WO2022161554A1 - Composición farmacéutica que comprende el ghrp-6 - Google Patents

Composición farmacéutica que comprende el ghrp-6 Download PDF

Info

Publication number
WO2022161554A1
WO2022161554A1 PCT/CU2022/050001 CU2022050001W WO2022161554A1 WO 2022161554 A1 WO2022161554 A1 WO 2022161554A1 CU 2022050001 W CU2022050001 W CU 2022050001W WO 2022161554 A1 WO2022161554 A1 WO 2022161554A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ghrp
formulation
peptide
pharmaceutical composition
tartrate
Prior art date
Application number
PCT/CU2022/050001
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2022161554A4 (es
Inventor
Héctor Jesús SANTANA MILIÁN
Francisco HERNÁNDEZ BERNAL
Sonia Gonzalez Blanco
Yasser ZÁRATE RIVERA
Dania Mercedes BACARDÍ FERNÁNDEZ
Diana Garcia Del Barco Herrera
Yaima GONZALEZ GONZALEZ
Fidel Raul Castro Odio
Jorge Amador Berlanga Acosta
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Juan VALIENTE MUSTELIER
Original Assignee
Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia filed Critical Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority to US18/274,955 priority Critical patent/US20240139105A1/en
Priority to CA3209594A priority patent/CA3209594A1/en
Priority to CN202280022883.9A priority patent/CN117083056A/zh
Priority to JP2023545946A priority patent/JP2024504462A/ja
Priority to EP22717716.9A priority patent/EP4285891A1/en
Priority to MX2023009034A priority patent/MX2023009034A/es
Publication of WO2022161554A1 publication Critical patent/WO2022161554A1/es
Publication of WO2022161554A4 publication Critical patent/WO2022161554A4/es
Priority to ZA2023/07499A priority patent/ZA202307499B/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention is related to the pharmaceutical industry and biomedicine, with the pharmaceutical formulation of peptides and proteins to improve their safety profile.
  • the invention is related to obtaining pharmaceutical compositions of growth hormone releasing peptide 6 (abbreviated GHRP-6, from the English Growth Hormone Releasing Peptide 6). It discloses pharmaceutical formulations of the peptide, suitable for administration by the parenteral route.
  • GHRP-6 growth hormone releasing peptide 6
  • GHRP-6 is one of the most studied molecules in the family of growth hormone secretagogues (Casanueva and Dieguez, Trends Endocrinol. Metab. 1999, 10:30-38). Its amino acid sequence is His-Trp-Ala-Trp-Phe-Lys-NH 2 , where the second and fifth amino acids are D amino acids. It is a synthetic peptide analogue of intestinal met-enkephalin and gastric ghrelin, and also competes with these agents for somatotrophic adenohypophyseal receptors.
  • G-protein-coupled receptor known as the growth hormone secretagogue receptor (GHS-R1a), whose natural ligand is ghrelin (Kojima et al., Nature 1999, 402: 656-660). ). Additional binding sites for GHRP-6 have been shown to exist in non-endocrine tissues through its binding to the CD36 receptor, which belongs to the B-type “scavenger or scavenger” receptor family (Bodart et al., Gire Res. 1999, 85:796-802).
  • GHRP-6 has shown a potent cytoprotective effect (Murriel and Mochly, Arch. Biochem. Brophys. 2003, 420: 246-254). Preliminary evidence suggests the possibility that the mechanism by which tissue damage is attenuated is related to the control of the cellular redox environment. Another form of cell death, such as apoptosis, also appears to be prevented by GHRP-6 (Colonna et al., Eur. J. Pharmacol. 1997, 334: 201-207; Cibrián et al., Clin. Sci. 2006, 110: 563-573).
  • GHRP-6 has been administered parenterally, mainly intravenously, to humans with the aim of inducing growth hormone release.
  • the doses used intravenously in humans have ranged between 1 and 2 ⁇ g/kg of weight (Leal-Cerro et al., Eur. J. Endocrinol., 1995, 132 (6): 712-715; Loche et al. , J. Clin. Endocrinol. Metab., 1995, 80 (2): 674-678).
  • pharmacological studies suggest that the therapeutic dose of GHRP-6 is much higher, in the order of 100 times more.
  • the reported therapeutic dose in a model of acute myocardial infarction in pigs was 400 ⁇ g/kg (Berlanga et al., Clin. Sel. 2007, 112: 241-250), which represents a dose between 200 and 400 times greater than that used in the 1990s in humans.
  • the therapeutic dose of GHRP-6 reported in a model of ischemic cerebral infarction in Mongolian Gerbil was of the order of 600 ⁇ g/kg (Subiros et al., Neurol. Res., 2016, 38 (3): 187-195). In the latter case, GHRP-6 was used in combination with EGF.
  • GHRP-6 GHRP-6
  • doses equal to or less than 2 pg/kg are referred to as safe.
  • much higher doses are required, ranging from 50 to 600 pg/kg.
  • a high safety profile of the product is particularly necessary in the treatment of patients with acute myocardial infarction and stroke.
  • a particular problem with formulations comprising peptides or proteins at high concentrations is their tendency to aggregation. As a consequence of the aggregation, precipitation of the product may occur during storage, which may impact the reproducibility of the dose administered to the patients. patients. In addition, embolism may occur during parenteral administration of solutions containing particles.
  • Another general problem with pharmaceuticals is that adverse effects and/or toxicity may be encountered during the treatment of patients. These unwanted events can be very vahados, depending on the characteristics of the active ingredient (metabolism, binding to proteins, etc.), the formulation, the route of administration and the characteristics of the patients, among others (Ajayi et al., J. Clin. Pharmacol., 2000, 40(10): 1093-1101; Choonara et al., Paediatr. Perinat. Drug The, 2001, 5: 12-18).
  • the preparation of concentrated peptide formulations that achieve an adequate therapeutic effect, while keeping the adverse effect profile to a minimum during parenteral use, represents a challenge. It is necessary to develop a particular formulation for each peptide, since each one has a unique in vivo behavior.
  • the present invention solves the above problem by providing a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising GHRP-6, tartrate pH buffer at pH 5.0-6.0 and trehalose.
  • GHRP-6 has an amino acid sequence identified as SEQ ID No. 1 in the Sequence Listing.
  • This composition which is revealed in the invention for the first time, has a high safety profile, minimizing the adverse and toxic events found for a previous formulation, both in animals and in humans.
  • the formulation of the invention showed no signs of acute toxicity, nor the appearance of adverse effects in animals as a result of the application of doses up to 100 times higher than the therapeutic dose, of 400 pg/kg of weight.
  • the formulation of the invention also did not show signs of toxicity at the systemic level during the repeated administration of up to 50 times the therapeutic dose (14 consecutive administrations).
  • bradycardia occurred in individuals who received doses of 50 pg/kg and 100 pg/kg.
  • bradycardia can cause serious problems when the peptide is administered as a drug, particularly in patients suffering from pathologies such as acute myocardial infarction or ischemic cerebral infarction.
  • the GHRP-6 formulation of the invention administered intravenously in patients suffering from myocardial infarction, showed no signs of toxicity and no bradycardia was reported after application of doses up to 100 pg/kg.
  • the GHRP-6 peptide is in a concentration between 1.0 mg/mL and 10 mg/mL in the pharmaceutical composition.
  • the chemical stability of GHRP-6 was studied only at low concentrations (approximately 100 pg/mL), in relation to pH/buffer system, ionic strength, and temperature (Ha et al., Int J. Pharm. 1996, 144: 91-97).
  • stability of GHRP-6 was achieved at high concentrations, 2.5 mg/mL and 10 mg/mL (25 times-100 times higher than the referred report); and in the presence of components where the stability of the peptide had not been evaluated.
  • the pharmaceutical composition disclosed in the invention despite the high concentration of the peptide, exhibits high stability during storage under refrigerated conditions (5 + 3 °C). It also has high stability at room temperature (25 ⁇ 2 °C), which allows the cold chain to be eliminated during drug distribution.
  • the buffer has a concentration between 10 mmol/L and 100 mmol/L.
  • the tartrate buffers that can be used are basically all the physiologically tolerated ones that are suitable for reaching the desired pH values, such as sodium or potassium tartrate salts or a mixture of both.
  • the buffer preferably consists of one or more tartrate salts and/or the free acid thereof (for example tartaric acid, sodium bitartrate, potassium bitartrate, disodium tartrate anhydrous, disodium tartrate dihydrate, potassium disodium tartrate tetrahydrate, potassium tartrate calcium).
  • the tartrate buffer is made up of a sodium or potassium salt, or a mixture of both.
  • the stabilizing compound, trehalose is in the range between 2% and 10% (m/v).
  • the trehalose employed is in the D-form (+), and in the dihydrate form.
  • the formulation of the present invention may be in liquid or freeze-dried form.
  • concentrations of peptide, buffer, and stabilizing agent refer to a composition that is in liquid form or that results from resuspending a lyophilisate.
  • the lyophilization process occurs after the sterilization process (for example, by filtration).
  • the lyophilization process removes the solvent used in the system (for example, water for injection) to levels below 5%, and even reduces it to values below 3% residual moisture.
  • Said process provides a GHRP-6 composition that can be stored at room temperature for extended periods of time.
  • the formulation is capable of retaining stability during storage, under the action of shear forces acting during preparation, transportation and also under storage at elevated temperatures.
  • an aqueous solution of trehalose in tartrate buffer is prepared, then the GHRP-6 is dissolved in the previous solution, and optionally the formulation can be lyophilized.
  • the lyophilized composition described herein is easily reconstituted once in contact with a sufficient quantity of a pharmaceutically acceptable solvent.
  • the lyophilized composition is reconstituted in less than 2 minutes.
  • Appropriate diluents include: water for injections, physiological saline, aqueous media in the presence of buffers, optionally buffer solutions in the presence of sugars, vitamins, synthetic polymers.
  • the diluent is water for injection.
  • the lyophilized composition can be reconstituted to produce a composition having the desired therapeutic concentration.
  • the invention comprises the use of the pharmaceutical composition comprising GHRP-6, tartrate buffer at pH 5.0-6.0 and trehalose for the manufacture of a medicament.
  • the medicine that includes GHRP-6 together with other components is useful as a cytoprotector in the treatment of damaged tissues due to the lack of blood supply. Therefore, in one embodiment of the invention, the medicament comprising the indicated GHRP-6 formulation is used as a cytoprotective, cardioprotective, cardiorestorative, neuroprotective or brain damage restorer.
  • the medicament is a kit of parts further comprising a second pharmaceutical composition. Therefore, a kit of parts comprising the pharmaceutical composition comprising GHRP-6, tartrate buffer at pH 5.0-6.0 and trehalose is also an object of the invention.
  • the invention discloses a method for the treatment of an individual in need where a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising GHRP-6, the tartrate pH regulating buffer at pH 5.0-6, is administered. 0 and trehalose.
  • the pharmaceutical composition is administered by routes that are known to those skilled in this field of the art.
  • the pharmaceutical composition comprising GHRP-6 is administered intravenously, subcutaneously, or intramuscularly.
  • FIG. 1 Reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) profiles of GHRP-6 lyophilized in the presence of different excipients at 3% (m/v), in two buffers at 25 mmol/L, and at pH 5, 5.
  • LVEF Left ventricular ejection fraction
  • GHRP-6 was used as the active pharmaceutical ingredient (API), which has an amino acid sequence that is identified as SEQ ID NO: 1 in the Sequence List. It was obtained by step-by-step solid phase linear peptide synthesis methodology (Atherton and Sheppard, 1989. Solid phase peptide synthesis: a practical approach, in: Coligan, J., Dunn, B., Ploegh, H. (Eds.), Current Protocols in Protein Science, IRL Press, Oxford). The identity of the peptide batches was confirmed by electrospray mass spectrometry (ESI-MS), and the percent intact peptide fraction was determined by RP-HPLC, which was greater than 98.0%.
  • API active pharmaceutical ingredient
  • Example 1 Obtaining a liquid formulation of GHRP-6 in sodium citrate/chloride.
  • the pH value of pharmaceutical formulations is relevant for their administration by the parenteral route.
  • the citrate-phosphate buffer (cithco acid/Na 2 HP0 4 ) was used at a concentration of 100 mmol/L, at pH values between 4.0 and 8, 0.
  • the IFA was dissolved until reaching the desired concentration of 2.5 mg/mL.
  • the formulations were sterilized by filtration (through 0.22 pm filters) and dispensed into 2R vials at a rate of 1.0 mL per vial. Representative samples of the different formulations were incubated at 60 °C, and peptide stability was evaluated by RP-HPLC after storage at that temperature for different time intervals.
  • the percentage of the intact peptide fraction was evaluated in RP-HPLC on a C18 column (4.6 x 150 mm, 5 pm) (Vydac, USA).
  • a mobile phase used the mixture of a solution of water for injection with 0.1% v/v thfluoroacetic acid (TFA) (solution A), and acetonitrile with 0.05% v/v TFA (solution B).
  • TFA v/v thfluoroacetic acid
  • solution B acetonitrile with 0.05% v/v TFA
  • the concentration of GHRP-6 was determined by the Lambert-Berr law, based on the absorbance reading at 280 nm and the mass extinction coefficient (s 1% 280 nm) of 146.8 mLmg' 1 cm' 1 , determined experimentally.
  • the highest RP-HPLC purity values were achieved at pH 6.0.
  • the stability of the peptide was studied at the same pH in sodium acetate, sodium citrate, sodium phosphate and sodium citrate-phosphate buffers, at buffer concentrations of 25, 50 and 100mmol/L.
  • a catalytic effect of the buffers was observed in the degradation of the peptide, with the increase in the concentration of the buffers the purity of the peptide decreased.
  • sodium acetate buffer no catalytic effect was observed.
  • the highest purity values of the peptide, according to the RP-HPLC analysis were observed with the use of sodium citrate buffer at pH 6.0 and at a concentration of 25 mmol/L.
  • composition of the formulation to be evaluated during the scale-up and the stability study was as follows: GHRP-6 at 2.5 mg/mL, sodium citrate buffer at 25 mmol/L and pH between 5, 7 and 6.3; and sodium chloride at 6 mg/mL as isotonizing agent.
  • GHRP-6 formulation components at 2.5 mg/mL GHRP-6 2.5 g; citric acid 4.8g; sodium chloride 6.0 g and water for injection sufficient for 1.0 L.
  • the IFA constituted by GHRP-6 All the components of the formulation, except the IFA constituted by GHRP-6, were measured and dissolved with water for injection. The pH of the solution was checked and adjusted to the value of 6.0 ⁇ 0.3 with NaOH at 1.0 mol/L. The IFA was added until reaching the desired concentration (2.5 mg/mL) in that solution. Next, the formulation was sterilized by filtration (through 0.22 pm filters), in a class 100 area. Next, the sterile liquid formulation was dispensed into vials to which the caps and seals were placed, respectively, in a class 100 area. Samples of the three batches were placed in a cold room, at a controlled temperature (5 + 3 °C), and in an incubator (for accelerated stability study) at 25 ⁇ 2 °C.
  • samples were drawn to analyze critical quality attributes: product appearance, GHRP-6 purity measured by RP-HPLC, GHRP-6 identity measured by ESI-MS, peptide concentration determined by absorbance at 280nm, pH, sterility and pyrogenicity. Analytical tests were performed as described above, or as described in the SP-United States Pharmacopeia monograph.
  • Example 2 Preclinical toxicology studies carried out on the liquid formulation of GHRP-6 in sodium citrate/chloride.
  • Example 1 the liquid formulation of GHRP-6 in sodium citrate/chloride described in Example 1 was used, consisting of GHRP-6 at 2.5 mg/mL, sodium citrate buffer at 25 mmol/L and pH between 5.7 and 6.3; and sodium chloride at 6 mg/mL as isotonizing agent.
  • the formulation was applied intraperitoneally on days 1 and 2 of the experimental phase, according to the design shown in Table 2.
  • the parameters evaluated were body weight, food consumption, clinical and macroscopic observations, as well as histopathological study of the organs of interest. Table 2. Distribution by groups of animals and doses of the peptide used.
  • the study design is summarized in Table 3.
  • the Satellite group was administered the highest dose used in the study, with the aim of evaluating the reversibility of the potential effects, and the animals of the same were sacrificed twice as long as the rest of the animals. Fourteen consecutive administrations were performed, once daily for two weeks, intraperitoneally, in all the treatment groups formed. The parameters evaluated were body weight, food consumption, clinical and macroscopic observations, as well as histopathological study of the organs of interest. In addition, hematology and biochemistry determinations were made, as well as absolute and relative weight of organs. All the organs of each animal were also studied in histopathology. Table 3. Distribution by groups of animals of the study treatments.
  • a total of 18 female animals were used, which formed 6 groups of 3 animals each. Five successive intravenous administrations were performed, one every 72 hours.
  • the distribution of the groups of animals by treatment was: Group I: untreated, Group II: placebo, Group III: SD of GHRP-6 (400 pg/kg), Group IV: 5 times the SD of GHRP-6 (2000 pg/kg), Group V: 10 times the DT of GHRP-6 (4000 pg/kg) and Group VI: Satellite, 10 times the DT of GHRP-6 (4000 pg/kg).
  • the parameters evaluated were body weight, food consumption, clinical and macroscopic observations, as well as histopathological study of the organs of interest. The results showed that the repeated administration of the GHRP-6 formulation in sodium citrate/chloride is well tolerated at the doses evaluated, and that the adverse events found do not constitute signs of toxicity.
  • Example 3 Dose study of the liquid formulation of GHRP-6 in sodium citrate/chloride in healthy volunteers.
  • GHRP-6 was evaluated in the liquid formulation containing sodium citrate/chloride developed in Example 1.
  • the formulation contained: GHRP- 6 to 2.5 mg/mL, sodium citrate buffer at 25 mmol/L and pH between 5.7 and 6.3; and sodium chloride at 6 mg/mL as isotonizing agent.
  • the peptide is administered a single dose intravenously in 6 dose scales: 1, 10, 50, 100, 200 and 400 pg/kg of weight.
  • the sample consisted of 18 healthy subjects, male, aged between 18 and 35 years, with a body weight within normal limits and who voluntarily agreed to participate in the research. At each level of dose escalation, 3 subjects were treated, with advancement to the next level dependent on the absence of toxicity (serious adverse event).
  • Bradycardia 0 (0.0%) 0 (0.0%) 1 (33.3%) 2 (66.7%) 2 (66.7%) 3 (100.0%)
  • Tachycardia 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 1 (33.3%)
  • Example 4 Obtaining a new formulation of GHRP-6.
  • the peptide is stable in the pH range between 5.0 and 6.0, tartrate, succinate and histidine buffers were studied, which have good buffering capacity to regulate pH in this range of values. Buffers were prepared at a final concentration of 50 mmol/L. To prepare the tartrate buffer, tartaric acid was used, the histidine buffer was prepared from the histidine-HCI reagent, and the pH was adjusted between 5.0 and 6.0 with NaOH at 1.0 mol/L in both cases. . The succinate buffer was prepared in the same way as the tartrate buffer, from succinic acid and NaOH.
  • IFA GHRP-6
  • the stirring time was less than one hour at 25 ⁇ 2 °C.
  • the concentration of GHRP-6 was 2.5 mg/mL, determined by absorbance at 280 nm.
  • the samples were then sterilized by filtration (on 0.22 pm filters) under aseptic conditions.
  • To evaluate the stability of the peptide the samples were placed in an incubator under stress conditions at 60 ⁇ 2 °C for 28 days. The percentage of intact peptide fraction, peptide concentration and pH were evaluated according to the methods described above.
  • the stability of GHRP-6 increased with increasing pH in the succinate buffer in the evaluated range (5.0-6.0).
  • the highest stability in succinate was reached at pH 6.0; where 74.31% purity of the peptide was found after
  • the formulation was stored for 28 days at 60 °C. Peptide purity was lower than that achieved under the same conditions for tartrate and histidine buffers.
  • Table 5 shows the results of the stability study of GHRP-6 for the tartrate and histidine buffers, and shows that the purity value in RP-HPLC in the sodium tartrate buffer was higher than that found for Histidine-HCI, at a pH between 5.5 and 6.0.
  • composition of the lyophilized formulation that was evaluated during the scale-up and stability study was: GHRP-6 peptide at 2.5 mg/mL, sodium tartrate buffer at 25 mmol/L; pH 5.0 to 6.0; and trehalose at 3% (m/v), as a stabilizing and isotonizing agent.
  • Example 5 Scale-up and stability study of liquid formulations of GHRP-6 in tartrate/trehalose.
  • Two liquid formulations of GHRP-6 were developed containing tartaric acid 3.75 g/L, ⁇ , ⁇ -trehalose dihydrate 33.16 g/L, water for injection in the amount enough for 1.0 L.
  • the peptide was at a concentration of 2.5 mg/mL and in the other it was at 10.0 mg/mL.
  • Table 7 shows the results of the stability study of the liquid formulation of GHRP-6. As can be seen, during storage for two years at 5 ⁇ 3 °C, the percentage of the intact peptide fraction remained above 97% at a concentration of 2.5 mg/mL; and above 98% at 10.0 mg/mL.
  • GHRP-6 at 2.5 mg/mL GHRP-6 at 10.0 mg/mL
  • Example 6 Scale-up and stability study of lyophilized formulations of GHRP-6 in tartrate/trehalose.
  • a conventional lyophilization cycle was used (Santana et al., Biologicals 2014, 42: 322-333). Using the procedure described, three batches of the lyophilized formulation of GHRP-6 in tartrate/trehalose were manufactured at each strength of GHRP-6 (2.5 or 10.0 mg/vial). Batch samples were placed in a cold room at a controlled temperature (5 ⁇ 3°C) or in an incubator at 25 ⁇ 2°C. At certain time intervals, samples of the lyophilized formulation were analyzed. The stability study at 25 ⁇ 2 °C was carried out for 6 months. The critical quality attributes and analytical methods evaluated were similar to those described above.
  • Table 8 shows the stability results of the lyophilized formulations of GHRP-6. During storage for 2 years at 5 ⁇ 3 °C, the percentage of the intact peptide fraction remained above 99% for both presentations (2.5 mg/vial and 10.0 mg/vial). The concentration of the peptide, the residual moisture and the pH of all the samples corresponding to both formulations were maintained at adequate values during the interval studied.
  • the mean value and standard deviation are displayed.
  • the percentage of the intact GHRP-6 fraction remained above 99.4% for both presentations.
  • the concentration of the peptide, the residual moisture and the pH of all the samples were maintained at adequate values during the interval studied.
  • the appearance, subvisible particle count, sterility, pyrogen and identity tests by ESI-MS were satisfactory for all batches at the beginning and end of the study for the two concentrations of the peptide, and at the two temperatures studied.
  • Example 7 Evaluation of the biological activity of the formulation of GHRP-6 in tartrate/trehalose in an animal model.
  • the in vivo biological activity of two GHRP-6 formulations containing the peptide at a concentration of 2.5 mg/mL was evaluated. For this, they used samples of the GHRP-6 formulation in citrate/NaCl (developed in Example 1) and of the GHRP-6 formulation in tartrate/trehalose, prepared as described in Example 5, where the peptide was at 2.5 mg/mL. As a control, the corresponding placebos of each formulation were also evaluated, prepared in the same way, but without adding the GHRP-6 peptide.
  • the inotropic activity of the peptide was evaluated in male Balb/c mice (6 animals per group). A 100 ⁇ g/kg dose of the GHRP-6 formulations or the equivalent volume of the placebos was administered intraperitoneally. For each group, echocardiograms were obtained at time zero, and every 5 min after administration up to 15 min, under the same monitoring, temperature, and sedation conditions.
  • Two-dimensional M-mode ultrasound images were obtained with a high-resolution imaging system (Vevo 770TM, Visual Sonics Inc.).
  • the system was equipped with a 40 MHz linear staggered-array transducer, with data acquisition at rates of up to 250 frames per second with an axial resolution of up to 30 microns between focal zones.
  • Data processing and analysis were performed using the Vevo 770 software application (version 3.0.0, Visual Sonics Inc.), in a view of the long parasternal axis at an angle of 45° and the caudal angulation of the platform.
  • LVEF Left ventricular ejection fraction
  • Figure 2 shows that for the animals treated with the peptide in the tartrate/trehalose formulation, the LVEF increased significantly over time, and remained increased for at least the 15 min studied. this effect it was not observed in the animals treated with the placebo of said formulation. LVEF was higher for animals receiving the tartrate/trehalose formulation compared to animals treated with the other peptide formulation.
  • the formulation of GHRP-6 in tartrate/trehalose presented greater inotropic activity in the animal model used.
  • Example 8 Preclinical toxicology studies of a formulation of GHRP-6 in tartrate/trehalose.
  • the lyophilized formulation containing sodium tartrate, trehalose, and 5 mg GHRP-6 per vial was reconstituted and subjected to toxicology studies in the following animal models.
  • Table 9 Distribution by groups of animals and doses of the peptide used.
  • a total of 18 female animals were used, which formed 6 groups of 3 animals each. Five successive administrations were carried out intravenously, one every 72 hours.
  • the distribution of the groups of animals by treatment was: Group I: untreated, Group II: placebo, Group III: DT of GHRP-6, 400 pg/kg, Group IV: 5 times the DT of GHRP-6, 2000 pg /kg, Group V: 10 times the DT of GHRP-6, 4000 pg/kg and Group VI: 10 times the DT of GHRP-6, 4000 pg/kg.
  • Example 9 Evaluation of the safety of the formulation of GHRP-6 in tartrate/trehalose in patients with acute myocardial infarction.
  • the lyophilized formulation of GHRP-6 containing sodium tartrate, trehalose, and 5 mg of GHRP-6 per vial was used in this study.
  • a phase I-B (exploratory), prospective, multicenter, open-label, randomized clinical trial was conducted in patients with acute myocardial infarction who underwent primary percutaneous transluminal coronary angioplasty.
  • the peptide was randomly administered at a dose of 50 or 100 pg/Kg of patient weight, intravenously, as a bolus.
  • the first dose was administered at the time of the patient's inclusion in the study.
  • the administration was continued every 12 hours for 7 days, up to a total of 14 administrations of the peptide.
  • the sample consisted of 19 patients of both sexes, over 30 years of age, who voluntarily participated in the research.
  • the primary objective of the study was to evaluate the safety of the lyophilized formulation containing GHRP-6.
  • Table 11 presents a summary of the adverse events registered with the intention of comparing them with those found in the dose escalation study in healthy volunteers, carried out with the formulation of GHRP-6 in citrate/NaCl. Said table shows that in this study the adverse events produced by the formulation of citrate/NaCI reflected in Example 3 were not observed. The rest of the events reported were of mild or moderate intensity, most of them had a low ratio of causality with the peptide under study and were attributed to the underlying disease of the patients. Table 11. Frequency of individuals with adverse events according to dose group.
  • Bradycardia 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
  • Tachycardia 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
  • the clinical evaluation of the formulation of GHRP-6 in tartrate/trehalose showed that it does not produce bradycardia, which allows its use in the treatment of patients suffering from cardiovascular or cerebrovascular diseases, while having the stability required by at least two years at a high concentration of the peptide.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Composición farmacéutica que comprende el péptido liberador de la hormona de crecimiento 6 (GHRP-6), el tampón tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa como agente estabilizante; así como el uso de esta composición para la fabricación de un medicamento. La invención también provee un kit de partes que comprende dicha composición farmacéutica y un método de tratamiento de un individuo que lo necesita donde se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende el péptido liberador de la hormona de crecimiento 6 (GHRP-6), el tampón tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE COMPRENDE EL GHRP-6
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con la industria farmacéutica y la biomedicina, con la formulación farmacéutica de péptidos y proteínas para mejorar su perfil de seguridad. En particular, la invención se relaciona con la obtención de composiciones farmacéuticas del péptido liberador de la hormona de crecimiento 6 (abreviado GHRP-6, del inglés Growth Hormone Releasing Peptide 6). Revela formulaciones farmacéuticas del péptido, adecuadas para su administración por ruta parenteral.
Estado de la técnica anterior
El GHRP-6 es una de las moléculas más estudiadas en la familia de los secretagogos de la hormona de crecimiento (Casanueva y Dieguez, Trends Endocrinol. Metab. 1999, 10: 30-38). Su secuencia de aminoácidos es His-Trp-Ala- Trp-Phe-Lys-NH2, donde el segundo y el quinto aminoácido son D aminoácidos. Es un péptido sintético análogo de la met-encefalina intestinal y de la ghrelina gástrica, así mismo compite con estos agentes por los receptores adenohipofisiarios somatotróficos. Estos péptidos actúan a través del receptor acoplado a proteína-G conocido como receptor de los secretagogos de la hormona de crecimiento (GHS- R1 a), cuyo ligando natural es la ghrelina (Kojima y cols., Nature 1999, 402: 656- 660). Se ha demostrado que existen sitios de unión adicionales para el GHRP-6 en tejidos no endocrinos, a través de su unión al receptor CD36, el cual pertenece a la familia de receptores “scavengers o eliminadores” tipo B (Bodart y cois., Gire. Res. 1999, 85:796-802).
En estudios realizados en modelos animales de isquemia/reperfusión, el GHRP-6 ha mostrado un potente efecto citoprotector (Murriel y Mochly, Arch. Biochem. Brophys. 2003, 420: 246-254). Evidencias preliminares sugieren la posibilidad de que el mecanismo por el cual los daños tisulares se atenúan se relacione con el control del ambiente redox celular. Otra forma de muerte celular, como la apoptosis, también parece ser prevenida por el GHRP-6 (Colonna y cols., Eur. J. Pharmacol. 1997, 334: 201-207; Cibrián y cois., Clin. Sci. 2006, 110: 563-573). Se ha evidenciado su efecto beneficioso sobre la función cardiovascular, en enfermedades como el infarto del miocardio y la cardiopatía isquémica (Berlanga y cois., Clin. Sci. 2007, 112: 241- 250; Berlanga y cols., Clin. Med. Insights Cardiol. 2017, 11: 1-9). Por otra parte, la combinación de GHRP-6 con el factor de crecimiento epidérmico (EGF) ha resultado una terapia prometedora en el tratamiento del infarto cerebral isquémico (Subiros y cols., Neurol. Res., 2016, 38 (3): 187-195).
El GHRP-6 ha sido administrado en humanos por vía parenteral, principalmente por vía intravenosa, con el objetivo de inducir la liberación de la hormona de crecimiento. Las dosis empleadas por vía intravenosa en humanos han oscilado entre 1 y 2 |ig/kg de peso (Leal-Cerro y cols., Eur. J. Endocrinol., 1995, 132 (6): 712- 715; Loche y cols., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1995, 80 (2): 674-678). Para nuevas aplicaciones en humanos, por vía parenteral, estudios farmacológicos sugieren que la dosis terapéutica del GHRP-6 es mucho mayor, en el orden de 100 veces más. La dosis terapéutica reportada en un modelo de infarto agudo de miocardio en cerdos fue de 400 |ig/kg (Berlanga y cois., Clin. Sel. 2007, 112: 241-250), lo que representa una dosis entre 200 y 400 veces mayor que la empleada en la década de los 90 en humanos. Por otra parte, la dosis terapéutica del GHRP-6 reportada en un modelo de infarto cerebral isquémico en Gerbil de Mongolia (Meriones unguiculatus) fue del orden de 600 |ig/kg (Subiros y cols., Neurol. Res., 2016, 38 (3): 187-195). En este último caso, el GHRP-6 se utilizó en combinación con el EGF.
En cuanto a la seguridad en humanos, durante la administración del GHRP-6 por vía intravenosa, se refieren como seguras la dosis ¡guales o inferiores a 2 pg/kg. Sin embargo, para lograr un uso eficaz del péptido en el tratamiento del infarto agudo del miocardio y el infarto cerebral isquémico se requieren dosis mucho mayores, en un rango de 50 a 600 pg/kg. Además, para dicho propósito, es necesario obtener una formulación del GHRP-6 a una alta concentración (de 1 ,0 a 10,0 mg/mL) que mantenga la calidad, estabilidad y las propiedades terapéuticas, al tiempo que minimice los efectos adversos y/o tóxicos. Un elevado perfil de seguridad del producto es particularmente necesario en el tratamiento de pacientes con infarto agudo del miocardio y accidente cerebrovascular.
Un problema particular de las formulaciones que comprenden péptidos o proteínas a altas concentraciones es su tendencia a la agregación. Como consecuencia de la agregación, puede ocurrir la precipitación del producto durante el almacenamiento, lo cual puede impactar en la reproducibilidad de la dosis administrada a los pacientes. Además, puede ocurrir embolismo durante la administración parenteral de soluciones que contienen partículas.
Otro problema general de los productos farmacéuticos es que pueden encontrarse efectos adversos y/o toxicidad durante el tratamiento de los pacientes. Estos eventos indeseados pueden ser muy vahados, en dependencia de las características del principio activo (metabolismo, unión a proteínas, etc.), de la formulación, la vía de administración y las características de los pacientes, entre otros (Ajayi y cols., J. Clin. Pharmacol., 2000, 40 (10): 1093-1101; Choonara y cois., Paediatr. Perinat. Drug The , 2001, 5: 12-18). La preparación de formulaciones concentradas de péptidos que logren un efecto terapéutico adecuado, al tiempo que mantengan en el mínimo el perfil de efectos adversos durante el uso por vía parenteral, representa un reto. Es necesario desarrollar una formulación particular para cada péptido, debido a que cada uno tiene un comportamiento in vivo único.
Por tanto, es necesaria la obtención de una composición farmacéutica estable del GHRP-6, que posea la concentración del péptido requerida para su administración como agente terapéutico en vahas afecciones, a la vez que exhiba el perfil de seguridad demandado en humanos.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes planteado al proveer una composición farmacéutica que comprende el GHRP-6, el tampón regulador de pH tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa. El GHRP-6 posee una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 1 en la Lista de Secuencias. Esta composición, que se revela en la invención por primera vez, presenta un elevado perfil de seguridad, minimizando los eventos adversos y tóxicos encontrados para una formulación precedente, tanto en animales como en humanos.
Al evaluar en ratas una formulación de GHRP-6 que comprendía el tampón citrato a pH 6,0 y cloruro de sodio, como agente isotonizante, se encontraron elementos de toxicidad aguda cuando se administró una dosis de péptido que es 50 veces la dosis terapéutica de 400 pg/kg. En este estudio toxicológico se reportaron cambios en las glándulas adrenales, consistentes en áreas focales de necrosis a nivel de la zona fascicular con presencia de células tumefactas y esteatosis macrovesicular. Estos signos se relacionaban con la administración de altas dosis del GHRP-6 en la formulación citrato/NaCI. Sorprendentemente, en estudios de toxicología en ratas la formulación de la invención no mostró signos de toxicidad aguda, ni aparición de efectos adversos en los animales como consecuencia de la aplicación de dosis hasta 100 veces superiores a la dosis terapéutica, de 400 pg/kg de peso. La formulación de la invención tampoco mostró signos de toxicidad a nivel sistémico durante la administración de hasta 50 veces la dosis terapéutica de forma repetida (14 administraciones consecutivas). Además, hubo buena tolerancia local al administrar hasta 10 veces la dosis terapéutica en un modelo en conejos, ampliamente utilizado para la evaluación toxicológica de fármacos.
Por otro lado, al realizar un escalado de dosis en voluntarios sanos de la formulación de GHRP-6 que contenía el tampón citrato a pH 6,0 y cloruro de sodio, como agente isotonizante, se produjo bradicardia en individuos que recibieron las dosis de 50 pg/kg y de 100 pg/kg. Clínicamente, la bradicardia puede traer serios problemas cuando se administra el péptido como medicamento, particularmente en pacientes aquejados de patologías como el infarto agudo de miocardio o el infarto cerebral isquémico. Sorprendentemente, la formulación de GHRP-6 de la invención, administrada por vía intravenosa en pacientes que sufrieron infarto del miocardio, no mostró signos de toxicidad ni se reportó bradicardia tras la aplicación de dosis de hasta 100 pg/kg.
En una materialización de la invención, el péptido GHRP-6 está en una concentración entre 1 ,0 mg/mL y 10 mg/mL en la composición farmacéutica. En la década de los 90, se estudió la estabilidad química del GHRP-6 solo a bajas concentraciones (aproximadamente 100 pg/mL), en relación con el pH/sistema tampón, la fuerza iónica y la temperatura (Ha y cols., Int. J. Pharm. 1996, 144: 91- 97). De forma contrastante, en la presente invención se logró estabilidad del GHRP- 6 a altas concentraciones, de 2,5 mg/mL y 10 mg/mL (25 veces-100 veces superior al reporte referido); y en presencia de componentes donde la estabilidad del péptido no había sido evaluada.
La composición farmacéutica que se revela en la invención, a pesar de la alta concentración del péptido, presenta una elevada estabilidad durante el almacenamiento en condiciones refrigeradas (5 + 3 °C). También posee una alta estabilidad a temperatura ambiente (25 ± 2 °C), lo que permite eliminar la cadena de frío durante la distribución del medicamento. En una realización de la invención el tampón tiene una concentración entre 10 mmol/L y 100 mmol/L. Los tampones tartrato que pueden ser empleados son básicamente todos los fisiológicamente tolerados que son apropiados para alcanzar los valores de pH deseados, tales como las sales de tartrato de sodio, potasio o mezcla de ambos. El tampón consiste preferiblemente en una o más sales de tartrato y/o el ácido libre de las mismas (por ejemplo ácido tartárico, bitartrato de sodio, bitartrato de potasio, tartrato disódico anhidro, tartrato disódico dihidratado, tartrato disódico y potasio tetrahidrato, tartrato de calcio). En una realización particular el tampón tartrato está formado por una sal de sodio, de potasio, o una mezcla de ambos.
En una materialización de la invención el compuesto estabilizante, trehalosa, está en el rango entre 2% y 10% (m/v). Preferiblemente, la trehalosa empleada está en la forma-D (+), y en forma dihidrato.
La formulación de la presente invención puede presentarse en forma líquida o secada por liofilización. Por tanto, las concentraciones del péptido, del tampón, y del agente estabilizante se refieren a una composición que está en forma líquida o que resulta de resuspender un liof ilizado.
El proceso de liofilización ocurre después del de esterilización (por ejemplo, mediante filtración). El proceso de liofilización remueve el solvente empleado en el sistema (por ejemplo, agua para inyección) hasta niveles inferiores al 5%, e incluso lo reduce hasta valores inferiores al 3% de humedad residual. Dicho proceso proporciona una composición de GHRP-6 que puede ser almacenada a temperatura ambiente por periodos de tiempo prolongados. La formulación es capaz de retener la estabilidad durante el almacenamiento, bajo la acción de fuerzas de cizallamiento que actúan durante la preparación, transportación y también bajo el almacenamiento a elevadas temperaturas.
En una realización preferida de la invención, se prepara una disolución acuosa de la trehalosa en el tampón tartrato, luego se realiza la disolución del GHRP-6 en la solución anterior, y opcionalmente se puede liof ilizar la formulación. La composición liofilizada descrita aquí se reconstituye fácilmente una vez en contacto con una suficiente cantidad de un disolvente farmacéuticamente aceptable. La composición liofilizada se reconstituye en un tiempo inferior a 2 minutos. Los diluyentes apropiados incluyen: agua para inyección, solución salina fisiológica, medios acuosos en presencia de tampones, opcionalmente soluciones tampón en presencia de azúcares, vitaminas, polímeros sintéticos. En una realización preferida el diluyente es agua para inyección. La composición liofilizada puede ser reconstituida para producir una composición que tenga la concentración terapéutica deseada.
En otro aspecto, la invención comprende el uso de la composición farmacéutica que comprende el GHRP-6, el tampón tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa para la fabricación de un medicamento. El medicamento que comprende el GHRP-6 junto a otros componentes tiene utilidad como citoprotector en el tratamiento de tejidos dañados debido a la falta de irrigación sanguínea. Por tanto, en una realización de la invención, el medicamento que comprende la formulación de GHRP-6 indicada se utiliza como citoprotector, cardioprotector, cardiorestaurador, neuroprotector o restaurador del daño cerebral.
En una materialización de la invención, el medicamento es un kit de partes que comprende adicionalmente una segunda composición farmacéutica. Por tanto, es también objeto de la invención un kit de partes que comprende la composición farmacéutica que comprende el GHRP-6, el tampón tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa.
En otro aspecto, la invención revela un método para el tratamiento de un individuo que lo necesita donde se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende el GHRP-6, el tampón regulador de pH tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa. En el método de tratamiento de la invención la composición farmacéutica se administra por las vías que son conocidas por los versados en este campo de la técnica. En una materialización de la invención, la composición farmacéutica que comprende el GHRP-6 se administra por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Perfiles de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP- HPLC) del GHRP-6 liofilizado en presencia de diferentes excipientes al 3% (m/v), en dos tampones a 25 mmol/L, y a pH 5,5. (A) Tartrato de sodio y (B) histidina-HCI. La concentración del péptido fue de 2,5 mg/mL. Las muestras se incubaron durante 6 meses a 50 ± 2 °C, previo al análisis cromatográfico.
Figura 2. Evaluación de la actividad biológica, mediante el efecto inotrópico en ratones Balb/c (n=6), de dos formulaciones del GHRP-6. Como control del experimento se emplearon los placebos correspondientes de cada formulación. Se evaluó la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) mediante ecocardiografía. Se administró una dosis de 100 pg del GHRP-6 por kg de peso del animal, o el volumen equivalente de la formulación placebo correspondiente, por vía intraperitoneal.
Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Para todos los estudios realizados se utilizó como ingrediente farmacéutico activo (IFA) el GHRP-6, que posee una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 1 en la Lista de Secuencias. El mismo se obtuvo por la metodología de síntesis lineal de péptidos en fase sólida paso a paso (Atherton y Sheppard, 1989. Solid phase peptide synthesis: a practical approach, en: Coligan, J., Dunn, B., Ploegh, H. (Eds.), Current Protocols in Protein Science. IRL Press, Oxford). La identidad de los lotes de péptido se corroboró mediante espectrometría de masas en modo de electronebulización (ESI-MS), y el porcentaje de la fracción del péptido intacto se determinó mediante RP-HPLC, el que fue superior al 98,0%.
Ejemplo 1. Obtención de una formulación líquida del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio.
Estabilidad a diferentes pH, especies iónicas, concentraciones de la solución tampón y concentración de cloruro de sodio
El valor de pH de las formulaciones farmacéuticas es relevante para su administración por ruta parenteral. Para estudiar la estabilidad del GHRP-6 a diferentes valores de pH, se empleó el tampón citrato-fosfato (ácido cithco/Na2HP04) a una concentración de 100 mmol/L, a valores de pH entre 4,0 y 8,0. Para la preparación de las diferentes formulaciones, el IFA se disolvió hasta alcanzar la concentración deseada de 2,5 mg/mL. Las formulaciones fueron esterilizadas por filtración (por filtros de 0,22 pm) y dispensadas en viales 2R a razón de 1 ,0 mL por vial. Muestras representativas de las diferentes formulaciones fueron incubadas a 60 °C, y la estabilidad del péptido fue evaluada mediante RP- HPLC después del almacenamiento a esa temperatura por diferentes intervalos de tiempo.
El porcentaje de la fracción de péptido intacto se evaluó en RP-HPLC en una columna C18 (4,6 x 150 mm, 5 pm) (Vydac, Estados Unidos). Como fase móvil se empleó la mezcla de una solución de agua para inyección con ácido thfluoroacético (TFA) al 0,1% v/v (solución A), y acetonitrilo con TFA al 0,05% v/v (solución B). Para separar los productos de degradación formados durante el estudio de estrés, se empleó un gradiente del 0 al 60% de B en A, durante 45 minutos, a una temperatura de trabajo de 34 SC. La concentración del GHRP-6 se determinó mediante la ley de Lambert-Berr, partiendo de la lectura de absorbencia a 280 nm y el coeficiente de extinción másico (s1% 280 nm) de 146,8 mLmg’1cm’1, determinado expehmentalmente. Durante el almacenamiento de las formulaciones del GHRP-6 (a 2,5 mg/mL) en tampón citrato-fosfato de sodio a 60 °C, los valores más altos de pureza en RP-HPLC se lograron a pH 6,0.
A continuación, se estudió la estabilidad del péptido (2,5 mg/mL) a ese mismo pH en los tampones acetato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio y citrato-fosfato de sodio, a las concentraciones del tampón de 25, 50 y 100 mmol/L. En los tampones fosfato, citrato y citrato-fosfato se observó un efecto catalítico de los tampones en la degradación del péptido, con el incremento de la concentración de los tampones disminuyó la pureza del péptido. Con el empleo del tampón acetato de sodio no se observó efecto catalítico. Los mayores valores de pureza del péptido, según el análisis de RP-HPLC, se observaron con el empleo del tampón citrato de sodio a pH 6,0 y a la concentración de 25 mmol/L.
Finalmente, con el objetivo de emplear el cloruro de sodio como agente isotonizante, se evaluó el efecto de su concentración (2,5; 5,0 y 10,0 mg/mL) en la estabilidad del GHRP-6. Este estudio se realizó en tampón citrato de sodio a pH 6,0 (a una concentración del tampón de 25 mmol/L). Durante el almacenamiento a 60 °C de las formulaciones del GHRP-6 a 2,5 mg/mL, en tampón citrato de sodio a 25 mmol/L, los valores de pureza del péptido no se afectaron por la concentración de cloruro de sodio presente en las formulaciones, que estuvo entre 2,5 y 10 mg/mL. Por ello, este compuesto se puede emplear en la formulación como agente isotonizante. La Tabla 1 resume los resultados de algunas de las formulaciones descritas anteriormente. Tabla 1. Porciento de pureza del GHRP-6 tras el almacenamiento a 60 °C de formulaciones acuosas que contienen 2,5 mg de péptido por mL.
Tiempo (días)
Formulaciones 0 7 14 21 28
Citrato-Fosfato 100 mmol/L 99,78 92,74 89,90 81 ,74 76,32
Citrato pH 100 mmol/L 99,80 93,64 91 ,09 87,56 82,12
Citrato 25 mmol/L 99,85 94,72 92,85 91 ,77 89,23
Citrato 25 mmol/L + 6 mg/mL de 99,63 94,29 93,00 91 ,62 90,43
NaCI
Las formulaciones indicadas tenían pH 6,0
Teniendo en consideración dichos resultados, la composición de la formulación a evaluar durante el escalado y el estudio de estabilidad fue la siguiente: GHRP-6 a 2,5 mg/mL, tampón citrato de sodio a 25 mmol/L y pH entre 5,7 y 6,3; y como agente isotonizante el cloruro de sodio a 6 mg/mL.
Preparación de una formulación líquida de GHRP-6 a 2,5 mg/mL en citrato/cloruro de sodio: Escalado y estudio de estabilidad
Componentes de la formulación del GHRP-6 a 2,5 mg/mL: GHRP-6 2,5 g; ácido cítrico 4,8 g; cloruro de sodio 6,0 g y agua para inyección cantidad suficiente para 1 ,0 L.
Todos los componentes de la formulación, excepto el IFA constituido por GHRP-6, fueron medidos y disueltos con agua para inyección. El pH de la solución se chequeó y ajustó al valor de 6,0 ± 0,3 con NaOH a 1 ,0 mol/L. El IFA se fue adicionando hasta alcanzar la concentración deseada (2,5 mg/mL) en esa solución. Seguidamente, la formulación fue esterilizada por filtración (por filtros de 0,22 pm), en un área clase 100. A continuación, la formulación líquida estéril se dispensó en viales a los cuales se les colocaron los tapones y sellos, respectivamente, en un área clase 100. Muestras de los tres lotes se colocaron en cámara fría, a temperatura controlada (5 + 3 °C), y en incubadora (para estudio de estabilidad acelerada) a 25 ± 2 °C. A determinados intervalos de tiempo, se extrajeron muestras para analizar los atributos críticos de calidad: apariencia del producto, pureza del GHRP-6 medida por RP-HPLC, identidad del GHRP-6 medida por ESI-MS, concentración del péptido determinada por absorbencia a 280 nm, pH, esterilidad y pirogenicidad. Las pruebas analíticas se realizaron según se describió anteriormente, o según se describe en la monografía SP-United States Pharmacopeia.
Durante el almacenamiento de la formulación líquida de GHRP-6 a 2,5 mg/mL en citrato/cloruro de sodio, por 12 meses a 5 ± 3 °C, el porcentaje de la fracción del péptido intacto se mantuvo por encima del 98,04%. Durante el estudio de estabilidad, el producto se mantuvo sin cambios en su apariencia. Además, las pruebas de esterilidad, pirógenos e identidad por ESI-MS resultaron satisfactorias para todos los lotes, tanto al inicio como al final del estudio. De forma similar, la formulación permaneció estable durante el almacenamiento a 25 ± 2 °C durante 6 meses. La pureza medida RP-HPLC se mantuvo por encima del 95,73% y las pruebas de esterilidad, pirógenos e identidad por ESI-MS resultaron satisfactorias para todos los lotes al inicio y al final del estudio. Se concluye que la formulación obtenida resultó estable durante el almacenamiento por 1 año a 5 ± 3 °C y por 6 meses a 25 ± 2 °C.
Ejemplo 2. Estudios de toxicología preclínica realizados a la formulación líquida del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio.
En los estudios preclínicos que se describen a continuación se empleó la formulación líquida del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio descrita en el Ejemplo 1 , que consiste en GHRP-6 a 2,5 mg/mL, tampón citrato de sodio a 25 mmol/L y pH entre 5,7 y 6,3; y como agente isotonizante el cloruro de sodio a 6 mg/mL.
Evaluación de la toxicidad aguda en ratas Sprague-Dawley
Se emplearon un total de 50 ratas, 25 hembras y 25 machos que conformaron 5 grupos de 10 animales cada uno. La dosis correspondiente a cada grupo se administró dividida en tres aplicaciones, una cada 6 horas. La formulación se aplicó por vía intraperitoneal en los días 1 y 2 de la fase experimental, según el diseño que muestra la Tabla 2. Se tomó como referencia la dosis terapéutica (DT) de 400 pg/kg. Los parámetros evaluados fueron el peso corporal, consumo de alimento, observaciones clínicas y macroscópicas, así como estudio histopatológico de los órganos de interés. Tabla 2. Distribución por grupos de animales y dosis del péptido empleadas.
Grupo Tratamiento Dosis GHRP-6
I Solución salina
II Placebo
III Formulación GHRP-6 20 veces la DT (8000 p.g/kg)
IV Formulación GHRP-6 30 veces la DT (12000 p.g/kg)
V Formulación GHRP-6 50 veces la DT (20000 .g/kg)
Después del análisis detallado de los resultados obtenidos, se concluyó que la formulación del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio, a las dosis evaluadas, no produjo alteraciones sistémicas agudas que pudieran comprometer la seguridad de los pacientes. La formulación evaluada mostró un adecuado marco de seguridad, hasta 30 veces la DT de la formulación del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio, para su empleo en estudios clínicos. No obstante, se reportaron hallazgos en las glándulas adrenales (áreas focales de necrosis a nivel de la zona fascicular, con presencia de células tumefactas y esteatosis macrovesicular) que se consideran elementos de toxicidad, eventos que estuvieron relacionados con la administración de altas dosis del GHRP-6, en este caso de 50 veces la DT.
Evaluación de la toxicidad a dosis repetida en ratas Sprague-Dawley
Se emplearon 100 ratas de ambos sexos, jóvenes adultos, 50 hembras y 50 machos, que formaron 7 grupos. El grupo no tratado y el grupo Satélite (al que se administró 9 veces la DT) estuvieron conformados por 10 animales cada uno. Los otros cinco grupos fueron conformados por 16 animales cada uno. El diseño del estudio se resume en la Tabla 3. Al grupo Satélite se le administró la mayor dosis empleada en el estudio, con el objetivo de evaluar la reversibilidad de los potenciales efectos, y los animales del mismo se sacrificaron al doble del tiempo que el resto de los animales. Se realizaron 14 administraciones consecutivas, una diaria durante dos semanas, por vía intraperitoneal, en todos los grupos de tratamiento conformados. Los parámetros evaluados fueron el peso corporal, consumo de alimento, observaciones clínicas y macroscópicas, así como estudio histopatológico de los órganos de interés. Además, se realizaron determinaciones de hematología, bioquímica, así como peso absoluto y relativo de órganos. También se estudió en histopatología la totalidad de los órganos de cada animal. Tabla 3. Distribución por grupos de animales de los tratamientos del estudio.
Grupo Cantidad de animales Tratamiento Dosis GHRP-6
I 10 No tratado 0
II 16 Solución salina 0
III 16 Placebo 0
IV 16 Formulación GHRP-6 3 veces la DT (1200 pg/kg)
V 16 Formulación GHRP-6 6 veces la DT (2400 pg/kg)
VI 16 Formulación GHRP-6 9 veces la DT (3600 pg/kg)
Satélite Formulación
Vil 10 GHRP 6 9 veces la DT (3600 pg/kg)
Del estudio se concluyó que la formulación del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio no es tóxica a nivel sistémico a las dosis evaluadas.
Evaluación de la tolerancia local en conejos F1
Se emplearon un total de 18 animales hembras que formaron 6 grupos de 3 animales cada uno. Se realizaron 5 administraciones sucesivas por vía intravenosa, una cada 72 horas. La distribución de los grupos de animales por tratamiento fue: Grupo I: no tratado, Grupo II: placebo, Grupo III: DT del GHRP-6 (400 pg/kg), Grupo IV: 5 veces la DT del GHRP-6 (2000 pg/kg), Grupo V: 10 veces la DT del GHRP-6 (4000 pg/kg) y Grupo VI: Satélite, 10 veces la DT del GHRP-6 (4000 pg/kg). Los parámetros evaluados fueron el peso corporal, consumo de alimento, observaciones clínicas y macroscópicas, así como estudio histopatológico de los órganos de interés. Los resultados demostraron que la administración reiterada de la formulación del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio es bien tolerada a las dosis evaluadas, y que los eventos adversos encontrados no constituyen signos de toxicidad.
Ejemplo 3. Estudio de dosis de la formulación líquida del GHRP-6 en citrato/cloruro de sodio en voluntarios sanos.
Se realizó un ensayo clínico fase I, no controlado, de escalado de dosis, en voluntarios sanos, donde se evaluó el GHRP-6 en la formulación líquida que contenía citrato/cloruro de sodio desarrollada en el Ejemplo 1. La formulación contenia: GHRP-6 a 2,5 mg/mL, tampón citrato de sodio a 25 mmol/L y pH entre 5,7 y 6,3; y como agente isotonizante el cloruro de sodio a 6 mg/mL. El péptido se administró a dosis única por vía intravenosa en 6 escalas de dosis: 1 , 10, 50, 100, 200 y 400 pg/kg de peso. La muestra estuvo constituida por 18 sujetos sanos, del género masculino, con edades entre 18 y 35 años, con un peso corporal dentro de los límites normales y que aceptaron participar voluntariamente en la investigación. En cada nivel de escalado de dosis se trataron 3 sujetos, y el avance al siguiente nivel dependió de la ausencia de toxicidad (evento adverso grave).
En lo concerniente a la seguridad del péptido, no se reportaron eventos adversos graves. Se registraron 6 eventos adversos diferentes en 12 sujetos (66,7%), siendo la sudoración (50%), la bradicardia (44,4%) y la somnolencia (16,7%) los más frecuentes, como se observa en la Tabla 4. Todos estos eventos adversos guardaron relación de causalidad con el producto farmacéutico administrado, que contenía GHRP-6 como IFA. El número de eventos adversos reportados se incrementó con el nivel de dosis del péptido en estudio.
Tabla 4. Frecuencia de individuos con eventos adversos según el grupo de dosis.
Evento 1 pg/kg 10 pg/kg 50 pg/kg 100 pg/kg 200 pg/kg 400 pg/kg adverso (EA)
Bradicardia 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (33,3%) 2 (66,7%) 2 (66,7%) 3 (100,0%)
Sudoración 0 (0,0%) 2 (66,7%) 1 (33,3%) 1 (33,3%) 2 (66,7%) 3 (100,0%)
Taquicardia 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (33,3%)
Febrícula 1 (33,3%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Somnolencia 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 3 (100,0%)
Total de 1 (33,3%) 2 (66,7%) 2 (66,7%) 2 (66,7%) 2 (66,7%) 3 (100,0%) individuos con EA
Se observaron valores de frecuencia cardiaca por debajo del rango normal (60-100) desde los valores básales; los valores patológicos (por debajo de 60) fueron reportados como eventos adversos de bradicardia. La misma tuvo una duración que osciló entre 55 minutos y 3 horas aproximadamente, siendo de mayor magnitud la disminución de los valores de frecuencia cardiaca en los grupos V (200 pg/kg) y VI (400 pg/kg) en los primeros 30 minutos de administrado el péptido. Con el evento adverso de mayor atención clínica (bradicardia) se exploró de manera más específica la relación con la concentración del GHRP-6. Aunque no se detectó correlación estadísticamente significativa, fue interesante observar que, en la medida que aumentaron los valores de concentración del GHRP-6, había mayor tendencia hacia una bradicardia, pues eran menores las frecuencias cardiacas. La bradicardia clínicamente puede traer serios problemas cuando se administra el péptido en pacientes, y en este estudio se presentó en 4 de los 6 niveles de dosis estudiados, a pesar de que los sujetos estudiados eran voluntarios sanos.
Debido a los resultados obtenidos en el escalado de dosis en individuos sanos, se hizo necesario explorar nuevas alternativas de formulación donde el péptido se mantuviera concentrado y estable, para su evaluación en humanos.
Ejemplo 4. Obtención de una nueva formulación del GHRP-6.
Efecto de los tampones tartrate, succinate e histidina a pH 5,0 - 6,0 en la estabilidad del GHRP-6 en solución acuosa
Debido a que el péptido es estable en el rango de pH entre 5,0 y 6,0, se estudiaron los tampones tartrato, succinato e histidina, que presentan buena capacidad tampón para regular el pH en este rango de valores. Los tampones se prepararon a una concentración final de 50 mmol/L. Para preparar el tampón tartrato se empleó ácido tartárico, el tampón histidina se preparó a partir del reactivo histidina-HCI, y el ajuste del pH entre 5,0 y 6,0 se realizó con NaOH a 1 ,0 mol/L en ambos casos. El tampón succinato se preparó igual que el tampón tartrato, a partir de ácido succínico y NaOH.
El IFA (GHRP-6) se disolvió en las diferentes soluciones tampón. El tiempo de agitación fue inferior a una hora a 25 ± 2 °C. La concentración del GHRP-6 fue de 2,5 mg/mL, determinada mediante absorbencia a 280 nm. A continuación, las muestras se esterilizaron por filtración (en filtros de 0,22 pm), bajo condiciones asépticas. Para evaluar la estabilidad del péptido, las muestras fueron colocadas en incubadora, bajo condiciones de estrés a 60 ± 2 °C por 28 días. El porcentaje de la fracción del péptido intacto, la concentración del péptido y el pH se evaluaron según los métodos descritos anteriormente.
La estabilidad del GHRP-6 se incrementó con el aumento del pH en el tampón succinato en el rango evaluado (5, 0-6,0). La mayor estabilidad en succinato se alcanzó a pH 6,0; donde se encontró 74,31% de pureza del péptido después de almacenada la formulación por 28 días a 60 °C. La pureza del péptido fue inferior a la alcanzada en las mismas condiciones para los lampones tartrato e histidina.
La Tabla 5 recoge los resultados del estudio de estabilidad de GHRP-6 para los lampones tartrato e histidina, y muestra que el valor de pureza en RP-HPLC en el lampón tartrato de sodio fue superior al encontrado para Histidina-HCI, a pH entre 5,5 y 6,0.
Tabla 5. Porcentaje de la fracción del GHRP-6 intacto en formulaciones acuosas en los lampones tartrato e histidina a pH 5,0 - 6,0 almacenadas a 60 ± 2 °C.
Figure imgf000017_0001
Efecto de los excipientes en la estabilidad del GHRP-6 liofilizado a pH 5,5 en los tampones tartrato e histidina
Es conocido que las formulaciones en estado sólido tienen mayor estabilidad que en solución acuosa. Para alcanzar la estabilidad requerida del GHRP-6, se evaluaron diferentes excipientes para la liofilización en los tampones tartrato e histidina-HCI. Los tampones, a pH 5,5 y a una concentración de 25 mmol/L, se prepararon como se describió anteriormente. Los excipientes empleados fueron: sacarosa, lactosa, trehalosa, manitol, glicina, alanina y dextrana 40. Estos fueron disueltos a una concentración final del 3% (m/v) en los tampones evaluados. La disolución del péptido, hasta alcanzar la concentración de 2,5 mg/mL se realizó como se describió anteriormente. A continuación, las formulaciones se esterilizaron por filtración, bajo condiciones ambientales asépticas, y se sometieron a liofilización. Se utilizó un ciclo de liofilización convencional que se ajusta a una amplia gama de excipientes (Santana y cois., Biologicals 2014, 42: 322-333).
Para el estudio de estabilidad, las muestras de las formulaciones liofilizadas fueron colocadas en incubadora, bajo condiciones de estrés, a 50 ± 2 °C. La mayor estabilidad del péptido liofilizado se encontró en presencia de la trehalosa, seguido por la dextrana 40, como se refleja en la Tabla 6. Los resultados fueron similares cuando se utilizó el tampón tartrato de sodio y el tampón histidina-HCI a pH 5,5. Sorprendentemente, excipientes lioprotectores muy utilizados en la liofilización de péptidos y proteínas, como la sacarosa, la lactosa y el manitol, no resultaron eficaces para el GHRP-6. Por otro lado, en la Figura 1 se muestran los perfiles de RP-HPLC del GHRP-6 liofilizado en presencia de cuatro excipientes. Se observa que la mayor estabilidad del péptido se alcanzó cuando se liofilizó en presencia del excipiente lioprotector trehalosa.
Tabla 6. Porcentaje de la fracción del péptido intacto en muestras de GHRP-6 liofilizado en diferentes excipientes almacenadas por 6 meses a 50 ± 2 °C.
Excipientes
Tampones Sacarosa Lactosa Trehalosa Manitol Glicina Alanina Dextrana
Tartrato 49,1 48,5 98,7 30,0 88,6 93,1 96,6
Histidina 43,8 46,4 98,4 29,7 96,6 91 ,1 97,7
Fue sorprendente la elevada estabilidad química del GHRP-6 liofilizado en presencia de los tampones tartrato e histidina en combinación con la trehalosa, con relación al resto de las formulaciones evaluadas. Además, estas formulaciones presentaron un bajo número de partículas subvisibles por unidad de volumen, cuando se analizó por el método de oscurecimiento de la luz, con resultados en el orden de 100 veces inferiores a los exigidos para partículas mayores o ¡guales que 10 jim y que 25 jim por la farmacopea estadounidense (USP<788>, 2008). Por ello, la composición de la formulación liofilizada que se evaluó durante el escalado y el estudio de estabilidad fue: Péptido GHRP-6 a 2,5 mg/mL, tampón tartrato de sodio a 25 mmol/L; pH de 5,0 a 6,0; y trehalosa al 3% (m/v), como agente estabilizante e isotonizante.
Ejemplo 5. Escalado y estudio de estabilidad de formulaciones líquidas del GHRP-6 en tartrato/trehalosa.
Se desarrollaron dos formulaciones líquidas de GHRP-6 que contenían ácido tartárico 3,75 g/L, a,a-trehalosa dihidrato 33,16 g/L, agua para inyección en cantidad suficiente para 1 ,0 L. En una de las formulaciones el péptido estuvo en la concentración de 2,5 mg/mL y en la otra estuvo a 10,0 mg/mL. Para lograr la concentración de 2,5 mg/mL, se disolvieron 2,5 g del GHRP-6; y para la concentración de 10,0 mg/mL se disolvieron 10,0 g del GHRP-6.
Todos los componentes de la formulación, excepto el IFA del GHRP-6, fueron medidos y disueltos con agua para inyección. El pH de la solución se chequeó y ajustó al valor de 5,5 ± 0,3 con NaOH a 1 ,0 mol/L. El GHRP-6 se fue adicionando hasta alcanzar la concentración deseada (2,5 o 10,0 mg/mL). Seguidamente, la formulación fue esterilizada por filtración, y la formulación líquida estéril se dispensó en viales en área clase 100. Se fabricaron tres lotes de la formulación líquida del péptido en tartrato/trehalosa a cada concentración del GHRP-6 (2,5 y 10,0 mg/mL). Muestras de los lotes se colocaron en cámara fría a temperatura controlada (5 ± 3 °C) o en incubadora a 25 ± 2 °C. A determinados intervalos de tiempo, se analizaron las muestras. El estudio de estabilidad a 25 ± 2 °C se realizó por 6 meses. Los atributos críticos de calidad evaluados y los métodos analíticos fueron similares a los descritos anteriormente.
En la Tabla 7 se muestran los resultados del estudio de estabilidad de la formulación líquida de GHRP-6. Como se aprecia, durante el almacenamiento por dos años a 5 ± 3 °C, el porcentaje de la fracción del péptido intacto se mantuvo por encima del 97% a la concentración de 2,5 mg/mL; y por encima del 98% a 10,0 mg/mL.
Tabla 7. Porcentaje de péptido intacto de las formulaciones líquidas del GHRP-6 en tartrato/trehalosa tras el almacenamiento a dos temperaturas.
GHRP-6 a 2,5 mg/mL GHRP-6 a 10,0 mg/mL
Tiempo 5 ± 3 °C 25 ± 2 °C 5 ± 3 °C 25 ± 2 °C
(Meses)
0 99,42 ± 0,04 99,42 ± 0,04 99,48 ± 0,06 99,48 ± 0,06
3 99,31 ± 0,03 96,28 ± 0,03 99,28 ± 0,05 97,94 ± 0,09
6 99,28 ± 0,07 95,47 ± 0,04 99,05 ± 0,08 97,30 ± 0,12
12 98,41 ± 0,04 - 98,53 ± 0,04
24 97,85 ± 0,09 - 98,01 ± 0,06
Se muestra el valor medio y la desviación estándar. Por su parte, durante el almacenamiento por seis meses a 25 ± 2 °C, el porcentaje de la fracción del GHRP-6 intacto se mantuvo por encima del 95% para la presentación de 2,5 mg/mL; y por encima del 97% para la de 10,0 mg/mL. Además, se mantuvo el pH dentro del rango requerido. Las pruebas de apariencia, conteo de partículas subvisibles, esterilidad, pirógenos e identidad por ESI-MS resultaron satisfactorios para todos los lotes al inicio y final del estudio, para las dos concentraciones del péptido y a las dos temperaturas estudiadas. De este estudio de estabilidad se concluyó que la formulación líquida evaluada era estable a 5 ± 3 °C por 24 meses y a 25 ± 2 °C por 6 meses.
Ejemplo 6. Escalado y estudio de estabilidad de formulaciones liofilizadas del GHRP-6 en tartrato/trehalosa.
Se conoce que las proteínas y péptidos en estado sólido generalmente presentan mayor estabilidad que en estado líquido, a medida que aumenta la temperatura de almacenamiento. Por ello, se desarrollaron dos formulaciones liofilizadas de GHRP- 6 que contenían ácido tartárico 3,75 g/L, a,a-trehalosa dihidrato 33,16 g/L, agua para inyección cantidad suficiente para 1 ,0 L. Para la concentración de 2,5 mg/mL se disolvieron 2,5 g del GHRP-6; y para la concentración de 10,0 mg/mL se disolvieron 10,0 g del GHRP-6. Se utilizó el mismo método de fabricación que se describió en el Ejemplo 5. Se prepararon tres lotes de granel en estado líquido. A continuación, el producto a granel se dispensó en viales para realizar el proceso de liofilización. Se utilizó un ciclo de liofilización convencional (Santana y cois., Biologicals 2014, 42: 322-333). Mediante el procedimiento descrito, se fabricaron tres lotes de la formulación liofilizada del GHRP-6 en tartrato/trehalosa a cada fortaleza del GHRP-6 (2,5 o 10,0 mg/vial). Muestras de los lotes se colocaron en cámara fría a temperatura controlada (5 ± 3°C) o en incubadora a 25 ± 2 °C. A determinados intervalos de tiempo, se analizaron las muestras de la formulación liofilizada. El estudio de estabilidad a 25 ± 2 °C se realizó por 6 meses. Los atributos críticos de calidad y los métodos analíticos evaluados fueron similares a los descritos anteriormente.
En la Tabla 8 se muestran los resultados de estabilidad de las formulaciones liofilizadas del GHRP-6. Durante el almacenamiento por 2 años a 5 ± 3 °C, el porcentaje de la fracción del péptido intacto se mantuvo por encima del 99% para ambas presentaciones (2,5 mg/vial y 10,0 mg/vial). La concentración del péptido, la humedad residual y el pH de todas las muestras correspondientes a ambas formulaciones se mantuvieron en valores adecuados durante el intervalo estudiado.
Tabla 8. Porcentaje de péptido intacto en las formulaciones liofilizadas del GHRP-6 en tartrato/trehalosa tras el almacenamiento a dos temperaturas.
GHRP-6 a 2,5 mg/vial GHRP-6 a 10,0 mg/vial
Tiempo 5 ± 3 °C 25 ± 2 °C 5 ± 3 °C 25 ± 2 °C
(Meses)
0 99,51 ± 0,04 99,51 ± 0,04 99,61 ± 0,16 99,61 ± 0,16
3 99,43 ± 0,06 99,44 ± 0,28 99,52 ± 0,05 99,45 ± 0,05
6 99,57 ± 0,19 99,40 ± 0,02 99,50 ± 0,08 99,42 ± 0,11
12 99,33 ± 0,09 - 99,59 ± 0,04
24 99,24 ± 0,07 - 99,36 ± 0,09
Se muestra el valor medio y la desviación estándar.
Durante el almacenamiento por seis meses a 25 ± 2 °C, el porcentaje de la fracción del GHRP-6 intacto se mantuvo por encima del 99,4% para ambas presentaciones. La concentración del péptido, la humedad residual y el pH de todas las muestras se mantuvieron en valores adecuados durante el intervalo estudiado. Además, las pruebas de apariencia, conteo de partículas subvisibles, esterilidad, pirógenos e identidad por ESI-MS resultaron satisfactorios para todos los lotes al inicio y final del estudio para las dos concentraciones del péptido, y a las dos temperaturas estudiadas.
De este estudio de estabilidad se concluyó que la formulación liofilizada evaluada era muy estable a 5 ± 3 °C por 24 meses y a 25 ± 2 °C por 6 meses. El porcentaje de péptido intacto se mantuvo por encima del 99% para ambas presentaciones a 25 ± 2 °C por 6 meses, lo que justifica que incluso se pueda almacenar el péptido sin cadena de frió durante la distribución del producto.
Ejemplo 7. Evaluación de la actividad biológica de la formulación del GHRP-6 en tartrato/trehalosa en un modelo animal.
Se evaluó la actividad biológica in vivo de dos formulaciones del GHRP-6 que contenían el péptido a una concentración de 2,5 mg/mL. Para ello, se utilizaron muestras de la formulación del GHRP-6 en citrato/NaCI (desarrollada en el Ejemplo 1 ) y de la formulación del GHRP-6 en tartrato/trehalosa, preparada como se describe en el Ejemplo 5, donde el péptido se encontraba a 2,5 mg/mL. Como control también se evaluaron los correspondientes placebos de cada formulación, preparados de igual forma, pero sin adicionar el péptido GHRP-6.
La actividad inotrópica del péptido se evaluó en ratones Balb/c machos (6 animales por grupo). Se administró una dosis de 100 |ig/kg de las formulaciones del GHRP-6 o el volumen equivalente de los placebos por vía intraperitoneal. Para cada grupo, los ecocardiogramas se obtuvieron al tiempo cero, y cada 5 min después de la administración hasta los 15 min, bajo las mismas condiciones de monitoreo, temperatura y sedación.
Las imágenes ultrasónicas bidimensionales en modo-M se obtuvieron con un sistema de imágenes de alta resolución (Vevo 770™, Visual Sonics Inc.). El sistema se equipó con un transductor lineal de matriz escalonada de 40 MHz, con adquisición de datos a frecuencias de hasta 250 fotogramas por segundo con una resolución axial de hasta 30 mieras entre zonas focales. El procesamiento y análisis de datos se realizaron con la aplicación del software Vevo 770 (versión 3.0.0, Visual Sonics Inc.), en una vista del eje paraesternal largo en un ángulo de 45° y la angulación caudal de la plataforma.
La fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) se calculó mediante la ecuación de Teichold:
Figure imgf000022_0001
donde: VDF, volumen diastólico final; VSF: volumen sistólico final
Las mediciones se tomaron de acuerdo con el ecocardiograma específico: los parámetros diastólicos se midieron en el pico de la onda R, y los parámetros sistólicos en el pico de la onda T. Se realizaron entre 3 y 5 ciclos cardiacos consecutivos, siguiendo las recomendaciones de la Sociedad Americana de Ecocardiografía (Langy cols., Eur J Echocardiogr. 2006, 7(2): 79-108).
En la Figura 2 se observa que para los animales tratados con el péptido en la formulación en tartrato/trehalosa, la FEVI se incrementó significativamente con el tiempo, y se mantuvo incrementada por al menos los 15 min estudiados. Este efecto no se observó en los animales tratados con el placebo de dicha formulación. La FEVI fue superior en el caso de los animales que recibieron la formulación en tartrato/trehalosa en comparación con los animales tratados con la otra formulación del péptido. En resumen, la formulación del GHRP-6 en tartrato/trehalosa presentó mayor actividad inotrópica en el modelo animal empleado.
Ejemplo 8. Estudios de toxicología preclínica de una formulación del GHRP-6 en tartrato/trehalosa.
Una vez demostrada la actividad biológica deseada, la formulación liofilizada que contenía tartrato de sodio, trehalosa, y 5 mg de GHRP-6 por vial se reconstituyó y se sometió a estudios de toxicología en los siguientes modelos animales.
Evaluación de la toxicidad aguda en ratas Sprague-Dawley
Se emplearon un total de 50 ratas, 25 hembras y 25 machos que formaron 5 grupos, de 10 animales cada uno. La dosis correspondiente a cada grupo se administró dividida en 3 aplicaciones, una cada 6 horas. Se aplicó el producto, por vía intraperitoneal, en los días 1 y 2 de la fase experimental. Se tomó como referencia la DT de 400 pg/kg. La Tabla 9 muestra el diseño del estudio realizado.
Tabla 9. Distribución por grupos de animales y dosis del péptido empleadas.
Grupo Tratamiento Dosis del GHRP-6
I Solución salina
II Placebo
III Formulación GHRP-6 30 veces la DT (12000 pg/kg)
IV Formulación GHRP-6 55 veces la DT (22000 pg/kg)
V Formulación GHRP-6 100 veces la DT (40000 pg/kg)
Después del análisis detallado de los resultados obtenidos, se concluyó que la formulación liofilizada del péptido GHRP-6 en tartrato/trehalosa, a las dosis evaluadas, no produjo alteraciones sistémicas agudas que comprometieran la seguridad de los pacientes. La misma mostró un adecuado marco de seguridad de hasta 100 veces la DT, y por tanto, la formulación en tartrato/trehalosa podría someterse a estudios clínicos. Evaluación de la toxicidad a dosis repetida en ratas Sprague-Dawley
Se emplearon 100 ratas de ambos sexos, jóvenes adultos, 50 hembras y 50 machos, que formaron 7 grupos. La Tabla 10 muestra el diseño del estudio realizado. El grupo no tratado y el grupo Satélite (al que se administró 50 veces la DT) estuvieron conformados por 10 animales cada uno. Los otros cinco grupos fueron conformados por 16 animales cada uno. Al grupo Satélite se le administró la mayor dosis empleada en el estudio, con el objetivo de evaluar la reversibilidad de los potenciales efectos, y los animales del mismo se sacrificaron al doble del tiempo en que se sacrificaron el resto de los animales del estudio. Se realizaron 14 administraciones consecutivas, una diaria durante dos semanas, por vía intraperitoneal, en todos los grupos de tratamiento conformados.
Tabla 10. Distribución de animales por tratamiento en estudio.
Cantidad de Dosis del GHRP-6
Grupo Tratamiento animales
I 10 No tratado 0
II 16 Solución salina 0
III 16 Placebo 0
IV 16 Formulación GHRP-6 10 veces la DT (4000 pg/kg)
V 16 Formulación GHRP-6 30 veces la DT (12000 pg/kg)
VI 16 Formulación GHRP-6 50 veces la DT (20000 pg/kg)
Satélite Formulación
Vil 10 GHRP 6 50 veces la DT (20000 pg/kg)
Después del análisis detallado de los resultados obtenidos se concluyó que la formulación liofilizada del GHRP-6 en tartrato/trehalosa no fue tóxica a nivel sistémico hasta 50 veces la DT.
Evaluación de la tolerancia local en conejos F1
Se emplearon un total de 18 animales hembras, que formaron 6 grupos de 3 animales cada uno. Se realizaron 5 administraciones sucesivas, por vía intravenosa, una cada 72 horas. La distribución de los grupos de animales por tratamiento fue: Grupo I: no tratado, Grupo II: placebo, Grupo III: DT del GHRP-6, 400 pg/kg, Grupo IV: 5 veces la DT del GHRP-6, 2000 pg/kg, Grupo V: 10 veces la DT del GHRP-6, 4000 pg/kg y Grupo VI: 10 veces la DT del GHRP-6, 4000 pg/kg. Una vez realizado el análisis de los resultados obtenidos en este estudio, se concluyó que la administración reiterada de la formulación del GHRP-6 en tartrato/trehalosa fue bien tolerada y que los eventos adversos encontrados no constituyeron signos de toxicidad.
Ejemplo 9. Evaluación de la seguridad de la formulación del GHRP-6 en tartrato/trehalosa en pacientes con infarto agudo de miocardio.
En este estudio se utilizó la formulación liofilizada del GHRP-6 que contenía tartrato de sodio, trehalosa, y 5 mg de GHRP-6 por vial. Se realizó un ensayo clínico fase I- B (exploratorio), prospectivo, multicéntrico, abierto y aleatorizado en pacientes con infarto agudo de miocardio que se sometieron a angioplastia coronaria transluminal percutánea primaria. Una vez reconstituida la formulación liofilizada, el péptido se administró aleatoriamente a la dosis de 50 o 100 pg/Kg de peso del paciente, por vía intravenosa, en bolo. La primera dosis se administró en el momento de la inclusión del paciente en el estudio. Posteriormente, se continuó con la administración cada 12 horas, por 7 días, hasta un total de 14 administraciones del péptido. La muestra estuvo constituida por 19 pacientes de ambos sexos, mayores de 30 años, que participaron voluntariamente en la investigación. El objetivo primario del estudio fue evaluar la seguridad de la formulación liofilizada que contiene GHRP-6.
En la Tabla 11 se presenta un resumen de los eventos adversos registrados con la intención de comparar con los encontrados en el estudio de escalado de dosis en voluntarios sanos, realizado con la formulación de GHRP-6 en citrato/NaCI. En dicha tabla se aprecia que en este estudio no se observaron los eventos adversos producidos por la formulación de citrato/NaCI reflejados en el Ejemplo 3. El resto de los eventos reportados fueron de intensidad leve o moderada, en su mayoría, tuvieron baja relación de causalidad con el péptido objeto de estudio y se le atribuyeron a la enfermedad de base de los pacientes. Tabla 11. Frecuencia de individuos con eventos adversos según el grupo de dosis.
Eventos adversos (EA) Grupo 1 (50 ¿xg/kg) Grupo II (100 |ig/kg) Total (Grupo I + II)
N 9 10 19
Sudoración 3 (33,3%) 1 (10,0%) 4 (21 ,0%)
Bradicardia 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Taquicardia 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Febrícula 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Somnolencia 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Por tanto, la evaluación clínica de la formulación de GHRP-6 en tartrato/trehalosa arrojó que esta no produce bradicardia, lo que permite su empleo en el tratamiento de pacientes aquejados de enfermedades cardiovasculares o cerebrovasculares, a la vez que posee la estabilidad requerida por al menos dos años a una elevada concentración del péptido.

Claims

25 REIVINDICACIONES COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE COMPRENDE EL GHRP-6
1. Una composición farmacéutica que comprende el péptido liberador de la hormona de crecimiento 6 (GHRP-6), el tampón tartrato a pH 5,0 - 6,0 y trehalosa.
2. La composición según la reivindicación 1 donde el péptido está en una concentración entre 1 ,0 mg/mL y 10 mg/mL.
3. La composición según la reivindicación 1 donde el tampón tiene una concentración entre 10 mmol/L y 100 mmol/L.
4. La composición según la reivindicación 1 , donde el tampón tartrato está formado por una sal de sodio, de potasio, o una mezcla de ambos.
5. La composición según la reivindicación 1 donde la trehalosa está en el rango entre 2% y 10% (m/v).
6. La composición según la reivindicación 1 que está en forma líquida o es el producto de resuspender un liofilizado.
7. Uso de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 para la fabricación de un medicamento.
8. El uso de la composición según la reivindicación 7 donde el medicamento es un kit de partes que comprende adicionalmente una segunda composición farmacéutica.
9. El uso de la composición según la reivindicación 7 donde el medicamento se utiliza como citoprotector, cardioprotector, cardiorestaurador, neuroprotector o restaurador del daño cerebral.
10. Un kit de partes que comprende la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6.
11. Un método de tratamiento de un individuo que lo necesita que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6.
12. El método de tratamiento según la reivindicación 11 donde la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular.
PCT/CU2022/050001 2021-01-29 2022-01-27 Composición farmacéutica que comprende el ghrp-6 WO2022161554A1 (es)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/274,955 US20240139105A1 (en) 2021-01-29 2022-01-27 Pharmaceutical composition containing ghrp-6
CA3209594A CA3209594A1 (en) 2021-01-29 2022-01-27 Pharmaceutical composition containing ghrp-6
CN202280022883.9A CN117083056A (zh) 2021-01-29 2022-01-27 包含ghrp-6的药学组合物
JP2023545946A JP2024504462A (ja) 2021-01-29 2022-01-27 Ｇｈｒｐ－６を含有する医薬組成物
EP22717716.9A EP4285891A1 (en) 2021-01-29 2022-01-27 Pharmaceutical composition containing ghrp-6
MX2023009034A MX2023009034A (es) 2021-01-29 2022-01-27 Composicion farmaceutica que comprende el ghrp-6.
ZA2023/07499A ZA202307499B (en) 2021-01-29 2023-07-27 Pharmaceutical composition containing ghrp-6

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2021000010A CU20210010A7 (es) 2021-01-29 2021-01-29 Composición farmacéutica que comprende el ghrp-6
CUCU2021-0010 2021-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2022161554A1 true WO2022161554A1 (es) 2022-08-04
WO2022161554A4 WO2022161554A4 (es) 2022-10-13

Family

ID=81346115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CU2022/050001 WO2022161554A1 (es) 2021-01-29 2022-01-27 Composición farmacéutica que comprende el ghrp-6

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240139105A1 (es)
EP (1) EP4285891A1 (es)
JP (1) JP2024504462A (es)
CN (1) CN117083056A (es)
CA (1) CA3209594A1 (es)
CU (1) CU20210010A7 (es)
MX (1) MX2023009034A (es)
WO (1) WO2022161554A1 (es)
ZA (1) ZA202307499B (es)

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AJAYICOLS, J. CLIN. PHARMACOL., vol. 40, no. 10, 2000, pages 1093 - 1101
ATHERTONSHEPPARD: "Current Protocols in Protein Science", 1989, IRL PRESS, article "Solid phase peptide synthesis: a practical approach, en"
BERLANGACOLS, CLIN. MED. INSIGHTS CARDIOL., vol. 11, 2017, pages 1 - 9
BERLANGACOLS, CLIN. SCI., vol. 112, 2007, pages 241 - 250
BODARTCOLS, CIRC. RES., vol. 85, 1999, pages 796 - 802
CASANUEVADIEGUEZ, TRENDS ENDOCRINOL. METAB., vol. 10, 1999, pages 30 - 38
CHOONARACOLS, PAEDIATR. PERINAT. DRUG THER., vol. 5, 2001, pages 12 - 18
CIBRIÁNCOLS, CLIN. SCI., vol. 110, 2006, pages 563 - 573
COLONNACOLS., EUR. J. PHARMACOL., vol. 334, 1997, pages 201 - 207
FERNÁNDEZ-MAYOLA M. ET AL.: "Growth hormone-releasing peptide 6 prevents cutaneous hypertrophic scarring: early mechanistic data from a proteome study", INTERNATIONAL WOUND JOURNAL, vol. 15, no. 4, 1 August 2018 (2018-08-01), UK, pages 538 - 546, XP055928488, ISSN: 1742-4801, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7949743/pdf/IWJ-15-538.pdf> DOI: 10.1111/iwj.12895 *
HA I.S. ET AL.: "Degradation kinetics of growth hormone-releasing hexapeptide (GHRP-6) in aqueous solution", INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, vol. 144, no. 1, 1996, pages 91 - 97, XP028783196, ISSN: 0378-5173, DOI: 10.1016/S0378-5173(96)04719-9 *
KOJIMACOLS, NATURE, vol. 402, 1999, pages 656 - 660
LANGY, EUR J ECHOCARDIOGR, vol. 7, no. 2, 2006, pages 79 - 108
LEAL-CERROCOLS, EUR. J. ENDOERINO/., vol. 132, no. 6, 1995, pages 712 - 715
LOCHECOLS, J. CLIN. ENDOERINO/. METAB., vol. 80, no. 2, 1995, pages 674 - 678
MURRIELMOCHLY, ARCH. BIOCHEM. BROPHYS., vol. 420, 2003, pages 246 - 254
SUBIRÓSCOLS, NEUROL. RES., vol. 38, no. 3, 2016, pages 187 - 195

Also Published As

Publication number Publication date
CA3209594A1 (en) 2022-08-04
EP4285891A1 (en) 2023-12-06
US20240139105A1 (en) 2024-05-02
MX2023009034A (es) 2023-08-09
CN117083056A (zh) 2023-11-17
JP2024504462A (ja) 2024-01-31
CU20210010A7 (es) 2022-09-08
ZA202307499B (en) 2024-04-24
WO2022161554A4 (es) 2022-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11959486B2 (en) Stable liquid formulation of AMG 416 (etelcalcetide)
ES2405994T5 (es) Soluciones estabilizadas de teriparatide
ES2282161T3 (es) Formulaciones de glp-2.
CA2664734C (en) Method of drug delivery for bone anabolic protein
US20090054331A1 (en) High temperature stable peptide formulation
US20090227498A1 (en) Method of drug delivery for bone anabolic protein
KR20180054847A (ko) 양극성 용매에서 안정한 치료 제형들의 제조방법.
ES2363738T3 (es) Formulación de aviptadil.
JPH05331071A (ja) カルシトニン遺伝子関連ペプチド類の凍結乾燥組成物および安定化法
EP3423042B1 (en) A lyophilised pharmaceutical formulation and its use
WO2022161554A1 (es) Composición farmacéutica que comprende el ghrp-6
US8431534B2 (en) GRF-containing lyophilized pharmaceutical compositions
US20180161401A1 (en) Novel Formulations of PTHrP Analogue
KR20230146515A (ko) 개선된 동결건조 제형
BR122023013738B1 (pt) Formulação farmacêutica de cloridrato de etelcalcetida (amg 416)
BR112015032615B1 (pt) Formulação farmacêutica líquida estável de etelcalcetida (amg 416)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22717716

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3209594

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18274955

Country of ref document: US

Ref document number: 2023545946

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2023/009034

Country of ref document: MX

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112023015113

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022717716

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022717716

Country of ref document: EP

Effective date: 20230829

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112023015113

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20230727

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280022883.9

Country of ref document: CN