ES2310056T3 - Sintesis de dihidrocloruro de histamina. - Google Patents
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Abstract
Un método para la síntesis de dihidrocloruro de histamina que comprende: descarboxilar una solución que contiene L-histidina, utilizando un catalizador seleccionado de: peróxido de benzoilo, 2,2''-azo-bis-isobutironitrilo (AIBN), 2-ciclohexen-1-ona, acetofenona, 4''-bromoacetofenona, benzofenona, p-nitroacetofenona, p-metilacetofenona, p-metoxiacetofenona, p-metilacetofenona/1-metil- 4-piperidona, y p-metilacetofenona/AcOH, con lo que se forma una solución que contiene histamina; formar una sal de monohidrocloruro de histamina a partir de la solución que contiene histamina, mediante tratamiento con una cantidad efectiva de ácido clorhídrico en isopropanol, y purificar la sal de monohidrocloruro de histamina por recristalización; y formar una solución que contiene dihidrocloruro de histamina a partir de la sal de monohidrocloruro de histamina, mediante tratamiento con ácido clorhídrico en isopropanol.
Description
Síntesis de dihidrocloruro de histamina.
La histamina es un compuesto que posee una
actividad biológica importante, mediada por receptores
farmacológicos. Desde hace tiempo, la histamina se contempla como
una molécula que tiene, principalmente, efectos biológicos
negativos. Recientemente, sin embargo, se han puesto de manifiesto
nuevos usos de la histamina como potente agente farmacéutico. Por
ejemplo, se ha usado histamina junto con
interferón-alfa para activar células NK en
presencia de monocitos. Véase la Patente de EE.UU. Nº 5.728.378.
Para poder beneficiarse de las propiedades terapéuticas de la
histamina, es necesario obtener grandes cantidades del compuesto de
grado farmacéutico.
La histamina está presente extensamente en la
naturaleza como resultado de procesos de putrefacción y un derivado
de la misma, dihidrocloruro de histamina, se vende en el comercio
como sustancia estándar para ensayos y como componente en ciertos
kits de diagnóstico de alergias. Con frecuencia, la fuente de esta
histamina es de origen natural y, como tal, contiene una variedad
de contaminantes que la hacen inapropiada para su iso farmacéutico.
Se conocen en la técnica también protocolos sintéticos para la
síntesis de dihidrocloruro de histamina.
El dihidrocloruro de histamina se puede
sintetizar, de manera conveniente, usando la descarboxilación de
histidina. Empleando esta vía de síntesis, la histidina se
descarboxila y, subsiguientemente, se trata para formar la forma de
sal dihidrocloruro de la molécula. Por ejemplo, Hashimoto y col. han
analizado la preparación de histamina usando ciclohexanona como
catalizador para la descarboxilación de la histidina (Hashimoto y
col., Chemistry Letters, 893-896 (1986)). El
estudio de Hashimoto y col. informa sobre el aislamiento de
dihidrocloruro de histamina con un rendimiento de 95%, usando
2-ciclohexen-1-ona
como catalizador, a partir de la reacción en la que interviene la
histidina y
2-ciclohexen-1-ona
al 1% en volumen en 10 partes de ciclohexanol a reflujo (26 horas).
El método de Hashimoto preconiza también el uso de tolueno y HCl
gaseoso que se hace burbujear a través de la solución
descarboxilada resultante para hacer precipitar y recoger el
producto final de dihidrocloruro de histamina.
Los intentos de reproducir el procedimiento de
Hashimoto para producir cantidades farmacéuticamente puras de
histamina han fracasado. Fueron necesarias cantidades adicionales
del catalizador para hacer el procedimiento operativo y en el
producto final hubo una cantidad sustancial de impurezas. Además,
estas impurezas fueron difíciles de eliminar. A la vista de estos
resultados, se encontró que el procedimiento de Hashimoto es un
método no apropiado para generar grandes cantidades de histamina
farmacéuticamente aceptable.
También se ha informado sobre el uso de
acetofenona como catalizador para la descarboxilación de histamina.
Los presentes inventores reprodujeron el método descrito en la
patente japonesa concedida a Akimasa y col. (Patente Japonesa Nº
05.255.204 (1983)) y usaron 0,26 equivalente de acetofenona y 10
partes de dietilenglicol como disolvente para la reacción de
descarboxilación. Aun cuando el método de Akimasa y col. fue mucho
más eficaz para la conversión de histidina en histamina, fracasó en
cuanto a proporcionar de manera consistente un producto de grado
farmacéutico. Al igual que el producto final obtenido con el método
de Hashimoto, durante el análisis de HPLC se observaron impurezas
en el producto final preparado según el método de Akimasa.
Aunque las condiciones con acetofenona y
dietilenglicol parecían prometedoras, se observó un problema
relacionado con el procesamiento. Tanto la base libre de histamina
como la sal dihidrocloruro son fácilmente solubles en agua y, por
lo tanto, resultó difícil utilizar cualquier técnica de extracción
para separar el producto del disolvente de dietilenglicol que,
normalmente, se retiraba con extracción con agua. Adicionalmente, el
dihidrocloruro de histamina también fue fácilmente soluble en
dietilenglicol, por lo que también es imposible el aislamiento
directo por filtración.
Igualmente, se reprodujeron las condiciones de
reacción de Takano y col., en las que interviene la
pentan-3-ona (Heterocycles,
6:1167).
Los resultados de estos experimentos no
mostraron ninguna mejoría con respecto a las condiciones de
acetofenona descritas anteriormente.
Se requiere una fuente consistente de histamina
de grado farmacéutico, en especial considerando las aplicaciones
farmacéuticas recientemente encontradas para la histamina. Los
métodos convencionales usados en la técnica, en los que la
histamina se purifica a partir de fuentes naturales, no son capaces
de proporcionar histamina en un grado suficientemente alto para los
usos farmacéuticos. Además, los métodos de síntesis que se llevan a
cabo en la técnica tampoco son capaces de lograr histamina con un
grado suficientemente alto. En consecuencia, existe en la técnica
la necesidad de un método optimizado mediante el cual se pueda
producir dihidrocloruro de histamina de grado farmacéutico.
La invención que se describe en este documento
se refiere a la preparación de grados farmacéuticos de
dihidrocloruro de histamina usando un método de síntesis no
enzimático de dos etapas. Una realización de la invención es un
método para la síntesis de dihidrocloruro de histamina que
comprende: descarboxilar una solución que contiene
L-histidina, con lo cual se forma una solución que
contiene histamina, en ausencia de una enzima de descarboxilación;
formación de una solución que contiene monohidrocloruro de histamina
a partir de la solución que contiene histamina; y formar una
solución que contiene dihidrocloruro de histamina a partir de la
solución que contiene monohidrocloruro de histamina.
Un aspecto de esta realización comprende,
además, triturar la solución que contiene histamina; por ejemplo,
la solución que contiene histamina se puede triturar con una
solución de cloruro de metileno. En otro aspecto de esta
realización, la solución que contiene monohidrocloruro de histamina
se forma por la adición de una cantidad efectiva de ácido
clorhídrico en una solución de isopropanol. Por ejemplo, la cantidad
efectiva de ácido clorhídrico es de aproximadamente 0,1 a 0,9
equivalentes molares de ácido clorhídrico con respecto a la base
libre de histamina. En otro ejemplo, la cantidad efectiva de ácido
clorhídrico es de aproximadamente 0,6 equivalentes molares con
respecto a la base libre de histamina. Todavía otro aspecto de esta
realización comprende, además, la etapa de aislar un grado
farmacéutico de dihidrocloruro de histamina a partir de la solución
que contiene dihidrocloruro de histamina.
Otra realización de la invención que se describe
en este documento es un método para sintetizar un grado farmacéutico
de dihidrocloruro de histamina, que comprende: descarboxilar una
solución que contiene L-histidina, con lo que se
forma una solución que contiene histamina en ausencia de una enzima
de descarboxilación; formar una solución que contiene
monohidrocloruro de histamina a partir de la solución que contiene
histamina; formar una solución que contiene dihidrocloruro de
histamina a partir de la solución que contiene monohidrocloruro de
histamina; y aislar el dihidrocloruro de histamina a partir de la
solución que contiene dihidrocloruro de histamina.
En un aspecto de esta realización, el
dihidrocloruro de histamina contiene cantidades iguales o inferiores
a las siguientes: 0,8% de hidrocloruro de histidina monohidrato,
0,1% de impurezas cromatográficas individuales, y 2% de impurezas
totales.
Figura 1 muestra el método de reacción según la
técnica anterior.
Figura 2 muestra el método según la invención
que se describe en este documento, y que se analiza en los Ejemplos
5 y 6.
La invención que se describe en este documento
se refiere a la preparación de grados farmacéuticos de
dihidrocloruro de histamina, utilizando un método de síntesis no
enzimática de dos etapas, tal como se define en las reivindicaciones
adjuntas. La invención a la que se refiere este documento describe
la síntesis de dihidrocloruro de histamina por medio de la
descarboxilación no enzimática de histidina y la conversión por
etapas del producto descarboxilado en la forma de sal
dihidrocloruro. La invención que se describe en este documento
considera que un producto final de dihidrocloruro de histamina que
contiene una cantidad menor que cada una de las siguientes
sustancias: 0,8% de HCl de histidina monohidrato, 0,1% de impurezas
cromatográficas (que se definen más adelante) y 2% de impurezas
totales, es aceptable para su uso farmacéutico.
Los métodos sintéticos conocidos en la técnica
para sintetizar dihidrocloruro de histamina no son capaces de
generar un producto de pureza suficiente para ser usado como
compuesto farmacéutico. La Figura 1 muestra un método de
descarboxilación conocido de la técnica anterior. Las etapas del
método según la invención que se describe en este documento
aparecen en la Figura 2.
Se utilizaron métodos de la técnica anterior
para producir dihidrocloruro de histamina a partir de
L-histidina como material de partida, en un intento
de generar grados farmacéuticos de dihidrocloruro de histamina
sintético. El material de partida se hizo reaccionar con el
catalizador de la técnica anterior,
\alpha-tetralona y ciclohexano. Después de
finalizar la reacción, la muestra se enfrió y se burbujeó ácido
clorhídrico en la solución para convertir la base libre de
histamina en su forma de sal dihidrocloruro. El precipitado logrado
se filtró, se lavó y se secó. El producto final obtenido por el
método de la técnica anterior demostró contener un número
inaceptablemente alto de contaminantes.
El material bruto producido usando el método de
la técnica anterior tuvo una pureza de 02-94%, con
una impureza importante del orden de 3-5% y cinco a
ocho otras impurezas de =0,1%. Se llevaron a cabo etapas de
purificación adicionales, o recristalización, que fueron
sustancialmente eficaces para retirar la mayor parte de estos
contaminantes. No obstante, dos impurezas no identificadas
permanecieron a niveles mayores que 0,1%. Estas impurezas eluyeron
después del producto de dihidrocloruro de histamina, y se hace
referencia a ellas como impurezas o contaminantes cromatográficos.
De esta forma, el producto preparado por este método fue inaceptable
para el uso farmacéutico.
En vista de estos resultados, se diseñó un nuevo
procedimiento para sintetizar dihidrocloruro de histamina de la
pureza deseada. Este nuevo procedimiento implicó la descarboxilación
de L-histidina (ácido
(\alpha-amino-4-(ó
5)-imidazol propiónico)
(C_{6}H_{9}N_{3}O_{2}) para dar histamina. Tras la
descarboxilación, la solución que contiene la base libre de
histamina se trituró con cloruro de metileno para precipitar el
producto. A continuación, el producto se filtró y lavó. El producto
filtrado se trató, subsiguientemente, con ácido clorhídrico en
isopropanol para precipitar una sal de monohidrocloruro de histamina
bruta. Este producto se filtró y aisló. La sal bruta se purificó
seguidamente por técnicas de recristalización. A continuación, la
sal monohidrocloruro de histamina se trató nuevamente con una
solución de ácido clorhídrico/isopropanol para generar la forma
dihidrocloruro de histamina de la molécula. Por último, la forma
final del producto se decoloró y lavó. Estas etapas, conocidas como
recristalización, se pueden repetir de forma extensiva para dar
dihidrocloruro de histamina de pureza farmacéutica.
Todas las etapas se llevaron a cabo bajo una
atmósfera de gas nitrógeno. La pureza del producto final se analizó
por una serie de métodos analíticos, incluido el análisis de
HPLC.
La invención que se describe en este documento
contempla el uso de una serie de catalizadores o iniciadores de
radicales para facilitar la reacción de descarboxilación. Un
catalizador apropiado es aquel es capaz de catalizar eficazmente la
descarboxilación de histidina, cuando este compuesto precursor se
encuentra en un disolvente neutro y se calienta durante un número
determinado de horas para dar un producto final de pureza
aceptable. Se utilizan las siguientes cetonas enriquecidas con
electrones, ya que tienden a reducir el número de impurezas
presentes en el producto final: peróxido de benzoilo,
2,2'-azo-bis-isobutironitrilo
(AIBN),
2-ciclohexen-1-ona,
acetofenona, 4'-bromoacetofenona, benzofenona,
p-nitroacetofenona,
p-metilacetofenona,
p-metoxiacetofenona,
p-metilacetofenona/1-metil-4-piperidona,
y p-metil-acetofenona/AcOH.
Las condiciones de la reacción de
descarboxilación estimulan la descarboxilación de los materiales de
partida, mientras minimizan la formación de contaminantes no
deseados. Las condiciones de reacción incluyen la realización de
varias etapas del método en presencia de un gas inerte, por ejemplo,
nitrógeno. Las condiciones de reacción incluyen, adicionalmente,
llevar a cabo la etapa de descarboxilación en un intervalo de
temperaturas entre aproximadamente 145 a 170ºC. Preferentemente, la
reacción se efectúa en un intervalo de temperaturas de
aproximadamente 150 a 165ºC, o en un intervalo de temperaturas
desde aproximadamente 160 a 165ºC.
En la invención que se describe en este
documento, se contempla el uso de una serie de disolventes. Los
disolventes en los que se llevan a cabo algunas etapas de la
reacción pueden afectar al tiempo de reacción necesario para
catalizar la descarboxilación de la histidina. Disolventes
utilizables en la invención que se describe en este documento
incluyen: ciclohexanol, n-metilpirrolidinona (NMP),
di(etilenglicol), éter metílico de di(etilenglicol),
2-metiloxietil éter, 1-butanol,
metoxietanol, ciclohexanona/NMP (en una relación de 3:1),
dimetilformamida, y tetrametilensulfona.
Un parámetro adicional de la reacción descrita
en este documento es el método de crear la forma salina de
histamina por medio del tratamiento de la mezcla de reacción con
cloruro de hidrógeno. El perfil de impurezas del producto final
demostró estar afectado por la equivalencia molar del ácido agregado
durante la precipitación de la sal bruta monohidrocloruro. Es
posible controlar el grado de la formación de impurezas preparando
una solución de cloruro de hidrógeno de una concentración conocida
en isopropanol, y tratar la mezcla de reacción con ella.
Se puede utilizar una gama de equivalentes
molares de cloruro de hidrógeno (HCl) en isopropanol (IPA) para
llevar a cabo el método de la invención que se describe en este
documento. Se puede utilizar una gama de aproximadamente 0,01 hasta
2 equivalentes molares para crear la forma salina de histamina. De
manera alternativa, se puede usar una gama de aproximadamente 0,05
hasta 1,4 equivalentes molares. En otra alternativa, se puede
utilizar una gama de aproximadamente 0,1 a 0,9 equivalentes
molares. En todavía otra alternativa, pueden usarse aproximadamente
0,5 equivalentes molares. La relación seleccionada para llevar a la
práctica la invención que se describe en este documento debe
resultar en la generación última de un producto final con un nivel
aceptable de impurezas, de modo que el producto final pueda ser
usado como composición farmacéutica.
La concentración de la solución ácida usada para
crear la forma salina no fue crítica. Por ejemplo, la concentración
de HCl en IPA puede estar dentro de un intervalo de aproximadamente
6 a 9N. Sin embargo, el número de moles de ácido introducido
resulta crucial para aislar un grado farmacéuticamente aceptable del
producto final. La adición de un exceso de ácido hace que
precipiten impurezas con la sal monohidrocloruro que son
extremadamente difíciles de eliminar durante la formación
subsiguiente de la sal de dihidrocloruro de histamina. La relación
entre el método de formación de la sal y la generación de
contaminantes no se apreció en la técnica.
Durante la adición de HCl en isopropanol para
lograr la precipitación de la forma de sal monohidrocloruro de la
molécula (precipitación de la sal) se pueden utilizar diversos
codisolventes. Codisolventes que se pueden usar en la invención que
se describe en este documento incluyen: cloruro de metileno,
ciclohexanol, tolueno y éter metílico de
terc-butilo (TBME).
Es de especial interés la pureza última del
producto final. También se contemplan etapas adicionales del método
para purificar el producto final. Por ejemplo, la recristalización
es un procedimiento de cristalización repetida destinado a
purificar una sustancia. En este procedimiento de purificación, se
contempla el uso de una serie de disolventes. Estos disolventes
incluyen: cloruro de metileno, 2-propanol, metanol,
etanol (EtOH), metanol/acetona, agua, metanol/acetato de etilo,
agua/acetona, metanol/etanol, agua/metanol, metanol/hexano,
agua/metanol/acetona, metanol/cloruro de metileno,
2-propanol/etanol,
metanol/2-propanol,
acetona/2-propanol, acetona/etanol. Desde el punto
de vista de la toxicología, se prefiere un disolvente atóxico tal
como EtOH.
Se ha observado presencia de color en las
diversas soluciones obtenidas durante la vía de síntesis. Se puede
agregar carbón activado para eliminar parte del color con
anterioridad, o como una etapa del procedimiento de
recristalización.
Los ejemplos siguientes analizan los métodos
destinados a la descarboxilación de histidina, así como al
aislamiento del producto de histamina. También se analizan los
métodos de purificación del producto de dihidrocloruro de histamina
bruto, usando múltiples etapas de recristalización. Igualmente, se
discute la decoloración mediada por carbón.
La eficacia de las diversas etapas del método,
así como la pureza del producto final, se puede analizar usando los
métodos descritos más adelante. Se puede usar una o múltiples etapas
de monitorización para ensayar la eficacia de la etapa de
descarboxilación. De manera alternativa, se pueden utilizar
distintos métodos de ensayo bien conocidos en la técnica para
analizar la pureza del producto final. Un ejemplo de una etapa de
monitorización de este tipo es la realización de una cromatografía
de capa fina (TLC), un procedimiento bien conocido en la técnica,
de diversos productos de reacción. Por ejemplo, la reacción se
podría monitorizar usando TLC (fase móvil:
CH_{3}CN:H_{2}O:NH_{4}OH; 7,5:2,0:0,5; y nebulización de
ninhidrina). Esta etapa de monitorización se puede llevar a cabo en
cualquier momento después de la etapa de descarboxilación.
Más adelante se analizan en detalle
realizaciones particulares de la invención. Los siguientes ejemplos
tienen únicamente valor ilustrativo y no se deben interpretar como
limitaciones de la invención reivindicada. Existe una variedad de
técnicas y procedimientos alternativos a disposición de los expertos
en la técnica, que permiten de igual forma la realización exitosa
de la invención prevista.
Los Ejemplos siguientes discuten la síntesis de
dihidrocloruro de histamina a partir de compuesto precursor
L-histidina. Los protocolos existentes de síntesis
de histamina, aunque son capaces de proporcionar dihidrocloruro de
histamina, adolecen de la limitación de producir un producto final
impuro. Los Ejemplos siguientes discuten las diversas mejoras en la
síntesis de dihidrocloruro de histamina y enseñan la preparación de
un grado farmacéuticamente aceptable de dihidrocloruro de
histamina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
1
A continuación, se describe un método para la
síntesis de una muestra de 500 g de dihidrocloruro de histamina.
En un matraz de doce litros de capacidad (12 l),
de 4 bocas y de fondo redondo, equipado con un termómetro, agitador
mecánico, condensador y burbujeador de nitrógeno, se depositaron 7,5
l de ciclohexanol (disolvente), 750 gramos de
L-histidina (sustrato), y 113 ml de acetofenona
(catalizador). La suspensión se agitó en atmósfera de nitrógeno,
que se mantuvo durante toda la reacción.
La suspensión se calentó a reflujo y se mantuvo
a esa temperatura (150-165ºC) durante un mínimo de
40 horas. Se retiró una pequeña muestra para un ensayo durante el
proceso, para determinar el grado de descarboxilación de la
histidina. La suspensión se enfrió a menos de 80ºC y se agregaron
1.875 ml de tolueno. La mezcla se enfrió adicionalmente a
temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de un embudo de
Buchner en un nuevo matraz de 12 l, 4 bocas y fondo redondo.
El matraz nuevo que contiene el filtrado estuvo
equipado con un termómetro, agitador mecánico, trampa de cloruro de
hidrógeno y trampa de vacío, y se preparó para la adición de cloruro
de hidrógeno gaseoso. Bajo agitación, la solución se enfrió a menos
de 10ºC. Manteniendo la temperatura del lote por debajo de 20ºC, se
cargó un mínimo de 441 gramos (2,5 equivalentes) de cloruro de
hidrógeno gaseoso. Después de finalizar la adición de cloruro de
hidrógeno, la suspensión amarillenta espesa resultante se agitó a
temperatura ambiente durante una hora.
La suspensión se filtró nuevamente a través de
un embudo de Buchner. La torta de filtración se enjuagó con una
mezcla de 375 ml de ciclohexanol y 375 ml de tolueno, seguido de dos
lavados con 750 ml de tolueno y dos enjuagues con 750 ml de
hexanos. La torta se secó en el filtro con succión durante un mínimo
de 30 minutos. La torta de filtración contuvo una cantidad
sustancial de ciclohexanol que se retiró por trituración.
La torta de filtración húmeda se cargó en un
matraz de 12 l y 4 bocas, de fondo redondo, equipado con un agitador
mecánico y burbujeador de nitrógeno. Se agregó también etanol
(EtOH) en un volumen de 7,5 l. La suspensión se agitó a temperatura
ambiente durante 4 horas. La suspensión se filtró a través de un
embudo de Buchner y la torta de filtración se enjuagó con 400 ml de
hexanos. La torta de filtración se secó en un horno de vacío a
60-65ºC durante la noche. El producto de este método
proporcionó 504 gramos de dihidrocloruro de histamina bruto
(rendimiento de 56,6%), con una pureza de 94,4% a/a, determinada por
el uso de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El
producto se recristalizó para mejorar la pureza del producto
final.
Un matraz de 12 l, 4 bocas y fondo redondo,
equipado con un termómetro, agitador mecánico, condensador, embudo
de adición y burbujeador de nitrógeno, se cargó con 503 gramos del
producto de dihidrocloruro de histamina bruto sintetizado
anteriormente. Se agregaron, además, 4,5 l de EtOH y 200 ml de agua
al matraz de reacción, para disolver la torta de filtración. La
suspensión se agitó bajo atmósfera de nitrógeno.
La suspensión se calentó a reflujo. Manteniendo
la suspensión bajo reflujo, se agregó agua gota a gota a la
suspensión, hasta la disolución de la mayor parte de los sólidos. La
solución se enfrió a menos de 75ºC. La solución se cargó con una
mezcla de 50 gramos de NUCHAR SA (Westvaco, Nueva York, NY) y 50
gramos de CELITE (J.T. Baker, Hayward, CA). Esta suspensión se
calentó entonces a reflujo y se mantuvo a esa temperatura durante
0,5 horas. La suspensión se enfrió a 65-75ºC y
seguidamente, se filtró a través de un lecho de CELITE en un matraz
de 12 l, 4 bocas y fondo redondo, limpio y seco. La torta de
filtración se enjuagó con una mezcla de 450 ml de EtOH y 50
ml
de agua.
de agua.
La solución filtrada se enfrió lentamente a
temperatura ambiente, bajo agitación, durante la noche. La solución
se enfrió, adicionalmente, a 0-5ºC durante 2 horas.
A 0-5ºC, la suspensión se filtró a través de un
embudo de Buchner. La torta de filtración se lavó tres veces con
200 ml de EtOH helado a 0-5ºC. La torta de
filtración se secó en un horno de vacío a
60-65ºC.
Después de la recristalización, el producto
final fueron 299 gramos (un rendimiento de 59,4%), con una pureza
HPLC a/a de 99,1%. El protocolo de HPLC se analiza en el Ejemplo 7
más adelante. Se llevaron a cabo ciclos adicionales de
recristalización para aumentar la pureza del producto final. Sin
embargo, siguieron estando presentes dos impurezas desconocidas
(RRt 1,3, 1,5) por encima del umbral del 0,1% después de la
recristalización.
De manera típica, la primera impureza (RRt 1,3)
estuvo presente a un nivel de 0,2-0,4% a/a, y la
segunda impureza (RRt 1,5), al nivel de 0,5-0,6%.
Una segunda recristalización de la muestra discutida anteriormente
redujo los niveles de impurezas a 0,1-0,2% y
0,4-0,5%, respectivamente. Las impurezas parecieron
volver a aumentar al analizar nuevamente la muestra después de
algunos días, lo que despierta preocupación acerca de la estabilidad
del producto final. La inestabilidad del producto podría explicar
la razón por la que la torta de filtración húmeda citada
anteriormente mostró una pureza HPLC de 99,9% a/a, pero sólo se
obtuvo un 99,1% después de secar el lote. Los tratamientos
subsiguientes con diclorometano o tratamientos químicos no fueron
capaces de eliminar las impurezas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
2
A la vista de los resultados que se discuten más
arriba, se emprendió una serie de modificaciones del método de
síntesis. Estas modificaciones buscaron reducir los niveles de
impurezas desconocidas a un nivel aceptable. Una variable examinó
con preocupación la naturaleza del catalizador usado en la reacción
de descarboxilación. Se analizó una variedad de otros
catalizadores, incluida acetofenona, para determinar el papel que
juegan, de hacerlo, en la formación de las impurezas
cromatográficas. La Tabla 1 muestra los catalizadores usados en
este estudio. Los catalizadores se utilizaron a una concentración de
0,3 equivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la Tabla 1 indican que
p-metilacetofenona fue superior a acetofenona en
reducir el nivel de impurezas halladas en el producto final. Por el
contrario, el uso de p-metilacetofenona junto con
una base
(1-metil-4-piperidona)
no mostró una mejora del nivel de impurezas generadas, en tanto que
la introducción de un ácido (ácido acético) elevó considerablemente
las impurezas presentes en el producto final. Adicionalmente,
p-metoxiacetofenona ofreció una ventaja con respecto
a acetofenona en lo relativo a la generación de contaminantes, pero
no logró una potenciación significativa frente a
p-metilacetofenona en cuanto al aislamiento de la
sal monohidrocloruro. Los datos señalan que los catalizadores con
una cetona deficitaria en electrones exhiben un incremento de la
generación de impurezas halladas en el producto final, en tanto que
las cetonas enriquecidas con electrones mostraron una reducción de
la misma. Basándose en estos resultados, se sustituyó acetofenona
con p-metilacetofenona como catalizador usado en la
reacción de descarboxilación de la invención que se describe en
este documento.
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Ejemplo de Referencia
3
Otro parámetro analizado, referido a la
generación de dihidrocloruro de histamina aceptablemente puro,
implicó la equivalencia molar del ácido agregado durante la
precipitación de la sal bruta. Uno de los sorprendentes
descubrimientos de la invención que se describe en este documento es
que la reducción de la cantidad de contaminantes presentes en el
producto final está relacionada con la cantidad de ácido usado para
crear la sal a partir de la molécula. En procedimientos de la
técnica anterior, se introdujo una cantidad de 2,5 equivalentes
molares de cloruro de hidrógeno (Cl) en gas en una solución que
contiene la histidina descarboxilada (base libre de histamina),
para generar una sal dihidrocloruro bruta. El presente Ejemplo
examina el efecto de agregar una variedad de equivalentes molares
de ácido clorhídrico a la solución de base libre de histamina,
mediante la introducción del ácido disuelto en isopropanol
(IPA).
Se disolvió una variedad de concentraciones de
HCl en IPA y se analizaron sus efectos sobre la producción de
impurezas. Se siguió el protocolo de síntesis según se ha descrito
anteriormente, con la excepción de que se usaron 0,3 equivalentes
de p-metilacetofenona con tolueno como codisolvente
para la adición de HCl. Se empleó el protocolo HPLC del Ejemplo 7
más adelante para determinar la presencia de impurezas. En la
siguiente Tabla 2 se exponen los resultados de esta gama de
concentraciones de ácido.
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Los resultados que se muestran en la Tabla 2
ilustran la forma en que la cantidad de ácido cargada en la solución
que contiene la base libre de histamina alteró de manera llamativa
el nivel de las dos impurezas presentes en el producto. El descenso
observado fue atribuible, probablemente, a las impurezas que poseen
menor carácter básico que la base libre de histamina. En
consecuencia, es probable que la base libre de histamina experimente
inicialmente una protonación, seguida por las impurezas.
El uso de 0,5 equivalentes molares de HCl
proporcionó los resultados más favorables en lo referente a limitar
los niveles de impurezas halladas en el producto. Bajo estas
condiciones, el producto bruto aislado fue la sal monohidrocloruro,
según se determinó por titulación del contenido de cloruro. Por lo
tanto, para sintetizar la forma dihidrocloruro de histamina con una
pureza aceptablemente alta, se incorporó una etapa intermedia de
purificación, consistente en la generación intencionada de la sal
monohidrocloruro. Sin embargo, utilizando este método, sería
necesario agregar un equivalente adicional de HCl en una etapa
posterior de la síntesis, al objeto de producir la forma
dihidrocloruro de la molécula.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para
examinar el efecto de pequeñas variaciones de, la concentración del
ácido sobre la pureza y el rendimiento del producto. Los resultados
de estos experimentos se muestran en la Tabla 3. Estos resultados
se tomaron de productos formados a partir de una mezcla de reacción
de 100 ml con 0,3 equivalentes de
p-metilacetofenona y CH_{2}Cl_{2} como
codisolvente. En el Ejemplo 4 se analiza de forma detallada la
elección de CH_{2}Cl_{2}.
El intervalo de equivalencia se estrechó para
determinar el efecto que tiene una variación relativamente pequeña
de la cantidad de ácido sobre el nivel de impurezas en la sal bruta.
Los datos que se muestran en la Tabla 3 confirman la observación
anterior de que un descenso de la cantidad de ácido incorporada da
como resultado una reducción de la cantidad de impurezas halladas
en el producto final, así como un descenso del rendimiento. En
experimentos posteriores, se usaron 0,6 equivalentes molares de HCl
con respecto al material de partida. Para cantidades mayores de
producto, para las que se usan cantidades también mayores de
material de partida, la cantidad de ácido necesaria es de 0,85
equivalentes molares de HCl por mol de base libre, tal como lo
determinan los ensayos. Esta cantidad de HCl calculada representa
aproximadamente 0,6 equivalentes molares frente al material de
partida de L-histidina.
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Ejemplo de Referencia
4
La siguiente variable analizada para mejorar la
síntesis de dihidrocloruro de histamina concernió al codisolvente
utilizado durante la etapa de adición de ácido del procedimiento.
Anteriormente, se utilizó tolueno como codisolvente. Para estudiar
el posible efecto del codisolvente sobre la pureza del producto
final, se utilizó una variedad de codisolventes en la etapa de
precipitación. Como se ha mencionado anteriormente, la pureza de las
muestras resultantes se analizó usando el método HPLC descrito en
el Ejemplo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
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Las condiciones de reacción para los resultados
obtenidos en la Tabla 4 fueron: p-metilacetofenona,
presente en 0,3 equivalentes, 0,6 equivalentes de HCl/IPA y 5
partes de codisolvente para la precipitación. Los resultados de la
Tabla 4 demuestran que el cloruro de metileno ofrece resultados
superiores con respecto a la formación de impurezas, en comparación
con otros codisolventes.
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Ejemplo
1a
El procedimiento que se describe a continuación
especifica la preparación de monohidrocloruro de histamina. Un
matraz de dos litros (2 l) y 3 bocas, de fondo redondo (reactor) se
equipó con un termómetro, agitador mecánico, condensador y sistema
de purga de nitrógeno, se cargó con 1 l de ciclohexanol, 100 g de
L-histidina y 25,9 ml de
p-metilacetofenona. El ciclohexanol tiene un punto
de fusión de 22-22ºC y puede requerir calentamiento
para generar un líquido que se pueda transferir al reactor. La
suspensión tuvo una coloración blanca, con una temperatura entre 20
y 25ºC, y un volumen de 1050 ml. La suspensión se agitó en presencia
de una atmósfera de nitrógeno, que se mantuvo durante toda la
reacción.
La suspensión se calentó a reflujo
(160-165ºC) y se mantuvo bajo reflujo durante 30
horas. Se retiró una pequeña muestra para determinar el porcentaje
de material de partida que se había descarboxilado. La suspensión
debe contener =1% a/a de L-histidina. En caso de
una reacción incompleta, se debe continuar calentando la suspensión
a reflujo durante 3,5 horas adicionales y, a continuación, volver a
extraer una muestra. La formación de una solución homogénea y
transparente indica que se ha consumido el material de partida y el
final de la reacción de descarboxilación.
Una vez terminada la reacción, la suspensión se
enfrió a aproximadamente 20-25ºC. A continuación, el
reactor se cargó con 300 ml de cloruro de metileno. Esta mezcla se
enfrió, adicionalmente, a temperatura ambiente. La mezcla se filtró
a través de un embudo de Buchner en otro matraz de 2 l y 3 bocas, de
fondo redondo. Seguidamente, se lavó el primer reactor dos veces
con 100 ml de cloruro de metileno, que se utilizó para enjuagar el
filtro. Esta etapa de filtración eliminó todo residuo de
L-histidina.
El segundo reactor que contiene el filtrado se
equipó con un termómetro, un agitador mecánico, un embudo de
adición y un sistema de purga del nitrógeno. Después de la etapa de
lavado y el restablecimiento de la atmósfera de nitrógeno en el
reactor, el reactor se calentó a 30-35ºC. Se retiró
una parte alícuota de la solución y se analizó el contenido de base
libre de histamina. Los resultados del ensayo se usaron para
calcular la cantidad de ácido necesaria para generar la sal
monohidrocloruro. La cantidad requerida de ácido fue de 0,85
equivalentes molares de HCl por mol de base libre de histamina.
Con agitación intensa, se agregaron, gota a
gota, 50,5 ml de una solución 7,65 M de
HCl-isopropanol (HCl/IPA), a una velocidad a la que
la temperatura de la solución no pasara de 40ºC. Dada la naturaleza
exotérmica de esta etapa del método, la adición de la solución de
HCl/IPA tuvo lugar durante el período de una hora. La suspensión de
color beis claro resultante se dejó enfriar a
20-25ºC durante 1 hora, y se agitó durante un
mínimo de 2 horas. La solución 7,65 M de HCl en isopropanol se
preparó haciendo burbujear 27,9 g de HCl gaseoso en 100 ml de
isopropanol enfriado a 5-10ºC.
La suspensión enfriada se filtró a través de un
embudo de Buchner bajo una corriente de nitrógeno, y la torta de
filtración se enjuagó tres veces con 100 ml de una solución 1:1 de
cloruro de metileno/ciclohexanol. La torta de filtración se lavó,
entonces, tres veces con 100 ml de cloruro de metileno. Dado que la
sal monohidrocloruro fue fácilmente soluble en agua, la humedad del
laboratorio pudo ejercer alguna influencia sobre el rendimiento del
producto. Por lo tanto, la exposición de la torta de filtración a la
humedad durante la etapa de filtración se redujo al mínimo,
realizando la operación bajo una corriente de nitrógeno.
A continuación, la torta de filtración húmeda se
cargó en un matraz de 1 l y 3 bocas, de fondo redondo, equipado con
un termómetro, un agitador mecánico y un sistema de purga de
nitrógeno para la trituración con metileno. El sólido se suspendió
en 500 ml de cloruro de metileno, y se agitó durante 1 hora bajo
nitrógeno. La trituración con metileno contribuyó a la eliminación
del ciclohexanol residual y permitió secar el producto de manera
más eficaz, tal como se vio en las etapas subsiguientes que se
describen a continuación.
La suspensión, bajo una corriente de nitrógeno,
se filtró y el material sólido se lavó dos veces con 75 ml de
cloruro de metileno. La torta de filtración se secó en un horno de
vacío a 55-60ºC durante 16 horas.
La Tabla 5 siguiente muestra los resultados del
método descrito en este Ejemplo. Este método se llevó a la práctica
tres veces y se compararon los rendimientos de producto de cada uno
de ellos.
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Ejemplo
1b
El Ejemplo 1b muestra un procedimiento para
sintetizar dihidrocloruro de histamina a partir del producto
precursor monohidrocloruro, preparado con el método del Ejemplo
1a.
Un matraz de un litro (1 l) y tres bocas, de
fondo redondo (reactor), equipado con una barra agitadora mecánica,
un embudo de adición, un sistema de purga de nitrógeno y termómetro
se depositó en una camisa calefactora. El reactor se cargó con 40
gramos de monohidrocloruro de histamina, 32 ml de H_{2}O
(destilada), y 280 ml de una solución de 1 x EtOH consistente en
99,5% de EtOH y 0,5% de tolueno. Se mantuvo una atmósfera de
nitrógeno durante toda la reacción, dado que la sal
monohidrocloruro de histamina fue altamente higroscópica.
La siguiente etapa del método comprendió la
adición de una solución de HCl/IPA para convertir la sal
monohidrocloruro de histamina en la forma dihidrocloruro. Se
agregaron al reactor 41,5 ml de una solución 6,85 M de HCl/IPA
(1,05 equivalentes). Tal como se ha discutido anteriormente, la
adición de la solución ácida fue exotérmica, por lo que el ácido se
agregó durante un período de tiempo de 15 minutos. Durante las
etapas iniciales de la adición de ácido, se generó una solución
transparente que, sin embargo, recuperó su forma de suspensión
blanquecina y espesa después de haber introducido aproximadamente
75% del ácido.
Después de completar la adición del ácido, la
suspensión blanquecina y espesa resultante se calentó a reflujo
(78-80ºC) en un baño de aceite. La sustancia sólida
de la suspensión se disolvió gradualmente para formar una solución
de color ámbar. Una vez que la sustancia sólida se disolvió por
completo, se retiró el reactor del baño de aceite. A continuación,
el reactor se cargó con carbón NUCHAR SA (2 gramos) y CELITE (2
gramos). Esta suspensión se calentó a reflujo durante 25 minutos.
El mantenimiento de la temperatura fue importante, dado que el
producto precipitaría a aproximadamente 60ºC.
La suspensión de color negro y caliente se
filtró a través de un lecho de CELITE en un nuevo matraz de 1 l, de
3 bocas y fondo redondo, equipado con un agitador mecánico y
termómetro. El lecho de CELITE sirvió como barrera para impedir el
flujo del carbón a través de la unidad de filtración. El nuevo
reactor había sido precalentado en un baño de aceite, y su carga
tuvo lugar también en dicho baño de aceite.
El primer reactor que contuvo la mezcla de
reacción se enjuagó dos veces con 40 ml de una solución 1 X de EtOH
a una temperatura de 60-65ºC. Esta solución se
filtró y se agregó al filtrado obtenido más arriba. La adición del
volumen de enjuague produjo un cierto precipitado en el filtrado.
Seguidamente, se agitó el volumen total de la solución durante 30
minutos a 60-65ºC.
Entonces, se enfrió lentamente la suspensión
(dihidrocloruro de histamina) a 25ºC durante 1 hora, y se agitó a
20-25ºC durante 2 horas, enfriándola a continuación
a 0,5ºC durante 2 horas más. A continuación, la suspensión se
filtró bajo una corriente de nitrógeno y la torta de filtración se
lavó tres veces con 40 ml de EtOH 1 X frío. Se pesó, seguidamente,
la torta de filtración y se secó en un horno de vacío a
55-60ºC durante 16 horas. En la Tabla 6 se muestran
los resultados de tres experimentos diferentes de conversión de
monohidrocloruro de histamina en la sal dihidrocloruro.
Ejemplo
2
El presente ejemplo discute el uso de HPLC para
cuantificar e identificar el dihidrocloruro de histamina y
cuantificar las sustancias y degradantes relacionados en el producto
final. El método empleó un sistema completo de HPLC con capacidades
de gradiente y detección UV. Para las determinaciones
cromatográficas de pureza, se utilizó un sistema que contuvo un
sistema de adquisición de datos computadorizados. El equipo
adicional usado incluyó: una columna Waters Symmetry
C-18, 5 \mum, 4,6: 350 mm; una balanza analítica
con resolución de 0,01 mg ó 0,01 mg; utillaje de vidrio
volumétrico; y un calefactor de columna. Los reactivos y estándares
usados incluyeron: un estándar de referencia o equivalente para
dihidrocloruro de histamina; metanol de grado HPLC; acetonitrilo de
grado HPLC; ácido
1-heptano-sulfónico, sal sódica;
fosfato sódico de grado HPLC o equivalente de Fisher Scientific
(Pittsburgh, PA), monobásico, monohidrato, grado de reactivo ACS;
monohidrocloruro de D-, L-histidina, monohidrato
(Sigma, St. Louis, MO); solución 1N de hidróxido sódico; solución 1N
de ácido clorhídrico; agua purificada; y alcohol bencílico, de
grado reactivo ACS o equivalente.
Se prepararon dos tampones de fase móvil. La
Fase Móvil A (MPA) contuvo fosfato sódico 0,02 M monobásico y ácido
heptano-sulfónico 0,005 M, pH ajustado a 3,0. La
Fase Móvil B (MPB) contuvo acetonitrilo (ACN)/metanol (MeOH): 20/15
(en volumen).
Los estándares y muestras se prepararon para el
ensayo y las determinaciones cromatográficas de pureza. Los
estándares de ensayo comprendieron la preparación de soluciones
estándares de dihidrocloruro de histamina en tres
concentraciones. Se prepararon estándares de monohidrocloruro de DL-histidina, monohidrato de 0,88 mg/ml,
0,80 mg/ml y 0,72 mg/ml a 0,008 mg/ml. De la misma forma, se prepararon muestras de ensayo por duplicado, que contuvieron 0,8 mg/ml de dihidrocloruro de histamina producido de manera sintética, mientras se preparó una solución para determinar el límite de cuantificación (LOQ) con 0,0006 mg/ml de dihidrocloruro de histamina. La sensibilidad del método para Histamina se ha determinado en 0,07% para el límite de cuantificación y 0,03% para el límite de detección. Estudios de pureza máxima realizados con disposiciones de fotodiodos han demostrado la especificidad para histamina.
concentraciones. Se prepararon estándares de monohidrocloruro de DL-histidina, monohidrato de 0,88 mg/ml,
0,80 mg/ml y 0,72 mg/ml a 0,008 mg/ml. De la misma forma, se prepararon muestras de ensayo por duplicado, que contuvieron 0,8 mg/ml de dihidrocloruro de histamina producido de manera sintética, mientras se preparó una solución para determinar el límite de cuantificación (LOQ) con 0,0006 mg/ml de dihidrocloruro de histamina. La sensibilidad del método para Histamina se ha determinado en 0,07% para el límite de cuantificación y 0,03% para el límite de detección. Estudios de pureza máxima realizados con disposiciones de fotodiodos han demostrado la especificidad para histamina.
Tras la preparación de los diversos estándares y
muestras, se equilibró el sistema HPLC. Una vez equilibrado, se
comprobó el caudal de la línea residual bajo las condiciones
iniciales de ajuste (es decir, 10% de MPB a 1,5 ml/min). El caudal
fue de 1,5 ml/minuto \pm 0,15 ml/minuto. Se llevó a cabo una
inyección de agua en blanco después de equilibrar el sistema para
acondicionar la columna antes de iniciar el ensayo.
Después de finalizar estos preparativos, se
inyectó la solución de resolución de 0,7 mg/ml \pm 0,1 mg/ml de
dihidrocloruro de histamina. Se calculó la resolución "R" entre
un pico de solución de alcohol bencílico de 1 mg/ml y los picos de
histamina. Además, este proceso se repitió cinco (5) veces y se
calculó la desviación estándar.
Para el ensayo, se generó una curva estándar. La
comprobación estándar se llevó a cabo cada cuatro a seis
inyecciones de muestra y se encontró dentro de los siguientes
parámetros: el factor de cola no fue >2,0%; y el coeficiente de
correlación de la curva estándar no fue menor que 0,995.
Para calibrar la pureza cromatográfica, se
efectuó una única inyección de la solución de resolución. Se calculó
la resolución "R" entre los picos de alcohol bencílico y de
histamina, al igual que el factor de cola del pico de histamina.
Dado que la resolución y los factores de cola satisficieron las
especificaciones, se realizaron tres inyecciones consecutivas de la
muestra LOQ.
Se calcularon las desviaciones estándares
relativas para las tres respuestas pico de histamina. En general,
el factor de cola no fue >2,0, la resolución fue mayor que 1,5, y
la desviación estándar relativa de las respuestas pico de histamina
no fue mayor que 10%.
Dado que se satisficieron los parámetros
citados, se analizaron las muestras finales de dihidrocloruro de
histamina. Los parámetros operativos para HPLC aparecen enumerados
en la Tabla 7. Los parámetros de gradiente se muestran en la Tabla
8.
El uso de este sistema analítico proporcionó el
método necesario para determinar la pureza de la muestra de
dihidrocloruro de histamina producido en los ejemplos mencionados
anteriormente.
Ejemplo
3
Los productos de dihidrocloruro de histamina del
Ejemplo 1b se sometieron al análisis HPLC descrito en el Ejemplo 2
para determinar la pureza de las muestras, y establecer si los
productos finales satisfacen los criterios de pureza fijados para
el método de la invención que se describe en este documento. Para
ser usado como agente farmacéutico, el dihidrocloruro de histamina
debe poseer mínimas impurezas cromatográficas. Las impurezas
individuales halladas a niveles mayores que 0,1% a/a requieren,
normalmente, cualificación toxicológica. Se generaron tres lotes de
dihidrocloruro de histamina usando los métodos de los Ejemplos 1a y
1b. Su pureza se describe en la Tabla 9.
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Los resultados descritos en la Tabla 9
demuestran que el producto final de dihidrocloruro de histamina se
encuentra dentro de los estándares aceptables establecidos para la
invención que se describe en este documento. En primer lugar, el
nivel de la impureza nº 1 demostró ser menor que el límite de
cuantificación fijado para el ensayo. En segundo lugar, la impureza
nº 2 estuvo presente en niveles ligeramente mayores que el umbral
de 0,1% y, por lo tanto, se cualificará por ensayos toxicológicos.
El nivel de especificación para impurezas se ha establecido en
<0,2% en peso. Estos resultados demuestran que el método de
síntesis de la invención que se describe en este documento ofrece
un medio de síntesis de una forma farmacéuticamente aceptable de
dihidrocloruro de histamina.
La invención que se presenta en este documento
describe un nuevo método no enzimático para producir dihidrocloruro
de histamina de grado farmacéutico. Una ventaja importante del
método descrito en este documento es que proporciona dihidrocloruro
de histamina con un nivel de pureza superior al disponible en la
actualidad por otros medios.
Por último, los ejemplos precedentes no
pretenden limitar el alcance de la presente invención, que se expone
en las siguientes reivindicaciones. En particular, los expertos en
la técnica podrán reconocer diversos e quivalentes y sustituciones
a la vista de la descripción anterior, que se consideran incluidos
dentro del alcance de la invención descrita.
Claims (10)
1. Un método para la síntesis de dihidrocloruro
de histamina que comprende:
- descarboxilar una solución que contiene L-histidina, utilizando un catalizador seleccionado de: peróxido de benzoilo, 2,2'-azo-bis-isobutironitrilo (AIBN), 2-ciclohexen-1-ona, acetofenona, 4'-bromoacetofenona, benzofenona, p-nitroacetofenona, p-metilacetofenona, p-metoxiacetofenona, p-metilacetofenona/1-metil-4-piperidona, y p-metilacetofenona/AcOH, con lo que se forma una solución que contiene histamina;
- formar una sal de monohidrocloruro de histamina a partir de la solución que contiene histamina, mediante tratamiento con una cantidad efectiva de ácido clorhídrico en isopropanol, y purificar la sal de monohidrocloruro de histamina por recristalización; y
- formar una solución que contiene dihidrocloruro de histamina a partir de la sal de monohidrocloruro de histamina, mediante tratamiento con ácido clorhídrico en isopropanol.
2. El método según la reivindicación 1, que
comprende, adicionalmente, triturar la solución que contiene
histamina.
3. El método según la reivindicación 2, en el
que la solución que contiene histamina se tritura con una solución
de cloruro de metileno.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad efectiva de ácido
clorhídrico es de aproximadamente 0,1 a 0,9 equivalentes molares de
ácido clorhídrico frente a la base libre de histamina.
5. El método según la reivindicación 4, en el
que la cantidad efectiva de ácido clorhídrico es de aproximadamente
0,6 equivalentes molares de ácido clorhídrico frente a la base libre
de histamina.
6. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el dihidrocloruro de histamina
contiene una cantidad igual o menor que cada una de las siguientes:
0,8% de L-histidina HCl, monohidrato, 0,1% de
impurezas cromatográficas individuales, y 2% de impurezas
totales.
7. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución que contiene
dihidrocloruro de histamina resultante comprende menos de 2% de
impurezas totales, según se mide por análisis HPLC.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende, adicionalmente, agregar un
codisolvente durante el tratamiento con ácido clorhídrico en
isopropanol, para formar la sal monohidrocloruro de histamina, en
donde dicho codisolvente se selecciona de cloruro de metileno,
ciclohexanol, tolueno y éter metílico de
terc-butilo.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende, adicionalmente, recristalizar
el dihidrocloruro de histamina con un disolvente para dar una forma
farmacéuticamente pura de dihidrocloruro de histamina.
10. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente utilizado para la
recristalización se selecciona de cloruro de metileno,
2-propanol, metanol, etanol, metanol/acetona, agua,
metanol/acetato de etilo, agua/acetona, metanol/etanol,
agua/metanol, metanol/hexano, agua/metanol/acetona, metanol/cloruro
de metileno, 2-propanol/etanol,
metanol/2-propanol,
acetona/2-propanol, y acetona/etanol.
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