PT1089998E - Derivados de epotilona e sua síntese e utilização - Google Patents

Description

ΡΕ1089998 1 DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE EPOTILONA E SUA SÍNTESE E UTILIZAÇÃO"

Sumário da invenção A presente invenção relaciona-se com análogos da epotilona com modificações na cadeia lateral e com métodos para produção desses compostos, sua utilização na terapia de doenças ou para a manufactura de preparações farmacêuticas para o tratamento de doenças, assim como com novos intermediários utilizados na síntese de tais análogos e novos métodos de síntese.

Direitos do Governo

Esta invenção foi efectuada com o suporte do governo com uma Bolsa CA 46446 ganha pelo Instituto Nacional de Saúde. O governo dos U.S. tem certos direitos nesta invenção.

Antecedentes da invenção

As epotilonas (1—5) são substâncias naturais que exibem citotoxicidade mesmo contra células de tumores resistentes a paclitaxel através da promoção da polime-rização de sub-unidades a- e β-tubulina e estabilizando as 2 ΡΕ1089998 ligações de microtubos resultantes. As epotilonas deslocam o paclitaxel (o princípio activo do TAXOL™) dos seus sítios de ligação ao microtubo e são referidos como sendo mais potentes do que o paclitaxel no que respeita á estabilização dos microtubos.

l:R=H,R1=Me: epotilona A

2 : R=Me, R1=Me : epotilona B 4: R=H: epotilona C

3:R=H, R1=CH20H:epotilona E 5: R=Me:epotilona D 0 que é necessário são análogos da epotilona A e B que exibe propriedades farmacológicas superiores, especialmente uma ou mais das seguintes propriedades: um aumento do índex terapêutico (e.g. um maior intervalo de doses citotóxicas contra e.g. doenças proliferativas sem toxicidade para as células normais), melhores propriedades fármaco-cinéticas, melhores propriedades farmacodinâmicas, melhor solubilidade em água, melhor eficiência contra tipo de tumores que são ou se tornam resistentes a elementos de formulações e.g. melhor solubilidade em solventes polares, especialmente aqueles compreendendo água, aumento de estabilidade, manufactura conveniente desses compostos, inibição melhorada da proliferação ao nível celular, 3 ΡΕ1089998 elevados níveis de efeitos de estabilização de microtubos, e/ou perfil farmacológico específico. W098/25929A descreve análogos de epotilona e biblioteca de análogos de epotilona e suas sínteses. Demonstrou-se que vários dos análogos têm uma actividade citotóxica superior para induzir a polimerização e estabilização de microtubos.

Descrição detalhada da invenção: A presente invenção relaciona-se com novos compostos que surpreendentemente tem uma ou mais das vantagens acima mencionadas.

Um aspecto maior da invenção relaciona-se com um composto análogo de epotilona representada pela fórmula I

onde a ligação ondulada indica que a ligação "a" está representada pela forma cis ou trans; (i) R2 está ausente ou é oxigénio; "a" pode ser ou uma ligação simples ou dupla; "b" pode estar ausente ou é uma ligação simples; e "c" pode estar ausente ou ser uma ligação simples, com a condição de 4 ΡΕ1089998 que quando R2 é oxigénio então "b" e "c" são ambos uma ligação simples e "a" é uma ligação simples; se R2 está ausente então "b" e "c" estão ausentes e "a" é uma ligação dupla; e se "a" é uma ligação dupla, então R2, "b" e "c" estão ausentes;

Rs é um radical seleccionado de um grupo consistindo de hidrogénio; alquilo inferior, especialmente meti-lo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo; -CH=CH2; -C^CH; -CH2F; -CH2C1; -CH2-OH; -CH2-0-(Ci-C6-alquilo) , especialmente -CH2-0-CH3; e —CH2 —S (Ci-C6alquilo) , especialmente -CH2-S-CH3; R4 e R5 são independentemente seleccionados de hidrogénio, metilo ou um grupo protector, preferencialmente hidrogénio, e

Ri é um radical seleccionado das seguintes estruturas:

ou um sal de um composto de formula I onde um grupo que forma sal está presente.

Os termos gerais utilizados anteriormente preferencialmente tem dentro do contexto desta descrição os seguintes significados, salvo indicação em contrário: 5 ΡΕ1089998 O termo "inferior" significa que o radical respectivo preferencialmente tem até e incluindo 7, mais preferencialmente até e incluindo 4 átomos de carbono. 0 alquilo inferior pode ser linear ou ramificado uma ou mais vezes e tem preferencialmente até e incluindo 7 átomos de carbono, mais preferencialmente até e incluindo 4 átomos de carbono. Preferencialmente, o alquilo inferior é metilo, etilo, n-propilo, isso-propilo, n-butilo, iso-butilo, terc-butilo ou ainda n-pentilo ou n-hexilo.

Um grupo protector é preferencialmente um grupo protector padrão. Se existir um ou mais grupos funcionais, por exemplo carboxilo, hidroxilo, amino, ou mercapto ou necessitar de ser protegido num composto de formula I, porque estes não devem tomar parte da reacção, estes são grupos que são normalmente utilizados na sintese de compostos de péptidos, e também de cefalosporinas e penicilinas, assim como derivados de ácidos nucleicos e açucares.

Os grupos protectores podem estar já presentes nos percursores e devem proteger os grupos funcionais no que respeita a reacções secundárias indesejadas, tais como acilação, eterificação, esterificação, oxidações, solvó-lise, e reacções similares. Uma caracteristica dos grupos protectores é a destes se adaptarem prontamente, i.e. sem reacções secundárias indesejadas, para remover, tipicamente por solvólise, redução, fotólise ou também por actividade 6 ΡΕ1089998 enzimática, por exemplo sob condições análogas às condições fisiológicas, e que estes não estão presentes nos produtos finais. Os especialistas sabem, ou podem estabelecer facilmente, qual os grupos protectores que são adequados com as reacções mencionadas aqui anteriormente e daqui em diante. A protecção de tais grupos funcionais por grupos protectores, os grupos protectores eles mesmos, e as reacções de remoção destes estão descritas por exemplo em trabalhos de referência, tais como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London e New York 1973, em T.W. Greene "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York 1981, em "The peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross e J. Meienhofer);, Academic press, London e New York 1981, em "Methoden der Organischen Chemie" (Methods of organic chemistry), Houben Weyl, 4a edição, Volumel5/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, em H. D. Jakubke e H. Jescheit, "Aminosauren, peptide, Protein" (Amino acids, peptides, proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, e Basel 1982, e em Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate; Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of carbohydrates: monosaccharides and derivatives) , Georg Thieme Verlag, Stuttgard 1974. Os grupos protectores especialmente preferidos são grupos protectores de hidroxilo, tais como terc-butildimetilsililo ou tritilo. R.4 e Rs são preferencialmente hidrogénio. 7 ΡΕ1089998 A ligação ondulada que começa no carbono que suporta R3 significa que uma ligação "a" está presente na forma trans ou preferencialmente na forma cis.

Os sais são especialmente os sais farmaceu-ticamente aceitáveis de compostos de fórmula I.

Tais sais são formados, por exemplo, como sais de adição de ácidos, preferencialmente com ácidos orgânicos ou inorgânicos, de compostos de fórmula I com um átomo de azoto básico, especialmente os sais farmaceuticamente aceitáveis. Os ácidos inorgânicos adequados são, por exemplo, ácidos de halogéneos, tais como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ou ácido fosfórico. Os ácidos orgânicos adequados são por exemplo, ácidos carboxílicos, fosfónicos, sulfónicos ou ácidos sulfâmicos, por exemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanoico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimelico, ácido suberico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tais como ácido glutâmico ou ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroxi-maleico, ácido me-tilmaleico, ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido adamanta-nocarboxílico, ácido benzóico, ácido salicílico, 4-amino-salicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido man-délico, ácido cinâmico, ácido metano- ou etanossulfónico, ácido etano-1,2-dissulfónico, 2-, 3- ou 4-metilbenzenos-sulfónico, ácido metil-sulfúrico, ácido etil-sulfúrico, 8 ΡΕ1089998 ácido dodecilsulfúrico, N-ciclo-hexilsulfâmico, ácido N-metil-, W-etil- ou N-propil-sulfâmico, ou outros ácidos orgânicos protónicos tais como ácido ascórbico.

Com o objectivo de isolamento ou purificação é também possível utilizar sais farmaceuticamente não aceitáveis, por exemplo picratos ou percloratos. Para utilização terapêutica, apenas são empregues sais farmaceuti-camente aceitáveis ou compostos livres (quando aplicáveis na forma de preparações farmacêuticas), e estes são por isso preferidos.

No que respeita à próxima relação entre os novos compostos na forma livre e aqueles na forma de seus sais, incluindo aqueles sais que podem ser utilizados como intermediários, por exemplo na purificação ou identificação de novos compostos, qualquer referência aos compostos livres anteriormente referidos e daqui em diante, deve ser entendido como referindo-se também aos sais correspondentes, como apropriado e conveniente. 0 termo "cerca" em ligação com valores numéricos, e.g. cerca de 2 vezes de excesso molar" ou semelhante, é preferencialmente entendido como significando que o valor numérico dado pode desviar do número dado por até 10%, mais preferencialmente por até + 3%; mais preferencialmente, o valo numérico é exactamente o valor dado.

Especialmente preferido é ou um composto de fórmula na forma livre I, ou um seu sal. 9 ΡΕ1089998

Bioactividade: Os composto (s) da invenção podem ser utilizados para o tratamento de uma doença proliferativa, especialmente cancro, como cancro dos pulmões, especialmente carcinoma de pulmão de células de pulmão que não são pequenas, ou da próstata, dos intestinos, e.g. cancros colorectais, tumores epidermóides, tais como tumores na cabeça e/ou pescoço, ou cancro da mama, ou outros cancros como cancros da bexiga, pâncreas ou cérebro ou melanoma, incluindo especialmente o tratamento de cancros que são multiresistentes a drogas (e.g. devido à expressão de p-glicoproteina =P-gp) e/ou reprimidas no tratamento com paclitaxel (e.g. na forma de TAXOL).

Avaliação Biológica: A capacidade dos compostos da presente invenção para bloquear a despolimerização de microtubos pode ser mostrada pelo seguinte ensaio:

Os ensaios de microtubos foram efectuados seguindo os procedimentos da literatura e os compostos sintetizados foram avaliados quanto à sua capacidade de formar microtubos estáveis. Os estudos citotóxicos foram também efectuados.

Os compostos de fórmula I são testados para a sua acção no ensaio de tubulina utilizando tubulina purificada com um ensaio desenvolvido para amplificar as diferenças 10 ΡΕ1089998 entre os compostos mais activos do que o Taxol. Verificou-se que os compostos de fórmula I mostraram um nivel elevado de citotoxicidade e actividade de polimerização de tubulina, quando comparados com Epotilonas A e B. (Lin et. al. Câncer Chemother. Pharmacol. 38, 136-140 (1996); Rogan et. al. Science 244, 994-996 (1984)

Ensaio Colorimétrico de Filtração A proteína tubulina (0,25 mL de 1 mg/mL) é colocada num tubo de ensaio e adiciona-se 2,5 pL de composto teste. A amostra é misturada e incubada a 37°C durante 30 minutos. A amostra (150 pL) é transferida para uma placa de filtração com tamanho de poro de 0,22 pm hidrofílica Dupore Multiscreen Millipore de 96 poços que foi previamente lavado com 200 pL de tampão MEM sob vácuo. O poço é em seguida lavado com 200 pL de tampão MEM. Para corar a proteína retida na placa, adiciona-se 50 pL de solução negra de amido [0,1% naftol azul escuro (Sigma)/45 % metanol/10% ácido acético] ao filtro durante 2 minutos; em seguida é aplicado novamente o vácuo. Adiciona-se por duas vezes 200 pL de solução que descora o negra de amido (90% metanol/2% ácido acético) para remover o corante não ligado. O sinal é quantificado pelo método de Schaffner and Weissmann et. al. Anal. Biochem., 56: 502-514, 1973 como segue: adiciona-se 200 pL de solução eluente (25 mM NaOH-0,05 mm EDTA-50% etanol) ao poço e a solução é misturada com uma pipeta após 5 minutos. Seguindo um período de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, 150 pL da 11 ΡΕ1089998 solução eluente são transferidos para o poço da placa de 96 poços e a absorvância é medida num Dispositivo Molecular de Leitor de Microplaca.

As experiências de citotoxicidade com linhas de células 1A9, 1A9PTX10 (α-tubulina mutante), e 1A9PTX22 (a-tubulina mutante) revelaram actividade citotoxica dos composto de fórmula I. Tal como as epotilonas de origem natural 1 e 2, os composto de fórmula I mostraram uma actividade significante contra a alterada a-tubulina-expressa em linhas de células 1A9PTX10 e 1A9PTX22. Para os compostos de fórmula I, aos valores preferidos de CI50 (concentração onde metade das células do tumor sofre inibição de crescimento em comparação com um controlo sem adição de inibidor de fórmula I) podem estar no intervalo de 1 a 1000 nM, preferencialmente desde 1 a 200 nM. A capacidade dos compostos da presente invenção para inibir o crescimento do tumor pode ser mostrada pelos seguintes ensaios com as seguintes linhas de células:

Ensaio Colorimétrico de Citotoxicidade para filtrar as Drogas Anti-cancerisnas

Ensaio Colorimétrico de Citotoxicidade utilizado é adaptado de Skehan et.al. (Journal of National Câncer Inst 82: 1107-1112, 19901). O procedimento proporciona um método rápido, sensivel, e económico para medir o conteúdo de proteina celular de culturas de adesão e suspensão em 12 ΡΕ1089998 placas de microtítulo de 96 poços. 0 método é adequado para as doenças do Instituto Nacional do Cancro orientado para filtrar a descoberta de drogas anti-cancro.

Em particular, as culturas fixas com ácido tricloroacético são coradas durante 30 minutos com 0,4% (p/v) sulf orodamina B (SRB) dissolvida em 1% de ácido acético. O corante não ligado é removido por quatro lavagens com ácido acético a 1%, e o corante ligado à proteína é extraído com base Tris não tamponada lOmM [Tris(hidroximetil)aminometano] para determinação da densidade óptica num computador com interface, leitor de placa de microtítulo de 96 poços. Os resultados do ensaio SRB são não lineares com o número de células e com os valores para as medidas de proteína celular pelos ensaios de Lowry e Bradford com densidades em intervalos desde escasso subconfluente até multicamada supraconfluente. A razão sinal-ruído a 564 nm é aproximadamente 1,5 com 1,000 células por poço. O ensaio SRB proporciona um ponto final calorimétrico que é não destrutivo, estável indefinidamente, e visível a olho nu. Este proporciona uma medição sensível da citotoxicidade induzida pela droga. A SRB é fortemente fluorescente com excitação no laser a 488 nm e pode ser medida quantitativamente no nível de célula-única por citometria de fluorescência estática (Skehan et. al. (Journal of National Câncer Inst 82:1107-1112, 19901)). 13 ΡΕ1089998

Alternativamente, a eficiência dos compostos de fórmula I como inibidores de despolimerização de microtubos pode ser demostrada como se segue: São preparadas soluções de estoque dos compostos teste e guardadas a -20°C. A proteina-microtubule é obtida a partir do cérebro do porco por dois ciclos de temperatura dependente despolimerização/polimerização, como descrito (ver (Weingarten et. al., Biochemistry 1974; 13: 5539-37). As soluções de trabalho guardadas de proteina microtubule (significa tubulina mais microtubuli-proteinas associadas) são guardadas a -70°C. 0 grau de polimerização de proteina microtubuli induzida por um composto teste é medida essencialmente como conhecido na literatura (ver Lin et. al. ; Câncer Chem. Pharm. 1996; 38: 136-140). Rapidamente, 5pL de solução estoque de composto teste são pré-misturados na concentração 20 vezes a concentração final desejada com 45 pL de água à temperatura ambiente, e a mistura é em seguida colocada em gelo. Uma alíquota de solução de trabalho de proteina microtubuli de cérebro de porco é descongelada rapidamente e em seguida diluida a 2 mg/mL com gelo 2 x tampão MEM (200 mL MES, 2mM EGTA, 2mM MgC12, pH 6,7) (MES = ácido 2-morfolinoetanosulfónico , EGTA = etilenoglicol-bis-2(2-aminoetil)-tetra-acético). A reacção de polimerização é em seguida iniciada pela adição de 50 pL de cada vez de proteina microtubuli no composto teste, seguido de incubação da amostra num banho de água com temperatura ambiente. Em seguida as misturas reaccionais são colocadas numa micro-centrífuga Eppendorf e incubadas 14 ΡΕ1089998 mais 15 minutos à temperatura ambiente. As amostras são em seguida centrifugadas durante 20 minutos a 14000 rpm à temperatura ambiente para separação da proteina microtubuli polimerizada da não polimerizada. Como medida indirecta para polimerização-tubulina a concentração do sobrenadante (que contém o resto de proteina de microtubo solúvel não polimerizada,) é determinada de acordo com o método Lowry (DC Assay Kit, Bio-Rad Laboratories, hércules, CA) , e a densidade óptica (OD) da reacção de cor é determinada a 750 nm num espectrómetro (SpectraMax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . As diferenças nos OD entre amostras tratadas com um composto teste e os controlos tratados com veiculo são comparados com aqueles dos testes de incubação que contém Epotilona B 25 μΜ (controlos positivos). O grau de polimerização que é induzido pelo composto teste é expresso relativamente aos controlos positivos (100%). Por comparação com várias concentrações pode ser determinada a EC50 (concentração para a qual se obtém 50% da polimerização máxima) para os compostos de formula I o EC50 fica preferencialmente no intervalo de 1 até 200, preferencialmente 1 a 50 μΜ. A indução da polimerização de tubulina do composto teste de formula I numa concentração 5 μΜ como percentagem em comparação com epotilona B 25 μΜ fica preferencialmente no intervalo de 50 a 100%, especialmente 80 a 100%. A eficiência contra células de tumores pode ser também mostrada da seguinte maneira: 15 ΡΕ1089998

As soluções de estoque de compostos teste de fórmula I (10 mM em DMSO) são preparadas e guardadas a -20°C. Células de carcinoma epidermóide humano KB-31 (multiresistente a drogas, expressão excessiva Pgp 170) KB-8511 são do Dr M. Baker, Roswell Park Memorial Institute (Buffalo, NY, USA) (para descrição ver também Akiyama et. al., Somat. Cell. Mol. Genetics 11, 117-126 (1985) e Fojo A. Et. al., Câncer Res. 45, 3002-3007 (1985) - KB-31 e KB-8511 ambos são derivados de linhas de células KB (América Type Culture Collection) e são células de carcinomas epidermóides humanos as células. As células KB-31 podem ser cultivadas em monocamadas utilizando soro de bovino (Μ. A. Bio-products), L-glutamina (Flow), penicilina (50 unida-des/mL) e esteptomicina (50 pg/mL (Flow); estas em seguida crescem com uma taxa duas vezes superior em cerca de 22 horas, e a eficiência relativa do seu plaqueamento fica em cerca de 60%. As células KB-8511 são uma variante derivada de uma linha de células KB-31 que foi obtida por tratamento em ciclos com colchicina, e apresenta uma resistência 40 vezes superior contra a colchicina em comparação com as células KB-31) . As células são incubadas a 37°C numa incubadora com 5% de CCç v/v e a 80% de humidade atmosférica relativa em meios MEM alfa que contém ribonucleósidos e desoxiribonucleósidos (Gibco BRL), complementado com 10 IU de penicilina, 10 pg/mL streptomicina e 5% de soro fetal de bovino. As células são espalhadas numa quantidade de 1,5 x 103 células/poço em placas de microtitulo de 96 poços e incubadas de um dia para o outro. Várias diluições dos compostos teste no meio de cultura são adicionadas no dia 16 ΡΕ1089998 1. As placas são em seguida incubadas por um periodo de mais quatro dias, ao fim dos quais as células são fixadas utilizando glutaraldeido 3,3% lavadas com água e finamente coradas com 0,05 % p/v de azul de metileno. Após mais uma lavagem, o corante é eluido com HCl a 3% e a densidade óptica a 665 nm é medida com um SpectaMax 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . os valores de CI50 são determinados por ajuste matemático dos dados às curvas utilizando o programa SoftPro2.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e a fórmula [(OD tratado)-(OD de partida)]/[(OD controlo)-(OD partida)]xlOO. A CI50 é definida como a concentração de um composto teste no fim do periodo de incubação que conduz a 50% do número de células em comparação com controlos sem composto teste (concentração a metade da inibição de crescimento máxima das células). Os compostos de fórmula I apresentam preferencialmente aqui CI50 no intervalo desde 0,1 x 10-9 até 500 x 10“9 M, preferencialmente entre 0,1 e 60 nM.

Os testes comparáveis podem também ser efectuados com outras linhas de células tumorais, tais como A459 (plumão; ATCC CCL 185), NC1H460 (plumão), Colo 205; ATCC N° CCL 222) (HCT-15 (colon; ATCCCCL 225 - ATCC = American Type

Culture Collection (Rockville, MD, USA)), HCT-116 (cólon), Dul45 (próstata; ATCC No. HTB 81; ver também Câncer Res. 37, 4049-58 [1978]), PC-3M (derivados insensíveis a 17 ΡΕ1089998 hormona-prostata do Dr. I. J. Fidler (MD Anderson Câncer Center, Houston, TX, USA) e derivados de PC-3 que é uma linha de células disponível a partir de ATCC (ATCC CRL 1435), MCF-7 (mama; ATCC HTB 22) ou MCF-7/ADR (mama, multi-resistente a drogas; para descrição ver Blobe G. C. et. al., J. Biol. Chem. (1983), 658-664; a linha de células é altamente resistente (360- a 3400 vezes) a doxorubicina e alcaloides Vinca comparadas com células MDR-7 "tipo desordenado") para as quais foram obtidos resultados semelhantes como células KB-31 e KB-8511. os compostos de formula I apresentam preferencialmente aqui CI50 num intervalo desde 0,1 x 10~9 até 500 x 1CT9M, preferencialmente entre 0,1 e 60 nM.

Com base nestas propriedades, os compostos de formula I (também os seus sais) são apropriados para o tratamento de doenças proliferativas, tais como doenças tumorais, incluindo também metástases quando presentes, por exemplo em tumores sólidos, tais como tumor dos plumões, cancro da mama, cancro colo-rectal, cancro da próstata, melanoma, tumor cerebral, tumor do pâncreas, tumor da cabeça e pescoço, cancro da bexiga, neuroblastoma, tumor da faringe, ou também de doenças proliferativas de células do sangue, tais como leucemia, ou ainda para o tratamento de outras doenças que respondem ao tratamento com inibidores de despolimerização de microtubos, tais como psoríase. Os compostos de fórmula I, ou seus sais, são também apropriados para cobertura de implantes médicos (úteis na profilaxia de restenosis) (ver WO 99/16416, prioridade 29 Setembro de 1997). 18 ΡΕ1089998 A actividade in vivo de um composto da invenção pode ser demonstrada com o seguinte modelo animal:

Ratinhos fêmea ou macho BALB nu/nu (atimicos) são mantidos em condições esterilizadas (10 a 20 ratinhos por gaiola Tipo III) com livre acesso a comida e água. O peso do ratinho está entre 20 e 25 g na altura do implante do tumor. Os tumores são estabelecidos por injecção subcutânea de células (minimo 2 x 106 células em 100 pL PBS ou meio) num ratinho veiculo (4-8 ratinhos por linha de células). Os tumores resultantes são passados em série num minimo de três implantes consecutivos antes de se iniciar o tratamento. Os fragmentos do tumor (aproximadamente 25 mg) são implantados s.c. no flanco esguerdo dos animais com uma agulha trocanter calibre-13 enguanto o ratinho é exposto a anestesia com Forene (Abbot, Switzerland). O crescimento do tumor e o peso corporal é monitorizado uma a duas vezes por semana. Todos os tratamentos são administrados intravenosamente (i.v.) e são iniciados guando um volume médio de tumor se aproxima de 100 a 250 mm3, dependendo do tipo de tumor. Os volumes do tumor são determinados utilizando a fórmula (L x D x n)/6 (ver Câncer Chemother. Pharmacol. 24: 184-154, [1989]. Os tratamentos com epotilonas de fórmula I variam a dose e a freguência de administração. Os agentes de comparação são administrados de acordo com o regímen de tratamento óptimos previamente determinados. Adicionalmente as alterações presentes nos 19 ΡΕ1089998 volumes de tumor no decorrer do tratamento, actividade anti-tumor é expressa como T/C% (aumento do volume médio do tumor doas animais tratados dividido pelo aumento do volume médio de tumor nos animais de controlo multiplicado por 100) . A regressão do tumor (%) representa o volume médio mais pequeno do tumor no inicio do tratamento, de acordo com a fórmula de regressão (%) = (1-Vfim/Vinicio)xlOO (Vfim = média do volume final de tumor), Vinicio = volume médio do tumor no inicio do tratamento.

Com este modelo, o efeito inibitório de um composto da invenção no crescimento e.g. dos tumores derivam da seguinte linha de células que podem ser testadas :

Linha de células HCT-15 de adenocarcinona colo-rectal humano (ATCC CCL 225) é da colecção de culturas tipo americana (Rockville, MD, USA), e as células são cultivadas in vitro como recomendado pelo fornecedor. HCT-15 é uma linha de células semelhante a epiteliais (Câncer Res. 39: 1020-25 [1979]) que é multi-resistente a drogas devido a expressão excessiva de P-glicoproteina (P-gp, gpl70, MDR-1;

Anticancer Res. 11: 1309-12 [1991]; J. Biol. Chem. 264: 18031-40 [1989]; Int. J. Câncer 1991; 49: 696-703 [1991]) e mecanismos de resistência dependente de glutationa (Int. J. Câncer 1991; 49: 688-95 [1991]). A linha de células Colo 205 é também uma linha de células de carcinoma do cólon humano (ATCC N° CCL 222; ver também Câncer Res. 38, 1345-55 [1978] que foi isolada do fluido ascitico de um paciente, 20 ΡΕ1089998 apresenta morfologia semelhante a células epiteliais e é geralmente considerada como sendo sensível a drogas. A linha de células humanas de cancro da próstata independente de androgénio é utilizada para estabelecer modelos subcutâneos e ortotópicos em ratinhos. O carcinoma da próstata metastático humano PC-3M é obtido a partir do Dr I. J. Fidler (MD Anderson Câncer Center, Houston, TX, USA) e é cultivado em meio Ham F12K suplementado com 7% v/v FBS. A linha de células PC-3M é o resultado do isolamento de metástases do fígado produzidas num ratinho atímico subsequente a uma injecção intrasplénica de células PC-3 [ATCC CRL 1435; American Type Culture Collection (ROckville, MD, USA)], e estas podem crescer em meio Eagle MEN suplementado com 10% de soro fetal de bovino, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais, L-glutamina, uma solução dupla de vitamina (Gibco Laboratories, Long Island, N. Y.) e penicilina- estreptomicina (Flow Laboratories, Rockville, Md.). A linha de células PC-3M é insensível a hormonas (isto é, presumivelmente deriva da linha de células PC-3M). A PC-3M é uma linha de células disponível a partir de ATCC (ATCC CRL 1435) e corresponde a um adenocarcinoma prostatico de grau IV isolado de um homem de raça caucasiana de 62 anos de idade; as células exibem baixa actividade de ácido fosfatase e testoterona-5-a-redutase. As células são quase triplóides com um número nodal de 62 cromossomas. Não podem ser detectados cromossomas normais Y pela análise de banda-Q. O acenocarcinoma do plumão A549 (ATCC CCL) 185; isolado como cultura extraída do tecido do carcinoma do plumão de uma mulher de raça caucasiana de 58 anos); mostra morfologia epitelial e pode 21 ΡΕ1089998 sintetizar lecitina com uma percentagem de ácidos gordos insaturados utilizando o mecanismo de citidina difosfoco-lina; um cromossoma marcador subtelocêntrico envolvendo o cromossoma 6 e o braço longo do cromossoma 1 é encontrado em todas as metafases. O carcinoma humano da mama ZR-75-1 (ATCC CRL 1500; isolado de um efusão ascitica maligna de uma mulher de raça caucasiana de 63 anos de idade com carcinoma de infiltração ductal); é de origem epitelial mamária; as células possuem receptores de estrogeneo e outras hormonas esteroides e tem um número de cromossoma hiper-triplóide. Uma linha de células KB-8511 de carcinoma (boca) epidermal humano (uma linha de células de expressão excessiva P-gp derivado de linha de células carcinoma KB-31 (boca) epidermóide I é obtida pelo Dr. R. M. Baker, Roswell Park Memorial Institute (Buffalo, N. Y., USA) (para descrição ver Akiyama et. al.; Somat cell. Mol. Genetics 11, 117-126 (1985) e Fojo A., et. al. Câncer Res. 45, 3002-3007 (1985))e é cultivada como descrito previamente (Meyer, T., et. al. Int. J. Câncer 43, 851-856 (1989)). As células KB-8511, como KB-30, são derivadas da linha de células KB (ATCC) e são células de carcinoma epidermal humanas; as células KB-31 podem crescer em monocamada utilizando um meio de Dulbecco Eagle modificado (D-MEM) com 10% de soro fetal de bovino (M.A. Bioproducts), L-glutamina (Flow), penicilina (50 unidades/mL) e esteptomicina (50 mg/mL (Flow); estas podem em seguida crescer com o dobro do tempo de 22h, e a sua eficiência de plaqueamento relativa é de aproximadamente 60%. As células KB-8511 são uma linha de células derivadas da linha de células KB-31 através da utilização de ciclos de tratamento com colchicina; mostra 22 ΡΕ1089998 cerca de 40 vezes de resistência relativamente á resistência contra colchicina quando comparadas com células KB-31/ podem crescer nas mesmas condições das KB-31."

Solubilidade: A solubilidade em água é determinada como se segue; por exemplo: os compostos de fórmula I, ou os seus sais, são agitados com água à temperatura ambiente até não se dissolver mais composto (cerca de 1 h). As solubilidades encontradas são preferencialmente entre 0,01 e 1% em peso.

Dentro dos grupos dos compostos preferidos de fórmula I anteriormente mencionados, as definições dos substituintes a partir das definições gerais mencionadas anteriormente podem ser utilizadas razoavelmente, por exemplo, para substituir definições gerais com mais definições especificas ou especialmente com definições caracterizadas como sendo preferidas. A invenção também se relaciona preferencialmente com um composto de fórmula I onde R2 está ausente ou é oxigénio; "a" pode ser ou uma ligação simples ou uma ligação dupla; "b" pode ser ou ausente ou ser uma ligação simples; e "c" pode ser ou estar ausente ou ser uma ligação simples, com a condição de se R2 é oxigénio então "b" e "c" são ambos uma ligação simples e "a" é uma ligação simples; se R2 está ausente então "b" e "c" estão ausentes e "a" é uma ligação dupla; e se "a" é uma ligação dupla, então R2, "b" e "c" estão ausentes ΡΕ1089998 23

Rs é um radical seleccionado de um grupo consistindo de alquilo inferior, especialmente metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo; -CH=CH2; -C=CH; -CH2F; -CH2C1; CH2-OH; -CH2-0- (Ci-Cô-alquilo) , especialmente -CH2-0-CH3; e -CH2-S-(Ci-C6_alquilo); especialmente -CH2-S-CH3; R4 e R5 são independentemente seleccionados de hidrogénio, metilo ou um grupo protector, preferencialmente hidrogénio, e

Ri é um radical seleccionado das estruturas seguintes

ou um seu sal onde um ou mais grupos que formam sais estão presentes. A invenção mais especificamente também se relaciona com um composto de fórmula Id

24 ΡΕ1089998 onde A é etilo, fluorometilo, metoxilo, metiltio ou etenilo (-CH=CH2) e D é hidrogénio, fluoro, hidroxilo ou metilo, especialmente hidrogénio. A invenção mais especificamente também se relaciona com um composto de fórmula Ie

onde A é etilo, fluorometilo, metoxilo, metiltio ou etenilo (-CH=CH2) e D é hidrogénio, fluoro, hidroxilo ou metilo. A invenção mais especificamente relaciona-se com os compostos de fórmula I dado nos exemplos, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis onde um ou mais grupos que formam sais estão presentes.

Mais preferencialmente, a invenção relaciona-se com um composto seleccionado de um grupo consistindo de composto 18b (ver Exemplo 2), composto 19b (ver Exemplo 2), ou um seu sal f armaceuticamente aceitável se um ou mais grupos que formam sais estiverem presentes.

Os compostos da invenção podem ser sintetizados 25 ΡΕ1089998 utilizando métodos em analogia com métodos conhecidos na técnica, preferencialmente por um método caracterizado por: a) reacção de um iodeto de fórmula II,

m onde R2, R3, R4, R5, a, b e c e a ligação ondulada tem os significados dados para a formula I, com um composto de estanho de fórmula III,

Ri-Sn(R)3 (III) onde Ri tem o significado dado para a formula I e R é alquilo inferior, especialmente metilo ou n-butilo, ou b) reacção de um composto de estanho de fór-

mula IV

onde R2, R3, R4, R5, a, b e c e a ligação ondulada têm os 26 ΡΕ1089998

significados dados para a formula I, com um iodeto de fórmula V

Ri-I (V) onde Ri tem o significado dado para a formula I; e, se desejável, um produto resultante de fórmula I é convertido num composto diferente de fórmula I, um composto livre de fórmula I é convertido num sal do composto de fórmula I, e/ou um sal resultante de um composto de fórmula I é convertido num composto de fórmula I livre ou num sal diferente de um composto de fórmula I, e/ou uma mistura estereoquimica de compostos de fórmula I é separado nos isómeros correspondentes.

Descrição detalhada das condições dos processos preferidos

Em todos os materiais de partida, sempre que requerido, grupos funcionais que não devem participar na reacção estão protegidos por grupos protectores, especialmente grupos protectores padrão. Os grupos protectores, a sua introdução e clivagem são conhecidas na técnica, por exemplo, eles estão descritos em referências padrão acima mencionadas.

Reacção a) : A reacção (um acoplamento de Stille (melhorado preferencialmente)) tem preferencialmente lugar em condições padrão; mais preferencialmente, a reacção tem lugar (i) num solvente apropriado, e.g. tolueno, a 27 ΡΕ1089998 temperaturas elevadas, especialmente cerca de 90 até cerca de 100°C, preferencialmente com um excesso de um composto de estanho de fórmula III, preferencialmente em 1,1 até 3-, e.g. 1,5- até 2- vezes de excesso molar; e uma quantidade catalítica, preferencialmente de cerca de 1 até 30%, preferencialmente 5 até 10%, de Pd(PPh3)4; ou ii) num solvente apropriado, e.g. dimetilformamida (DMF), a temperaturas desde 10 até 40°C, especialmente a 25°C, preferencialmente com um excesso de um composto de estanho de fórmula III, preferencialmente num excesso molar de 1,1 até 3-, e.g. o excesso molar de 1,5- até 2,3; na presença de uma quantidade catalítica, preferencialmente de 10 até 50 %, especialmente 20 até 30%, de Pd (MeCN) 2CI2. As condições alternativas para este acoplamento também compreende a utilização dos seguintes reagentes e/ou condições: (iii) 2-tiofenocarboxilato de cobre, W-metil-2-pirrolidina. (iv) PdCl2(MeCN)2 (cat.), DMF, 50-150°C (com ou sem adição de uma base terceária). (v) Pd (PPh3) 4/CuI (cat), DMF, 50-150°C (com ou sem adição de uma base terceária).

Reacção b) : a reacção (um acoplamento de Stille melhorado) preferencialmente tem lugar em condições padrão; mais preferencialmente, a reacção tem lugar num solvente 28 ΡΕ1089998 apropriado, especialmente DMF, a temperaturas desde 50 até 100°C, preferencialmente desde 85 até 85°C, preferencialmente com um excesso de iodeto de fórmula V, na presença de uma quantidade catalítica de AsPh3, preferencialmente cerca de 0,4 equivalentes, Cul, preferencialmente cerca de0,l equivalentes, e PdCl2 (MeCN) 2, preferencialmente cerca de 0,2 equivalentes.

Especialmente preferidas são as condições reaccionais mencionadas nos exemplos.

Conversão de compostos/sais

Compostos de fórmula I podem ser convertidos em diferentes compostos de fórmula I por métodos padrão ou métodos novos.

Por exemplo, um composto de fórmula I onde R2 está ausente, b e c estão ausentes e a é uma ligação dupla, e outras unidades são descritas para compostos de fórmula I, podem ser convertidos no correspondente epóxido onde R2 é O e b e c estão presentes enquanto a é uma ligação simples. Preferencialmente, a epoxidação tem lugar na presença de (+)-D-tartarato de dietilo ((+)-DET) (preferencialmente cerca de 0,5 equivalentes), Ti(i-PrO)4 (preferencialmente cerca de 0,5 equivalentes), hidroxiperóxido de terc-butilo (preferencialmente cerca de 2,2 equivalentes) e peneiros moleculares, especialmente peneiros moleculares de 4 Â, num solvente apropriado, e.g. diclorometano e opcio- 29 ΡΕ1089998 nalmente um alcano, tal como decano, a baixa temperatura, preferencialmente -78 até 0°C, especialmente cerca de - 4 0 ° C;

Ou na presença de peróxido de hidrogénio (preferencialmente cerca de 30 equivalentes) , acetonitrilo (preferencialmente cerca de 60 equivalentes) , uma base, especialmente KHCO3 (preferencialmente cerca de 10 equivalentes) num solvente apropriado, e.g. um álcool, preferencialmente metanol, a temperaturas preferidas entre 10 e 40°C, e.g. a cerca de 25°C.

Um composto de fórmula I onde R3 é hidroximetilo pode ser convertido num composto de fórmula I onde R3 é fluorometilo, e.g. tratamento com DAST (preferencialmente 1,05 até 1,4 equivalentes) num solvente apropriado, e.g. diclorometano, a baixa temperatura, preferencialmente de -95°C até 0°C, especialmente a cerca de -78°C. DAST é de dimetilamino-sulfurotrifluoreto

Um composto de fórmula I onde R3 é iodometilo pode ser convertido num composto de fórmula I onde R3 é metilo, e.g. por tratamento com cianoboro-hidreto (preferencialmente cerca de 10 equivalentes) em HMPA (triamida-hexametilfosfórico) a temperaturas elevadas, e.g. a 40 até 45°C.

Outras conversões podem ser efectuadas de acordo com procedimentos conhecidos, e.g. aqueles dados no Pedido 30 ΡΕ1089998 de Patente PCT WO 98/25929, o qual é aqui incorporado por referência.

Os sais de um composto de fórmula I com um grupo que forma um sal pode ser preparado numa maneira conhecida per se. Os sais de adição ácida de compostos de fórmula I podem assim ser obtidos por tratamento com um ácido ou com um reagente adequado de troca de anião.

Os sais podem ser convertidos em compostos livres, e.g. por tratamento com agentes básicos adequados, por exemplo com carbonatos de metais alcalinos, hidro-genocarbonatos de metais alcalinos, ou hidróxidos de metais alcalinos, tipicamente carbonato de potássio ou hidróxido de sódio.

Os compostos livres resultantes podem então, se desejável, ser convertidos em diferentes sais como descrito para a formação de sais a partir de compostos livres.

As misturas esterioisoméricas, e.g. misturas de diastereoisómeros, podem ser separadas nos seus isómeros correspondentes de um modo conhecido per se através de métodos de separação adequados. As misturas diastereoisoméricas por exemplo podem ser separadas nos seus diastereoisomeros individuais por cristalização fraccionada, cromatografia, distribuição de solventes, e procedimentos semelhantes. Esta separação pode ter lugar ou ao nivel do material de partida ou mesmo num composto de 31 ΡΕ1089998 fórmula I. Os enantiómeros podem também ser separados através da formação de sais diastereoisoméricos, por exemplo por formação de sais com um enantiómero ácido quiral - puro, ou através de cromatografia, por exemplo por HPLC, utilizando substratos com ligandos quirais.

Materiais de partida

Os materiais de partida e intermediários são conhecidos na técnica, comercialmente disponível, e/ou preparado de acordo com métodos conhecidos na técnica ou em seus análogos.

Os compostos de fórmula II e fórmula III podem, por exemplo, ser sintetizados como descrito no pedido de patente PCT WO 98/25929, que é aqui incorporada por referência, ou como descrito ou em analogia com os métodos nos exemplos.

Os compostos de formula IV são acessíveis por reacção dos respectivos compostos de formula II, por exemplo por reacção de um composto de fórmula II com (Re) Sn2, onde R é alquilo inferior, especialmente metilo ou n-butilo, na presença de uma base de azoto, e.g. base Hunig, e na presença de quantidades catalíticas (preferencialmente cerca de 0,1 equivalentes) de Pd(PPh3)4 num solvente apropriado, e.g. tolueno, a temperaturas elevadas, e.g. 30 até 90°C, especialmente 80 até 85°C. 32 ΡΕ1089998

Os iodetos de fórmula V são conhecidos e podem ser obtidos de acordo com procedimentos da literatura, ou podem estar disponiveis comercialmente. Por exemplo, 2-iodo-6-metil-piridina pode ser obtido de acordo com Klei, E.; Teuben, J. H., J. Organomet. Chem. 1981, 214, 53-64/ 2-iodo-5-metilpiridina de acordo com Talik, T.; Talik, Z. Rocz. Chem. 1968, 42, 2061-76, Yamamoto, Y.; Yanagi, A. Heterocycles 1981, 16, 1161-4 ou Katritzky, A. R.; eweiss, N. F.; Nie, P.-L. JCS, perkin Trans I 1979, 433-5. Os compostos hidroxi-substituidos de fórmula V correspondentes estão disponiveis por exemplo por oxidação do metilo dos grupos iodeto mencionados acima com Se02 e redução subsequente, e.g. com NaBH4 ou DIBALH) de um aldeído ou por oxidação do grupo metilo para formar o ácido (por exemplo KMn04) e redução subsequente do éster e.g. com DIBAL.

Preferencialmente, materiais de partida novos ou conhecidos e intermediários podem ser preparados de acordo com ou por analogia com os métodos descritos nos exemplos, onde as quantidades, temperatura e as respectivas reacções semelhantes podem ser modificadas, e.g. por variação num intervalo de _+9 9 %, preferencialmente j^25%, e podem ser utilizados outros solventes e reagentes apropriados. A invenção também se relaciona com todos os intermediários, especialmente aqueles mencionados nos Exemplos. ΡΕ1089998 33

Preparações Farmacêuticas A presente invenção também se relaciona com a utilização de um composto de fórmula I para manufactura de uma formulação farmacêutica para utilizar contra doenças proliferativas como definido acima; ou com uma formulação farmacêutica para o tratamento da referida doença prolife-rativa compreendendo um composto da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Os compostos de fórmula I são daqui em diante chamados de principio activo. A invenção relaciona-se também com uma composição farmacêutica que é adequada para administração num animal de sangue quente, especialmente em humanos, para o tratamento de uma doença proliferativa como definido anterior-mente, compreendendo uma quantidade de um principio activo, que é eficaz para o tratamento da referida doença proliferativa, juntamente com pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas de acordo com a invenção são aquelas para administração parentérica, tal como nasal, rectal ou oral, preferencialmente parentérica, tal como administração intramuscular ou intravenosa, administração a um animal de sangue quente (humano ou animal) que compreende uma dose eficaz de um principio activo farmacologicamente, sozinho ou juntamente com uma quantidade significante de um veiculo farmaceuticamente aceitável. A dose do principio activo depende das espécies de animal de sangue quente, do peso corporal, da idade e do 34 ΡΕ1089998 estado de saúde do indivíduo, dados fármaco-cinéticos do indivíduo, da doença a ser tratada e do modo de administração; preferencialmente, a dose é uma ou as doses preferidas como definido abaixo, sendo ajustadas apropriadamente quando se pretende tratamento pediátrico

As composições farmacêuticas compreendem cerca de 0, 00002 até cerca de 95%, especialmente (e.g. no caso de diluições de infusão que estão prontas a utilizar) de 0,0000 até 0,02%, ou (por exemplo no caso de infusões concentradas) desde cerca de 0,1% até cerca de 95%, preferencialmente desde cerca de 20% até cerca de 90%, princípio activo (peso por peso, em cada caso). As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser, por exemplo, na forma de dose única, tal como em formas de ampolas, frascos, supositórios, drageias, comprimidos ou cápsulas.

As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas numa maneira conhecida per se, por exemplo por meio de processos de dissolução convencional, liofi-lização, mistura, granulação ou processos de confecção.

As soluções do princípio activo, e também suspensões, e especialmente soluções aquosas isotónicas ou suspensões, são preferencialmente utilizadas, sendo se possível, por exemplo no caso de composições liofilizadas que compreendem o princípio activo sozinho ou juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo manitol, para as soluções ou suspensões a serem preparadas antes de ser utilizadas. As composições farmacêuticas podem 35 ΡΕ1089998 ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo preservativos, estabilizantes, molhantes e/ou agentes emulsionantes, solubilizantes, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas de uma maneira per se, por exemplo através de processos de dissolução convencional ou liofilização. As referidas soluções ou suspensões podem compreender substâncias para aumentar a viscosidade, tais como carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextran, polivinilpirrolidinba ou gelatina.

As suspensões em óleo compreendem como componente óleo os óleos vegetais, sintéticos ou semi-sintéticos habituais para fins de injecção. Podem ser mencionados como tal especialmente esteres de ácidos gordos líquidos que contem como componente acido um acido gordo de cadeia longa com desde 8 até 22, especialmente desde 12 até 22, átomos de carbono, por exemplo ácido laurico, ácido trideciclico, ácido miristico, ácido pentadeciclico, ácido palmítico, ácido marggarico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beénico ou os correspondentes ácidos insaturados, por exemplo ácido oleico, ácido elaidico, ácido erucico, ácido brasídico ou ácido linoleico, se desejável com adição de antioxidantes, por exemplo vitamina E, betacaroteno ou 3,5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno. 0 componente álcool dos esteres daqueles ácidos gordos tem um máximo de 6 átomos de carbono e é um mono- ou pli-hidroxilo, por exemplo um mono-, di- ou tri-hidroxilo, álcool, por exemplo metanol, etanol, propanol, butanol ou pentanol ou os seus isómeros, mas especialmente glicol e glicerol. 36 ΡΕ1089998 A injecção ou composições de infusão compreendem um principio activo e um solvente orgânico farmaceu-ticamente aceitável.

Preferida é uma formulação de infusão compreendendo um componente activo e um solvente orgânico farma-ceuticamente aceitável 0 solvente farmaceuticamente aceitável utilizado na formulação de acordo com a invenção pode ser escolhido de qualquer solvente orgânico conhecido na técnica. Preferencialmente o solvente é seleccionado de um álcool, e.g. etanol absoluto ou etanol/água, mais preferencialmente 70% etanol, polietilenoglicol 300, polietilenoglicol 400, polipropilenoglicol ou N-metilpirrolidina, mais preferencialmente polipropilenoglicol ou 70% etanol ou polietilenoglicol 300. O componente activo pode preferencialmente estar presente na formulação numa concentração de cerca de 0,01 até cerca de 100 mg/mL, mais preferencialmente cerca de 0,1 até cerca de 100 mg/ml, ainda mais preferencialmente cerca de 1 até cerca de 10 mg/mL (especialmente em concentrados de infusão) O componente activo pode ser utilizado como substância pura ou como uma mistura com outro componente activo. Quando utilizado como substância pura é preferen- 37 ΡΕ1089998 cialmente empregar uma concentração de componente activo de 0,01 até 100, mais preferencialmente 0,05 até 50, mais preferencialmente ainda 1 até 10 mg/mL (este numero é referência especialmente para um concentrado de infusão que, antes do tratamento, é diluído de modo adequado, ver abaixo).

Tais formulações são convenientemente guardadas em frascos ou ampolas. Tipicamente os frascos ou ampolas são feitos de vidro, e.g. vidro borosilicato ou cal sodada. Os frascos ou ampolas podem ter qualquer volume convencional na técnica, preferencialmente eles tem um tamanho suficiente para acomodar 0,5 até 5 mL de formulação. A formulação é estável por períodos de armazenamento de 12 até 24 meses a temperaturas de pelo menos 2 a 8°C.

As formulações podem ser diluídas num meio aquoso adequado para administração intravenosa antes da formulação do componente activo ser administrada ao paciente. A solução de infusão preferencialmente deve ter a mesma ou essencialmente a mesma pressão osmótica do fluido do corpo. Deste modo, o meio aquoso contém preferencialmente um agente isotónico que tem o efeito de manter a pressão osmótica da solução de infusão na mesma ou essencialmente a mesma do fluido do corpo. O agente isotónico pode ser seleccionado que qualquer um dos conhecidos na técnica, e.g. manitol, dex-trose, glucose e cloreto de sódio. Preferencialmente o 38 ΡΕ1089998 agente isotónico é glucose ou cloreto de sódio. Os agentes isotónicos podem ser utilizados em quantidades que transmitem a uma solução de infusão a mesma ou essencialmente a mesma pressão osmótica como fluido do corpo. As quantidades precisas necessárias podem ser determinadas por experimentação de rotina e dependerá da composição da solução de infusão e da natureza do agente isotónico. A selecção de um agente isotónico particular é efectuada tendo em conta as propriedades do agente activo. A concentração do agente isotónico no meio aquoso depende da natureza do agente isotónico particular. Quando a glucose é utilizada é preferencialmente utilizado numa concentração de desde 1 até 5% m/v, mais particularmente 5% m/v. Quando o agente isotónico é cloreto de sódio é preferencialmente empregue em quantidades até 1% m/v, em particular 0,9% m/v. A formulação de infusão pode ser diluída com meio aquoso. A quantidade de meio aquoso empregue como diluente é escolhida de acordo com a concentração desejada do componente activo na solução de infusão. Preferencialmente a solução de infusão é efectuada por mistura num frasco ou ampola de concentrado de infusão anteriormente mencionado com um meio aquoso, perfazendo o volume entre 20 mL até 200 mL, preferencialmente entre cerca de 50 até cerca de 100 mL, com meio aquoso.

As soluções de infusão podem conter outros 39 ΡΕ1089998 excipientes vulgarmente empregues em formulações a serem administradas intravenosamente. Os excipientes incluem antioxidantes. As soluções de infusão podem ser preparadas por mistura de uma ampola ou frasco da formulação com um meio aquoso, e.g. uma solução a 5% m/v de glucose em WFI ou especialmente 0,9% de solução de cloreto de sódio num contentor adequado, e.g. um saco de infusão ou garrafa. A solução de infusão, uma vez formada, é preferencialmente utilizada imediatamente ou dentro de um curto período de tempo de se formada, e.g. dentro de 6 horas. Os contentores para guardar as soluções de infusão devem ser escolhidos de qualquer contentor convencional que é não reactivo com a solução de infusão. Os contentores de vidro feitos daqueles vidros anteriormente mencionados são adequados apesar de serem preferível a utilização de recipientes de plástico, e.g. sacos plásticos de infusão. A invenção também se relaciona com um método de tratamento de um animal de sangue quente, especialmente humanos, que está com necessidade de tal tratamento, especialmente de tratamento de uma doença proliferativa, compreendendo a administração de um composto de fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ao referido animal de sangue quente, especialmente humano, numa quantidade que é suficiente para o referido tratamento, especialmente eficaz contra doenças proliferativas.

As formas de dosagem podem ser convenientemente administradas intravenosamente numa dosagem de desde 0,01 mg até 100g/m2 de componente activo, preferencialmente 40 ΡΕ1089998 desde 0,1 até 20 mg/m2 de componente activo. A dosagem exacta requerida e a duração da administração dependem da gravidade do estado do doente e da taxa de administração. A dose pode ser administrada diariamente ou preferencialmente com intervalos de alguns dias ou semanas, por exemplo todas as semanas ou de três em três semanas. Como a dose pode ser libertada intravenosamente, a dose recebida e a concentração no sangue podem ser determinadas com exactidão com base nos conhecimento de técnicas in vivo e in vitro.

As composições farmacêuticas para administração oral podem ser obtidas por combinação do componente activo com veículos sólidos, se desejável a mistura resultante, e o processamento da mistura, após a adição de excipientes apropriados, em comprimidos, drageias cores ou cápsulas. É possível para estes serem incorporados em veículos plásticos que permitem que os componentes activos se difundam ou sejam libertados em quantidades medidas.

Os compostos da invenção podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros as substâncias farmaceuticamente activas, e.g. com outros quimio-tera-pêuticos, tais como citostáticos clássicos. No caso de combinações com outro quimioterapeutico, uma combinação fixa de dois ou mais componentes ou dois ou mais formulações independentes (e.g. num conjunto de partes) são preparados como descrito acima, ou os outros quimiotera-pêuticos são utilizados em formulações padrão que são comercializadas e conhecidas pelos especialistas na 41 ΡΕ1089998 técnica, e o composto da presente invenção e qualquer outro quimioterapeutico são administrados em intervalos que permitem para um vulgar, adicional ou preferencial efeito sinergético para o tratamento de tumores.

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar a presente invenção sem se pretender limitar o âmbito da invenção.

Materiais de partida:

Exemplo 1. Síntese total de Epotilona E e análogos relacionados de cadeia lateral via estratégia baseada no acoplamento de Stille A primeira síntese total de epotilona E (3) é acompanhada de uma estratégia na qual a chave do passo é acoplamento de Stille (Stille et. al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986, 25, 508-524; Farina et. Al. J. Org. React. 1997, 50, 1-65) entre iodeto de vinilo 7 e a unidade tiazole (8h, Esquema 2a) . O fragmento do núcleo da macrolactona 7, que é preparado via metátese do fecho do anel da olefina (RCM), e subsequentemente utilizado para proporcionar acesso conveniente e flexível a uma variedade de análogos modificados na cadeia lateral (9) para avaliação biológica (Esquema 2b). A reacção de RCM utilizada para aceder a 7 também proporciona trans-macrolactona (11, Esquema 2b) que serve como modelo alternativo pata o acoplamento de Stille e proporciona uma lista adicional de análogos 10. 42 ΡΕ1089998 ---Esquema 2: a) Análise retrossintética e estratégia para a síntese total de epotilona E.

b)

Análogos de cadeia lateral de epotilona C (9) e seus Δ12'13 trans-isómero(10)

1$

11 43 ΡΕ1089998 A síntese química dos iodetos de vinilo 7 necessários e 11 é delineada no Pedido de Patente PCT WO 98/25929.

Os parceiros de acoplamento a estanano utilizados na reacção de Stille são apresentados no Esquema 3. ---Esquema 3:

-X m- X « Sfô», 8 * Me

Acoplamento de Stille: Procedimento A: 2,0 equiv. de 8, 5-10% em moles de Pd(PPh3)4, tolueno, 90-100°C, 15-40 min, 39-88%; procedimento B: 2,0 - 2,2 equiv. de 8, 20-30% em moles de Pd(MeCN) 2C12, DMF, 25°C, 12-13h, 49-94%.

Os parceiros do acoplamento 8b acessíveis a partir de 2,4-dibromotiazole (20) via monobrometos (21) como delineado no Esquema 4 e 5. 44 ΡΕ1089998 ---Esquema 4: b: 21 te

B<r m

g: rS“8%SnCi

Preparação de A) estananos 8b. Reagentes e condições: (b) 3,0 equiv. de NaSMe, EtOH, 25°C, 2h, 92%; (d) 13 equiv. de NaOH, EtOH, 25°C, 30 h, 91%; (e) 13 equiv. de NaOH, MeOH, 25°C, 16h, 82%; (f) 5-10 equiv. de

Me3SnSnMe3, 5-10% em moles de Pd(PPh3)4 tolueno, 80-100°C, 0,5-3h, 81-100%; (g) 1,1 equiv. de n-BuLi, 1,2 equiv. de nBusSnCl, -78 a 25°C, 30 min., 98%; O sulfureto 21b é obtido com rendimento de 92% por substituição do substituinte 2-bromo de 20 com a unidade tiometilo utilizando tiometóxido de sódio (EtOH, 25°C). O brometo (21b) é então transformado no tri-etilestanano desejado com hexametildiestanho em condições catalisadas por paládio [Pd(PPh3)4, tolueno, 80-100°C]

Com os componentes necessários na mão, são investigados os acoplamentos criticos de Stille. Dois conjuntos de condições alternativas provaram ser adequadas (Esquema 3) . O procedimento A envolve o aquecimento de uma solução do desejado iodeto de vinilo (7 ou 11) em tolueno com o estanano 8 apropriado na presença de quantidades catalíticas de Pd(PPh3)4, a 80-100°C durante 15 e 40 minutos. O protocolo é utilizado para acoplar o estanano 8b. 45 ΡΕ1089998 A síntese total é completada pela epoxidação com ácido metilperoxicarboximídico gerado in situ (H2O2; KHC03, MeCN, MeOH, 25°C; Chaudhuri et. AI. J. J. Org. Chem. 1982, 47, 5196-5198) dando a epotilona E (3) (66% com base em 50% de conversão), que exibe características físicas idênticas (ΧΗ RMN, [a]D) aos publicados na técnica. A abordagem do acoplamento de Stille é então extendida para proporcionar um acesso fácil a uma variedade de análogos de epotilona B de cadeia lateral modificada (2), tanto em C-26 como na cadeia lateral. A análise retrossintética dos análogos da epotilona possuindo estas duplas modificações é apresentada no Esquema 6b e requer a preparação crucial de um fragmento do núcleo de iodeto de vinilo 24. Pensa-se que a estratégia similar de macro-lactonização para essa utilização na nossa síntese de epotilona B e de uma variedade de análogos de epotilona é a mais adequada para esta tarefa. ---Esquema 6b:

m 4« 46 ΡΕ1089998

Ilustração de uma análise retrossintética de análogos de epotilona possuindo modificações em C26 e unidades de cadeia lateral (Esquema análogos A sintese começa a partir do iodeto de vinilo 13 7) utilizado na preparação de epotilona E e relacionados (Esquema 3). ---Esquema 7:

p— 3 !; R = O H '* L—»*, 32; R = ! 23: R = H 30: R - T r f: TTCi

L MMPP

jj. DíBAL 34: R = ÇR 35: R ~ CHÔ 47 ΡΕ1089998 Síntese estereosselectiva do aldeído 35. Reagentes e condições: (a) 1,7 equiv. de TBSC1, 2,8 equiv. de imidazole, DMF, 0 a 25°C, 7 h, 84%; (b) i. 1,0% em moles de 0s04, 1,1 equiv. NMO, THF: t-Bu0H:H20 (5:%:1), 0 a 25°C, 13 h, 89%; ii. 6,0 equiv. de NaI04, MeOH: H20 (2:1), 0°C, 30 min, 92%; (c) 2,4 equiv. de 27, benzeno, refluxo, 1,2 h, 98%; (d) 3,0 equiv. de DIBAL, THF, -78°C, 2,5 h, 100%. (e) 1,4 equiv. de TrCl, 1,7 equiv. de 4-DMAP, DMF, 80°C, 21h,

95%; (f) 1,4 equiv. de 9-BBN, THF, 0°C, 9h; então NaOH aquoso 3N e 30% H202, 0°C, lh, 95%; (g) 2,6 equiv. de I2, 5,0 equiv. imidazole, 2,5 equiv. de Ph3P, Et20: MeCN (3:1), 0°C, 45 min, 97%; (h) 1,3 equiv. de SMAP hidrazona do propionaldeído, 1,4 equivalente de LDA, THF, 0°C, 16 h; então -100 °C e adiciona-se 1,0 equiv. de 32 em THF, -100 até -20°C , 71%, (i) 2,5 equiv. de MMPP, MeOH: tampão fosfato pH 7 (1:1), 0°C, 3,5 h, 89%; (j) 3,0 equiv. de DIBAL, tolueno, -78°C, 1 h, 88%. 9-BBN = 9-borabiciclo- [3.3.1]nonano; DIBAL = hidreto de diisobutilalumínio; 4-DMAP = 4-dimetilaminoipiridina; LDA = diisopropilamideto de lítio; NMO = N- óxido de 4-metilmorfolina; SAMO = (S) — ( —) — l-amino-2-(metoximetil)pirrolidina; MMPP = ácido monopero-xidiftálico, sal de magnésio. A protecção do grupo hidroxilo alílico (TBSC1, imidazole, DMF, 0 a 25°C) dá o éter silílico 25 (84%) que é transformado no aldeído 26 por uma sequência de clivagem de glicol por di-hidroxilação em dois passos (Os04, NMO, THF/t-BuOH/H20, 0 a 25°C; então NaI04, Me0H/H20, 0°C, 82% para os dois passos) . Numa reacção de Wittig estereo- 48 ΡΕ1089998 selectiva com o intermediário 27 estabilizado (benzeno, refluxo; Marshall et. al. J. Org. Chem., 1986, 51, 1735-1741; Bestmann et. al. Angew. Chem. Imt. Ed. Engl. 1965, 4, 645-660) dá o éster 28 como um isómero geométrico simples com rendimento de 98%. A redução do último composto (DIBAL, THF, -78°C) dá o álcool 29, que é protegido como derivado trifenilmetilo (tritilo) 30 (TrCl, 4-DMAP, DMF, 70°C, 95%). A elaboração da olefina terminal é então conseguida por hidroboração-oxidação selectiva para dar o álcool 31 (9-BBN, THF, 0°C; então NaOH, H20, 0o C) que é transformado adicionalmente num di-iodeto 32 (I2, imidazole, PIL3P, 0°C) com um rendimento total de 92%. A introdução do estereocentro Cs é então conseguida utili- zando um protocolo de alquilação de Ender (SAMP hidrazona do propionaldeido, LDA, THF, 0°C; então -100°C e adiciona-se 32 em THF; Enders et. al. Asymmetric Synthesis 1984; Morrison, J. D.; Ed.; Academic Press, Orlando, Vol 3, p. 275-339; nós agradecemos ao Prof. Enders pelo seu generoso contributo de SAMP) resultando na formação da hidrazona SAMP 33 com rendimento de 71%) . A conversão em nitrilo 34 (MMPP, MeOH/tampão fosfato pH 7, 0°C, 89%) e ensuing redução (DIBAL, tolueno, -78°C) dá o aldeído desejado 35 com rendimento de 88%. A transformação do aldeído 35 no núcleo macro-cíclico da epotilona desejada 24 é sumariada no Esquema 8. ΡΕ1089998 49 ---Esquema 8

e, NsCÍO j 43

41; X * H

n. HFv?ií£ — 44: R * Tf. Ri s T8S ™». 24: R » Rs * H IS v íí»sjfSlSs.t-S(Ãis4çSô lie ÍSWIWÇaSjfcã Síntese estereo-selectiva do iodeto de vinilo 24. Reagentes e condições: (a) 1,45 equiv. de LDA, THF, -78°C, então 1,4 equiv. de 36 em THF, -78°C, 1,5 h então; -40°C, 0,5h; então 1,0 equiv. de 35 em THF a -78°C (66% rendimento combinado, ca. razão 1,5:1 de 37:38); (b) 3,2 equiv. de TBSOTf, 4,3 equiv. de 2, 6-lutidina, CH2CI2, -20°C a 0°C, 2,5 50 ΡΕ1089998 h, 90%); (c) HF*pir., THF, 0°C, 3h, 84%; (d) 2,0 equiv. de (C0C1)2, 4,0 equiv. de DMSO, 6,0 de Et3N, CH2C12, -78 a 0°C, 1,5 h, 98%; € 5,0 equiv. de NaC102, 75 equiv. de 2-mwtil-2- buteno, 2,5 equiv. de NaH2P04, t-BuOH: H20 (4,5:1), 25 °C 40 min, 100%; (f) 6,0 equiv. de TBAF, THF, 0 a 25°C, 19 h 95%; (g) 6,0 equiv. de Et3N 2,4 equiv. de cloreto de 2,4,6-triclorobenzoilo, THF, 0°C, 1,5 h; então adiciona-se a uma solução de 2,2 equiv. de 4-DMAO em tolueno (0,005M baseado em 43), 75°C, 2,5 h, 84%; (h) HF*pir. 25% v/v em THF 0 a 25°C, 15 h, 86%. TBAF = fluoreto de tetra n-butilamónio.--- A reacção aldólica de cetona 36, previamente utilizada na nossa síntese de epotilona B e análogos (LDA, THF, -78°C a -40°C) e aldeído 35, dá os álcoois 37 e 38 com 66% de rendimento total, com a selectividade modesta para o desejado diastereoisómero SR,1S (37). A separação e sililação (TBSOTf, 2,6-lutidina, CH2C12, -20 a 0°C) do produto aldol 37 correcto proporciona o tris-éter silílico 39 com 90% de rendimento. A remoção selectiva do grupo protector éter silílico primário (HF*pir. em piridina/THF, 0°C) dá o álcool 40 (84%), que é oxidado a ácido 42 via aldeído 41 por um procedimento de dois passos (Swern; então NaC102, 2-metil-2-buteno, NaH2P04, t-Bu0H/H20, 25°C, 98% para os dois passos). A remoção do grupo protector silícico em C15 (TBAF, THF, 0 a 25°C) proporciona o hidroxi-ácido 43 (95%) e prepara a base para o processo de macrolac-tonização. Este passo chave é conseguido sob condições de Yamaguchi (cloreto de 2,4, 6-triclorobenzoílo, Et3N, THF; em seguida adicionado a uma solução de 4-DMAP em tolueno, 0, 005M, 75 °C, Inanaga et. al. Buli. Chem. Soc. Jpn. 1979, 51 ΡΕ1089998 52, 1989; Mulzer et. al. Synthesis 1992, 215-228, Nicolaou et. al. Chem Eur. J. 1996, 2, 847-868) para dar o núcleo de epotilona protegida 44 com 88% de rendimento. A desprotecção global (HF*pir., THF, 0 a 25°C, 86%) completa a sintese do intermediário chave iodeto de vinilo 24.

Com o intermediário 24 na mão, o protocolo de Stille é então empregue para ligar a desejada unidade heterocíclica. A quimica descrita neste exemplo assenta numa estratégia de acoplamento de Stille para construir uma série de análogos de epotilona com diversidade na cadeia lateral ou em ambas as cadeias laterais e C-26 a partir de um intermediário macrociclico comum.

Exemplo 2: Formulação de compostos de acordo com a invenção:

52 ΡΕ1089998

Exemplo 3; resultados biológicos

De acordo com os métodos descritos acima (inibição da despolimerização da tubulina por um composto de fórmula I é medida utilizando microtubos de cérebro de porco, comparando com epotilona B 25μΜ; os ensaios em células são análogos aos descritos acima para as células KB-31.

Exemplo 4: Mais compostos de fórmula I

Em métodos análogos dos métodos descritos acima e abaixo, os compostos que caiem dentro da fórmula I são preparados para ter a seguinte formula.

Exemplo 4 (i)

Exemplo 4 (ii)

53 ΡΕ1089998

Exemplo 4 (ix)

Protocolos de síntese.

Geral: todas as reacções são efectuadas sobre atmosfera de árgon com solventes secos destilados de fresco sob condições anidras, salvo indicação em contrário. O tetra-hidrofurano (THF) e éter dietílico (éter) são destilados com sódio-benzofenona, e o diclorometano (CH2CI2) , benzeno (phH), e tolueno a partir de hidreto de cálcio. Os solventes anidros são também obtidos passando através de colunas de alumina activadas disponíveis comercialmente. Os rendimentos referem-se a materiais homogéneos cromatogra-ficamente e espectroscopicamente (ΧΗ RMN), salvo indicação em contrário. Todas as soluções utilizadas no processamento da reacção são saturadas salvo indicação em contrário. Todos os reagentes são comprados com elevada qualidade comercial e utilizados sem purificação adicional salvo indicação adicional. Todas as reacções são monotorizadas por cromatografia em camada fina em placas de sílica gel de 0,25 mm d E. Merck (60F-254) utilizando luz ultravileta como agente de visualização e de solução de ácido molibdénico em etanol a 7% ou solução de p-anisaldeído e 54 ΡΕ1089998 aquecidas como agentes reveladores. A sílica gel E. Merck (60, tamanho de partícula 0,040-0,063 mm) é utilizada para crornatografia em coluna "flash". As separações por cromatografia de camada fina preparativa são efectuadas em placas de sílica gel E. Merck com 0,25, 0,50 ou 1 mm. Os espectros de RMN são efectuados num aparelho Bruker DRX-600, AMX-500, AMX-400 ou AC-250 e calibrados utilizando solvente não deuterado residual como referência interna. As abreviaturas seguintes são utilizadas para explicar as multiplicidades: s, singeleto; d, dupleto; t, tripleto, q., quarteto, m, multipleto; banda, vários sinais sobrepostos; b, largo, os espectros de IV foram efectuados num espectrómetro da Perkin-Elmer 1600 da série FT-IR. As rotações ópticas foram registadas num polarímetro Perkin-Elmer 241. Os espectros de massa de alta resolução (HRMS) são registados num espectrómetro de massa VG ZAB-ZSE em condições de bombardeamento de átomos rápidos (FAB). cis-Macrolactona diol 7 como ilustrado no Esquema

3. A uma solução de iodo 16 (305 mg, 0,491 mmol) em THF (8,2 mL, 0,06 M) a 25°C é adicionado HF*pir. (2,7 mL) e a solução resultante é agitada à mesma temperatura durante 27 h. A reacção é então desactivada através da adição cuidadosa de uma mistura de uma solução aquosa saturada de NaHCCq (100 mL) e EtOAc (100 mL), e a mistura de duas fases resultantes é agitada a 25°C durante 2 h. Os extractos são então separados e a fase orgânica é lavada com solução aquosa saturada de NaHC03 (100 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (100 mL) , e em seguida seca (MgS04) . A 55 ΡΕ1089998 purificação por cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 20 a 50% EtOAc em hexano), dá o diol 7 (208 mg, 84%).

Rf = 0,21 (silica gel, 25% EtOAc em hexano); [a]22D -53,1 (c I, 37, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3499 (br) , 2930, 1732, 1688, 1469, 1379, 1259, 1149, 1093, 1048, 1006, 732 cm'1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) δ 6,43 (s, 1H, (CH=C (CH3) ) , 5,44 (ddd, J = 10,5, 10,5, 4,5 Hz, 1H, CH=CHCH2) , 5,34 (dd, J= 9,5, 2,0 Hz, 1H, CHOCO), 5,32 (ddd, J= 10,5, 10,5, 5,5 Hz, 1H, CH=CHCH2), 4,07 (ddd, J= 11,0, 6,0, 3,0 Hz, 1H, (CH3)2CCH(OH) , 3,73 (ddd, J=2,5, 2,5, 2,5 Hz, 1H, CHO(CHCH3)), 3,10 (qd, J= 7,0, 2,5 Hz, 1H, CH3CH(C=0) ) , 2,84 (d, J= 2,5 Hz, 1H, CH (CH3) CHOHCH (CH3) ) , 2,66 (ddd, J = 15,0, 9,5, 9,5 Hz, 1H, =CHCH2CHO) , 2,51 (dd, J = 15,5, II, 0Hz, 1H, CH2COO) , 2,42 (dd, J = 15,5, 3,0 Hz, 1H, CH2COO) , 2,35 (d, J = 6,0 Hz, 1H, (CH3) 2CHOJí) , 2,21-2,12 (m, 2H) , 2,05-1, 97 (m, 1H) , 1,88 (s, 3H, ICH=CCH3) , 1,76- 1,70 (m, 1H) , 1,70-1, 62 (m, 1H) , 1,32 (s, 3H, C(CH3)2), 1,18 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CH (C=0) ) , 1,10 (s, 3H C(CH3)2), 1,35-1,05 (m, 3H) , 0,99 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CHCH2) ; HRMS (FAB), calculado para C22H35I05 (M+Cs + ) 639, 0584, encontrado 639,0557. trans-Macrolactona diol 11 como ilustrado no Esquema 3. Uma solução de iodo 17 (194 mg, 0,313 mmol) em THF (5,2 mL, 0,06 M) é ratada com HF.pir. (1,7 mL) de acordo com o procedimento descrito para a preparação do diol 7 para dar, após cromatograf ia em coluna "flash" (silica gel, 20 a 50% EtOAc em hexano), diol 11 (134 mg, 85%), Rf = 0,16 (silica gel, 25% EtOAc em hexano); [oí]22d - 56 ΡΕ1089998 20,0 (c 1,15, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3478, 2930, 1732, 1693 cm"1; 1H-RMN (50 0 MHz, CDC13) δ 6, 37 (d, J = 1,5 Hz, 1H, ICH=C (CH3) ) , 5,24 (ddd, J = 14,5, 7,0, 7,0 Hz, 1H, CH=CHCH2), 5,17 (dd, J= 6,5, 3,5 Hz , 1H, CHOCO) , 4, 41 (ddd, J= 8,0, 3,5 Hz, 1H, CH3CCH(OTBS) ) , 3,85 (bs, 1H, (CHOH (CHCH3) ) , 3,38 (bs, 1H, CHOH(CHCH3) ) , 3,18 (qd, J= 7,0, 6,5 Hz, 1H, CH3Cíí(C=0) ) , 2, 68-2,34 (m, 4H) , 2,44 (s, 3H, CH3Ar) , 2,19-2,11 (m, 1H) , 1, 96 (s, 3H, CH3C=CH) , 1, 99-1, 93 (m, 1H) , 1, 67-1,52 (m, 2H) , 1,48-1,42 (m, 1H) , 1,31-0,99 (m, 2H) , 1,22 (d, J= 7,0 Hz, 3H, CH3CH(C=0)), 1,44 (s, 3H, C (CH3) 2) , 1,09 (s, 3H, C(CH3)2), 1,02 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CHCH2), 0,84 (s, 9H, SiC (CH3) 3/CH3) 2) , 0,08

(s, 3H, SiC (CH3) 3 (CH3) 2) , -0,01 (s, 3H, SiC (CH3) (CH3) 2) ; HRMS (FAB) calculado para C22H351O5 (M+Cs+) 639, 0584, encontrado 639,0606. 2-tiometil-4-bromotiazole 21b como ilustrado no Esquema 4. O 2,4-dibromotiazole 20 (82 mg, 0,34 mmol, 1,0 equiv.) é dissolvido em etanol (2,3 mL, 0,15 M) e tratado com tio-metóxido de sódio (75 mg, 1,02 mmol, 3,0 equiv.). A reacção é agitada a 25°C durante 2 h, ao fim deste tempo é estabelecida por 1H RMN a altura em que reacção está completa e a mistura é vertida em água (85 mL) e extraida com éter (2x5 mL) . As fracções orgânicas combinadas são secas (MgS04), os solventes evaporados e o resíduo purificado por cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 5% EtOAc em hexano) para dar 2-tiometil-4-bromotioazole 21b (77 mg, 92%. Rf= 0,58 (sílica gel, 10% EtOAc em hexano); IV (filme) vmax 3118, 2928, 1459, 1430, 1388, 1242, 1040, 966, 57 ΡΕ1089998 876, 818 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) δ 7,07 (s, 1H, ArH), 2,69 (s, 3H, SCH3) / GC/MS (EI) calculado para C4H4BrNS2 (M+) 209/211, encontrado 209/211.

2-tiometil-4-trimetilestaniltiazole 8b como ilustrado no Esquema 3. a uma solução de bromotiazole 21b (51 mg, 0,24 mmol, 1,0 equiv.) em tolueno desarejado (4,9 mL, 0,1M) adiciona-se hexametildiestanho (498 L, 2,4 mmol, 10 equiv.) e Pd(PPh3)4 (14 mg, 0,012 mmol, 0,05 equiv.) e a mistura reacional é aquecida a 80°C durante 3 horas. Em seguida a reacção é arrefecida a 25°C e dá, após cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 5% Et3N em hexano), estanano 8b (71 mg, 100%). Rf = 0,67 (silica gel; pré-tratamento com Et3N, 10% EtOAc) ; IV (filme) vmax 2981, 2924, 1382, 1030, 772 cm"1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) 7,25 (s, 1H, ArH), 2,70 (s, 3H, SCH3) , 0,32 (s, 9H, Sn(CH3)3)3; HRMS (FAB), calculado para C7Hi3NS2Sn (M+H+) 295, 9588 encontrado 295,9576.

Epotilona E (3) como ilustrado nos Esquemas 2 e 3. A uma solução de lactona 18h (10,0 mg, 0,002 mmol, 1,0 equiv.) em metanol (600 pL, 0,03 M) é adicionado acetonitrilo (32 pL, 0,606 mmol, 30 equiv), KHC03 (10 mg, 0,102 mmol, 5 equiv.) e peróxido de hidrogénio (27 pL, 35% p/p em água, 0, 303 mmol, 15 equiv.) e a mistura reaccional é agitada a 25°C durante 3h. Adiciona-se mais acetonitrilo (32 pL, 0,606 mmol, 30 equiv), KHC03 (10 mg, 0,102 mmol, 5 equiv.) e peróxido de hidrogénio (27 pL, 35% p/p em água, 0,0303 mmol, 15 equiv.) e a agitação continua durante mais 58 ΡΕ1089998 3 h. A mistura reaccional é então passada directamente através de um pequeno leito de silica gel, eluindo com éter, e o filtrado é concentrado sob pressão reduzida. Por cromatografia fina em camada preparativa (placas de 250 mm silica gel, 50% EtOAc em hexano) dá o material de partida que não reagiu 18b (5,0 mg, 50%) e epotilona E (3) (3,4 mg, 33%). Rf = 0,56 (silica gel, 60% EtOAc em hexano); [cx]22d= -27,5 (c 0,20 , CHC13) ; IV (filme) vMax 3413, 2928, 2867, 1731, 1689, 1462, 1375, 1257, 1152, 1061, 978, 756 cm-1; ΧΗ- RMN (600 MHz, CDC13) δ 7,13 (s, 1H, ArH) , 6, 61 (s CH=CCH3) , 5,46 (dd, J= 8,1, 2,4, 1H, CHOCO), 4, 94 (d 5,2 Hz, 2H, CH2OH) , 4,16-4,12 (m, 1H, (CH3) 2CCff (OH) ) , 3,82- 3,78 (m, 1H, CffOH (CHCH3) ) , 3,66 (bs, 1H, OH), 3,23 (qd, J= 6,8, 5,2 Hz, 1H, CH3Cíf(C=0) ) , 3,04 (ddd, J=8,l, 4,5, 4,5 Hz, 1H, CH2CH(0) CHCH2) , 2,91 (ddd, J=7,3, 4,5, 4,1 Hz, 1H,

CH2CH(0) CHCH2) , 2,61 (t, J= 5,2 Hz, 1H, CJÍ2OH) , 2,55 (dd, J= 14,7, 10,4 Hz, 1H, CH2COO), 2,48 (bs, 1H, OH), 2,45 (dd, J 14,7, 3,2 Hz, 1H, CH3COO), 2,14-2,07 (m, 1H, CH2CH (O) CHCH2) , 2,11 (s, 3H, CH=CCH3) , 1,91 (ddd, J = 15,1, 8.1 8,1 Hz, 1H, CH2CH (O) CHCH2) , 1,78-1-66 (m, 2H, CH2CH (O) CHCH2) , 1,52-1,38 (m, 5H) , 1,36 (s, 3H, C(CH3)2), 1,18 (d, 3H, J= 6,8 Hz, CH3CH(C=0)), 1,10 (s, 3H, C(CH3)2), 1.01 (d, J=7, 0 Hz, 3H, CH3CHCH2) ; HRMS (FAB), calculado C26H39N07S (M+H+) 510,2525, encontrado 510,2539.

Macrolactona cis 18b como ilustrado no Esquema 3.

Uma solução de iodeto de vinilo 7 (9,2 mg, 0,018 mmol, 1,0 equiv.), estanhato 8b (10,7 mg, 0,036 mmol, 2,0 equiv.) e Pd(PPh3)4 (2,1 mg, 0,0018 mmol, 0,1 equiv.) em tolueno 59 ΡΕ1089998 desarejado (180 L, 0,1 M) é aquecida a 100°C durante 40 min., de acordo com o procedimento descrito para a sintese da lactona 18h, para dar, após cromatografia em camada fina preparativa (placas de 250 mm silica gel , 75% éter em hexano), macrolactona 18b (4,1 mg, 44%). Rf = 0,50 (silica gel, 50% EtOAc em hexano); [oí]22d -38,6 (c 0,21, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3444, 2925, 1732, 1682, 1259, 1037, 756

cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) δ 6,99 (s, 1H, CH=C (CH3) ) 6,52 (bs, 1H, ArH) , 5,45 (ddd, J = 10,5, 10,5, 4,0 Hz, 2H CH=CHCH2), 5,3 9 (ddd, J = 10,5, 10,5, 4, 0 Hz, 1H CH=CHCH2), 5,29 (d, J= 8,0 Hz, 1H, CHOCO), 4,20 (ddd, J= 8.0 HZ, 1H, CHOH(CHCH3) ) , 3,13 (qd, J = 6,5, 2,0 Hz, 1H, CH3CH(C=0)), 2,98 (d, J = 2,0 Hz, 1H, CHOH (CHCH3) ) , 2,93 (d, J= 6,5, 2,0 Hz, 1H, (CH3) 2CCH (OH) ) , 2,71 (ddd, J 15,0, 10,0, 10,0 Hz, 1H,CH=CHCH2) , 2,70 (s, 3H, SCH3) , 2,51 (dd, J 15,5, 11,5 Hz, 1H, CH2COO) , 2,30 (dd, J= 15,0, 2,5 Hz, 1H, CH2COO) , 2,28-2,16 (m, 2H) , 2,13 (d, J 1,0 Hz, 3H, CH=CCH3), 2,06-1, 98 (m, 1H) , 1,79-1, 60 (m, 3H) , 1,33 (s,

3H, C(CH3)2), 1,19 (1,19 (d, J 7,0 Hz, 3H, CH3CH(C=0)), 1,09 (s, 3H, C(CH3)2), 1,00 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CHCH2) ; HRMS (FAB) calculado C26H39N05S2 (M+Cs+) 642,1324, encontrado 642,1345. fcrans-Macrolactona 19b como ilustrado no Esquema 3. Uma solução de iodeto de vinilo 11 (6,9 mg, 0,014 mmol, 1.0 equiv.), estanhato 8b (8,2 mg, 0,028 mmol, 2,0 equiv.) e Pd(PPh3)4 (1,6 mg, 0,0014 mmol, 0,1 equiv.) em tolueno desarejado (140 pL, 0,1 M) é aquecida a 100°C durante 40 min., de acordo com o procedimento descrito para a sintese 60 ΡΕ1089998 da lactona 18h, para dar, após cromatografia em camada fina preparativa (placas de 250 mm silica gel , 75% éter em hexano), macrolactona 18b (4,1 mg, 44%). Rf = 0,47 (silica gel, 50% EtOAc em hexano); [a]22D -32,9 (c 0,35, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3488, 2928, 1728, 1692, 1259, 1036, 757 cm 1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) δ 7,00 (s, 1H, ArH), 6, 48 (s, 1H, CH=CCH3), 5,53 (ddd, J = 15,0, 7,5, 7,5 Hz, H, CH=CHCH2), 5,40 (d, J = 8,0, Hz, 1H, CHOCO), 5,39 (ddd , J= 15, 0 , 7,5, 7,5 Hz, 1H, CH=CHCH2), 4,12 (ddd, J= 11,0 HZ, 2,5, 2,5 Hz, 1H, (CH3) CCffOH) , 3,77-3,74 (m, 1H, CHOH (CHCH3) , 3,24 (m, 1H , CH=CHCH2), 3,07 (m, 1H, (ch3; )CH(C=0)) , 2,70 (s, 3H, SCH3), 2,61 (d, J 3,5, Hz, 1H, CHOH(CHCH3) ) ) ,2,59-2,44 (m, 5H) , 2,19-2,12 (m, 1H) , 2,13 (s, 3H, CH=CCH3), 2,01- -1, 94 (m, 1H), 1,70-1,55 (m, 2H) , 00 \—1 -1,41 (m, 1H), 1,29 (s, 3H, C (CH3) 2) , 1,18 (d, J = 7,0

Hz, 3H, CH3CH(C=0)), 1,08 (s, 3H, C(CH3)2), 0,99 (d, J= 7,0 Hz, 3H, CH3CHCH2); HRMS (FAB) calculado C26H39N05S2 (M+Cs+) 642,1324, encontrado 642,1298.

Éter sililico 25 como ilustrado no Esquema 7. A uma solução de álcool 13 (12,96 g, 54,4 mmol, 1,0 equiv., em DMF (180 mL, 0,3M) a 0°C, é adicionado imidazole (10,2 g, 150 mmol, 2,8 equiv.) seguido de terc-butildimetilcloro-silano (13,5 g, 89,8 mmol, 1,7 equiv.). Após aquecimento a 25°C durante 7 h, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o óleo resultante foi partilhado entre éter (200 mL) e solução aquosa saturada de NH4C1 (200 mL) . A fase aquosa foi extraída com éter (200 mL) e os extractos combinados foram lavados com solução saturada de cloreto de 61 ΡΕ1089998 sódio (500 mL) , seca (MgS04) e concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 0 a 50% EtOAc em hexano) deu o éter sililico 25 como um óleo (16,03 g, 84%). Rf = 0,48 (hexano); [oí]22d -17,5 (c 1,65, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 2954, 2928, 2857, 1472, 1361, 1278, 1252, 1082, 914, 836, 776, 677 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDCI3) 6,15 (s, 1H, CH=CCH3), 5, 74-5, 66 (m, 1H, CH=CH2) ,

5, 03 (bm, 1H, CH=CH2) , 5,01 (s, 1H, CH=CH2) , 4,16 (dd, J : 6,5, 6,5 Hz, 1H, CHOH) , 2,25 (m, 1H, CH2=CHCÍÍ2) , 1,77 (s 3H, CH=CCH3) , 0,88 (s, 9H, SiC(CH3)3), 0,04 (s, 3H

Si(CH3)2), -0,01 (s, 3H, Si (CH3) 2) ;

Aldeído 26 como ilustrado no Esquema 7. A uma solução de olefina 25 (16,0 g, 45,3 mmol, 1,0 equiv.) numa mistura de THF (206 mL) , t-BuOH (206 mL) e H20 (41 mL) a 0°C é adicionou-se a N-óxido de metilmorfolina (NMO) (5,84 g, 4 9,8 mmol, 1,1 equiv.) seguido de 0s04 (5,2 mL, 2,5 % p/v em t-BuOH, 0,453 mmol, 0,01 equiv.). A mistura foi agitada vigorosamente 13 h a 25°C e em seguida é desac-tivada com solução aquosa saturada de Na2S03 (125 mL) . A solução resultante é agitada durante 2 h e em seguida partilhada entre EtOAc (150 mL) e água (150 mL) . A fase orgânica é separada e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 200 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram secos (MgS04) , filtrado, e os solventes removidos sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 50 a 90 % éter em hexano) proporciona o material de partida que não reagiu (1,0 g, 6%) e os óleos desejados como uma mistura de diastereoisomeros ca 1:1 (15,5 g, 89%) . Rf = 62 ΡΕ1089998 0,44 (sílica gel, 50% EtOAc em hexano); IV (filme fino) vmax 3387, 2952, 2928, 1252, 1080, 837, 777 cm'1; 1H-RMN (50 0 MHz, CDC13), 6,28 e 6,26 (singletos, 1H total, Ci7=CCH3) , 4,47- 4,42 (m, 1H, CHOSi) , 3,86-3,76 (m, 1H, CHOH) , 3,61- 3, 55 e 3,49-3,39 (m, 2H, total, CH2OH), 3,33 e 3,15 (2 dupletos, J= 2,0 e 3,5 Hz, 1H total, CHOJí) , 2,46 e 2,45 (tripletos, J = 5,5 e 5,5 Hz, CH2OH) , 1,78 e 1,76 (singletos, 3H total), 1,63-1,60 e 1,58-1,53 (m, 2H total, CH2) , 0,88 e 0,87 (singletos, 9H total, SiC(CH3)3), 0,08 e 0,07 (singletos, 3H total, Si(CH3)2), 0,01 e 0,00 (singletos, 3H total, Si(CH3)2); HRMS (FAB), calculado Ci3H27l03Si (M+Na+) 409, 0672 encontrado 409, 0662.

Os dióis (obtidos como descrito acima) (23,3 g, 60,2 mmol, 1,0 equiv.) são dissolvidos numa mistura de MeOH (400 mL) e água (200 mL) e a solução é arrefecida a 0°C. Em seguida adiciona-se NaI04 (77,2 g, 361,1 mmol, 6,0 equiv.) em pequenas porções durante 5 minutos, e a mistura resultante é agitada vigorosamente durante 30 minutos a 25 °C. Uma vez completa a reacção, a mistura é partilhada entre CH2CI2 (500 mL) e água (500 mL) e a fase orgânica separada. A fase aquosa é extraída com CH2C12 (500 mL) e os extractos orgânicos combinados são lavados com solução saturada de cloreto de sódio (1L), seca (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 17 a 50% éter em hexano) proporciona o aldeído 26 como um óleo (19,6 g, 92%). Rf = 0,35 (silica gel, 20% éter em hexano); [a]22 D -34,1 (c 2,8, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 2954, 2928, 2885, 2856, 1728, 1471, 1279, 63 ΡΕ1089998 1254, 1091, 838, 777, 677 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) 9,73 (dd, J = 2,5, 2,5 Hz, 1H, CHO) , 6,34 (s, 1H, CJÍ=CCH3) , 4,70 (dd, J= 8,0, 4,0 Hz, 1H, CHOSi) , 2,68 (ddd, J= 16,0, 8,3, 2,5 Hz, 1H, (CHO)CH2), 2,44 (ddd, J= 16,0, 4,0, 2,5 Hz, 1H, (CHO)CH2), 1,80 (s, 3H, CH=CC#3), 0,85 (s, 9H, SiC(CH3)3), 0,05 (s, 3H, Si (CH3) 2) , 0,01 (s, 3H, Si(CH3)2; HRMS (FAB) calculado para Ci2H23I02Si (M+Na+) 377,0410 encontrado 377,0402. Éster metilico 28 como ilustrado Esquema 7. Uma mistura de aldeído 26 (19,6 g, 55,2 mmol, 1,0 equiv.) e intermediário estabilizado 27 (50,2 g, 134,0 mmol, 2,4 equiv.) [preparado a partir de 4-bromo-l-buteno por (i) formação do sal fosfónio; (ii) formação do anião com KHMDS; e (iii) desactivação com MeOC(OCl)] (ver Marshall, J. A. et. al. J. Org. Chem. 51, 1735-1741 (1986) e Bestmann, H. J., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1965, 645-60) em benzeno (550 mL, 0,1 M) é aquecida a refluxo durante l,5h. Após arrefecimento a 25°C, a mistura é filtrada e o solvente é removido sob pressão. A cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 9 a 17% éter em hexano) dá éster metilico 28 (24,5 g, 98%). Rf = 0,37 (silica gel, 20% éter em hexano); [oí]22d -7,25 (c 1,6, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3078, 2952, 2920, 2856, 1720, 1462, 1434, 1276, 1253, 1208, 1084, 836, 776, 672 cm'1; 1H-RMN (600 MHz, CDC13) 6,81 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 1H, CH=CCOOCH3) , 6,22 (s, 1H, CH=CCH3) , 5,83-5,75 (m, 1H, CH=CH2), 4, 99-4, 98 (m, 1H, CH=CH2) , 4,96 (m, 1H, CH=CH2), 4,22 (dd, J = 7,5, 5,1 Hz, 1H, CHOSi), 3,72 (s, 3H, COOCH3), 3,05 (d, J = 6,0 Hz, 2H, CH2C(C02Me)), 2,40 64 ΡΕ1089998 (ddd, J = 15,0, 7,5, 7,5 Hz, 1H, CH2CHOSi) , 2,33 (ddd, J = 15.0, 7,5, 5,1 Hz, CH2CHOSi) , 1,77 (s, 3H, CH=CCJÍ3) , 0,85 (s, 9H, SiC(CH3)3), 0,02 (s, 3H, Si(CH3)2), -0,02 (s, 3H,

Si (CH3) 2) ; HRMS (FAB) calculado para Ci8H3iI03Si (M+Cs+) , 583,0142 encontrado 583,0159.

Álcool alílico 29 como ilustrado no Esquema 7. O éster metílico 28 (24,5 g, 54,3 mmol, 1,0 equiv.) é dissolvido em THF (280 mL) e a solução é arrefecida até -78°C. Adiciona-se DIBAL (163,0 mL, 1M em CH2C12, 163 mmol, 3,0 equiv.) gota a gota a -78°C durante 50 minutos, e a

mistura reaccional é agitada durante mais 80 minutos. A mistura reaccional é desactivada com solução aquosa saturada de tartarato de potássio-sódio (150 mL) e a mistura resultante é deixada a aquecer até 25°C durante 16 h. A fase orgânica foi separada e a fase aquosa é extraída com éter (3 x 250 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com solução saturada de cloreto de sódio (650 mL) , secos (MgS04) e concentrados sob pressão. A cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 17 a 50% éter em hexano) dá álcool 29 (22,9 g, 100%). Rf = 0,11 (silica gel, 20% éter em hexano); [a ] 22D -7,25 (c 1,6, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3346, 3078, 2954, 2928, 2857, 1637, 1471, 1361, 1276, 1252, 1078, 1005, 836, 775, 674, 558 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) 6,16 (s, 1H, CH=CCH3) , 5,81-5,73 (m, 1H, CH=CH2), 5,45 (dd, J = 6,5, 6,5 Hz, 1H, CH=CCH2OH) , 5,03 (m, 2H, CH=CH2) , 4,16 (dd, J = 6,5, 6,5 Hz, 1H, CHSiO) , 4,02 (d, J = 4,5 Hz, 2H, CJÍ2OH) , 2,85 (dd, J = 15.0, 5,1 Hz, 1H, CH2CH=CH2), 2,85 (dd, J = 15,0, 5,0 Hz, 65 ΡΕ1089998 1Η, CH2CH=CH2) , 2,27 (ddd, J = 15,0, 6,5, 6,5 Hz, 1H, CH2CHOSi) , 2,25 (ddd, J = 15,0, 6,5, 6,5 Hz, 1H, CH2CHOSi), 1,78 (s, 3H, CH=CCH3), 0,88 (s, 88 (s, 9H, SiC(CH3)3, 0,02 (s, 3H, Si (CH3) 2) , -0,02 (s, 3H, Si(CH3) 2);HRMS (FAB), calculado para Ci7H31I02Si (M+Cs+) 555, 0192 encontrado 555, 0177.

Trifenilmetiléter 30 como ilustrado no Esquema 7. O álcool 29 (23,5 g, 55,7 mmol, 1,0 equiv.) é dissolvido em DMF (300 mL, 0,15M) e adiciona-se 4.DMAP (11,3g 92,5 mmol, 1,7 equiv.) e cloreto de tritilo (22,1 g, 79,3 mmol, 1,4 equiv.). A mistura reaccional é agitada a 80°C durante 21h, arrefecida à temperatura ambiente e o solvente é removido sob pressão reduzida. 0 residuo resultante é purificado por cromatografia em coluna "flash" para dar o éter requerido 30 como um óleo (35,3g, 95%) . Rf = 0,88 (silica gel, 20% éter em hexano) ; [oí] 22d - 0,74 (c 0,3, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3058, 2927, 2854, 1488, 1470, 1448, 1250, 1082, 836, 702, 632 cm-1; 1H-RMN (600 MHz, CDC13) 7,45-7,43 (m, 5H, Ph) , 7,32- 7,21 (m, 10H, Ph) , 6,19 (s, 1H, CH=CCH3), 5, 61 (m, 2H, ch=ch2, ch=ch2), 4,87 (m, 2H, CH=CJÍ2,

Cff(C) CH2OTr) , 4,19 (dd, J = 6,8, 6,8 Hz, 1H, CHOSi) , 3,46 (s, 2H, CH2OTr) , 2,78 (dd, J = 15,4, 6,7 Hz, 1H, CH2CH=CH2) , 2,73 (dd, J = 15,4, 6,3 Hz, 1H, CÍÍ2CH=CH2) , 2,33 (ddd, J= 14,5, 6,8, 6,8 HzlH, CÍÍ2CHOSi) , 2, 31 (ddd, J= ‘14,5, co co Hz; 1H, CH2CHOSi), 1,80 (s, 3H, CH=CCH3) , 0,87 (s, 9H,

SiC(CH3)3), 0,04 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,00 (s, 3H, Si(CH3)2); HRMS (FAB) calculado para C36H45I02Si (M+Cs + ) , 797,1288 encontrado 797,1309. 66 ΡΕ1089998 Álcool 31 como ilustrado no Esquema 7. A olefina 30 (35,3 g, 53,1 mmol, 1,0 equiv.) é dissolvida em THF (53 mL, 1,0 M) e a solução é arrefecida a 0°C. 0 9-BBN (149 mL, 0,5 M em THF, 74,5 mmol, 1,4 equiv.) é adicionado gota a gota durante 1,5 h e a mistura resultante é agitada durante 9h a 0°C. A solução NaOH aquosa (106 mL de uma solução 3N, 319,0 mmol, 6,0 equiv.) é adicionada, seguida de H2O2 (32 mL, 30% p/p em água, 319 mmol, 6,0 equiv.). A agitação é continuada durante lha 0°C, após o que a mistura reaccional é diluida com éter (500 mL) e (água (500mL) . A fase orgânica é separada e a fase aquosa é extraida com éter (2 x 500 mL). Os extractos orgânicos combinados foram lavados com solução saturada de cloreto de sódio (1L), secos (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. A croma-tografia em coluna "flash" (silica gel, 60% éter em hexano) ; [oí]22d -3,5 (c 0,2, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3380, 3032, 2926, 2855, 1489, 1449, 1278, 1251, 1078, 835, 706, 632 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) 7,47-7,45 (m, 5H, Ph) , 7,32-7,22 (m, 10H, Ph) , 6,22 (s, 1H, CH=CCH3) , 5,58 (dd, J = 7,1 7,1 Hz, 1H, C=CHCH2) , 4,22 (dd, J = 6,8 6,0

Hz, 1H, CHOSi), 3,52 (bm, 2H, CH2OH) , 3,50 (s, 2H, CH2OTr) , 2,33 (dd, J = 14,5, 6,8, 6,8 Hz, 1H, CH2CHOSi) , 2,28 (ddd, J= 14,5, 6,8, 6,8 Hz, 1H, CH2CHOSi) , 2,14 (m, 2H, CH2CH2CH2OH) , 1,82 (s, 3H, CH=CCH3), 1,46 (m, 2H, CH2CH2OH) , 0,90 (s, 9H, SiC (CH3) 3) , 0,06 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,02 (s, 3H, Si (CH3) 2) ; HRMS (FAB) calculado para C36H47I03Si (M+Cs+) 815,1394 encontrado 815,1430. 67 ΡΕ1089998

Iodeto 32 como ilustrado no Esquema 7. Uma solução do álcool 31 (34, 6g, 50,73 inmol, 1,0 equiv.) numa mistura de éter (380 mL) e MeCN (127 mL) é arrefecida a 0°C. Adiciona-se imidazole (17,3g, 253,7 mmol, 5,0 equiv.) e PPh3 (33,3 g, 126,8 mmol, 2,5 equiv.) e a mistura é agitada até os sólidos se dissolverem. Em seguida adiciona-se iodo (33,5 g, 131,9 mmol, 2,6 equiv.) e a mistura é agitada durante 45 minutos durante a 0°C. A reacção é desactivada por adição de solução aquosa saturada de Na2S203 (150 mL) e as camadas foram separadas. A fase aquosa é então extraida com éter (2 x 250 mL) e os extractos orgânicos combinados foram lavados com solução saturada de cloreto de sódio (750 mL), secos (MgS04) e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 5 a 9% éter em hexano) dá o iodeto 32 (39,2 g, 97%).

Rf = 0,88 (silica gel, 60% éter em hexano) / [a] 22D -2,9 (c 2,6, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3057, 2926, 2855, 1481, 1448, 1251, 1083, 939, 836, 774, 706, 632 cm’1/ 1H-RMN (500 MHz, CDCI3) δ 7,49-7,45 (m, 5H, Ph) , 7,33-7,23 (m, 10, Ph), 6,23 (s, 1H, CH=CCH3), 5,67 (dd, J= 7,2, 7,1 Hz, 1H, CH2C=CH), 4,22 (dd, J = OO KD OO Hz, 1H, CHOSi), 3,51 (s, 2H, CH2OTr) , 3 ,07 (dd, J= 7,1, 7,0 Hz, 2H, CH2I), 2,34 (ddd, J=14,5, OO 07 co Hz; 1H, CH2CHOSi) , 2,25 (ddd, J= 14,5, 6,8, 6,8 Hz, CH2CHOSi) , 2,13 (m, 2H, CH2CH2CH2I), 1,84 (s, 3H, CH=CCH3), 1,75 (m, 2H, CH2CH2CH2I) , 0,90 (s, 9H,

SiC(CH3)3), 0,07 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,02 (s, 3H, Si(CH3)2); HRMS (FAB) calculado ara C36H46l02Si (M+Cs + ) 925, 0411 encontrado 925,0450. 68 ΡΕ1089998

Hidrazona 33 como ilustrado no Esquema 7.

Adiciona-se diisopropilamina (5,= mL, 35,28 mmol, 1,4 equiv.) a uma solução de n-BuLi (22,0 mL, 1,6M em hexano, 35,28 mmol, 1,4 equiv.) em 32 mL de THF a 0°C e aqitada durante lh. A hidrazona SAMP do propionaldeido (5,6 q, 32,76 mmol, 1,3 equiv.) em THF (16 mL), é adicionada a uma solução preparada de fresco de LDA a 0°C. Após agitação aquela temperatura durante 16 h, a soluço amarela resultante é arrefecida a -100°C, e a solução de iodeto 32 (20,Og, 25,23 mmol, 1,0 equiv.) em THF (32 mL) é adicionada gota a gota durante 2h. A mistura é deixada aquecer até -2 0°C durante 2Oh e em seguida vertida numa solução aquosa saturada de NH4CI (50 mL) e extraída com éter (3 x 100 mL) . 0 extracto combinado é seco (MgS04), filtrado e evaporado. A purificação por cromatografia em coluna flash de sílica gel (5 a 50% éter em hexano) proporciona a hidrazona 33 (15,0 g, 71%) como um óleo amarelo. Rf = 0,63 (sílica gel, 40% éter em hexano) ; [a]22D -22,7 (c 0,2, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3057, 2927, 2854, 1489, 1448, 1251, 1078, 940, 836, 775, 706, 668, 632 cm 1; 1H-RMN (500 MHz, CDCI3) δ 7,46-7,44 (m, 5H, Ph), 7,31-7,21 (m, 10H, Ph) , 6,40 (d, J = 6, 5Hz, 1H, N=CH) , 6,21 (s, 1H, CH=CCH3) , 5,50 (dd, J = 7,0, 7,0 Hz, 1H, CH2C=CH), 4,20 (dd, J = 6,0, 6,0 Hz, 1H, CHOSi), 3,54 (dd, J = 9,2, 3,5 Hz, 1H, Ctf2OCH3) , 3,45 (s, 2H, CH2OTr) , 3,41 (dd, J = 9,5 7,0 Hz, 1H, CH2OCH3) , 3,37 (s, 3H, CH2OCH3), 3, 32-3, 30 (m, 2H, CH2N) , 2, 60-2,55 (m, 1H), 2,34-2,20 (m, 3H) , 2,04-1, 95 (m, 1H) , 1, 98-1,73 (m, 5H) , 1,82 (s, 3H, CH=CCH3) , 1,38-1,21 (m, 4H) , 0,96 (d, J = 6,9 Hz, 3H, CHCJÍs), 0,89 (s, 9H, SiC(CH3)3, 0,06 (s, 3H, 69 ΡΕ1089998

Si(CH3)2), 0,01 (s, 3H, Si(CH3)2); HRMS (FAB) calculado para C45H63IN2O3SÍ (M+Cs + ) 967,2707 encontrado 967,2740.

Nitrilo 34 como ilustrado no Esquema 7. O sal de magnésio do ácido monoperoxiftálico (MMPP.6H20, 80%, 52,4 g, 84,8 mmol, 2,5 equiv.) é adicionado em pequenas porções durante 10 minutos a uma solução de hidrazona 33 (28,3g, 33,9 mmol, 1,0 equiv.) agitada rapidamente numa mistura de MeOH (283 mL) , THF (100 mL) e tampão fosfato a pH 7 (283 mL) a 0°C. A mistura é agitada a 0°C durante l,5h e então mais THF (120 mL) é adicionado em duas porções durante 30 minutos para ajudar a dissolver o material de partida. Após agitação durante mais l,5h a mistura reaccional é vertida numa solução aquosa saturada de NaHC03 /550 mL) e o produto é extraído com éter (750 mL) e em seguida EtOAc (2 x 750 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com solução saturada de cloreto de sódio (1L), seco (MgS04) e concentrado a pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 9 a 20% éter em hexano) dá o nitrilo 34 como um óleo incolor (21,8 g, 89%). Rf = 0,44 (sílica gel, 20% éter em hexano); [oí]22d +2,9 (c 1,2, CHCI3) ; IV (filme fino) vmax 3057, 2 92 8, 2855, 2238, 1489, 1490, 1448, 1252, 1081, 836, 775, 707, 632 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) δ 7,47-7,45 (m, 5H, Ph) , 7,33-7,23 (m, 10H, Ph) , 6,22 (s, V \—1 CH=CCH3), 5, 56 (dd, J= 6,8, 6,8 Hz, 1H, CH2C=CH) , 4,21 (dd, 00 OO II •d Hz, 1H, CHOSi), 3,49 (s, 2H, CH2OTr), 2,48 (m, 1H, CJÍ(CH3)) , 2,29 (ddd, J = 14,5, 6,8, 6,8 Hz, 1H, CH2CHOSi), 2,24 (ddd, J = 14,5, &,8, 6,8 Hz, 1H, CH2CHOSi) , 2,07 (m, 2H, CH (C) Jí2OTr) ) , 1,82 (s, 3H, CH=CCH3) , 1,58-1,23 70 ΡΕ1089998 (m, 4H), 1,24 (d, J= 7,0 Hz, 3H, CHCff3) , 0,90 (s, 9H, SiC(CH3)3), 0,07 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,0 (s, 3H, Si(CH3)2); HRMS (FAB) calculado para C39H50INO2Si (M+Cs + ) , 852,1710 encontrado 852,1783.

Aldeído 35 como ilustrado no Esquema 7. O nitrilo 34 (7,01 g, 9,74 mmol, 1,0 equiv.) é dissolvido em tolueno (195 mL, 0,005 M) e arrefecido a -78°C. Adiciona-se DIBAL (29,2 mL, 1,0 M em tolueno, 29,2 mmol, 3,0 equiv.) gota a gota a -78°C durante 10 minutos. A mistura reaccional é agitada a -78°C até se verificar que está completa por TLC (1 h) . o metanol (10 mL) e HC1 (10 mL, 1,0N e, água) são sequencialmente adicionados e a mistura resultante é deixada até atingir os 0°C durante lh. em seguida são adicionados éter (250 mL) e água (250 mL) e as fases são separadas. A fase orgânica é extraída com éter (2 x 250 mL) e os extractos combinados são lavados com solução saturada de cloreto de sódio (500 mL) , seco (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 17 a 33% éter em hexano) dá o aldeído 35 como um óleo (6,18 g, 88%). Rf = 0,51 (silica gel, 20% éter em hexano); [a ] 22D +2,0 (c 0,3, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3057, 2927, 2855, 1726, 1490, 1448, 1251, 1081, 836, 775, 707, 632 cm"1; 1H-RMN (500 MHz, CDC13) δ 9,51 (d, J= 1,9 Hz, 1H, CHO), 7,46-7,45 (m, 5H, Ph), 7, 32-7,22 (m, 10H, Ph) , 6,20 (s, 1H, CH=CCH3), 5,54 (dd, J= 7,0, 7,0 Hz, 1H, CH2C=CJÍ) , 4,20 (dd, J= 6,5, 6,0 Hz, 1H, CHOSi) , 3,47 (s, 2H, CH2OTr) , 2,34-2,20 (m, 3H, CH2CHOSi e CH(CH3)), 2,04 (m, 2H, CH2 (C)CH2OTr) , 1,82 (s, 3H, CH=CCH3) , 1,66 (m, 1H) , 71 ΡΕ1089998 1,30-1,19 (m, 3H) , 1,02 (d, J=7,0 Hz, 3 H, CHCH3), 0,89 (S, 9h, SiC (CH3) 3) , 0, 06 (S, 3H, Si(CH3)2), 0,00 (s, 3H, Si (CH3) 2) ; HRMS (FAB) , calculado C39H5iI03Si (M+Cs+) 855, 1707 encontrado 855,1672.

Tris-(éteres sililicos) 37 e 38 ilustrados no Esquema 8. Uma solução de cetona 36 (ver Nicolau, K. C. et. al. , J. Am. Chem. Soc. 119, 7974-91 (1997) (1,20 g, 2,99 mmol, 1,4 equiv.) em THF (4,3 mL) é adicionada gota a gota durante 5 minutos a uma solução de LDA preparada de fresco [diisopropilamina (424 pL, 3,03 mmol, 1,45 equiv.) é adicionada a n-BuLi (2,00 mL, 1,52 M em hexano, 3,04 mmol, 1,45 equiv.) a 0°C e após 5 min em THF (4,3 mL) é adicionada] a -78°C. Após agitação durante l,5h a -78°C, a solução é deixada aquecer até -40°C durante um periodo de tempo de 30 min. A mistura reaccional é então arrefecida a -78°C e a solução do aldeido 35 (1,51 g, 2,09 mmol, 1,0 equiv.) em THF (12,5 mL) é adicionada gota a gota durante 15 minutos. A mistura reaccional resultante é agitada durante lha -78°C, e em seguida desactivada por adição gota a gota de uma solução aquosa saturada de AcOH (3,1 mL de solução 1M em THF, 3,10 mmol, 1,5 equiv.). A mistura é em seguida aquecida a 25°C e partilhada entre éter (25 mL) e solução aquosa saturada de NH4C1 (25 mL). A fase aquosa é extraída com éter (3 x 25 mL) e os extractos orgânicos combinados são secos (MgS04) e concentrados a pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 4 a 20% éter em hexano) proporciona cetona que não reagiu (502 mg, 42%), produto aldol indesejado 38 (705 mg, 27%) e 72 ΡΕ1089998 a mistura do desejado produto aldol 37 e aldeído que não reagiu 35 [1,136 g, (razão 37:35 ca 9:1 por 1H-RMN)] (i.e. 39% de rendimento do 37) . A mistura é utilizada directamente no próximo passo. 37: (maioritário) (obtido como um óleo incolor a partir da mistura contendo 35, por cromatografia em coluna flash de sílica gel, (10 a 17% EtOAc em hexano. Rf = 0,22 (sílica gel, 10 % éter em hexano) ; [a] 22D -20 , 0 (c 0,3, CHC13) ; IV (filme fino) ^max 3486, 2954, 2828, 2856, 1682, 1472, 1448, 1253, 1090, 994, 836, 775, 706, 668, 632 cm-1; 1H-RMN (600 MHz, CDC13) δ 7,75-7,43 (m, 5H, Ph), 7,30-7,19 (m, 10H, Ph) , 6,19 (s, 1H, CH=CCH3), 5,51 (dd, J=7,0, 6,9 Hz, 1H, C=CffCH2) , 4,18 (dd, J= 6,3, 6,2 Hz, : 1H, CHOSi), 3,88 (dd, J= 7, 5, 2,6 Hz, 1H, CHOSi), 3,65 (m, 1H, CH2OSi), 3,59 (m, 1H, CH2OSi), 3,46 (d, J= 11,2 Hz, 1H, CH2OTr), 3,43 (d, J= 11,2 Hz, 1H, CH2OTr), 3,27 (m, 1H, CH3CH(C=0)), 3,22 (d, J= 9,3 Hz, 1H, CHOH), 2,32-2,18 (m, 2H, C=CHCH2CHOSi), 2,00 (m, 2H, CH2 (C) CH2OTr) , 1,80 (s, 3H, CH=C(CH3)), 1,66 (m, 2H) , 1,46 (m, 2H) , 1,27 (m, 1H, CH(CH3) , 1,19 (s, 3H, C(CH3)2), 1,07 (s, 3H, C(CH3)2), 0,99 (d, J= 6,8 Hz, 3H, CH(C H) 3) ) , 0,89 (s, 9H, SiC (CH3) 3) , 0,87 (s, 9H, SiC(CH3)3), 0,86 (s, 9H SiC (CH3) 3), 0,71 (d, J= 6 ,7 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,10 (s, 3H Si (CH3)2 ), 0,07 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,04 (s, 3H, Si (CH 3) 2 0,03 (s, 6H, Si(CH3)2), -0,01 (s, 3H, Si(CH3)2); HRMS (FAB) calculado para C6oHg7I06Si3 (M+Cs+) 1257,4639 encontrado 1257,4639. 38: (minoritário) óleo incolor; Rf = 0,38 (silica gel, 20% éter em hexano); [a]22D -11,9 (c 2,9, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3501, 2954, 2930, 2856, 1682, 1469, 1254, 1088, 836, 776, 705, 670 cm-1; 1H-RMN (500 MHz, 73 ΡΕ1089998 CDC13) δ 7,46-7,44 (m, 5H, Ph), 7, 31-7,21 (m, 10H, Ph) 6,21 (s, 1H, CH=CCH3), 5, 52 (dd, J= 7,0, 6,9 Hz, 1H C=CHCH2) , 4,20 (dd, J= 6,5, 6,5 Hz, 1H, CHOSi), 3,88 (dd J= 7,5, 2 ,5 Hz, 1H, CHOSi), 3, 67 (m, 1H, CH2OSi), 3,60 (m 1Η, CH2OSi), 3,46 (s, 2H, CH2OTr) , 3,30-3,21 (m, 2H, CHOH, CH3CH(C=0)), 2,30-2,25 (m, 2H, C=CHCfí2CHOSi) , 2,05-1, 93 (m, 2H, CH2C (CH2OTr) =CH, 1,81 (s, 3H, CH=C(CH3)), 1,63 (m, 1H, ), 1,45 (m, 2H) , 1,24 (, 2H) , (s, 3H, C(CH3) ' 2) , 1,05 [, C(CH3)2), 1,01 (d, J= 6, 9 Hz, 3H, CH(CH3) ) , 0,92 (s, SiC(CH3)3), 0,89 (s, 9H, SiC (CH3) 3), 0,88 (dupleto pouco definido, 3H, CH(CJí3)), 0,88 (s, 18H, SiC(CH3)3), 0,01 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,07 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,06 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,04 (s, 6H, Si (CH3) 2) , 0,01 (s, 3H, Si(Ch3)2); HRMS (FAB) calculado para C60H97IO6SÍ3 (M+Cs+) , 1257,4692 encontrado 1257,4749.

Tetra-éter sililico 39 como ilustrado no Esquema 8. O álcool 37 (1,136 g de uma mistura 9:1 com aldeido 35, 0, 933 mmol) é dissolvido em CH2C12 (5,0 mL) , arrefecido a -20°C e tratado com 2,6-lutidina (470 pL, 4,04 mmol, 4,3 equiv.) e terc-butildimetilsililtrifluorometanossulfonato (695 pL, 3,03 mmol, 3,2 equiv.). A mistura é então agitada durante 2,5 h com aquecimento lento a 0°C. A reacção é desactivada com solução aquosa saturada de NaHC03 (25mL) e a fase aquosa é extraída com éter (3 x 25 mL). Os extractos orgânicos combinados foram lavados com solução saturada de cloreto de sódio (250 mL) , seca (MgS04) e concentrada a pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 4 a 9% de éter em hexano) dá o tetra-sililéster 39 74 ΡΕ1089998 como um óleo incolor (1,04 g, 90%). Rf = 0,91 (sílica gel, 20% éter em hexano) ; [a] 22D -16,8 (c 0,7, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3058, 2951, 2856, 1693, 1471, 1253, 1079, 1004, 836, 706 cm-1; 1H-RMN (600 MHz, CDC13) δ 7,46-7,43 (m, 5H,

Ph) , 0,29-7,19 (m, 10H, Ph) , 6,19 (s, 1H, Cfí=CCH3) , 5,49 (dd, J= 7,0, 7,0 Hz, 1H, C=CJÍ(CH2) , 4,18 (dd, J= 6,3, 6,1 Hz, 1H, CHOSi), 3,85 (dd, J= 7,6, 2,5 Hz, 1H, CHOSi), 3,70

(dd, J= 6,7, 2,0 Hz, 1H, CHOSi), 3,67 (ddd, J= 9,6, 4,8 hz 1H, CH2OSi), 3,59 (ddd, J= 9,7, 7,9, 7,9 Hz, 1H, CH2OSi) 3, 45 (d, J= 11,2 Hz, 1H, CH2OTr) , 3,42 (d, J= 11,2 Hz, 1H CH2OTr) , 3,08 (qd, J= 6,8, 6,8 Hz, 1H, CH3CH(C=0)), 2,27 (ddd, J= 14,4, 7,2, 7,2 Hz, 1H, C=CHCH2CHOSi) , 2,23 (ddd, J= 14,5, 6,2, 6,2 hz, 1H, C=CHCH2CHOSi) , 1,97 (m, 2H, CH2C (CH2OTr) =CH) , 1,79 (s, 3H, CH=C (CH3) ) , 1,57 (m, 1H) , 1,46 (m, 1H) , 1,25 (m, 3H) , 1,17 (s, 3H, C(CH3)2), 1,01 (d, J= 6,8 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,95 (s, 3H, C(CH3)2), 0,87 (s, 18H, SiC (CH3) 3) , 0,86 (s, 18H, SiC(CH3) 3, 0,09-0,03 (m, 24Hm Si(CH3)2); HRMS (FAB), calculado para C66HmI06Si4 (M+Cs+) , 1371,5557 encontrado 1371,5523 Álcool 40 como ilustrado no Esquema 8. A uma

solução de tetra-siliéter 39 (180 mg, 0,145 mmol) em THF (1,5 mL) a 0°C é adicionado HF*pir. numa mistura de piridina/THF (preparada a partir de uma solução contendo 420 pL HF*pir., 1,14 mL e 2,00 mL THF) (1,5 mL) e a solução resultante é agitada durante 2h a 0°C. Mais HF*pir. em mistura de piridina/THF (0,5 mL) é em seguida adicionada e a agitação continuada por mais lh a 0°C. A reacção é desactivada com a adição cuidadosa de uma solução aquosa 75 ΡΕ1089998 saturada de NaHC03 e o produto é extraído com EtOAc (3 x 25 mL). Os extractos orgânicos combinados são em seguida secos (MgS04) e concentrado a pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel 30% de éter em hexano) deu o álcool 40 como um óleo amarelo claro (137 mg, 84%) . Rf = 0,36 (sílica gel, 40% éter em hexano) ; [a]22D -26,0 (c 0,3, CHC13) ; IV (filme fino) vmax 3422, 2928, 2855, 1690, 1490, 1471, 1448, 1360, 1252, 1086, 1004, 986, 836, 774, 706 cm" \· 1H-RMN (600 MHz, CDCI3) δ 7,44-7,42 (m, 5H, Ph) , 7,29- 7,20 (m, 10H, Ph) , 6,19 (s, 1H, CH=CCH3) , 5,49 (dd, J= 7,1, 7,1 Hz, 1H, C=CJÍCH2), 4,17 (dd, J= 6,2, 6,0 Hz, 1H, CHOSi), 4,03 (dd, J= 6,6, 3,7 Hz, 1H, CHOSi), 3,73 (dd, J= 7,2, 1,7 Hz, 1H, CHOSi), 3,65 (m, 2H, CH2OH) , 3,45 (d, J= 11,7 Hz, 1H, CH2OTr), 3,42 (d, J= 11,7 Hz, 1H, CH2OTr), 3,06 (qd, J= 6,9, 6,9 Hz, 1H, CH3CH(C=0)), 2,28 (ddd, J= 14,7, 7,3, ,3 Hz, 1H, C=CHCH2CHOSi) , 2,22 (ddd, J= 14,7, 6,3, 6,3 Hz, 1H, C=CHCH2CHOSi) , 1,98 (m, 2H, Cff2C (CH2OTr) =CH, 1,79 (s, 3H, CH=C(CH3)), 1,56 (m, 2H) , 1,24 (m, 3H) , 1,18 (s, 3H, C(CH3)2), 1,03 (d, J= 6,9 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,97 (s, 3H, C(CH3)2), 0,87 (3 singletos, 27H, SiC(CH3)3), 0,81 (d, J= 6,7 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,10 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,04 (s, 9H,

Si(CH3)2), 0,03 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,00 (s, 3H, Si(CH3)2); HRMS (FAB) calculado para C60H97lO6SÍ3 (M+Cs + ) 1257,4692 encontrado 1257,4780.

Aldeído 41 como ilustrado no Esquema 8. A uma solução de cloreto de oxalilo (150 pL, 1,72 mmol, 2,0 equiv.) em CH2C12 (10 mL) a -78°C é adicionado gota a gota DMSO (247 pL, 3,48 mmol, 4,0 equiv.). Após agitação durante 76 ΡΕ1089998 10 minutos a -78°C, uma solução de álcool 40 (960 mg, 0,853 mmol, 1,0 equiv.) em CH2C12 (810 mL) é adicionada gota a gota. A solução resultante é agitada a -78°C durante lh, e em seguida adiciona-se Et3N (714 pL, 5,12 mmol, 6,0 equiv.) e a mistura reaccional é deixada a aquecer até aos 25°C durante 30 minutos. Adiciona-se água (30 mL), e o produto é extraído com éter (3 x 40 mL) . Os extractos orgânicos combinados são secos (MgS04) e em seguida concentrado sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 17 a 50 % éter em hexano) dá o aldeído 41 como um óleo incolor (943 mg, 98%). Rf = 0,74 (sílica gel, 40% éter em hexano); [ oí ] 22 D -10,8 (c 0,1, CHC13);IV (filme fino)vmax 2928, 2855,1728, 1690,1471, 1448 , 1260, 1252,1085, 987, 836, 774, 70 6 cm-1,. ΧΗ NMR (600 MHz, CDC13) δ 9,74 (dd, J=2,4, 1, 5Hz, 1H, CHO) , 7,44-7,42 (m, 5H,Ph), 7,29-7,20 (m, 10H, Ph) , 6,19 (s, 1H, CJÍ=CCH3), 5,49 (dd, J=7,0 , 6,8Hz, 1H, C=CHCH2), 4,44 (dd, J=6,3, 5,0Hz, 1H, CHOSi 00 \—1 (dd, J=6,9, 6,4Hz , 1H, CHOSi), 3,70 (dd, J=7,2, 1,8Hz, 1H, CHOSi), 3,45 (d, J=11,4Hz, 1H, CH2OTr), 3,42 (d, J=ll, 4Hz, 1H, CH2OTr), 3,05 (qd, J=7,0, 7, 0Hz,1H, . CH3CH(C=0)), 2,49 (ddd, J=17,0, 4,5, 1,4Hz, CH2CHO) , 2,38 (ddd, J=17,0, 5,4, 2, 8Hz, 1H, CH2CHO), 2.27 (ddd, J=14, 0, 7, 1,7,1Hz, 1H, C=CHCH2CHOSi) , 2,23 (ddd, J=14,5, 6,5, 6,5Hz, 1H, C=CHCH2CHOSi) , 1,98 (m, 2H, CH2C(CH2OTr) =CH) , 1,79 (s, 3H, CH=C(CH3)), 1 .,27 (m, 4H) , 1,19 (s, 3H, C(CH3: >2), 1,12 (m, 1H) , 1,00 (d, J=6, 8HZ, 3H, CH(CH3)), 0,98 (s, 3H, C(CH3)2), 0,87 (s, 27H, Si (CH3) 3) , 0,80 (d, J=6,7Hz, 3H, CH(CH3)), 0,07 (s,3H, Si (CH3) 2) , 0,03 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,03 (s, 3H, Si (CH3) 2) , 0,02 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,00 (s, 3H, Si(CH3)2); 77 ΡΕ1089998 HRMS (FAB), Calculado para C6oH95l06Si3 (M+Cs+) , 1255, 4536 encontrado 1255,4561. Ácido carboxilico 43 como ilustrado no Esquema 8. A uma solução de aldeído 41 (943 mg, 0,839 mmol, 1,0 equiv.) em t-BuOH (38,5 mL) e H20 (8,4 mL) e adiciona-se 2-metil-2-buteno (31,5 mL, 2M em THF, 63 mmol, 75 equiv.) e NaH2P04 (250 mg, 2,08 mmol, 2,5 equiv.) seguida por NaC102 (380 mg, 4,20 mmol, 5,0 equiv.) e a mistura resultante é agitada a 25°C durante 40 minutos. Os voláteis são então removidos sob pressão reduzida e o resíduo é partilhado entre EtOAc (40 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (40 mL) e as fases são separadas. A fase aquosa é então extraída com EtOAc (3 x 40 mL) , e os extractos combinados são secos (MgS04) e em seguida concentrados sob pressão reduzida. A coluna de cromatografia "flash" (sílica gel, 60% éter em hexano) dá o ácido carboxilico 42 como um óleo (956 mg, 100%). Rf = 0,47 (sílica gel, 40% éter em hexano); [oí] 22d -19, 6 (c 0,2, CHC13);IV (filme fino)vmax 3389, 2856, 1711, 1469, 1254, 1085, 988, 835, 775, 705 cm"1,. XH NMR (600 MHz, CDCls) δ 7,44-7,43 (m, 5H, Ph) , 7,29-7,20 (m, 10, 6, 19 (s, 1H, CH=CCH3), 5,49 (dd, J= 7,3, 7,1 Hz C=CHCH2), 4,34 (dd, J = 6,4, 3,3 Hz, 1H, CHOSi) , 4,18 (dd, J= 6,2, 6,2 Hz, 1H, CHOSi), 3,72 (dd, J= 7,2, 1,7 Hz, 1H, CHOSi), 3,45 (d, J= 11,4 Hz, 1H, CH2OTr), 3,41 (d, J= 11,4 Hz, 1H, CH2OTr) , 3,07 (qd, J = 7,0, 7, 0 Hz, 1H, CH3CH(C=0)), 2,46 (dd, J= 16,3, 3,1 Hz, 1H, CH2C02H) , 2,32-2,18 (m, 3H, CJÍ2C02H e C=CHCH2CHOSi) , 1,97 (m, 2H, CH2C (CH2OTr) =CH) , 1,80 (s, 3H, CH=C(CJí3)), 1,31-1,19 (m, 78 ΡΕ1089998 5Η) , 1,19 (s, 3H, C(CH3)2), 1,02 (d, J= 6,9 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,99 (s, 3H, C(CH3)2), 0,87 (s, 27H, Si(CH3)3), 0,80 (d, J = 6,8 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,07 (s, 3H, Si (CH3) ) ,

0,04 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,04 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,03 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,02 (s, 3H, Si(CH3)2, 0,00 (s, 3H, Si(CH3)2; HRMS (FAB) calculado para C60H95lO7Si3 (M+Cs + ) , 1271,4485 encontrado 1271,4550

Hidroxi-ácido 43 como ilustrado no Esquema 8. Uma solução de ácido carboxilico 42 (956 mg, 0,839 mmol, 1,0 equiv.) em THF (17 mL) a 0°C é tratada com TBAF (5,0 mL, 1,0 M em THF, 5,00 mmol, 6,0 equiv.) e a mistura é deixada aquecer até 25 °C durante 19 h. A reacção é então desactivada por adição de solução aquosa saturada de NH4CI (40 mL) e o produto é extraído com EtOAc (3 x 40 mL) . Os extractos orgânicos combinados são secos (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (sílica gel, 5% MeOH em CH2C12) dá o hidroxi-ácido 43 como um óleo amarelo (817 mg, 95%). Rf = 0,27 (sílica gel, 5% MeOH em CH2C12) ; [a] 22D _11,4 (c 0,2, CHC13);IV (filme fino) v: raax 3364, 3057, 2938, 2856, 1712, 1694, 1469, 1254, 1086, 1053, 988, 836, 776, 734, 705 cm-1,- XH NMR (600 MHz, CDC13) δ 7,43-7,42 (m, 5H, Ph) , 7,30-7,21 (m, 10H, Ph) , 6,32 (s, 1H, CH=CCH3), 5,46 (dd, J= 7,2, 7,2 hz, 1H, C=CHCH2), 4,35 (dd, J= 6,3, 3,2 Hz, 1H, CÍÍOH) , 4,21 (dd, J=

6,4 6,3 Hz, 1H, CHOSi), 3,73 (dd, J= 7,3, 1,2 Hz, 1H CHOSi), 3,52 (d, J= 12,1, 1H, CH2OTr), 3, 48 (d, J= 12,1 Hz 1H, CH2OTr) , 3,06 (m, 2H, CH3CH(C=0) e OH) , 2,45 (dd, 0P 16,4, 3,0 Hz, 1H, CH2C02H, ) , 2,35 (m, 2H, C=CHCff2CHOH) , 2,29 79 ΡΕ1089998 (dd, J= 16,4, 6,5 Hz, 1H, CH2C02H) , 2,07-1, 97 (m, 2H, CH2C (Cff2OTr) =CH) , 1,85 (s, 3H, CH=C(Cff3)), 1,71 (m, 1H) , 1,39 (m, 1H, CH(CH3) ) , 1,27 (m, 3H) , 1,18 (s, 3H, C(CH3)2), 1,02 (dupleto mal definido, 3H, CH(CH3)), 1,02 (s, 3H, C(CH3)2), 0,87 (s, 18H, Si (CH3) 3) , 0,81 (d, J= 6,8 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,09 (s, 3H, Si (CH3) 2) , 0,07 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,04 (s, 3H, Si (CH3) 2) , 0,02 (s, 3H, si (ch3) 2); HRMS (FAB) calculado para C54H81IO7SÍ2 (M+Cs+), 1157,3620 encontrado 1157,3669.

Macrolactona 44 como ilustrado no Esquema 8. A uma solução de hidroxi-ácido 43 (1,06 g, 1,04 mmol, 1,0

equiv.) em THF (15 mL; 0,07 M) é adicionado Et3N (870 pL, 0,24 mmol, 6,0 equiv.) e cloreto de 2,4,6-triclorobenzoilo (390 L, 2,50 mmol, 2,4 equiv.). A mistura reaccional é agitada a 0°C durante l,5h, e em seguida é adicionada lentamente durante um periodo de 2 h via uma seringa para puxar uma solução de 4-DMAP (280 mg, 2,29 mmol, 2,2 equiv.) em tolueno (208 mL, 0,005 M baseado em 43) a 75°C. A mistura é agitada aquela temperatura por mais 0,5h e é em seguida concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante é filtrado através de um leito de sílica gel eluíndo com 50% éter em hexano. A cromatografia de coluna "flash" (sílica gel, 17% éter em hexano) dá macrolactona 44 como uma espuma incolor (877 mg, 84%). Rf = 0,19 (sílica gel, 10% éter em hexano); [a]22D -7,4 (c 0,2, CHC13);IV (filme fino' ) vmax 2929, 2855 , 1742, 1695, 1468, 1381, 1253 1156, 1065, 985, 834, 774, 733, 706 cm-1 ; XH NMR (600 MHz CDC13) δ 7, 44-7, 42 (m, LO Ph), 7,29-7, .20 (m, 10H, Ph) 80 ΡΕ1089998 6,39 (s, 1H, CH=CCH3), 5,51 (dd, J= 9,5, 6,8 Hz, 1H, C=CHCH2), 5,07 (d, J= 9,3 Hz, 1H, CHOCO), 4,02 (d, J= 9,2

Hz, 1H, CHOSi), 3,82 (d, J= 8,9 Hz, 1H, CHOSi), 3,46 (d, J= 11,5 Hz, 1H, CH2OTr), 3,42 (d, J= 11,5 Hz, 1H, CH2OTr) , 2,95 (dq, J= 8,7, 7,0 Hz, 1H, CH3CH(C=0)), 2,72 (m, 2H, C=CHCH2CHO e CH2COO) , 2,54 (dd, J= 16,2, 9,7 Hz, 1H, CH2COO) , 2,2 9 (m, 1H, C=CHCH2CHO) , 2,12 (dd, J= 14,3, 5,1

Hz, 1H, CH2C (CH2OTr) =CH) , 1,98 (m, CH2C (CH2OTr) =CH) , 1,88 (s, 3H, CH=C (CH3)) , 1,44-1,23 (m, 5H) , 1/18 (s, 3H, C(CH3)2) , 1,10 (s, 3H, C(CH3)2), 1,07 (d, J= 6,8 Hz, 3H, CH(CH3) ) , 0,92 ((s, 9H, Si(CH3)3), 0,82 (d, J, =6,9 Hz, 3H, CH(CH3)), 0,72 (s, 9H, Si(CH3)), 0,08 (s, 3H, Si(CH3)2, 0,05 (s, 3H, Si(CH3)2), 0,05 (s, 3H, Si(CH3)2), -0,32 (s, 3H,

Si (CH3) 2) ; HRMS (FAB) calculado para C54H79IO6S12 (M+Cs+) , 1139,3514 encontrado 1139,3459.

Triol 24 como ilustrado no Esquema 8. A uma solução de macrolactona 44 (608 mg, 0,604 mmol, 1,0 equiv.) em THF (45 mL) a 0°C e adicionado HF*pir. (15 mL) . A mistura resultante é deixada aquecer até 25°C durante 15h e é então arrefecida a 0°C e desactivada por adição cuidadosa de solução aquosa saturada de NaHC03 (50 mL). O produto é então extraido com EtOAc (3 x 50 mL) , e em seguida os extractos combinados foram secos (MgS04) , e concentrados sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna "flash" (silica gel, 60% EtOAc em hexanos) dá o triol 24 como uma espuma incolor (280 mg, 86%). Rf = 0,32 (sílica gel, 60% EtOAc em hexano) ; [cx] 22D -32,l(c 0,2, CHC13);IV (filme fino) vmax 3413, 2923, 2857, 1731, 1686, 1461, 1259, 1148, 81 ΡΕ1089998 1046, 737 cm-1; 1ti NMR (600 MHz, CDC13) δ 6,43 (s, 1H, CH=CCH3), 5,38 (dd, J= 9,7, 5,4 Hz, 1H, C=CHCH2) , 5,29 (dd, J = 8,8, 1,9 Hz, 1H, CHOCO), 4,08 (m, 1H, CHOH) , 4,06 (d, J= 13,0 Hz, 1H, CH2OH) , 4,00 (d, J= 13,0 Hz, 1H, CH2OH) , 3,69 (dd, J= 3,5, 3,4 Hz, 1H, CHOH) , 3,12 (qd, J= 6,9, 3,1 Hz, 1H, CH3Cff(C=0) ) , 2,76 (bs, 1H, OH), 2,67 (ddd, J= 15,0, 9,7, 9,7 Hz, 1H, C=CHCH2CHO) , 2,45 (dd, J= 15,4, 10,6 Hz, 1H, CH2COO) , 2,38 (bs, 1H, OH), 2,33 (dd, J= 15,4, 3,0 Hz, \—1 CH2COO) , 2,21 (m, 2H, CH2C(CH2OH)=CH) , 2,06 (m, 1H, C=CHCJÍ2CHO) , 1,87 (s, 3H, CH=C(CH3)), 1,71 (m, 1H) , 1, 66 (m, 1H), 1,32 (s, 3H, C(CH3) 2), 1,29-1,24 (m, 3H) , 1,17 (d, J= 6,9 Hz, 3H, CH(CH3)), 1,08 (s, 3H, C(CH3)2), 0,99 (d, J=7, 0 Hz, 3H, CH (CH3) ) ; HRMS (FAB) calculado para C23H37I06 (M+Cs+) 669,0689 encontrado 669,0711.

Polimerização de tubulina e ensaios de citotoxicidade. A polimerização de tubulina é determinada pelo método colorimétrico-filtração, desenvolvido por Bollag et Câncer Res. 1995, 55, 2325-2333. A tubulina purificada (1 mg/mL) é incubada a 37°C durante 30 minutos na presença de cada um dos compostos (20 mM) em tampão MEM [ (lOOmM ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico, pH 6,75, lmM etilenoglicol bis(β-aminoetiléter), ácido Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraacético, e 1 mM de MgCl2] ; a mistura é em seguida filtrada para remover a tubulina que não polimerizou utilizando uma placa de filtração de tamanho de poro 0,22 pm hidrofilica de 96 poços Durapore Multiscreen Millipore; a tubulina polimerizada recolhida é corada com solução de amido negra e guanti- 82 ΡΕ1089998 ficada pela medição da absorvância da solução do corante num Leitor de Microplacas Molecular Devices. O crescimento de todas as linhas de células é avaliado pela quantificação da proteina nas placas de 96 poços como descrito anteriormente. Rapidamente, são semeadas 500 células em cada poço das placas e incubadas com várias concentrações de epotilonas a 37 °C e numa atmosfera húmida com 5% CO2 durante quatro dias. Após fixação da célula com 50% de ácido tricloroacético, a densidade óptica correspondente à quantidade de proteínas é medida em solução de NaOH 25mM (50% metanol: 50% água) num comprimento de onda de 564 nm. A CI50 é definida como a dose de princípio activo requerida para inibir o crescimento das células em 50%.

Lisboa, 4 de Janeiro de 2007

Claims (10)

1. ΡΕ1089998 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto representado pela formula I

   em que a ligação ondulada indica que a ligação "a" é representada pela forma cis ou trans; (i) R2 está ausente ou é oxigénio; "a" pode ser ou uma ligação simples ou dupla; "b" pode estar ausente ou ser uma ligação simples; e "c" pode estar ausente ou ser uma ligação simples, com a condição de que quando R2 é oxigénio então "b" e "c" são ambos uma ligação simples e "a" é uma ligação simples; se R2 está ausente então "b" e "c" estão ausentes e "a" é uma ligação dupla; e se "a" é uma ligação dupla, então R2, "b" e "c" estão ausentes; R3 é um radical seleccionado de um grupo consistindo de hidrogénio; alquilo inferior, especialmente metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo; -CH=CH2; -C=CH; -CH2F; -CH2C1; -CH2-OH; -CH2-0- (Ci-C6_alquilo) , especialmente -CH2-0-CH3; e -CH2-S (Ci-C6alquilo) , especialmente -CH2-S-CH3; 2 ΡΕ1089998 R.4 e R5 são independentemente seleccionados de hidrogénio, metilo ou um grupo protector, preferencialmente hidrogénio, e Ri é um radical seleccionado das seguintes estruturas:

   S-€H3 ou um sal de um composto de formula I onde um grupo que forma sal está presente.
2. 2. Composto de formula I de acordo com a reivindicação 1, em que R2 está ausente ou oxigénio; "a" pode ser ou uma ligação simples ou dupla; "b" pode estar ausente ou ser uma ligação simples; e "c" pode estar ausente ou ser uma ligação simples, com a condição de que quando R2 é oxigénio então "b" e "c" são ambos uma ligação simples e "a" é uma ligação simples; se R2 está ausente então "b" e "c" estão ausentes e "a" é uma ligação dupla; e se "a" é uma ligação dupla, então R2, "b" e "c" estão ausentes; R3 é um radical seleccionado de um grupo consistindo de hidrogénio; alquilo inferior, especialmente metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo; -CH=CH2; -C=CH; - 3 ΡΕ1089998 CH2F; -CH2CI; -CH2-OH; -CH2-0- (Ci-C6-alquilo) , especialmente -CH2-0-CH3; e -CH2-S (Ci-C6alquilo) , especialmente -CH2-S-CH3; R4 e R5 são independentemente seleccionados de hidrogénio, metilo ou um grupo protector, preferencialmente hidrogénio, e Ri é um radical seleccionado das seguintes estruturas

   -C H, ou um sal de um composto de formula I onde um grupo que forma sal está presente.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 de formula Id

   m em que A é metiltio e D é hidrogénio, fluoro, hidroxilo ou metilo.
4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1 de fórmula Ie ΡΕ1089998 4

   m onde A é metilo. metiltio e D é hidrogénio, fluoro , hidroxilo ou
5. 5. Composto de acordo com a reivindicação seleccionado de um grupo consistindo de compostos com seguintes fórmulas: 1, as

   5 ΡΕ1089998 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável onde o grupo que forma o sal está presente.
6. 6. Formulação farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 para utilização no tratamento de uma doença proliferativa.
8. 8. Utilização de um composto de fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a manufactura de um medicamento para o tratamento de uma doença proliferativa.
9. 9. Utilização de uma composição farmacêutica que é adequada para administração a um animal de sangue quente para o tratamento de uma doença proliferativa, compreendendo uma quantidade de um componente activo de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, que é eficiente para o tratamento da referida doença proliferativa, juntamente com pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.
10. 10. Método para a síntese de um composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ΡΕ1089998 6 a) acoplamento de um iodeto de fórmula II,

    em que R3, R4, R5, a, b e c e a ligação ondulada tem o significado da fórmula I na reivindicação 1, com um composto de estanho de fórmula III, (III) Ri~Sn(R)3 em que Ri tem o significado dado na fórmula I e R é alquilo C1-C7, especialmente metilo e n-butilo, ou b) acoplamento de um composto de estanho de fórmula IV,

    em que R3, R4, R5, a, b e c e a ligação ondulada tem o significado da fórmula I, com um iodeto de fórmula V, 7 ΡΕ1089998 Ri-I (V) em que Ri tem o significado dado para a fórmula I na reivindicação 1; e, se desejável, se converter um composto de fórmula I num composto diferente de fórmula I, se converter um composto livre resultante de fórmula I num sal de um composto de fórmula I, e/ou se converter um sal resultante de um composto de fórmula I num composto livre de fórmula I ou num sal diferente do composto de fórmula I, e/ou se separar uma mistura estereoisomérica de compostos de fórmula I nos isómeros correspondentes. Lisboa, 4 de Janeiro de 2007