade, Alamar blue foi adicionado e os poços foram lidos após 6 horas de incubação.

Citotoxicidade celular de MDA-MB-468

As células MDA-MB-468 foram incubadas durante 72 h com concentrações crescentes do composto de teste. Para os estudos de viabilidade, Alamar blue foi adicionado e os poços foram lidos após 6 horas de incubação.

Citotoxicidade celular de MV4-11

As células MV 4-11 foram incubadas durante 3 dias com concentrações crescentes do composto de teste. A 95 viabilidade das células foi avaliada usando uma leitura com Alamar blue.

Citotoxicidade celular de K562

As células K562 foram incubadas com concentrações crescentes do composto de teste. A viabilidade das células foi avaliada usando uma leitura com Alamar blue.

Citotoxicidade celular de SK-MEL-28

Concentrações crescentes do composto de teste foram adicionadas a células SK-MEL-28 em cultura durante 2, 3 ou 4 dias, e a viabilidade das células foi medida usando Alamar blue.

Citotoxicidade celular de LnCAP

Concentrações crescentes do composto de teste foram adicionadas a células LnCAP em cultura durante 4 dias, e a viabilidade das células foi medida usando Alamar blue.

Exemplo 36

Ensaio de Ligação competitiva a HSP90 para 17-AAG e Composto 15

Materiais A proteína humana nativa Hsp90 isolada a partir de células HeLa (SPP-770), canino recombinante Grp94 (SPP-766), e 96 humana recombinante Hsp70 (ESP-555) foram adquiridos a partir de StressGen Biotechnologies (Victoria, BC). Comprimidos de inibidor de protease Complete™ foram obtidos a partir de Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) . Todos os outros produtos químicos e reagentes foram adquiridos à Sigma-Aldrich e são de grau analítico ou superior.

Ensaio de ligação PF - Ligação de BODIPY-GDM a Proteínas Purificadas

Os procedimentos foram modificados com base em Llauger-Bufi et al. (Llauger-Bufi L, Felts SJ, Huezo H, Rosen N, Chiosis G. Synthesis of novel fluorescent probes for the molecular chaperone Hsp90. Bioorg Med Chem Lett (2003) 13:3975-3978) e Kim et al. (Kim J, Felts S, Llauger L, He H, Huezo H, Rosen N, Chiosis G. Development of a fluorescence polarization assay for the molecular chaperone Hsp90. J Biomol Screening (2004) 9:375-381). Uma solução de BODIPY- GDM a 20 nM foi preparada em tampão de ensaio de ligação FP [20 mM de HEPES-KOH, pH 7,3, 1,0 mM de EDTA, 100 mM de cloreto de potássio, 5,0 mM de cloreto de magnésio, 0,01% de NP-40, 0,1 mg/mL de γ-globulina bovina (BGG), 1,0 mM de DTT, e inibidor de protease Complete™] a partir de uma solução em stock de 20 μΜ em DMSO. Dez microlitros desta solução foram colocados em cada poço de uma microplaca de fundo redondo de 384 poços preta (Corning # 3676). Um volume igual de solução diluída serialmente de Hsp90 humana em tampão de ensaio de ligação FP foi então adicionado para dar concentrações finais de 10 nM e BODIPY-GDM Hsp90 variando em concentração desde 6,25 μΜ a 0,10 nM. A concentração final de DMSO foi de 0,05%. Após 3 horas de incubação a 30 °C, a anisotropia de fluorescência foi medida num leitor de placa EnVision 2100 de marcadores 97 múltiplos equipado com um filtro de 485 nm de excitação e um filtro de emissões de 535 nm, P/S (Perkin Elmer, Boston, MA) .

Competição por 17-AAG e Análogos 17-AAG e o composto 15 foram dissolvidos em primeiro lugar em DMSO, para dar soluções de stock a concentrações de 5,0 e de 1,0 mM. Uma série de diluições para cada composto foi preparada em tampão de ensaio de ligação de FP de 2 0 μΜ a 0,20 nM. Uma solução contendo 20 nM de BODIPY-GDM e 80 nM de Hsp90 também foi preparada em tampão de ensaio de ligação de FP (0,10% de DMSO) . Numa microplaca de 384 poços, 10 pL da solução contendo BODIPY-GDM e Hsp90 foram misturados com um volume igual da série de diluição do composto para dar concentrações finais de 10 nM de BODIPY-GDM, 40 nM de Hsp90, e concentrações variadas do composto especifico de 10 μΜ a 0,10 nM. A concentração máxima de DMSO é de 0,25% na mistura final de ensaio. Após 3 horas de incubação a 30 °C, a anisotropia de fluorescência foi medida num leitor de placas EnVision 2100.

Os ensaios foram realizados sob atmosfera de azoto numa caixa luva LabMaster (M. Braun, Stratham, NH). Tipicamente, 50 mL de tampão de ensaio de ligação de PF foram desoxigenados por ciclos repetidos de evacuação e lavados com árgon. Soluções de proteína e soluções de compostos em stock de DMSO foram levados para a caixa de luva como líquidos congelados. Todas as diluições e mistura subsequente dos componentes de ensaio foram realizadas dentro da caixa de luva, conforme descrito acima. Após 3 horas de incubação a 30 °C, a microplaca foi levada para 98 fora da caixa de luva, e anisotropia de fluorescência foi imediatamente medida num leitor de placas EnVision 2100.

Análise de Dados A ligação de BODIPY-GDM a Hsp90 resulta em aumentos simultâneos de anisotropia de fluorescência (FA) e intensidade (FI). Para calcular Kd, uma curva de ligação da concentração de FI contra Hsp90 (monómero) é ajustada com uma função de quatro parâmetros de logística: pi _ ρτ , (EInlax ~ ^min)

^ l + (ECW[E],otal)HiU com o coeficiente de Hill forçado a 1 para efeitos de simplicidade. A partir dos valores de FImax (ligante ligado) e Flmin (ligante livre), um factor Q é calculado por:

FI λ 1 lmax A curva de ligação da concentração FA vs Hsp90 é posteriormente ajustada utilizando o programa SCIENTIST e as seguintes equações: d [EL] ([E]Iotal-[EL])x([L]total-[EL]) [EL] e FA é expresso como a soma ponderada das contribuições das formas livres e ligadas do ligante: 99 FA,nin x [L]free + FAmax x Q x [EL] [L]free+Qx[EL] FAmin x([L]total - [EL]) + FAmax x Q x [EL] ([L]totai-[EL]) + Qx[EL]

As curvas de ligação de competição são analisadas de forma semelhante. A diminuição no FI em função do aumento da concentração de inibidor é descrita pela função logística: FT — F1 + (Elmax ~ EImjn) min l^U^/ECjor A curva de FA vs concentração de inibidor é posteriormente ajustada com a função implícita para o equilíbrio de ligação competitiva para dar Ki: [E]t0Ial =[E]frcc +[EL] + [E1] _ |-p-. [E]freç x [E] tptal , [E]free x Π] lotai "L Jfc* [E]free+Kd [Elfree + K;

dados os valores conhecidos de [E]totai de [L]totai/· e Kd. SUMÁRIO

Esta experiência demonstrou que as ansamicinas de quinona e hidroquinona (por exemplo, 17-AAG e composto 15) são inibidores ativos de HSP90.

Exemplo 37

Análise In Vivo

Modelo de Mieloma Múltiplo

Os efeitos do composto de teste foram estudados numa linha de células de mieloma múltiplo humano, em RPMI-8226 de 100 ratinhos machos SCID/NOD. Neste estudo, ratinhos machos foram implantados subcutaneamente com células RPMI-8226 (1 x 107 células) . Quando o tamanho médio do tumor atingiu 100 mm3, os animais foram divididos aleatoriamente em grupos de tratamento (N = 10-15/grupo) para receber o veiculo (50 mM de citrato, 50 mM de ascorbato, 2,4 mM de EDTA, ajustado para um pH de 3,0) ou 100 mg/kg (300 mg/m2), do composto de teste três dias consecutivos por semana. O artigo ou o veículo de teste foi administrado por via intravenosa (IV), através da veia caudal, num volume de 0,2 mL ao longo de cerca de 20 segundos (seg). Os animais foram sacrificados após 45 dias e os volumes dos tumores foram comparados.

Modelo de Carcinoma na Mama

Um estudo foi realizado no modelo MDA-MB-468 de carcinoma da mama para determinar a capacidade do composto de teste reduzir a carga do tumor subcutâneo. Neste estudo, ratinhos fêmeas nu/nu atímicos foram implantados subcutaneamente com células MDA-MB-468 (1 x 107 células). Quando a dimensão média do tumor atingiu os 100 m3, os animais forma aleatoriamente divididos (N=10-15/grupo) num dos seguintes grupos de tratamento; veículo ou composto de teste a 100 mg/kg (300 mg/m2) duas vezes por semana, em cada semana. O artigo ou o veículo de teste foi administrado por via intravenosa (IV), através da veia caudal, num volume de 0,2 mL ao longo de cerca de 20 segundos (seg). Os animais foram sacrificados após 120 dias e os volumes dos tumores foram comparados. 101

Modelo de Carcinoma no Ovário

Um estudo foi realizado no modelo xenográfico de ratinho de SKOV-3 ovariano para determinar a capacidade do composto de teste reduzir a carga do tumor subcutâneo. Neste estudo, ratinhos fêmeas nu/nu atimicos foram implantados subcutaneamente com células SKOV-3 (1 x 107 células). Quando a dimensão média do tumor atingiu os 100 m3, os animais foram aleatoriamente divididos (N=10-15/grupo) em grupos de tratamento para receber qualquer um dos veículos, composto de teste a 100 mg/kg (300 mg/m2) duas vezes por semana. O artigo ou o veículo de teste foi administrado por via intravenosa (IV), através da veia caudal, num volume de 0,1 mL ao longo de cerca de 10 segundos (seg) . Os animais foram sacrificados após 88 dias e os volumes dos tumores foram comparados.

Modelo de Pulmão de Lewis Murine

Um estudo foi realizado no modelo de pulmão de ratinho Lewis para avaliar a capacidade dos compostos da presente invenção em reduzir a carga subcutânea do tumor, bem como a incidência de metástases pulmonares. Neste estudo, ratinhos C57B1/6 foram implantados subcutaneamente com células de pulmão de Lewis (1 x 106 células). Quando o tamanho médio do tumor chegou a 71 mm3, os animais (N = 10-15/grupo) foram distribuídos aleatoriamente pelos seguintes grupos de tratamento: veículo e composto 15, 75 mg/m2 segunda, quarta e sexta-feira (MWF) durante 3 ciclos. Cada ciclo consistiu de 5 dias por semana de tratamento. O artigo ou veículo de teste foram administrados através da veia caudal, num volume de 0,2 mL ao longo de aproximadamente 30 seg. Os 102 animais foram sacrificados após 25 dias e os volumes tumorais foram comparados.

Carcinoma da Próstata

Dois estudos foram realizados em modelos xenográficos de próstata de ratinhos PC-3 para avaliar a capacidade do composto de teste em reduzir a carga do tumor subcutâneo como um agente único ou em combinação com o padrão atual de cuidados. Em ambos os estudos, ratinhos machos nu/nu atimicos foram implantados subcutaneamente com células PC-3 (1 x 107 células). Quando o tamanho médio do tumor atingiu 100 mm3, os animais foram divididos aleatoriamente em grupos de tratamento (N = 10-15/grupo). No primeiro estudo, os ratinhos receberam qualguer veiculo, composto de teste de 100 mg/kg (300mg/m2) duas vezes por semana. O artigo ou veiculo de teste foram administrados através da veia caudal, num volume de 0,2 mL ao longo de aproximadamente 20 seg. Os animais foram sacrificados após 64 dias e os volumes tumorais foram comparados.

Um segundo estudo foi realizado neste modelo para avaliar o composto de teste em combinação com o padrão de tratamento, o Taxotere. Neste estudo, grupos separados de 10-15 ratinhos cada foram distribuídos aleatoriamente para receber o veículo, o composto de teste lOOmg/kg (300mg/m2) duas vezes por semana, Taxotere 5 mg/kg (15 mg/m2) , uma vez por semana ou combinação do composto de teste com Taxotere. Os animais foram sacrificados após 64 dias e os volumes dos tumores foram comparados.

Exemplo 38 103

Resultados Biológicos

Os resultados da análise da atividade biológica das hidroquinonas da invenção são apresentados abaixo. Todos os valores são expressos como a média ± SEM. A análise dos dados consistiu numa análise de variância de via única e, quando necessário, seguida pelo teste Dunnets para avaliar as diferenças entre os grupos de tratamento e veiculo. As diferenças são consideradas significativas quando p <0,05.

Resultados In Vitro

Linha de Células Composto 15 (EC50) ! 17-AAG (EC50) MM1. s 307 nM 1306 nM SKBr3 32 nM 134 nM MDA-MB-468 335 nM |356 nM MV 4-11 2 5 nM j 38 nM K562 2 9 nM 150 nM SK-MEL-28 200 nM \---- LnCAP 7 3 nM |----

Resultados In Vivo ÍLinha de Células j% de Crescimento Tumoral \Comparado com iVeículo \ jComposto 15 Composto 15+ Taxotere -------------------1--------------------------------------------- --------------- RPMI-8226 171 % 104 104 Linha de Células j% de Crescimento Tumoral jComparado com Veículo \ jComposto 15 Composto 15+ Taxotere "}---------------------------------------------- .................................................. MDA-MB-468 17 6% SKOV-3 15 9% Células Pulmonares de Lewis 160% PC-3 ] 5 0 % 84%

Ligação do Composto 15 e 17-AAG a HSP90 k± | 2 8 nM \ 67 nM j

iComposto iComposto 15 ! 17-AAG

Lisboa

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula 3:

em que X~ é uma base conjugada de um ácido farmaceuticamente aceitável.

2. 0 composto da reivindicação 1, em que o referido ácido farmaceuticamente aceitável tem um pKa entre cerca de -10 e cerca de 7 em água.

3. O composto de acordo com a reivindicação 1, em que X” é selecionado a partir do grupo que consiste em cloreto, brometo, iodeto, H2P04~, HS04~, metilsulf onato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, trifluorometilsulfonato, 10-canforossulfonato, ácido 5- sulfonato naftaleno-l-sulfónico, ácido 2-sulfonato etan-1-sulfónico, sal do ácido ciclâmico, sal do ácido tiociânico, naftaleno-2-sulfonato, e oxalato.

4. O composto de acordo com a reivindicação 1, em que X” é cloreto. 2

5. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, compreendendo ainda um ou mais selecionados a partir de: um antioxidante; um agente tampão; e um quelante de metais.

7. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que o referido antioxidante é ascorbato, cloridrato de cisteina, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, tioglicerol, mercaptoacetato de sódio, sulfoxilato formaldeido de sódio, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, lecitina, gaiato de propilo, ou alfa-tocoferol.

8. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que o referido agente de tampão é citrato, ascorbato, fosfato, bicarbonato, carbonato, fumarato, acetato, tartarato, malato, succinato, lactato, maleato, glicina ou outros a- ou β-aminoácidos que ocorrem naturalmente.

9. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que o referido agente quelante de metais é ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o seu sal, DTPA (ácido dietileno-triamina-penta-acético) e o seu sal, EGTA e o seu sal, NTA (ácido nitriloacético) e o seu sal, sorbitol e o seu sal, ácido tartárico e o seu sal, N-hidroxi iminodiacetato e seu sal, ácido hidroxietil-etileno-diamina-tetra-acético e o seu sal, ácido 1- e 3-propanodiamina tetra-acético e seus sais, ácido 1- e 3-diamino-2-hidroxi propano tetra-acético e seus sais, gluconato de sódio, ácido hidroxi etano difosfónico e o seu 3 sal, ou ácido fosfórico e seu sal.

10. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, em que o referido agente de tampão é citrato, o referido antioxidante é ascorbato, e o referido quelante de metal é EDTA.

11. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto está na gama de cerca de 0,001 a cerca de 0,1.

12. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto está na gama de cerca de 0,001 a cerca de 1.

13. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a razão molar do referido citrato para o referido composto está na gama de cerca de 0,05 a cerca de 2.

14. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, em que a razão molar do referido EDTA para o referido composto está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 0,1; e a razão molar do referido ácido ascórbico para o referido composto está no intervalo de cerca de 0,001 a cerca de 1.

15. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, compreendendo um antioxidante e um agente quelante de metal. 4

16. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, em que o antioxidante é ascorbato, e o quelante de metal é EDTA.

17. A composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 6 a 16, compreendendo ainda um agente solubilizante.

18. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 17, em que o referido agente solubilizante é ésteres de ácidos gordos de polioxietileno sorbitano, estearatos de polioxietileno, álcool benzilico, álcool etilico, polietileno glicóis, propileno glicol, glicerina, ciclodextrina, ou poloxâmeros.

19. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 18, compreendendo ainda um agente anti-neoplástico.

20. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, em que o referido agente antineoplásico é docetaxel, paclitaxel, mesilato de imatinib, gemcitebine, Velcade (bortezomib), cis-platina, carboplatina, ou 5-fluorouracilo.

21. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que o referido agente antineoplásico é docetaxel ou paclitaxel.

22. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que o referido agente antineoplásico é docetaxel. 5

23. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que o referido agente antineoplásico é paclitaxel.

24. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que o referido agente antineoplásico é mesilato de imatinib.

25. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, em que o referido agente antineoplásico é Velcade (bortezomib).

26. Um composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização no tratamento do cancro.

27. Um composto para uso no tratamento de cancro, em que o referido tratamento é realizado em conjunto com um agente antineoplásico, em que o referido composto é tal como definido em qualquer das reivindicações 1 a 4.

28. Um composto de acordo com a reivindicação 27, em que o referido agente antineoplásico é docetaxel, paclitaxel, mesilato de imatinib, gemcitebine, Velcade (bortezomib), cis-platina, carboplatina, ou 5-fluorouracilo.

29. Um composto de acordo com a reivindicação 27, em que o referido agente antineoplásico é docetaxel.

30. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, em que o referido tratamento é a administração sequencial do referido composto e do referido agente antineoplásico. 6

31. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, em que o referido tratamento é a administração concomitante do referido composto e do referido agente antineoplásico.

32. 0 composto de acordo com a reivindicação 26, em que o referido tratamento é a administração do referido composto por um modo selecionado a partir de inalação, por via oral, intravenosa, sublingual, ocular, transdérmica, rectal, vaginal, tópica, intramuscular, intra-arterial, intratecal, subcutânea, bucal, e nasal.

33. 0 composto de acordo com a reivindicação 32, em que o modo é intravenoso.

34. 0 composto de acordo com a reivindicação 26, em que o tratamento é em conjunto com a terapia de radiação.

35. Um composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é um cancro do sistema hematopoiético, sistema imunológico, sistema endócrino, sistema pulmonar, gastronintestinal, sistema musculoesquelético, sistema reprodutivo, sistema nervoso central ou sistema urológico, ou em que o cancro está localizado nos tecidos mieloides do mamífero, tecidos linfoides, tecidos pancreáticos, tecidos da tiroide, pulmões, tecidos do cólon, tecidos rectais, tecidos anais, tecidos do fígado, da pele, dos ossos, tecidos do ovário, tecidos uterinos, tecidos cervicais, mama, próstata, tecidos testiculares, do cérebro, do tronco cerebral, tecidos meningiais, do rim ou da bexiga. 7

36. Um composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro da mama, mieloma múltiplo, cancro da próstata, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, carcinoma de células renais, melanoma maligno, cancro pancreático, cancro do pulmão, carcinoma colorretal, cancro do cólon, cancro no cérebro, cancro renal, cancro de cabeça e pescoço, cancro da bexiga, cancro da tiroide, cancro do ovário, cancro cervical, ou sindrome mielodisplásica.

37. Um composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o cancro do mamífero é cancro de mama, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, melanoma, mieloma múltiplo, cancro de pulmão de pequenas células, cancro do ovário ou cancro da próstata.

38. Um composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro do pulmão.

39. Um composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro do pulmão de células não-pequenas.

40. O composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro da mama.

41. O composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é leucemia mieloide aguda.

42 . 0 composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é leucemia mieloide crónica.

43. 0 composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro dos ovários.

44. 0 composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro do cólon.

45. 0 composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é mieloma múltiplo.

4 6 . 0 composto ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, em que o referido cancro é cancro do pulmão de células pequenas

47 . Um método de preparação de um composto de fórmula 3, compreendendo : a combinação de um composto de fórmula 1:

NHZ 1 9 com um agente redutor num solvente de reação, seguido por tratamento com um ácido farmaceuticamente aceitável para se obter o referido composto de fórmula 3:

em que X é uma base conjugada de um ácido farmaceuticamente aceitável.

48. 0 método de acordo com a reivindicação 47, em que o referido agente redutor é hidrossulfito de sódio, zinco, ácido ascórbico, ou uma redução eletroquimica.

49. 0 método de acordo com a reivindicação 47, em que o referido solvente da reação é diclorometano, clorofórmio, dicloroetano, clorobenzeno, THF, 2-MeTHF, éter dietilico, diglima, 1,2-dimetoxietano, MTBE, THP, dioxano, 2-etoxibutano, éter metil-butilico, acetato de etilo, acetato metilico, 2-butanona, água, ou suas misturas.

50. O método de acordo com a reivindicação 47, em que o referido ácido é HC1, HBr, H2S04, ácido metanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido triflico, ácido canforsulfónico, ácido naftaleno-1,5-dissulfónico, ácido etan-1,2-dissulfónico, ácido ciclâmico, 10 ácido tiociânico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ou ácido oxálico.

51. O método de acordo com a reivindicação 47, em que o referido ácido é dissolvido num solvente orgânico, selecionado a partir do grupo que compreende: EtOAc, DCM, IPA ou dioxano.

52. Um co-sal de um composto da fórmula: Mc'

Lisboa