CN101072504A - 治疗慢性淋巴细胞性白血病的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过施用HSP90抑制剂,特别是安莎霉素类药物,更特别是17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)治疗慢性淋巴细胞性白血病的新方法。
Description
技术领域
一般而言,本发明涉及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的治疗,特别是采用HSP90抑制剂治疗侵袭性CLL,尤其是采用安莎霉素类药物,如,17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG),治疗CLL。
背景技术
下面的描述包含可能有助于理解本发明的信息。既没有承认此处所提供的信息是现有技术或是与申请专利的本发明相关、也没有承认任何明示或暗示参考的出版物是现有技术。
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的病程变化无常。在侵袭性疾病中,CLL细胞通常表达一种未突变的免疫球蛋白重链可变区基因(IgVH)以及一种70KD的Zeta相关蛋白(ZAP70),而在进展缓慢的疾病中,CLL细胞通常表达突变的Ig VH但不表达ZAP70。CLL患者的ZAP70表达与疾病进展、不良临床结果、总存活率降低以及早期需要治疗相关。尽管未突变的Ig VH的存在与ZAP70的表达高度相关,但ZAP70是B细胞CLL需要治疗和预后的关键预报因子。Rassenti,L.Z.等人,N Eng J M ed.,2004,351,893-901。
ZAP70分子量为70kD,是细胞质中的一种蛋白质酪氨酸激酶(PTK),通常仅在自然杀伤(NK)细胞和T细胞中表达,并在T细胞受体信号通路中发挥关键性作用。Keating等人,Hematology,2003,153-175。B细胞缺乏ZAP70,取而代之的是使用另一种相关的PTK,通过B细胞受体(BCR)复合物参与信号转导。研究发现,含有未突变的Ig VH基因的CLL B细胞,通常其ZAP70蛋白的表达水平与正常人血液中T细胞的表达水平相当。与此相反,表达突变的Ig VH基因或有低水平CD38表达的CLL B细胞,通常不表达可检测水平的ZAP70蛋白。Chen等人,Blood 2002,100:13,4609-4614。B细胞的ZAP70表达并不是由遗传预先确定的。Chen,2002,同上。ZAP70表达对CLL中表达的BCR复合物的信号能力具有功能性显著意义。Keating等人,同上。ZAP70可以促进结合BCR后下游信号分子的磷酸化,并在膜抗原-信号通路中发挥作用。Keating等人,同上和Rassenti等人,同上。一项研究表明,CLL中ZAP70的表达使得CLL B细胞的IgM-信号传导更加有效,这个特点促成通常与表达未突变的Ig VH的CLL细胞相关的相对侵袭性临床表现。Chen等人,Blood,2004,prepublication online October 28,2004。
真核生物的热休克蛋白90s(HSP90s)是普遍存在的侣伴蛋白,其参与广泛的客户蛋白(client protein)的折叠、激活和装配,这些客户蛋白包括信号转导、细胞周期控制和转录调控的介质。为了发挥其对客户蛋白的作用,HSP90需要形成由辅伴侣分子和活性ATP结合位点组成的活性蛋白复合物。确定为HSP90客户蛋白的蛋白质包括:跨膜酪氨酸激酶[HER-2/neu,表皮生长因子(EGFR),MET和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-IR)]、亚稳态信号蛋白(Akt,Raf-1和IKK)、突变的信号蛋白(p53,Kit,Flt3和v-src)、嵌合信号蛋白(NPM-ALK,Bcr-Abl)、甾体受体(雄激素,雌激素以及孕酮受体)、细胞周期调节剂(cdk4,cdk6)以及细胞凋亡相关蛋白。现已假设恶性进展和癌症预后可能与活化的HSP90的存在有关,该HSP90存在于增多的含辅伴侣蛋白的复合物中。Kamal等人,Nature,2003,425:407-410。
现在认为,安莎霉素抗生素,如除莠霉素A(HA)、格尔德霉素(GDM)、17-AAG以及其他HSP90抑制剂,是通过紧密结合HSP90N-末端ATP结合口袋而发挥其抗癌作用(Stebbins,C.等人,Cell,1997,89:239-250)。该结合口袋是高度保守的,且与DNA促旋酶的ATP结合位点具有弱的同源性(Stebbins,C.等人,同上;Grenert,J.P.等人,J.Biol.Chem.1997,272:23843-50)。而且研究发现ATP和ADP都可以与该结合口袋以低亲和力结合,并且具有弱的ATP酶活性(Proromou,C.等人,Cell,1997,90:65-75;Panaretou,B.等人,EMBO J.,1998,17:482936)。体外和体内研究表明安莎霉素类和其他HSP90抑制剂占据这种N-末端结合口袋后改变了HSP90的功能并抑制了蛋白质折叠。研究发现,在高浓度条件下,安莎霉素类以及其他HSP90抑制剂可以阻止蛋白质底物与HSP90的结合(Scheibel,T.,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96:1297-302;Schulte,T.W.等人,J.Biol.Chem.1995,270:24585-8;Whitesell,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994,91:8324-8328)。研究也发现,安莎霉素可以抑制ATP依赖性侣伴蛋白相关的蛋白质底物的释放(Schneider,C.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:14536-41;Sepp-Lorenzino等人,J.Biol.Chem.1995,270:16580-16587)。无论在何种情况下,在蛋白酶体中通过泛蛋白依赖性过程降解底物(Schneider,C.L.同上;Sepp-Lorenzino,L.等人,J.Biol.Chem.,1995,270:16580-16587;Whitesell,L.等人,同上)。
这种底物的脱稳定化在肿瘤细胞和非转化的细胞中都同样地发生,而且研究表明其对一类信号调节剂,如Raf(Schulte,T.W.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.1997,239:655-9;Schulte,T.W.等人J.Biol.Chem.1995,270:24585-8)、核甾体受体(Segnitz,B.和U.Gehring,J.Biol.Chem.1997,272:18694-18701;Smith,D.F.等人,Mol.Cell.Biol.1995,75:6804-12)、v-src(Whitesell,L.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994,91:8324-8328),和某些跨膜酪氨酸激酶(Sepp-Lorenzino,L.et al.J.Biol Chem.1995,270:6580-16587),如EGF受体(EGFR),Her2/Neu(Hartmann,F.等人,Int.J.Cancer 1997,70:221-9;Miller,P.等人,Cancer Res.1994,54:2724-2730;Mimnaugh,E.G.等人J.Biol Chem.1996,277:22796-801;Schnur,R.等人,J.Med.Chem.1995,38:3806-3812)、CDK4和突变体p53(Erlichman等人,Proc.AACR,2001,42,摘要4474)尤其有效。安莎霉素诱导的这些蛋白质的丢失导致某些调控通路选择性中断,结果导致处理的细胞在细胞周期中特定阶段生长停滞(Muise-Heimericks,R.C.等人,J.Biol.Chem.,1998,273:29864-72)和细胞凋亡,和/或细胞分化(Vasilevskaya,A.等人,Cancer Res.,1999,59:3935-40)。
由于ZAP70表达与侵袭性CLL相关,因此需要控制这种过度表达的方法。最理想的是能够同时避免对正常细胞和组织的损害或将这种损害降至最低的治疗。本发明符合这些要求。
发明内容
本发明的发明人发现ZAP70是HSP90的一种客户蛋白,而且HSP90的特异性抑制剂,如17-AAG,能够下调这种酪氨酸激酶的表达和功能,并优先在ZAP-90阳性CLL B细胞中以剂量和时间依赖性的方式诱导细胞凋亡。
本发明的一方面是一种治疗以CLL B细胞表达ZAP70为特征的一种类型的CLL的方法,通过给予需要治疗的患者药学上有效量的HSP90抑制剂进行这种治疗。
在一实施方案中,所述抑制剂是一种安莎霉素;该安莎霉素选自以下化合物,或其多晶型物、溶剂合物、酯、互变异构体、对映体、药学上可接受的盐或前药:
格尔德霉素 DMAG 17-AAG
化合物#563 化合物#237
化合物#956 化合物#1236
在另一实施方案中,安莎霉素是17-AAG,可能包含低熔点型的17-AAG,其特征为DSC熔解温度低于175℃,和/或X-射线粉晶衍射图谱上的峰位于5.85°、4.3 5°和7.90°双θ角。在另一实施方案中,安莎霉素是一种低熔点多晶型的17-AAG,其特征为DSC熔解温度大约为156℃,和X-射线粉晶衍射图谱上的峰位于5.85°、4.35°和7.90°双θ角。在另一实施方案中,安莎霉素为另一种低熔点多晶型17-AAG,其特征为DSC熔解温度大约为172℃。此外,17-AAG可以是高熔点型、低熔点型、无定形型、或其组合。
在另一实施方案中,抑制剂在HSP90的ATP结合位点处结合。
在本发明的另一方面,HSP90抑制剂通过静脉内、病灶内(intralesionally)、肠胃外、或口服给药。
在本发明的另一方面,HSP90抑制剂对ZAP70升高的患者B细胞中HSP90的IC50较ZAP70没有升高的正常B细胞中的HSP90低约2-10倍。在一实施方案中,HSP90抑制剂对ZAP70升高的患者B细胞中HSP90的IC50较ZAP70没有升高的正常B细胞中HSP90低约2倍、5倍或10倍。
在本发明的另一方面,该抑制剂对ZAP70升高细胞的IC50大约为100nM或更低。在一实施方案中,该抑制剂对ZAP70升高的细胞的IC50大约为75nM或更低。在一实施方案中,该抑制剂对ZAP70升高的细胞的IC50大约为50nM或更低。在另一实施方案中,该抑制剂对ZAP70升高的细胞的IC50大约为30nM。
在可行或适当条件下,可以将上述方面和实施方案进行组合。本发明也包括对本领域技术人员而言显而易见的上述方面和实施方案的其他方面和变化。
本发明的优点包括以下一项或多项优点:生产简单、临床上可接受制剂的使用(如降低环境和/或患者毒性)、增强的剂型稳定性、降低运输和仓储难度、以及简化的药房和床旁处理。通过上面的论述和下面的详细描述和权利要求,其他优点、方面、以及实施方案将是显而易见的。
附图说明
图1显示17-AAG对抗生物素标记的格尔德霉素探针竞争性结合B细胞、T细胞、ZAP70阳性CLL B细胞(ZAP70CLL B细胞)和ZAP70阴性CLL B细胞(ZAP70-CLL B细胞)裂解产物中HSP90的结果。Western印迹法带型显示,随着17-AAG浓度升高,对HSP90与生物素-GM结合的抑制作用降低(1a)。将结果定量,并以生物素-GM与HSP90结合的抑制率(%)对17-AAG浓度(nM)做散点图(1b)。所报告的IC50是导致半数最大结合抑制所需的17-AAG浓度(1c)。
图2显示随着17-AAG浓度升高,生物素化的格尔德霉素探针(生物素-GM)与ZAP70+CLL B细胞(▲)和ZAP70-CLL B细胞(■)裂解产物中HSP90结合的抑制。
图3显示生物素化的格尔德霉素(生物素-GM)与正常B细胞(◆)和T细胞(■)中HSP90结合的抑制。
图4为采用指定的抗体通过共免疫沉淀法以及SDS-PAGE和Western印迹分析,证明HSP90和MCF-7乳腺癌细胞、ZAP70+CLL B细胞和ZAP70-CLL B细胞以及正常T和B细胞中ZAP70的结合。″IP″表示免疫沉淀,而″WB″表示Western印迹法。P23和HOP是两种已知的多侣伴蛋白HSP90复合物的基本成分。
图5比较在37℃下用EC1(17-AAG)(■)、EC82(▲)、EC86(X)(EC82和EC86是嘌呤基HSP90抑制剂)或EC116(一种无活性的结构相关的HSP90抑制剂)(◆)处理24小时后,ZAP70+CCL B细胞中ZAP70的降解情况。
图6通过双色流式细胞术比较用300nM EC1(17-AAG)37℃处理24小时的CLL B细胞(右图)与未处理的CLL B细胞(左图)中ZAP70的表达。右上四分之一区域为正常T细胞(CD3+,ZAP70+);右下四分之一区域为CD3-,ZAP70+;左上四分之一区域为CD3+,ZAP70-;左下四分之一区域为CD3-,ZAP70-。
图7比较用EC1(17-AAG)(◆)或EC116(无活性的结构相关的HSP90抑制剂)(■)处理后,ZAP70+CCL B细胞的存活率(%)(表示为100%-%凋亡细胞)。
图8比较用100nM EC1(17-AAG)(■)或EC116(无活性的结构相关的HSP90抑制剂)(◆)处理后,ZAP70+CCL B细胞的存活率(%)(表示为100%-%凋亡细胞)。达到50%细胞死亡所需的时间是17-AAG处理后大约48小时。
图9比较用100nM EC1(17-AAG)治疗48小时后,来源于16例ZAP70+患者和11例ZAP70-患者的CCL B细胞的存活率(表示为100%-%凋亡细胞)。ZAP70+CLL B细胞的平均%存活率为45.74+/-3.177%,而ZAP70-CLL B细胞的平均%存活率为93+/-1.701%。两个人群之间存活率差异的Students t检验的P值为<0.0001。
发明详述
本发明涉及采用HSP90抑制剂治疗特征在于ZAP70过度表达的侵袭性慢性淋巴细胞性白血病的方法,ZAP70是一种蛋白激酶,正常情况下仅存在于T细胞中。该方法是基于对ZAP70与HSP90发生共免疫沉淀的观察,提示其为HSP90客户蛋白。发明人还观察到ZAP70阳性CLL患者样品中,存在于细胞质中的绝大多数的HSP90为复合的形式,而ZAP70阴性CLL样品中所发现的大部分HSP90没有复合。发明人推测CLL B细胞中异常的过度表达和功能可能依赖于激活的HSP90,而且可以采用HSP90特异性抑制剂下调其表达水平,从而诱导产生ZAP70阳性CLL B细胞凋亡。试验结果发现,用纳摩尔浓度的HSP90抑制剂处理24小时的细胞其ZAP70表达水平下降30-40%。
I.定义
下述术语释义如下,未特别指出的术语其释义同本领域中的常见含义:
术语″ZAP70阳性″和″ZAP70阴性″是基于通过流式细胞术(FACSCalibur,BD Biosciences and Flow Jo software)测量的20%的截断值表达。
″HSP90-抑制性化合物″或″HSP90-抑制剂″指的是破坏HSP90侣伴蛋白和/或HSP90依赖性蛋白的结构和/或功能的物质。本质上,HSP90蛋白高度保守(参见,如,NCBI登录号P07900和XM 004515(分别为人α和βHSP90),P11499(小鼠),AAB2369(大鼠),P46633(中国仓鼠),JC1468(鸡),AAF69019(麻蝇),AAC21566(斑马鱼),AAD30275(鲑鱼),002075(猪),NP015084(酵母),以及CAC29071(蛙))。Grp94和Trap-1是符合此处HSP90定义的相关分子。因此有许多不同的HSP90,预期都具有类似的作用和抑制能力。本发明的HSP90抑制剂可以特别针对特定宿主患者的HSP90,或可以基于针对不同种属来源的HSP90同系物或HSP90变体的反应性而鉴定。
″安莎霉素″是一个宽泛的术语,指的是具有″袢(ansa)″结构的化合物,该结构包括通过长链桥接的苯醌、苯氢醌、萘醌或萘氢醌部分任一。临床上重要的药物利福平和利福霉素分别是萘醌或萘氢醌类化合物的例子。苯醌类化合物的例子包括格尔德霉素(包括其合成衍生物17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、17-N,N-二甲基氨基乙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(DMAG)、二氢格尔德霉素和除莠霉素(herbamycin))。苯氢醌类化合物的例子有macbecin。尽管本发明应用安莎霉素类药物,尤其是17-AAG进行阐述,但是应当理解,本发明所述治疗CLL的新方法也可以应用高熔点和低熔点型化合物,及其多晶型物、互变异构体、对映体、药学上可接受的盐类和前药。还应理解,该方法可以应用其他多种安莎霉素类药物,包括但并不仅限于实施例部分的实施例1-13所列举的那些,如格尔德霉素、17-N,N-二甲基氨基乙基氨基格尔德霉素,及其多晶型物、互变异构体、对映体、药学上可用的盐类及其前药。在发明内容部分,公开了编号的化合物的结构。
术语″药理学活性化合物″、″活性药物成分″或″治疗成分″与″药物″含义相同,指的是在应用于培养的细胞或生物体时,能够在体内或体外直接或间接发挥某一生物学效应的所有化合物。
“前药”是在对哺乳动物给药时与载体共价结合并在其中发生体内药物释放的药物。本发明化合物的前药的制备方法是通过修饰化合物的官能团,使其通过常规操作或在体内切除此种修饰,从而获得目标化合物。前药包括将羟基、氨基、或巯基基团结合到任一基团的化合物,当对哺乳动物给药后,该基团被切除分别形成自由的羟基、氨基、或巯基基团。前药的实例包括但并不仅限于:本发明化合物中的醇或胺官能团的醋酸酯、甲酸酯、或苯甲酸酯衍生物;本发明化合物中的醇或苯酚官能团的磷酸酯、二甲基甘氨酸酯、氨基烷基苄基酯、氨基烷基酯或羧基烷基酯;等等。前药可使给药具有多种优势,如REMINGTON PHARMACEUTICAL SCIENCES,20th Edition,Ch.47,pp.913-914所述。
“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的无机和有机的酸和碱的衍生物。适宜的酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、1,2-乙烷二磺酸(乙二磺酸盐)、半乳糖基-d-葡萄糖酸等。其他的酸,如草酸,尽管其本身并不是药学上可接受的,但是有可能用于制备对获得本发明化合物的中间体有用的盐,及其药学上可以接受的酸加成盐。来源于适宜碱的盐包括碱金属(如,钠)、碱土金属(如,镁)、铵和N-(C1-C4烷基)4盐等。这些碱中的某些实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、胆碱氢氧化物、碳酸钠等。当权利要求中提到″化合物(如,化合物′x′)或药学上可接受的盐″,并且只给出该化合物时,这些权利要求应稀释为可替代地或结合地包括该化合物的药学上可以接受的盐或盐类。
″药物有效量″指能够提供治疗或预防效果的药物量。为获得治疗和/或预防效果而依照本发明施用的化合物的具体剂量当然依据具体病例的特定环境而定,包括,如所给予的特定化合物、给药途径、所治疗的疾病、以及接受治疗的患者个体。典型的每日给药剂量(单次或分次给药)涵盖从约0.01mg/kg至约100mg/kg的剂量水平,更优选50mg/kg体重的本发明的活性化合物。优选的每日给药剂量一般为从约0.05mg/kg至约20mg/kg,理想的给药剂量为从约0.1mg/kg至约10mg/kg。
优选的治疗效果是所治疗疾病特有的细胞生长出现某些程度的抑制。治疗效果也通常(但不是必须的)是在某种程度上减轻疾病相关的一个或多个症状。
术语″IC50″定义为达到杀死某一细胞群或特定细胞类型(如更大细胞群中的癌细胞和非癌细胞)中50%细胞所需的HSP90抑制剂的浓度。尽管不是必然现象,但是优选对正常细胞的IC50较表现出增殖紊乱的细胞更高。
″生理学上可接受的载体″指的是不会对生物体造成显著性的刺激,而且不会消除所施用化合物的生物活性和特征的载体或稀释剂。根据剂型不同,稀释剂可能是固体,如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;或是液体,如水或油。
″赋形剂″指的是向药物组合物中添加的药学上可接受的无毒物质,目的是促进化合物的加工、给药以及药学特性。赋形剂可能包括,但并不仅限于:充填剂、稀释剂、助流剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、增溶剂、稳定剂/膨胀剂、以及各种功能性和非功能性包衣。
术语″大约″指包括和超出指定的特定端点值最高至15%。因此,其范围被加宽。
术语″任选地″表示这一术语后的步骤或组分可以是但不是必须是方法或制剂的一部分。
II.安莎霉素的制备
本发明的安莎霉素可能是合成的、天然形成的、或两种形式的组合,亦即“半合成的”,其可能包括二聚体以及变体和前药形式的结合物。在本发明各种实施方案中采用的一些示例性的苯醌安莎霉素及其制备方法包括但并不仅限于如下文献所述:例如美国3,595,955号专利(描述格尔德霉素的制备)、4,261,989号专利、5,387,584号专利、和5,932,566号专利,以及在下面的“实施例”章节(实施例1-12)中所述。格尔德霉素也可经商业途径购得,例如,购自CN Biosciences,这是Merck KGaA(Darmstadt,Germany)的一家关联公司,其总部在USA加利福尼亚州圣地亚哥市(目录号345805)。EMD/Calbiochem公司可以供应17-N,N-二甲基氨基乙氨基-17-脱甲氧基-格尔德霉素(DMAG)。在WO93/14215(Cullen等人)中,描述了从吸水链霉菌(ATCC 55256)培养物中生物化学纯化格尔德霉素衍生物,4,5-二氢格尔德霉素及其氢醌:通过格尔德霉素的催化氢化合成4,5-二氢格尔德霉素的一种备选方法也是已知的。参见,如″Progress in theChemistry of Organic Natural Products,″Chemistry of the AnsamycinAntibiotics,1976 33:278。本发明各种实施方案中可能使用的其他安莎霉素,在前文“背景技术”和“发明内容”章节的引用文献中有所描述。
在氮气环境下,在干燥的THF中,可通过格尔德霉素与烯丙胺反应制备1 7-AAG。粗制品的纯化可能是通过用H2O∶EtOH(90∶10)制备混悬液,根据毛细管熔点技术,获得的洗涤后的晶体的熔点为206-212℃。通过将粗制品于2-丙醇(异丙醇)中溶解和重结晶,获得第二种17-AAG产物。通过毛细管熔点技术测得该第二种17-AAG产品的熔点为147-153℃。分别将这两种17-AAG产物称为低熔点型和高熔点型。通过将低熔点型产物晶体与纯化高熔点型产物所用溶剂(H2O∶EtOH(90∶10))制备混悬液来检测低熔点型的稳定性,结果未观察到其向高熔点型的转化。这两种多晶型17-AAG的详细制备方法参见实施例1-2。
III.HSP90的抑制下调ZAP70的效果的表征和评价
A.细胞裂解产物中ZAP70水平的测定
本领域中已知有许多不同类型的方法用于测定蛋白质浓度,和测量或预测细胞和液体样品中蛋白质的水平。间接方法包括核酸杂交和扩增法,如采用聚合酶链式反应(PCR)。这些技术是本领域技术人员所公知的,并在如Sambrook,Fritsch&Maniatis,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAI,Second Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,Ausubel,等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY John Wiley&Sons,NY,1994中对这些技术进行了论述。ZAP70的浓度可以通过免疫测定技术,如免疫印迹、放射性免疫测定、免疫荧光、蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、以及使用抗ZAP70抗体的衍生技术、和流式细胞术来测定。一种方便的ZAP70表达的定量测定方法是FACS(荧光激活细胞分选仪)(FACSCalibur,BDBiosciences and Flow-Jo software,version 2.7.4(Tree Star)),这是一种流式细胞术的版本,在Rassenti等人(同上)最近发表的研究中对其进行了阐述,其公开内容通过参考全部在此引入。在Rassenti的研究中,采用分别结合别藻蓝蛋白和藻红蛋白的CD19-特异性和CD3-特异性单克隆抗体(Pharmingen)对血细胞进行染色,也可能采用结合Alexa-488染料(Becton Dickenson)的抗ZAP70单克隆抗体进行染色。也可以采用其他的染料体系。根据淋巴细胞的前向角光散射和侧向角光散射对其进行设门(gate),并利用健康献血者的血单个核细胞建立初始门。通过计算CD19+CD3-细胞超出该门阈值的百分数来测定ZAP70的表达。根据表达截断值判断ZAP70阳性和ZAP70阴性,如通过流式细胞术检测发现超过20%的白血病细胞表达ZAP70。
B.HSP90配体与HSP90的亲和力的测定
一系列同位素和非同位素方法,如比色法、酶法、以及光密度法,具有足够的是敏度用于评价抑制剂与靶蛋白的结合亲和力。这些方法是本领域公知的,且能用于本发明上下文中。
也可以通过Kamal等人,Nature 2003,425:407-410描述的竞争性结合测定法来测定HSP90配体与HSP90的结合亲和力,其公开内容通过参考全部在此引入。通过其抑制格尔德霉素(一种已知的HSP90抑制剂)结合的能力来测定配体的亲和力。在裂解缓冲液中,含有HSP90的细胞首先被裂解。在有或无17-AAG存在的条件下,对裂解产物进行孵育,继而与连接到BioMagTM链霉抗生物素蛋白磁珠(Qiagen)上的生物素-GM共同孵育。已结合样品和未结合的上清液可以通过SDS蛋白凝胶来分离采集,分析,并采用HSP90抗体(StressGen,SPA-830)形成印迹。Western印迹的条带可以通过Bio-rad Fluor-S MultiImager进行定量,同时计算对HSP90与生物素-GM结合的抑制率(%)。IC50指的是导致半数最大结合抑制所需的HSP90配体浓度。
图1至3显示17-AAG对抗生物素化的格尔德霉素探针(生物素-GM)竞争性结合B细胞、T细胞、ZAP70阳性CLL B细胞和ZAP70阴性CLL B细胞裂解产物中HSP90的试验结果。Western印迹法带型显示,随着17-AAG浓度升高,对HSP90与生物素-GM结合的抑制作用降低(1a)。将结果定量,并以对生物素-GM与HSP90结合的抑制率(%)对17-AAG浓度(nM)做散点图(1b)。该图显示对从ZAP70+CLL B细胞分离的HSP90结合的抑制作用更高。IC50的计算结果显示17-AAG对分离自ZAP70+CLL B细胞的HSP90的结合亲和力较其对分离自ZAP70-CLL B细胞和正常B细胞的亲和力高约10倍。
C.通过共免疫沉淀法测定蛋白质的结合
各种蛋白质的相互结合可以通过采用目标蛋白质的特异性抗体的共免疫沉淀试验进行测定。这些方法是本领域公知的。参见,Goldsby R.A.等人,KIRBY IMMUNOLOGY,4th Edition,W.H.Freemanand Company,2000。
为了确定ZAP70是否是HSP90的客户蛋白以及ZAP70+CLL B细胞中HSP90是否以多侣伴蛋白复合物的形式存在,进行了一组四个共免疫沉淀试验。将MCF-7乳腺癌细胞、ZAP70+和ZAP70-慢性淋巴细胞性白血病(CLL B)细胞的初步分离物(primary isolates)以及正常的T和B细胞裂解,并将裂解产物与采用目标蛋白质特异性抗体预封闭的蛋白A琼脂糖凝胶珠(Zymed)共同孵育。已结合和未结合的部分可以应用指定的抗体,通过SDS-PAGE和Western印迹法进行分离采集和分析。
图4显示共免疫沉淀试验的免疫印迹。示出了每一步试验所用抗体。IP Ab意指在免疫沉淀中所用的抗体。WB Ab意指在Western印迹中所用的抗体。P23和HOP是两种已知的多伴侣蛋白HSP90复合物的基本组分。第一条凝胶结果证实ZAP70+CLL B细胞和正常T细胞表达ZAP70,而ZAP70-CLL B细胞和正常B细胞未见ZAP70表达。第二条凝胶结果显示ZAP70与ZAP70+CLL B细胞中的HSP90物理相关,而不与其他任何细胞型,包括正常T细胞中的HSP90相关。第三条凝胶通过反向共免疫沉淀法证实了上述结果。第四条凝胶结果显示MCF-7细胞(阳性对照,参见Kamal等人,Nature,2003,425:407-410)和ZAP70+CLL B细胞中的HSP90处于激活状态(含有HOP和p23的多侣伴蛋白复合物),而ZAP70-CLL B细胞或正常的T或B细胞中的HSP90处于潜伏的静息状态(未与HOP或p23结合)。
IV.ZAP70抑制作用的效果的表征和评价
通过ZAP70表达量或通过测定用选择的HSP90抑制剂处理后细胞的存活率来直接检测抑制HSP90对ZAP70的下游作用。
来源于每个ZAP70+患者的B细胞型慢性淋巴细胞性白血病细胞的初步分离物,在37℃条件下,用EC1(17-AAG)、EC82或EC86(两种已知的嘌呤基HSP90抑制剂)或EC116(一种无活性的结构相关的HSP90抑制剂)处理24小时。通过采用抗ZAP70特异性抗体对透化处理的细胞进行间接免疫荧光以及FACS分析,测定ZAP70蛋白的表达水平。
图5显示所有三种活性HSP90抑制剂均剂量依赖性地诱导ZAP70降解,证实了ZAP70是一种HSP90依赖性客户蛋白,正如在共免疫沉淀试验中所证明的物理相关性所显示的(图4)。另外,三种结构不相关的HSP90抑制剂产生同样效果的事实,强烈提示HSP90是CLL B细胞中ZAP70稳定性的必需蛋白质。
将来源于每个ZAP70+B细胞慢性淋巴细胞性白血病患者的白细胞的初步分离物不予处理(左图),或用300nM EC1(17-AAG)于37℃处理24小时(右图)。通过应用结合藻红蛋白的特异性抗CD3抗体和结合Alexa-488染料的抗ZAP70抗体的双色间接免疫荧光法测定ZAP70蛋白表达水平,并通过流式细胞术进行分析。CD3是T细胞的特异性标志。图6比较了未处理的CLL B细胞(左图)与处理的(300nM 17-AAG)细胞(右图)的ZAP70的表达水平。如图所示,未处理的细胞(左图),大约有5%的细胞为正常T细胞(CD3+,ZAP70+,右上四分之一区域),大约85%的细胞为ZAP70+CLL B细胞(CD3-,ZAP70+,右下四分之一区域)。EC1(17-AAG)诱导B-CLL细胞中ZAP70发生降解(%阳性细胞,85%→34%),而不诱导正常T细胞中的降低(%阳性细胞,4.5%→4.2%),正如基于共免疫沉淀试验中所证明的B-CLL细胞中而非正常T细胞中的物理相关性所预测的(图4)。HSP90抑制剂诱导B-CLL细胞而非正常T细胞中的ZAP70降解的结果表明,此类药物较ZAP70激酶抑制剂具有更特异性的抗白血病活性。这一点具有重要意义,原因是B-CLL患者由于疾病所致出现慢性免疫抑制,因此避免对由ZAP70发挥的正常T细胞功能产生影响显然是有益的。
在37℃条件下,来源于每个ZAP70+患者的CLL B细胞的初步分离物用EC1(17-AAG)或EC116(无活性的结构相关的HSP90抑制剂)处理48小时。通过采用线粒体活体染料DiOC6和碘化丙啶染色的标准方案鉴定凋亡细胞。细胞存活率(%)表示为100%-%凋亡细胞。图7为ZAP70+慢性淋巴细胞性白血病B细胞在EC1(17-AAG)(◆)或EC116(无活性结构相关的HSP90抑制剂)(■)处理后的存活率的比较。显而易见,ZAP70+CLL B细胞易于被17-AAG杀死,其50%抑制浓度(IC50)大约是80nM。
进行了一项类似试验,用于测量ZAP70+CLL B细胞的死亡率。在37℃条件下,来源于每个ZAP70+患者的CLL B细胞的初步分离物用100nM EC1(17-AAG)或EC116(无活性的结构相关的HSP90抑制剂)处理不同时间。通过采用线粒体活体染料DiOC6和碘化丙啶染色的标准方案鉴定凋亡细胞。细胞存活率(%)表示为100%-%凋亡细胞。图8为ZAP70+慢性淋巴细胞性白血病B细胞在100nMEC1(17-AAG)(■)或EC116(无活性结构相关的HSP90抑制剂)(◆)处理后的%存活率的比较。结果提示ZAP70+肿瘤细胞被17-AAG快速杀死,其导致50%细胞死亡的时间大约是48小时。
在37℃条件下,来源于16例ZAP70+患者和11例ZAP70-患者的CCL B细胞的初步分离物用100nM EC1(17-AAG)处理48小时。通过采用线粒体活体染料DiOC6和碘化丙啶染色的标准方案鉴定凋亡细胞。细胞存活率(%)表示为100%-%凋亡细胞。图9为来源于16例ZAP70+患者和11例ZAP70-患者的CLL B细胞在100nM EC1(17-AAG)处理48小时后的存活率的比较。ZAP70+CLL B细胞的平均%存活率为45.74+/-3.177%,而ZAP70-CLL B细胞的平均%存活率为93+/-1.701%。两个人群之间存活率差异的Students t检验的P值为<0.0001,即具有高度统计学显著性意义。
V.药物组合物的配制和给药
依照U.S.3,595,955号专利,采用吸水链霉菌(保存在美国农业部,Northern Utilization and Research Division,Agricultural Research,Peoria,111.,USA,登录号为NRRL 3602)传代培养制备格尔德霉素。正如在U.S.4,261,989号专利、5,387,584号专利和5,932,566号专利中所详细说明的,依照标准技术,可以合成这一化合物的众多衍生物。
本领域一般技术人员熟悉可以在本发明中使用的配制和给药技术,例如,正如在Goodman和Gilman,THE PHARMACOLOGICALBASIS OF THERAPEUTICS,最新版,Pergamon Press和REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(最新版)MackPublishing Co.,Easton,Pa.中所论述的那样。
依照标准的药物制剂实践,本发明的方法中所用化合物可以单独给药,或在药物组合物中与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂联合使用。化合物可以经口服或肠胃外给药,包括静脉、肌肉、腹膜内、皮下、直肠内以及局部给药途径。
例如,本发明的治疗或药物组合物可以向需要治疗的区域局部给药。例如,这可以通过如下方法但并不仅限于这些方法实现,在外科手术中局部输注、局部应用如乳膏、软膏、注射液、导管、或植入物、所述植入物例如由多孔、非孔或凝胶状材料制成,包括膜,如硅橡胶膜或纤维。给药方式也可以是在肿瘤或赘生物或前赘生物组织部位(或其形成部位)直接注射。
此外,还可以通过药囊(如脂质体)给予治疗或药物组合物(参见,如,Langer,Science,1990,249:1527-1533;Treat等人,Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer,1989,LopezBernstein和Fidler(eds.),Liss,N.Y.,pp.353-365)。
本发明方法所用药物组合物可以应用控释系统给药。在一实施方案中,使用了泵(参见,Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.1987,14:201;Buchwald,等人,Surgery,1980,55:507;Saudek等人,N Engl.J.Med,1989,321:574)。此外,也可以将控释系统安置在治疗靶点附近。(参见,Goodson,Medical Applications of Controlled Release,1984,Vol.2,pp.115-138)。
本发明方法中所用药物组合物可能含有适合于口服的形式的活性成份,如片剂、含片、锭剂、水或油混悬液、可分散的粉剂或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。可以依照本领域公知的任意药物组合物制备方法制备预期用于口服的组合物,此类组合物可以含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的物质,目的是提供制剂学上雅致和可口的制剂。片剂含有活性成份与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物,所用赋形剂适于片剂的生产。例如,这些赋形剂可以是惰性的稀释剂,诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;粒化和崩解剂,诸如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、或褐藻酸;粘合剂,如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯胶;以及润滑剂,如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是无包衣的,或者采用已知的技术包覆,以掩盖药物味道或延迟其在胃肠道的崩解和吸收,从而提供长期的持续作用。例如,可以应用水溶性味道掩盖剂如羟丙基甲基纤维素或羟丙纤维素,或时间延迟物质如乙基纤维素或醋酸丁酸纤维素。
口服制剂也可以是硬明胶胶囊,其活性成份与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合,或可以是软明胶胶囊,其活性成份与水溶性载体如聚乙二醇或油性介质如花生油、液体石蜡、或橄榄油混合。
水性混悬液含有活性物质与适于生产水性混悬液的赋形剂的混合物。此类赋形剂包括悬浮剂,如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶;分散或湿润剂可以是自然产生的磷脂,如卵磷脂,或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物,如聚氧乙烯硬脂酸酯,或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物,如十七烯基-氧基十六醇(heptadecaethylene-oxycetanol),或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯类的缩合产物,如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯,或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯类的缩合产物,如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬液也可以含有一种或多种防腐剂,如乙基或正丙基对-羟基苯甲酸酯,一种或多种着色剂,一种或多种调味剂,以及一种或多种甜味剂,如蔗糖、糖精或天冬酰苯丙氨酸甲酯。
油性混悬液可以通过将活性成份混悬于植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油,或矿物油如液体石蜡中制得。油性混悬液可以含有增稠剂,如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以添加如上所述的甜味剂以及调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如丁基羟基茴香醚或α-生育酚进行防腐。
适合通过添加水制备水性混悬液的可分散性粉剂和颗粒提供活性成份与分散剂或湿润剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂的混合物。适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂的例证如上所述。此外,也可以存在如甜味剂、调味剂以及着色剂等辅料。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸进行防腐。
本发明方法中使用的药物组合物也可以以水包油乳剂的形式存在。油相可以是植物油,如橄榄油或花生油,也可以是矿物油,如液体石蜡,或这些油的混合物。适当的乳化剂可以是天然形成的磷脂,如大豆卵磷脂,以及脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯类或部分酯类,如去水山梨糖醇单油酸酯,以及所述部分酯类与环氧乙烷的缩合产物,如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。该乳剂也可以含有甜味剂、调味剂、防腐剂以及抗氧化剂。
糖浆剂和酏剂可以由甜味剂配制,如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。此类制剂也可以含有湿润剂、防腐剂、调味剂以及着色剂和抗氧化剂。
药物组合物可以是无菌注射水溶液的形式。其中可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。
无菌注射剂也可以是无菌的可注射的水包油微乳剂,其中活性成份溶解在油相中。例如,活性成份可以首先溶解于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液导入水和甘油的混合物中,经处理形成微乳剂。
注射液或注射用微乳剂,可以通过局部快速浓注的方式导入患者血流中。此外,采用此种方式给予溶液或微乳剂维持本发明化合物恒定的循环浓度可能具有优势。为了维持恒定的药物浓度,可以使用持续的静脉给药装置。这种装置的一个例子是Deltec CADD-PLUSTM5400型静脉泵。
药物组合物可以是无菌的可注射的水性或油性混悬液,用于肌肉和皮下给药。这类混悬液可以按照已知的方法,采用上述适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂制造而成。无菌的注射剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或混悬液,例如1,3-丁二醇溶液。此外,无菌的不挥发性油是传统使用的溶剂或混悬介质。为此目的,任何温和的不挥发性油都可以应用,包括合成的甘油一酯和甘油二酯。此外,脂肪酸如油酸也可用于注射剂中。
本发明方法中所使用的HSP90抑制剂也可以以栓剂的剂型用于药物直肠给药。这些组合物可以通过将抑制剂与适当的无刺激性辅料混合的方法制造,这些辅料常温下为固体,在直肠温度条件下变成液体,因此溶解在直肠中从而释放药物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇的混合物以及聚乙二醇的脂肪酸酯。
在局部用药时,可以使用含有HSP90抑制剂的乳膏、软膏、凝胶剂、溶液或混悬液等。此处,局部应用可以包括口腔洗剂和漱口剂。
本发明方法中所使用的化合物可以通过适当的鼻内载体和给药装置局部应用以鼻内剂型给药,或采用本领域众所周知的透皮贴剂形式,经透皮途径给药。采用透皮递药系统给药,其给药剂量在整个给药方案中当然是持续的而不是间断的。
本发明的方法和化合物也可以与其他众所周知的治疗药物联合使用,这些治疗药物的选择依据是其对所治疗疾病的特定效用。例如,本化合物与已知的抗癌和细胞毒性药物联合使用是有效的。
而且,本发明的方法和化合物与连接细胞表面生长因子受体和启动细胞增殖的核信号的信号通路部分的其他抑制剂联合使用也可能有效。
本发明的方法与其他抑制血管发生,藉此抑制肿瘤细胞的生长和侵占性的药物联合使用也可能有效,这类药物包括但并不仅限于VEGF受体抑制剂,包括核糖酶和以VEGF受体为靶标的反义药物,血管抑制素和内皮抑制素。
一般而言,可与本发明方法联合使用的抗肿瘤药的例子包括:烷化剂、抗代谢物、表叶毒素、抗肿瘤酶、拓扑异构酶抑制剂、甲基苄肼、米托蒽醌、铂配合物、生物学反应修饰剂以及生长抑制剂、激素/抗激素治疗药物以及造血生长因子。
抗肿瘤药的分类包括,例如:蒽环类抗生素家族药物、长春花属药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒性核苷、埃坡霉素类(epothilones)、discodermolide、蝶啶家族药物、diynenes和鬼臼毒素。这些分类中尤其有用的成员包括,如洋红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、氨甲喋呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物如鬼臼乙叉甙、依托泊苷磷酸酯或鬼臼噻吩甙、美法仓、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春花碱酰胺、长春罗新、紫杉醇等。其他有用的抗肿瘤药包括雌氮芥、卡铂、环磷酰胺、博来霉素、gemcitibine、异磷酰胺、美法仓、六甲蜜胺、硫替派、阿糖胞苷、idatrexate、曲美沙特、氮烯唑胺、L-门冬酰胺酶、喜树碱、CPT-11、托泊替康、ara-C、比卡鲁胺、氟他米特、醋酸亮丙瑞林、吡啶苯并吲哚衍生物、干扰素和白介素。
当本发明方法中所使用的HSP90抑制剂施用于人类患者时,通常由处方医生确定每日给药剂量,该给药剂量通常因患者的年龄、体重、个体反应以及患者症状的严重程度不同而有所不同。
在一项示例性使用中,对经受癌症治疗如乳腺癌治疗的哺乳动物施用适量的HSP90抑制剂。每一类型抑制剂的给药剂量介于每天大约0.1mg/kg体重至大约60mg/kg体重之间,优选每天0.5mg/kg体重至大约40mg/kg体重。包括本发明组合物的特定治疗剂量包括大约0.01mg至大约1000mg HSP90抑制剂。优选地,剂量包括大约1mg至大约1000mg HSP90抑制剂。
优选地,该药物制剂为单位剂量形式。在此剂量形式下,将制剂细分为含有适量活性成分的单位剂量,如达到预期目的的有效量。
依据其特殊用途,单位剂量制剂的活性化合物的量可能不同,或调节为约0.1mg至1000mg之间,优选约1mg到300mg,更优选10mg到200mg。
根据患者的要求和所治疗疾病的严重程度不同,其使用的实际剂量可能不同。确定特殊情况下的适当给药剂量是本领域公知的。通常,以较低剂量起始治疗,该治疗剂量低于化合物的最佳剂量。此后,给药剂量小量递增直至获得此条件下的最佳作用。为方便起见,如果需要,可将每日总的剂量分开,在一天内分开施用。
依据主治医师(临床医师)对患者年龄、身体状况、大小以及所治疗疾病的严重程度等因素的判断,调整本发明方法所使用的HSP90抑制剂的给药剂量和频率,如有必要调节其他化疗药物和/或放射治疗。
依照本领域众所周知的治疗方案,可以给予患者化学治疗药物和/或放射治疗。对于本领域技术人员而言显而易见的是,将依所治疗的疾病以及化学治疗药物和/或放射治疗对该疾病的已知疗效而给予患者不同的化学治疗药物和/或放射治疗。而且,与专业临床医师的认识一致,治疗方案(例如给药剂量和给药次数)将视观察到的给予的治疗药物(即抗肿瘤药或放疗)对患者的疗效以及观察到的疾病对治疗药物的反应而有所不同。
一般而言,HSP90抑制剂和化学治疗药物没有必要在同一种药物组合物中给药,而可能由于其不同的物理和化学性质而不得不通常不同的途径给药。例如,HSP90抑制剂可能通过口服给药以产生和保持其良好的血液水平,而化学治疗药物可能是通过静脉给药。专业临床医师熟知,就给药模式和给药合理性而言,如有可能,选择在同一药物组合物中。可以依照本领域已建立的给药方案进行初次给药,继而,根据所观察到的疗效,可以由专业临床医师调整给药剂量、给药模式和给药次数。
将依靠主治医师的诊断及其对患者身体状况和适宜治疗方案的判断确定对HSP90抑制剂和/或化学治疗药物和/或放疗的特定选择。
可以同时(如,同时、基本同时或在同一治疗方案内)或连续施用HSP90抑制剂、以及化学治疗药物和/或放射治疗,这取决于增生性疾病的本质、患者的状况、以及化学治疗药物和/或放射治疗合并(亦即在单一治疗方案内)HSP90抑制剂的实际选择。
如果不是同时或基本同时施用HSP90抑制剂以及化学治疗药物和/或放射治疗,则HSP90抑制剂以及化学治疗药物和/或放射治疗的起始治疗顺序并不重要。因此,可以首先给予HSP90抑制剂,继而给予化学治疗药物和/或放射治疗;或首先给予化学治疗药物和/或放射治疗继而给予HSP90抑制剂治疗。在单一治疗方案中,可以重复这种交替治疗。专业临床医师在评估所治疗的疾病以及患者身体状况后很容易确定治疗方案中的给药顺序,以及每种治疗药物的重复给药次数。例如,可以首先开展化学治疗药物和/或放射治疗,尤其是在其为细胞毒性药物时,继而给予HSP90抑制剂继续治疗,在确定有益的情况下,随后再给予化学治疗药物和/或放射治疗,如此直至完成治疗方案。
因此,依照经验和知识,执业医生可以根据每一名患者的需要,随着治疗的进展改变每一方案中的治疗成分(治疗药物,亦即,HSP90抑制剂、化学治疗药物或放射治疗)的给药。
主治医师在判断某一给药剂量下治疗是否有效时,将考虑患者的一般健康状况以及更明确的症状如疾病相关症状的缓解、肿瘤生长抑制、肿瘤实际收缩、或转移的抑制。可以通过标准方法(如放射性研究,如CAT或MRI扫描)测量肿瘤大小,而连续的测量可用于判断是否已经延缓了肿瘤生长乃至发生逆转。疾病相关症状如疼痛等的缓解以及整体状态的改善也可能有助于判断治疗的有效性。
VI.制剂使用方法
A.剂量范围
在每天输注1小时,每3周给药5天时,基于成人晚期实体瘤患者的17-AAG的I期药理学研究确定的最大耐受剂量(MTD)为40mg/m2。(Wilson等人,Am.Soc.Clin.Oncol,摘要,″Phase IPharmacologic Study of 17-(Allylamino)-17-Demethoxygeldanamycin(AAG)in Adult Patients with Advanced Solid Tumors″2001.)。在此项研究中,终末半衰期、清除率、以及稳态容积的均值±SD分别为2.5±0.5小时,41.0±13.5 L/小时,和86.6±34.6L/m2。给药剂量为40和56mg/m2时,其血浆Cmax值分别是1860+660nM和3170±1310nM。基于这些数值,可以预测,本发明制剂的有用的患者给药剂量范围包括约0.40mg/m2至4,000mg/m2的活性成份,其中m2表示的是表面积。已有标准算法用于将mg/m2换算为mg药物/kg患者体重。
实施例
下述实施例仅以举例的方式提供,除非在权利要求中特别指出,此处所包含的所有药物、成分、摩尔比、浓度、pH以及操作步骤并不意味着限制本发明。实施例1-12的化合物制剂按照如下所述适当地重复,共同拥有的美国临时申请序列号60/371,668和60/478,430,以及国际申请PCT/US03/10533,标题为NOVEL ANSAMYCINFORMULATIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND USINGSAME,2003年4月4日申请,以及国际申请PCT/US03/1053,标题为DRUG FORMULATIONS HAVING LONG AND MEDIUM CHAINTRIGLYCERIDES,2003年10月4日申请,且本申请要求其优先权。
实施例1:17-AAG的制备
在干燥的2L烧瓶中,向1.45L干燥THF中的45.0g(80.4mmol)格尔德霉素中滴加50mL干THF中的36.0mL(470mmol)烯丙胺,时间30分钟。在氮气条件下,反应混合液在室温搅拌4小时,此时TLC分析提示反应完全[(GDM:嫩黄∶Rf=0.40;(5%MeOH-95%CHCl3);17-AAG:紫色∶Rf=0.42(5%MeOH-95%CHCl3)]。通过旋转蒸发去除溶剂,粗制品在25℃条件下在H2O∶EtOH(90∶10)中制成浆状,过滤,45℃干燥8小时,得到40.9g(66.4mmol)17-AAG紫色结晶(产率82.6%,经HPLC于254nm测得纯度>98%)。MP206-212℃。1H NMR和HPLC结果与目标产物一致。
实施例2:低熔点型17-AAG的制备
在80℃条件下,将来源于实施例1的粗制17-AAG溶解在800mL2-丙醇(异丙醇)中,然后冷却至室温。过滤后,在45℃下干燥8小时,得到44.6g(72.36mmol)17-AAG紫色结晶(产率90%,经HPLC于254nm下测得纯度>99%)。MP=147-153℃。1H NMR和HPLC结果与目标产物一致。
实施例3:低熔点型17-AAG的溶剂稳定性
在25℃条件下,将来源于实施例2的17-AAG产物溶解在400mLH2O∶EtOH(90∶10)中,过滤后,在45℃下干燥8小时,得到42.4g(68.6mmol)17-AAG紫色结晶(产率95%,经HPLC于254nm下测得纯度>99%)。MP=147-175℃。1H NMR和HPLC结果与目标产物一致。
实施例4:化合物237(二聚体)的制备
在烘干的烧瓶中,在氮气条件下,将3,3-二氨基-二丙胺(1.32g,9.1mmol)滴加入格尔德霉素(10g,17.83mmol)的DMSO(200mL)溶液中,并于室温中搅拌。在12小时后,用水稀释反应混合液。产生沉淀物,过滤后得到粗制品。通过硅层析(5%CH3OHZCH2Cl2)对粗制品进行层析,从而获得为紫色固体的目标二聚体。在快速(硅胶)层析后,获得纯紫色产物;产率:93%;mp 165℃;1H NMR(CDC13)0.97(d,J=6.6Hz,6H,2CH3),1.0(d,J=6.6Hz,6H,2CH3),1.72(m,4H,2CH2),1.78(m,4H,2CH2),1.80(s,6H,2CH3),1.85(m,2H,2CH),2.0(s,6H,2CH3),2.4(dd,J=11Hz,2H,2CH),2.67(d,J=15Hz,2H,2CH),2.63(t,J=10HZ,2BL,2CH),2.78(t,J=6.5Hz,4H,2CH2),3.26(s,6H,20CH3),3.38(s,6H,20CH3),3.40(m,2H,2CH),3.60(m,4H,2CH2),3.75(m,2H,2CH),4.60(d,J=10Hz,2H,2CH),4.65(Bs,2H,20H),4.80(Bs,4H,2NH2),5.19(s,2H,2CH),5.83(t,J=15Hz,2H,2CH=),5.89(d,J=10Hz,2H,2CH=),6.58(t,J=15Hz,2H,2CH=),6.94(d,J=10Hz,2H,2CH=),7.17(m,2H,2NH),7.24(s,2H,2CH=),9.20(s,2H,2N-H);MS(m/z)1189(M+H)。
通过下述方法制备相应的盐酸盐:在室温条件下,将EtOH盐酸溶液(5ml,0.123N)加入化合物#237(1g,如上法制备)的THF(15ml)和EtOH(50ml)溶液中。反应混合液搅拌10分钟。沉淀出盐,过滤,并用大量EtOH进行冲洗,最后真空干燥。作为选择,可以用甲磺酸代替盐酸制备“甲磺酸”盐。
实施例5:化合物914的制备
在室温条件下,在含格尔德霉素(500mg,0.89mmol)的10mL二烷中添加二氧化硒(IV)(198mg,1.78mmol)。将反应混合液加热至100℃并搅拌3小时。将其冷却至室温后,采用乙酸乙酯稀释反应溶液,用水和盐水进行冲洗,在硫酸镁上干燥,过滤并真空干燥。在(硅胶)柱层析后,获得最终纯黄色产物;产率:75%;1HNMR(CDCl3)δ0.97(d,J=7.0Hz,3H,CH3),1.01(d,J=7.0Hz,3H,CH3),1.75(m,3H,CH2+CH),2.04(s,3H,CH3),2.41(d,J=9.9Hz,1H,CH2),2.53(t,J=9.9Hz,1H,CH2),2.95(m,1H,CH),3.30(m,2H,CH+OH),3.34(s,6H,2CH3),3.55(m,1H,CH),4.09(m,1H,CH2),4.15(s,3H,CH3),4.25(m,1H,CH2),4.41(d,J=9.8Hz,1H,CH),4.80(bs,2H,CONH2),5.32(s,1H,CH),5.88(t,J=10.4Hz,1H,CH=),6.04(d,J=9.7Hz,1H,CH=),6.65(t,J=11.5Hz,1H,CH=),6.95(d,J=11.5Hz,1H,CH=),7.32(s,1H,CH-Ar),8.69(s,1H,NH);MS(m/z)575.6(M-1)。
实施例6:化合物967的制备
向3mL含有化合物#914(50mg,0.05mmol)的THF中,加入烯丙胺(3.5mg,0.06mmol)。反应混合液于室温条件下搅拌24小时。通过旋转蒸发去除溶剂。在(硅胶)柱层析后,获得纯紫色产物;产率:90%;1HNMR(CDCl3)δ0.89(d,J=6.6Hz,3H,CH3),1.03(d,J=6.9Hz,3H,CH3),1.78(m,1H,CH),1.82(m,2H,CH2),2.04(s,3H,CH3),2.37(dd,J=13.7Hz,1H,CH2),2.65(d,J=13.7Hz,1H,CH2),2.90(m,1H,CH),3.33(s,3H,CH3),3.34(s,3H,CH3),3.45(m,2H,CH+OH),3.58(m,1H,CH),4.14(m,3H,CH2+CH2),4.16(m,1H,CH2),4.42(s,1H,OH),4.43(d,J=10Hz,1H,CH),4.75(bs,2H,CONH2),5.33(m,2H,CH2=),5.35(s,1H,CH),5.91(m,2H,CH=+CH=),6.09(d,J=9.9Hz,1H,CH=),6.46(t,J=5.8Hz,1H,NH),6.66(t,J=11.6Hz,1H,CH=),6.97(d,J=11.6Hz,1H,CH=),7.30(s,1H,CH),9.15(s,1H,NH)。
实施例7:化合物956的制备
化合物#956的制备方法与化合物#967相同,不同之处为采用吖丁啶代替烯丙胺。在(硅胶)柱层析后,获得最终纯紫色产物;产率:89%;1H NMR(CDCl3)δ0.99(d,J=6.8Hz,3H,CH3),1.04(d,J=6.8Hz,3H,CH3),1.77(m,1H,CH),1.80(m,2H,CH2),2.06(s,3H,CH3),2.26(m,1H,CH2),2.50(m,2H,CH2),2.67(d,1H,CH2),2.90(m,1H,CH),3.34(s,3H,CH3),3.36(s,3H,CH3),3.48(m,2H,OH+CH),3.60(t,J=6.8Hz,1H,CH),4.11(dd,J=12Hz,J=4.5Hz,1H,CH2),4.30(dd,J=12Hz,J=4.5Hz,1H,CH2),4.45(d,J=10.0Hz,1H,CH),4.72(m,5H,2CH2+OH),4.78(bs,2H,NH2),5.37(s,1H,CH),5.89(t,J=10.5Hz,1H,CH=),6.10(d,J=10Hz,1H,CH=),6.66(t,J=12Hz,1H,CH=),7.00(d,J=12Hz,1H,CH=),7.17(s,1H,CH=),9.20(s,1H,CONH);MS(m/z)602(M+1)。
实施例8:化合物529的制备
室温条件下,将17-氨基格尔德霉素(1mmol)EtOAc溶液用Na2S2O4(0.1M,300ml)处理。2小时后,采用EtOAc对水层提取2次,合并的有机层在Na2SO4上干燥,减压浓缩获得18,21-二氢-17-氨基格尔德霉素,其为黄色固体。该固体溶解于无水的THF中,并经过导管转移至皮考啉基氯化物(1.1mmol)与MS4A(1.2g)的混合物中。2小时后,将EtN(i-Pr)2(2.5mmol)加入到反应混合液中。搅拌过夜后,过滤反应混合液,并减压浓缩。然后在残渣中加入水,此混合物经EtOAc提取三次;合并的有机层在Na2SO4上干燥,并减压浓缩获得粗制品,其通过快速层析法进行纯化,从而获得17-皮考啉基-氨基格尔德霉素,即化合物#529,其为黄色固体。Rf=0.52,在80∶15∶5CH2Cl2∶EtOAc∶MeOH中。Mp=195-197℃。1H NMR(CDCl3)δ0.91(d,3H),0.96(d,3H),1.71-1.73(m,2H),1.75-1.79(m,4H),2.04(s,3H),2.70-2.72(m,2H),2.74-2.80(m,1H),3.33-3.35(m,7H),3.46-3.49(m,1H),4.33(d,1H),5.18(s,1H),5.77(d,1H),5.91(t,1H),6.57(t,1H),6.94(d,1H),7.51-7.56(m,2H),7.91(dt,1H),8.23(d,1H),8.69-8.70(m,1H),8.75(s,1H),10.51(s,1H)。
实施例9:化合物1046的制备
化合物#1046的制备方法参照化合物#529,采用4-氯甲基-苯甲酰氯代替皮考啉基氯化物。(3.1g,81%)。Rf=0.45,在80∶15∶5CH2Cl2∶EtOAc∶MeOH中。1H NMR CDCl3δ0.89(d,3H),0.93(d,3H),1.70(br s,2H),1.79(br s,4H),2.04(s,3H),2.52-2.58(m,2H),2.62-2.63(m,1H),2.76-2.79(m,1H),3.33(br s,7H),3.43-3.45(m,1H),4.33(d,1H),4.64(s,2H),5.17(s,1H),5.76(d,1H),5.92(t,1H),6.57(t,1H),6.94(d,1H),7.49(s,1H),7.55(d,2H),7.91(d,2H),8.46(s,1H),8.77(s,1H)。
实施例10:化合物1059的制备
向化合物#1046(0.14g,0.2mmol)的THF(5ml)溶液中,加入碘化钠(30mg,0.2mmol)和吗啉(35μL,0.4mmol)。所形成的混合物回流加热10小时,很快将其冷却至室温,减压浓缩,将残渣再溶解于EtOAc(30ml),用水(10ml)冲洗,在Na2SO4上干燥并再次浓缩。然后将残渣在EtOH(10ml)中重结晶,从而获得化合物#1059(100mg,66%),其为黄色固体。Rf=0.10,在80∶15∶5CH2Cl2∶EtOAc∶MeOH中。1H NMR CDCl3δ0.93(s,3H),0.95(d,3H),1.70(br s,2H),1.78(br s,4H),2.03(s,3H),2.48(br s,4H),2.55-2.62(m,3H),2.74-2.79(m,1H),3.32(br S,7H),3.45(m3 1H),3.59(s,2H),3.72-3.74(m,4H),4.32(d,1H),5.15(s,1H),5.76(d,1H),5.91(t,1H).6.56(t,1H),6.94(d,1H),7.48(s,1H),7.50(d,2H),7.87(d,2H),8.47(s,1H),8.77(s,1H)。
实施例11:化合物1236的制备
化合物#1 236的制备方法参照化合物#1059,采用苯乙基乙胺代替吗啉。Rf=0.43,在80∶15∶5 CH2Cl2∶EtOAc∶MeOH中。1H NMR CDCl3δ0.925(s,3H),0.95(d,3H),1.09(t,3H),1.70(br s,2H),1.79(br s,4H),2.04(s,3H),2.50-2.62(m,5H),2.75-2.79(m,1H),3.32(br s,7H),3.46(m,1H),3.59(s,2H),3.63(s,2H),4.33(d,1H),5.16(s,1H),5.78(d,1H),5.91(t,1H),6.57(t,1H),6.94(d,1H),7.25-7.27(m,1H),7.32-7.38(m,4H),7.48(s,1H),7.53(d,2H),7.85(d,2H),8.47(s,1H),8.77(s,1H)。
实施例12:化合物563:17-(苯甲酰)-氨基格尔德霉素的制备
室温条件下,将17-氨基格尔德霉素(1mmol)的EtOAc溶液用Na2S2O4(0.1M,300ml)处理。2小时后,采用EtOAc对水层提取2次,合并的有机层在Na2SO4上干燥,减压浓缩获得18,21-二氢-17-氨基格尔德霉素,其为黄色固体。该固体溶解于无水THF中,并经过导管转移至苯甲酰氯(1.1mmol)与MS4A(1.2g)的混合物中。2小时后,将EtN(i-Pr)2(2.5mmol)加入到反应混合液中。搅拌过夜后,过滤反应混合液,并减压浓缩。然后在残渣中加入水,此混合物经EtOAc提取三次;合并的有机层在Na2SO4上干燥,并减压浓缩获得粗制品,其通过快速层析法进行纯化,从而获得17-苯甲酰基-氨基格尔德霉素。Rf=0.50,在80∶15∶5 CH2C12∶EtOAc∶MeOH中。Mp=218-220℃。1H NMR(CDC13)0.94(t,6H),1.70(br s,2H),1.79(br s,4H),2.03(s,3H),2.56(dd,1H),2.64(dd,1H),2.76-2.79(m,1H),3.33(br s,7H),3.44-3.46(m,1H),4.325(d,1H),5.16(s,1H),5.77(d,1H),5.91(t,1H),6.57(I,1H),6.94(d,1H),7.48(s,1H),7.52(t,2H),7.62(t,1H),7.91(d,2H),8.47(s,1H),8.77(s,1H)。
实施例13:细胞裂解产物的制备
应用Potter-Elvejem匀浆器,通过手动匀浆,在裂解缓冲液(20mMHEPES,pH7.3,1mM EDTA,5mM MgCl2,100mM KCl)中将研究用细胞裂解。
实施例14:HSP90裂解产物结合试验
按照实施例13的描述,在裂解缓冲液中,将正常B细胞、正常T细胞、ZAP70+CLL B细胞以及ZAP70-CLL B细胞裂解。在有或无17-AAG存在的条件下,将裂解产物于4℃孵育30分钟,继而与连接到BioMagTM链霉抗生物素蛋白磁珠(Qiagen)上的生物素-GM共同4℃孵育1小时。将试管置于磁性架上,移除未结合的上清液。将磁珠在裂解缓冲液中冲洗3次,并在SDS-PAGE上样缓冲液中于95℃加热5分钟。样品经SDS蛋白质凝胶分析,并采用HSP90抗体(StressGen,SPA-830)进行Western印迹分析。Western印迹中的条带通过Bio-rad Fluor-S MultiImager进行定量,并计算对HSP90与生物素-GM结合的抑制率(%)。所报告的IC50指的是导致半数最大结合抑制所需的17-AAG浓度。竞争性结合试验的结果如图1-3所示。
实施例15:评价HSP90与客户蛋白结合的研究
如实施例13所述,将MCF-7乳腺癌细胞、ZAP70+和ZAP70-B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)细胞的初步分离物以及正常的T和B细胞裂解,并如Kamal等人,Nature,2003 425:407-410所描述的方法进行共免疫沉淀试验。蛋白A琼脂糖凝胶珠(Zymed)采用5%BSA进行预封闭。通过与50μL蛋白A琼脂糖凝胶珠(50%膏剂)共同孵育,对细胞裂解产物进行预先净化。向100μL预净化的细胞裂解产物中添加p23和Hop,添加或不添加HSP90抗体,于4℃旋转孵育1小时。然后加入50μL预净化的凝胶珠(50%膏剂),并于4℃旋转孵育1小时。结合的凝胶珠在3000g条件下进行短暂离心,并收集未结合的样品。在裂解缓冲液中将凝胶珠冲洗三次,继而用50mMTris,pH6.8冲洗一次,然后加入SDS上样缓冲液于95℃加热5分钟。通过SDS-PAGE和采用指定抗体的Western印迹试验分析结合和未结合的样品。共免疫沉淀试验的结果如图4所示。
实施例16:证明所选择的HSP90抑制剂抑制ZAP70表达的研究
在37℃条件下,来源于每个ZAP70+患者的ZAP70+慢性淋巴细胞性白血病B细胞的初步分离物,用EC1(17-AAG)、EC116(一种无活性的结构相关的HSP90抑制剂)或EC82或EC86(另外两种已知的HSP90抑制剂)处理24小时。通过采用抗ZAP70特异性抗体对透化处理的细胞进行间接免疫荧光以及FACS分析,测定ZAP70蛋白的表达水平。研究结果如图5所示。所有三种活性HSP90抑制剂均剂量依赖性地诱导ZAP70降解,证实了ZAP70是一种HSP90依赖性客户蛋白,正如在共免疫沉淀试验中所证明的物理相关性所显示的(图4)。三种结构不相关的HSP90抑制剂产生同样效应的事实,强烈提示HSP90是CLL B细胞中ZAP70稳定性的必需蛋白质。
实施例17:确定抑制HSP90对ZAP70+CLL B细胞患者血细胞的下游效应的研究
将来源于每个ZAP70+慢性淋巴细胞性白血病B细胞患者的白细胞的初步分离物不予处理,或用300nM 17-AAG于37℃处理24小时。采用Rassebti等人(同上)所描述的方法,制备样品用于流式细胞术分析。首先采用分别结合别藻蓝蛋白和藻红蛋白的CD19-特异性和CD3-特异性单克隆抗体(Pharmingen)对细胞进行染色,继而采用结合Alexa-488染料(Becton Dickenson)的抗ZAP70特异性单克隆抗体染色。CD3是T细胞的特异性标志。通过流式细胞术(FACSCalibur,BD Biosciences)和Flow-Jo软件(version 2.7.4,TreeStar)测定ZAP70蛋白表达的水平。结果如图6所示,左图为未处理细胞的ZAP70表达,右图为处理细胞的ZAP70表达。
未处理细胞(左图),大约有5%的细胞为正常T细胞(CD3+,ZAP70+,右上四分之一区域),约85%的细胞为ZAP70+CLL B细胞(CD3-,ZAP70+,右下四分之一区域)。17-AAG诱导CLL B细胞中ZAP70降解(%阳性细胞,85%→34%),而不诱导正常T细胞中的降低(%阳性细胞,4.5%→4.2%),正如基于共免疫沉淀试验中所证明的CLL B细胞中而非正常T细胞中的物理相关性所预测的(图4)。
实施例18:HSP90抑制对ZAP70+CCL B细胞存活率的浓度依赖性效应
在37℃条件下,来源于每个患者的ZAP70+慢性淋巴细胞性白血病B细胞的初步分离物,用浓度渐增的EC1(17-AAG)或EC116(无活性的结构相关的HSP90抑制剂)处理48小时。通过采用线粒体活体染料DiOC6和碘化丙啶染色的标准方案鉴定凋亡细胞。结果如图7所示,以%存活率对抑制剂浓度(nM)作图。存活率(%)表示为100%-%凋亡细胞。ZAP70+肿瘤细胞易于被17-AAG杀死,其50%抑制浓度(IC50)大约是80nM。
实施例19:抑制HSP90对ZAP70+CCL B细胞存活率的时间依赖性效应
在37℃条件下,来源于每个ZAP70+患者的B细胞慢性淋巴细胞性白血病细胞的初步分离物,用100nM EC1(17-AAG)或EC116(无活性的结构相关的HSP90抑制剂)处理不同时间。通过采用线粒体活体染料DiOC6和碘化丙啶染色的标准方案鉴定凋亡细胞。结果如图8所示,以%存活率对处理时间(小时)作图。存活率(%)表示为100%-%凋亡细胞。ZAP70+肿瘤细胞被17-AAG快速杀死,其导致50%细胞死亡的时间大约是48小时。
实施例20:CLL B细胞中抑制HSP90的下游作用
在37℃条件下,来源于16例ZAP70+患者和11例ZAP70-患者的慢性淋巴细胞性白血病B细胞(CCL B细胞)的初步分离物,用100nM EC1(17-AAG)处理48小时。通过采用线粒体活体染料DiOC6和碘化丙啶染色的标准方案鉴定凋亡细胞。研究结果如图9所示。存活率(%)表示为100%-%凋亡细胞。ZAP70+肿瘤细胞易于被17-AAG杀死,其平均存活率(%)为45.74+/-3.177%,而在同样条件下ZAP70-细胞未受该药物影响,这些细胞的存活率为93+/-1.701%。存活率差异的Students t检验的P值为<0.0001,即具有高度统计学显著性意义。
前述实施例的目的不是限制本发明,而只是本发明各种实施方案的代表。对于本领域技术人员而言显而易见的是,可以对本发明做各种置换或改变,而不违背本发明的范围和精神。因此,这些另外的实施方案仍属本发明以及下述权利要求书的范围以内。
多克隆或单克隆抗体可以从许多供应商处购得,或可以采用众所周知的方法制备,如Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORYMANUAL,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1988)中所述。此处所述试剂或是购得的,如购自Sigma-Al drich,或是采用本领域一般技术人员已知的和/或在此引入作为参考的出版物所述的常规方法,不需过度试验易于制备的试剂。
Claims (18)
1.一种治疗特征在于B细胞中ZAP70表达水平升高的慢性淋巴细胞性白血病的方法,该方法包括给需要治疗的患者施用药学上有效量的HSP90抑制剂。
2.权利要求1的方法,其中所述抑制剂为安莎霉素。
4.权利要求2的方法,其中所述安莎霉素为17-AAG。
5.权利要求2的方法,其中所述安莎霉素包括17-AAG的低熔点型,其特征为DSC熔解温度低于175℃。
6.权利要求4的方法,其中所述17-AAG选自高熔点型、低熔点型、无定形型,或其组合。
7.权利要求1的方法,其中所述抑制剂结合HSP90的ATP结合位点。
8.权利要求1的方法,其中所述给药方式为病灶内给药。
9.权利要求1的方法,其中所述给药方式为肠胃外给药。
10.权利要求1的方法,其中所述给药方式为口服。
11.权利要求1的方法,其中所述给药方式为静脉内给药。
12.权利要求1的方法,其中所述HSP90抑制剂对ZAP70升高的患者B细胞中所述HSP90的IC50较没有ZAP70升高的B细胞至少低2倍。
13.权利要求1的方法,其中所述HSP90抑制剂对ZAP70升高的患者B细胞中所述HSP90的IC50较没有ZAP70升高的B细胞至少低5倍。
14.权利要求1的方法,其中所述HSP90抑制剂对ZAP70升高的患者B细胞中所述HSP90的IC50较没有ZAP70升高的B细胞至少低10倍。
15.权利要求1的方法,其中所述抑制剂对ZAP70升高的B细胞中HSP90的IC50大约是100nM或更低。
16.权利要求1的方法,其中所述抑制剂对ZAP70升高的B细胞中HSP90的IC50大约是75nM或更低。
17.权利要求1的方法,其中所述抑制剂对ZAP70升高的B细胞中HSP90的IC50大约是50nM或更低。
18.权利要求1的方法,其中所述抑制剂对ZAP70升高的B细胞中HSP90的IC50大约是30nM。
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