PT1140857E - Síntese de dicloridrato de histamina - Google Patents

Description

- 1 - DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE DICLORIDRATO DE HISTAMINA"

Estado dos Conhecimentos Anterior à Invenção A histamina é um composto : que possui uma actividade biológica significativa mediada por receptores farmacológicos. Durante muito tempo 'considerou-.se que a histamina era uma molécula possuindo sobretudo efeitos biológicos negativos. No entanto, recentemente, têm vindo à luz novas utilizações para a histamina, na qualidade de agente farmacêutico potente. Por exemplo, . tem-se .utilizado a. histamina em conjunto com o i.nterf erão-alf a para activar' a.s células NK na presença de monócitos. Veja-se a Patente U. S. No, 5.728.37,8. Para se. realizarem as vantagens plenas das propriedades terapêuticas da histamina, é necessário obter grandes quantidades . do composto, com um grau de pureza farmacêutico. .A histamina. ' ocorre largamente na natureza ' na qualidade de um resultado dos processos de putrefacção, e é. vendido um seu derivado, o cloridrato de histamina, para utilização na qualidade de padrão em testes e, como componente em determinados estojos para o diagnóstico da alergia. A fonte desta histamina é amiúde uma fonte natural e portanto ela contém diversos contaminantes que a tornam 2 inapropriada para utilização farmacêutica. Também são conhecidos na.técnica protocolos sintéticos para a síntese de dicloridrato de histamina. 0 dicloridrato de histamina pode ser sintetizado convenientemente explorando.a descarboxilação da histidina. Utilizando este caminho sintético, descarboxila-se a histidina e subsequentemente trata-se para formar o sal dicloridrato da molécula.' Por exemplo, Hãshimoto'. et al.·, , descreveram , a·, preparação da histamina utilizando çiclohexenona. a título de . catalisador para a descarboxilação da histidina. (Hãshimoto, M., et al., Chemistry Letters, 893-896(1986)). . A publicação de Hãshimoto, et ,al., relata o isolamento do dicloridrato de histamina com um. rendimento de 95 %, . utilizando a 2- ciclohexen-l-cna como catalisador, a. partir.. da reacção envolvendo histidina' e 1 %,' em volume, de 2-ciclohexeh~l-. ona em 10 partes -de ciclohexanol ao refluxo (26 horas}·. 0. método de Hãshimoto também ensina a utilização do. tolueno. e HCl .gasoso borbulhado através da solução .descarboxilada' resultante para precipitar- e .recolher, o . produto final, dicloridrato de histamina.

Falharam tentativas de reproduzir o processo de .Hãshimoto para gerar quantidades de histamina pura do ponto de vista farmacêutico. Eram necessárias quantidades adicionais , de catalisador para tornar .operacional , -o processo e estava presente no. produto final um número, substancial de impurezas. Para além· disto, aquelas 3 impurezas eram difíceis de remover. Atentos estes resultados, verificou-se que o processo de Hashimoto é um método inapropriado. para gerar grandes quantidades de histamina aceitável para utilização em farmácia.. A utilização de acetofenona como catalisador para a descarboxilação da histamina também já foi descrita. Voltamos a criar o método .descrito na patente Japonesa a favor de Akimasa, et al.r Patente Japonesa. No.. 05 255.204, (1983), e utilizámos 0,26 equivalehtes.de acetofenona e 10 partes de dietilenoglicol como solvente para a reacção de descarboxilação. Embora o método de Akimasa et' al. fosse muito mais eficiente para transformar a histidina em histamina, ele .falhava na obtenção consistente' de um. produto com grau, de pureza farmacêutico.. Tal-como o produto final obtido utilizando o método de Hashimoto, observaram-se. impurezas no produto final produzido utilizando o método de Akimasa, na análise por HPLC.

Embora. a utilização de . acetofenona e dietilenoglicol parecesse promissora,. existia um problema relacionado cóm o isolamento. Tanto a histamina como base livre como. o seu sal dicloridrato sejam ambos facilmente' solúveis em água, e rportanto era difícil utilizar uma qualquer técnica de extracção para separar o produto do dietilenoglicol utilizado como solvente, o qual era habitualmente separado por extracção: com· água.· Para além disto, o dicloridrato de histamina também era facilmente 4 solúvel no dietilenoglicol, e portanto o isolamento directo por filtração também não era possível.

As condições . reaccionais de Takano ' et . al.>, envolvendo pentan-3-ona. voltaram. a ser criadas. (Hetero.cycles, 6: 1167 (1977)). Os resultados destas experiências não ' evidénciaram qualquer melhoramento em relação às condições em que se utiliza acetofenona, tal como descritas acima. É necessária uma fonte consistente de histamina de grau de pureza, farmacêutico, em especial atentas as novas aplicações farmacêuticas para a histamina.. Os métodos habitualmente utilizados nos quais .a histamina -é purificada a partir.de fontes naturais não p errai tem obter histamina com um grau de. pureza, suficiente·; para as utilizações farmacêuticas. Para além disco, os métodos sintéticos levados a cabo na técnica também não permitem obter histamina com um grau de pureza' .suficientemente elevado. Existe .'portanto uma necessidade na técnica de um processo melhorado que permita produzir-se dicloridrato de histamina com grau de pureza para farmácia.·

Descrição Hesumida da Invenção A invenção descrita neste documento diz respeito à preparação, de dicloridrato com graus de pureza adequados para utilização farmacêutica, . recorrendo a; um método sintético não enzimático em dois.passos. Uma concretização 5 da invenção é um método de síntese dó dicloridrato de histamina.qué inclui: descârboxilar-se uma solução contendo L-histidina, para o que se prepara uma solução contendo histamina. na ausência de um enzima descarboxilante; formar-se uma solução .contendo monocloridrato de histamina a partir da solução contendo a histidina; e formar-se uma solução contendo dicloridrato .de histamina a partir, da solução contendo monocloridrato· de' histamina-

Um aspecto desta concretização .inclui também triturar-se a solução contendo a histamina, por. exemplo-, podendo triturar-se' a: solução contendo- a histamina com' uma solução em cloreto de metileno. Noutroaspecto desta concretização, .forma-se . a solução contendo.'o monocloridrato de histamina por adição de uma quantidade eficaz de ácido clorídrico numa solução . em isopropanol. Por exemplo, a quantidade eficaz de .ácido clorídrico; é de entre cerca de 0,1 e 0,9 equivalentes molares de ácido clorídrico, em relação . ã base livre de histamina. Noutro exemplo, a. quantidade eficaz de ácido clorídrico é de . cerca de 0,6 equivalentes molares de ácido clorídrico por base livre de histamina. Ainda um outró aspecto desta concretização inclui também ..o passo de se isolar um dicloridrato- de histamina com grau de puxeza farmacêutico a partir da, solução contendo dicloridrato de histamina.

Outra concretização da invenção descrita neste documento é um método para se sintetizar um dicloridrato de histamina com . grau de pureza farmacêutico1 que inclui: - 6 descarboxilar-se uma . solução. contendo. L-histidina, formando-se desta modo uma solução contendo histamina na ausência de dum enzima descarboxilante; , formar-se uma solução contendo , monocloridrato de histamina a partir da solução contendo .histamina; .formar-se uma solução contendo dicloridrato de. histamina a "partir da solução contendo monocloridrato de histamina; e isolar-se o dicloridrato de histamina a partir da solução contendo dicloridrato· dê histamina. d : '·

Num aspecto .desta concretização, o dicloridrato de histamina contém quantidades menores., ou iguais às listadas adiante., das seguintes impurezas: 0,8 % de mon.ohidrato de L-histidina*HGl, 0,1 % de impurezàs individuais, detectadas por cromatografia, e 2 % de impurezas totais.

Breve.Descrição dos Desenhos „ A figura .1 ilustra um método sintético conhecido na técnica. A Figura 2 ilustra o método descrito neste documento, em pormenor nos. Exemplos 5 e 6.

Descrição Pormenorizada da Invenção A invenção descrita neste documento diz respeito à preparação . de graus de pureza farmacêuticos de 7 dicloridrato de'histamina utilizando um processo sintético não enzimático em dois passos. A invenção descrita neste documento descreve a síntese de dicloridrato de histamina pela descarboxilação não enzimática de histidina e pela transformação em passos do produto descarboxiiado na· sua. forma de sal dicloridrato. A invenção descrita neste documento conduz, a um produto final que é o dicloridrato de histamina contendo menos do que as percentagens indicadas de cada um dos produtos seguintes: 0,8 % de monohicrató de L-hÍstidina*HCl, 0,1 % de . impurezas na' cromatografia (definidas adiante), e 2 % de impurezas totais,: para ser aceitável para.utilização farmacêutica.

Os métodos sintéticos conhecidos na técnica para se sintetizar o dicloridrato de histamina não. permitem obter produto com um grau de pureza 'suficiente para ser utilizado .como composto farmacêutico.· A Figura' 1 mostra um-método envolvendo uma descarboxilação, que. é ensinado na técnica. Os passes do método da invenção. descrita neste documento estão descritos· na Figura 2.

Os métodos da técnica anterior foram utilizados para se gerar o dicloridrato de histamina a partir da L-histidína utilizada como'matéria-prima, numa tentativa para se gerarem graus, de pureza farmacêuticos dé dicloridrato de histamina. sintético. Fez-se reagir a matéria-prima com os Catalisadores da técnica anterior, α-tetralona e ciclohexanó. Depois de completada a reacção, arrefeçeu-Se â amostra e borbulhou-se ácido.clorídrico através, da solução para se transformar a base livre de histamina na sua forma de sal dicloridrato.. . Ό precipitado que se formou foi' filtrado,- lavado e seco.' 0 produto final produzido pelo método da técnica anterior continha no entanto, um número de contaminantes demasiado elevado.· e não era portanto aceitável 0 grau de pureza do material produzido pela técnica anterior, em bruto/ era de 92-94 % cora.uma impureza principal a 3-5 % e cinco a oito outras impurezas a > 0,1 %. Levaram-se a cabo passos adicionais de purificação ou recristalizações, que foram substancialmente eficazes na remoção da maior parte destes contaminantes. No entanto, existiam.duas impurezas residuais não identificada.- a níveis' acima: dos 0,1, %. Estas impurezas eluíam depois' do produto,· dicloridrato de histamina, e' são referidas , como' impurezas cromatográficas ou contaminantes. Deste" modo, c produto feito por- este'. método era. inaceitável para: utilização farmacêutica. . Atentos. . estes resultados, foi concebido um novo processo para a síntese do dicloridrato.de histamina com o grau de pureza pretendido. Este novo .processo envolveu a descarboxilação "da :L-histidina (ou do ácido a-amino-4(ou. 5)-imidazolepropiónico (C6H9N3O2) para se obter a histamina.. Depois da descarboxilação, triturou-se a solução contendo a base livre histamina com cloreto, de metileno para se precipitar o produto^. Filtrou-se então' o produto, e lãvou-se.·Tratou-se o produto filtrado subsequentemente'com ácido 9 clorídrico em isopropanol para se precipitar um sal d dicloridrato de. histamina em bruto.. Filtrou-se e isolou-se este produto. Pode purifiçar-se subsequentemente o sal em bruto por técnicas;de recristalização ou pode prosseguir-se para . o passo · final modificado do processo actual. Em. seguida, trata-se de novo o sal monocloridrato mais uma vez com uma solução de ácido clorídrico em- isopropanol. para., se .gerar a forma de. dicloridrato . de histamina da molécula.- A forma final do produto é então descorada, e lavada.· 'Estes passos, denominados recristalizaç.ão,.·· .·.. podem -.ser extensivamenté repetidos para se obter ..o- dicloridrato de· histamina com utilidade farmacêutica. Todos os passos foram levados acabo. sob.uma atmosfera de azoto gasoso. Analisou-se a pureza do produto final por diversos métodos analíticos, ..incluindo uma análise por HPLC. A invenção descrita neste documento contempla a utilização de diversos catalisadores ou ' iniciadores -de reacções radicalares diferentes para facilitar a reacção de descarboxilação. Um catalisadorapropriado é um catalisador que catalise eficientemente a descarboxilação da histidina. quando o composto precursor se encontre num solvente neutro e se aqueça durante diversas horas para se obter o produto final com um grau. de pureza · aceitável. São -preferidas as cetonas enriquecidas em electrões uma vez que com elas tende.a diminuir o número de impurezas presentes no produto final. . -Por. exemplo, inclui-se nos. membros de um grupo aceitável de catalisadores : peróxido -. de benzoílo, 2,2’-azobisisobutironitrilo (AIBN), 2-ciclohexen-l-ona, 10 acetofenona, 4' -bromoacetofenona, benzofenona,· p-nitroacetofenona, metilacetofenona, p-metoxiacetofenona,. p-metilacetofeηona/1-met i1-4-ρipe r i dοπa, e metilacetofenona/AcOH.

As condições . da reacção de. descarboxilação promovem a descarboxilação das matérias-primas enquanto minimizam a . formação dós contamir.antes indesejáveis. As. condições reaccionais incluem levar-se. a cabo os diversos passos.reaccionais do método na presença de um gás Inerte, por exemplo., . azoto.,; ,Inclui-se também nas condições reaccionais levar-se a cabo o passo de descarboxilação a uma temperatura adentro, da : gama de entre cerca de 145 e 17 0 °C. h reacção é. 'preferivelmente ' levada a cabo uma temperatura adentro da'gama. de entre cerca de 150 e 165°C, ou a uma temperatura, adentro' da gama de entre cerca de 160 e 165°C.

Encaram-se diversos solventes para utilização na invenção que se descreve, neste documento.'Ós solventes nos quais determinados passos, da reacção são' conduzidos podem afectar o período, reaccíonal necessário para catalisar, a descarboxilação da histidina. Incluem-se nos solventes que se podem utilizar na invenção, descrita neste documento: ciclohexanol, N-metilpirrolidinona ' (NMP), di-(etilenoglicol) , éter. metílico do' di- (etilenoglieol) ,' éter 2-metiioxietilico, 1-butanol, metcxietar.ol, ciclohexanól/NMP (numa razão de 3:1), dimètilformamida, e tetrametilenossulfona. - 11 -

Outro . parâmetro da reacção descrita neste documento é o método para criar a forma salina da histamina por tratamento da mistura com cloreto de. hidrogénio.. Verificou-se que-.c perfil de impurezas do produto final era áfectado pelo número de equivalentes molares de ácido que são adicionados · durante a precipitação- do sal monocloridrato em bruto. É possível controlar a extensão da: formação- de impurezas preparando, uma solução de ácido clorídrico em isopropancl com uma concentração conhecida, e tratando a mistura reac-cional com.ela,-

Pode utilizar-se uma gama de equivalentes molares de ácido , clorídrico (HC1-) em isopropanol . (ISA) para ' levara cabo o método da invenção que se descreve neste- documento. Pode utilizar-se uma gama' de entre cerca.-· de 0, Cl e 2 equivalentes molares para dar . origem- à forma salina da histamina. Em alternativa,, pode utilizar-se uma 'gama de entre cerca de C, 05 e 1,4 equivalentes molares . Noutra alternativa, pode. utilizar-se uma gama dè entre cerca de 0,1 e 0,9 equivalentes molares. Noutra alternativa ainda, podem utilizar-se cerca de 0,5 equivalentes molares. A razão que é seleccionada para levar. a. cabo a . invenção descrita neste documento deverá originar a formação de um produto final com um nível aceitável de impurezas de tal modo ' que o " produto final possa ser utilizado numa composição farmacêutica. ' - 12 A. concentração da solução ácida, utilizada para gerar a forma salina não. era um íactor critico. 'Por exemplo, a concentração de HC1 em ISA pode variar adentro da gama de entre cerca de.6 e 9 N. No entanto, o número de moles de ácido que são introduzidas é crucial para se .isolar o produto . final com um grau .'de pureza aceitável do ponto de vista farmacêutico. A adição de ácido demais provoca o aparecimento de impurezas que precipitam, com. o sal monocloridrato·: e. que ’ são. extremamente difíceis de eliminar durante a formação, subsequente do sal dicloridrato de histamina. A, relação entre o método de formação de sal de histamina e a criação de contaminantes não tinha' sido considerada previamente na' técnica.·

Podem utilizar-se diversos co-solventes durante < adição do HC1 em Isopropanol, para se levar a cabo a precipitação do sal : monocloridrato da molécula (precipitação do sal). Incluem-se nos co-solventes utilizáveis ria .. invenção e descritos neste documento:, cloreto de metileno, ciclohexanol, tolueno e éter metil-terc-butilico (TBME). : É uma preocupação fundamental a pureza do produto final. Também se contemplam passos adicionais neste método, para purificar o ' produto final. Por exemplo, a recristalização é um processo envolvendo uma cristalização repetida de modo a purificar uma substância. Diversos solventes são utilizáveis no processo de purificação. Incluem-se nestes solventes: cloreto de metilo., 2-propanol, - 13 - metanol, etanol (ETOH), metanol/acetona, água, metanol/acetato de etilo, água/acetona, metanol/etanol, água/etanol, metanol/hexano, água/metanol/acetona, metanol/clo.reto de metileno, 2-propan'ol/etanol, metanol/2-propancl, acetona/2-propanol, acetona/etanol. De um ponto de vista toxicòlógico, prefere-sé um solvente não tóxico,' tal como o ETOH. - : . ..Observou-se a presença de oor nas diversas soluções . que. foram sendo obtidas ao longo do percurso sintético.

Pode adicionar-se carvão activadc para- remover parte da . cor, antes: da recristalizaçao ou num . passo do processo de recristalizaçao. j A invenção descrita .neste documento também, inclui a utilização de reacçõés químicas de derivatização para ajudar, na purificação do diclcridrato de histamina. Deste modo, considera-se que durante o processo de. síntese do dicloridrato de histamina da invenção que se descreve neste documento, serão produzidos derivados químicos de diversas ..impurezas, para .facilitar, a remoção, dessas .impurezas. A criação de um derivado destes envolve: a adição de um grupo terc-butoxicarbonilo a Uma molécula de interesse. Também se podem utilizar outros grupos, modificadores tais como os grupos benziloxicarbonílo (CEZ). 14

Nos exemplos seguintes descrevem-se métodos para se levar a cabo a descarboxilação da hlstidina, bem como o isolamento da histamina' obtida como produto. Também: se descrevem métodos de purificação do produto em bruto, dicloridrato de histamina, utilizando diversos passos de recristalização. Também se descreve ã descoloração mediante utilização de carvão açtivado.

Pode analisar-se a eficiência dos diversos passos dos métodos bem como a pureza do produto final, utilizando os métodos que se descrevem adiante. Pode utilizar-se um ou mais passos de monitorização: para avaliar a eficiência do passo de descarboxilação- Em alternativa, podem utilizar-se diversos métodos de . teste', bem. conhecidos na técnica para analisar a pureza do produto final. Um exemplo de um passo de monitorização- tal . como os mencionados acima é levar, a cabo uma cromatografia em camada :fina (CCF), um processo bem conhecido na .técnica, . sobre diversos·· -produtos reaccionais. Por exemplo, 'podem- monitorizar-se as reacções usando CCF (fase móvel: CH3CN: H20: NH4OH; 7,5: 2,0: 0,5; e aspersão com ninidrina). Este passo de monitorização pode ser levado a cabo em = qualquer momento após o passo de descarboxilação.

Descrevem-se . em pormenor adiante diversas concretizações da invenção. Os exemplos que se seguem destinam-se apenas a ilustrar a invenção e não devem ser interpretados como. limitações .: da invenção . reivindicada. Existe uma série de técnicas alternativas e procedimentos 15 disponíveis aos especialistas da. técnica. que poderiam permitir de uma forma semelhante levar a . cabo a invenção pretendida.

: EXEMPLOS

Preparação de Dicldridrato dé Histamina

Nos, Exemplos, seguintes descrevé-se a sirttesé de diclcridrato de histamina a partir ao composto.precursor L-histidina. Os protocolos', sintéticos, existentes, embora permitam .obter-se diclcridrato de histamina, sofrem da limitação de levarem a um produto final · impuro. .Nos Exemplos adiante descrevem-se diversas, .concretizações da síntese de dicloridrato de histamina;com um grau. de -pureza aceitável do ponto de vista farmacêutico. ·.' Exemplo de Referência 1 . · :' .

Preparação de 500' Gramas, de dicloridrato de histamina em bruto

Descreve-se adiante' um . método para se preparar uma amostra, de 5Q0 g de dicloridrato de histamina.

Carregou-se um balão de doze litros (12 L) , 4 tubuladuras, com fundo'redondo, equipado com.um termómetro, um agitador mecânico, um condensador e. um dispositivo de borbúlhamento dé azoto, com 7,5 L de ciclohexanol (o 16 solvente), 750 gramas de L-histidina (ó substrato) ,e 113 mL de acctofenona {o catalisador)^ Agitou-se a suspensão sob uma atmosfera de azoto, que se manteve todo ao longo da reacção.

Aqueceu-se a suspensão ao refluxo e manteve-se a essa temperatura (150-165°C) durante pelo menos 40.horas. Retirou-se uma pequena .amostra para uma avaliação do processo através dâ detérminação da 'extensão da descarboxilação da l-histidina.

Arrefeceu-.se . a suspensão a uma temperatura inferior a 80°C e carrégaram-se 1875 mL de toiueno. Arrefeceu-se ainda iria is esta mistura até' à. temperatura, ambiente. Fi_t.rou.-se a mistura· através de um funil de Buchner para um. novo balão de fundo redondo de .1.2-L, -com- 4 tubuladuras.' 0 novo balão contendo o filtrado estava.equipado com um termómetro, um agitador mecânico, uma.armadilha para ácido clorídrico e una armadilha para vácuo, e estava preparado, para adição de gás clorídrico. .Sob agitação, arrefeceu-se a solução' a menos de 1C°C. : Mantendo a temperatura do balão abaixo dos 20°C, carregou-se'no mínimo 441 gramas.(2,5 equivalentes) de gás clorídrico. Completada a adição de gás clorídrico, agitou-se a suspensão espessa amarelada obtida à temperatura ambiente durante uma hora. - 17 -

Voltou a filtrar-se a suspensão ' mais uma vez através de um funil de .Buchner. Lavou-se o bolo de filtração, com 375 mL de ciclohexanol e com 37 5 ml de tolueno, e em seguida com' duas porções de 750 mL de tolue.no e duas porções de 750 mL de hexanos. Secou-se o bolo no próprio filtro durante 30 minutos ou mais. 0 bolo de filtração continha uma quantidade substancial de ciclohexanol que foi removida por trituração'.

Colocou-se o bolo de filtração húmido. num balão de 12 Lie fundo, redondo, com 4 tubuladuras, equipado·com um agitador mecânico e com um borbulhador de. azoto. .. Também se carregou eta.nol (ET0H), num volume de 7,5 Li Agitou-se a suspensão à .temperatura ambiente durante‘4 horas. Filtrou-se; a suspensão através de um funil de Buchner. e lavou-se o· bolo de filtração com 403 mL de hexanos. Secou-se o bolo.de. filtração; numa estufa de vazio a 60-65°C de um dia para c outro. ' Por este método obtiveram-se .' 504 gramas: de dicloridrato: de histamina em bruto (um rendimento de 56, 6 %; . com uma pureza de 94,4% determinada utilizando cromat ogra fia liquida· de alta . eficiência (HPLC). Recristali.zou-se .o produto .para melhorar a pureza do produto final. · .. ·

Num balão de 12 L, com 4 tubuladuras e fundo redondo, equipado com um termómetro, um agitador mecânico, um condensador, e- tubo de carga e um dispositivo de borbulhamento de azoto, os 503 gramas de dicloridrato de-histamina em bruto , produzidos acima. Para. além disto, 18 adicionaram-se 4,5 L de ETOH e 200 mL. de água ao balão reaccional para dissolver o bolo de filtração.. Agitou-se a suspensão sob uma atmosfera . de azoto. Aqueceu-se . a suspensão. ao refluxo. Mantendo a suspensão ao. refluxo, adicionou- -se água gota a gota até resultar dissolvida a maior parte dos sólidos. Arrefeceu-se a solução até menos do que 75°C. Carregou-se a solução com uma mistura de 50 gramas de NUCHAR SA (Westvaco, New York, NY) e 50 gramas de CELITE (J. T. Baker, Hayward, CA) . Aqueceu-sê esta suspensão ao refluxo è manteve-se essa temperatura durante 0,5 horas. Arrefeceu-se, a suspensão a entre 55 e 75°C e depois filtrcu-se através de um leito de CELITE para dentro de um balão limpo de fundo redondo- com 12 L, 4. tubuladuras, . Lavou-se o bolo de filtração'.'com. uma mistura de 450 mL de ETOH e. 50 mL de água.'

Arrefeceu-se lentamente a solução filtrada até à temperatura ambiente, sob agitação, de um dia para o outro. Arrefeceu-se mais esta- solução, até 0,59C durante 2 horas. A 0,5°C, filtrou-se a solução através de um funil de Buchner. Lavou-se o boio de filtração três vezes com 200 mL de ETOH arrefecido a entre 0-5°C. Secou-se: o bolo de filtração numa'estufa de vazio a 50-65°C. ' Depois da recristalização, a quantidade final de. produto foi de 299. gramas, (um rendimento de 59,4%), a uma pureza de 99,1 % por HPLC. Descreve-se o protocolo de HPLC' no Exemplo 7 adiante:. Levaram-se a cabo diversas recristalizações adicionais para aumentar o grau de pureza - 19.- do produto final.· No entanto, permaneciam ainda duas impurezas desconhecidas, (RRt 1,3, 1,5) acima do limiar de 0,1 %, depois da recristalização. . A primeira, destas impurezas (RRt 1,3} estava presente tipicamente· .. a .. cerca de ..0,2-0,4 % e a segunda impureza (RRt.1,5) a 0,5-0,6 %. Uma segunda recristalização da amostra .descrita acima levou os teores de impurezas até cerca de, respectivamente, 0,4 é 0,.5 %. 'Quando as amostras eram analisadas- ao fim-de alguns dias, o teor em impurezas parecia aumentar, indicando, que o produto, final levantava .desconfiança quanto, à sua estabilidade. A instabilidade do produto podia explicar porque é que o bolo de filtração, descrito acima evidenciava uma pureza. de 99,9 % por HPLC, mas apenas se obtinha uma pureza de 99,1 % depois de se secar c fabrico. Não foi possível remover as imputezas por tratamentos subsequentes com carvão activado.

Exemplo de Referência 2

Catalisadores para a Descarboxilaçâo da L-histidina 1

Atentos os resultados.descritos acima, levaram-se a cabo diversas alterações do método sintético. Estas modificações destinavam-se a diminuir os teorés de impurezas : desconhecidas até ' um' valor acéitável. Uma variável que se examinou dizia respeito à natureza do catalisador utilizado na rèacção de descarboxilaçâo. - 20 -

Examinou-se . uma série de outros catalisadores,, incluindo acetofenona, para se determinar qual o papel/ se é que este existia, que eles .desempenham na formação das impurezas, cromatográficas. Na Tabela 1 mostram-se os catalisadores utilizados neste estudo. Utilizaram-se os catalisadores à taxa:de 0,3 equivalentes. TABELA 1

Listagem dos Catalisadores c le Descarboxilaçâo Catalisador- Período Reaccional íh) Pureza por. HPLC (%) Impureza . N°1 . Impureza N°2 -.Acetofenona (controlo) 21 4,5 4,0 4' -Brornoacetof enona ' 21 7,0 3,4 Benzofenona . . 21 14,.5 : 2,9 p-Nitrobenzofenona ·. 17 Decomposição Decomposição p-Metilbenzofenona : 16 ' - 1,6 0,71 p-Metoxiacetofenona 16 ' 1,9 2,9 p- Hetoxiacetofenona/1-metil-4-piperidona : 7,5 3,0 2,4 ?" Metilacetofenona/AcOH 7,5 . ; 9,6 3,5

Os resultados da Tabela 1 indicam que a p-metilacetofenona era marginalmente superior à acetofenona -. 21 na cara a diminuição do teor de impurezas analisadas no .produto' final. Por outro lado, a utilização de p-metilacetofenona em conjunto com uma base {l-meti.L-4- piperidona) não evidenciou nenhuma melhoria no teor de impureza gerada, enquanto a introdução de um ácido ' (ácido acético) aumentou consideravelmente as impurezas detectadas no· produto final. Para além disto, a p-meto'xiacetofenona tinha uma vantagem em •-e.laçãc á acetofenona. no que toca à geração de contamina.nt.es, mas não' permitia uma melhoria .significativa, desta melhoria fase à p-metilacerofcnona quando se isolava o sal monocloridrato. /Os. dados sugerem que a utilização como catalisador de uma cetona deficiente em eléetrões.' correspondia a um aumento da geração ’ de impurezas .· analisáveis, no produto1. . final, ) enquanto ' a utilização. de uma cetona deficiente, em eléetrões correspondia a uma diminuição da geração . de .impurezas.Com base nestes resultados., substituiu-se a acetofenona pela p-metilacetofenona., como catalisador utilizado na reacção de des.carboxilação. da invenção que sé descrevo neste documento. ; ·

Exemplo de Referência 3' Métodos, de Produção de Formas Salinas da

Histamina .

Outro parâmetro que se explorou, dizia respeito à geração de dícloridrato' de histamina suficientemente puro, envolvia a equivalência' molar do ácido utilizado, durante a - 22 .- precipitação, do sal em bruto., Um dos factos .verificados de forma surpreendente, no. decurso da invenção que se descreve :neste, ' documento é que: uma diminuição' dos ' contaminantes presentes .no produto final se relaciona com. ò número de equivalentes de ácido utilizados' para. criar a, forma salina da molécula. Nos processos da técnica anterior introduzia-se uma 'quantidade de 2.,5- equivalentes molares de gás clorídrico (HC1.) na solução que continha. . a· histidina descarboxilada (base livre' de histamina) , para. se gerar um sal, diclcridrato em "bruto. Neste, Exemplo examina-se o efeito de se adicionar, um número variável .de equivalentes molares de. ácido clorídrico à solução contendo a base livre de histamina, pela introdução . do ácido dissolvido . em isopropanol.

Testou-se uma série de concentrações de HC1 .quanto aos" seus efeitos sobre as impurezas' na produção. Seguiu-se o protocolo de síntese tal como sé descreveu acima, excepto que se utilizaram 0,3 equivalentes, de p-metilacetofenona com.tolueno como co-solvente para a adição de HC1 - . .Seguiu-se o protocolo do Exemplo 7 adiante para se determinar a presença de impurezas. Os resultados desta gama de concentrações de ácido estão listados ina Tabela 2 adiante. . - 23 - TABELA 2

Equivalentes- de. HC1 e o Seu Efeito .Sobre â Q.eraçao de Impurezas Equivalentes molares de HC1/IPA Pureza, por 1 PLC (%} Impureza N°1 Impureza N°2 Produtos de Condensação. 2 (controlo) 2,5 2,35 22,0 1/4 2,0 1- 2,1 .. 6,5 0,9 0,55 1,15 2,1 · 0, 5 0,06 O > co ço 0,45

Os resultados listados na Tabela 2 ilustram a formá notável como. a .quantidade de ácido adicionada à. solução que continha a base livre de hi st arai na alterou o' teor das duas impurezas presentes nc produto. A diminuição observada foi provavelmente., devida ao facto de às impurezas terem um carácter básico, menos., pronunciado do que - a base livre da .histamina.·. · Eir. consequência, ..a base livre da histamina provavelmente· é protonada em primeiro lugar, seguida pelas impurezas. A utilização de 0,5' equivalentes, molares de MCI proporcionou os resultados ma is favoráveis. no que toca a limitar, os teores .de impurezas analisados . no : produto·. Nestas condições, o produto, em bruto que se isolou foi o .sal nonocloridrato, tal como se, determinou por.titulação do ’ séu conteúdo em cloreto. ..Deste modo., para se sintetizar uma forma, de dicloridrato de histamina com um grau de pureza . - 24 - elevado aceitável, adoptou-se um passo de purificação intermediário envolvendo a geração intencional do sal monocloridrato.. Utilizando este método, nò entanto, seria .. necessário adicionar mais um equivalente de HC1 num passo sintético ulterior de modo· a produzir a forma de dicloridrato da molécula...;

Levaram-se .a ' cabo. mais. . experiências ' para se avaliar, o efeito de -pequenas, alterações'' na concentração' em .. ácido, sobre o rendimento e a pureza do produto. Listam-se '. na. Tabela 3 os . resultados destas .experiências. Estes resultados foram obtidos dos produtos formados a partir de uma mistura reaccicnal com 100 mL contendo 0,3 equivalentes de p-metilacetofenoná'.é. CH3Cl2 a titulo de co-solvente. A . .-selecçâo do CH2CI2 é abordada· em pormenor no Exemplo 4. TABELA 3

Pequenas Alterações dos Equivalentes de Ácido e 0 Seu Efeito Sobre: a Formação de Produtos. | SAL EM BRUTO . . f \ PRODUTO FINAL [ HC1. (eq. )' f'~........ ““l íRendimento !' ·. % r . 1 ] Pureza por HPLC.j i (%.) ; í Rendimento s. *5 j Pureza por HPLC' J 1 . · (%) · 1 * ·"*·—— ;Γ” i Impure z a | Impure z a | I * N° . 1 . p° . 2 | 1 jjlmpureza IN°. 1 Impureza] N°. 2 1 0,57 •43,3 1 0, 05 i. 0,14 . j .......57,7 1 I 0,03 0,07 | r....... ! 0,67- 5.0,6 ' 1 0.,06 ! 0,17 | . 61 i 0,05 • 0,10. | 1 0, 76 1. ! . .53,5 II 0, 09 1 0, 20. ! 59 I | 0,05 0,1 1 - 25 -

Diminuiu-se a largura' da janela de equivalências para se determinar o efeito que uma variação relativamente pequena da quantidade dè ácido tinha sobre o perfil de impurezas no sal em br.uto.. O.s dados listados na Tabela 3 reforçam a observação anterior de que um decréscimo da quantidade dé ácido adicionado resulta; num decréscimo da quantidade de impurezas 'detectadas no produto final,. bem como num decréscimo do rendimento. "Nás experiências subsequentes utilizaram-se 0,6. equivalentes molares de HC1 em relação à matéria-prima.. Para maiores quantidades de produto partindo de maiores quantidades de matéria-prima, a quantidade de ácido necessária era de 0,85 equivalentes molares, de HC1 por mole de base livre, tal como determinados pór análise. Esta quantidade de HC1 calculada representa aproximadamente 0,6 equivalentes molares em relação à matéria-prima L-histidina.

Exemplo dé Referência 4

Co-solventes para Utilização Durante a Formação do Sal A variável seguinte.que se examinou para melhorar a síntese qo dicloridrato de histamina foi o co-solvente utilizado durante o passo 'de adição de ácido noprocesso. Utilizava-se.ânteriormente o tolueno como co-solvente. .Para explorar o efeito possível do co-solvente sobre a pureza do produto final, utilizaram-se diversos solventes no passo de - .26 precipitação. Tal. como acima, a pureza das. amostras resultantes foi avaliada utilizando o. método, dê . HPLC descrito no Exemplo. Mostram-se' os resultados na Tabela 4. 27 TABELA .4 0 Efeito' do Cloreto. de;: Metileno e de Outros 1 sobre a Pureza do Produto Final Oo-solventes 1 . 1 Co-solvente.. j % ... de Rendimento , Pureza por HP^ LC (%.),. .' Impureza N°. Impureza ' N°. 2 V I ' ' ' ITolueno .49,5 ..' 0,13/ ' i ..0'31. 1 (controlo). / 1ch2ci2 45,9 0.,10.. : 0,15 ν'- |. . .. . :T3ME 51,9 0,33 : 0,51 V ' [Nenhum I 43,5 ., 0,12 i 0,18·

As condições reaccionais ' para os resultados reproduzidos na Tabela 4 foram a presença de 0,3 equivalentes de .p-raetilacetofenona, 0,6 equivalentes, de HCl/IPA e 5 partes de co-solver.te para a precipitação. Os resultados da Tabela 4.mostram que o cloreto de metileno .proporciona resultados superiores no que toca à formação de .impurezas, quando'se-compara com os outros co-solventes.

Exemplo la

Preparação de Monocloridrato de Histamina em

Bruto .- 28 - 0 processo descrito adiante ensina a preparação, do monocloridrato de histamina.. Equipou-se um. balão de fundo redondo de 2 litros (2 L) , cor. 3' tubuladuras, (o reactor1) com um termómetro, um .agitador, mecânico, um condensador e um sistema, de purga de azoto, e carregou-se com .1 L de ciclohexancl, 100 g de L-histidina e 25,9 mL de. p-metilacetofenor.a. O ciclohexanol tem um ponto de fusão de 22-22°C e pode ser necessário aquecimento para se gerar um líquido que1se pode transferir, para o reactor. A suspensão tinha uma cor branca, a uma temperatura de entre.20-25°C e um volume de 1050 mL. Agitou-se a suspensão na presença de uma. atmosfera de azoto que se manteve ao longo de toca a reacção. ' ;· . . . Aqueceu-se a suspensão ao refluxo (16C-165°C) e manteve-se ao refluxo durante... 30 horas. Retirou-se .uma pequena .amostra para se determinar qual a percentagem da matéria-prima que tinha ;sido decarboxilada. A suspensão' deve conter 1 1% de L-histidina. No caso de uma reacção incompleta,· continua-se o' aquecimento da' suspensão ao refluxo durante mais 3,5 horas e. volta a retirar-se uma amostra. A formação de uma ' solução homogénea e límpida indica que foi consumida a matéria-prima e se completou a reacção de descarbcxilação. .Completada a reacção, arrefeceu-se a suspensão até cerca de 20-25°C.· Carregou-se então'no' reactor/300 mL dc cloreto de metileno. Arrefeceu-se mais esta. mistura até. a temperatura ambiente..· Filtrou-se a: mistura através de um 29 fujail de Buchner para. dentro, de outro balão de fundo redondo de 2 L, corr. 3 tubuladuras. Lavou-se então o prirr.eirc reaccor duas vezes corr. 1CC mL de .cloreto de metileno que depois se utilizou para cavar o filtro. Este passo de filtração removia'toda a L-histidina residual. ·.. Equipou-se o segundo reactor contendo o filtrado com um termómetro, um agirador mecânico, e. tubo de carga e um sistema de purga de. azoto. Depois, dc passo de lavagens voltou, a estabelecer—sc nc rcaclor uma· atmosfera de azoto, e aqueceu-se o filtrado até 30-35°C. Retirou-se uma aliquota da solução e determinou-se o seu conteúdo em base livre de histanina. Utilizaram-se · os resultados . da determinação' para. calcular a quantidade de. ácido necessária para gerar o sal- monocloridrato. A quantidade de ácido necessária era de 0,85 equivalentes molares de HC1 por mole de base livre de h.i.sramina.

Sob agitação vigorosa, adicionaram-se gota a gota, a uma velocidade tal quê a temperatura da solução não passasse dos 40°C, 50,5 mL de uma solução' 7,65 M de HC1 em isopropanol (HC1/ISA) . Atendendo à natureza.; exotérmica deste passo do método, á adição da solução de HCl/ISA ocorreu ao longo de um período de uma hora-. Deixou-se a suspensão' beige clara resultante arrefecer' até 20-25°C ao longo de 1 hora e agitou-se durante pelo menos ma is 2 horas. A solução 7,65 M. de. HC1 ém isopropanol havia sido preparada borbulhando 27,9 g de HC1 gasoso em 100 mL de isopropanol arrefecido a 5-10°C. -30

Filtrou-se .a. suspensão arrefecida através de um funil . de Buchner sob. uma, corrente de azoto e lav"ou-se o bolo de filtração três vezes corri 100 mL de uma solução de. cloreto de ne t i1e η o/c i c1oh e x a ηo1 a 1:1. Lavou-se' então o bolo. de filtração três vezes com 100 mL- de cloreto de metileno. Uma vez que o sal mcncc.loridrato era muito facilmente solúvel em água,, a . humidade do laboratório, poderia ter un efeito sobre o .-rendimento no produto. A exposição dp: bolo. de filtração à humidade durante o passo de. filtração foi portanto minimizada levando a cabo essa operação em corrente de azoto.·. f' . . Colocou-se então . o bolo de filtração húmido num balão de 1 L, com fundo redondo e 3 tubuladuras,, equipado com um termómetro, um agitador mecânico e um sistema de purga para uma trituração ém cloreto de metileno. Voltou a suspender-se o sólido, em 500.mL. de cloreto de metileno e agitou-se durante 1 hora sob azoto. A trituração em cloreto de metileno ajudava a remoção do ciclohexanol residual e permitia uma secagem mais eficaz, do produto, tal como resultava dos passos .subsequentes que se descrevem em seguida. .

Filtrou-se a .'suspensão, sob uma corrente de azoto, e lavou-se o material sólido duas vezes com 75 mL de cloreto, de metileno. Secou-se o bolo de filtração numa estufa de vazio, durante 16 horas a 55-60°C. -31.- ... A Tabela 5 adiante mostra os resultados.do método descrito neste Exemplo. Levou-se a cano este método três vezes' e . com.pararam-.se os ; rendimentos de produto obtidos. TABELA.5 ! Rendimentos em Monocloridrato de Grude Histamina Em Ernto ijExperiência 1 jiExperiênci.a 2Φ Experiência '3Φ Peso de Sólidoj|50,28 152, 29· . Seco1' j ' · ·. ·.' .! " : 50,28 . 1 % de Rendimentojjsi, 91 ' " 15.5,0.. em. Bruto | |/ 152,9 '. t Os pesos dos sólidos e os rendimentos percentuais correspondentes foram corrigidos levando em' conta c seu conteúdo em solvente. Φ Nas Experiências 2 e .3, secou-se. o bolo de filtração durante 9 horas, é não durante 16. : Exemplo lb , ·. '.

Preparação de Dicloridrato de Histamina por Descarboxilação da L-Histidina 0 Exemplo lb mostra um processo para a. sintese do dicloridrato de histamina a. partir . do produto' precursor, monocloridrato de. . histamina, produzido pelo método : do Exemplo la. ' ‘ - 32 -

Co.locou-se um balão de um litro (1 L) com. fundo redondo e três tubuladuras (o reactor) equipado com umâ barra- de agitação mecânica, um tubo. de carga,. um condensador, e um. sistema de purga de azoto bem como um termómetro,, sobre uma manta de aquecimento. Carregou-se o reactor com'4,0 gramas . de, monocloridrato de histamina, 32 mL de Ξ120 (destilada) , e 280 mL de solução de EtOH. 1 X constituída por 99,5 % de EtOH e 0.,5.- % de tolueno.. Manteve-, sc ro reactor uma. .atmosfera de azoto todo ao lenço da reacção, uma. ve.z. que o sal monocloridrato de histamina , era muito higroscópico,., O pa-sso seguinte do método incluía a adição de uma solução de HC1/ISA para transformar o .. sal. monocloridrato de histamina' na correspondente forma de dicloridrato. Colocaram-se. no reactor 41,5· mL' de uma 'solução 6,85 M de HC1/ISA (1,05 equivalentes) . Tal como se descreveu acima a' adição da solução ácida é exotémica, e portanto adicionou-se o ácido ao longo de um período d.e 15 minutos. Durante : a . parte, inicial da adição de .ácido', formou-se uma solução límpida, que no entanto voltou a tomar o aspecto. .. de uma suspensão branco-sujo., espessa.,' quando cerca de:75 %.,do ácido havia sido adicionado.1..

Depois da adição' ,do .ácido se haver completado, aqueceu-se a suspensão espessa e .branco-sujo resultante ao refluxo (78-80'C) num banho de óleo. 0 material- sólido em suspensão di-ssolveu-se gradualmente para se obter uma solução cor. de âmbar. Uma vez completamente dissolvido o - 33 - material sólido, removeu-se o reactor do banho de óleo, Colocou-se então no reactor o carvão (SidCHAR SA (2 gramas) e a CELITE (2 gramas). Aqueceu-se esta suspensão ao refluxo durante , 25 minutos. ... Á. manutenção' da temperatura era importante uma vez que o produto teria.precipitado a cerca de 60°C. : . '

Filtrou-se a suspensão quente e preta através de um leito de CELITE, para dentro de um novo balão de. fundo .redondo,' com .1' L, com 3 tubuladuras., equipado, com um agitador, mecânico , e com um termómetro. O leito em CELITE serviu· . de barreira para. impedir, a passagem do carvão através . da unidade de filtração. Este novo .reactor havia sido previamente aquecido num banho de óleo e a adição da suspensão ao balão também ocorreu com o balão imerso num banho de óleo. .

Lavou-se duas vezes o primeiro reactor contendo a mistura reaccionál com 40 ml de solução EtOH IX. a uma .temperatura de 60-65 °C. Filtrou-se esta solução e adicionou-se ao filtrado obtido acima. A adição deste volume, de lavagens provocou alguma precipitação no filtrado. O volume.total de solução foi então agitado a 60-65°C durante 30 minutos.;

Arrefeceu-se então .lentamente a suspensão (dicloridrato de histamina) até 25°C ao longo de 1 hora, e agitou-se a 20-259C durante 2 horas e depois até 0,5°C durante mais 2 horas. Filtrou-se então a suspensão sob uma 34 corrente de azoto e lavou-se o bolo de filtração três vezes com 4 0 nL de solução fria de EtOH 1 X. Pesou-se então o bolo de filtração e secou-se numa estufa de vácuo a 55-60 °C-durante 16 horas. Na Tabela 6 mostram-se os resultados de três experiências . diferentes de transformação. do monocloridratp.de histamina no seu sal dicloridrato. ' ' TABELA 6 *SS3SSS3íB^ ...........-______ í · . .···. ·' 'Experiência 4 [Experiência 5 jjjExperiência 6 Peso . do -,Bolo Húmido (gramas) co 00 [ 45,6 , ! .46,4 jpeso·.de sólido seco.' (gramas).” 34,9 33, 3- ; : | 33, 6 . ' Ί Rendimento em %. ; : 7 0 . 66,7 | 67,4 0 valer da percentagem : de ' rendimento . era baseado rio [monocloridrato de histamina, corrigido do .seu conteúdo em fsolyente. ' [ . Exemplo 2

Um Método de HPLC para Avaliar, Identificar e Determinar a Pureza de Dicloridrato de Histamina

Neste exemplo- , descrève-se a utilização"' de HPLC para quantificar e identificar o dicloridrato de:histamina e para' quantificar substâncias relacionadas, e produtos de degradação no produto final.. 0 método empregou um sistema de KP1C completo' com um gradiente de eluição e com. capacidade de detecção no UV. Para as .determinações da pureza cromatográfica, utilizou-se.· um sistema contendo : um sistema computadorizado de aquisição de dados·. Outro, equipamento utilizado incluía: uma coluna Waters. Symmetry C-18, de 5 μη, 4, 6 : 350 mm; uma balança analítica., com ' uma resolução' de ./.0,, 01 mg ou. de 0,01 ç; material /volumétrico ' em vidre; e ur. sistema de aquecimento da coluna.. Os reagentes e cs padrões utilizados .incluíram: um padrão da U3P de clcridratc· de histamina ou equivalente; metanol com gráu de pureza . para H?LC; acetonitrilo com grau de .pureza para HPLC: sal sódico de ácido 1-heptanossulfónico com grau de pureza para HPLCda Fishér Sclentlfic . (Pittsburgh, PA) ou equivalente·; monohidratp. de fosfato de sódio monobásico, ACS,. com grau de pureza de reagente; monohidrato de monoclcridrato de D-, L-histidina, (Sigma St. Louis, MO); solução de hidróxido de sódio 1 N; solução , de ácido', clorídrico 1 N; água purificada, +e álcool benzílico, ACS, grau de pureza de reagente, ou equivalente.

Prepararám-se dois tampõés de fase móvel. A Fase Móvel A (MPA) continha fosfato desódio monobásico 0;02 Me ácido heptanossulfónico'0,005 M, com o pH ajustado a 3,0. A Fase Móvel B (MPB) continha acetonitrilo (AON)/metanol (MeOH): a 20/15 (em volume). . . Prepararam^s.e. os padrões' e as amostras para as determinações cromatográficas.de pureza. Os padrões para as - 3.6 - determinações envolviam a preparação de soluções padrão de •dicloridrato de histamina a três Concentrações: 0,88.mg/mL, 0,8C ng/ml, e 0,72 mg/mL·.. Prepararam-se. padrões. de monohidrato de monocloridrato de DL-histidina a 0,CCS mg/mL. De modo semelhante prepararam-se em duplicado amostras . padrão de modo ' .' a conterem . 0,8 . mg/mL de dicloridrato de histamina produzido por síntese enquanto a solução para determinar o limite de quantificação (LOQ) foi preparada com 0,0006 mg/mL de .dicloridrato de histamina.. Detèxminou-se a sensibilidade;· do método para a Histamina como sendo de 0,07 % para o limite de quantificação e de 0,03';% para o limite, de detecção. A especificidade para a. histamina foi demonstrada num estudo da pureza do pico obtido com detecção por. um conjunto de fotqdíodos.

Após a preparação dos '.diversos '. padrões, e amostras,; · equilibrou-se o sistema ' de . HPLC. . Uma- vez equilibrado o sistema, confirmou-se o caudal da coluna, de • efluente nas'. condições iniciais de funcionamento {isto é, 10 % de MPB a· .1,5 .mL/minuto) . ' Ό caudal' era de 1,5 rnL/minuto ± 0,15 mL/minuto. - 'Fez-sé. uma injecção de um branco, de água,· depois de o sistema estar equilibrado/ para preparar .a .coluna, antes de se iniciar o teste.

Completadas estas preparações, . injectou-se a solução . de' resolução, a 0,7 mg/mL ' +' 0,1 mg/mL de dicloridrato de histamina,.: Calculou-se ε resolução "R" entre um pico devido a uma solução de álcool benzílico a 1 .- 3 7 - mg/xnL e o pico da histamina. Além disto, repetiu-se ésté processo cinco vezes (5) e calculou-se um desvio padrão.

Para o teste,· . gerou-se uma curva, padrão de calibração. Confirmou-se. o padrão a cada quatro, a' seis injecções e verificou-sc que se encontrava adentro, dos seguintes parâmetros: C factor de cauda (tailing) não.era > 2,0;. a resolução, era >1,5, o desvio padrão médio das respostas do pico de histamina não era > 2,0 %; e ; o coeficiente de correlação da curva padrão não era inferior a 0, 995.

Para se calibrar a- pureza cromatográfica, fez-se uma única; injecção de solução de resolução. Calculou-se. a resolução., "R" entre cs picos de álcool benzílico e de histamina' e. também o; .factor. de cauda para· o pico' de histamina..' Uma vez que tanto ' a, resolução como o factor de cauda se'encontravam adentro: das especificações, levaram-se a cabo três injecções consecutivas da amostra de LOQ.

Os valores ré la ti vos'. dos desvios padrão Standard para as três respostas a histamina forma calculados. Em geral o facto de cauda não era > 2,0, a resolução era maior que 1,5, e os desvios padrão relativos das respostas pico da histamina não eram superiores a 10 %.

Uma vez que se conseguiram atingir s parâmetros acima.,' testaram-se as amostras finais de dicloridrato de' histamina. listam-se na Tabela 7 os parâmetros· de operação' - 38 - para a HPLC. Listam-se os parâmetros do gradiente na Tabela 8. TABELA 7 j Parâmetro'de Operação. J L ,· Ί íCaudal: il, 5-mL/minuto .. ; | Γ'1!Ί""1,......'ΠΙΙΤ'ΤΙΊΤΙΙΙΤΠΤΙ,Ι,Τ-ΤΠΙΓΠΤ. E ' ; IVoliime .de II I ·.: jlnjecção: . :2C μΐ I Det-ecção: . |a 212 . nm \ ; · j Coluna: ..· ^Waters Symmetry C-18, 5 μιη, 4,6 (mm x 250 mm : I Temperatura da Coluna: |δ 0° C v . Concentração do. Teste: |θ,8 mg/mL de dicloridrato de ihistamina . f™™"* .. Período. do teste: ...............- jcerca de 30 minutos Fase Móvel A: Fase. Móvel B: . Isolúção tampão Γ“ ·:. . . . . _ “η SACN/MeOH '20/15 {em volume) TABELA 8

Parâmetros. do; Gradiente- |1 Tempo (minutos). ||% . de Fase Móvel. B Caudal ...............: iL............... (mL/minuto) o'. í.:-' 1 10 i,5 : - 39 - I-.· .................................. ·.· "i jj Parâmetros do Gradiente jTempo (minutos) |% de Fase Móvel 3 iCaudal 1 ' · : - · i ...... j (mL/minuto) o . - <N ! 30 . I:- 1,5 1 : 21 r , 10 ' li'· 1/5 L :_r '30 . 10' 1.,.:..........;...:....."1,5

Per iodos de Retenção:' histidina -.. cercã .de 3 minutos; histamina, = .cerca de 12 minutes A utilização deste1 sistema 'analítico proporcionou . a metodologia necessária .para se determinar' a ; .pureza·, da amostra de dicloridrato de histamina produzida- nos . exemplos acima,.· ·.. .-o ··.

Exemplo 3

Análise por HPLC do Produto, Dicloridrato de

Histamina • Submeteram-se os produtos, . dicloridrato de histamina, do Exemplo 1b, . à análise por HPLC descrita no Exemplo 2, para se- determinar a pureza das amostras e para. estabelecer, se, os produtos· finais - respeitavam ,os critérios de pureza definidos· para o método da invenção que se. descreve neste documento. Para utilização a··, titulo de. agente· farmacêutico, o dicloridrato' de histamina tem que possuir quantidades mínimas de impurezas cromatográficas.. Âs . impurezas individuais analisadas acima de 0,1 %, em - 40 -: área, necessitam em geral. de uma qualificação toxicológica.-Geraram-se ' três lotes ' de dicloridrato de histamina utilizando os métodos doá Exemplos lã· e lb. Descreve-se a sua pureza na Tabela 9. TABELA 9

Resultados da Análise por HPLC . | lExperiênciá f· . | . · · . · : Descrição .das' Impurezas· jjEspecifiçado.; | iSDeterminado'. 1' 1 ÍExperiência l1:·...:.....i_. 1_ Konohidrato de L-:'< 0,8 % em . peso;! Histidina*HCl ' βίίο detectado . . ] S . ' ' Impurezas , ." |< . 0,1 '·%·. em pesoj Cromatograficas |< 0,05 % em peso! Individuais' Impureza N°|0,13% em peso | 1 Impureza. N° 2 J . ] Impurezas iCromatográfidas To.ta.Is j<. 2,0 % ' em peso; j0:, 2 % em peso ExperiênciaIjMonohidrató . , de : '.L-2 ÉHistidina*HCl . |< 0,8 % em peso; Não. detectado L·. . «J. ' . - · - 1 Impurezas ' ’ . : 1 Cromatográf ioas·' Individuais ..Impureza N° ll Impureza N° 2 j< 0,1 % em pesoj j< 0,05% em pesoj !0.,10- % em peso . ... j ' · Impurezas Cror.arográficas Totais k 2·, 6 ' % em · peso; 0,2 % em peso: j Experiência 3 : Mon.ohidrato . de L-Histidina*HCl < . Õ, 8 % 'em·- peso; Não detectado | Impurezas Cromatográficas Individuais Impureza N° 1 Impureza N° 2 <0,1 %.em peso; < 0,05 % em' peso; 0,06 % em peso ιιι··ΐΓΐΐ'.···Μίΐι:ιΙι·ι>ιιί<Ν'<ιιΐί<ίιΙίΗ6^ιΐΓ>ΐΝΐίΙιιιιιι1ιιιιιιιιιιιι»:ΗΗ>Ηΐιιιιιιιιι;ΐ!!τ!ι::::^Γ··}ΓΓ··!ί··ίκι:;ιΐιιιιιιι>ιιιιτικ;ι«ι!·Γ!·.ίί>:!«>!ΐ!ΐιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιι:ι:ίϋΐ:ίϋϋϋΐϋί»ίϋΙίί«:ίι«ί ... |lrapurezas ·, ÍCromatoçráficas Totais < 2,0. % em peso; 0,1 % empeso j

Os resultados descritos na Tabela 9 mostram que o dicloridrato de histamina,. obtido, como produto· . final respeita os padrões de aceitabilidade definidos para a - 41 - invenção e descritos neste documento.. Em primeiro lugar, verificou-se que o teor em Impureza, N° 1 era inferior ao limite de quantificação para o teste. Em segundo lugar, verificou-se que o teor em Impureza, N°. 2 apresentava valores ligeiramente acima do. limiar definido de 0,1 % e que portanto ela precisava de ser qualificada por . testes toxicoló.gicos. O teor·1 especificado para a impureza foi estabelecido como. sendo de <. 0,2 % em peso. Estes resultados mostram 'que · o método , sintético . dá invenção descrito neste' documento proporciona um método de· síntese de uma forma aceitávèl do ponto de vista farmacêutico do dicloridrato de histamina.

Conclusão A invenção descrita neste documento descreve um .método novo, não " enzimático, . para ,. sé produzir . um dicloridrato de histamina. de' grau de pureza farmacêutico. Uma vantagem significativa do método descrito: neste documento, é que permite obter dicloridrato de histamina com um grau de pureza superior ao que se encontra' presentemente disponível. ; .

Por .· último,, os exemplos acima não pretendem limitar o âmbito da invenção presente, o qual se define nas reivindicações seguintes. Em particular, as pessoas com conhecimentos, médios da técnica· .reconhecerão diversos pormenores equivalentes, e substituições possíveis, face. ao conteúdo da especificação acima, e considera-se que estes e 42 - estas se incluem.no âmbito da invenção descrita

Lisboa, 25 de Setembro, de 2008

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1.. Um método de síntese de dicloridrato . de hi st amina' incluindo descarboxi.1 ar-se · uma .solução ' contendo L-histídina. utilizando um . ..catalisador selcccionado i de entre . peróxido de ' benzdílò, 2,2’ -azobisisobutiror.itri.l.c (AIBN) , 2-ciclohexenrl-ona, acetofenona, 4'-. bromoacetof en.pna ,·. benzofenona, p-nitroacelofenona, meti.lacetof enòna, p-metcxiacetofenona, p-metilacetofenona/l-metil-4-piperidona, e. metilacetofenona/AcOH, no· qual se forma uma solução contendo histámina; formar-se um sal de montícloridrato de histamina .a partir , da.·'solução contendo mohocloridràto de histámina por tratamento com uma .quantidade eficaz de ácido clorídrico em isopropanol, e purificar-se o sal monocloridrato de histamina por recristalização; e formar-se uma .solução contendo dicloridrato de histamina a partir do sal de monocloridrato de histamina· purificado por tratamento com ácido clorídrico em isopropanol.

2. 0 método da Reivindicação 1, incluindo também tritura'r-se a solução contendo histamina.

3. 0 método da Reivindicação.. 2,' no qual a solução contendo histamina. seja triturada com uma solução em cloreto- de métileno.

4. '0 método de qualquer, uma das reivindicações 1 e -2.,-:.-: em- que a . quantidade de ácidó clorídrico seja de entre cerca ae 0,1 e 0,9 : equivalentes molares em relação à quantidade de.base livre de; histamina.

5. 0. método dá Reivindicação 4, em que a quantidade equivalente de ácido clorídrico seja de cerca de 0,6 equivalentes molares de ácido clorídrico em relação à base livre de histamina.

6. 0 método de qualquer uma' das Reivindicações 1 a 5, no qual o dicloridrato de histamina contenha no máximo 0,8 % do monohidrato de L-h:.stidína*HCl, 0,1 % de impurezas cromatograficamente individualizadas, e 2 % de impurezas totais.

---- -- 7. .0 método de qualquer uma das Reivindicações 1 a 5, no qual a solução , contendo o dicloridrato de histamina contenha no total menos do que 2 % de' impurezas, tal como quantificadas por análise de HPLC.

-8.:-.0 método de qualquer uma das Reivindicações 3 .1 a ·7, incluindo também a adição de um co-solvente. durante 0 tratamento· com ácido clorídrico em isopropanol para se formar o sal monocloridrato . de histamina, em .que· o co-solvente referido seja. seleccionado de . entre, cloreto, de metileno, ciclohexanol, tolueno e éter metil-t-butílico.

9. 0. método de qualquer' uma das Reivindicações la 8, incluindo também recristalizar-se o dicloridrato de histamina com um solvente para se obter uma forma aceitável do ponto cie vista farmacêutico de . dicloridrato de histamina·. ; :.>, 10. 0.método de qualquer uma das· Reivindicações 1 a 9, no qual o solvente utilizado para a recristalização seja seleccionado de entre cloreto dé metileno, 2-propanol, metanol, ecanól, metanol/acetona, água, metanol./acetato de etilo, água/acetona, metanol/étanol, água/étanol, me t an o 1./ h e x a π o, água/metanol/acetona, metanol/cloreto de metileno, 2-propanol/etanol, metanol/2-propanol, acetor.a/2-propanci e acetona/etanol. . Lisboa, 25 de Setembro'de 2008