PT1490355E

PT1490355E - Derivados de indolilmaleimida

Info

Publication number: PT1490355E
Application number: PT03720413T
Authority: PT
Inventors: Gerhard Zenke; Peter Von Matt; Juergen Wagner; Jean-Pierre Evenou
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2011-11-03
Also published as: NO20044613L; ECSP045254A; TW200918046A; TWI324064B; RU2004132203A; US7358253B2; JP4247125B2; MXPA04009632A; NZ535613A; WO2003082859A1; US7534808B2; MY137566A; EP1490355A1; KR100886521B1; ATE517888T1; CN1639153A; PE20040079A1; KR20040094901A; AU2003224031B2; DK1490355T3

Description

ΡΕ1490355 1 DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE INDOLILMALEIMIDA" A presente invenção relaciona-se com derivado de indolilmaleimida, processo para a sua produção e composições farmacêuticas que os contêm. WO 02/10158 descreve derivados de indolmaleimida substituídos por um fenilo opcionalmente substituído por uma morfolina, N-pirrolidina ou hidroxipiperidina, que inibem a Quinase-33 da Sintase de Glicogénio (GSK-3p), e a utilização de tais compostos. WO 01/46178 descreve derivados de bisindolmaleimida em que um dos resíduos indolilo é substituído por exemplo por um resíduo heteroarilo ou um heterocíclico. Os compostos descritos neste documento possuem uma actividade anticancro.

Mais particularmente a presente invenção providencia um composto de fórmula I

H

em que 2 ΡΕ1490355

Ra é H; CH3; ou isopropilo,

Rb é H; halogéneo; Ci-6alcoxi; ou Ci-6alquilo, e R é um radical de fórmula (e)

(e) em que

Rg é 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo; ou um seu sal.

Os compostos de fórmula I poderão existir na forma livre ou na forma de sal, e.g. sais de adição com e.g. ácidos orgânicos ou inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido trifluoroacético.

Entender-se-á que os compostos de fórmula I poderão existir na forma de isómeros óticos, racematos ou diastereoisómeros. Por exemplo, um átomo de carbono no anel contendo um substituinte na posição 3 do resíduo piperazinilo é assimétrico e poderá ter a configuração Fiou S-. Entender-se-á que a presente invenção abrange todos os enantiómeros e suas misturas. Os enantiómeros são preferidos relativamente aos racematos. Como mencionado, aplicam-se considerações semelhantes em relação aos materiais de partida apresentando átomos de carbono assimétricos.

Alquilo ou alcoxi poderão ser lineares ou ramificados. Fenil-Ci-4alquilo é preferencialmente benzilo 3 ΡΕ1490355 ou fenetilo. Em Ci-4alcoxi-Ci_4alquilo a unidade alcoxi é preferencialmente metoxi ou etoxi e a unidade alquilo preferencialmente metilo ou etilo; um exemplo adequado é e.g. 2-metoxietilo. Halogéneo poderá ser F, Cl, Br ou I, preferencialmente F, Cl ou Br. Halogeno-Ci-4alquilo é alquilo em que um ou mais H são substituídos por halogéneo, e.g. Cl ou F, e.g. CH2C1, CH2F ou CF3. R é preferencialmente um radical de fórmula (a), (c) ou (e), preferencialmente (e).

No radical de fórmula (a) ou (c) , R2 ou R15 está preferencialmente na posição para relativamente a Ri ou Ri4, respectivamente. R3 está preferencialmente na posição meta relativamente a Ri. No radical ou na fórmula (e) , R9 é preferencialmente 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo; quando Rg é piperazinilo substituído na posição 3, este possui configuração R ou S.

A presente invenção também inclui um processo para a preparação de um composto de fórmula I cujo processo compreende a reacção de um composto de fórmula II

(II) 4 ΡΕ1490355

em que Ra e Rb são como definido acima, com um composto de fórmula III R-CH2-CO-NH2 (III) em que R é como definido acima, e, quando requerido, convertendo o composto resultante de fórmula I obtido na forma livre ou vice-versa, conforme adequado. O processo poderá convenientemente ser efectuado na presença de uma base forte, e.g. t-BuOK, e.g. como revelado em WO 02/38561, e como ilustrado nos Exemplos.

Os compostos de fórmula II e III poderão ser preparados de acordo com métodos conhecidos, e.g. como revelado na página 7, parágrafo 2 a 4 de WO 02/38861, sendo o conteúdo destes parágrafos aqui incorporados por citação, e como ilustrado nos exemplos.

Na medida em que a produção dos materiais de partida não está particularmente descrita, os compostos são conhecidos ou poderão ser preparados analogamente a métodos conhecidos na técnica ou como descrito daqui em diante.

Os exemplos seguintes são ilustrativos da invenção sem qualquer limitação. ΡΕ1490355 5 ΤΑ = THF = FCC = TBAF = BINAP = Pd2 (dba) 3 temperatura ambiente tetra-hidrofurano cromatografia flash em coluna fluoreto de tetrabutilamónio 2,2'-bis(difenil)fosfino)-1,l'-binaftilo

Pd(0)-bis(dibenzilidenacetona)

Exemplo 69: 3-[3-(4,7-Diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-4-(7-metil-lH-indol-3-il)-pirrole-2,5-diona

H

2-[3-(4,7-Diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il ]-acetamida (4,95 g, 16,70 mmol) e éster metilico do ácido (7-metil-lH-indol-3-il)-oxo-acético (5,44 g, 25,05 mmol) são destilados azeotropicamente duas vezes com THF seco. Em seguida é adicionado THF seco (100 ml), e sob uma atmosfera de árgon é adicionado gota a gota t-BuOK (1,0 M em THF, 50 ml, 50 mmol) durante 20 min. Após 90 min adicionais, a análise por TLC indicou a conversão completa dos materiais de partida. A mistura reaccional é diluída com H20 e extraída duas vezes com EtOAc. As fases orgânicas combinadas são lavadas duas vezes com solução aquosa saturada de NH4C1 (re-extraídas), secas sobre Na2S04 e 6 ΡΕ1490355 concentradas. A purificação por FCC (CH2Cl2/MeOH 100:0 a 98:2 a 96:4 a 94:6 a 92:8 a 90:10) originou o composto intitulado, que é convertido no seu sal de acetato por concentração de uma solução de EtOH/AcOH. 1H RMN (DMSO, 400 MHz) δ 0 ,26 - 0 , 53 (largo, 4H) , co \—1 (s, 3H , CH3COOH), 2,36 (s, 3H) , 2, 80 (m largo, 2H), 3, 15 - 3,48 (m largo, 2H) , 6, 14 (d, J = 8 ,2 Hz, 1H) , 6, 4‘ 4 (dd, J = 8 ,2/7,4 Hz, 1H) , 6, 75 (d, J = 7,4 Hz, 1H) , 7, 00 (s, 1H) , 7,02 (dd, J = 8,2/ 8,2 Hz, 1H) , 7 ,40 (dd, J = 8,2/8, 2 Hz, 1H), 7, 59 (d, J = 8, 2 Hz , 1H), 7,63 (d, J = 8, 2 Hz, 1H), 7 ,63 (d, J = 8,2 Hz, 1H) , 7, 97 (d, J = 2, 9 Hz, 1H) , 11,04 - 11,21 (largo, 1H) , 11, 86 (d, J = 2,9 Hz, 1H) ; ES-EM : 464 [M+H] +. A 2-[3-(4,7-Diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoqui-nolin-l-il]-acetamida utilizada como material de partida poderá ser preparada como se segue: o

a) 2-[3-(4-Benzil-4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-acetamida (490 mg, 1,27 mmol) é dissolvida em MeOH absoluto (5 mL). É adicionado Pd sobre carvão (140 mg), bem como formato de amónio (200 mg, 3,17 mmol). Após refluxo durante 1 h (T = 75°C), é adicionada uma carga adicional de formato de amónio (200 mg, 3,17 mmol) . 1 h 7 ΡΕ1490355 mais tarde, a análise por TLC indicou a conversão completa do material de partida. Após filtração e concentração, o resíduo é incorporado em CH2CI2 e lavado com água (pH 10 pela adição de NaOH 2 N) . A fase orgânica é seca sobre Na2SC>4 e o solvente é removido. A purificação por FCC (Et0Ac/Ac0H/H20 750:83:68 a 700:110:90 a 650:130:120 a 600:150:150) originou o composto intitulado como o seu sal de bis-acetato. 1H RMN (DMSO, 400 MHz) δ 0,46 - 0, 52 (m, 4H) , 2,88 (t, J = 5,5, 2H) , 3,35 (s, 2H) , 3,49 (t, J = 5,5, 2H), 3,94 (s, 2H), 6,77 (s, 1H), 7,00 (s largo, 1H), 7,18 -7,25 (m, 1 H) , 7,45 - 7,56 (m, 2H) , 7, 60 - 7, 65 (m, 1H) , 7,95 (d, J = 9,9, 1H). ES-EM: 297 [M+H]+. b) 2-[3-(4-Benzil-4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-acetamida. O éster etílico do ácido [3-(4-benzi1-4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-acético (700 mg, 1, 68 mmol) é dissolvido em DMF seca sob uma atmosfera de árgon. É adicionada formamida (224 pL, 254 mg, 5,64 mmol), e a mistura reaccional é aquecida até 105°C. A esta temperatura, é adicionado gota a gota NaOMe (312 pL de uma solução 5,4 M em MeOH, 91 mg, 1,68 mmol) durante 20 minutos. Após 30 minutos a 105°C, a análise por TLC indica a conversão completa do material de partida. O arrefecimento da mistura reaccional até à TA é seguido pela adição de água e extracção com EtOAc. As fases orgânicas são lavadas com H20 (duas vezes), secas sobre Na2S04 e concentradas. O resíduo é purificado por FCC (hexanos/EtOAc 1:1 a 1:3 a 0:100 a EtOAc/MeOH 98:2) para originar o composto intitulado. 1H RMN (DMSO, 400 MHz) δ 0,68 - 0,70 ΡΕ1490355 (m, 2h; ), 0, 82-0 ,88 (m , 2H) , 3, 08 ( t, J = 4,4, 2H) , 3, 45 (s, 2H) , 3, 58 (t, J = 4, 4, 2H) , 3,96 (s, 2H), 4,27 (s, 2H ), 5, 3 - 5, 5 (largo, 1H) , 6,55 - 6,7 (largo, 1H) , 6,72 ( s, 1H) , 7, 26 - 7,36 ( m, 6H) , 7,51 (t, J = 8,8, 1H) , 7,60 ( :d, J = 9, 9, 1H) , 8, 02 ( (d, J = 9,9, 1H); ES -EM: 387 [M+H]+. c) Éster etílico do ácido [3-(4-benzil-4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-acético. O éster etílico do ácido (3-cloro-isoquinolin-l-il)acético (2,50 g, 10.01 mmol), 4-benzil-4,7-diaza-espiro[2.5]octano (2,23 g, 11.01 mmol), t-BuONa (1,06 g, 11,01 mmol), BINAP (249 mg, 0,40 mmol) e acetato de paládio(II) (180 mg, 0,80 mmol) são misturados sob árgon. Após adição de dioxano seco desgaseifiçado (36 mL), a suspensão é aquecida até 85°C. Após 25 minutos a 85°C, a análise por HPLC indicou uma conversão de 71 %. A mistura é arrefecida até à TA, diluída com EtOAc, e lavada com H2O e NH4C1 aq. sat. (re-extraída) . As fases orgânicas combinadas são secas sobre Na2SC>4, o solvente é removido e o resíduo purificado por FCC (hexa-no/EtOAc 100:0 a 96:4 a 93:7 a 90:10 a 85:15) para originar o composto intitulado. 1H RMN (DMSO, 400 MHz) δ 0,58 - 0,61 (m, 2H) , 0,70 - • 0,73 (m, 2H), 1, 18 (t, J = 8,8, 3H) , 2, 98 (t, J = 5 , 5, 2H ), 3,39 (s f 2H) , 3 ,49 (t, J = 5,5, 2H), 3, 86 (s, 2H) , 4,12 ( s, 2H), 4, 12 (q, J = 8,8, 2H) , 5,59 (s, 1H) , 7,14 - 7, 19 (m, - 6H) , 7,39 (t, J = 8,8, 1H) , 7,51 (d, J = 9,9, 1H) , 7,78 (d, J = 9, 9, 1 H) ; ES-EM: 417 [M+H]+. d) Éster etílico do ácido (3-cloro-isoquinolin-l-il)-acético. 1,1,1,3,3,3-Hexametil-disilazano (27,4 mL, 9 ΡΕ1490355 20,37 g, 126,2 mmol) são dissolvidos em tolueno seco (150 mL). Após arrefecimento até -78°C, é adicionado lentamente n-BuLi (79 ml de uma solução 1,6 M em hexanos, 126,2 mmol) durante 20 minutos. A suspensão branca é agitada a -78°C durante 15 minutos e à TA durante 15 minutos, tempo após o qual é obtida uma solução límpida amarelo brilhante. Esta solução é introduzida através de uma cânula num segundo balão de duas tubuladuras, contendo Pd2(dba)3 (1,39 g, 1,51 mmol) e (2'-diciclohexilfosfanil-bifenil-2-il)-dimetilamina (1,25 g, 3,18 mmo1).

Após agitação à TA durante 10 minutos, a solução límpida vermelha escura é arrefecida até -10°C. É adicionado éster terc-butílico do ácido acético (15,7 mL, 13,5 g, 116,1 mmol) durante 5 min. Após 10 minutos a -10°C, é adicionada de uma só vez 1,3-dicloro-isoquinolina (10,0 g, 50,49 mmol). A solução vermelho escuro é deixada aquecer até à TA. Após 30 minutos à TA, a análise por TLC indica a conversão completa do material de partida. A mistura reaccional é filtrada através de uma camada de sílica de 2 cm, que é enxaguada com EtOAc/MeOH 98:2. Após concentração, o resíduo é purificado por FCC (tolueno/CH2Cl2 2:1 a tolueno/EtOAc 100:0 a 99:1 a 98:2 a 97:3 a 96:4 a 94:6 a 90:10) para originar éster terc-butílico do ácido (3-cloro-isoquinolin-l-il)acético. Este composto é dissolvido numa solução etanólica saturada de HC1 (200 ml) e sujeito ao refluxo durante 15 minutos. A concentração originou o composto intitulado com um rendimento quantitativo. 1H RMN (DMSO, 400 MHz) δ 1,17 (t, J = 8,8, 3H) , 4,11 (q, J = 8,8, 10 ΡΕ1490355 2Η) , 4,28 (s, 2H) , 7,51 - 7,57 (m, 1H) , 7,61 (s, 1H) , 7,61 - 7,66 (m, 1H), 7,72 (d, J = 8,8, 1H) , 7,98 (d, J = 8,8, 1H); ES-EM: 250 [M+H]+.

Seguindo o procedimento do Exemplo 69 mas utilizando os materiais de partida adequados, poderão ser obtidos os compostos de fórmula I em que R é o resíduo de fórmula (e), como indicado na Tabela 5 abaixo. TABELA 5

Exem plo Rg Ra Rb Dados de E.M. 70 -(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il) ch3 H MH+ 465 72 -(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il) H H MH+ 451 81 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo H F MH+ 479 83 4,7-diaza-espiro 2.5]oct-7-ilo H CH(CH3)2 MH+ 495 84 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo H och3 MH+ 471 85 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo ch3 ch2-ch3 MH+ 451 86 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo H ch2-ch3 MH+ 4 65 87 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo CH(CH3)2 H MH+ 451 88 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo ch3 ch3 MH+ 479 89 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo ch3 Cl MH+ 499 90 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo H Cl MH+ 485

Os compostos de fórmula I na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável exibem propriedades farmacológicas valiosas, e.g. inibindo a proteína quinase C (PKC), e.g. isoformas de PKC, tais como a activi- 11 ΡΕ1490355 dade de α, β, δ, ε, η ou θ, inibindo a activação e proliferação de células T, e.g. por inibição da produção de células T ou citoquina, e.g. IL-2, por inibição da resposta proliferativa de células T a citoquinas, e.g. IL-2, e.g. como indicado nos testes in vítro e in vivo e são por conseguinte indicados para terapia. A. In vitro

1. Ensaio de Proteína Quinase C

Os compostos de fórmula I são testados para sua actividade em diferentes isoformas de PKC de acordo com um método publicado (D. Geiges et al. Biochem. Pharmacol. 1997;53: 865-875). 0 ensaio é realizado numa placa de microtitulação em polipropileno de 96 poços (Costar 3794) que foi previamente siliconizada com Sigmacote (Sigma SL -2) . A mistura reaccional (50 μ]1) contém 10 μΐϋ da isozima PKC relevante juntamente com 25 μ]1 do composto teste e 15 μΐϋ de uma solução de mistura que contém 200 μg/mL de sulfato de protamina, Mg(NC>3)2 10 mM, ATP 10 μΜ (Boehringer 519987) e 3750 Bq de 33P-ATP (Hartmann Analytic SFC301, 110 TBq/mmol) em tampão Tris 20 mM, pH 7,4 + 0,1 % de BSA. A incubação é realizada durante 15 min a 32°C num incubador de agitação de placa de microtitulação (Biolabo Scientific Instruments) . A reacção é parada pela adição de 10 μΒ de Na2EDTA 0,5 M, pH 7,4. São pipetados 50 μΒ da mistura sobre um papel de fosfocelulose pré-humedecido (Whatmann 3698- 12 ΡΕ1490355 915) sob pressão ligeira. 0 ATP não incorporado é removido por lavagem com 100 μΐϋ de H20 bi-destilada. O papel é lavado duas vezes em H3P04 a 0,5 % durante 15 min seguido de 5 min em EtOH. Daqui em diante o papel é seco e colocado num omnifilter (Packard 6005219), e sobreposto com 10 μΐϋ/ροςο de Microscint-0 (Packard 6013611) antes da contagem num contador de radioactividade Topcount (Packard). As medições de IC50 são realizadas numa base de rotina incubando uma diluição em série do inibidor com concentrações variando entre 1 - 1000 μΜ de acordo com o método descrito acima. Os valores de IC50 são calculados a partir do gráfico por ajustamento da curva sigmoidal. 2. Ensaio de Proteína Quinase C0 É utilizada PKC0 recombinante humana sob condições de ensaio como descrito acima. Neste ensaio, os compostos de fórmula I inibem PKC0 com uma IC50 < 1 μΜ. O composto do Exemplo 69 inibe a PKC0 neste ensaio com uma IC50 de 12,1 nM. 3. Ensaio de Proteína Quinase Ca

Foi obtida PKCa recombinante humana a partir de Oxford Biomedical Research e é utilizada sob as condições do ensaio como descrito na secção A.l acima. Neste ensaio, compostos de fórmula I inibem PKC0 com um IC50 < 1 μΜ. 13 ΡΕ1490355 4. Ensaio de Proteína Quinase Οβί

Foi obtida ΡΚΟβΙ recombinante humana a partir de Oxford Biomedical Research e é utilizada sob as condições do ensaio como descrito na secção A.l acima. Neste ensaio, os compostos de fórmula I inibem PKC0 com uma IC50 < 1 μΜ. 5. Ensaio de Proteína Quinase Οδ

Foi obtida PKCô recombinante humana a partir de Oxford Biomedical Research e é utilizada sob as condições do ensaio como descrito na secção A.l acima. Neste ensaio, os compostos de fórmula I inibem a PKC0 com uma IC50 < 1 μΜ. 6. Ensaio de Proteína Quinase Cs

Foi obtida PKCs recombinante humana a partir de Oxford Biomedical Research e é utilizada sob as condições do ensaio como descrito na secção A.l acima. Neste ensaio, compostos de fórmula I inibem PKC0 com uma IC50 < 1 μΜ. 0 composto do Exemplo 69 inibe PKCs neste ensaio com uma IC50 de 18 nM. 7. Ensaio de Proteína Quinase .Çn

Foi obtida ΡΚΟη recombinante humana a partir da Oxford Biomedical Research e é utilizada sob as condições do ensaio como descrito na secção A.l acima. Neste ensaio, os compostos de fórmula I inibem PKC0 com uma IC50 < 1 μΜ. 14 ΡΕ1490355 8. Ensaio de co-estimulação de CD28 O ensaio é realizado com células Jurkat transfec-tadas com uma construção de gene promotor/repórter de interleuquina-2 humana como descrito por Baumann G. et al. em Transplant. Proc. 1992;24:43-8, sendo o gene repórter de β-galactosidase substituído pelo gene de luciferase (de Wet J., et al., Mol. Cell Biol. 1987, 7(2), 725-737). As células são estimuladas por anticorpos acoplados com fase sólida ou acetato de miristato de forbol (PMA) e a ionomicina de ionóforo Ca++ como se segue. Para o estimulo mediado por anticorpo, as placas de microtitulação Microlite TM1 (Dynatech) são revestidas com 3 pg/mL de anticorpos IgG Fc de cabra anti-rato (Jackson) em 55 pL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por poço durante três horas à TA. As placas são bloqueadas após remoção dos anticorpos por incubação com albumina de soro bovino (BSA) a 2 % em PBS (300 pL por poço) durante 2 horas à TA. Após lavagem três vezes com 300 pL de PBS por poço, são adicionados 10 ng/mL de anticorpos de anti-receptor de células T (WT31, Becton & Dickinson) e 300 ng/mL de anticorpos anti-CD28 (15E8) em 50 pL de BSA/PBS a 2 % como anticorpos estimulantes e incubados durante a noite a 4°C.

Finalmente as placas são lavadas três vezes com 300 pL de PBS por poço. São preparadas sete diluições triplas em série de compostos de teste em duplicados em meio de ensaio (RPMI 1640/soro fetal bovino (FCS) a 10 % 15 ΡΕ1490355 contendo 2-mercaptoetanol 50 μΜ, 100 unidades/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina) em placas separadas, misturadas com células de Jurkat transfectadas (clone K22 290_H23) e incubadas durante 30 minutos a 37°C em CO2 a 5 %. 100 pL desta mistura contendo 1 x 105 células são em seguida transferidas para as placas do ensaio revestidas com anticorpo. Em paralelo são incubados 100 pL com PMA 40 ng/mL e ionomicina 2 pM. Após incubação durante 5,5 horas a 37°C em CO2 a 5 %, o nível de luciferase é determinado através de medida de bioluminescência. As placas são centrifugadas durante 10 min a 500 g e o sobrenadante é removido através de agitação. É adicionado tampão de lise contendo Tris-fosfato 25 mM, pH 7,8, DTT 2 mM, ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,Ν',N-tetraacético 2 mM, glicerol a 10 % (v/v) e Triton X-100 a 1 % (v/v) (20 pL por poço). As placas são incubadas à TA durante 10 minutos sob agitação constante. A actividade de luciferase é avaliada com um leitor de bioluminescência (Labsystem, Helsínquia, Finlândia) após adição automática de 50 pL por poço de tampão de reacção de luciferase contendo Tricina 20 mM, (MgC03) 4Mg (OH) 2 x 5H20 1, 07 mM, MgS04 2, 67 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 33,3 mM, coenzima A 270 pM, luciferina 470 μΜ (Chemie Brunschwig AG), ATP 530 pM, pH 7,8. O tempo de retardo é 0,5 segundos, o tempo de medida total é 1 ou 2 segundos. Os valores de controlo inferiores são unidades de luz a partir de células estimuladas com PMA ou anti-receptoras de células T, os controlos elevados são a partir de células estimuladas com PMA/ionomicina ou anti- receptoras de células T /anti-CD28, sem qualquer amostra de teste. Os 16 ΡΕ1490355 controlos inferiores são subtraídos a todos os valores. A inibição obtida na presença de um composto de teste é calculada como a percentagem de inibição do controlo elevado. A concentração de compostos de teste que resulta em 50 % de inibição (IC50) é determinada a partir das curvas de dose - resposta. Neste ensaio, os compostos de fórmula I inibem as células Jurkat estimuladas com PMA/ionomicina e anti-receptoras de células T/anti-CD28, com uma IC50 <_ 1 μΜ. O composto do Exemplo 29 possui uma IC50 de 20 nM neste ensaio. 9. Reacção de Linfócito Misto Aloqénico (MLR) A MLR de duas vias é realizada de acordo com procedimentos comuns (J. Immunol. Methods, 1973, 2, 279 e Meo T. et al., Immunological Methods, New York, Academic Press, 1979, 227-39) . Resumidamente, as células do baço a partir de murganhos CBA e BALB/c (1,6 x 105 células de cada estirpe por poço em placas de microtitulação de cultura de fundo plano, 3,2 x 105 no total) são incubadas em meio RPMI contendo FCS a 10 %, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina (Gibco BRL, Basileia, Suíça), 2-mercapto-etanol 50 μΜ (Fluka, Buchs, Suíça) e compostos diluídos em série. São realizados sete passos de diluição tripla em duplicados por composto de teste. Após quatro dias de incubação é adicionado 1 μΟί de 3H-timidina. As células são recolhidas após um período de incubação adicional de cinco horas, e a 3H-timidina incorporada é determinada de acordo com procedimentos comuns. Os valores de fundo (controlo 17 ΡΕ1490355 inferior) da MLR são a proliferação de células BALB/c sozinhas. Os controlos inferiores são subtraídos a todos os valores. Os controlos elevados sem qualquer amostra são tomados como uma proliferação de 100 %. É calculada a percentagem de inibição pelas amostras, e são determinadas as concentrações requeridas para uma inibição de 50 % (valores de IC50) . Neste ensaio, o composto do Exemplo 29 possui uma IC50 de 28 nM. Os compostos da fórmula I também exibem valores de IC50 na gama de nM quando testados na MLR humana. 10. Inibição de GSK-30 0 ensaio de ligação de GSK-3P é realizado em reacções de 50 pL numa placa de polipropileno de 96 poços, cada reacção contendo cloreto de magnésio 20 mM, ATP 40 μΜ, DTT 2 mM, substrato de péptido CREB biotinilado e fosforilado 88,5 μΜ (biotin-KRREILSRRPS (PO4) YR-OH ; Q. M. Wang et al.r J. Biol. Chem. 269, 14566-14574, 1994), [γ-33P]ATP (1 pCi) e 2 pL do composto a ser testado em DMSO (várias concentrações). São adicionados 15 pL de GSK-3P (várias concentrações) e a mistura é incubada a 30°C durante 1 hora. A reacção é parada através da transferência de 25 pL da mistura para uma placa de fosfocelulose contendo 130 pL de ácido fosfórico a 1,85 %. Os radionucleótidos livres na membrana são removidos por lavagem sob vácuo com ácido fosfórico a 1,85 % (5 vezes) . Após a última lavagem, a placa é transferida para uma placa de adaptação e são adicionados 50 pL de cocktail de cintilação (Microscint-20, 18 ΡΕ1490355

Packard, cat. #20-133) a cada poço e a quantidade de radioactividade é contada num contador de topo. Os compostos de fórmula I são activos neste ensaio. Os compostos de fórmula I poderão também ser testados noutros ensaios de ligação de ΘΞΚ-όβ comuns utilizando outros substratos, e.g. como disponíveis comercialmente. B. In vivo

Transplante de Coração de Rato A combinação de estirpes utilizada: Machos Lewis (haplotipo RT' ) e BN (haplotipo RT1) . Os animais são anestesiados utilizando isofluorano para inalação. Após a heparinização do rato doador através da veia cava inferior abdominal com exsanguinação simultânea através da aorta, o peito é aberto e o coração rapidamente arrefecido. A aorta é ligada e dividida distai relativamente à primeira ramificação e o tronco braquiocefálico é dividido na primeira bifurcação. A artéria pulmonar esquerda é ligada e dividida e a parte direita é dividida mas deixada aberta. Todos os outros vasos são dissecados para serem libertados, ligados e divididos e o coração doador é removido e colocado numa solução salina gelada. O recipiente é preparado através de dissecação e fixação cruzada da aorta abdominal infra-renal e veia cava. O enxerto é implantado com anastomoses terminolateral, utilizando sutura de monofilamento 10/0, entre o tronco 19 ΡΕ1490355 braquiocefálico do doador e a aorta do receptor e a artéria pulmonar doadora direita do doador com a veia cava do receptor. Os agrafos são removidos, o enxerto amarrado retroabdominalmente, os conteúdos abdominais lavados com solução salina morna e o animal é fechado e deixado recuperar sob uma lâmpada de aquecimento. A sobrevivência ao enxerto é monitorizada por palpação diária do batimento do coração do doador através da parede abdominal. A rejeição é considerada estar completa quando o batimento cardíaco pára. Aumentos da sobrevivência ao enxerto são obtidos em animais tratados com um composto de fórmula I administrado oralmente a uma dose diária de 1 até 30 mg/kg duas vezes ao dia.

Modelo de Enxerto v. Hospedeiro

As células do baço (2 x 107) de ratos Wistar/F são injectadas subcutaneamente na pata traseira direita de ratos híbridos Fi (Wistar/F x Fischer 344). A pata esquerda é deixada por tratar. Os animais são tratados com os compostos de teste em 4 dias consecutivos (0-3) . Os nodos linfáticos popliteais são removidos no dia 7, e são determinadas as diferenças de peso entre dois nodos linfáticos correspondentes. Os resultados são expressos como a inibição do aumento do nodo linfático (dado em percentagem) comparando as diferenças de peso do nodo linfático nos grupos experimentais com a diferença de peso entre os nodos linfáticos correspondentes de um grupo de animais deixado por tratar com um composto de teste. Neste ensaio, é obtida 20 ΡΕ1490355 uma inibição de 100 % com o composto do Exemplo 29 quando administrado a uma dose de 30 mg/kg/dia duas vezes ao dia.

Os compostos de fórmula I são, consequentemente, úteis no tratamento e/ou prevenção de doenças ou patologias mediadas por linfócitos T e/ou PKC, e.g. rejeição aguda ou crónica de alo- ou xenoenxertos de órgão ou tecido, doenças de enxerto versus hospedeiro, aterosclerose, oclusão vascular devida a lesão vascular tal como angioplastia, restenose, obesidade, sindrome X, intolerância a glucose, síndrome de ovário policistico, hipertensão, insuficiência cardíaca, doença pulmonar obstrutiva crónica, doenças do SNC tais como doença de Alzheimer ou esclerose amiotrófica lateral, cancro, doenças infecciosas tais como SIDA, choque séptico ou síndrome de insuficiência respiratória do adulto, lesão por isquemia/reperfusão e.g. enfarte do mioc-árdio, acidente vascular, isquemia por gota, insuficiência renal ou choque hemorrágico, ou choque traumático, e.g. lesão cerebral traumática. Os compostos de fórmula I são também úteis no tratamento e/ou prevenção de doenças inflamatórias agudas ou crónicas mediadas por células T ou patologias ou doenças autoimunes e.g. artrite reumatóide, osteoartrite, lúpus sistémico eritematoso, tiroidite de Hashimoto, esclerose múltipla, miastenia grave, diabetes tipo I ou II e as patologias a ela associadas, e.g. angiopatia, retinopatia proliferativa diabética, edema macular diabético, nefropatia, neuropatia e fenómeno de Dawn, doenças respiratórias tais como asma ou lesão inflamatória pulmonar, lesão inflamatória do fígado, lesão 21 ΡΕ1490355 inflamatória glomerular, manifestações cutâneas de patologias ou enfermidades mediadas imunologicamente, doenças inflamatórias e hiperproliferativas da pele (tais como psoriase, dermatite atópica, dermatite de contacto alérgica, dermatite de contacto irritante e dermatites eczema-tosas adicionais, dermatite seborreica), doenças inflamatórias do olho, e.g. sindrome de Sjoegren, queratocon-juntivite ou uveite, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn ou colite ulcerativa. Para as utilizações acima a dosagem requerida irá com certeza variar dependendo do modo de administração, do estado particular a ser tratado e do efeito desejado.

Em geral, são indicados resultados satisfatórios a serem obtidos sistemicamente com dosagens diárias de desde cerca de 0,1 até cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Uma dosagem diária indicada num mamífero superior, e.g. seres humanos, está na gama de desde cerca de 0,5 mg até cerca de 2000 mg, convenientemente administrada, por exemplo, em doses divididas até quatro vezes por dia ou numa forma retardada.

Os compostos de fórmula I poderão ser administrados através de qualquer via convencional, em particular entericamente, e.g. oralmente, e.g. na forma de comprimidos ou cápsulas, ou parentericamente, e.g. na forma de soluções ou suspensões injectáveis, topicamente, e.g. na forma de loções, géis, unguentos ou cremes, ou numa forma nasal ou de um supositório. As composições farmacêuticas compreen- 22 ΡΕ1490355 dendo um composto de fórmula I na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável em associação com pelo menos um veículo ou diluente farmacêutico aceitável poderão ser fabricadas de um modo convencional por mistura com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. As formas de dosagem unitárias para administração oral contêm, por exemplo, desde cerca de 0,1 mg até cerca de 500 mg de substância activa. A administração tópica é e.g. à pele. Uma forma adicional de administração tópica é ao olho.

Os compostos de fórmula I poderão ser administrados na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável e.g. como indicado acima. Tais sais poderão ser preparados de um modo convencional e exibem a mesma ordem de actividade que os compostos livres.

De acordo com o que se segue a presente invenção providencia adicionalmente: 1.1 Um método para prevenir ou tratar patologias ou doenças mediadas por linfócitos T e/ou PKC ou GSK-3P, e.g. tal como indicado acima, num sujeito com necessidade de tal tratamento, cujo método compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade efectiva de um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; 1.2 Um método para prevenir ou tratar rejeição aguda ou 23 ΡΕ1490355 crónica a transplante ou doenças autoimunes ou inflamatórias mediadas por células T, e.g. como indicado acima, num sujeito com necessidade de tal tratamento, cujo método compreende administrar ao referido sujeito uma quantidade efectiva de um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; 2. Um composto de fórmula I, na forma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável para utilizar como um fármaco, e.g. em qualquer dos métodos como indicado em 1.1 e 1.2 acima. 3. Uma composição farmacêutica, e.g. para utilizar em qualquer um dos métodos como em 1.1 e 1.2 acima compreendendo um composto de fórmula I na forma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável em associação com um seu diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. 4. Um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável para utilizar na preparação de uma composição farmacêutica para utilizar em qualquer um dos métodos como em 1.1 e 1.2 acima.

Os compostos de fórmula I poderão ser administrados como o único componente activo ou juntamente com outros fármacos em regimes moduladores imunológicos ou outros agentes anti-inflamatórios e.g. para o tratamento ou prevenção de rejeição aguda ou crónica de alo- ou xeno-enxerto ou patologias inflamatórias ou autoimunes. Por 24 ΡΕ1490355 exemplo, poderão ser utilizados em combinação com ciclos-porinas, ou ascomicinas ou seus análogos ou derivados imunossupressores, e.g. ciclosporina A, ISA Tx247, FK506, ABT-281, ASM 981; um inibidor de mTOR, e.g. rapamicina, 40-0-(2-hidroxi)etil-rapamicina, CCI779, ABT578 ou arapalog, e.g. AP23573 etc.; corticosteróides; ciclofosfamida; aza-tiopreno; metotrexato; um agonista de receptor de EDG possuindo propriedades de inicio de linfócito acelerador, e.g. FTY 720 ou um seu análogo; leflunomida ou seus análogos; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato de mofetilo; 15-desoxispergualina ou seus análogos; anticorpos monoclonais imunossupressores, e.g., anticorpos monoclonais para receptores de leucócito, e.g., MHC, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40, 4-1 BB ou seus ligandos, e.g. CD154; ou outros compostos moduladores imunológicos, e.g. uma molécula de ligação recombinante possuindo pelo menos uma porção do domínio extracelular de CTLA4 ou um seu mutante, e.g. pelo menos uma porção extracelular de CTLA4 ou um seu mutante ligado a uma sequência proteica diferente de CTLA4, e.g. CTLA4Ig (por ex. designada ATCC 68629) ou um seu mutante, e.g. LEA29Y, ou outros inibidores de molécula de adesão, e.g. mAbs ou inibidores de baixo peso molecular incluindo antagonistas de LFA-1, antagonistas de Selectina e antagonistas de VLA-4. Os compostos de fórmula I poderão também ser administrados juntamente com um fármaco anti-proliferativo, e.g. um fármaco quimioterapêutico, e.g. como utilizado no tratamento de cancro, incluindo mas não limitado a inibidores de aromatase, anti-estrógenos, inibidores 25 ΡΕ1490355 de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, agentes activos microtubulares, agentes alquilantes, inibidores de histona desacetilase, inibidores de farnesil transferase, inibidores de COX-2, inibidores de MMP, inibidores de mTOR, metabolitos antineoplásicos, compostos de platina, compostos redutores da actividade de proteína quinase e adicionalmente compostos anti-angiogénicos, agonistas de gonado-relina, anti-andrógenos, bengamidas, bisfosfonatos, anticorpos anti-proliferativos e temozolomida, ou com um fár-maco anti-diabético, um secretor de insulina ou intensifi-cador de secreção de insulina, e.g. uma sulfonilureia, e.g. tolbutamida, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, 4-cloro-iV- [ (1-pirolidinilamino) carbonil] -benzenosulfonamida (glicopiramida), glibenclamida (gliburida), gliclazida, 1-butil-3-metanililureia, carbutamida, glibonurida, glipizi-da, gliquidona, glisoxepida, glibutiazole, glibuzole, gli-hexamida, glimidina, glipinamida, fenbutamida ou tolilci-clamida, derivados de um agente insulinotrópico oral, e.g. um potenciador de insulina de curta acção, e.g. megli-tinida, repaglinida, um derivado de ácido fenilacético, e.g. nateglinida, um inibidor de DPP IV, e.g. dicloridrato de 1-{2-[(5-cianopiridin-2-il)amino]etilamino}acetil-(2 S) — cianopirrolidina, LAF237, GLP-1 ou um análogo de agonista de GLP-1, ou um sensibilizador de insulina e.g. um agonista do receptor γ activado por proliferador de peroxisoma (PPARy) , e.g. uma glitazona, um tipo diferente de glitazona tal como um análogo de N- (2-benzoilfenil)-L-tirosina, e.g. GI-262570, ou uma oxolidinediona, e.g. JTT501, um agonista dual PPARy/PPARcx, e.g. DRF-554158, NC-2100 ou NN-622, um 26 ΡΕ1490355 agonista de receptor retinoide X ou um rexinoide, e.g. ácido 2—[1—(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2- naftil)-ciclopropil]-piridino-5-carboxílico, ácido 4- [(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra-hidro-2-naftil)-2-carbonil]-benzoico, ácido 9-cis retinóico ou um seu análogo, derivado ou sal farmaceuticamente aceitável, em terapia de diabetes.

De acordo com o que segue a presente invenção providencia num aspecto ainda adicional: 5. Um método como definido acima compreendendo a co-administração, e.g. concomitantemente ou em sequência, de uma quantidade terapeuticamente efectiva de um inibidor de GSK-3p, PKC ou de activação e proliferação de células T, e.g. um composto de fórmula I na forma livre ou numa forma de sal farmaceuticamente aceitável, e uma segunda substância fármaco, sendo a referida segunda substância fármaco um fármaco imunossupressor, modulador imunológico, anti-inflamatório, antiproliferativo ou antidiabético, e.g. como indicado acima. 6. Uma combinação terapêutica, e.g. um kit (conjunto), compreendendo a) um inibidor de GSK-33, PKC ou de activação e proliferação de células T, e.g. um composto de fórmula I na forma livre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, e b) pelo menos um segundo agente seleccionado a partir de um fármaco imunossupressor, modulador imunológico, anti-inflamatório, antiproliferativo ou antidiabé- 27 ΡΕ1490355 tico. 0 componente a) e o componente b) poderão ser utilizados concomitantemente ou em sequência. O kit (conjunto) poderá compreender instruções para a sua administração.

Quando um inibidor de GSK-3P, PKC ou de activação e proliferação de células T, e.g. um composto de fórmula I, é administrado em conjunção com outra terapia imunossupres-sora/moduladora imunológica, anti-inflamatória, antiproli-ferativa ou antidiabética, e.g. para prevenir ou tratar a rejeição aguda ou crónica a enxerto ou patologias inflamatórias ou autoimunes como especificado aqui acima, as dosagens do composto imunossupressor, modulador imunoló-gico, anti-inflamatório, antiproliferativo ou antidiabético co-administrado irão com certeza variar dependendo do tipo de co-fármaco empregue, e.g. quer seja um esteróide ou uma ciclosporina, do fármaco especifico empregue, do estado a ser tratado e assim por diante.

Os compostos de fórmula I possuem um perfil farmacocinético interessante e actividades in vítro e in vivo interessantes.

Lisboa, 21 de Outubro de 2011

Claims

ΡΕ1490355 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de fórmula I

em que Ra é H; CH3; ou isopropilo, Rb é H; halogéneo; Ci-6alcoxi; ou Ci-6alquilo, e R é um radical de fórmula (e)

(e) em que Rg é 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-ilo; ou um seu sal.
2. Um composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1 que é seleccionado a partir dos seguintes compostos: 3-[3-(4,7-Diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-4-(7-metil-lH-indol-3-il)-pirrole-2,5-diona ou um composto de fórmula I em que os substituintes são definidos como se segue: 2 ΡΕ1490355 r9 Ra Rb -(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il) ch3 H -(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il) H H 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il H F 4,7-diaza-espiro 2.5]oct-7-il H CH(CH3)? 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il H och3 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il ch3 CH2-CH3 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il H ch2-ch3 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il CH(CH3)2 H 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il ch3 ch3 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il ch3 Cl 4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il H Cl ou um seu sal.
3. Um composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1 que é 3-[3-(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)isoquinolin-l-il]-4-(7-metil-lH-indol-3-il)-pirrole-2,5-diona ou um seu sal.
4. Um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, na forma livre ou numa forma de sal farmaceuticamente aceitável para utilização como um medicamento.
5. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das rei- 3 ΡΕ1490355 vindicações 1 a 3 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em associação com um seu diluente ou veículo farma-ceuticamente aceitável.
6. Um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou um seu sal farmaceu-ticamente aceitável para utilização na preparação de uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou na prevenção de rejeição aguda ou crónica de aloenxertos ou enxerto de órgão ou tecido versus doenças do hospedeiro.
7 . de fórmula I compreende a Um processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1, cujo processo reacção de um composto de fórmula II

em que Ra e Rb são como definido na reivindicação 1, com um composto de fórmula III R-CH2-CO-NH2 (III) em que R é como definido na reivindicação 1, e, quando requerido, conversão do composto resultante de fórmula I obtido na forma livre para uma forma de sal ou vice-versa, como adequado. 4 ΡΕ1490355
8. Uma combinação compreendendo a) 3-[3-(4,7-diaza-espiro[2.5]oct-7-il)-isoquinolin-l-il]-4-(7-metil-lH-indol-3-il)-pirrole-2,5-diona na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável, e b) a pelo menos um segundo agente seleccionado a partir de um fármaco imunos-supressor, imunomodulador, anti-inflamatório, anti-prolife-rativo e anti-diabético.
9. Utilização de um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, na forma livre ou na forma de sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com pelo menos uma segunda substância de fármaco seleccionada a partir de um fármaco imunossupressor, imunomodulador, anti-inflamatório, anti-proliferativo, quimio-terapêutico e anti-diabético, na preparação de um medicamento para terapia. Lisboa, 21 de Outubro de 2011