KR20230114224A

KR20230114224A - D형 비천연 아미노산으로부터 근감소증 예방 또는 치료용 에스터 화합물을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 에스터 화합물

Info

Publication number: KR20230114224A
Application number: KR1020230009337A
Authority: KR
Inventors: 심재호; 김현수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2023-01-25
Publication date: 2023-08-01

Abstract

본 발명은 D형 비천연 아미노산으로부터 근감소증 예방 또는 치료용 에스터 화합물을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 근감소증 예방 또는 치료용 에스터 화합물에 관한 것으로서, 구체적으로는 염의 이온교환법을 통한 에스터화 반응을 통해 친환경적이면서도 높은 수율로 에스터화합물을 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

D형 비천연 아미노산으로부터 근감소증 예방 또는 치료용 에스터 화합물을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 에스터 화합물{Method for preparing ester compound for preventing or treating sarcopenia from D-type non-natural amino acid and ester compound prepared thereby}

본 발명은 D형 비천연 아미노산으로부터 근감소증 예방 또는 치료용 에스터 화합물을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 에스터 화합물을 제공하며, 여기에 사용되는 합성 장비와 이를 이용한 합성 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면 기존의 근감소증 억제효과가 있는 물질을 친환경적이면서도 높은 수율로 합성할 수 있다.

2050년 세계 고령인구 비율이 20%를 넘어 초고령 사회로의 진입이 예상되고 있다(World Population Aging, UN). 이전에는 노화에 따른 자연스러운 현상으로 인식되던 근육량의 감소가 2016년 미국 질병분류 코드(ICD-10-CM)로 등록된 후 질병으로 인식되고 관련 기술에 대한 수요가 급증하고 있다. 근감소증 치료제는 기술 진입의 장벽이 낮고, 상업화 가능성이 높아 권리화가 시급한 분야인데, 글로벌 제약사들은 현재까지 항체 위주의 개발 전략을 구사하였으나, 오프타겟(off-target) 비선택성으로 인해 발생하는 문제로 임상단계에서 대부분 실패하였다. 본 발명자는 이러한 문제점을 극복하고자 전사수준에서 마이오스타틴을 조절하는 새로운 작용기전을 가진 근감소 억제 소분자 물질을 확보하였다.

근감소증은 고령화 시대 미충족 의료 현안 중 핵심 분야이다. 국내 노인인구 비율은 15.7%(2020년), 2025년에는 20%에 달해 초고령 사회 진입이 예상되고, 2060년에는 43.9%에 도달할 것으로 예측된다. 근감소증의 경우 질환 특성상 노화와 관련이 깊고, 전세계적으로 평균 수명이 늘어나면서 근감소에 대한 의료시장의 규모가 빠른 속도로 커지고 있으며 또한 근감소증은 스테로이드, 항암제 등 다양한 종류의 약물에 의해서도 유발될 수 있으나, 이에 대한 해결책은 아직까지 존재하지 않는 실정이다.

현재까지 근감소증 치료제와 관련하여 TNFa, IL-6, Myostatin, Ghrelin, Androgen을 대상으로 글로벌 제약회사들에 의해 약물개발이 진행되고 있다. 상기 제제 중 근육량을 결정하는 마이오스타틴(myostatin)에 대한 항체의 일부 효능이 보고되었으나 임상시험단계에서 탈락하였고, 이들에 대한 수용체나 전사인자 수준에서 조절하려는 시도는 있으나 그 결과들은 아직 미비한 실정이다.

이러한 세계적 추세를 고려하며 본 기술은 근감소증에 대한 새로운 기전을 가진 물질로서 관련 분야 전문기업들과의 통합적인 연구 역량을 투입하면 혁신신약으로 개발될 가능성이 높다.

신약 개발시, 공정과정에서 다양한 환경문제에 의해 규제가 강화됨에 따라 기존의 화학적 방법들에 대한 대체 방법들이 연구되고 있는데, 앞서 언급한 유기 및 무기산들은 환경오염 및 인체에 대한 유독성에 의해 규제가 강화되고 있음에 따라 산업적으로 환경부담금 및 적재량 제한 등으로 인한 대량생산의 문제점들이 발생되고 있다. 그러므로 친환경 공법들은 용매 및 유해물질의 회수, 필터기법을 활용한 유해가스 흡착 등의 다양한 방법으로 해결점을 찾고 있으며, 나아가서 새로운 방법들을 모색하고 있다. 현재까지 알려진 제조방법에 따르면, 반응 조건 상에서 저온 반응 조건 및 pH의 영향을 많이 받는 조건들이 대부분이다. 또한, 에스터화합물의 제조방법의 경우, p-톨루엔술폰산 또는 토실산을 주로 사용하여, 합성된 화합물의 잔여물질로 인해 환경문제가 야기된다.

이에 본 발명자들은 친환경적이고 종래 발명내용보다 효율적으로, 기존의 표적과 다른 차별적인 작용기전을 가진 아미노산 유래 저분자 물질을 합성하는 방법을 개발하여 신약개발을 위한 합성공정문제를 해결하고자 한다.

KR 출원번호 제10-2019-0027372호

본 발명의 일 실시예에 따르면, D형 비천연 아미노산으로부터 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 에스터 화합물이 제공된다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 하기 [반응식 1]에 의한 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물의 제조방법이 제공된다:

[반응식 1]

상기 R¹은 C1 내지 C12의 알킬기 또는 tert-뷰틸기에서 선택되는 어느 하나이며,

R²는 메틸기 또는 아이소프로필기에서 선택되는 어느 하나일 수 있고,

상기 ZnCl₂는 H₂SO₄와 반응하여 MgSO₄ 및 HCl을 생성하고,

상기 HCl은 기체상태로 에스터화 반응의 촉매제로 사용되며,

상기 MgSO₄는 탈수제로 작용하는 것을 특징으로 한다.

일 측에 따르면, 상기 Al₂O₃는 촉매지지체일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 반응은 40℃에서 8시간동안 반응하는 것일 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 Al₂O₃ 와 ZnCl₂는 1:1 내지 1:3.33의 몰 당량비로 반응하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 방법 중 어느 하나의 방법으로 제조된 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 에스터 화합물은 하기 [화학식 1-1] 내지 [화학식 1-6]으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다:

[화학식 1-1]

;

[화학식 1-2]

;

[화학식 1-3]

;

[화학식 1-4]

;

[화학식 1-5]

; 및

[화학식 1-6]

.

본 물질은 비천연 아미노산을 골격으로하는 에스터화반응을 통해, 아미노산에서 유래한 유도체 형태로 인체 내에서 대사과정이 느려 천연 형태의 아미노산에 비해 천천히 대사되는 장점이 존재하며, 또한 근육 단백질의 합성과 성장을 촉진하는 고유한 기전을 가지고 있어 안전성과 유효성을 동시에 가진다.

또한 종래 황산을 이용한 에스터화 반응은 반응 중 생성되는 물의 제거가 어려운 단점이 있어 수율이 낮아지는 경향이 있는데, 본 발명에 따르면 이와 같은 문제를 해결하기 위해서 물을 제거해주는 첨가제를 도입하는 것으로써 에스터화 반응의 효율성을 높일 수 있으며, 특히 특정 촉매를 사용하는 경우 불순물 고착화 현상을 해결할 수 있다.

또한 알루미늄옥사이드를 촉매지지체로 사용함으로써 촉매 사용량을 줄일 수 있는 장점이 존재한다.

또한, 시중에서 쉽고 저렴하게 구입이 가능하며 해수로부터 얻을 수 있는 알칼리금속의 염 및 알칼리토금속의염을 사용하기 때문에 공정의 단가를 낮출 수 있으며 유해폐기물이 발생하지 않아 환경문제를 개선할 수 있다. 기존 에스터화반응에 비해 높은 수율을 보임과 동시에 정제방법 또한 간편하다는 장점을 가지고 있기 때문에 상업적으로 사용할 시, 생산품의 단가를 낮출 수 있다.

또한 본 발명의 에스터화반응에서는 염산 대신 황산을 사용하고, 염산은 부반응을 통해 기체상태로 공급되므로, 기존에 알려진 반응 시 일정한 간격을 두고 기체상태의 염산을 주입해주어야 하는 번거로움을 해결하였다.

또한, 본 발명에서 제공하는 에스터 합성방법에 따르면, 대량생산을 위한 제조공정으로 쉽게 업스케일링(up-scaling)될 수 있다.

도 1은 류신과 D-류신 유도체 화합물 처리시 세포 생존력을 확인한 것이다.
도 2는 류신과 D-류신 유도체 화합물 처리하여 골격근 세포의 분화능력을 확인한 것이다.
도 3은 D-류신 유도체가 골격근세포 C2C12의 세포생장을 촉진함을 확인한 도표이다.
도 4는 D-류신 유도체 처리군과 L-류신 처리군의 광학현미경 사진과 다중핵 세포수를 나타낸 도표이다.
도 5는 D-류신 유도체 처리군과 L-류신 처리군의 마커 발현 차이를 나타낸 도표이다.
도 6은 대조군과 D-류신 유도체 섭취군의 체중 변화를 나타낸 도표이다.
도 7은 대조군과 D-류신 유도체 섭취군의 악력 테스트 결과를 나타낸 도표이다.
도 8은 대조군과 D-류신 유도체 처리군의 골격근 조직 염색결과와 무게를 측정한 것이다.
도 9는 근육량 변화의 모식도를 나타낸 것이다.
도 10은 근세포 조직을 현미경으로 촬영한 것이다.
도 11은 근세포의 무게 및 근력을 측정한 도표이다.
도 12는 Al₂O₃를 사용한 경우 생성된 생성물을 확인한 것이다.
도 13은 D-류신 메틸에스터염산염의 분석법 중 특이성을 확인한 결과이다.
도 14는 D-류신 메틸에스터염산염의 분석법 중 직선성을 확인한 결과이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 하기 [반응식 1]에 의한 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물의 제조방법이 제공된다:

[반응식 1]

상기 ZnCl₂는 H₂SO₄와 반응하여 ZnSO₄ 및 HCl을 생성하고,

상기 HCl은 기체상태로 에스터화 반응의 촉매제로 사용되며,

상기 ZnSO₄는 탈수제로 작용하는 것을 특징으로 한다.

상기 반응은 에스터화 반응이며, 에스터화 반응에서는 촉매, 바람직하게는 금속염화물, 더욱 바람직하게는 ZnCl₂가 사용될 수 있다. 상기 금속염화물은 수화물 또는 무수물일 수 있으나 바람직하게는 수화물일 수 있다.

상기 에스터화 반응은 알코올(R¹OH) 존재 하에서 진행될 수 있으며, 상기 R¹은 C1 내지 C12의 알킬기 또는 tert-뷰틸기 중 선택되는 어느 하나이며, 바람직하게는 메틸기, 도데실기(dodecyl) 및 tert-뷰틸기 중 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메틸기일 수 있다. 상기 에스터화 반응은 용매를 포함하지 않을 수 있다.

상기 반응의 부 반응으로 하기 [반응식 2]의 반응이 일어난다.

[반응식 2]

상기 [반응식 2]를 통해 생성된 HCl은 기체상태로 반응에 공급될 수 있다. 염산은 기체상태로 공급되어야 하기 때문에 종전의 에스터화 반응의 경우 일정한 시간간격을 두고 기체상태의 염산을 반응에 공급해주어야 하는 번거로움이 있는데, 본 발명의 [반응식 2]의 부 반응을 통해 염산기체가 생성되므로 이러한 번거로움을 줄일 수 있다.

상기 [반응식 2]를 통해 생성된 황산아연은 물을 제거하는 탈수제 역할을 할 수 있다. 에스터화반응은 탈수축합반응이므로 물을 제거해주는 경우 평형이 정반응 방향으로 이동하여 생성물의 수율을 높일 수 있다.

이러한 에스터화 반응의 반응물인 금속염화물은 알코올에 대한 용해도가 낮아 완전한 해리가 이루어지지 않으므로 수화물 형태로 제공되는 것이 바람직하며, 이 경우 상술한 황산아연이 탈수제로 작용하여 물을 제거할 수 있다. 상기 탈수제에 더해 바람직하게는 무수황산나트륨이 선택적으로 첨가될 수 있다. 특히, 생성물이 가수분해반응에 민감하다면 추가적으로 물분자를 제거하여 높은 수율을 얻기 위해 무수황산나트륨이 첨가될 수 있다.

본 발명의 반응물인 아미노산은 아미노산에스터를 생성하는데, 쯔비터(Zwitter)평형이 존재하지 않아 아민에 의한 염기성 화합물이 된다. 이 때 산촉매와 함께 암모늄염의 형태가 되어 촉매가 소진되며 이러한 결과는 반응계의 pH를 높이게 되는 원인이 되고, 촉매량의 감소로 인해 정반응으로 이끌지 못하므로 수율이 저하된다. 그래서 더 많은 산촉매를 사용하게 되므로 정제 시, 잔여 촉매의 제거가 상당히 어려운 점이 있다. 또한, 이러한 아미노산에스터의 염 형태는 극성 정도가 높아 추출 정제가 매우 어렵고 산촉매 역시 극성 정도가 높기 때문에 깨끗하고 깔끔한 정제가 매우 어려운 단점을 가지고 있다. 이에 비하여 본 발명은 염화물과 황산화물의 이온교환에 의한 염산기체발생과 탈수제에 의한 물 분자의 제거로 인해 높은 에스터로의 전환율을 보이며 손쉽게 제거가 가능한 염산기체를 산촉매로 사용하기 때문에 1회의 필터만으로 정제가 간편한 장점을 가지고 있다.

일 측에 따르면, 상기 Al₂O₃는 촉매지지체일 수 있다. 상기 촉매지지체는 높은 표면적으로 인해 촉매의 반응 효율을 높이는 것일 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 알루미늄옥사이드는 염화아연과 1:1 내지 1:3.33의 몰 당량비로, 바람직하게는 1:3.33의 몰 당량비로 투입될 수 있으며, 이러한 조건 하에서 반응에 필요한 염화아연 촉매의 양을 최소화하면서도 짧은 반응시간내에 높은 수율을 보여줄 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 반응은 40℃에서 8시간동안 반응하는 것일 수 있다. 상기 반응조건에서 적은 염화아연의 양으로도 짧은 반응시간내에 높은 수율을 얻을 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 방법 중 어느 하나의 방법으로 제조된 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물이 제공된다. 상기 에스터화반응의 생성물인 에스터는 극성에스터화합물일 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

[화학식 1-1]

;

[화학식 1-2]

;

[화학식 1-3]

;

[화학식 1-4]

;

[화학식 1-5]

; 및

[화학식 1-6]

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이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

실시예1. 에스터화 반응

[반응식 1-1]

일반적으로 황산의 경우 고체상태의 금속염과의 반응성이 낮아 금속염을 이온상태로 만들어 주는 것이 중요하다. 하지만 일반적인 금속염화물은 알코올에 대한 용해도가 낮아 완전한 해리가 이루어 지지 않으므로 금속염화물은 수화물형태로 제공되어야 바람직하나, 이 경우 에스터화반응의 역반응인 가수분해반응을 유도하므로 물을 제거해 주는 탈수제를 첨가하여 수율을 높일 수 있다.

본 실시예에서는 1000mL 둥근바닥플라스크에 MeOH 122mL(10 eq)과 D-Lucine 50g(1 eq), ZnCl₂ 127.64g(2.5 eq)을 가한 뒤 상온에서 용해하였다. 이를 30분간 교반한 뒤 Na₂SO₄ 97g을 가하고 H₂SO₄ 77.8mL (1.5 eq)를 천천히 가해준 다음 65℃로 온도를 유지하며 16시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온냉각 시킨 뒤 여과한 다음 농축하였다. EA 100mL을 가하여 용해시킨 뒤, 유기층을 NaHCO₃ 포화수용액으로 1회 세척하였다. Na₂SO₄로 수분을 제거하고 여과하고 농축하여 생성물을 (68.3g, 99.4%)를 얻었다.

반응 시간이 길어지거나 용매 및 반응조 내부의 수분으로 인해 가수분해가 일어날 수 있기 때문에 별도의 탈수제인 무수황산나트륨이 선택적으로 첨가될 수 있다.

상기 [반응식 1-1]의 반응은 염화물의 염화이온과 황산의 수소이온으로 인해 반응 중 기체상태의 염산이 발생되고 그 염산을 산촉매로 하여 에스터화반응이 진행되어 염산기체의 지속적인 공급이 가능하다.

실시예2. D-류신의 에스터화 반응

[반응식 3]

상기 [반응식 3]에서 R²는 tert-뷰틸로, D-류신의 에스터화 반응을 실험한 결과는하기 [표 1]과 같았다. 반응조건은 D-류신 염산염(hydrochloride) 5.5g에 메탄올 60ml를 이용하였으며, 온도와 시간, Al₂O₃여부에 따른 D-류신 메틸에스터의 수율을 나타내었다. 실험 1 내지 6에서는 16시간, 60℃를 고정한 후, M¹에 따른 수율을 확인하였다. ZnCl₂와 CuCl₂가 각각 95%와 93%로 높은 수율을 보였다. 실험 7 및 8에서는 Al₂O₃와 함께 반응시 ZnCl₂가 CuCl₂보다 우수한 수율을 보임을 확인하였다. 실험 9 이하에서는 M¹을 ZnCl₂로 고정한 후, Al₂O₃의 당량과 반응시간 및 온도를 조정하여 수율을 확인하였다.

실시예3. 에스터화물의 세포독성 및 골격근세포 분화능력 확인

실시예 3-1. C2C12 세포배양

C2C12 세포는 ATCC에서 구입하여 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 13% 소 혈청(BS, bovine serum), 1.2% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin, P/S) 존재 하에 37.5℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포배양접시에서 C2C12 세포가 100% 가득 차게 되면 분화를 위하여 12% 소 태아 혈청(FBS, fetal bovine serum), 1.2% P/S가 함유된 고농도 포도당 DMEM을 사용하였으며, 0.5 mM 아이소뷰틸메틸잔틴(IBMS, Isobutylmethylxanthine), 1.1 μM 덱사메타손(DEX, Dexamethasone), 1.3 ㎍/㎖ 인슐린을 처리하여 48시간 배양하여 분화시켰다. 세포는 실험목적에 따라 96-웰플레이트(96-well plate)와 24-웰플레이트(24-well plate)에 세포를 분주하여 배양 및 실험하였다.

실시예3-2. 세포 독성 평가

L형 Leucine, D-Leucine 유도체를 세포 독성 평가를 하기 위해, C2C12 세포를 실험 전날 1×10⁶ 농도로 96-웰플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 화합물의 농도는 각각 0 mM~10 mM이 되도록 처리한 후 세포배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 1 ㎖, PMS reagent 20 ㎕ 비율로 혼합하여 배양액(media) 부피의 20%를 첨가하여 세포배양기에서 4시간 반응시킨 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 450 nm와 690 nm의 흡광도를 측정하고, 결과값을 계산하여 도 1에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이 웨스턴 블롯 분석을 통해 류신 및 류신 유도체 1 내지 3의 마이오스테틴 저해 효과를 세포와 배양 상청액의 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 측정하였으며, 세포 배양을 9일간 진행하여 L형 Leucine과 D-Leucine OMe HCl(유도체)의 세포 배양 차이를 광학 현미경을 통해 확인하고, 분화된 셀의 크기를 확인하여 D-Leucine OMe HCl(유도체)의 분화 촉진 효과를 확인하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, D-류신 유도체(D-leu-OMe-HCl)가 골격근 세포인 C2C12 세포의 성장에 영향을 줌을 확인할 수 있었다.

도 4에서 나타내는 바와 같이, D-류신 유도체가 L-류신에 비해 세포의 분화를 촉진하며, 6개 이상의 다중핵(multi-nuclei)을 갖는 세포 수를 증가시킴을 확인하였다.

도 5에서 나타내는 바와 같이, D-류신 유도체가 L-류신에 비해 분화 마커인 MyoD, MyuG, MyhC1의 발현을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예4. 체중, 악력 및 근무게 분석

실시예 4-1. 체중 변화 관찰

24개월령 마우스를 매일 20mg/kg의 양을 음수로 섭취한 그룹(실험군)과 일반 PBS를 음수로 섭취한 그룹(대조군)을 4개월 동안 유지시킨 후 체중 변화를 관찰하여 도 6에 나타내었으며, 대조군에 비해 실험군의 몸무게 감소가 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 4-2. 근육량 및 근 기능 강화 검사

1년 이상의 노화쥐를 대상으로 6개월간 D-류신 유도체(D-Leucine OMe HCl)를 경구 투여하여 근육량의 변화 추정 및 악력시험을(Grip strength test) 주 1회 실시함으로써, 근력의 변화를 관찰하였으며 실험 종료 후 골격근 조직을 H&E 염색을 통해 조직의 크기를 분석하여 근육량의 변화를 관찰하였다.

실시예 4-3. 악력(grip strength) 테스트 및 근무게 측정

악력은 BIOSEB사의 마우스용 악력측정기를 사용하여 측정하였다. 힘의 세기를 모니터링 할 수 있는 계기판에 부착된 철망 위에 마우스를 올려놓고 꼬리를 잡아 아래쪽으로 끌어내리면서 마우스가 철망을 잡는 힘을 측정하였다. 연속적으로 5회 반복하여 나타난 평균값을 사용하였다. 악력 측정결과, D-류신 유도체(D-Leucine OMe HCl)를 투여한 실험군에서 대조군에 비해 악력이 향상된 것을 확인하였다 (도 7). 또한, 골격근 조직의 염색분석결과는 도 8에 나타내었으며, 골격근 무게는 대조군과 D-류신 유도체 투여군에서 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

실시예5. D-류신의 최적제조예

본 발명에서, 촉매인 ZnCl₂의 당량비를 낮추고 반응조건을 개선하기 위하여, 실시예 2와 유사한 조건에서 알루미늄옥사이드를 촉매지지체로 사용하였다. 1000mL 둥근바닥플라스크에 메탄올 224mL(10 eq)과 D-류신 100g(1 eq), ZnCl₂91.90g(0.9 eq), Al₂O₃ 23.34g(0.3 eq)을 가한 뒤 상온에서 용해하였다. 이후 30분간 교반한 뒤 Na₂SO₄ 129.92g을 가하고 H₂SO₄ 40.35mL (0.6 eq)를 천천히 가하였다. 온도를 40℃로 유지하며 8시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온냉각 시킨 뒤 여과한 다음 농축하였다. EA(Ethyl Acetate) 100mL을 가하여 용해시킨 뒤, 유기층을 NaHCO₃ 포화수용액으로 1회 세척하였다. Na₂SO₄로 수분을 제거하고 여과하고 농축하여 생성물을 수득하였으며, 생성물은 136.64g, 수율 99.5%로 측정되어 매우 우수한 수율을 가짐을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 1에서 ZnCl₂ 127.64g(2.5eq)을 사용하였을 때와 유사한 수율이며, 반응시간은 절반가량 단축한 것이다. 제조된 생성물을 도 12에 나타내었다.

제조된 생성물인 D-류신 메틸에스터염산염의 FAB MASS 분석결과는 다음과 같다.

실시예 6. 최종생성물의 특성 확인

상기 실시예 5의 합성법으로 합성된 D-류신 메틸에스터염산염(methyl ester hydrochloride)을 HPLC-UV를 이용하여 멸균생리식염수 용액 중 D-류신 메틸에스터염산염을 정량하고 순도를 확인하는 분석법을 검증하였다.

분석법 검증은 특이성(specificity), 시스템 적합성 테스트(system suitability test, SST), 스톡 표준 비교(stock standard comparison, SSC), 성능 확인 표준(performance check standard, PCS), 직선성(linearity), 정확도(accuracy), 정밀도(precision), 균질성(homogeneity) 및 안정성(stability)으로 평가하였다. 결과적으로 특이성 면에서 희석용매 및 부형제 중 분석물질의 정량에 영향을 미치는 내인성 간섭물질은 확인되지 않았다. 분석법 검증 기간 동안 시스템은 적합하였고, SSC 및 PCS는 기준에 적합하였다. D-류신 메틸에스터염산염은 5 내지 100 μg/mL의 농도범위에서 직선성(linearity)을 보였다. QC 시료는 정확성, 정밀성 및 균질성 기준을 충족하였다. 또한 QC 시료는 실온에서 6 시간, 전처리 후 15 ℃ 오토샘플러(auto-sampler)내에서 6 시간, 그리고 조제 후 냉장 조건에서 7 일간 안정하였다. 표준원액은 실온에서 6 시간, 냉장 조건에서 7 일간 안정하였다.

결론적으로 본 시험에 사용한 분석법은 멸균생리식염수 용액 중 D-류신 메틸에스터염산염을 정량하기에 적합하였다.

실험에 수행된 기기 및 장치는 다음과 같다. HPLC는 Acquity UPLC(Waters, 미국), 정수 시스템(Water purification system)은 aquaMAX Ultra 370 (Young Lin, 대한민국), 초음파세척기(Ultrasonic cleaner)는 JAC-3010 (Kodo, 대한민국), 저울(Balance)는 XP205 (Mettler Toledo, 스위스), 디스펜서(Dispenser)는 E3x (Eppendorf, 독일), 마이크로피펫(Micropipette)은 Microman (Gilson, 프랑스) 및 볼텍스 믹서(Vortex mixer)는 MAXI-MIX (Thermo Fisher Scientific, 미국)을 이용하였다.

실험에 사용된 시약은 다음과 같다. 암모늄아세테이트(Ammonium acetate)는 로트번호 No. BCCG0465, Sigma-Aldrich를, 아세토나이트릴(acetonitrile)은 로트번호 No. M5C201, Fisher를, 탈이온수(Deionized water)는 aquaMAX Ultra 370에서 생산하여 이용하였다.

분석 기기의 작동조건은 하기 표 2와 같았다.

Parameters	조건
Detector	UV detector (λ = 195 nm)
Column	Kinetex HILIC (2.1 * 150 mm, 2.6 μm, Phenomenex)
Column oven temp.	40 °C
Auto-sampler temp.	15 °C
Mobile Phase	10 mM Ammonium acetate : Acetonitrile (3 : 97, v/v)
Flow rate	0.3 mL/min
Injection volume	2 μL
Run time	4 min
Data processing	Empower 3 (Version 3471)

용액은 다음과 같이 조제하였다. 385.4 mg의 암모늄아세테이트에 탈이온수를 가하여 최종 500 mL가 되게 하여 10 mM 암모늄아세테이트 용액을 제조하였다. 이 용액은 0.2 μm filter로 여과한 후 이동상으로 사용하였다. 실온보관하였으며, 유효기간은 조제 후 2주였다. 아세토나이트릴(acetonitrile)은 희석용매로, 실온보관하였으며 유효기간은 개봉일로부터 1년이었다.

표준물질은 순도에 대한 보정 없이 칭량하였고, 희석용매를 넣어 볼텍싱 및 초음파처리하여 조제하였다. 표준원액은 표준물질의 취량에 따라 용매첨가량을 조절하여 아래의 농도와 동일하게 조제하였다. 표준원액은 시험기간 동안 냉장 보관하였다.

분석결과는 다음과 같았다. 먼저 특이성(specificity) 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 A는 부형제(diluent), B는 비히클(vehicle), C는 SW_5(5μg/mL) 및 D는 QC_H(200 mg/mL)를 나타낸다. 도 13에서 확인할 수 있듯이, 희석용매 및 희석용매로 50 배 희석한 부형제 중 D-류신 메틸에스터염산염의 정량에 영향을 미치는 내인성 간섭물질은 확인되지 않았다.

다음으로 시스템 적합성 테스트(system suitability test, SST) 결과를 표 3에 나타내었다. D-류신 메틸에스터염산염의 피크면적에 대한 변동계수는 0.3 % 내지 0.7 %, 대칭계수는 1.09 내지 1.12, 이론단수는 22499 내지 23025 였으며, 이 결과는 허용기준을 충족하였다.

Batch Run	Nominal conc. (μg/mL)	Peak area	Tailing factor	Theoretical plate number
1	20	32544	1.09	22479
		32767	1.10	22580
		32846	1.07	22418
		32945	1.10	22565
		33125	1.09	22452
	Mean	32845	1.09	22499
	SD	215	-	-
	CV (%)	0.7	-	-
2	20	32787	1.11	22649
		32832	1.11	22759
		32505	1.09	22729
		32662	1.11	22722
		32413	1.10	22734
	Mean	32640	1.10	22719
	SD	179	-	-
	CV (%)	0.5	-	-
3	20	31691	1.11	23029
		31477	1.14	23165
		31602	1.11	23002
		31707	1.12	22950
		31669	1.13	22977
	Mean	31629	1.12	23025
	SD	94	-	-
	CV (%)	0.3	-	-

다음으로 스톡 표준 비교(stock standard comparison, SSC) 결과를 표 4에 나타내었다. 별개로 조제한 표준용액의 피크면적에 대한 SSC의 상대오차는 -0.3 내지 0.1 % 였으며 이 결과는 허용기준을 충족하였다.

Batch Run	Area of SW_3	Area of SSC	RE (%)
1	33093	33007	-0.3
2	32833	32830	0.0
3	32579	32605	0.1

다음으로, 성능 확인 표준(performance check standard, PCS) 결과를 표 5에 표시하였다. 별개로 조제한 표준용액의 이론농도에 대한 PCS의 상대오차는 -2.1 내지 1.2 % 였으며, 이 결과는 허용기준을 충족하였다.

Batch Run	Nominal conc. (μg/mL)	Measured conc. (μg/mL)	RE (%)
1	20	19.589	-2.1
		19.770	-1.2
		19.852	-0.7
		20.244	1.2
2	20	19.696	-1.5
2	20	19.919	-0.4
3	20	19.895	-0.5
3	20	19.881	-0.6

다음으로, 직선성(linearity) 결과를 표 6 및 도 14에 표시하였다. D-류신 메틸에스터염산염의 검량선 농도 범위 5 내지 100 μg/mL에서 결정계수는 모두 0.99 이상으로 허용기준을 충족하였다.

Batch Run	Curve equationa)	Coefficient of determination
1	y = 1761 x - 1680	1.0000
2	y = 1747 x - 1634	1.0000
3	y = 1722 x - 1573	0.9999
a) y = ax + b
a: Slope
b: Intercept
x: Measured concentration
y: Peak area

다음으로, 정확도(accuracy) 및 정밀도(precision) 결과를 각각 표 7 및 표 8에 표시하였다. QC 시료의 배치내 회수율은 각각 106.2 % (QC_L) 및 102.3 % (QC_H), 변동계수는 각각 0.2 % (QC_L) 및 1.2 % (QC_H) 였다. 배치간 회수율은 각각 105.9 % (QC_L) 및 101.7 % (QC_H), 변동계수는 모두 0.9 % (QC_L 및 QC_H) 였다. 이 결과는 허용기준을 충족하였다.

Batch Run	Replicate	QC level
Batch Run	Replicate	Low (0.5 mg/mL)	High (200 mg/mL)
1	1	0.5302	207.3
	2	0.5303	204.2
	3	0.5325	202.4
	Mean	0.5310	204.6
	SD	0.0013	2.5
	CV (%)	0.2	1.2
	Recovery (%)	106.2	102.3

Batch Run	Replicate	QC level
Batch Run	Replicate	Low (0.5 mg/mL)	High (200 mg/mL)
1	1	0.5302	207.3
	2	0.5303	204.2
	3	0.5325	202.4
2	1	0.5237	201.5
	2	0.5295	202.1
	3	0.5203	201.9
3	1	0.5365	203.0
	2	0.5346	204.5
	3	0.5297	202.4
	Mean	0.5297	203.3
	SD	0.0050	1.8
	CV (%)	0.9	0.9
	Recovery (%)	105.9	101.7

다음으로, 균질성(homogeneity) 결과를 표 9에 표시하였다. 조제 당일 QC 시료의 회수율은 각각 106.3%(QC_L) 및 102.7%(QC_H), 변동계수는 각각 1.0%(QC_L) 및 0.9%(QC_H)였다. 조제 후 7 일째 QC 시료의 회수율은 각각 105.6%(QC_L) 및 102.0%(QC_H), 변동계수는 각각 0.4%(QC_L) 및 0.9%(QC_H)였다. 이 결과는 허용기준을 충족하였다.

Time Point	Sample portion	QC level
Time Point	Sample portion	Low (0.5 mg/mL)	High (200 mg/mL)
0 hour	Top	0.5298	206.6
	Middle	0.5273	206.0
	Bottom	0.5375	203.3
	Mean	0.5315	205.3
	SD	0.0053	1.8
	CV (%)	1.0	0.9
	Recovery (%)	106.3	102.7
7 days	Top	0.5269	202.9
	Middle	0.5305	206.2
	Bottom	0.5268	202.9
	Mean	0.5281	204.0
	SD	0.0021	1.9
	CV (%)	0.4	0.9
	Recovery (%)	105.6	102.0

다음으로, 안정성(stability) 결과를 처리전 안정성(pre-pocessed stability), 처리후 안정성(post-processed stability) 및 저장 안정성(storage stability)으로 나누어 확인하였다. 처리전 안정성의 경우 표 10에 나타내었으며, 실온(11 내지 30℃)에서 6 시간 보관한 QC 시료의 회수율은 각각 105.9 % (QC_L) 및 101.0 % (QC_H), 변동계수는 각각 1.2 % (QC_L) 및 0.8 % (QC_H) 였다. 이상의 결과로, QC 시료는 실온에서 6 시간 안정함을 확인하였다.

Time Point	Replicate	QC level
Time Point	Replicate	Low (0.5 mg/mL)	High (200 mg/mL)
6 hours	1	0.5260	203.0
	2	0.5254	202.5
	3	0.5366	200.1
	Mean	0.5293	201.9
	SD	0.0063	1.6
	CV (%)	1.2	0.8
	Recovery (%)	105.9	101.0

처리후 안정성의 경우 표 11에 나타내었으며, 15 ℃의 오토샘플러에서 6 시간 보관한 QC 시료의 회수율은 각각 106.5 % (QC_L) 및 101.8 % (QC_H), 변동계수는 각각 1.1 % (QC_L) 및 0.1 % (QC_H)였다. 이상의 결과로, QC 시료는 15 ℃의 오토샘플러에서 6 시간동안 안정함을 확인하였다.

Time Point	Replicate	QC level
Time Point	Replicate	Low (0.5 mg/mL)	High (200 mg/mL)
6 hours	1	0.5304	203.8
	2	0.5275	203.4
	3	0.5392	203.4
	Mean	0.5324	203.5
	SD	0.0061	0.2
	CV (%)	1.1	0.1
	Recovery (%)	106.5	101.8

저장 안정성은 표 12에 나타내었다. QC 시료의 조제 후 5 일째 회수율은 각각 105.7 % (QC_L) 및 102.3 % (QC_H), 변동계수는 각각 1.0 % (QC_L) 및 0.7 % (QC_H) 였다. 조제 후 7 일째 회수율은 각각 107.3 % (QC_L) 및 101.2 % (QC_H), 변동계수는 모두 0.7 % (QC_L 및 QC_H) 였다. 이상의 결과로, QC 시료는 냉장 조건에서 7 일간 안정함을 확인하였다. 조제 당일 QC 시료의 회수율은 각각 106.3%(QC_L) 및 102.7%(QC_H), 변동계수는 각각 1.0%(QC_L) 및 0.9%(QC_H)였다. 조제 후 7 일째 QC 시료의 회수율은 각각 105.6%(QC_L) 및 102.0%(QC_H), 변동계수는 각각 0.4%(QC_L) 및 0.9%(QC_H)였다. 이 결과는 허용기준을 충족하였다.

Time Point	Replicate	QC level
Time Point	Replicate	Low (0.5 mg/mL)	High (200 mg/mL)
5 days	1	0.5342	204.7
	2	0.5246	206.0
	3	0.5262	203.0
	Mean	0.5283	204.6
	SD	0.0051	1.5
	CV (%)	1.0	0.7
	Recovery (%)	105.7	102.3
7 days	1	0.5370	203.1
	2	0.5398	203.2
	3	0.5322	200.8
	Mean	0.5363	202.4
	SD	0.0038	1.4
	CV (%)	0.7	0.7
	Recovery (%)	107.3	101.2

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims

하기 [반응식 1]에 의한 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물의 제조방법:
[반응식 1]

상기 R¹은 C1 내지 C12의 알킬기 또는 tert-뷰틸기에서 선택되는 어느 하나이며,
R²는 메틸기 또는 아이소프로필기에서 선택되는 어느 하나일 수 있고,
상기 ZnCl₂는 H₂SO₄와 반응하여 MgSO₄ 및 HCl을 생성하고,
상기 HCl은 기체상태로 에스터화 반응의 촉매제로 사용되며,
상기 MgSO₄는 탈수제로 작용하는 것을 특징으로 함.
제1항에 있어서, 상기 Al₂O₃는 촉매지지체인 것을 특징으로 하는, 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 반응은 40℃에서 8시간동안 반응하는 것을 특징으로 하는, 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 Al₂O₃ 와 ZnCl₂는 1:1 내지 1:3.33의 몰 당량비로 반응하는 것을 특징으로 하는, 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제5항에 있어서,
상기 에스터 화합물은 하기 [화학식 1-1] 내지 [화학식 1-6]으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 근감소증의 예방 또는 치료용 에스터 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염.
[화학식 1-1]
;
[화학식 1-2]
;
[화학식 1-3]
;
[화학식 1-4]
;
[화학식 1-5]
; 및
[화학식 1-6]
.