KR20070085677A

KR20070085677A - 만성 림프성 백혈병의 치료 방법 및 치료 조성물

Info

Publication number: KR20070085677A
Application number: KR1020077012496A
Authority: KR
Inventors: 자누아리오 이 카스트로; 토마스 제이 킵스; 프란시스 제이 버로우스; 아델라 카말; 카를로 이 프라다
Original assignee: 콘포마 세러퓨틱스 코포레이션
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2007-08-27
Also published as: WO2006050457A3; WO2006050457A2; IL182618A0; RU2007120473A; NO20072190L; EP1814392A4; US20080280878A1; BRPI0517268A; CN101072504A; CA2584266A1; MX2007004893A; EP1814392A2; AU2005302000A1; JP2008519031A

Abstract

HSP90 억제제, 특히 안사마이신, 더욱 특히 17-알릴아미노-17-데메톡시게트다나마이신 (17-AAG) 의 투여에 의한 만성 림프성 백혈병의 신규 치료 방법.

HSP90 억제제, 안사마이신, 17-알릴아미노-17-데메톡시게트다나마이신 (17-AAG), 만성 림프성 백혈병

Description

만성 림프성 백혈병의 치료 방법 및 치료 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA}

본 발명은 일반적으로 만성-림프성 백혈병 (CLL) 의 치료, 특히 HSP90 억제제를 사용한 공격적인 CLL 의 치료 ; 더욱 특히 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (17-AAG) 과 같은 안사마이신 (ansamycin) 을 사용한 CLL 의 치료에 관한 것이다.

하기 명세서는 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보 중 어느 것이 선행 기술이거나 또는 현재 청구된 발명에 상응하는 것이라거나, 또는 구체적으로나 함축적으로 언급된 임의의 공개물이 선행 기술이라는 것은 승인된 사실이 아니다.

만성 림프성 백혈병 (CLL) 의 경로는 다양하다. 공격적인 질환에서, CLL 세포는 보통 비돌연변이 면역글로불린 중쇄 가변-영역 유전자 (IgV_H) 및 70-kD 제타-연관 단백질 (ZAP70) 을 발현하는 반면, 무통성 질환에서, CLL 세포는 보통 돌연변이 IgV_H를 발현하나 ZAP70 의 발현은 없다. CLL 환자에서의 ZAP70 의 발현은 질환 진행, 불량한 임상 결과, 감소된 전체적인 생존율 및 치료의 빠른 요구와 관 련 있다. 비돌연변이 IgV_H 의 존재가 ZAP70 의 발현과 강하게 연관되어 있더라도, ZAP70 이 B-세포 CLL 의 치료 및 진단 필요성의 더 강력한 예보자이다 (Rassenti, L.Z. 등, N Eng J Med ., 2004, 351, 893-901).

ZAP70 은 보통 자연살해 (NK) 세포 및 T-세포에서만 발현되고 T-세포-수용체 신호화에서 중요한 역할을 하는 70-kD 세포질 단백질 타이로신 키나아제 (PTK) 이다 (Keating 등 Hematology, 2003, 153-175). B-세포에는 ZAP70 이 없는 대신, B-세포 수용체 (BCR) 복합체를 통한 신호 전달을 위해 또다른 관련 PTK 를 사용한다. 비돌연변이 IgV_H 유전자를 갖는 CLL B 세포가 일반적으로 정상 혈액 T 세포에 의해 발현되는 것에 상당한 수준의 ZAP70 단백질을 발현함이 연구에서 밝혀졌다. 반대로, 돌연변이 IgV_H 유전자를 발현하거나, 또는 CD38 의 발현 수준이 낮은 CLL B 세포는 일반적으로 ZAP70 단백질을 검출가능한 수준으로 발현하지 않는다 (Chen, 등, Blood 2002, 100 : 13, 4609-4614). B-세포의 ZAP70 발현은 유전적으로 예정되지 않는다 (상기 Chen, 2002). ZAP70 의 발현은 CLL 에서 발현되는 BCR 복합체의 신호화 능력에 대해 기능적인 유의성을 갖고 있다 (상기 Keating 등). ZAP70 은 BCR 의 참여 후에 다운스트림 신호화 분자의 인산화를 촉진하고, 막 항원-수용체 신호 경로에서 역할을 한다 (상기 Keating 등 및 상기 Rassenti 등). 한 연구에서는, CLL 에서의 ZAP70 의 발현이 CLL B 세포에서의 더욱 효과적인 IgM-신호화를 가능하게 하며, 이는 비돌연변이 IgVH 를 발현하는 CLL 세포와 일반적으로 연관된 상대적으로 공격적인 임상 거동에 기여할 수 있는 특징이라고 보여주고 있다 (Chen, 등, Blood, 2004, prepublication online October 28, 2004).

진핵생물 열 충격 단백질 90 (HSP90) 은 신호 전달, 세포 주기 조절 및 전사 조절의 매개자를 포함하여, 다양한 범위의 클라이언트 단백질의 접힘, 활성화 및 조립에 관여하는 유비퀴틴성 샤페론 단백질이다. 클라이언트 단백질에 그의 작용을 부여하기 위해서, HSP90 은 공샤페론 분자 및 활성 ATP 결합 부위로 이루어진 활성 단백질 복합체의 형성을 필요로 한다. HSP90 클라이언트 단백질로서 규명된 단백질에는, 막관통 타이로신 키나아제 [HER-2/neu, 외피 성장 인자 수용체 (EGFR), MET 및 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)], 전이 신호화 단백질 (Akt, Raf-1 및 IKK), 돌연변이 신호화 단백질 (p53, Kit, Flt3 및 v-src), 키메라성 신호화 단백질 (NPM-ALK5 Bcr-Abl), 스테로이드 수용체 (안드로겐, 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체), 세포-주기 조절자 (cdk4, cdk6) 및 세포자멸사 관련 단백질이 포함된다. 악성 진행 및 암 예후는 공샤페론 단백질과의 보강된 복합체에 존재하는 활성화된 HSP90 의 존재와 연관되어 있을 수 있다고 주장되어 왔다 (Kama 등, Nature, 2003, 425:407-410).

안사마이신 항생제, 예를 들어 헤르비마이신 A (herbimycin A, HA), 겔다나마이신 (GDM), 17-AAG, 및 기타 HSP90 억제제는 HSP90 의 N-말단 ATP-결합 포켓의 단단한 결합에 의해 그의 항암 효과를 발휘하는 것으로 생각된다 (Stebbins, C. 등, Cell, 1997, 89:239-250). 상기 포켓은 고도로 보존되어 있으며, DNA 기라제의 ATP-결합 부위에 약한 상동성을 갖는다 (상기 Stebbins, C. 등 ; Grenert, J.P. 등, J. Biol . Chem . 1997, 272:23843-50). 더욱이, ATP 및 ADP 는 둘 다 상기 포켓에 낮은 친화성으로 결합하고, 약한 ATP 분해효소 활성을 갖는 것으로 보인다 (Proromou, C. 등, Cell, 1997, 90: 65-75; Panaretou, B. 등, EMBOJ ., 1998, 17: 482936). 시험관 내 및 생체 내 연구는, 안사마이신 및 기타 HSP90 억제제에 의해 상기 N-말단 포켓이 채워지는 것은 HSP90 기능을 변경시키고, 단백질 접힘을 억제한다고 하였다. 고농도에서, 안사마이신 및 기타 HSP90 억제제는 단백질 기질이 HSP90 에 결합하는 것을 방지하는 것으로 보인다 (Scheibel, T., H. 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 1999, 96: 1297-302; Schulte, T. W. 등 J. Biol . Chem. 1995, 270:24585-8; Whitesell, L. 등. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1994, 97:8324-8328). 안사마이신은 또한 샤페론-연관 단백질 기질의 ATP-의존성 방출을 억제시키는 것으로 나타나 있다 (Schneider, C. L. 등., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 1996, 93:14536-41; Sepp-Lorenzino 등. J. Biol . Chem . 1995, 270:16580-16587). 어떤 경우에, 기질은 프로테아좀에서 유비퀴틴-의존성 방법에 의해 분해된다 (상기 Schneider, C. L.; Sepp-Lorenzino, L. 등. J. Biol . Chem., 1995, 270:16580-16587; 상기 Whitesell, L. 등).

상기 기질 불안정화는 종양 및 비-형질전환 세포 둘 다에서 유사하게 일어나며, 신호화 조절자의 하위유형, 예를 들어 Raf (Schulte, T. W. 등., Biochem . Biophys. Res . Commun. 1997, 239:655-9; Schulte, T. W. 등. J. Biol . Chem . 1995, 270:24585-8), 핵 스테로이드 수용체 (Segnitz, B., and U. Gehring, J. Biol. Chem. 1997, 272:18694-18701; Smith, D. F. 등 Mol . Cell . Biol. 1995, 75:6804-12 ), v- src (Whitesell, L., 등., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1994, 91: 8324-8328) 및 특정 막관통 타이로신 키나아제 (Sepp-Lorenzino, L. 등. J. Biol Chem. 1995, 270:16580-16587) 예컨대 EGF 수용체 (EGFR), Her2/Neu (Hartmann, F. 등 Int . J. Cancer 1997, 70:221-9; Miller, P. 등, Cancer Res . 1994, 54:2724-2730; Mimnaugh, E. G. 등. J. Biol Chem. 1996, 277:22796-801; Schnur, R. 등, J. Med . Chem . 1995, 38:3806-3812), CDK4, 및 돌연변이 p53 (Erlichman 등, Proc . AACR, 2001, 42, abstract 4474) 에 특히 효과적인 것으로 나타나 있다. 상기 단백질의 안사마이신-유도 손실은 특정 조절 경로의 선택적인 붕괴를 초래하고, 그렇게 처리되는 세포의 세포 주기의 특정 기에서의 성장 억제 (Muise-Heimericks, R. C. 등, J. Biol . Chem ., 1998, 273:29864-72), 및 세포자멸사 및/또는 분화를 초래한다 (Vasilevskaya, A. 등, Cancer Res ., 1999, 59:3935-40).

ZAP70 발현이 공격적인 유형의 CLL 과 연관되어 있기 때문에, 상기 과발현을 조절하는 수단이 필요하다. 정상 세포 및 조직에의 피해를 동시에 피하거나 또는 최소화할 수 있는 처리가 가장 바람직할 것이다. 본 발명은 상기 필요성을 강조한다.

발명의 요약

본 발명의 발명자들은, ZAP70 이 HSP90 의 클라이언트 단백질이며, 17-AAG 와 같은 HSP90 의 특정 억제제가 상기 타이로신 키나아제의 발현 및 기능을 하위조정하고, 투여량- 및 시간-의존적 방식에서 ZAP-90 양성 CLL B 세포에서의 세포자멸 사를 선호할만하게 유도한다는 것을 발견하였다.

본 발명의 한 측면은 CLL 형태의 치료 방법으로서, 이 방법은 치료가 필요한 환자에게 약학적 유효량의 HSP90 억제제를 투여하는 것에 의한, CLL B 세포에서의 ZAP70 의 발현을 특징으로 한다.

한 구현예에서, 상기 억제제는 안사마이신이고 ; 안사마이신은 하기 군, 또는 그의 다형체, 용매화물, 에스테르, 호변이성질체, 거울상이성질체, 약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물로부터 선택된다 :

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한 추가의 구현예에서, 안사마이신은 175℃ 미만의 DSC 용융 온도 및/또는 5.85°, 4.35° 및 7.90° 2-세타 각에서 위치하고 있는 피크를 갖는 X-선 분말 회 절 패턴을 특징으로 하는, 저 용융 형태의 17-AAG 를 포함할 수 있는 17-AAG 이다. 또다른 구현예에서, 안사마이신은 약 156℃ 의 DSC 용융 온도 및 5.85°, 4.35° 및 7.90° 2-세타 각에서 위치하고 있는 피크를 갖는 X-선 분말 회절 패턴을 특징으로 하는, 저 용융 다형체의 17-AAG 이다. 더욱 또다른 구현예에서, 안사마이신은 약 172℃ 의 DSC 용융 온도를 특징으로 하는 또다른 저 용융 다형체의 17-AAG 이다. 추가로, 17-AAG 는 고 용융 형태, 저 용융 형태, 비정질 형태, 또는 그의 조합일 수 있다.

더욱 또다른 구현예에서, 억제제는 HSP90 의 ATP-결합 부위에서 결합한다.

본 발명의 또다른 측면에서, HSP90 억제제는 정맥내, 병변내, 비경구 또는 경구로 투여된다.

본 발명의 추가의 측면에서, HSP90 억제제의 IC₅₀ 은 상승된 ZAP70 을 갖지 않는 정상 B 세포의 HSP90 보다 상승된 ZAP70 을 갖는 환자의 B 세포의 HSP90 에 대해 약 2 내지 약 19 배 더 낮다. 한 구현예에서, HSP90 억제제의 IC₅₀ 은 상승된 ZAP70 을 갖지 않는 정상 B 세포의 HSP90 보다 상승된 ZAP70 을 갖는 환자의 B 세포의 HSP90 에 대해 약 2 배, 5 또는 10 배 더 낮다.

본 발명의 또다른 측면에서, 상기 억제제는 상승된 ZAP70 을 갖는 세포에서 약 100 nM 이하의 IC_5O 을 나타낸다. 한 구현예에서, 상기 억제제는 상승된 ZAP70 을 갖는 세포에서 약 75 nM 이하의 IC_5O 을 나타낸다. 한 구현예에서, 상 기 억제제는 상승된 ZAP70 을 갖는 세포에서 약 50 nM 이하의 IC_5O 을 나타낸다. 추가의 구현예에서, 상기 억제제는 상승된 ZAP70 을 갖는 세포에서 약 30 nM 의 IC_5O 을 나타낸다.

상기 측면 및 구현예는 유연성이 있거나 또는 적절할 때에 조합될 수 있다. 당업자에게 분명한 전술한 측면 및 구현예의 기타 측면 및 변형은 본 발명의 고려사항 내에 속한다.

본 발명의 이점에는, 용이한 제조, 임상적으로 허용가능한 (예를 들어, 감소된 환경 및/또는 환자 독성을 갖는) 시약의 사용, 증진된 제제 안정성, 덜 복잡한 운반 및 보관, 및 간략화된 약국 및 침실-옆 취급 중 하나 이상이 포함된다. 기타 이점, 측면, 및 구현예는 상기 설명 및 하기 상세한 설명 및 청구항에서 알게 될 것이다.

도 1 은 B 세포, T 세포, ZAP70 양성 CLL B 세포 (ZAP70+ CLL B 세포) 및 ZAP70 음성 CLL B 세포 (ZAP70- CLL B 세포) 의 파쇄물에서의, HSP90 에 대한 비오틴화 겔다나마이신 프로브 (비오틴-GM) 에 대한 17-AAG 의 경쟁적 결합을 보여준다. 웨스턴 블롯 밴드는, 17-AAG 의 농도를 증가시킴에 따라 비오틴-GM 에의 HSP90 의 결합 억제가 감소됨을 보여준다 (1a). 상기 결과를 정량화하고, nM 농도로 있는 비오틴-GM 대 17-AAG 에의 HSP90 의 결합 억제를 % 로 플롯화하였다 (1b). 기록된 IC₅₀ 은 결합 중 최대-절반을 억제시키는데 필요한 17-AAG 의 농 도이다 (1c).

도 2 는 증가하는 농도의 17-AAG 의 존재 하에, ZAP70+ CLL B 세포 (▲) 및 ZAP70- CLL B 세포 (■) 의 파쇄물에서의, HSP90 에 대한 비오틴화 겔다나마이신 프로브 (비오틴-GM) 의 결합 억제를 그래프로 나타낸 것이다.

도 3 은 정상 B 세포 (◆) 및 T 세포 (■) 의 파쇄물에서의, HSP90 에 대한 비오틴화 겔다나마이신 (비오틴-GM) 의 결합 억제를 나타낸 것이다.

도 4 는 지시된 항체를 사용한 공-면역침강 및 SDS-PAGE 와 웨스턴 블롯에 의해 분석된, MCF-7 유방암 세포, ZAP70+ CLL B 및 ZAP70- CLL B 및 정상 T 및 B 세포에서의 HSP90 및 ZAP70 의 연관을 나타낸다. "IP" 는 면역침강을 나타내고, "WB" 는 웨스턴 블롯을 나타낸다. P23 및 HOP 는 2 개의 공지된 멀티-샤페론 HSP90 복합체의 필수 성분이다.

도 5 는 EC1 (17-AAG) (■), EC82 (▲), EC86 (X) (EC82 및 EC86 은 퓨린 기재 HSP90 억제제임) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) (◆) 로 37℃ 에서 24 시간 처리한 후, ZAP70+ CCL B 세포에서의 ZAP70 의 분해를 비교한 것이다.

도 6 은 비처리된 (좌측 패널) 또는 30OnM EC1 (17-AAG) 로 37℃ 에서 24 시간 동안 처리된 (우측 패널) CLL B 세포에서의 ZAP70 의 발현을 2-색 유세포분석기에 의해 비교한 것이다. 상부 우측 사분면은 정상 T-세포 (CD3+, ZAP70+) 이고, 하부 우측 사분면은 (CD3-, ZAP70+) 이고 ; 상부 좌측 사분면은 CD3+, ZAP70- 이고 ; 하부 좌측 사분면은 CD3-, ZAP70- 이다.

도 7 은 EC1 (17-AAG) (◆) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) (■) 으로 처리한 후, ZAP70+ CCL B 세포의 %생존성 ([100% - 세포자멸사 세포%] 로서 나타냄) 을 비교한 것이다.

도 8 은 100 nM 의 EC1 (17-AAG) (■) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) (◆) 으로 처리한 후, ZAP70+ CCL B 세포의 % 생존성 (100% - 세포자멸사 세포% 로서 나타냄) 을 비교한 것이다. 50% 세포 죽음에 도달하는데 걸린 시간은 17-AAG 로 처리한 후 대략 48 시간째이다.

도 9 는 100 nM EC1 (17-AAG) 로 48 시간 동안 처리한 후, 16 명의 ZAP70+ 환자 및 11 명의 ZAP70- 환자로부터의 CCL B 세포의 생존성 (100% - 세포자멸사 세포% 로서 나타냄) 을 비교한 것이다. ZAP70+ CLL B 세포는 45.74 +/- 3.177% 의 평균 % 생존성을 갖는 반면, ZAP70- CLL B 세포는 93 +/- 1.701% 의 평균 % 생존성을 갖는다. 2 개의 군 사이의 생존에서의 차이의 Students T-Test P-값은 < 0.0001 였다.

본 발명은 HSP90 억제제를 사용한, 정상적으로는 T 세포에서만 발견되는 단백질 키나아제인 ZAP70 의 과발현을 특징으로 하는, 공격적인 형태의 만성 림프성 백혈병 (CLL) 의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 ZAP70 이 HSP90 과 공-면역침강하며, ZAP70 이 HSP90 클라이언트 단백질임을 제시하는 관찰을 바탕으로 한다. 본 발명자들은 추가로, ZAP70 양성 CLL 샘플에서는, 세포질에 존재하는 HSP90 의 대부분이 복합체화된 형태로 있었으나, 반면 ZAP70 음성 샘플에서는, 대부분의 HSP90 이 비복합체화되어 있음이 발견되었다. 본 발명자들은, CLL B 세포에서의 비정상적인 과발현 및 기능이 활성화된 HSP90 에 의존할 수 있고, 그의 발현 수준은 특정 HSP90 억제제를 사용함으로써 하향-조절될 수 있으며, 이는 ZAP70 양성 CLL B 세포의 세포자멸사를 유도한다고 가정하였다. ZAP70 발현 수준은 나노몰 농도에서 HSP90 억제제를 24 시간 동안 처리한 세포에서 30-40% 감소되었음이 밝혀졌다.

I. 정의

하기 용어는 하기 의미를 갖고, 하기에서 구체적으로 보여지지 않는 용어는 당기술분야에서 사용된 바와 같은 그의 공통적인 통상의 의미를 갖는다.

용어 "ZAP70 양성" 및 "ZAP70 음성" 은 유세포 분석기 (FACSCalibur, BD Biosciences 및 Flow Jo 소프트웨어) 에 의해 측정된 바와 같이 20% 의 확정 범위 발현을 바탕으로 한다.

"HSP90-억제 화합물" 또는 "HSP90-억제제" 는 HSP90 샤페론 단백질 및/또는 HSP90 에 의존하는 단백질의 구조 및/또는 기능을 방해하는 것이다. HSP90 단백질은 자연 상태에서 고도로 보존되어 있다 (예를 들어, NCBI 기탁 번호 P07900 및 XM 004515 (각각 인간 α 및 β HSP90), P11499 (마우스), AAB2369 (래트), P46633 (차이니즈 햄스터), JC1468 (닭), AAF69019 (쉬파리), AAC21566 (제브라피쉬), AAD30275 (연어), 002075 (돼지), NP 015084 (효모), 및 CAC29071 (개구리) 참조). Grp94 및 Trap-1 은 본원에 사용된 바와 같은 HSP90 의 정의에 속하는 관련 분자이다. 따라서, 많은 상이한 HSP90 이 있으며, 모두는 예상되는 유사한 효과 및 억제 능력을 갖고 있다. 본 발명의 HSP90 억제제는 특정 숙주 환자의 HSP90 에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 상이한 종으로부터의 HSP90 상동체 또는 HSP90 변이체에 대한 반응성을 바탕으로 규명될 수 있다.

용어 "안사마이신" 은 장쇄에 의해 연결된 벤조퀴논, 벤조히드로퀴논, 나프토퀴논 또는 나프토히드로퀴논 부분 중 임의의 하나를 포함하는 "안사" 구조를 갖는 화합물을 특징짓는 광범위한 용어이다. 나프토퀴논 또는 나프토히드로퀴논 부류의 화합물은 각각 임상적으로 중요한 제제인 리팜피신 및 리파마이신을 예로 든다. 벤조퀴논 부류의 화합물은 겔다나마이신 (그의 합성 유도체 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (17-AAG), 17-N,N-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (DMAG), 디히드로겔다나마이신 및 헤르바마이신을 포함) 을 예로 든다. 벤조히드로퀴논 부류는 마크베신 (macbecin) 을 예로 든다. 본 발명은 안사마이신, 특히 17-AAG 를 사용하여 예시되는 한편, 본원에서 기술된 CLL 의 신규 치료 방법은 본 화합물의 고 용융 및 저 용융 형태 둘 다, 및 그의 다형체, 호변이성질체, 거울상이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, 및 전구약물에 적용된다고 이해해야 할 것이다. 본 방법이 추가로 적용되는 많은 기타 안사마이신에는 겔다나마이신, 17-N,N-디메틸아미노에틸아미노겔다나마이신과 같은 실시예 부분의 실시예 1 - 13 에서 예시된 것들, 및 그의 다형체, 호변이성질체, 거울상이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, 및 전구약물이 포함되나, 이에 제한되지 않음을 이해해야 할 것이다. 번호가 매겨진 화합물의 구조는 요약 부분에서 개시된다.

용어 "약동학적으로 활성인 화합물," "활성 약학적 성분" 또는 "치료 성분" 은 "약물" 과 동의어이고, 배양 세포 또는 개체에 투여될 때 시험관 내에서 또는 생체 내에서 직접 또는 간접적으로 생물학적 효과를 발휘하는 임의의 화합물을 의미한다.

"전구약물" 은, 전구약물을 포유류 개체에 투여할 때, 약물의 방출이 생체 내에서 발생된는, 담체에 공유 결합된 약물이다. 본 발명의 화합물의 전구약물은 화합물 내에 존재하는 작용기를 개질시킴으로써 제조되는데, 상기 개질은 일반적인 조작으로 또는 생체 내에서 절단되는 식으로 일어난다. 전구약물은, 포유류 개체에 투여될 때 절단되어 자유 히드록시, 아미노, 또는 술피드릴기 각각을 형성하는, 히드록실, 아민, 또는 술피드릴기가 임의의 기에 결합된 화합물을 포함한다. 전구약물의 예에는, 본 발명의 화합물 내의 알콜 또는 아민 작용기의 아세테이트, 포르메이트, 또는 벤조에이트 유도체 ; 본 발명의 화합물 내의 알콜 또는 페놀 작용기의 포스페이트 에스테르, 디메틸글리신 에스테르, 아미노알킬벤질 에스테르, 아미노알킬 에스테르 또는 카르복시알킬 에스테르 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 전구약물은 예를 들어, [REMINGTON PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th Edition, Ch. 47, pp. 913-914] 에 기술된 바와 같이, 약물 전달을 위한 다수의 이점을 줄 수 있다.

"약학적으로 허용가능한 염" 은 약학적으로 허용가능한 무기 및 유기산 및 염기 유래의 것들을 포함한다. 적합한 산의 예에는, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 퍼클로르산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산, 벤젠술폰산, 1,2-에탄술폰산 (에디실레이트), 갈락토실-d-글루콘산 등이 포함된다. 그 자체가 약학적으로 허용가능하지 않은 옥살산과 같은 기타 산은, 본 발명의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 산 부가염을 수득하는데 있어 중간체로서, 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 적절한 염기 유래의 염에는 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨), 알칼리 토금속 (예를 들어, 마그네슘), 암모늄 및 N-(C₁-C₄ 알킬)₄+ 염 등이 포함된다. 상기 중 일부의 예시적인 예로는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화콜린, 탄산나트륨 등이 포함된다. 청구항이 "화합물 (예를 들어, 화합물 'x') 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염" 을 말하고 단지 화합물로 표현된 경우에라도, 상기 청구항은 대안적이거나 또는 연결하는 식으로, 약학적으로 허용가능한 염 또는 상기 화합물의 염을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

"약학적 유효량" 은 치료적 또는 예방적 효과를 제공할 수 있는 양을 의미한다. 치료 및/또는 예방 효과를 얻기 위해 본 발명에 따라 투여되는 화합물의 특정 투여량은 물론, 예를 들어, 투여되는 특정 화합물, 투여 경로, 치료 상태, 및 치료되는 개인을 포함하여, 경우에 따른 특정 조건에 의해 결정될 것이다. 전형적인 일일 투여량 (단일 또는 분리 투여로 투여됨) 은 본 발명의 활성 화합물을 약 0.01 mg/kg (체중) 내지 약 100 mg/kg (체중), 및 더욱 바람직하게는 50 mg/kg (체중) 의 양으로 함유할 것이다. 바람직한 일일 투여량은 일반적으로 약 0.05 mg/kg (체중) 내지 약 20 mg/kg (체중), 및 이상적으로는 약 0.1 mg/kg (체중) 내지 약 10 mg/kg (체중) 일 것이다.

바람직한 치료 효과는 치료 장애의 특징적인 세포 성장을 어느 정도로 억제시키는 것이다. 치료 효과는 또한 정상적으로는, 그러나 반드시는 아니고, 장애와 관련된 증후 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 것이다.

용어 "IC₅₀" 은 어느 한 군의 세포, 또는 더 큰 세포 군 내의 암성 대 비암성 세포와 같은 특정 세포 유형 중 50% 를 죽이는데 필요한 HSP90 억제제의 농도로서 정의된다. IC₅₀ 은 바람직하게는, 본래는 아니더라도, 증식 장애를 나타내는 세포에 대해서보다 정상 세포에 대해서 더 크다.

"생리학적으로 허용가능한 담체" 는 개체에 유의한 자극을 야기하지 않으면서, 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 제제에 따라, 희석제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 고체, 또는 물 또는 오일과 같은 액체일 수 있다.

"부형제" 는 화합물의 가공, 투여 및 약학적 특성을 유용하게 하기 위해 약동학적 조성물에 첨가되는 비-독성 약학적으로 허용가능한 성분을 말한다. 부형제에는, 필러, 희석제, 유동화제, 윤활제, 붕괴제, 결합제, 용해제, 안정화제/벌크제, 및 다양한 기능적 및 비-기능적 코팅제가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "약 (about)" 은 지정된 특정 종점(들) 을 포함하고, 그것을 15% 이하로 초과하는 것을 의미한다. 따라서, 범위가 광범위해진다.

용어 "임의로" 는 이 용어 뒤에 오는 단계 또는 성분이 방법 또는 제제의 일부가 될 수 있으나, 반드시 그럴 필요가 있는 것은 아님을 말한다.

II . 안사마이신의 제조

본 발명에 따른 안사마이신은 합성, 천연-발생, 또는 그 둘의 조합, 즉 "준-합성" 일 수 있고, 이량체 및 공액 변이체 및 전구약물 형태를 포함할 수 있다. 본 발명의 다양한 구현예 및 그의 제조 방법에서 유용한 일부 실례의 벤조퀴논 안사마이신은 예를 들어, 미국 특허 제 3,595,955 호 (겔다나마이신의 제조를 기술함), 제 4,261,989 호, 제 5,387,584 호 및 제 5,932,566 호에 기술된 것들 및 하기 "실시예" 부분 (실시예 1 - 12) 에서 기술된 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 겔다나마이신은 또한 [CN Biosciences, Affiliate of Merck KGaA, Darmstadt, Germany, headquartered in San Diego, California, USA (카탈로그 번호 345805)] 와 같이 시판된다. 17-N,N-디메틸아미노에틸아미노-17-데스메톡시-겔다나마이신 (DMAG) 은 EMD/Calbiochem 로부터 시판된다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus (ATCC 55256)) 의 배양으로부터의 겔다나마이신 유도체, 4,5-디히드로겔다나마이신 및 그의 히드로퀴논의 생화학적 정제는 WO 93/14215 (Cullen 등) 에 기술되어 있으며 : 겔다나마이신의 촉매 수소화에 의한 4,5-디히드로겔다나마이신의 합성의 대안적인 방법 또한 알려져 있다. 예를 들어, ["Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, Chemistry of the Ansamycin Antibiotics, 1976 33:278] 를 참조한다. 본 발명의 다양한 구현예와 관련해서 사용될 수 있는 기타 안사마이신은 상기 "배경" 부분 및 또한 "요약" 부분에서 언급된 문헌에 기술되어 있다.

17-AAG 는 질소 분위기 하에 건조 THF 중 알릴아민과 반응함으로써 겔다나마이신으로부터 제조될 수 있다. 조 생성물은 H₂0:Et0H (90:10) 중에서 슬러리시킴으로써 정제될 수 있고, 수득된 세척 결정은 모세관 용융점 기술에 의해 206-212℃ 의 용융점을 갖는다. 17-AAG 의 두번째 생성물은 2-프로필 알콜 (이소프로판올) 로부터의 조 생성물을 용해 및 재결정화시킴으로써 수득될 수 있다. 상기 두번째 17-AAG 생성물은 모세관 용융점 기술에 의해 147-153℃ 의 용융점을 갖는다. 2 개의 17-AAG 생성물을 저 용융 형태 및 고 용융 형태라고 지정한다. 저 용융 형태의 안정성은 고 용융 형태가 정제된 용매 (H₂O:EtOH (90:10)) 중에서 결정을 슬러리시킴으로써 테스트될 수 있으며 ; 고 용융 형태로의 전환은 관찰되지 않았다. 17-AAG 의 2 개의 다형체 형태의 제조의 상세한 사항은 실시예 1 - 2 를 참조한다.

III . HSP90 의 억제에 의한 ZAP70 의 하향 조절의 효능의 특징화 및 평가

A. 세포 파쇄물 내의 ZAP70 농도의 결정

많은 상이한 유형의 방법이 세포 내 및 유체 샘플 중의 단백질 농도를 결정하고, 단백질 수준을 측정 또는 예측하기 위해 당기술분야에 공지되어 있다. 간접 방법은 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 사용한 핵산 혼성화 및 증폭을 포함한다. 상기 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, [Sambrook, Fritsch & Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAI, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., Ausubel, 등., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1994] 에서 토의되어 있다. ZAP70 의 농도는 면역블로팅, 방사능면역어세이, 면역형광, 웨스턴 블로팅, 면역침강, 효소-결합 면역흡착 어세이 (ELISA), 및 ZAP70 에 대한 직접적인 항체를 사용하는 유도체 기술, 및 유세포분석기와 같은 면역어세이 기술에 의해 측정될 수 있다. ZAP70 발현을 측정하는 편리하고 정량적인 방법은 FACS (형광-활성화 세포 분석기) (FACSCalibur, BD Biosciences 및 Flow-Jo 소프트웨어, 버전 2.7.4 (Tree Star)), 상기 Rassenti 등에 의한 최근 공개된 연구 및 참조로써 본원에 삽입된 개시물에서 기술된, 유세포 분석기 버전을 포함한다. Rassenti 연구에서, 혈액 세포를 각각 알로피코시아닌 및 피코에리트린으로 공액된 CD19-특이적 및 CD3-특이적 단일클론 항체 (Pharmingen), 및 또한 Alexa-488 염료와 공액된 항-ZAP70 단일클론 항체 (Becton Dickenson) 로 염색하였다. 기타 염료 시스템을 또한 사용할 수 있다. 림프구를 전-각 빛 산란기 및 측-각 빛 산란기를 바탕으로 게이팅하였고, 건강한 공여자의 혈액 단핵 세포를 초기 게이트를 구축하는데 사용할 수 있다. ZAP70 의 발현을 상기 게이팅 역치 초과인 CD19+CD3- 세포의 % 를 계산함으로써 측정하였다. ZAP70 양성 및 ZAP70 음성을 백혈병 세포의 20% 초과에서 유세포 분석기에 의해 검출된 ZAP70 의 발현으로서, 확정 범위 표현을 바탕으로 할 수 있다.

B. HSP90 리간드의 HSP90 에의 결합 친화성 결정

다양한 동위원소법, 및 측색법, 효소법, 및 밀도법과 같은 비동위원소법은 억제제의 표적 단백질에의 결합 친화성을 평가하기에 충분한 감수성을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 당기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 내용에서 사용될 수 있다.

HSP90 리간드의 HSP90 에의 결합 친화성을 또한 본원에서 참조로써 삽입된 개시물인 [Kamal 등, Nature 2003, 425:407-410] 에서 기술된 경쟁적 결합 어세이에 의해 측정할 수 있다. 리간드의 결합 친화성은 HSP90 의 공지된 억제제인 겔다나마이신의 결합을 억제시키는 리간드의 능력에 의해 측정된다. HSP90 을 함유하는 세포를 우선 파쇄 완충액 내에서 파쇄시킨다. 파쇄물을 17-AAG 가 있거나 또는 없이 인큐베이션시킨 다음, BioMag™ 스트렙타비딘 자기 비드에 결합된 비오틴-GM (Qiagen) 과 함께 인큐베이션시켰다. 결합 샘플 및 비결합 상청액을 분리해서 수합하고, SDS 단백질 겔 상에서 분석하고, HSP90 항체 (StressGen, SPA-830) 를 사용하여 블로팅할 수 있다. 웨스턴 블롯의 밴드를 Bio-rad Fluor-S MultiImager 를 사용하여 정량화할 수 있고, HSP90 의 비오틴-GM 에의 결합 억제 % 를 계산하였다. IC₅₀ 은 결합을 최대-절반만큼 억제시키는데 필요한 HSP90 리간드의 농도이다.

도 1 - 3 은 B 세포, T 세포, ZAP70 양성 CLL B 세포 및 ZAP70 음성 CLL B 세포의 파쇄물 내의 HSP90 에 대한 비오틴화 겔다나마이신 프로브 (비오틴-GM) 에 대한 17-AAG 의 경쟁적 결합을 보여준다. 웨스턴 블롯 밴드는, HSP90 의 비오틴-GM 에의 결합 억제가 17-AAG 의 농도를 증가시킴에 따라 감소함을 보여준다 (1a). 상기 결과를 정량화하고, nM 로 나타낸 비오틴-GM 대 17-AAG 농도에서의 HSP90 의 결합 억제 % 를 도식화하였다 (1b). 도는, 결합 억제가 ZAP70+ CLL B 세포로부터 단리된 HSP90 에 대해 더 높다는 것을 보여준다. 계산된 IC₅₀ 은, 17-AAG 가 ZAP70- CLL B 세포 및 정상 B 세포와 비교해 ZAP70+ CLL B 세포로부터 단리된 HSP90 에 대해 결합 친화성을 대략 10 배 더 높게 가짐을 보여준다.

C. 공- 면역침강에 의한 단백질의 연관성 결정

다양한 단백질의 내부-연관성을 흥미있는 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 공-면역침강 실험에 의해 결정할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. [Goldsby R.A. 등, KIRBY IMMUNOLOGY, 4th Edition, W.H. Freeman and Company, 2000] 를 참조한다.

ZAP70 이 HSP90 의 클라이언트 단백질인지, 그리고 ZAP70+ CLL B 세포 내의 HSP90 이 멀티-샤페론 복합체 내에 존재하는지 알아보기 위해, 4 가지 공-면역침강 방법 한 세트를 수행하였다. MCF-7 유방암 세포, 1 차 단리된 ZAP70+ 및 ZAP70- 만성 림프성 백혈병 (CLL B) 세포 및 정상 T 및 B 세포를 파쇄하고, 흥미있는 단백질에 특이적인 항체와 함께, 미리-차단된 단백질-A 세파로스 비드 (Zymed) 와 함께 인큐베이션시켰다. 결합 및 비결합 분획을 따로 수합하고, 지정 항체를 사용한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석할 수 있다.

도 4 는 공-면역침강 실험의 면역블로팅을 보여준다. 실험의 각 단계에 사용된 항체를 지정하였다. IP Ab 는 면역침강 동안에 사용된 항체를 말한다. WB Ab 는 웨스턴 블롯 동안에 사용된 항체를 말한다. P23 및 HOP 는 2 개의 공지 멀티-샤페론 HSP90 복합체의 필수 성분이다. 제 1 젤은, ZAP70 이 ZAP70+ CLL B 세포 및 T 세포에서는 발현이 되나, ZAP70- CLL B 세포 또는 정상 B 세포에서는 발현되지 않음을 보여준다. 제 2 젤은 ZAP70 이 ZAP70+ CLL B 세포 내의 HSP90 과는 물리적으로 관련되어 있으나, 정상 T 세포를 포함한 임의의 기타 세포 유형 내의 HSP90 과는 그렇지 않음을 보여준다. 제 3 젤은 공-면역침강을 역행함으로써 이전의 발견을 확인시켜준다. 제 4 젤은 MCF-7 세포 (양성 조절, [Kamal 등, Nature, 2003, 425:407-410] 참조) 및 ZAP70+ CLL B 세포 내의 HSP90 이 활성화된 상태 (HOP 및 p23 이 있는 멀티샤페론 복합체) 에 있는 반면, ZAP70-CLL B 세포 또는 정상 T 또는 B 세포 내의 HSP90 은 잠재적인 휴지기 상태 (HOP 또는 p23 와 관련이 없음) 에 있음을 보여준다.

IV . ZAP70 억제의 효능의 특징화 및 평가

HSP90 의 억제에 의한 ZAP70 의 다운스트림 효과는, 선택된 HSP90 억제제로 처리한 후 ZAP70 발현의 양을 직접 측정하거나, 또는 세포의 생존성을 측정함으로써 측정될 수 있다.

개별 ZAP70+ 환자의 B-세포 만성 림프성 백혈병 세포의 1 차 단리물을 EC1 (17-AAG), EC82 또는 EC86 (2 가지 퓨린 기재의 공지 HSP90 억제제) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) 으로 37℃ 에서 24 시간 동안 처리하였다. ZAP70 단백질 발현의 수준을 특이적 항-ZAP70 항체를 사용한 투과된 세포의 간접 면역형광 및 FACS 분석에 의해 측정하였다.

도 5 는, 모든 3 가지 활성 HSP90 억제제가 투여량-의존적으로 ZAP70 의 분해를 유도하였으며, 이는 공-면역침강 실험에서 나타낸 물리적 연관에 의해 지시된 바와 같이 (도 4), ZAP70 이 HSP90-의존성 클라이언트 단백질임을 확인시켜줌을 보여주는 것이다. 추가로, 3 가지 구조적-비관련 HSP90 억제제가 동일한 효과를 강하게 생성하였다는 사실은, CLL B 세포 내의 ZAP70 의 안정성을 위한 필수 단백질로서의 HSP90 을 함축한다.

개별 ZAP70+ B-세포 만성 림프성 백혈병 환자로부터의 백혈구의 1 차 단리물을 처리하지 않은 상태로 놔두거나 (좌측 패널) 또는 300 nM EC1 (17-AAG) 로 37℃ 에서 24 시간 동안 처리하였다 (우측 패널). ZAP70 단백질 발현의 수준을, 피코에리트린에 공액된 특이적인 항-CD3 항체 및 Alexa-488 염료에 공액된 항-ZAP70 항체를 사용한 2-색상 간접 면역형광에 의해 측정하고, 유세포 분석기에 의해 분석하였다. CD3 은 T 세포의 특이적 표지이다. 도 6 은 비처리 CLL-B 세포 비처리 (좌측 패널) 또는 처리 (300 nM 17-AAG) (우측 패널) 세포에서의 ZAP70 의 발현을 비교한다. 비처리 세포 (좌측 패널) 에서 나타낸 바와 같이, 대략 5% 의 세포가 정상 T-세포 (CD3+, ZAP70+, 상부 우측 사분면) 였고 ~85% 의 세포가 ZAP70+ CLL B 세포 (CD3-, ZAP70+, 하부 우측 사분면) 였다. EC1 (17-AAG) 은 공-면역침강 실험에서 정상 T 세포에서가 아니라 B-CLL 세포에서 나타낸 물리적 연관으로부터 예측되는 바와 같이 (도 4), B-CLL 세포 (% 양성 세포 85% -> 34%) 내에서 ZAP70 의 분해를 유도하였으나, 정상 T-세포 (% 양성 세포 4.5% -> 4.2%) 에서는 그렇지 못하였다. HSP90 억제제가 정상 T-세포에서가 아니라 B-CLL 세포에서 ZAP70 분해를 유도한다는 사실은 상기 약물이 ZAP70 키나아제 억제제보다 더욱 특이적인 항백혈병 활성을 가질 것임을 지시한다. B-CLL 환자는 그의 질환에 의해 만성적으로 면역억제되기 때문에, ZAP70 에 의해 수행되는 정상 T-세포 기능에 대한 효과를 피하는 것이 확실히 유익하다는 사실이 중요하다.

개별 ZAP70+ 환자의 CLL B 세포의 1 차 단리물을 EC1 (17-AAG) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) 으로 37℃ 에서 48 시간 동안 처리하였다. 세포자멸사 세포를 미토콘드리아 생체 염료 DiOC6 및 프로피디움 요오다이드 염색을 사용한 표준 프로토콜에 의해 규명하였다. % 생존성을 100% - 세포자멸사 세포% 로서 표현한다. 도 7 은 EC1 (17-AAG) (◆) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) (■) 으로 처리한 후 ZAP70+ 만성 림프성 백혈병 B 세포의 생존성 % 를 비교한 것이다. ZAP70+ CLL B 세포가 대략 80 nM 의 50% 억제 농도 (IC₅₀) 를 가지고 17-AAG 에 의해 빨리 죽음을 확실히 보여준다.

ZAP70+ CLL B 세포가 죽는 비율을 측정하기 위해 유사한 실험을 수행하였다. 개별 ZAP70+ 환자로부터의 CLL B 세포의 1 차 단리물을 37℃ 에서 시간을 달리하면서 100 nM EC1 (17-AAG) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) 으로 처리하였다. 세포자멸 세포를 미토콘드리아 생체 염료 DiOC6 및 프로피디움 요오다이드 염색을 사용한 표준 프로토콜에 의해 규명하였다. 생존성% 를 [100% - 세포자멸 세포%] 로서 나타낸다. 도 8 은 100 nM 의 EC1 (17-AAG) (■) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) (◆) 으로 처리한 후 ZAP70+ 만성 림프성 백혈병 B 세포의 생존성% 를 비교한 것이다. 결과는, ZAP70+ 종양 세포가 17-AAG 에 의해 빨리 죽으며, 세포의 50% 가 대략 48 시간 내에 죽는다는 것을 지시한다.

16 명의 ZAP70+ 환자 및 11 명의 ZAP70- 환자로부터의 CCL B 세포의 1 차 단리물을 100 nM EC1 (17-AAG) 로 37℃ 에서 48 시간 동안 처리하였다. 세포자멸 세포를 미토콘드리아 생체 염료 DiOC6 및 프로피디움 요오다이드 염색을 사용한 표준 프로토콜에 의해 규명하였다. 생존성% 를 [100% - 세포자멸 세포%] 로서 나타낸다. 도 9 는 10O nM EC1 (17-AAG) 로 48 시간 동안 처리한 후 16 명의 ZAP70+ 환자 및 11 명의 ZAP70- 환자로부터의 CLL B 세포의 생존성을 비교한 것이다. ZAP70+ CLL B 세포의 평균 생존성% 는 45.74 +/- 3.177% 인 반면, ZAP70- B CLL 세포의 평균 생존성% 는 93 +/- 1.701% 이다. 2 개 군 사이의 생존성의 차이의 Students T-Test P-값은 고도로 통계적으로 유의성이 있는 < 0.0001 이었다.

V. 약학적 조성물의 제형 및 투여

겔다나마이신을, 미국 특허 제 3,595,955 호에 따라 [U.S. Department of Agriculture, Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research, Peoria, 111., USA, accession number NRRL 3602] 로 기탁 중인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 서브컬쳐를 사용해 제조할 수 있다. 상기 화합물의 수많은 유도체를 표준 기술에 따라 미국 특허 제 4,261,989 호, 제 5,387,584 호, 및 제 5,932,566 호에서 명시된 바와 같이 제조할 수 있다.

당업자는 예를 들어, [Goodman and Gilman's, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, current edition; Pergamon Press; and REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (current edition.) Mack Publishing Co., Easton, Pa] 에서 논의된 바와 같은 본 발명의 용도에 적용될 수 있는 제형 및 투여 기술에 친숙하다.

본 발명의 방법에 사용되는 화합물은 표준 약학적 실행에 따라, 약학적 조성물 내에서, 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 화합물은 경구, 또는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 직장 및 국소 투여 경로를 포함한 비경구로 투여될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 치료적 또는 약학적 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소 투여할 수 있다. 이는 예를 들어, 수술 동안의 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어, 크림, 연고, 주사, 카테터, 또는 임플란트 (그러나, 이에 제한되지 않음) 에 의해 수행될 수 있으며, 상기 임플란트는 예를 들어, 다공성, 비다공성, 또는 실리콘 막과 같은 막을 포함하여 젤라틴성 물질 또는 섬유로 이루어져 있다. 종양 또는 신생물성 또는 예비-신생물성 조직의 위치 (또는 전 위치) 에의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.

더욱 더, 치료적 또는 약학적 조성물은 리포좀과 같은 소낭 내에서 전달될 수 있다 (예를 들어, [Langer, Science, 1990, 249: 1527-1533; Treat 등, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, 1989, LopezBernstein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., pp. 353-365] 참조).

본 발명의 방법에 사용되는 약학적 조성물은 서방성계로 전달될 수 있다. 한 구현예에서, 펌프를 사용할 수 있다 ([Sefton, CRC Crit . Ref Biomed . Eng . 1987, 14:201; Buchwald, 등, Surgery, 1980, 55:507; Saudek 등, N Engl . J. Med , 1989, 321:574] 참조). 추가로, 서방성계를 치료 표적의 근처에 위치시킬 수 있다 ([Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 1984, Vol. 2, pp. 115-138] 참조).

본 발명의 방법에 사용되는 약학적 조성물은 정제, 구내정, 마름모꼴 정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경성 또는 연성 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭셔와 같은 경구 용도용에 적합한 형태 내에 활성 성분을 함유할 수 있다. 경구용 조성물을 약학적 조성물의 제조를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 상기 조성물은 아취가 있고 비위에 맞는 제제를 제공하기 위해, 감미제, 풍미제, 착색제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 비-독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 활성 성분을 함유한다. 상기 부형제는, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제 ; 미세결정질 셀룰로스, 소듐 크로스카멜로스, 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립화제 및 붕괴제 ; 전분, 젤라틴, 폴리비닐-피롤리돈 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 및 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크와 같은 윤활제일 수 있다. 정제를 비코팅시킬 수 있거나, 또는 약물의 맛을 가리거나 또는 위장관에서의 붕괴 및 흡수를 지연시키기 위해 공지 기술에 의해 코팅시켜서 더 긴 기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 히드록시프로필메틸-셀룰로스 또는 히드록시프로필셀룰로스와 같은 수용성 맛 가림 물질, 또는 에틸 셀룰로스 또는 셀룰로스 아세테이트 부티레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다.

경구용 제제는 또한 활성 성분이 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 같은 불활성 고체 희석제와 혼합된 경성 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 폴리에틸렌글리콜과 같은 수용성 담체 또는 피넛 오일, 액체 파라핀, 또는 올리브유와 같은 유성 매질과 혼합된 연성 젤라틴 캡슐로서 나타내어질 수 있다.

수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 활성 물질을 함유한다. 상기 부형제는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아와 같은 현탁제이고 ; 분산제 또는 습윤제는 레시틴과 같은 자연-발생 포스파티드, 또는 폴리옥시에틸렌 스테아레이트과 같이 알킬렌 옥시드와 지방산과의 축합 생성물, 또는 헵타데카에틸렌-옥시세탄올과 같이 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜과의 축합 생성물, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트와 같이 에틸렌 옥시드와 지방산 유래의 부분 에스테르 및 헥시톨과의 축합 생성물, 또는 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같이 에틸렌 옥시드와 지방산 유래의 부분 에스테르 및 헥시톨 무수물과의 축합 생성물일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트와 같은 하나 이상의 방부제, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 풍미제, 및 수크로스, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 하나 이상의 감미제를 함유할 수 있다.

아라키스유, 올리브유, 참기름 또는 코코넛유와 같은 식물유, 또는 액체 파라핀과 같은 광유 내에 활성 성분을 현탁시킴으로써 유성 현탁액을 제조할 수 있다. 유성 현탁액은 밀랍, 경성 파라핀 또는 세틸 알콜과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같은 감미제 및 풍미제를 첨가하여 비위에 맞는 경구 제제를 제공할 수 있다. 상기 조성물은 부틸화 히드록시아니솔 또는 알파-토코페롤과 같은 항-산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 방부제와 혼합한 상태로 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 상기에서 이미 언급된 것들에 의해 예시된다. 감미제, 풍미제 및 착색제와 같은 추가의 부형제가 또한 존재할 수 있다. 상기 조성물은 아스코르브산과 같은 항-산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 약학적 조성물은 또한 수-중-유 에멀젼의 형태로 있을 수 있다. 유상은 올리브유 또는 아라키스유와 같은 식물유, 또는 액체 파라핀과 같은 광유 또는 그것들의 혼합물일 수 있다. 적합한 에멀젼화제는 대두 레시틴과 같은 자연-발생 포스파티드, 및 소르비탄 모노올레에이트와 같은 헥시톨 무수물 및 지방산 유래의 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같은 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드와의 축합 생성물일 수 있다. 상기 에멀젼은 또한 감미제, 풍미제, 방부제 및 항산화제를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭셔가 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로스와 같은 감미제와 함께 제형될 수 있다. 상기 제형은 또한 완화제, 방부제, 풍미제 및 착색제 및 항산화제를 함유할 수 있다.

약학적 조성물은 멸균 주사 수용액의 형태로 있을 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다.

멸균 주사 제제는 또한 활성 성분이 유상 내에서 용해되는 멸균 주사 수-중-유 미세에멀젼일 수 있다. 예를 들어, 활성 성분을 우선 대두 및 레시틴의 혼합물 내에 용해시킬 수 있다. 다음, 상기 용액을 물 및 글리세롤 혼합물에 넣고 처리하여 미세에멀젼을 형성시킨다.

주사 용액 또는 미세에멀젼을 국소 일시 주사에 의해 환자의 혈류에 도입할 수 있다. 대안적으로, 본 화합물의 일정 순환 농도를 유지하는 방식으로 용액 또는 미세에멀젼을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 상기 일정 농도를 유지하기 위해서, 지속적인 정맥 내 전달 장치를 사용할 수 있다. 상기 장치의 예가 Deltec CADD-PLUSTM 모델 5400 정맥내 펌프이다.

약학적 조성물은 근육 내 및 피하 투여용 멸균 주사 수성 또는 유성 현탁액의 형태로 있을 수 있다. 상기 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당기술분야에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사 제제는 또한 1,3-부탄 디올 내 용액으로서 비-독성의 비경구-허용가능한 희석제 또는 용매 내 멸균 주사액 또는 현탁액일 수 있다. 또한, 멸균, 고정유가 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 임의의 블랜드 고정유를 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사 제제에 사용된다.

본 발명의 방법에 사용되는 HSP90 억제제는 또한 약물의 직장 투여용 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은, 상온에서 고체이나 직장 온도에서 액체이어서 직장 내에서 용융되어 약물을 방출시킬 적합한 비-자극성 부형제와 억제제를 혼합시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 물질은 코코아 버터, 글리세린화 젤라틴, 수소화 식물유, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스테르의 혼합물을 포함한다.

국소 적용을 위해, HSP90 억제제를 함유하는 크림, 연고, 젤리, 용액 또는 현탁액 등을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 국소 적용에는 구강 세척액 및 가글이 포함될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 화합물은 적합한 비내 비히클 및 전달 장치의 국소 사용을 통해 비내 형태로, 또는 당업자에게 잘 공지된 경피 피부 패치의 형태를 사용하여 경피 경로를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템 형태로 투여되기 위해서는, 물론 투여량 투여가 투여량 섭생 전체를 통틀어서 간헐적이기보다는 지속적이어야 할 것이다.

본 발명의 방법 및 화합물은 또한 치료 증상에 대한 그의 특별한 유용성을 위해 선택되는 기타 잘 공지된 치료제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 공지된 항암제 및 세포독성제와 병용하여 유용할 수 있다.

추가로, 본 방법 및 화합물은 또한 세포 표면 성장 인자 수용체를 세포성 증식을 개시하는 핵 신호에 연결하는 신호화 경로 중 일부분의 기타 억제제와 병용하여 유용할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 신생혈관을 억제시키고, 그리하여, VEGF 수용체, 앤지오스타틴 및 엔도스타틴을 표적으로 하는 리보자임 및 안티센스를 포함한 VEGF 수용체 억제제를 포함하여 (그러나, 이에 제한되지 않음), 종양 세포의 성장 및 침윤을 억제시키는 기타 제제와 함께 유용할 수 있다.

본 발명의 방법과 병용되어 사용될 수 있는 항신생물성제의 예에는, 일반적으로 알킬화제, 항-대사물질 ; 에피도필로톡신 ; 항신생물성 효소 ; 토포이소머라제 억제제 ; 프로카바진 ; 미톡산트론 ; 백금 배위 착체 ; 생물학적 반응 변형제 및 성장 억제제 ; 호르몬성/항-호르몬성 치료제 및 조혈모 성장 인자가 포함된다.

항신생물제 부류의 예에는, 안트라사이클린계 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 에포틸론, 디스코데르몰리드, 프테리딘계 약물, 디인네네 (diynene), 및 포도필로톡신이 포함된다. 상기 부류 중 특히 유용한 구성원에는, 예를 들어 카르미노마이신, 다우노루비신, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로메토트렉세이트, 미토마이신 C, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토퓨린, 겜시타빈, 사이토신 아라비노시드, 포도필로톡신 또는 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 또는 테니포시드와 같은 포도필로톡신 유도체, 멜팔란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류로시딘, 빈데신, 류로신, 파클리탁셀 등이 포함된다. 기타 유용한 항신생물제에는 에스트라무스틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 블레오마이신, 겜시타빈, 이포사미드, 멜팔란, 헥사메틸 멜라민, 티오테파, 사이타라빈, 이다트렉세이트, 트리메트렉세이트, 다카르바진, L-아스파라기나제, 캄포테신, CPT-11, 토포테칸, 아라-C, 비칼루타미드, 플루타미드, 류프롤리드, 피리도벤조인돌 유도체, 인터페론 및 인터루킨이 포함된다.

본 발명의 방법에 사용되는 HSP90 억제제가 인간에 투여될 때, 일일 투여량은 보통 개개 환자의 연령, 체중, 및 반응, 뿐만 아니라 환자의 증후의 심각성에 따라 일반적으로 투여량을 달리하면서, 처방 의사에 의해 결정될 것이다.

한 실례의 적용에서, 적합한 양의 HSP90 억제제를 유방암과 같은 암을 치료하기 위해 포유류에 투여한다. 각각의 유형의 억제제의 양을 일일 약 0.1 mg/kg (체중) 내지 약 60 mg/kg (체중), 바람직하게는 일일 약 0.5 mg/kg (체중) 내지 약 40 mg/kg (체중) 으로 투여한다. 본 조성물을 포함하는 특별한 치료 투여량은 HSP90 억제제를 약 0.01 mg 내지 약 1000 mg 으로 포함한다. 바람직하게는, 투여량은 HSP90 억제제를 약 1 mg 내지 약 1000 mg 으로 포함한다.

바람직하게는, 약학적 제제는 단위 투여량 형태로 있다. 상기 형태에서, 제제는 원하는 목적을 달성하기에 효과적인 양과 같은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 투여량으로 세분된다.

제제의 단위 투여량 내 활성 화합물의 양은 다양할 수 있거나 또는 특별한 적용에 따라 약 0.1 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 약 1 mg 내지 300 mg, 더욱 바람직하게는 10 mg 내지 200 mg 으로 조정될 수 있다.

적용되는 실제 투여량은 환자의 요구사항 및 치료 증상의 심각성에 따라 다양할 수 있다. 특별한 상황에 대해 적절한 투여량을 결정하는 것은 당기술분야 내에 속한다. 일반적으로, 화합물의 최적 투여량 미만의 더 작은 투여량으로 치료가 시작된다. 그런 후, 상황 하에 최적의 효과가 달성될 때까지 투여량을 소량씩 증가시킨다. 편리를 위해, 총 일일 투여량을 세분하여 필요하다면 하루 동안 일부분씩 투여할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 HSP90 억제제 및 사용가능하다면 기타 화학치료제 및/또는 방사선 치료의 양 및 투여 빈도는 환자의 연령, 증상 및 크기, 뿐만 아니라 치료 질환의 심각성과 같은 요소를 고려하여 참여 임상의 (내과의사) 의 판단에 따라 조절될 것이다.

화학치료제 및/또는 방사선 치료는 당업계에 잘 공지된 치료 프로토콜에 따라 투여될 수 있다. 당업자는, 화학치료제 및/또는 방사선 치료의 투여가 치료 질환 및 상기 질환에 대한 화학치료제 및/또는 방사선 치료의 공지 효과에 따라 다양할 수 있음을 알 것이다. 또한, 숙련된 임상의의 지식에 따라, 환자에의 투여 치료제 (즉, 항신생물제 또는 방사선) 의 관찰된 효과를 고려하고, 투여 치료제에 대한 질환의 관찰된 반응을 고려하여 치료 프로토콜 (예를 들어, 투여량 및 투여 시간) 을 다양하게 할 수 있다.

또한, 일반적으로, HSP 90 억제제 및 화학치료제는 동일 약학적 조성물 내에서 투여되어서는 안되고, 상이한 물리적 및 화학적 특성 때문에 상이한 경로에 의해 투여되어야 할 수 있다. 예를 들어, HSP90 억제제는 그의 양호한 혈액 농도를 발생시키고 유지시키기 위해 경구 투여될 수 있고, 한편 화학치료제는 정맥내 투여될 수 있다. 가능한 경우 동일한 약학적 조성물 내에서의 투여 형태 및 투여 득책의 결정은 숙련된 임상의의 지식에 잘 속해 있다. 초기 투여는 당업계에 공지된 구축된 프로토콜에 따라 수행될 수 있고, 그런 다음, 관찰된 효과를 바탕으로, 숙련된 임상의가 투여량, 투여 형태 및 투여 시간을 변형시킬 수 있다.

HSP90 억제제, 및 화학치료제 및/또는 방사선의 특별한 선택은 참여 내과의사의 진단 및 환자의 상태에 대한 그의 판단 및 적절한 치료 프로토콜에 의존할 것이다.

HSP90 억제제, 및 화학치료제 및/또는 방사선을 증식 질환의 성질, 환자의 상태, 및 HSP90 억제제와 함께 (즉, 단일 치료 프로토콜 내에서) 투여되는 화학치료제 및/또는 방사선의 실제적인 선택에 따라, 동시에 (예를 들어, 동시에, 본래 동시에 또는 동일 치료 프로토콜 내에서) 또는 연속적으로 투여할 수 있다.

HSP90 억제제 및 화학치료제 및/또는 방사선이 동시에 또는 본래 동시에 투여되지 않는다면, HSP90 억제제 및 화학치료제 및/또는 방사선의 초기 투여 순서는 중요하지 않을 수 있다. 따라서, HSP90 억제제를 우선 투여하고, 이어서 화학치료제 및/또는 방사선을 투여할 수 있거나 ; 또는 화학치료제 및/또는 방사선을 우선 투여하고 이어서 HSP90 억제제를 투여할 수 있다. 상기 대체적인 투여를 단일 치료 프로토콜 동안에 반복할 수 있다. 투여 순서, 및 치료 프로토콜 동안의 각각의 치료제의 투여 반복 횟수의 결정은 치료되는 질환 및 환자의 증상에 대한 평가 후에 숙련된 내과의사의 지식 내에 잘 속한다. 예를 들어, 특히 화학치료제가 세포독성제라면, 화학치료제 및/또는 방사선을 우선 투여할 수 있고, 그런 다음 이어서 HSP90 억제제를 투여하는 치료를 계속하고, 유리하다고 결정되면 이어서 화학치료제 및/또는 방사선을 투여하고, 마침내는 치료 프로토콜이 완성된다.

따라서, 경험과 지식에 따라, 수행 내과의사는 치료가 진행되면서, 개별 환자의 필요에 따라 치료 성분 (치료제 -즉, HSP90 억제제, 화학치료제 또는 방사선) 의 투여에 대한 각각의 프로토콜을 변경할 수 있다.

치료가 투여되는 투여량에서 효과적인지 판단하면서 참여 임상의는 환자의 일반적인 안녕뿐만 아니라 질환-관련 증후의 완화, 종양 성장의 억제, 종양의 실제적인 축소, 또는 전이의 억제와 같은 더욱 분명한 표시를 고려할 것이다. 종양의 크기는 방사선학 연구와 같은 표준 방법, 예를 들어 CAT 또는 MPI 스캔에 의해 측정될 수 있고, 연속적인 측정은 종양의 성장이 지연되거나 또는 역행되었는지 아닌지를 판단하는데 사용될 수 있다. 통증과 같은 질환-관련 증후의 완화 및 전체적인 증상의 향상이 또한 치료의 효능을 판단하는데 도움을 주도록 사용될 수 있다.

VI . 제제의 사용 방법

A. 투여량 범위

진행성 고형 종양을 가진 성인 환자에서의 17-AAG 의 I 기 약리학적 연구는 매 3 주 5 일 동안 1-시간 주입으로 매일 투여되었을 때의 최대 인용 투여량 (MTD) 을 40 mg/m² 로 결정하였다 (Wilson 등, Am . Soc . Clin . Oncol , abstract, "Phase I Pharmacologic Study of 17-(Allyamino)-17-데메톡시겔다나마이신 (AAG) in Adult Patients with Advanced Solid Tumors" 2001). 상기 연구에서, 최종 반감기, 투명성 및 꾸준한-상태의 체적에 대한 평균 ± SD 값을 각각 2.5 ± 0.5 시간, 41.0 ± 13.5 L/시간, 및 86.6 ± 34.6 L/m² 으로 결정하였다. 혈장 Cmax 수준은 40 및 56 mg/m² 에서 1860 ± 660 nM 및 3170 ± 1310 nM 로 측정되었다. 상기 값을 기준으로 사용하면, 본 발명의 제제에 대한 유용한 환자 투여량의 범위가 활성 성분의 약 0.40 mg/m² 및 4000 mg/m² 사이 (여기서, m² 는 표면적을 나타냄) 에 포함될 것임이 추측된다. 표준 알고리즘은 mg/m² 을 mg (약물)/kg (환자 체중) 으로 전환시키기 위해 존재한다.

하기 실시예는 단지 예시로써 제공된 것이며, 거기에 포함된 모든 약물, 성분, 몰비, 농도, pH 및 단계는 청구항에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 실시예 1 - 12 의 화합물 제제는 본 출원이 우선적으로 청구하고 있는, 미국 가출원 시리얼 번호 60/371,668 및 60/478,430, 및 2003 년 4 월에 출원된 명칭이 [NOVEL ANSAMYCIN FORMULATIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND USING SAME] 인 국제 출원 PCT/US03/10533, 및 2003 년 10 월 4 일에 출원된 명칭이 [DRUG FORMULATIONS HAVING LONG AND MEDIUM CHAIN TRIGLYCERIDES] 인 국제 출원 PCT/US03/1053 으로부터 하기에서 적절히 재생된다.

실시예 1 : 17- AAG 의 제조

건조된 2 L 플라스크 내의 건성 THF 1.45 L 중 겔다나마이신 45.0 g (80.4 mmol) 에 건성 THF 50 mL 중 알릴 아민 36.0 mL (470 mmol) 을 30 분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에 4 시간 동안 교반하고, 그 때 TLC 분석은, 반응이 완료되었음을 지시하였다 [(GDM: 밝은 황색: Rf=0.40; (5% MeOH-95% CHCl₃); 17-AAG: 보라색: Rf=0.42 (5% MeOH-95% CHCl₃)]. 용매를 로터리 증발에 의해 제거하고, 미정제 물질을 25℃ 에서 H₂O:EtOH (90:10) 420 mL 중에서 슬러리하고, 여과시키고, 45℃ 에서 8 시간 동안 건조시켜, 보라색 결정으로서 17-AAG 40.9 g (66.4 mmol) 을 수득하였다 (82.6% 수율, 254 nm 에서 모니터링된 HPLC 에 의해 > 98% 의 순도). MP 206-212℃. ¹H NMR 및 HPLC 는 목적 생성물과 일치함.

실시예 2 : 저 용융 형태의 17- AAG 의 제조

실시예 1 의 미정제 17-AAG 를 80℃ 에서 2-프로필 알콜 (이소프로판올) 800 mL 중에 용해시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 여과하고 이어서 45℃ 에서 8 시간 동안 건조시켜서, 17-AAG 44.6 g (72.36 mmol) 을 보라색 결정으로서 수득하였다 (90% 수율, 254 nm 에서 모니터링된 HPLC 에 의한 순도 > 99%). MP = 147 - 153℃. ¹H NMR 및 HPLC 는 목적 생성물과 일치하였다.

실시예 3 : 저 용융 형태의 17- AAG 의 용매화 안정성

25℃ 의 H₂O:EtOH (90:10) 400 mL 중의 실시예 2 의 17-AAG 생성물을 여과하 고 45℃ 에서 8 시간 동안 건조시켜, 17-AAG 42.4 g (68.6 mmol) 을 보라색 결정으로서 수득하였다 (95% 수율, 254 nm 에서 모니터링된 HPLC 에 의한 순도 > 99%). MP = 147 - 175℃. ¹H NMR 및 HPLC 는 목적 생성물과 일치하였다.

실시예 4 : 화합물 237 의 제조 : 이량체

3,3-디아미노-디프로필아민 (1.32 g, 9.1 mmol) 을 N2 하에 화염-건조 플라스크 내의 DMSO (200 mL) 중 겔다나마이신 (10 g, 17.83 mmol) 의 용액에 적가하고, 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 12 시간 후에 물로 희석시켰다. 침전물을 형성시키고, 여과하여, 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제 생성물을 실리카 크로마토그래피 (5% CH₃OH/CH₂Cl₂) 에 의해 크로마토그래피하여, 목적하는 이량체를 보라색 고체로서 수득하였다. 순수한 보라색 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔) 후에 수득하였다 ; 수율 : 93% ; mp 165℃.

상응하는 HCl 염을 하기 방법에 의해 제조하였다 : EtOH (5 ml, 0.12 3N) 중 HCl 용액을 THF (15 ml) 및 EtOH (50 ml) 중 화합물 #237 (상기 제조된 1 g) 의 용 액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 10 분 동안 교반하였다. 염을 침전시키고, 여과하고, 다량의 EtOH 로 세척하고, 진공 내에서 건조시켰다. 대안적으로는, "메실레이트" 염을 HCl 대신에 메탄술폰산을 사용하여 형성시킬 수 있다.

실시예 5 : 화합물 914 의 제조

디옥산 10 mL 중 겔다나마이신 (500 mg, 0.89 mmol) 에 셀레늄 (IV) 이산화물 (198 mg, 1.78 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃ 로 가열하고, 3 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 용액을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물 및 염수로 세척하고, 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 여과시키고, 진공 내에서 증발시켰다. 최종 순수한 황색 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔) 후에 수득하였다 ; 수율: 75%.

실시예 6: 화합물 967 의 제조

THF 3mL 중 화합물 #914 (50 mg, 0.05 mmol) 에 알릴아민 (3.5 mg, 0.06 mmol) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 용매를 로터리 증발에 의해 제거하였다. 순수한 보라색 생성물을 칼럼 크로마 토그래피 (실리카 겔) 후에 수득하였다 ; 수율: 90%.

실시예 7 : 화합물 956 의 제조

알릴아민 대신에 아제티딘을 사용하는 것을 제외하고는, 화합물 #956 을 화합물 #967 에 대해 기술된 것과 동일한 방법으로 제조하였다. 최종 순수한 보라색 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카 겔) 후에 수득하였다 ; 수율: 89%.

실시예 8 : 화합물 529 의 제조

EtOAc 중 17-아미노겔다나마이신 (1 mmol) 의 용액을 RT 에서 Na₂S₂O₄ (0.1 M, 300 ml) 로 처리하였다. 2 시간 후에, 수성층을 EtOAc 로 2 회 추출하고, 조합된 유기층을 Na₂SO₄ 로 건조시키고, 감압 하에 농축시켜, 18,21-디히드로-17-아미노겔다나마이신을 황색 고체로서 수득하였다. 상기 고체를 무수 THF 중에 용해시키고, 캐뉼러를 통해 피콜리노일 클로라이드 (1.1 mmol) 및 MS4A (1.2 g) 의 혼합물에 옮겼다. 2 시간 후, EtN(i-Pr)₂ (2.5 mmol) 를 반응 혼합물에 추가로 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 다음, 물을 잔류물에 첨가하고, 이를 EtOAc 로 3 회 추출하고 ; 조합된 유기층을 Na₂SO₄ 로 건조시키고, 감압 하에 농축시켜, 미정제 생성물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 화합물 529 인 17-피콜리노일-아미노겔다나마이신을 황색 고체로서 수득하였다. 80:15:5 CH₂Cl₂: EtOAc: MeOH 중 Rf= 0.52. Mp = 195 - 197℃.

실시예 9 : 화합물 1046 의 제조

피콜리노일 클로라이드 (3.1 g, 81%) 대신에 4-클로로메틸-벤조일 클로라이드를 사용하여 화합물 #529 에 대해 기술된 과정에 따라 화합물 #1046 을 제조하였다. 80:15:5 CH₂Cl₂: EtOAc: MeOH 중 Rf= 0.45.

실시예 10 : 화합물 1059 의 제조

THF (5 ml) 중 화합물 #1046 (0.14 g, 0.2 mmol) 의 용액에 나트륨 요오다이드 (30 mg, 0.2 mmol) 및 모르폴린 (35 μL, 0.4 mmol) 을 첨가하였다. 생성 혼합물을 환류에서 10 시간 동안 가열하고, 그 후에 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc (30 ml) 중에 재용해시키고, 물 (10 ml) 로 세척하고, Na₂SO₄ 로 건조시키고, 다시 농축시켰다. 다음, 잔류물을 EtOH (10 ml) 중에 재결정시켜서, 화합물 1059 (100 mg, 66%) 를 황색 고체로서 수득하였다. 80:15:5 CH₂Cl₂: EtOAc: MeO 중 Rf= 0.10.

실시예 11 : 화합물 1236 의 제조

모르폴린 대신에 벤질에틸 아민을 사용하여 화합물 #1059 에 대해 기술된 과정에 따라 화합물 #1236 을 제조하였다. 80:15:5 CH₂Cl₂2: EtOAc: MeOH 중 Rf= 0.43.

실시예 12 : 화합물 563 : 17-( 벤조일 )- 아미노겔다나마이신의 제조.

EtOAc 중 17-아미노겔다나마이신 (1 mmol) 의 용액을 Na₂S₂O₄ (0.1 M, 300 mL) 로 RT 에서 처리하였다. 2 시간 후, 수성층을 EtOAc 로 2 회 추출하고, 조합된 유기층을 Na₂SO₄ 로 건조시키고, 감압 하에 농축시켜, 18,21-디히드로-17아미노겔다나마이신을 황색 고체로서 수득하였다. 상기 고체를 무수 THF 중에 용해시키고, 캐뉼러를 통해 벤조일 클로라이드 (1.1 mmol) 및 MS4A (1.2 g) 의 혼합물에 이동시켰다. 2 시간 후, EtN(i-Pr)₂ (2.5 mmol) 를 반응 혼합물에 추가로 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 다음, 물을 잔류물에 첨가하고, 이를 EtOAc 로 3 회 추출하고 ; 조합된 유기층을 Na₂SO₄ 로 건조시키고, 감압 하에 농축시켜, 미정제 생성물을 수득하고, 플래쉬 크 로마토그래피에 의해 정제하여, 17-(벤조일)-아미노겔다나마이신을 수득하였다. 80:15:5 CH₂Cl₂2: EtOAc: MeOH 중 Rf= 0.50. Mp = 218 - 220℃.

실시예 13 : 세포 파쇄물의 제조.

연구용 세포를 Potter-Elvejem 균질기 내에서의 매뉴얼 다운싱 (douncing) 에 의해 파쇄 완충액 (20 mM HEPES, pH 7.3, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 100 mM KCl) 중에서 파쇄시켰다.

실시예 14 : HSP90 파쇄물 결합 어세이 .

정상 B 세포, 정상 T 세포, ZAP70+ CLL B 세포 및 ZAP70- CLL B 세포를 실시예 13 에서 기술된 바와 같은 파쇄 완충액 중에서 파쇄시켰다. 파쇄물을 4℃ 에서 30 분 동안 17-AAG 가 있거나 또는 없이 인큐베이션시킨 다음, BioMag™ 스트렙타비딘 자기 비드에 결합된 비오틴-GM (Qiagen) 과 함께 4℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 튜브를 자기 랙 상에 놓고, 비결합 상청액을 제거하였다. 자기 비드를 파쇄 완충액 중에서 3 회 세척하고, SDS-PAGE 샘플 완충액 내에서 95℃ 에서 5 분 동안 끓였다. 샘플을 SDS 단백질 겔, 및 HSP90 항체 (StressGen, SPA-830) 를 사용하여 수행된 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 웨 스턴 블롯의 밴드를 Bio-rad Fluor-S MultiImager 를 사용해 정량화하고, HSP90 의 비오틴-GM 에의 결합의 억제% 를 계산하였다. 보고된 IC₅₀ 은 결합의 최대-절반을 억제시키는데 필요한 17-AAG 의 농도이다. 경쟁적 결합의 결과를 도 1 - 3 에 나타낸다.

실시예 15 : HSP90 과 클라이언트 단백질과의 결합을 측정하기 위한 연구

MCF-7 유방암 세포, ZAP70+ 및 ZAP70- B-세포 만성 림프성 백혈병 (B-CLL) 세포의 일차 단리물 및 정상 T 및 B 세포를 실시예 13 에서 기술된 바와 같이 파쇄하고, 공-면역침강 실험을 [Kamal 등, Nature, 2003 425: 407-410] 에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 단백질-A Sepharose 비드 (Zymed) 를 5% BSA 로 미리-차단시켰다. 세포 파쇄물을 단백질-A Sepharose 비드 (50% 슬러리) 50 μL 와 함께 인큐베이션시킴으로써 미리-정화시켰다. 미리-정화된 세포 파쇄물 100 μL 에, 항체가 없이 또는 HSP90, p23 및 Hop 에 대한 항체를 첨가하고, 4℃ 에서 1 시간 동안 회전시켜 인큐베이션시켰다. 다음, 미리-정화된 비드 50 μL (50% 슬러리) 를 첨가하고, 4℃ 에서 1 시간 동안 회전시켜 인큐베이션시켰다. 결합 비드를 간단하게 3,00O g 에서 원심분리시키고, 비결합 샘플을 수합하였다. 비드를 파쇄 완충액 중에서 3 회 세척하고, 50 mM Tris, pH 6.8 중에서 1 회 세척한 다음, SDS-샘플 완충액을 95℃ 에서 5 분 동안 첨가하였다. 결합 및 비결합 샘플을 SDS-PAGE 및 지시 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 공-면역침강의 결과를 도 4 에 나타낸다.

실시예 16. 선택된 HSP90 억제제에 의한 ZAP70 발현의 억제를 기술하기 위한 연구.

개별 ZAP70+ 환자로부터의 ZAP70+ 만성 림프성 백혈병 B-세포의 1 차 단리물을 EC1 (17-AAG), EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) 또는 EC82 또는 EC86 (2 가지 다른 공지된 HSP90 억제제) 으로 37℃ 에서 24 시간 동안 처리하였다. ZAP70 단백질 발현의 수준을 특이적인 항-ZAP70 항체를 사용한 투과된 세포의 간접 면역형광 및 FACS 분석에 의해 측정하였다. 연구 결과를 도 5 에 나타낸다. 모든 3 가지 활성 HSP90 억제제는 투여량-의존적으로 ZAP70 의 분해를 유도하였고, 이는 ZAP70 이 공-면역침강 실험에서 나타난 물리적 결합에 의해 지시된 바와 같이, HSP90-의존성 클라이언트 단백질임을 확인시켜 주었다 (도 4). 3 가지 구조적-비연관 HSP90 억제제가 동일한 효과를 발생시켰다는 사실은 CLL B-세포에서 ZAP70 의 안정성을 위한 필수 단백질로서의 HSP90 을 강하게 암시한다.

실시예 17. ZAP70 + CCL B-세포 환자의 혈액 세포 상의 HSP90 의 억제의 하위 효과를 측정하기 위한 연구.

개별 ZAP70+ 만성 림프성 백혈병 B-세포 환자의 백혈구 세포의 1 차 단리물을 처리하지 않은 상태로 놔두거나 또는 300 nM 17-AAG 로 37℃ 에서 24 시간 동안 처리하였다. 다음, 샘플을 상기 Rassebti 등에서 기술된 방법에 의해 유세포 분석기 분석을 위해 제조하였다. 세포를 우선 각각 알로피코시아닌 및 피코에리트린과 공액된 CD19-특이적 단일클론 항체 및 CD3-특이적 단일클론 항체 (Pharmingen) 로 염색하고, 후에 Alexa-488 염료에 공액된 ZAP70 에 특이적인 단일 클론 항체 (Becton Dickinson) 로 염색하였다. CD3 은 T 세포 특이적 마커이다. ZAP70 단백질 발현의 수준을 유세포 분석기 (FACSCalibur, BD Biosciences) 및 Flow-Jo 소프트웨어, 버전 2.7.4 (Tree Star) 에 의해 계산하였다. 결과를 도 6 에 나타내고, 좌측 패널은 비처리 세포에서의 ZAP70 발현을 나타내고, 우측 패널은 비처리 세포에서의 ZAP70 발현 수준을 나타낸다.

비처리 세포 (좌측 패널) 에서, 대략 5% 의 세포가 정상 T-세포 (CD3+, ZAP70+, 상부 우측 사분면) 였고 ~85% 의 세포는 ZAP70+ CLL B-세포 (CD3-, ZAP70+, 하부 우측 사분면) 였다. 17-AAG 는 정상 T-세포가 아닌 (% 양성 세포 4.5% -> 4.2%) CLL B-세포에서 ZAP70 의 분해 (% 양성 세포 85% -> 34%) 를 유도하였고, 이는 공-면역 침강 실험 (도 4) 에서 정상 T- 세포에서가 아닌 CLL B-세포에서 기술된 물리적 결합으로부터 예측된 바와 같다.

실시예 18. ZAP70 + CCL B 세포 생존성에 대한 HSP90 억제의 농도 의존적 효과

개별 환자의 ZAP70+ 만성 림프성 백혈병 B-세포의 1 차 단리물을 증가하는 농도의 EC1 (17-AAG) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) 으로 37℃ 에서 48 시간 동안 처리하였다. 세포자멸 세포를 미토콘드리아 생체 염료 DiOC6 및 프로피디움 요오다이드 염색을 사용한 표준 프로토콜에 의해 규명하였다.

결과를 생존성% 대 nM 로 있는 억제제의 농도로서 도 7 에 플롯화하였다. 생존성% 를 [100% - 세포자멸 세포%] 로서 표현한다. ZAP70+ 종양 세포가 17- AAG 에 의해 일찍 죽고, 50% 억제 농도 (IC₅₀) 는 대략 8O nM 이었다.

실시예 19. ZAP70 + CCL B 세포 생존성에 대한 HSP90 의 시간 의존성 억제 효과.

개별 ZAP70+ 환자의 B-세포 만성 림프성 백혈병 세포의 1 차 단리물을 100 nM EC1 (17-AAG) 또는 EC116 (비활성 구조-연관 HSP90 억제제) 으로 37℃ 에서 다양한 시간 동안 처리하였다. 세포자멸 세포를 미토콘드리아 생체 염료 DiOC6 및 프로피디움 요오다이드 염색을 사용한 표준 프로토콜에 의해 규명하였다. 연구 결과를 생존성% 대 처리 시간 (hr) 으로서 도 8 에 플롯화하였다. 생존성% 를 [100% - 세포자멸 세포%] 로 표현한다. ZAP70+ 종양 세포는 17-AAG 에 의해 빨리 죽고, 50% 의 세포 사멸은 대략 48 시간 내에 이루어졌다.

실시예 20. CLL B 세포 내에서 HSP90 의 억제의 다운스트림 효과.

16 명의 ZAP70+ 환자 및 11 명의 ZAP70- 환자로부터의 만성 림프성 백혈병 B-세포 (CLL B 세포) 를 17-AAG 100 nM 로 37℃ 에서 48 시간 동안 처리하였다. 세포자멸 세포를 미토콘드리아 생체 염료 DiOC6 및 프로피디움 요오다이드 염색을 사용한 표준 프로토콜에 의해 규명하였다. 연구 결과를 도 9 에 플롯화하였다. 생존성% 를 [100% - 세포자멸 세포%] 로 표현한다. ZAP70+ 종양 세포는 17-AAG 에 의해 빨리 죽고 평균 생존율% 가 45.74 +/- 3.177% 인데 반해, ZAP70- 세포는 동일한 조건 하에 약물에 의해 영향을 받지 않는데 - 상기 세포에서의 생존율은 93 +/- 1.701% 였다. 생존율의 차이의 Students T-Test 의 P-값은 < 0.0001 이 었고, 이는 고도로 통계적으로 유의한 수이다.

전술한 실시예는 본 발명을 제한하려는 것은 아니고, 단지 본 발명의 다양한 구현예의 대표적인 것들이다. 당업자는 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 다양한 치환 및 개질을 할 수 있다는 것을 쉽게 알게 될 것이다. 따라서, 그러한 추가의 구현예는 본 발명의 범주 및 하기 청구항 내에 속한다.

폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 다양한 시판의 공급업체로부터 구매될 수 있거나, 또는 예를 들어 [Harlow 등, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N-.Y. (1988)] 에서 기술된 바와 같이 잘-공지된 방법을 사용해 제조될 수 있다. 본원에서 기술된 시약은 예를 들어, Sigma-Aldrich 와 같은 데서 시판되거나, 또는 당업자에게 공지되고/되거나 또는 참조로써 본원에 삽입된 공개물에 기술된 일반적인 과정을 사용하여, 과도한 실험 없이 쉽게 제조가능하다.

Claims

B 세포 내 증가된 수준의 ZAP70 의 발현을 특징으로 하는 만성 림프성 백혈병 형태의 치료를 필요로 하는 환자에 약학적 유효량의 Hsp90 억제제를 투여하는 것을 포함하는, B 세포 내 증가된 수준의 ZAP70 의 발현을 특징으로 하는 만성 림프성 백혈병 형태의 치료 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 안사마이신 (ansamycin) 인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 안사마이신이 하기 군, 또는 그의 다형체, 용매화물, 에스테르, 호변이성질체, 거울상이성질체, 약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물로부터 선택되는 방법 :

.
제 2 항에 있어서, 상기 안사마이신이 17-AAG 인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 안사마이신이 DSC 용융 온도가 175℃ 미만인 것을 특징으로 하는 저 용융 형태의 17-AAG 를 포함하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 17-AAG 가 고 용융 형태, 저 용융 형태, 비정질 형태, 또는 그의 조합으로부터 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 HSP90 의 ATP-결합 위치에 결합하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 투여가 병변 내인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 투여가 비경구인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 투여가 경구인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 투여가 정맥 내인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 HSP90 억제제의 IC₅₀ 이, 상승된 ZAP70 을 갖지 않는 B 세포보다 상승된 ZAP70 을 갖는 상기 환자의 B 세포 내의 상기 HSP90 에 대해 2-배 이상 더 낮은 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 HSP90 억제제의 IC₅₀ 이, 상승된 ZAP70 을 갖지 않는 B 세포보다 상승된 ZAP70 을 갖는 상기 환자의 B 세포 내의 상기 HSP90 에 대해 5-배 이상 더 낮은 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 HSP90 억제제의 IC₅₀ 이, 상승된 ZAP70 을 갖지 않 는 B 세포보다 상승된 ZAP70 을 갖는 상기 환자의 B 세포 내의 상기 HSP90 에 대해 10-배 이상 더 낮은 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 상승된 ZAP70 을 갖는 B 세포 내 HSP90 에 대해 약 100 nM 이하의 IC₅₀ 을 나타내는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 상승된 ZAP70 을 갖는 B 세포 내 HSP90 에 대해 약 75 nM 이하의 IC₅₀ 을 나타내는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 상승된 ZAP70 을 갖는 B 세포 내 HSP90 에 대해 약 50 nM 이하의 IC₅₀ 을 나타내는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 억제제가 상승된 ZAP70 을 갖는 B 세포 내 HSP90 에 대해 약 30 nM 의 IC₅₀ 을 나타내는 방법.