PT1246639E

PT1246639E - Formulação glp-2.

Info

Publication number: PT1246639E
Application number: PT00988416T
Authority: PT
Inventors: Indu J Isaacs
Original assignee: Nps Allelix Corp
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2007-05-31
Also published as: AU782110B2; WO2001049314A3; EP1246639B1; CY1106558T1; JP2012116861A; US7056886B2; JP5001498B2; JP2014159463A; EP1246639A2; US20010027180A1; AU2462601A; DE60033437T2; DK1246639T3; DE60033437D1; GB9930882D0; ATE353665T1; JP5604463B2; CA2395814A1; WO2001049314A2; JP2003519195A

Description

1

DESCRIÇÃO «FORMULAÇÕES DE GLP-2»

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece formulações para péptidos GLP-2 e análogos derivados. A invenção fornece, em especial, formulações de péptidos GLP-2 e análogos de GLP-2 com estabilidade melhorada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A administração de péptidos terapêuticos reguer formulações de péptidos que se mantenham estáveis durante o armazenamento. Normalmente, utiliza-se a administração parentérica com péptidos, devido ao seu tamanho aumentado e à dificuldade subsequente em atravessar membranas biológicas. Os péptidos podem ser especialmente difíceis de formular por causa da sua tendência para se degradarem ao longo do tempo e/ou sofrerem agregação e precipitação. A degradação, agregação e a precipitação são todas indicadores de uma formulação instável. Essa formulação instável não é comercialmente viável, pois não é aprovada pela U.S. Food and Drug Administration.

As variáveis das formulações que afectam a degradação dos péptidos durante o armazenamento incluem, entre outros, o pH, a quantidade de sais presentes e o tipo e quantidade de 2 veículos. Além disso, as temperaturas, as pressões e o tempo dos ciclos de congelamento e de secagem podem afectar a estabilidade de uma formulação de péptido liofilizada. 0 papel da maioria dessas variáveis tem sido estudado; no entanto, o efeito sinergético das variáveis é pouco conhecido. 0 péptido do tipo glucagão - 2 (GLP-2 - Glucagon-like peptide 2) é um péptido de 33 aminoácidos que tem aplicações terapêuticas no tratamento de doenças do tracto gastrointestinal. Determinou-se, em particular, que o GLP-2 e os análogos derivados actuam como agentes tróficos para melhorar e manter o funcionamento do tracto gastrointestinal e promover o crescimento de tecido gastrointestinal. Ver, por exemplo, as patentes norte-americanas 5,834,428; 5,789,379 e 5,990,077; e a publicação internacional número WO 98/52600. A exploração comercial do GLP-2 ou de um análogo derivado requer uma formulação de GLP-2 estável que possa ser rapidamente preparada utilizando um procedimento comercialmente aceitável. Como o GLP-2 é uma proteína, e, por conseguinte, muito mais lábil que fármacos de baixo peso molecular tradicionais, a formulação de GLP-2 ou de um análogo derivado apresenta desafios que não são habitualmente encontrados pela indústria farmacêutica. Por exemplo, a oxidação da metionina na posição 10 e a desaminação da aspargina na posição 11, 16 e/ou 24 do GLP-2 são vias potenciais de degradação. Além disso, o GLP-2 ou um 3 análogo derivado também pode ser adsorvido por superfícies para formar agregados e/ou precipitar, o que tornaria depois a formulação instável.

Existe uma necessidade na técnica de formulações estáveis de péptidos GLP-2 e análogos derivados que possam ser preparadas utilizando um procedimento comercialmente aceitável. A presente invenção satisfaz estas necessidades.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece formulações estáveis de GLP-2 e análogos derivados que podem ser preparadas utilizando um procedimento comercialmente aceitável.

Descobriu-se que podem ser utilizadas concentrações relativamente altas de GLP-2 em formulações farmacologicamente aceitáveis. Além do mais, descobriu-se que um pH maior que cerca de 5,5, mais preferencialmente maior do que cerca de 6, ainda mais preferencialmente entre cerca de 6,9 até cerca de 7,9 e o mais preferencialmente entre cerca de 7,3 até cerca de 7,4, é adequado para uma formulação estável.

Descobriu-se também que o análogo de GLP-2 h[Gly2]GLP-2 sofre uma transição de fase entre os 40 e 55 °C, dependendo da concentração de sal, e torna-se hidrofóbico na presença de sal. Também se descobriu que Tween 80®, sal e arginina não são materiais adequados para produzir uma formulação 4 estável para o h[Gly2]GLP-2.

De acordo com um modo de realização da presente invenção, fornece-se uma formulação de GLP-2 que compreende: (1) uma quantidade medicamente útil de GLP-2; (2) um tampão fosfato suficiente para ajustar o pH da formulação a um nível farmacologicamente aceitável, e em particular acima de 6,0; (3) uma quantidade estabilizadora do aminoácido L-histidina; e (4) um agente de volume seleccionado de entre sacarose e manitol.

Fornece-se, mais em particular, uma formulação de GLP-2 que compreende: (1) uma quantidade medicamente útil de GLP-2 que compreende entre cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml de GLP-2, preferencialmente cerca de 5 a cerca de 40 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 7 a cerca de 30 mg/ml, ainda mais preferencialmente entre cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, e, mais preferencialmente, cerca de 20 mg/ml; (2) um tampão fosfato para manter o pH a um nível fisiologicamente tolerável, isto é, acima de 6; (3) um aminoácido, em particular a L-histidina; e (4) um agente de volume, em particular o manitol. Todas as percentagens aqui descritas (excepto para as percentagens de água) são percentagens de peso/volume de produto formulado antes da liofilização em gramas/ml (x 100). As percentagens para o conteúdo em água são peso/peso de produto liofilizado (x 100).

Num modo de realização da presente invenção, a formulação de GLP-2 é uma formulação de h[Gly2]GLP-2 liofilizada que 5 compreende, no produto reconstituído: (1) um tampão fosfato numa quantidade necessária para manter o pH do produto reconstituído entre 6,9 a 7,9 e, de preferência, numa quantidade para manter um pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,4; (2) cerca de 0,5 a cerca de 1% de L-histidina; (3) cerca de 2 a cerca de 5% de manitol, preferencialmente entre cerca de 2,5 a cerca de 3,5% de manitol, e mais preferencialmente cerca de 3% de manitol; e (4) entre cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml de GLP-2 ou um análogo derivado, preferencialmente cerca de 5 a cerca de 40 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 7 a cerca de 30 mg/ml, ainda mais preferencialmente cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml e, mais preferencialmente, cerca de 20 mg/ml.

Num modo de realização preferido da invenção, fornece-se uma formulação de h[Gly2]GLP-2 liofilizada que compreende no produto reconstituído: (1) cerca de 7 a cerca de 30 mg/ml, preferencialmente cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, e, mais preferencialmente, cerca de 20 mg/ml de h[Gly2]GLP-2; (2) um tampão fosfato suficiente para manter o pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,4; (3) cerca de 0,5 a cerca de 1% de L-histidina; e (4) cerca de 3% de manitol.

Num outro aspecto da presente invenção, fornece-se um procedimento para produzir a formulação liofilizada de GLP-2. 0 procedimento compreende os seguintes passos: (a) a preparação da formulação de GLP-2 que compreende GLP-2 ou um análogo derivado, um tampão fosfato, L-histidina e 6 manitol; (b) o congelamento da formulação até cerca de -40 °C; (c) a realização de um primeiro passo de secagem a -20 °C; e (d) a realização de um segundo passo de secagem a +20 °C.

Num modo de realização preferido, a formulação liquida submetida ao processo de liofilização compreende: (1) o análogo de h [Gly2] GLP-2; (2) 35 mM de tampão fosfato para manter o produto reconstituído num pH de cerca de 6,9 a cerca de 7,9, e, preferencialmente, a um pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,4; (3) cerca de 0,5 a cerca de 1% de L-histidina; e (4) cerca de 3% de manitol.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, fornece-se um método para preparar uma formulação de GLP-2 farmacologicamente aceitável para administração parentérica, compreendendo o passo de reconstituição da formulação de GLP-2 liofilizada.

Fornece-se, além disso, de acordo com a presente invenção um kit terapeuticamente útil compreendendo: (1) um frasco esterilizado compreendendo uma formulação de GLP-2 liofilizada da invenção; (2) um veículo adequado para a sua reconstituição, de preferência água esterilizada; (3) instruções para a reconstituição; e (4) instruções opcionais para a administração. O kit pode ainda compreender um dispositivo adequado para a injecção da preparação reconstituída. 7

Quer a anterior descrição geral, quer a descrição pormenorizada que se segue, são exemplares e explicativas e visam fornecer explicações adicionais sobre a invenção, tal como é reivindicada. Outros objectivos, vantagens e caracteristicas novas serão prontamente evidentes àqueles com experiência na arte, a partir da seguinte descrição pormenorizada da invenção.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Apresenta um gráfico de barras do efeito de determinados estabilizadores de aminoácidos sobre a formulação de h[Gly2]GLP-2 utilizando um teste de resistência ao calor. A pureza em percentagem (%) está representada para três diferentes formulações de aminoácidos, quer antes quer depois da aplicação do calor;

Figura 2: Apresenta um gráfico de barras do efeito de L-histidina sobre uma formulação de h[Gly2]GLP-2 tamponada com fosfato. A pureza em % está representada para as três diferentes formulações às 0 e 4 horas;

Figura 3: Apresenta um gráfico de barras da análise de agentes de volume analisados através de cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) a temperatura ambiente e a 60 °C. A pureza em % está representada para sete diferentes formulações de aminoácidos; 8

Figura 4: Apresenta um gráfico de barras da análise de agentes de volume analisados através de cromatografia liquida de alta eficiência de exclusão molecular (SE-HPLC). «HMW» representa um pico de peso molecular elevado. A pureza em % está representada para sete diferentes formulações;

Figura 5: Apresenta um gráfico de barras da estabilidade de formulações de manitol e de sacarose de h[Gly2]GLP-2 num estado liquido, antes da liofilização, que foram armazenadas a 4 °C. A pureza em % está representada para quatro diferentes formulações aos 0 min., ao longo de 49 min., em intervalos de 7 min.; e

Figura 6: Apresenta um gráfico de barras da estabilidade das formulações de manitol e de sacarose liofilizadas de h[Gly2]GLP-2, que foram armazenadas a 60 °C. A pureza em % está representada para quatro diferentes formulações de aminoácidos.

Descrição Pormenorizada da Invenção A invenção diz respeito a formulações de GLP-2 que exibem uma estabilidade de armazenamento superior. O termo «GLP-2», tal como é aqui utilizado, indica um péptido GLP-2 natural ou um análogo de GLP-2 derivado (excepto se indicado o contrário).

As formulações de GLP-2 presentes podem ser fornecidas sob a 9 forma de formulações líquidas adequadas para administração, como por injecção, em quantidades únicas ou em quantidades de doses múltiplas. As formulações líquidas também podem servir como solução-mãe a partir da qual se podem preparar formas de dosagem liofilizadas. Assim, as formulações de GLP-2 presentes também podem ser fornecidas sob forma liofilizada, por exemplo, como pós liofilizados adequados para reconstituição e administração subsequente sob a forma de formulações líquidas injectáveis.

As formulações liofilizadas da presente invenção exibem uma estabilidade de armazenamento de seis meses à temperatura ambiente, e dezoito meses a 4 °C. A estabilidade de armazenamento é exibida através de uma degradação mínima dos péptidos, de preferência menor do que cerca de 5% de degradação dos péptidos, mais preferencialmente menor do que cerca de 3 a 4% de degradação dos péptidos, e ainda mais preferencialmente menor do que cerca de 1 a cerca de 2% de degradação de péptidos. A degradação dos péptidos pode ser medida utilizando técnicas padrão de HPLC de fase reversa (RP-HPLC).

Os péptidos de GLP-2 naturais são péptidos altamente conservados. Assim, os péptidos de GLP-2 para utilização na presente invenção incluem as formas de GLP-2 produzidas naturalmente, em particular por espécies vertebradas (incluindo espécies piscícolas e aviárias), mais em particular formas mamíferas [como as de primatas, roedores (incluindo o rato, o ratinho, o degu, o hamster e a cobaia), 10 suínas e bovinas], e mais em particular a forma humana. O péptido GLP-2 natural seleccionado para utilização é, desejavelmente, mas não necessariamente, da mesma espécie da do indivíduo identificado para tratamento.

Os análogos de GLP-2 potencialmente úteis na presente invenção incluem agonistas e antagonistas do receptor de GLP-2. Os agonistas de GLP-2 activam o receptor de GLP-2 ao ligarem-se em primeiro lugar ao receptor, seguido da estimulação de um sistema de segundo mensageiro intracelular acoplado ao receptor. Num modo de realização da invenção, os agonistas de GLP-2 actuam selectivamente no receptor de GLP-2. Os agonistas de GLP-2 que actuam selectivamente são compostos que, no contexto de um ensaio adequado de ligação ou funcional do receptor de GLP-2, se ligam ao receptor de GLP-2 com maior afinidade. Essa maior afinidade é preferencialmente pelo menos uma ordem de grandeza maior do que os diferentes tipos de receptores, como o receptor de GLP-1. Noutros modos de realização, os análogos de GLP-2 ligam-se ao receptor de GLP-2 com uma afinidade pelo menos equivalente à afinidade do GLP-2 natural.

Noutros modos de realização da invenção, o péptido GLP-2 é um análogo do GLP-2 natural que incorpora uma ou mais substituições, adições, delecções ou modificações de aminoácidos e mantém actividade biológica.

Pensa-se que a actividade agonista do GLP-2 humano ou do GLP-2 de rato requer uma extremidade N-terminal intacta, mas 11 são toleradas várias delecções de vários resíduos na extremidade C-terminal sem perda da actividade agonista. As substituições são toleradas em sítios fora das regiões conservadas ao longo dos vários homólogos das espécies de GLP-2. Similarmente, as substituições são também toleradas nos sítios dentro de regiões conservadas ao longo das espécies de GLP-2. Em modos de realização preferidos, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras. Por exemplo, um membro de uma classe de aminoácidos pode ser substituído por um outro membro, por exemplo, a substituição de alanina por glicina, a substituição de asparagina por glutamina, a substituição de metionina por leucina ou isoleucina, etc. A actividade antagonista dos análogos de GLP-2 nos seres humanos e em ratos é exibida quando o péptido GLP-2 natural sofreu mutação num ou mais dos primeiros quatro resíduos da extremidade N-terminal, especialmente ao serem detectados qualquer um ou mais desses resíduos da extremidade N-terminal. Além disso, a actividade antagonista é exibida quando o hGLP-2 natural é substituído: (1) com um aminoácido que não ocorre naturalmente em qualquer uma das seguintes posições: Asp15, Phe22, Thr29, Thr32 e/ou Asp33; (2) e quando a Ala2 é substituída por qualquer um dos seguintes aminoácidos: Leu, Cys, Glu, Arg, Trp e PCb-Tyr2. Além disso, os antagonistas dos análogos de GLP-2 incluem qualquer mutação ou variação do péptido GLP-2 natural que resulta na inibição da actividade intestinotrófica do GLP-2 ou dos análogos de GLP-2 naturais que exibem actividade agonista. São descritos 12 especificamente na WO 98/03547 análogos estruturais de GLP-2 que actuam como antagonistas.

Os análogos do receptor de GLP-2 podem ser identificados analisando os péptidos contra células alteradas geneticamente para produzir o receptor de GLP-2. O receptor de GLP-2 já foi clonado. Ver Munroe et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96 (1):1569 (1999). Também são descritas na publicação internacional número WO 98/25955, publicada a 18 de Junho de 1998, células que incorporam funcionalmente o receptor de GLP-2 e a sua utilização para analisar análogos de GLP-2.

Num modo de realização preferido, o análogo de GLP-2 com actividade agonista foi alterado para conferir resistência contra a degradação por parte de enzimas endógenas, como a DPP-IV. Esses análogos incorporam adequadamente uma substituição do resíduo de alanina na posição 2. Em modos de realização específicos, o resíduo de Ala2 é substituído por glicina ou serina ou por outros resíduos, como se descreve, por exemplo, na patente norte-americana n.° 5,789,379. Num modo de realização preferido, o agonista do receptor de GLP-2 é [Gly2] GLP-2. Para a utilização no tratamento de seres humanos, o análogo de GLP-2 é desejavelmente, mas não necessariamente, um péptido GLP-2 humano ou um análogo, incluindo especialmente o análogo Gly2 do GLP-2 humano.

Descobriu-se que o análogo de h[Gly2]GLP-2 precipita num pH menor que 5,5 e que o perfil de temperatura sugere uma 13 temperatura de transição de cerca de 40 °C induzida pelo calor e dependente de sal. Baseando-se nos perfis de solubilidade de pH, determinou-se que um tampão fosfato fornece uma capacidade de tampão óptima para os péptidos GLP-2. Além disso, descobriu-se que a adição de L-histidina ao tampão fosfato estabilizava eficazmente os péptidos de GLP-2, enquanto a adição de citrato de arginina ou de lisina não estabilizava eficazmente as composições de GLP-2. A L-histidina actua como um aminoácido estabilizante que aumenta o periodo de tempo que o péptido GLP-2 permanece intacto antes da degradação.

As formulações liofilizadas da presente invenção são preferencialmente fornecidas sob a forma de pó compreendendo não mais de 5% do peso em água, preferencialmente não mais de 2% do peso em água, e mais preferencialmente não mais de 1% do peso em água. O agente de volume incorporado na preparação produz um bolo amorfo não cristalino. Descobriu-se que os açúcares de lactose, trealose e maltose não estabilizam eficazmente a formulação de GLP-2 tão bem como o manitol e a sacarose. Descobriu-se que o manitol é o excipiente preferido para as formulações de GLP-2.

Selecciona-se o agente tampão incorporado na formulação da presente invenção de entre aqueles capazes de tamponar a preparação para um pH dentro de um intervalo fisiologicamente tolerável para administração a um doente. 14

Formulações «fisiologicamente toleráveis» são aquelas que provocam reacções, num recipiente, que não são tão extremas ao ponto de precludir a administração da formulação, intervalo aceitável para administração no doente. Em particular, descobriu-se que o pH da formulação deveria ser maior do que cerca de 5,5, preferencialmente maior do que cerca de 6, mais preferencialmente entre cerca de 6,9 a cerca de 7,9 e ainda mais preferencialmente entre cerca de 7,3 a cerca de 7,4. De preferência, o agente tampão é baseado em fosfato, e mais preferencialmente utiliza-se um tampão fosfato de 35 mM.

As formulações da presente invenção incorporam GLP-2 numa quantidade medicamente eficaz, nomeadamente uma quantidade que é útil quer do ponto de visto terapêutico quer do ponto de vista de diagnóstico. Essa quantidade pode ser determinada com base no tipo de péptido GLP-2 ou análogo seleccionado e no fim que se pretende para a preparação. As quantidades terapeuticamente eficazes de GLP-2 incluem aquelas quantidades de unidade de dosagem úteis num regime de tratamento de um indivíduo que beneficiaria da administração de GLP-2, como se descreve mais em pormenor nas patentes norte-americanas números 5,834,428; 5,789,379; 5,990,077; e 5,952,301; e na publicação internacional número WO 98/52600.

Num modo de realização, a formulação pode ser utilizada para o tratamento de doenças gastrointestinais, em particular doenças, distúrbios e estados do intestino. As quantidades 15 terapeuticamente eficazes também incluem quantidades em doses múltiplas de GLP-2, que podem ser administradas a um individuo especifico. As quantidades diagnósticas úteis de GLP-2 incluem aquelas quantidades que são úteis como um calibrador quando se determinam os níveis endógenos de GLP-2 ou níveis de fármaco GLP-2 num indivíduo, por exemplo, antes de iniciar a terapêutica com GLP-2, ou durante a duração do tratamento com GLP-2. As quantidades terapeuticamente úteis de GLP-2 podem, por conseguinte, situar-se num intervalo tão abrangente como o que vai de alguns microgramas a muitos miligramas. As formulações da presente invenção proporcionam de preferência cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml de GLP-2, de preferência cerca de 4 a cerca de 40 mg/ml, mais preferencialmente cerca de 7 a cerca de 30 mg/ml, ainda mais preferencialmente entre cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml e, mais preferencialmente, cerca de 20 mg/ml de GLP-2.

Num modo de realização da invenção, uma formulação líquida de h[Gly2]GLP-2 conveniente para liofilização compreende: (1) preferencialmente cerca de 7 a cerca de 30 mg/ml, mais preferencialmente, cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml, e mais preferencialmente cerca de 20 mg/ml de h[Gly2]GLP-2; (2) cerca de 2 a cerca de 5% de manitol, preferencialmente cerca de 2,5 a cerca de 3,5%, mais preferencialmente cerca de 3%; (3) cerca de 0,5 a cerca de 1% de um estabilizador de aminoácido que é preferencialmente L-histidina; e (4) um tampão fosfato numa quantidade capaz de tamponar o produto reconstituído até um pH de cerca de 6,9 a 7,9, e preferencialmente um pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,4. 16

As formulações de GLP-2 da presente invenção são de preferência colocadas em frascos individuais até ao volume desejado, sendo os frascos submetidos a um processo de liofilização. 0 processo de liofilização inclui um processo de ciclos de temperatura que é cuidadosamente controlado para assegurar que a secagem se mantém uniforme. 0 processo de secagem é continuado até haver menos de cerca de 5% de água, preferencialmente menos de cerca de 2% de água, e mais preferencialmente não mais do que cerca de 1% de água, na formulação de GLP-2.

Um procedimento de liofilização conveniente para a presente invenção envolve um passo de congelamento e um procedimento de secagem de dois ciclos. Num exemplo de procedimento de congelamento: (1) os frascos de formulação são primeiro arrefecidos da temperatura ambiente até cerca de -1 °C a cerca de 2 °C por minuto, e depois mantidos a -1 °C durante cerca de 15 minutos; (2) depois, os frascos são arrefecidos de cerca de -1 °C até cerca de -40 °C, a cerca de 2 °C por minuto, e depois mantidos a cerca de -40 °C durante cerca de 4 horas.

Num exemplo do primeiro ciclo de secagem, a temperatura é aumentada de cerca de -40 °C até cerca de -20 °C, a cerca de 2 °C por minuto, e depois mantida a cerca de -20 °C durante cerca de 14 horas, sob um vácuo de cerca de 150 mT com uma temperatura de condensação de cerca de -80 °C. Num exemplo do segundo ciclo de secagem, os frascos são aquecidos de 17 cerca de -20 °C até cerca de +20 °C, a cerca de 2 °C por minuto, e depois mantidos a cerca de +20 °C durante cerca de 14 horas a um vácuo de cerca de 150 mT e a uma temperatura de condensação de cerca de -80 °C até haver menos de cerca de 5% de água, preferencialmente menos de cerca de 2% de água e mais preferencialmente não mais de cerca de 1% de água. Os frascos são depois, de preferência, armazenados a cerca de 4 °C. A presente invenção também proporciona um kit medicamente útil que compreende: (1) pelo menos um frasco contendo a formulação de GLP-2 liofilizada da invenção; (2) pelo menos um frasco de água esterilizada para reconstituição; (3) instruções dirigidas à reconstituição; e (4) opcionalmente um dispositivo de injecção para administração. Para utilizar o kit, o utilizador mistura a água com o frasco da formulação, de preferência, transferindo a água para o frasco da formulação. A formulação liofilizada da presente invenção dissolve-se rapidamente depois da reconstituição e, quando reconstituída, permanece estável durante pelo menos cerca de 12 horas, de preferência até cerca de 24 horas, a 4 °C. Num modo de realização preferido, a reconstituição da formulação liofilizada é levada a cabo utilizando água esterilizada, de preferência não mais do que cerca de 1 mL de água esterilizada por dose de GLP-2. Para reconstituir, a água esterilizada poderá ser posta numa seringa e depois transferida para o frasco que contém a formulação de GLP-2 liofilizada. 18 Dão-se os seguintes exemplos para ilustrar a presente invenção.

Exemplo 1: Formulação e liofilização de h[Gly2]GLP-2 0 objectivo deste exemplo foi preparar uma formulação liofilizada do péptido GLP-2 h[Gly2]GLP-2.

Um tampão de formulação base, compreendendo 35 mM de fosfato de sódio a um pH de 7,4, foi preparado como se segue: (1) adicionou-se água purificada ao frasco esterilizado, despirogenado; (2) adicionou-se sódio heptahidratado ao frasco; e (3) adicionou-se fosfato de sódio monobásico monohidrato ao frasco. 0 tampão foi misturado e o pH foi ajustado a 7,4 ± 0,2. O tampão de formulação base foi depois usado para diluir a substância do fármaco bruto liquido do péptido GLP-2 h[Gly2]GLP-2 até uma concentração de 10 mg/ml. Adicionou-se depois L-histidina até uma concentração final de 7,76 gm/L e adicionou-se manitol até uma concentração final de 30 gm/L. A preparação foi cuidadosamente misturada, e em seguida filtrou-se a preparação através de um filtro de 0,22 pm num tanque de enchimento esterilizado. A preparação de GLP-2 foi depois assepticamente enchida, em aliquotas de 1 ml, do tanque para frascos de vidro USP Tipo 1 esterilizados de 3 cc, que foram depois parcialmente tapados com rolhas de borracha esterilizadas e colocados em tabuleiros de liofilização. 19

Os frascos foram depois colocados num liofilizador, e o ciclo de liofilização foi começado através de um pré-congelamento da formulação a uma temperatura de -40 í 2 °C durante cerca de 4 horas. Num passo de congelamento, os frascos da formulação foram primeiro arrefecidos da temperatura ambiente até -1 °C a 2 °C por minuto e depois mantidos a -1 °C durante cerca de 15 minutos. O primeiro passo de congelamento foi seguido por arrefecimento dos frascos de -1 °C até -40 °C, a 2 °C por minuto, e os frascos foram depois mantidos a -40 °C durante 4 horas.

No primeiro e principal ciclo de secagem, a temperatura foi aumentada de -40 °C até -20 °C a 2°C por minuto e depois mantida a -20 °C durante cerca de 14 horas sob um vácuo de 150 mT com uma temperatura de condensação de -80 °C. No segundo ciclo de secagem, os frascos foram aquecidos de -20 °C até +20 °C, a 2 °C por minuto, e depois mantidos a +20 °C durante cerca de 14 horas a um vácuo de 150 mT e uma temperatura de condensação de -80 °C. O segundo ciclo de secagem foi continuado até haver menos de cerca de 5% de água, preferencialmente menos de cerca de 2% de água, e mais preferencialmente não mais de cerca de 1% de água restante na formulação de GLP-2. Os frascos foram depois armazenados a 4 °C.

No final do ciclo de liofilização, os frascos foram purgados com azoto filtrado e as rolhas de borracha foram totalmente enfiadas nos frascos. Os frascos tapados foram removidos do 20 liofilizador e selados permanentemente com um selo de alumínio e tapados com um tampa flip-off de polipropileno.

Exemplo 2: Análise dos Aminoácidos para Estabilizar a Formulação 0 objectivo deste exemplo foi determinar o efeito dos vários aditivos de aminoácidos na estabilidade de GLP-2 depois da exposição a temperaturas elevadas. A formulação de h[Gly2]GLP-2 foi testada com vários aminoácidos, como se mostra abaixo. As formulações de teste compreendem: (1) h[Gly2]GLP-2 a uma concentração de 10 mg/ml; e (2) os aditivos apresentados abaixo. O pH da composição foi mantido entre 7,1 a 7,5. 1. 10 mM de fosfato, 10 mM de Glutamato 2. 10 mM de fosfato, 10 mM de Glutamato, 50 mM de

Arginina 3. 10 mM de fosfato, 10 mM de Citrato 4. 10 mM de fosfato, 10 mM de Citrato, 50 mM de Arginina 5. 10 mM de fosfato, 100 mM de Citrato 6. 10 mM de fosfato, 100 mM de Citrato, 50 mM de Arginina 7. 10 mM de fosfato, 10 mM de Serina 8. 10 mM de fosfato, 10 mM de Serina, 50 mM de Arginina 9. 10 mM de fosfato, 10 mM de Prolina 10. 10 mM de fosfato, 10 mM de Prolina, 50 mM de Arginina 11. 10 mM de fosfato, 10 mM de Histidina 12. 10 mM de fosfato, 10 mM de Histidina, 50 mM de 21

Arginina 13. 10 mM de fosfato, 10 mM de Glicina 14. 10 mM de fosfato, 10 mM de Glicina, 50 mM de Arginina 15. 10 mM de His, 10 mM de Glicina 16. 10 mM de His, 10 mM de Glicina, 50 mM de Arginina

Depois da preparação, as amostras foram liofilizadas de

acordo com o protocolo do Exemplo 1, armazenadas a 40 °C durante 14 dias, diluídas até 0,4 mg/ml, e depois aquecidas até 60 °C durante 4 horas.

Todas as formulações contendo arginina precipitaram depois do aquecimento (Formulações 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16) . A Formulação 5 (100 mM de citrato) e a Formulação 15 (L- histidina e glicina) também precipitaram. As formulações compreendendo L-histidina, 10 mM de citrato, serina, prolina, glutamato, e glicina (Formulações 1, 3, 7, 9, 11 e 13) revelaram estabilidade similar quando estes compostos foram utilizados sem a adição de outros aminoácidos (ver Figura 1).

Como se pode ver na Figura 2, quando se utilizou L-histidina como estabilizador, em combinação com um tampão fosfato, o péptido GLP-2 permaneceu estável depois do teste de resistência ao calor durante 4 horas a 60 °C.

Exemplo 3: Análise dos Agentes de Volume O objectivo deste exemplo foi determinar o efeito de vários 22 aditivos de agentes de volume na estabilidade de um péptido GLP-2 depois da exposição a temperaturas elevadas.

As seguintes formulações do péptido GLP-2 h[Gly2]GLP-2, a uma concentração de 0,4 mg/ml, foram liofilizadas de acordo com o procedimento de liofilização do Exemplo 1. As composições foram depois reconstituídas e aquecidas até 60 °C. 1. 25 mM de histidina, 35 mM de fosfato, 3% de manitol 2. 50 mM de histidina, 35 mM de fosfato, 3% de manitol 3. 75 mM de histidina, 35 mM de fosfato, 3% de manitol 4. 25 mM de histidina, 25 mM de fosfato, 3% de sacarose 5. 25 mM de histidina, 25 mM de fosfato, 3% de trealose 6. 25 mM de histidina, 25 mM de fosfato, 3% de maltose 7. 25 mM de histidina, 25 mM de fosfato, 3% de lactose

Como se pode ver nas Figuras 3 e 4, os dados da HPLC de fase reversa (Fig. 3) demonstram que as amostras de manitol (Formulações 1, 2 e 3) revelaram a quantidade mais pequena de degradação de GLP-2. Além disso, as três concentrações de L-histidina (25 mM, 50 mM e 75 mM) mostraram todas uma estabilidade comparável. A análise de SE-HPLC (Fig. 4) também mostrou que, excepto a maltose e a lactose (Formulações 6 e 7), o análogo de GLP-2 eluiu em todas as formulações como um só pico sem agregação. As formulações 6 e 7 deram um pico de impureza de peso molecular elevado (HMW) que representou cerca de 6%. Contudo, quando estas amostras foram submetidas a teste de resistência ao calor a 23 60 °C, os agregados de impureza de peso molecular elevado aumentaram até cerca de 20% nas Formulações 6 e 7.

Assim, concluiu-se que o manitol e a sacarose são candidatos aceitáveis para adição às formulações de GLP-2 da invenção.

Exemplo 4: Análise dos Agentes de Volume O objectivo deste exemplo foi comparar a eficácia dos aditivos de agentes de volume sacarose e manitol na estabilidade de GLP-2 depois da exposição a temperaturas elevadas.

Foram preparadas as seguintes formulações de h[Gly2]GLP-2, a 10 mg/ml, e analisou-se a estabilidade de GLP-2 em cada formulação. A concentração de sacarose na Formulação 2 foi aumentada até 5% para satisfazer a osmolaridade fisiológica. 1. 35 mM de fosfato, 50 mM de histidina, 3% de manitol, pH 7,4 2. 35 mM de fosfato, 50 mM de histidina, 5% de sacarose, pH 7,4

3. 35 mM de fosfato, 25 mM de lisina, 3% de manitol, pH 7.4

4. 35 mM de fosfato, 25 mM de lisina, 5% de manitol, pH 7.4

As formulações foram depois liofilizadas de acordo com o procedimento de liofilização do Exemplo 1, seguido de 24 reconstituição e de testes de estabilidade. As formulações foram depois aquecidas até 60 °C durante 4 horas, seguidas de testes de estabilidade.

Todas as amostras liofilizadas armazenadas a temperatura ambiente e a 40 °C permaneceram estáveis. A estabilidade das formulações depois da liofilização e da exposição a temperaturas elevadas foi depois medida. A Formulação 1, compreendendo L-histidina e manitol, não revelou indícios de degradação de GLP-2. Contudo, as Formulações 2, 3 e 4, compreendendo histidina/sacarose, lisina/manitol e lisina/manitol, respectivamente, revelaram indícios de degradação de GLP-2 ao longo do tempo (ver Figura 6).

Estes resultados sugerem que a adição de sacarose e lisina destabiliza o péptido GLP-2 (ver também a Figura 5) , depois da exposição a temperaturas elevadas.

Exemplo 5: A pureza e a quantidade de h[Gly2]GLP-2 A pureza de GLP-2 é uma medida da degradação do péptido ou da ausência desta. A quantidade de GLP-2 é uma medida do conteúdo total de GLP-2 e, assim, é uma indicação das quantidades quantitativas de degradação, precipitação e/ou agregação dos péptidos.

Para determinar a pureza e a quantidade de h[Gly2]GLP-2, 25 utiliza-se HPLC de fase reversa. A cromatograf ia de fase reversa é uma técnica cromatográfica de fase ligada que permite a separação dos compostos com base na sua polaridade. 0 h[Gly2]GLP-2 é absorvido no material de empacotamento da coluna baseado em silica hidrofóbica de fase reversa ligada e é eluido como um só pico pelo aumento da hidrofobicidade da fase móvel com um gradiente de acetonitrilo. A amostra de h[Gly2]GLP-2 é quantificada de acordo com um padrão de referência.

Equipamento

Sistema HPLC Waters ou equivalente

Vydac (Hesperia, CA), coluna analítica de fase reversa C18, 4.6 mm x 25 cm, tamanho de partícula 5 pm, tamanho de poro 300 Â, ou equivalente

Vydac (Hesperia, CA), cartuchos de guarda analíticos C18, 4.6 x 30 mm, tamanho de partícula 5 pm, tamanho de poro 300 Ã, ou equivalente

Seringa Digital Hamilton ou equivalente Pipetas

Materiais

Filtros de membrana (0,45 pm)

Frascos de vidro padrão de HPLC, revestimento de polipropileno, e septos de PTFE Acetonitrilo, grau de HPLC Água Milli-Q 26 Ácido trifluoroacético (TFA), grau do espectro Bicarbonato de amónio, grau de ACS 1 M de hidróxido de amónio Procedimento

Condições cromatográficas:

Fase móvel Eluente A 0,1% (v/v) de TFA em água Milli-Q Eluente B 0,1% (v/v) de TFA em acetonitrilo Amostrador 2-8°C automático: Detector: comprimento de onda regulado a 214 nm e sensibilidade a 2 AU Duração: 45 minutos Condições de gradiente: Tempo Débito % de Forma da (minutos) (mL/min) Eluente B Curva 0 1,0 30 6 1 1,0 30 6 30 1,0 60 6 35 1,0 30 6 45 1,0 30 6 Coluna de armazenamento em 20 % de acetonitrilo depois do uso.

Preparação de 10 mM de bicarbonato de amónio, tampão com um pH de 8: 27

Dissolver 0,20 gramas de bicarbonato de amónio em cerca de 200 mL de água Milli-Q. Ajustar o pH a 8,0 ± 0,1 utilizando 1 M de hidróxido de amónio. Adicionar água Milli-Q até um volume final de 250 mL. Definir a data de validade em uma semana e armazenar a 2 a 8 °C. Deixar o tampão aquecer até à temperatura ambiente, depois, verificar o pH e filtrar o tampão através de um filtro de 0,45 pm antes da utilização.

Preparação do padrão:

Reconstituir um padrão de referência h[Gly2]GLP-2 com 10 mM de bicarbonato de amónio filtrado, tampão com um pH de 8, até uma concentração de 200 pg/mL.

Preparação da amostra:

Reconstituir/diluir a(s) amostra(s) de teste de h[Gly2]GLP-2 no mesmo tampão utilizado para o padrão, até uma concentração de 200 pg/mL. Preparar amostras em duplicado.

Análise:

Injectar 50 pL de uma solução padrão 6 vezes, a % de RSD do tempo de retenção do pico e da área de h[Gly2]GLP-2 não é maior do que (NMT) 5%, o factor de assimetria USP do pico de h[Gly2]GLP-2 é entre 1 e 2.

Injectar 50 pL de amostra branca (10 mM de bicarbonato de 28 amónio filtrado, tampão com pH de 8) uma vez.

Injectar 50 pL de amostra de teste de h[Gly2]GLP-2 uma vez.

Injectar 50 pL de solução padrão uma vez depois de dez injecções de amostra de teste e no final do teste.

Processamento e Cálculo de Dados

Processamento de Dados

Ajustar o software fornecido com o sistema de HPLC para integrar a área sobre todos os picos observados entre 5 e 40 minutos, não incluindo quaisquer picos que correspondam àqueles observados no cromatograma da injecção do branco. Cálculos % Pureza = área do pico de h[Gly2]GLP-2 X 100 área de todos os picos detectados

Concentração = (área do pico de h[Gly2]GLP-2 da amostra x conc. de padrão) x Factor de Diluição (DF) área média do pico de h[Gly2]GLP-2 de padrão

Preparou-se uma formulação liofilizada de 9 mg/ml de h[Gly2]GLP-2 de acordo com o método do Exemplo 1. Esta amostra foi testada quanto à estabilidade medindo a pureza e o conteúdo de fármaco da amostra a 4 °C e 25 °C utilizando o método do Exemplo 4. Os resultados são apresentados na 29

Tabela 1 e na Tabela 2. Como se constata nas tabelas, a amostra mostrou estabilidade durante pelo menos 6 meses e 18 meses a 4 °C e 25 °C, respectivamente.

Tabela 1: Condições de Armazenamento: 4 °C RESULTADOS MÉTODO DE TESTE Tempo 3 6 9 12 18 0 Meses Meses Meses Meses Meses pH 7,4 7,4 7,2 7,0 7,4 7,4 Pureza por RP-HPLC 99, 3% 99, 5% 99,3% 99, 1% 99, 0% 99,4% Conteúdo por RP-HPLC (mg/ml) 9, 0 8,7 8,9 8,7 8,7 8,8 Conteúdo de Água ou Humidade Residual (p/p) 1,0% 1, 0% 1,0% 1, 0% 1,0% 1,2%

Tabela 2: Condições de Armazenamento: 25 °C MÉTODO DE TESTE RESULTADOS Tempo 0 (libertação) 1 Mês 2 Meses 3 Meses 4 Meses 5 Meses 6 Meses PH 7,4 7,4 7,5 7,4 7,2 7,3 7,2 Pureza por RP-HPLC 99,3% 99,5% 99, 3% 99, 6% 99,3% 99,3% 99,4% Conteúdo por RP-HPLC 9, 0 8,7 9,1 8,8 9,3 8,7 9, 0 Conteúdo de Água ou Humidade Residual (p/p) 1,0% 1,2% 1, 2% 1,2% 1,3% 2,0% 1,3%

Lisboa, 14/05/2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação de GLP-2 compreendendo: (a) uma quantidade medicamente útil de um péptido GLP-2 natural ou um análogo derivado, tendo o análogo uma ou mais substituições, adições, delecções ou modificações de aminoácidos e actividade de ligação ao receptor GLP-2; (b) um tampão fosfato numa quantidade suficiente para ajustar o pH da formulação a um nível fisiologicamente tolerável; (c) L-histidina; e (d) um agente de volume seleccionado de entre o grupo que consiste em manitol e sacarose.

2. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, em que o pH da formulação é maior do que cerca de 6,0.

3. A formulação de GLP-2 de acordo com a reivindicação 2, em que o pH da formulação é entre cerca de 6,9 a cerca de 7,9.

4. A formulação de GLP-2 da reivindicação 3, em que o pH da formulação é entre cerca de 7,3 a cerca de 7,4.

5. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, em que o péptido GLP-2 ou análogo derivado está presente a uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml.

6. A formulação de GLP-2 da reivindicação 5, em que o 2 péptido GLP-2 ou análogo derivado está presente a uma concentração de entre cerca de 5 a cerca de 40 mg/ml.

7. A formulação de GLP-2 da reivindicação 6, em que o péptido GLP-2 ou análogo derivado está presente a uma concentração de entre cerca de 7 a cerca de 30 mg/ml.

8. A formulação de GLP-2 da reivindicação 7, em que o péptido GLP-2 ou análogo derivado está presente a uma concentração de cerca de 10 a cerca de 20 mg/ml.

9. A formulação de GLP-2 da reivindicação 8, em que a L-histidina está presente numa quantidade entre cerca de 0,5 a cerca de 1%.

10. A formulação de GLP-2 da reivindicação 9, em que o agente de volume é o manitol.

11. A formulação de GLP-2 da reivindicação 10, em que o manitol está presente a uma concentração de entre cerca de 2 a cerca de 5%.

12. A formulação de GLP-2 da reivindicação 11, em que o manitol está presente a uma concentração de entre cerca de 2,5 a cerca de 3,5%.

13. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, em que o péptido GLP-2 é seleccionado de entre o grupo que consiste em um péptido GLP-2 de mamífero, um péptido GLP-2 de 3 vertebrado e um péptido GLP-2 de ser humano.

14. A formulação de GLP-2 da reivindicação 13, em que o péptido GLP-2 tem a sequência de uma espécie de GLP-2 de um animal seleccionado de entre o grupo que consiste em um primata, rato, ratinho, espécie porcina, espécie taurina, espécie bovina, degu, hamster, cobaia, peixe, galinha e ser humano.

15. A formulação de GLP-2 de qualquer reivindicação anterior, em que o péptido GLP-2 é h[Gly2]GLP-2.

16. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, em que o análogo de GLP-2 é identificado por um processo que compreende: (a) a análise de péptidos contra células geneticamente modificadas para produzir o receptor GLP-2, e (b) a identificação de péptidos que se ligam ao receptor de GLP-2, em que esses péptidos são identificados como péptidos GLP-2 úteis na formulação da reivindicação 1.

17. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, em que o péptido GLP-2 é um análogo que foi alterado para conferir resistência a enzimas endógenas.

18. A formulação de GLP-2 da reivindicação 17, em que a alteração compreende a substituição do resíduo alanina na posição 2 do GLP-2 por outro aminoácido apropriado. 4

19. A formulação de GLP-2 da reivindicação 18, em que o resíduo de alanina na posição 2 é substituído por glicina ou serina.

20. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, em que o análogo de GLP-2 é um antagonista do receptor de GLP-2 em que o antagonista do receptor de GLP-2 tem (1) uma substituição de aminoácido em qualquer uma das seguintes posições: Asp15, Phe22, Thr29, Thr32 e/ou Asp33; ou (2) uma substituição de aminoácido em Ala2 por qualquer um dos 2 seguintes aminoacidos: Leu, Cys, Glu, Arg, Trp e PCb-Tyr .

21. A formulação de GLP-2 da reivindicação 15 na forma liofilizada.

22. As formulações liofilizadas da reivindicação 21, compreendendo menos de cerca de 5% de água por peso.

23. As formulações liofilizadas da reivindicação 22, compreendendo 2% ou menos de água por peso.

24. A formulação de GLP-2 da reivindicação 15, que é estável à temperatura ambiente durante até 6 meses, como se mostra pela degradação do péptido GLP-2 inferior a cerca de 5% durante este período de tempo.

25. A formulação de GLP-2 da reivindicação 24, em que se observa menos de cerca de 3 a cerca de 4% de degradação do 5 péptido depois de armazenamento da formulação de GLP-2 durante o período de tempo.

26. A formulação de GLP-2 da reivindicação 25, em que menos se observa uma degradação do péptido entre cerca de 1 a cerca de 2% depois de armazenamento da formulação de GLP-2 durante o período de tempo.

27. A formulação de GLP-2 da reivindicação 1, que é estável a uma temperatura de cerca de 4 °C durante até cerca de 18 meses, como é evidenciado pela degradação do péptido GLP-2 de menos de cerca de 5% durante este período de tempo.

28. A formulação de GLP-2 da reivindicação 27, em que se observa uma degradação do péptido entre cerca de 3 a cerca de 4% depois de armazenamento do GLP-2 durante o período de tempo.

29. A formulação de GLP-2 da reivindicação 28, em que se observa uma degradação do'péptido de menos de cerca de 2% depois de armazenamento da formulação de GLP-2 durante o período de tempo.

30. A formulação de GLP-2 de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a dita formulação: (a) cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml de um péptido GLP-2 ou um análogo derivado, tendo o análogo uma ou mais substituições, adições, delecções ou modificações de 6 aminoácidos e actividade de ligação ao receptor de GLP-2; (b) um tampão fosfato numa quantidade suficiente para ajustar o pH da formulação a um nivel farmacologicamente tolerável; (e) cerca de 0,5 a cerca de 1% de L-histidina; e (f) cerca de 2 a cerca de 5% de manitol.

31. A formulação de GLP-2 da reivindicação 30, em que o GLP-2 é h[Gly2]GLP-2.

32. A formulação de GLP-2 da reivindicação 31, em que a formulação é liofilizada.

33. A formulação de GLP-2 da reivindicação 31, em que o pH da formulação é seleccionado de entre o grupo que consiste em mais de 6,0 e entre cerca de 6,9 a cerca de 7,9.

34. A formulação de GLP-2 da reivindicação 33, em que o pH da formulação é entre cerca de 7,3 a cerca de 7,4.

35. Um método para preparar uma formulação liofilizada de GLP-2 compreendendo os seguintes passos: (a) a preparação de uma formulação de GLP-2 que compreende: (i) um péptido GLP-2 ou um análogo derivado, tendo o análogo uma ou mais substituições, adições, deleções ou modificações de aminoácidos, e actividade de ligação ao 7 receptor de GLP-2; (ii) um tampão fosfato numa quantidade suficiente para ajustar o pH da formulação a um nivel farmacologicamente tolerável; (iii) L-histidina; e (iv) um agente de volume seleccionado de entre o grupo que consiste em manitol e sacarose; (b) o congelamento da formulação a -40 °C; (c) a secagem da formulação num primeiro passo de secagem a -20 °C; e (d) a secagem da formulação num segundo passo de secagem a +20 °c.

36. 0 método da reivindicação 35, em que o pH da formulação de GLP-2 anterior à congelação é seleccionado de entre o grupo que consiste em mais de 6,0, e entre cerca de 6,9 a cerca de 7,9.

37. O método da reivindicação 36, em que o pH da formulação é entre cerca de 7,3 a cerca de 7,4.

38. O método da reivindicação 35, em que o procedimento de congelamento do passo (b) compreende: (a) o arrefecimento da formulação da temperatura ambiente até cerca de -1 °C, a cerca de 2 °C por minuto, seguido de manutenção da formulação a cerca de -1 °C durante cerca de 15 minutos; e (b) o arrefecimento da formulação de cerca de -1 °C até cerca de -40 °C, a cerca de 2 °C por minuto, seguido de manutenção da formulação a cerca de -40 °C durante 4 horas.

39. O método da reivindicação 35, em que o procedimento de secagem do passo (c) compreende: (a) o aumento da temperatura de cerca de -40 °C até cerca de -20 °C, a cerca de 2 °C por minuto; e (b) a manutenção da formulação a cerca de -20 °C durante cerca de 14 horas, sob condições de vácuo de 150 mT com uma temperatura de condensação de cerca de -80 °C.

40. O método da reivindicação 35, em que o procedimento de secagem do passo (d) compreende: (a) o aquecimento da formulação de cerca de -20 °C até cerca de +20 °C, a cerca de 2 °C por minuto; e (b) a manutenção da formulação a cerca de +20 °C durante cerca de 14 horas, sob condições de vácuo de cerca de 20000 mPa (150 mT) e uma temperatura de condensação de cerca de -80 °C, até restar menos de cerca de 5% de água na formulação.

41. O método da reivindicação 40, em que a formulação é mantida a cerca de +20 °C, sob condições de vácuo de cerca de 2 00 00 mPa (150 mT) e a uma temperatura de condensação de cerca de -80 °C, até não restar mais de cerca de 2% de água 9 na formulação.

42. Um kit que compreende: (a) uma formulação de GLP-2 liofilizada compreendendo: (i) um péptido GLP-2 ou um análogo derivado, tendo o análogo uma ou mais substituições, adições, deleções ou modificações de aminoácidos, e actividade de ligação ao receptor de GLP-2; (ii) um tampão fosfato numa quantidade suficiente para ajustar o pH da formulação a um nível farmacologicamente aceitável; (iii) L-histidina; e (iv) um agente de volume seleccionado de entre o grupo que consiste em manitol e sacarose; (b) um frasco de água esterilizada para reconstituição; e (c) instruções para a reconstituição.

43. 0 kit da reivindicação 42, em que o pH da formulação de GLP-2 é seleccionado de entre o grupo que consiste em mais de cerca de 5,5, mais de cerca de 6,0 e entre cerca de 6,9 e cerca de 7,9.

44. O kit da reivindicação 43, em que o pH da formulação é entre cerca de 7,3 e 7,4.

45. O kit da reivindicação 44, em que o péptido GLP-2 é 10 h [Gly2] GLP-2.

46. O kit da reivindicação 45 compreendendo ainda um dispositivo de injecção para administração.

47. 0 kit da reivindicação 46, em que, depois da reconstituição, a formulação de GLP-2 permanece estável durante pelo menos cerca de 12 horas.

48. 0 kit da reivindicação 46, em que, depois da reconstituição, a formulação de GLP-2 permanece estável durante pelo menos cerca de 24 horas.

49. A utilização da formulação de GLP-2, compreendendo: (a) um péptido GLP-2 ou um análogo derivado, tendo o análogo uma ou mais substituições, adições, deleções ou modificações de aminoácidos, e actividade de ligação ao receptor de GLP-2; (ii) um tampão fosfato numa quantidade suficiente para ajustar o pH da formulação a um nivel farmacologicamente tolerável; (iii) L-histidina; e (iv) um agente de volume seleccionado de entre o grupo que consiste em manitol e sacarose, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio, doença ou estado para o qual o tratamento com GLP-2 esteja indicado num ser humano ou num animal. 11

50. A utilização da reivindicação 49, em que o pH da formulação de GLP-2 é seleccionado de entre um grupo que consiste em mais de cerca de 5,5, mais de cerca de 6,0 e entre cerca de 6,9 e cerca de 7,9.

51. A utilização da reivindicação 50, em que o péptido GLP-2 é h[Gly2] GLP-2.

52. A utilização da reivindicação 51, em que o pH da formulação é de entre cerca de 7,3 e cerca de 7,4.

53. A utilização da reivindicação 52, em que o tratamento de GLP-2 é indicado para um distúrbio, doença ou estado gastrointestinal.

54. A utilização da reivindicação 53, em que a formulação de GLP-2 é adaptada para a administração por injecção.

55. A utilização da reivindicação 54, em que a formulação de GLP-2 é adaptada para administração por perfusão.

56. A formulação de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34 para utilização como medicamento. Lisboa, 14/05/2007