PL189204B1

PL189204B1 - Zastosowanie 14-O-[1-(R)-2-amino-3-metylobutyrylamino]-2-metylopropan-2-ylotioacetylo]mutyliny w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie akceptowalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciwko chorobie weterynaryjnej

Info

Publication number: PL189204B1
Application number: PL97330726A
Authority: PL
Inventors: David George Sidney Burch; Paul Howard Ripley; Erich Zeisl
Original assignee: Biochemie Gmbh
Priority date: 1996-07-04
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 2005-07-29
Also published as: EP0910363A1; DE69740162D1; ATE509625T1; EP0910363B1; SK285711B6; PT1813272E; PL330726A1; IL127299A0; EP1810672A1; BG64369B1; JP2000514072A; EP1813272B1; RU2197237C2; IL127299A; EP1813272A1; ES2360813T3; HUP9903103A3; HU230325B1; NO986198L; GB9614017D0

Abstract

1. Zastosowanie zwiazku o wzorze I ( I ) w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie akceptowalnej soli do wytwa- rzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobie weterynaryjnej wystepujacej u zwie- rzat podatnych na wtórne zakazenia spowodowane zwiekszona obsada (liczba i wiel- kosc/wiek zwierzat), przy czym wspomniana choroba weterynaryjna jest zwiazana z zaka- zeniem bakteriami wybranymi z grupy zlozonej z Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracel- lularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, oraz ich mieszanin. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I)

w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie akceptowalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobie weterynaryjnej występującej u zwierząt

189 204 podatnych na wtórne zakażenia spowodowane zwiększoną obsadą (liczba i wielkość / wiek zwierząt), przy czym wspomniana choroba weterynaryjna jest związana z zakażeniem bakteriami wybranymi z grupy złożonej z Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, oraz ich mieszanin.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I), zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobom świń. W szczególnie korzystnym wariancie realizacji przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I), zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw zapaleniu okrężnicy świń związanemu z zakażeniem bakteriami Serpulina pilosicoli.

W następnym korzystnym wariancie realizacji przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I), zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw zapaleniu krętnicy u świń związanemu z zakażeniem bakteriami Lawsonia intracellularis.

W kolejnym korzystnym wariancie realizacji przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I), zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobie weterynaryjnej związanej z zakażeniem bakteriami Pasteurella multocida.

W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I), zdefiniowanego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw zapaleniu płuc u jagniąt, owiec lub bydła, związanemu z zakażeniem bakteriami Pasteurella haemolytica.

Zwierzęta cierpiące na choroby weterynaryjne, których ekspresja jest wzmagana przez podwyższoną gęstość obsady inwentarza, nie mogą już np. być leczone przeciwbakteryjnie środkiem według niniejszego wynalazku lub otrzymywać ten środek według niniejszego wynalazku dla pobudzania wzrostu.

A) Zapalenie okrężnicy u świń, związane z zakażeniem przez Serpulina pilosicoli:

Zapalenie okrężnicy można rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych takich, jak: Taylor, D.J., Pig Diseases (Choroby świń), 6 wyd. (1995), wyd. D.J. Taylor, Glasgow, Wielka Brytania, na stronach 148-149. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku w tym zastosowaniu określa są np. w następujący sposób:

1. Wartości MIC:

Badanie obejmuje dziewięć izolatów WBHS z wybuchu czerwonki świń ze stad z biegunką i bez biegunki oraz ATCC 29796 {Serpulina innocens, grupa 3) (Fellstróm, C., Res. Vet. Sci. 59 [1995] 1-4. Identyfikacji dokonuje się na podstawie modelu hemolizy na TSA (Tryticase soy agar, sojowy agar Tryticase) z 5% krwi wołowej, Oraz pfóby wytwarzania indolu i hydrolizy hipuranu (Rosco Diagnostic Tables, Taastrup, Dania). Spośród dziewięciu słabo beta-hemolitycznych krętków jeden przypisano do grupy 2, cztery do grupy 3 oraz pięć do grupy 4 (Fellstróm, tamże). Bakterie przenosi się z płytek agarowych do 0,9% roztworu soli i dobiera mętność do 1,0 w skali McFarlanda, zanim porcje po 0,01 ml każdego izolatu posieje się na płytki agarowe z dwukrotnymi stężeniami następujących środków przeciwbakteryjnych. chlorowodorku walnemuliny, kwaśnego fumaranu tiamuliny, dimetridazolu, chlorowodorku linkomycyny i tylozyny. Rozrost i hemolizę rejestruje się po 4 dniach hodowli beztlenowej i oznacza MIC jako najniższe stężenia antybiotyków, przy których krętki nie rosną.

Wyniki oznaczeń MIC dla WBHS przedstawiono w tabeli 6. W ogólności WBHS były wrażliwe na wszystkie pięć środków przeciwbakteryjnych. Nie było różnic wrażliwości między trzema grupami WBHS dla każdego spośród badanych środków przeciwbakteryjnych. Wartości MIC, otrzymane dla walnemuliny, były najniższe względem 9 spośród 10 szczepów, natomiast były one znacznie wyższe dla ogromnej większości szczepów w przypadku wszystkich czterech związków odniesienia.

Wysoka wrażliwość na walnemulinę obydwu WBHS jest korzystna dla stosowania jej w leczeniu klinicznych przypadków w zakażonych stadach

189 204

Tabela 1

Wartości najmniejszego stężenia powstrzymującego (MIC) dla 10 rodzajów słabo beta-hemolitycznych krętków

Środek przeciwbakteryjny °
MIC ( (tg/ml)	Walnemulina (ch)	Tiamulina (hfu)	Dimetridazol	Linkomycyna	Tylozyna
0,0156	9	4	-	-	-
0,0312	-	2	-	-	-
0,0625	-	3	2	-	-
0,1250	-	-	4	-	-
0,2500	-	-	4	-	-
0,5000	-	-	-	4	-
1,0000	1	1	-	1	-
2,0000	-	-	-	-	2
4,0000	-	-	-	-	-
8,0000	-	-	-	-	1
16,0000	-	-	-	-	-
32,0000	-	-	-	1	-
64,0000	-	-	-	1	-
128,0000	-	-	-	3	-
>128,0000	-	-	-	-	7

¹¹ Figura oznacza liczbę krętków beta-hemolitycznych oznaczanych tygodniowo jako posiadającewartość MIC ch = chlorowodorek hfu = wodorofumaran

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest więc użyteczny w terapii zapalenia okrężnicy u świń, związanego z zakażeniem przez Serpulina pilosicoli. W tym zastosowaniu skuteczne dawkowanie będzie oczywiście różniło się w zależności od określonej stosowanej soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Najczęściej jednak zadowalające wyniki uzyskuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w dziennych dawkach od około 1 mg/kg do 5 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podawanych w podzielonych dawkach od dwóch do czterech razy dziennie, albo dowolnie w paszy lub w wodzie, lub tez w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 10 do około 400 mg, np. od około 10 mg do około 200 mg w celu zapobiegania lub od około 20 mg do około 400 mg w celu leczenia, podawana dowolnie w paszy lub w wodzie, albo raz łub dwa razy dziennie.

Korzystne dawki w wodzie pitnej wynoszą od 0,001 do 0,05% wagowo-objętościowych, zwłaszcza od 0,001 do 0,005%, a w karmie od 20 do 100 g/tonę, zwłaszcza od 20 do 75 g/tonę.

189 204

B) Zapalenie krętnicy u świń, związane z zakażeniem przez Lawsonia intracellularis.

Zakażenie przez Lawsonia intracellularis można rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych takich, jak: Taylor D.J., Pig Diseases, 6 wyd. (1995), wyd. D.J. Taylor, Glasgow, Wielka Brytania, na stronach 154-157. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku w tym zastosowaniu określa się np. w następujący sposób:

1. Działanie in vitro\

Najczęściej stosuje się metodę Lawsona, G.H.K. i in., J. Glin. Microbiol. 31 [1993] 1136-1142, z pewnymi modyfikacjami (standardowe metody krążkowe Kirby-Bauera nie nadają się do bakterii wewnątrzkomórkowych):

Komórki: Warstwy powierzchniowe hodowli komórek enterocytowych szczepów IEC-18 (ATCC CRL 1589) wytwarza się i utrzymuje standardowymi metodami hodowli komórek. Określonego dnia stare warstwy powierzchniowe dzielących się komórek (około 30% zbioru) przygotowuje się do zakażenia w dniu 0 na szkiełkach nakrywkowych w małych fiolkach do hodowli (Tracs).

Materiały inokulacyjne: Jako materiały inokulacyjne stosuje się partie trzech szczepów Lawsonia intracellularis. Pochodzą one od świń, dotkniętych proliferacyjną enteropatią w postaciach proliferacyjnych enteropatii krwotocznej (PHE) i gruczołakowatości jelitowej świń (PIA), i są spreparowane z jelit świń oraz pasażowane w hodowli komórek, jak to opisano w wyżej wymienionej publikacji Lawsona. Dwa szczepy PHE częściowo przebadano na chorobotwórczość u świń, jak to opisano w publikacji: McOrist, S. i in., Infect. Immun. 61 (1993) 4286-4292. Partie materiałów inokulacyjnych zbiera się po szeregu pasażowań komórek i przechowuje w stanie zamrożonym w -70°C w 1 ml fiolkach. Z wstępnych prób ustalono odpowiednie rozcieńczenia w odtajanych fiolkach, które powodowałyby łatwo rozpoznawalne zakażenia komórek w pięciodniowych próbach.

Antybiotyki przygotowuje się w postaci 100x roztworów podstawowych do każdego zastosowania. Działanie każdej partii antybiotyku potwierdza się standardową metodą krążkową Kirby-Bauera z użyciem laboratoryjnego szczepu Escherichia coli.

Zakażanie: W dniu 0 fiolki z każdym szczepem poddaje się odtajaniu i rozcieńcza od 1/8 do 1/32 pożywką hodowlaną w celu zastosowania w czterech grupach, od 1 do 4.

Dla grupy 4 (ciągłego leczenia) ten materiał inokulacyjny najpierw inkubuje się w 37°C przez godzinę na pożywce hodowlanej, zawierającej antybiotyk w różnych stężeniach, przed dodaniem do komórek.

Dla grupy 3 (działania pozakomórkowego) ten materiał inokulacyjny przygotowuje się na pożywce hodowlanej, zawierającej antybiotyk w różnych stężeniach, dodawany tuż przed momentem dodawania do komórek.

Dla grupy 1 (kontrolnej) i grupy 2 (działania wewnątrzkomórkowego) materiały inokulacyjne przygotowuje się na pożywce hodowlanej, nie zawierającej antybiotyków, i dodaje do komórek. Fiolki hodowlane (Tracs) z komórkami i dodanym materiałem inokulacyjnym (+/- antybiotyki) w ogólnej objętości 0,5 cm³ pożywki umieszcza się w stalowych słoikach, wytwarza próżnię do 40% ciśnienia atmosferycznego (8% O₂), pozostawia na 2 min i ponownie napełnia wodorem, a w końcu 10% CO₂. Następnie wyjmuje się te fiolki ze słoików i umieszcza w zestawie inkubatorów w celu zapewnienia wilgotnej atmosfery, zawierającej 8% O₂, 8,8% CO₂ i resztę azotu, w 37°C.

W dniach 1 oraz 2 wszystkie fiolki wyjmuje się i zasila świeżą pożywką albo zawierającą antybiotyki (grupy 2 oraz 4), albo nie zawierającą antybiotyków (grupy 1 oraz 3) i ponownie umieszcza w inkubatorze. Piątego dnia wszystkie szkiełka nakrywkowe wyjmuje się i barwi na Lawsonia intracellularis pośrednim barwnikiem immunoperoksydazowym, wprowadzającym specjalne przeciwciało monoklonalne. Liczbę komórek na każdym szkiełku nakrywkowym, ciężko zakażonych przez Lawsonia intracellularis (> 30 na komórkę, ciężko zakażona komórka - HIC), wykorzystuje się jako główny miernik zakażenia. Rejestruje się również liczbę ognisk HIC oraz ogólne obserwacje komórek. HIC w grupie kontrolnej (grupa 1), próby na działający wewnątrzkomórkowo antybiotyk (grupa 2), próby na działający pozakomórkowo antybiotyk (grupa 3) i próby ciągłego leczenia (grupa 4) porównuje się w trzech

189 204 równoległych próbach, z których każda dotyczy do 3 szczepów. Niektóre próby powtarza się dla różnych mocy materiałów inokulacyjnych. Procentowe stosunki oblicza się po obliczeniu pochodnych średniej HIC grupy kontrolnej w powiązaniu z badanymi grupami. Średnia HIC grupy kontrolnej oznacza liczbą HIC w kontrolnych fiolkach, podzieloną przez liczbę zakażonych fiolek kontrolnych. Procentowy stosunek w badanych fiolkach oblicza się następnie, dzieląc ich wartości HIC przez średnią wartość HIC grupy kontrolnej i mnożąc przez 100 w celu uzyskania wartości procentowej. Oznacza to, że badane fiolki, w których antybiotyki nie wywołują żadnego skutku, będą wykazywały procentowe stosunki około 100, a fiolki, w których antybiotyki całkowicie powstrzymują wzrost, będą wykazywały stosunek 0.

Wyniki uzyskane z użyciem chlorowodorku walnemuliny przedstawiono w tabeli 2, która przedstawia procentowy udział komórek, które pozostająniezakażone po leczeniu.

Tabela 2

Procentowe stosunki zakażenia przez Lawsonia intracellularis hodowli komórkowej z dodatkiem walnemuliny

Stężenie walnemuliny (ch) (Mg/ml)	Szczep, grupa	Szczep, grupa
2	3	4	2	3	4
8	0	0	0	0,86	0,2	0,5
0	0	0	0	0	1,4
0	0	0	0	1,4	0,2
4				0	0	0,8
			0	0,83	2,5
			1,7	1,7	2,5
2	0	0	0
0	0	0
0	-	28

ch = chlorowodorek

Wyniki te wskazują, że najmniejsze stężenie chlorowodorku walnemuliny, powodujące znaczne powstrzymanie wzrostu Lawsonia intracellularis (< 1% wzrostu) wynosi < 2 pg/cm³.

2. Badania prowokacyjne:

Trzydzieści pięć prosiąt świeżo odstawionych od matki prowokuje się tego samego dnia wirulentnym materiałem inokulacyjnym zawierającym Lawsonia intracellularis (szczep LR 189/5/83), izolatem czynnika powodującego proliferacyjną enteropatię u świń, otrzymanym przez hodowlę w linii komórek enterocytowych IEC-18 szczura (ATCC CRL 1589), jak to opisano w publikacji: Lawson i in., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142. Siedmiu prosiętom kontrolnym podaje się roztwór buforowy. Siedem spośród 21 prowokowanych prosiąt pozostaje bez leczenia. Tych siedem prosiąt wykazało zmniejszony przyrost masy i u wszystkich rozwinęły się zmiany chorobowe proliferacyjnej enteropatii, wykryte w skrawkach jelit, pobranych podczas sekcji po upływie trzech tygodni od prowokacji. Sześć spośród tych siedmiu prosiąt miały wyraźnie widoczne zmiany chorobowe, a trzy z nich łagodną lub umiarkowaną biegunkę w dwa tygodnie po prowokacji. Dla zbadania strategii dawkowania „zapobiegawczego” dwu innym grupom prowokowanych prosiąt dawkuje się do pyska chlorowodorek walnemuliny w dawkach odpowiednio 25 ppm i 75 ppm (tj. 1,25 mg/kg i 3,7 mg/kg) jako

189 204 domieszkę podawaną dwa dni przed prowokacją z kontynuacją aż do eutanazji. Dla zbadania strategii „leczenia” dwu innym grupom prowokowanych prosiąt dawkuje się doustnie walnemulinę na poziomie 25 ppm i 75 ppm jako domieszkę podawaną siedem dni po prowokacji z kontynuacją aż do eutanazji.

Żadne zmiany chorobowe proliferacyjnej enteropatii nie były widoczne w skrawkach jelit, pobranych podczas sekcji, u 3 spośród 7 prosiąt z grupy zapobiegania oraz u 5 spośród 7 prosiąt z grupy leczenia. Prosięta kontrolne pozostały normalne. Walnemulina zapobiegła więc chorobie lub wyleczyła z choroby w przypadku dużej części prowokowanych prosiąt nawet przy niskich stosowanych dawkach otrzymywanego leku.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest wiec użyteczny w terapii zapalenia krętnicy u świń, związanego z zakażeniem przez Lawsonia intracellularis. W tym zastosowaniu skuteczne dawkowanie będzie oczywiście różniło się w zależności od określonej stosowanej soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Najczęściej jednak zadowalające wyniki uzyskuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w dziennych dawkach od około 1,5 mg/kg do około 6,5 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podawanych dowolnie w wodzie lub w paszy, albo w podzielonych dawkach od dwóch do czterech razy dziennie, lub też w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 10 mg do około 1000 mg, korzystnie od około 15 mg do około 500 mg, podawana raz lub dwa razy dziennie.

Korzystne dawki w wodzie pitnej wynoszą od 0,001 do 0,05% wagowoobjętościowych, zwłaszcza od 0,001 do 0,005%, a w karmie od 20 do 400 g/tonę, zwłaszcza od 20 do 200 g/tonę.

C) Wtórne zakażenie przez Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae i/lub Haemophilus parasuis:

Wtórne zakażenie przez Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae i/lub Haemophilus parasuis można w rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych takich, jak: Taylor, D.J., Pigs Diseases (Choroby świń), 6 wyd., (1995), wyd. D.J. Taylor, Glasgow, Wielka Brytania, na stronach 185-187; 188-194; oraz 194-197. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku w tym zastosowaniu oznacza się np. w następujący sposób:

Oznacza się najmniejsze stężenie powstrzymujące (MIC) chlorowodorku walnemuliny przeciw świeżym izolatom Pasteurella multocida, Haemophilus pleuropneumoniae i Haemophilus parasuis, pochodzącym z materiału dróg oddechowych świń, i porównuje z tiamuliną. Stosuje się hodowle izolatów bakteryjnych, zawierających 10 P. multocida, 10 H. pleuropneumoniae i 3 H parasuis, wyizolowanych w granicach ostatnich 5 lat z chorych świń, uznanych za takie w badaniach pośmiertnych. Trzy spośród izolatów Pasteurella były toksynotwórczymi szczepami Pasteurella multicida. W przypadku H. pleuropneumoniae i H. parasuis dzień przed próbą pojedyncze ezy każdej z czystych hodowli inokuluje się do 10 ml bulionu Todd & Hewitt (Unipath CM 190), zawierającego 1% donorowej surowicy cielęcej i 2 mg/ml dwunukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD). W przypadku P. multocida w dniu próby pojedyncze ezy każdej z czystych hodowli inokuluje się do 10 ml odżywczego bulionu nr 2 (Unipath CM67), zawierającego 1% donorowej surowicy cielęcej. Wszystkie przygotowane hodowle bulionowe inkubuje się przez 18 godzin w 37°C w 10% CO 2. Po inkubacji w dniu próby doprowadza się 23 hodowle bulionowe do zawartości 10⁵ - 10⁶ organizmów w ml przez rozcieńczanie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej jako przygotowanie do inokulacji pożywki hodowlanej MIC. Dla każdego badanego związku przygotowuje się również standardowe hodowle kontrolne Oxford Staphylococcus aureus NCTC 6571 w celu uwiarygodnienia wyników prób MIC. We wszystkich przypadkach hodowle bulionowe przygotowane z kontrolnych organizmów są identyczne, jak hodowle organizmów badanych. Walnemulinę stosuje się w postaci chlorowodorku, a tiamulinę w postaci kwaśnego fumaranu. W dniu próby przygotowuje się podstawowe roztwory badanych związków, zawierające 3,2 mg/ml czynnego składnika w sterylnej wodzie destylowanej. Następnie przygotowuje się dziewięć dwukrotnych rozcieńczeń w sterylnej wodzie destylowanej, tworzących dla każdego antybiotyku

189 204 zakres od 320 pg do 1,25 pg w 1 ml, do wprowadzania do pożywki MIC. Uczulony agar (Oxoid CM409), zawierający lizowaną krew końską (Oxoid SR50), przygotowuje się według zaleceń wytwórcy i w razie potrzeby doprowadza do pH = 7,4. Do wszystkich serii pożywek MIC przygotowanych do prób MIC przeciw dwu odmianom Haemophilus, dodaje się 2 mg NAD na 1 ml dla zapewnienia niezbędnego czynnika wzrostu. 18 ml stopionego agaru (50°C) miesza się z 2 ml (jednego z dziesięciu rozcieńczeń) każdego z przygotowanych rozcieńczeń badanego związku na płytkach Petriego 90 mm. Dla każdego rozcieńczenia przygotowuje się cztery równolegle płytki. Dla każdej próby MIC przygotowuje się również 4 równoległe płytki, zawierające 18 ml agaru i 2 ml sterylnej wody destylowanej, działające jako wskaźniki wzrostu.

Suche płytki MIC posiewa się 0,2 pl przygotowanych badanych organizmów. Płytki z P. multocida inkubuje się w powietrzu w 37°C przez 18 godzin, a płytki inokulowane H. pleuropneumoniae i H. parasuis inkubuje się w 37°C przez 18 godzin w 10% CO2. Po inokulacji bada się wzrost organizmów początkowo gołym okiem, a następnie badaniami mikroskopowymi na stereozoomomikroskopie. Wartość MIC przyjmuje się jako najniższe stężenie badanego związku, przy którym w badaniach mikroskopowych nie można wykryć wzrostu w miejscu inokulacji na wszystkich czterech płytkach. Otrzymane wyniki przestawia tabela 3:

Tabela 3

Wartości MIC (pg/ml)

Czynnik chorobotwórczy	Zwikzek
Walnemulina (ch)	Tiamulina (hfu)
Pasteurella multocida
Zakres	2,0-8,0	4,0-16
Średnio	3,8	9,2
Haemophilus pleoropneumoniae
Zakres	0,125-4,0	0,125-16
Średnio	0,85	4,5
Heamophilus parasuis
Zakres	0,25	0,5-1,0
Średnio	0,25	0,7

ch - chlorowodorek hfu - wodorofumaran

Widać z niej, że walnemulina w porównaniu z tiamuliną wykazała średni 2,5-krotny wzrost działania przeciw P. multocida, 5,5-krotny wzrost przeciw H. pleuropneumoniae i trzykrotny wzrost przeciw H. parasuis.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest więc użyteczny w terapii wtórnego zapalenia płuc u świń, związanego z zakażeniem przez Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae i/lub Haemophilus parasuis. W tym zastosowaniu skutecznie działające dawki będą oczywiście zmieniać się w zależności od rodzaju poszczególnych stosowanych soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w celu terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Zazwyczaj jednak zadowalające wyniki otrzymuje się wówczas, gdy środek ten

189 204 podaje się w dziennych dawkach od około 5 mg/kg do około 15 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podawanych dowolnie w wodzie lub karmie, albo w dawkach podzielonych od dwóch do czterech razy dziennie, lub też w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 100 mg do około 1000 mg, korzystnie od około 100 mg do około 500 mg, podawana raz lub dwa razy dziennie. Korzystne może być podawanie go w charakterze wyłącznej terapii.

Korzystne dawki w wodzie pitnej wynoszą od 0,01 do 0,05% wagowo-objętościowych, zwłaszcza od 0,01 do 0,025%, a w karmie od 100 do 400 ppm (g/tonę), zwłaszcza od 100 do 200 ppm.

D) Zapalenie płuc u jagniąt, owiec i bydła domowego, związane z zakażeniem przez Pasteurella haemolytica'.

Zakażenie przez Pasteurella haemolytica można rozpoznawać powszechnie znanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych takich, jak Veterinary Medicine (Medycyna weterynaryjna), 8 wyd. (1994), wydawcy: Radostits, O.M., Blood, D.C. i Gay, C.C., Publ. Bailliere Tindall, Londyn, Wielka Brytania, na stronach 748-770. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku w tym zastosowaniu oznacza się in vivo np. w następujący sposób:

Oznacza się kliniczną skuteczność działania dwóch kompozycji chlorowodorku walnemuliny w terapii zapalenia płuc u cieląt, spowodowanego kontrolowanym zakażeniem przez Pasteurella haemolytica Al:

W szóstym dniu 24 cielęta, u których pobrano wymazy nosowe i stwierdzono, że nie zawierają one P. haemolytica Al, waży się i przydziela po sześć do czterech grup leczenia, bilansując je według żywej wagi i równego rozkładu płci w tych grupach. Cielęta te chowa się w pomieszczeniach w osobnych zagrodach w konwencjonalnym cielętniku, gdzie aklimatyzują się przez 33 dni przed przydzielaniem do grup. W tej fazie wstępnych badań dwukrotnie pobiera się próbki krwi do analizy na przeciwciała leukotoksyn jako ewentualne wskaźniki wcześniejszego wystawienia na wpływ P. haemolytica Al.

Terapię zaczyna się w dniu -1, około 27 godzin przed czasem prowokacji: grupa 1 kontrolna; grupa 2 - 2,5% cholorowodorek walnemuliny do wstrzykiwania (2,5 mg/kg dwa razy dziennie); grupa 3 - 10% chlorowodorek walnemuliny w domieszce podawany doustnie przez podajnik mleka dla cieląt (5,0 mg/kg dwa razy dziennie).

Wszystkie cielęta poddaje się prowokacji w dniu 0 przez wewnątrzoskrzelowe osadzenie 30 ml hodowli bulionowej Pasteurella haemolytica Al (M4/1/3, Moredun Research Institute - 1,25 x 10⁷ cfu/ml) z wykorzystaniem bronchoskopu z włóknami optycznymi. Badania kliniczne prowadzi się raz dziennie w dniach -3 oraz -2 i dwa razy dziennie od dnia -1 do 3. Kliniczną punktację rozdziela się na każdy z czterech następujących parametrów: temperatura w odbycie, częstość oddechów, charakter oddychania i sposób zachowania się. Bada się również miejsca wstrzyknięć. Każde z cieląt, które jest leżące lub półleżące i/lub wykazuje depresję i/lub objawy ostrego wyczerpania oddechowego, albo które ma ogólną punktację kliniczną wyższą od 5 w pojedynczym badaniu w dniach od 0 do 3, poddaje się niezwłocznie humanitarnej eutanazji przez dożylne podanie śmiertelnej dawki soli sodowej pentobarbitolu BP (Vet) w stężeniu 20% wagowo-objętościowych i w ciągu 24 godzin dokonuje się sekcji. Cielęta, które przeżyją do dnia 4 po prowokacji przez P haemolytica, poddaje się eutanazji w dniu 4 w ten sam sposób, jak poddawane eutanazji w dniach 0-3. Płuca wyjmuje się z wszystkich cieląt i ocenia wizualnie utrwalone zmiany chorobowe oraz zrosty opłucnowe. Próbki tkanki płuc wycina się z ośmiu standardowych miejsc i bada na obecność P. haemolytica w celu określenia wartości wskaźnika izolacji. Od cieląt, które padają w wyniku ostrości choroby, pobiera się wymazy krwi z serca i bada je na obecność P haemolytica..

Wszystkie parametry: ogólną kliniczną punktację, punktację utrwalonych zmian chorobowych, wskaźnik izolacji, punktację zapalenia opłucnej i ogólną punktacją, oblicza się dla poszczególnych cieląt i całych grup, jako średnie z grup i mediany z grup. Wszystkie kategorie

189 204 tworzące ogólną punktację kliniczną: temperaturę w odbycie, częstość oddechów, charakter oddychania i sposób zachowania się, oblicza się dla poszczególnych cieląt i całych grup, jako średnie z grup i mediany z grup. Stosuje się podstawową analizę testem Kruskala-Wallisa (Minitab 9) w celu oznaczenia, czy występują, jakieś różnice między jakimikolwiek punktacjami grup dla każdego z parametrów: ogólnej punktacji klinicznej, punktacji utrwalonych zmian chorobowych, wskaźnika izolacji, punktacji zapalenia opłucnej i ogólnej punktacji. Istotność testu Kruskala-Wallisa wskazuje, ze grupy te nie wszystkie są takie same, ale także, iż nie wszystkie są różne. Dla zbadania, które grupy są różne, zbadano pary grup z wykorzystaniem testu Manna-Whitneya (Minitab 9).

W porównaniu z nieleczonymi cielętami (grupa 1) stwierdzono, że ogólne punktacje kliniczne (p = 0,13) są znacznie niższe dla cieląt, które leczono 10% domieszką walnemuliny w dawkach 5,0 mg/kg, podawanych doustnie dwa razy dziennie przez podajnik mleka dla cieląt przez okres pięciu dni, zaczynając 27 godzin przed prowokacją przez P. haemolytica Al.

Ogólne punktacje kliniczne uległy również zmniejszeniu, ale statystycznie w sposób nieznaczny, u cieląt leczonych domięśniowo 2,5% walnemuliny wstrzykiwaną w dawkach 2,5 mg/kg dwa razy dziennie przez okres pięciu dni, zaczynając. 27 godzin przed prowokacją przez P. haemolytica Al.

Nie występowały znaczne różnice między grupami leczonymi, jeśli porównywano ogólną punktację kliniczną..

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest wiec użyteczny w terapii zapalenia płuc u jagniąt, owiec i bydła domowego, związanego z zakażeniem przez Pasteurella haemolytica. W tym zastosowaniu skutecznie działające dawki będą oczywiście zmieniać się w zależności od rodzaju poszczególnych stosowanych soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w celu terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Zazwyczaj jednak zadowalające wyniki otrzymuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w dziennych dawkach od około 5 mg/kg do około 15 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podawanych dowolnie w karmie, albo w podzielonych dawkach od dwóch do czterech razy dziennie, lub też w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 250 mg do około 3000 mg, korzystnie od około 250 mg do około 1000 mg, podawana raz lub dwa razy dziennie, albo podawana dowolnie w karmie.

Ponadto związek o wzorze (I), jak zdefiniowano powyżej, jest użyteczny w następujących zastosowaniach:

E) Zakażenie przez Mycoplasma hyopneumoniae:

Zakażenie przez Mycoplasma hyopneumoniae można rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych, takich, jak: Taylor, D.J., Pig Diseases (Choroby świń), 6 wyd. (1995), wydawca DJ. Taylor, Glasgow, Wielka Brytania, na stronach 164-165. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku w tym zastosowaniu można określić np. następującymi sposobami:

1. Działanie in vitro\

W próbach wykorzystuje się polowe izolaty z wybuchów enzootycznego zapalenia płuc w różnych stadach oraz typ szczepu „J”. Izolaty te klonuje się na sączku, identyfikuje testem powstrzymywania wzrostu krążków i stosuje w prasazowaniach od 7 do 10. Próbę na najmniejsze stężenie powstrzymujące (MIC) wykonuje się w ciekłej pożywce (Friis, N.F. i in., Acta Vet. Scand. 32 [1991] 425-429) w probówkach 1,8 cm³, zawierających 2-krotne stężenie walnemuliny i kwaśnego fumaranu tiamuliny. Mykoplazmy stosuje się do zakażania w 10-kro-tnych rozcieńczeniach, a wzrost hodowli odczytuje się wizualnie z zastosowaniem probówek z posiewem zawierającym od 10² do 10⁴ jednostek dających zabarwienie. Pierwszy odczyt wykonuje się po 2-4 dniach, a końcowy odczyt po 10-14 dniach, gdy już nie występuje dalszy postęp w zmianie barwy. MIC określa się jako najniższe stężenie badanego związku, wykazujące powstrzymywanie wzrostu w porównaniu z próbką kontrolną (Friis, N.F. i Szancer, J., Acta Vet. Scand. 35 [1994] 389-394).

189 204

Wyniki przedstawiono w tabeli 4

Tabela 4 MIC (pg/cnf)

Numer szczepu	Walnemulina (ch)	Tiamulina (hfu)
początkowo	końcowo	początkowo	końcowo
1	0,0010	0,0025	0,025	0,050
1	0,0010	0,0025	0,025	0,100
3	0,0010	0,0025	0,050	0,100
5*	0,0025	0,0025	0,050	0,100
1	0,0025	0,0025	0,100	0,100

* zawiera typowy szczep ch = chlorowodorek hfu = kwaśny fumaran

Wszystkie badane szczepy Mycoplasma hyopneumoniae są bardzo wrażliwe na działanie walnemuliny z wartościami MIC 10-40-krotnie mniejszymi od tych wartości dla tiamuliny, zarówno przy początkowych, jak i końcowych odczytach, co czyni ten związek szczególnie interesującym dla zastosowań w leczeniu klinicznych przypadków w zakażonych stadach.

2. Działanie in vitro

Próbki tkanki otrzymuje się z płuc świń z różnych stad dotkniętych enzootycznym zapaleniem płuc świń (EPP). Próbki te przesyła się do hodowli w suchym lodzie. Mycoplasma hyopneumonie odzyskuje się ze świeżo odciętej tkanki płucnej przez bezpośrednią hodowlę na agarze do doświadczeń z mykoplazmą (Mycoplasma Experience). Ta technika umożliwia rozpoznanie charakterystycznych kolonii Mycoplasma hyopneumoniae i łatwe ich oddzielenie przez klonowanie od innych szybciej wzrastających odmian mykoplazmy, takich jak Mycoplasma hyorhinis, często występująca w próbkach 21 płuc z EPP. Izolaty hoduje się następnie i identyfikuje przez powstrzymywanie wzrostu krążków z zastosowaniem specjalnej króliczej surowicy odpornościowej, wyhodowanej do Mycoplasma hyopneumoniae NCTC 10110.

Hodowle do prowokacji antybiotykowej wytwarza się w bulionie do doświadczeń z mykoplazmą (Mycoplasma Experience), inkubując je aerobowo w 36°C.

Do wydzielania Mycoplasma hyopneumoniae z tkanki płucnej używa się stalą pożywkę, dostępną w handlu (Mycoplasma Experience Ltd.). Do prób MIC stosuje się ciekłą pożywkę (Mycoplasma Experience Ltd.), zawierającą czerwień fenolową oraz glukozę (pH 7,6). Roztwory podstawowe badanego związku przygotowuje się o stężeniu 1 mg/cm3 w wodzie dejonizowanej, sterylizuje przez filtrację przez filtry błonowe o wymiarach porów 0,2 pm. (Sartorius Minisart, N) i przechowuje w -20°C. Do użycia w próbach MIC te roztwory podstawowe rozcieńcza się ciekłą pożywką do dwukrotnych wymaganych stężeń końcowych. Próby MIC przeprowadza się metodą Tannera & Wu, Avian Diseases 36 (1992) 714-717. Aktywnie rosnące hodowle do prowokacji wytwarza się albo z 1 cm³ porcji hodowli bulionowych przechowywanych w -70°C, albo z hodowli przechowywanych na agarze w -70°C. Hodowle do prowokacji rozcieńcza się, otrzymując docelowe miano od 10 uo 10⁵jednostek zmieniających barwę na 1 cm3. Porcje 0,1 cm3 prowokujących materiałów inokulujących miesza się z 0,1 cm3 porcjami rozcieńczonego antybiotyku we wgłębieniach do mikromiareczkowania. Każda płytka do mikromiareczkowania zawiera nieinokulowane pożywki o pH 6,8 (Mycoplasma hyopneumoniae) (kontrola punktu końcowego) oraz inokulowane do prowokacji próbki kontrolne

189 204 bez antybiotyku. Wszystkie płytki szczelnie zamyka się folią adhezyjną i inkubuje aerobowo w 36°C. Wartości MIC odczytuje wówczas, gdy zmiana barwy we wgłębieniach kontrolnych prowokacji odpowiada pH kontroli punktu końcowego. MIC oznacza najniższe stężenie, wykazujące brak zmiany barwy.

W tabeli 5 przedstawiono wyniki dla walnemuliny oraz dwóch związków odniesienia: tiamuliny i enrofloksacyny:

Tabela 5

Wrażliwość in vitro dziesięciu izolatów polowych Mycoplasma hyopneumoniae

Antybiotyk	MIC (pg/cm¹)	Typowy szczep J
Szczepy polowe (n = 10)	(NCTC10110)
50%	90%	Zakres
Walnemulina (ch)	0,0005	0,001	0,00025-0,0010	0,0025
Tiamulma (hfu)	0,0250	0,050	0,01000-0,0500	0,1000
Enrofloksacyna	0,0050	0,010	0,00250-0,0250	0,0250

Stwierdzono, że wszystkie szczepy są bardzo silnie wrażliwe na walnemulinę. Większość szczepów wykazuje bardzo dobrą wrażliwość na enrofloksacynę, ale w przypadkach poszczególnych szczepów wartości MIC są przynajmniej pięciokrotnie niższe, nawet tych, które są wrażliwe na 0,0025 pg/ml enrofloksacyny. Wyniki te potwierdzają że izolaty polowe są nadzwyczaj wrażliwe na walnemulinę.

3. Wywoływanie oporności

Szczep odniesienia Mycoplasma hyopneumoniae NCTC 10110 (otrzymany z National Collection of Type Cultures, Londyn, Wielka Brytania) oraz świeży izolat połowy (MEVT G23) hoduje się aerobowo w 36°C w bulionie glukozy mykoplazmowej, zawierającym czerwień fenolową, aż wystąpi zmiana barwy na wskazującą na odczyn kwaśny. Po dodaniu sterylnej gliceryny (5% objętościowych) hodowle te rozdziela się na porcje po 1 ml i zamraża w -70°C. Hodowle te używa się do inicjowania dalszych hodowli bulionowych, które miareczkuje się w celu otrzymania liczby jednostek zmieniających barwę (ccu) na płytkach do miareczkowania po inkubacji (36°C). Replikacja umożliwia prowokowanie różnych rozcieńczeń antybiotyku z góry założoną liczbą ccu w próbach określania najmniejszego stężenia powstrzymującego (MIC) oraz w pierwotnym pasażowaniu w badaniach przyzwyczajania. Dostępną w handlu pożywkę (Mycoplasma Experience Ltd.), zawierającą glukozę i czerwień fenolową (MEGB), stosuje się w warunkach pH = 7,6. Podstawowe roztwory badanego związku przygotowuje się w dejonizowanej wodzie w stężeniu 1000 pg/cm³. Po odwirowaniu roztwory te sterylizuje się przez filtrację przez filtry błonowe o wymiarach porów 0,2 pm (Sartorius Minisart, N). Do stosowania w próbach MIC rozcieńcza się te roztwory podstawowe bulionem mykoplazmowyrn do wymaganego podwójnego stężenia końcowego. W badaniach przyzwyczajania te roztwory podstawowe rozdziela się na porcje po 1 ml i zamraża w -20°C. Roztapia się je i używa w odstępach 5-7-dniowych do przygotowywania serii rozcieńczeń leku (serie dublowane) w MEGB w porcjach po 1,9 ml, obejmujących wartości MIC przeciw obydwu szczepom Mycoplasma hyopneumoniae. Chlorowodorek oksytetracykliny przygotowuje się świeży dla każdego przypadku. Zakresy rozcieńczeń zmienia się stopniowo od pasażowania do pasażowania, aby umożliwić wywołanie oporności mykoplazm.

189 204

Procedura przeprowadzania testu:

Próby MIC prowadzi się metodą Tannera & Wu, Avian .Diseases 36 (1992) 714-717 przed prowadzeniem badań przyzwyczajania (niżej) i po dziesiątych pasażowaniach miesza się w zagłębieniach do mikromiareczkowania porcje po 0,1 ml rozcieńczeń badanego związku z porcjami po 0,1 ml prowokujących materiałów inokulacyjnych, zawierających od 10³ do 10⁵jednostek zmieniających barwę (ccu) w 1 ml. Każda płytka do mikromiareczkowania zawiera pożywkę nieinokulowaną, pożywkę o pH = 6,8 (kontrola punktu końcowego) oraz kontrolne próbki prowokowane przez inokulację, ale nie zawierające leku. Wszystkie płytki zamyka się szczelnie i inkubuje aerobowo w 36°C. Wartości MIC rejestruje się wówczas, gdy zmiana barwy w kontrolnych zagłębieniach prowokowanych odpowiada kontrolnej wartości pH = 6,8 (pomarańczowo-żółtej). Wartość MIC oznacza najniższe stężenie, nie wykazujące zmiany barwy.

Badania przyzwyczajania: W pierwotnym doświadczeniu pasażowania objętości po 1,9 ml roztworów antybiotyków w stężeniach obejmujących MIC dla badanych szczepów Mycoplasma hyopneumoniae inokuluje się 0,1 ml hodowli bulionowej, zawierającej od 103 ccu/ml do 105 ccu/ml. w każdym doświadczeniu pasażowania dołącza się kontrolną próbkę hodowli, zawierającą bulion inokulowany przez Mycoplasma hyopneumoniae, ale nie zawierającą leku, oraz kontrolną próbkę pożywki nieinokulowanej. Po 7 dniach inkubacji (36°C) buliony zawierające lek o dwóch najwyższych stężeniach, wykazujących zmianę barwy na kwaśną, zbiera się i stosuje do inkubacji świeżej serii rozcieńczeń leku w bulionie mykoplazmowym (0,1 ml hodowli do 1,9 ml bulionu zawierającego lek). Proces ten powtarza się co 5-7 dni aż do 10 pasażowań. Gdy szczepy mykoplazmy staną się oporne na poszczególne antybiotyki, albo przy dziesiątym pasażowaniu, każdy szczep hoduje się jeszcze raz w bulionie zawierającym lek i oznacza wartości MIC.

Wyniki: Wartości MIC szczepu Mycoplasma hyopneumoniae „J” oraz izolatu polowego przed wystawieniem na wpływ antybiotyków oraz po tym wystawieniu przedstawiono w tabeli 6:

Tabela 6

Wywoływanie oporności in vitro dwóch szczepów Mycoplasma hyopneumoniae

Związek	Szczep	Pierwotne pasażowanie (pg/ml)	Po pasażowaniu MIC doP 10/P11^l)(pg/ml)	Wzrost oporności (krotność wzrostu)
Walnemulina (ch)	NCTC10110	0,0025	0,005	2
Izolat polowy	0,0010	0,0025	2,5
Winian tylozyny	NCTC10110	0,2500	> 500²¹	>2000
Izolat polowy	0,1250	62,51	500
Chlorowodorek oksytetracykliny	NCTC10110	0,2500	1,0	4
Izolat polowy	0,2500	1,0	4

1) Poziom pasażowania in vitro;

2) Wartości MIC po 8 pasażowaniach w bulionie mykoplazmowym zawierającym tylozynę.

189 204

Stwierdzono, że przed wystawieniem na wpływ antybiotyku obydwa szczepy były bardzo silnie wrażliwe na walnemulinę, wykazując wartości MlC 0,0025 pg/cm³ w przypadku szczepu odniesienia oraz 0,001 pg/cm³ w przypadku izolatu polowego. Te poziomy działania były 50-100 razy wyższe, niż w przypadku tylozyny i oksytetracykliną··. Otrzymane wyniki wartości MIC wykorzystano do wyboru zakresu rozcieńczeń leków w badaniach przyzwyczajania.

Po 10 cyklach wystawienia na wpływ walnemuliny wywołanie oporności było minimalne w przypadku obydwóch szczepów Mycoplasma hyopneumoniae, podwyższające wartości MIC z 0,0025 pg/ml do 0,005 pg/ml oraz z 0,001 pg/ml do 0,0025 pg/ml odpowiednio dla szczepu odniesienia i dla izolatu polowego. Natomiast w obydwóch tych szczepach Mycoplasma hyopneumoniae została wywołana znaczna oporność na winian t^lozyny W przypadku szczepu odniesienia oporność pojawiła się w obszarze pasażowania z 4 na 5, w bulionie zawierającym tylozynę, a przy ósmym pasażowaniu wartość MIC wzrosła powyżej 500 pg/ml, co odpowiada ponad 2000-krotnemu wzrostowi oporności na ten antybiotyk (tabela 3). Znaczna oporność na tylozynę została wywołana w izolacie polowym w obszarze 8, pasażowania, podwyższając 500-krotnie wartość MIC do 62,5 pg/ml. Ten poziom oporności w bulionie zawierającym tylozynę utrzymuje się po 10-11 pasażowaniach. 4-krotny wzrost oporności na oksytetracyklinę występuje w przypadku obydwóch szczepów Mycoplasma hyopneumoniae podczas 10 cykli wystawienia na wpływ tego antybiotyku, podwyższając wartość MIC z 0,25 pg/ml do 1 pg/ml.

Wyniki te wskazują że walnemulina działa znacznie silniej przeciw Mycoplasma hyponeumoniae niż tylozyna lub oksytetracyklina, oraz że nie wywołuje znaczącej oporności na siebie u szczepów Mycoplasma hyopneumoniae.

4. Zapobieganie doświadczalnie wywołanemu enzootycznemu zapaleniu płuc in vivo.

W celu oszacowania potencjału walnemuliny do zapobiegania enzootycznemu zapaleniu płuc stosowano doświadczalny model tej choroby, wykorzystujący pasażowany materiał płucny, pochodzący pierwotnie od świń gnotobiotycznych (utrzymywanych od urodzenia w jałowych warunkach), zakażonych przez Mycoplasma hyopneumnoniae. Wykonywano trzy próby: próby 1 oraz 2 stanowiły badania miareczkowania dawki nowego związku z wykorzystaniem standardowego prowokującego szczepu Mycoplasma hyopneumoniae, a w próbie 3 oceniano skuteczność działania tego związku w stężeniu 200 ppm w karmie przeciw drugiemu szczepowi prowokującemu. Wykorzystywano duże, białe, męskie osobniki świń Landrace w wieku 6-7 tygodni z obsady wolnej od zakażenia przez Mycoplasma hyopneumoniae. Materiały prowokujące stanowiły płuca w stanie zapalnym, zawierające Mycoplasma hyopneumoniae, podawane w postaci homogenatu wewnętrznosowo w ciągu trzech kolejnych dni. Najmniejsze stężenie powstrzymujące (MIC) walnemuliny przeciw szczepowi, występującemu w materiałach stosowanych w próbach 1 oraz 2, wynosiło 0,016 pg/ml, a w przypadku szczepu wyizolowanego z materiału stosowanego w próbie 3, wynosiło 0,0078 pg/ml. Prowokujący materiał pierwotnie pochodził od świń gnotobiotycznych, zakażonych przez Mycoplasma hyopneumoniae, a następnie z pasażowania u świń SPF (specjalnie pozbawionych zarazków) i był przechowywany w temperaturze poniżej -70°C.

Próba 1: Leczenie chlorowodorkiem walnemuliny przez zgłębnik żołądkowy raz dziennie w dawkach 0 (kontrola), 2,5, 5, 7,5 lub 10 mg/kg masy ciała na dzień. Sześć świń w każdej grupie.

Próba 2: Leczenie chlorowodorkiem walnemuliny przez karmę w dawkach 0, 100, 200, 300 lub 400 ppm (równoważnych 0, 5, 10, 15 i 20 mg/kg/dzień). Sześć świń w każdej grupie.

Próba 3: Leczenie chlorowodorkiem walnemuliny przez karmę w dawkach 0 lub 200 pm (równoważnych 0 i 10 mg/kg/dzień). Osiem świń w każdej grupie. Lek podawano od pierwszego dnia zakażenia prowokacyjnego aż do pośmiertnego badania, wykonywanego po upływie około 3 tygodni od zakażenia prowokacyjnego. Chorobą oceniano przez ilościowe określanie zmian chorobowych w płucach [system punktacji zmian chorobowych w płucach

189 204

Cambridge (Goodwin, R.F.W. i Whittlestone, P., J. Hyg. 69 [1971] 391-397), w którym wynik oceniany w punktach oznacza w przybliżeniu procentową część płuc dotkniętą zapaleniem], oznaczając stosunek wagowy płuc do wagi ciała i wydzielając Mycoplasma hyopneumoniae z płuc.

Wyniki przedstawiono w tabeli 7:

Tabela 7

Próba 1: Podawanie leku przez zgłębnik żołądkowy, MIC 0,016 pg/ml¹’
Lek	Punktacja zmian chorobowych w płucach	Stosunek wagowy płuc i ciała (%)
0	13,2	1,35
1,0 mg/kg/dzień	1,7	1,08
7,5 mg/kg/dzień	3,8	1,21
5,0 mg/kg/dzień	11,1	1,31
2,5 mg/kg/dzień	7,7	1,21
Próba 2: Podawanie leku w karmie, MIC 0,016 pg/ml
0	22,1	1,61
400 ppm (20 mg/kg)²’	6,3	1,24
300 ppm (15 mg/kg)	12,7	1,27
200 ppm (10 mg/kg)	12,0	1,29
100 ppm (5 mg/kg)	25,0	1,53
Próba 3: Podawame leku w karmie, MIC 0,0078 pg/ml
Lek	Punktacja zmian chorobowych w płucach	Stosunek wagowy płuc i ciała (%)
0	10,8	1,32
200 ppm (10 mg/kg)	2,3	1,21

MIC chlorowodorku walnemuliny w pg/ml przeciw Mycoplasma hyopneumoniae wyizolowanego z materiału prowokacyjnego ²¹ Przyblizona dzienna dawka chlorowodorku walnemuliny dla jednej świni

W próbie 1 świnie nieleczone, a poddane prowokacji, wykazywały średnią punktację zmian chorobowych 13,2. Walnemulina zmniejszała zmiany chorobowe odpowiednio o 71% oraz 87% w dawkach 7,5 oraz 10 mg/kg, podczas gdy w dawkach 2,5 oraz 5 mg/kg/dzień była

189 204 nieco mniej skuteczna w zmniejszaniu zmian chorobowych. Mycoplasma hyopneumoniae wyizolowano potem z mniejszej liczby świń leczonych dawką 10 mg/kg w porównaniu ze świniami leczonymi dawką 2,5 mg/kg (w stosunku 1:4 liczby tych świń).

W próbie 2 świnie nieleczone, a poddane prowokacji, wykazywały średnią punktację zmian chorobowych 22,1. Świnie leczone walnemuliną odpowiednio w dawkach 200, 300 lub 400 ppm wykazywały zmniejszenie zmian chorobowych o 46%, 43% i 71%. Wagi płuc, które mogą odzwierciedlać mikroskopowe zmiany chorobowe, a także makroskopowe zmiany chorobowe, wykazywały bardziej dramatyczny skutek, ze znacznym jego zmniejszeniem dla poziomów dawek w dół do 200 ppm. Żadnego zmniejszenia zmian chorobowych nie obserwowano u świń leczonych dawką 100 ppm. Mycoplasma hyopneumoniae wyizolowano potem ze wszystkich nieleczonych świń w badaniach pośmiertnych, ale nie wyizolowano ze świń leczonych dawkami 400 ppm lub 300 ppm walnemuliny. Mycoplasma hyopneumoniae wyizolowano odpowiednio z 3 oraz 4 świń leczonych dawką 200 ppm i 100 ppm.

W próbie 3 świnie nieleczone wykazywały średnią punktację zmian chorobowych 10,8. Leczenie walnemuliną w dawce 200 ppm w karmie zmniejszało punktację zmian chorobowych o 79%. Nie było żadnych różnic w poziomach Mycoplasma hyopneumoniae, wykrywanych w badaniach pośmiertnych u świń leczonych i nieleczonych.

Walnemuliną okazuje się więc skuteczna w zapobieganiu doświadczalnie wywoływanemu zapaleniu płuc u świń w poszczególnych doświadczeniach z użyciem materiału prowokacyjnego, zawierającego dwa różne szczepy Mycoplasma hyopneumoniae.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest więc użyteczny w terapii enzootycznego zapalenia płuc u świń, powodowanego zakażeniem przez Mycoplasma hyopneumoniae. W tym zastosowaniu wielkość skutecznej dawki będzie oczywiście zmieniała się w zależności od rodzaju stosowanych poszczególnych soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz pożądanego skutku; np. w terapii profilaktycznej należałoby podawać stosunkowo niskie dawki przez długi czas. Zazwyczaj jednak zadowalające wyniki uzyskuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w dziennych dawkach od około 5 mg/kg do około >15 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podając go w podzielonych dawkach od dwóch do czterech razy dziennie, albo w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 100 mg do około 1000 mg, korzystnie od około 100 mg do około 500 mg, podawana raz lub dwa razy dziennie. Środek ten korzystnie można podawać w charakterze wyłącznej terapii.

Korzystne dawki w wodzie pitnej wynoszą od 0,01 do 0,05% wagowo-objętościowych, zwłaszcza od 0,01 do 0,025%, a w karmie od 100 do 400 ppm (g/tonę), zwłaszcza od 100 do 200 ppm (g/tonę).

F) Zakażenie przez Serpulina hyodysenteriae:

Zakażenie przez Serpulina hyodysenteriae można rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych, takich jak: Taylor, D.J., Pig Diseases (Choroby świń), 6 wyd. (1995), wyd. D.J. Taylor, Glasgow, Wielka Brytania, na stronach 143-144. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku w tym zastosowaniu oznacza się np. w następujący sposób:

1. Oznaczanie MIC:

Badaniami obejmuje się dziewięć izolatów polowych Serpulina hyodysenteriae z przypadków epidemii czerwonki świń oraz typowy szczep ATCC 31212 i ATCC 29796 (Serpulina innocens, grupa 3 (Fellstróm, C., Res. Vet. Sei. 59 [1995] 1-4). Identyfikacja bazuje na modelu hemolizy na TSA (Tryticase soy agar) z 5% krwi wołowej oraz na próbie wytwarzania indolu i hydrolizy hipuranu (Rosco Diagnostic Tables, Taastrup, Dania). Bakterie przenosi się z płytek agarowych do 0,9% roztworu soli i doprowadza mętność do 1,0 w skali McFarlanda, a potem 0,01 ml każdego izolatu posiewa się na płytki agarowe z dwukrotnymi stężeniami chlorowodorku walnemuliny, kwaśnego fumaranu tiamuliny, dimetridazolu, chlorowodorku linkomycyny i tylozyny. Rozrost i hemolizę rejestruje się po 4 dniach hodowli beztlenowej i oznacza MIC jako najniższe stężenie antybiotyków, wobec którego nie rozwijają się krętki.

189 204

Wyniki oznaczeń MIC dla Serpulina hyodysenteriae przedstawiono w tabeli 8:

Tabela 8

Wartości najnizszego stężenia powstrzymującego (MIC) dla 10 szczepów Serpulina hyodysenteriae

Środek przeciwbakteryjny
MIC (pg/ml)	Walnemuhna (ch)	Tiamulina (hfu)	Dimetridazol	Linkomycyna	Tylozyna
0,0156	2	-	-	-	-
0,0312	4	-	-	-	-
0,0625	3	-	-	-	-
0,125		6	-	-	-
0,250		1	-	-	-
0,500		1	2	-	-
1	1	2	2	-	-
2	-	-	1	-	-
4	-	-		-	-
8	-	-	1	-	-
16	-	-	1	-	-
32	-	-	-	-	-
64	-	-	3	1	-
128	-	-	-	3	1
>128	-	-	-	6	9

ch = chlorowodorek hfu = wodorofumaran

Wszystkie szczepy Serpulina hyodysenteriae były bardzo wrażliwe na walnemulinę, wykazując wartości MIC 2-32 razy niższe od tych wartości dla tiamuliny. Duża wrażliwość Serpulina hyodysenteriae na walnemulinę sprawia, że związek ten jest interesujący do stosowania w leczeniu klinicznych przypadków u zakażonej trzody.

2. Oznaczanie MIC:

Najniższe stężenie powstrzymujące (MIC) oznacza się względem 10 szczepów Serpulina hyodysenteriae, wyizolowanych z kału świńskiego, metodą rozcieńczania agaru. We wszystkich testach MIC jako kontrolne stosuje się szczepy NCTC (National Collection of Type Cultures) lub szczepy odniesienia. Podłoże agarowe dla Serpulina hyodysenteriae zawiera BAB2 (Unipath CM271) z 7% całkowicie odwłóknionej, sterylnej krwi owczej. Wszystkie środki przeciwbakteryjne bada się w zdublowanych rozcieńczeniach. Przygotowane rozcieńczenia antybiotyków dodaje się do odpowiednich objętości agaru MH, uprzednio ochłodzonego do 50°C. miesza i rozlewa na 20 ml objętości. Wszystkie inkubacje Serpulina hyodysenteriae

189 204 prowadzi się na beztlenowym stanowisku roboczym w 37°C (+/-0,5°C) (Don Whitley Scientific), które zapewnia ściśle beztlenową atmosferę, zawierającą 80% azotu, 10% wodoru i 10% dwutlenku węgla. Wszystkie inne inkubacje prowadzi się w 37°C. Wszystkie szczepy inkubuje się w atmosferze aerobowej w 37°C przez 24 godz. Liczbę organizmów dobiera się do gęstości optycznej (OD), równoważnej 1 χ 10⁸ jednostek tworzących kolonie (cfu) w 1 ml, stosując bulion MH jako ślepą próbę. Płytki zawierające antybiotyki inokuluje się w dwóch próbach równoległych z użyciem wielopunktowego inokulatora (Deniey Instruments), który dostarcza na płytki inokulum w objętości około 0,001 ml, dając inokulum zawierające 10 -10⁵ cfu na każde miejsce dla wszystkich szczepów (Amon, J. Antimicrob. Chemother. 21 [1988] 701-710; Erickson i in., Acta Pathol. Microbiol. et Immunol. Scand. 217 [1971] (B) Suppt., 1-90). Kontrolne płytki inkubuje się w tych samych warunkach, jak płytki do badań. Wartości MIC odczytuje się po 24 oraz 48 godzinach, przy czym ten drugi odczyt jest rozstrzygający. Wartości MIC określa się jako najniższe stężenie antybiotyku, przy którym nie występuje rozrost, pomijając pojedyncze kolonie lub lekkie zamglenie spowodowane przez inokulum (Nationale Committee for Clinical Laboratory Standards [1989], Antimicrobial Suscebility Testing, NCCLC Publications SC3, Villanova, USA).

Wartości MIC (w pg/cm³) przeciw Serpulina hyodysenteriae wynosiły dla walnemuliny (0,1), tiamuliny (0,3), linkomycyny (50,0), tylozyny (200,0) i dimetridazolu (30,0). Wszystkie szczepy Serpulina hyodysenteriae były wrażliwe na walnemulinę, która była najbardziej czynna wśród zbadanych środków z krotnością działania od 3 do 600.

3. Próba prowokacji:

Wykonano dwie próby, w których porównuje się karmę z walnemuliną na różnych poziomach domieszkowania z tiamuliną podawaną w celu zapobiegania czerwonce świń. Ciężkość choroby ocenia się na podstawie oznak choroby klinicznej, określanych przez kliniczne punktacje stanu ciała, konsystencji kału i jego kompozycji. Oznacza się również wydalanie Serpulina hyodysenteriae 7. kałem, zmiany chorobowe w badaniu pośmiertnym, szybkość wzrostu oraz stopień konwersji karmy.

W pierwszej próbie porównuje się karmę, zawierającą chlorowodorek walnemuliny na poziomach 20, 30 oraz 40 ppm, z karmą zawierającą kwaśny fumaran tiamuliny na poziomie 30 ppm, oraz z karmą kontrolną nie zawierającą leków. W każdej grupie leczenia wykorzystuje się pięć grup po 9 standardowo hodowanych świń (w wieku od 5 do 6 tygodni). Świnie te karmi się paszą nie zawierającą leków przez 14 dni, a następnie prowokuje standardowym szczepem Serpulina hyodysenteriae (P18A). Prowokacji dokonuje się drogą doustną w ciągu dwóch kolejnych dni. Karmę zawierającą leki wprowadza się następnego dnia po drugiej prowokacji. W drugiej próbie stosuje się podobny sposób postępowania z tą różnicą że wykorzystuje się 4 grupy po około 9 świń. Są one karmione chlorowodorkiem walnemuliny na poziomie 5, 10 oraz 20 ppm i porównywane z kontrolnymi świniami nieleczonymi. W tej próbie wykorzystuje się świnie ze stada hodowanego na wolnym powietrzu i prowokuje je szczepem Serpulina hyodysenteriae, wyizolowanym ze stada hodowanego na wolnym powietrzu, który uprzednio wykazał, że jest zdolny do wywołania czerwonki świń. W obu próbach oznaki choroby klinicznej ocenia się codziennie i oznacza punktację kliniczną dwa razy na tydzień pobiera się wymazy odbytnicze w celu izolacji Serpulina hyodysenteriae i wszystkie świnie waży się w regularnych odstępach czasu. Rejestruje się również pobór składników pokarmowych. Badania pośmiertne wykonuje się 21 dni po prowokacji i bada się jelito grube na obecność zmian chorobowych. Z 4 obszarów w jelicie grubym pobiera się też wyskrobmy śluzówkowe i hoduje dla uzyskania Serpulina hyodysenteriae.

W pierwszej próbie kliniczną czerwonkę świń zaobserwowano najpierw w nieleczonej grupie kontrolnej 8 dni po prowokacji i 8 spośród 9 świń zostało nią dotkniętych. Kliniczną chorobę zaobserwowano również u 1 świni z grupy karmionej paszą z walnemuliną na poziomie 30 ppm oraz u 2 spośród 9 zwierząt w grupie tiamuliny. Oznak chorobowych nie zaobserwowano w grupach leczonych walnemuliną na poziomie 20 oraz 40 ppm. Zanotowano średnią kliniczną punktację na jedną świnię na poziomie 36 dla grupy kontrolnej w porównaniu z punktacją wynoszącą 6 dla grupy leczonej tiamuliną. Różnice między punktacjami zarejestrowanymi dla wszystkich grup leczonych były statystycznie różne od grupy kontrolnej

189 204 (p < 0,001). Serpulina hyodysenteriae wyizolowano z wymazów odbytniczych, pobranych od wszystkich świń z grupy kontrolnej oraz również od 2 świń dotkniętych chorobą z grupy leczonej tiamuliną. Serpulina hyodysenteriae wyizolowano także od 2 świń, które otrzymywały karmę z walnemuliną na poziomie 30 ppm, co było zgodne z klinicznymi objawami czerwonki świń, obserwowanymi w wyniku przypadkowego zakażenia w tej grupie. S. hyodysenterie nie wyizolowano z grup leczonych 20 i 40 ppm. We wszystkich grupach karmionych paszą zawierającą leki występowały małe różnice przyrostu wagi lub stopnia przetworzenia pożywienia. W badaniach pośmiertnych świnie z grupy kontrolnej i z grupy leczonej tiamulinią które miały kliniczne objawy choroby, wykazywały typowe zmiany chorobowe czerwonki świń, obejmujące przylegający śluz z martwicą powierzchni śluzówki jelita grubego. Zmiany chorobowe zaobserwowano również u jednej świni z grupy leczonej tiamuliną i u świni kontrolnej, które uprzednio nie wykazywały klinicznych objawów czerwonki świń. Serpulina hyodysenteriae wyizolowano z wyskrobin śluzówkowych, pobranych od wszystkich tych zwierząt dotkniętych chorobą. Jedna Świnia z grupy karmionej paszą z walnemuliną na poziomie 30 ppm również wykazywała zmiany chorobowe czerwonki świń, ale w tym przypadku nie wyizolowano Serpulina hyodysenteriae z wyskrobin śluzówkowych. Zmian chorobowych nie zaobserwowano w badaniach pośmiertnych w grupach karmionych paszą z walnemuliną na poziomie 20 oraz 40 ppm.

W drugiej próbie kliniczną czerwonkę świń zaobserwowano po raz pierwszy u nieleczonych świń kontrolnych po upływie 5 dni od prowokacji, a następnie wszystkie 9 świń w tej grupie było dotkniętych chorobą. a 6 spośród nich musiano uśmiercić w związku z ciężkością choroby.

W grupie karmionej paszą z walnemuliną na poziomie 5 ppm kliniczne objawy czerwonki świń zaobserwowano po raz pierwszy po upływie 8 dni od prowokacji, a następnie 5 spośród 10 zwierząt było dotkniętych chorobą. Liczba dotkniętych chorobą z grupy otrzymującej 5 ppm walnemuliny była jednak znacznie niższa, niż w grupie kontrolnej (p < 0,05). Klinicznych objawów choroby nie zaobserwowano w grupach karmionych paszą z walnemuliną na poziomie 10 lub 20 ppm. Średnia punktacja 11 w grupie otrzymującej 5 ppm walnemuliny była znacznie niższa od tej punktacji 77 dla zwierząt kontrolnych (p < 0,05). Serpulina hyodysenteriae wyizolowano z wymazów odbytniczych, pobranych od wszystkich zwierząt kontrolnych w czasie tej próby. Natomiast wśród 5 zwierząt dotkniętych chorobą w grupie otrzymującej 5 ppm walnemuliny wyizolowano Serpulina hyodysenteriae tylko z 2 takich świń. Po zakończeniu próby świnie karmione paszą z walnemuliną na wszystkich poziomach były znacznie cięższe od zwierząt kontrolnych (odpowiednio 5 ppm, p = 0,05; 10 oraz 20 ppm, p < 0,05). W badaniach pośmiertnych u trzech pozostałych świń' kontrolnych zaobserwowano typowe zmiany chorobowe czerwonki świń w śluzówce jelita grubego. W grupie karmionej paszą z 5 ppm walnemuliny wśród 5 świń, które pierwotnie wykazywały objawy choroby, tylko 2 miały zmiany chorobowe w badaniach pośmiertnych, a Serpulina hyodysenteriae nie wyizolowano z tych zwierząt. Serpulina hyodysenteriae wyizolowano natomiast z wyskrobin śluzówkowych, pobranych od 2 innych zwierząt, które wykazały równocześnie typowe zmiany chorobowe, ale nie wykazywały klinicznych objawów choroby. Zmian chorobowych nie zaobserwowano u świń karmionych paszą z walnemuliną na poziomie 10 lub 20 pm i nie wyizolowano Serpulina hyodysenteriae z tych grup.

Walnemuliną w dawkach domieszkowych idąc w dół aż do 10 ppm skutecznie zapobiega występowaniu klinicznych objawów czerwonki świń, wydalania krętków w kale i zmian chorobowych w badaniach pośmiertnych. W grupie otrzymującej 30 ppm parę świń wykazało kliniczne objawy czerwonki świń, ale to zbiegło się z przypadkowym zakażeniem, które mogło być związane z przyjmowaniem antybiotyku. Wpływ równoległej choroby na przyjmowanie antybiotyku oraz częstość występowania czerwonki świń opisano wcześniej (Burch, D.G.S., Vet. Rec. 110 [1982] 244-246). Analiza danych przyrostu wagi nie wykazała różnic między leczonymi grupami, co wskazuje, że antybiotyk ten nie wpływa na smakowitość karmy. Walnemulina na poziomie 5 ppm niecałkowicie zapobiegała klinicznej chorobie lub wydalaniu krętków, ale występowało znaczne zmniejszenie klinicznych punktacji oraz wydalania krętków w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. W tej grupie karmienie paszą z tiamuliną

189 204 na poziomie 30 ppm nie zapobiegało czerwonce świń, ale zmniejszało 'częstość występowania choroby w porównaniu z grupą kontrolną ze zmniejszeniem klinicznych punktacji. W próbie tej wykazano jednak, że leczenie walnemuliną podawaną w karmie na poziomie 10 ppm jest wyraźnie bardziej skuteczne niż tiamuliną na poziomie 30 ppm w przypadku zapobiegania czerwonce świń.

4. Dalsza próba prowokacji:

Grupą 60 konwencjonalnie hodowanych świń (w wieku od 3,5 do 4 tygodni) karmi się paszą nie zawierającą leku przez 14 dni, a następnie poddaje prowokacji przez doustne podanie standardowego szczepu Serpulina hyodysenteriae (P18A). Gdy kliniczne objawy choroby stają się widoczne, świnie te przydziela się do sześciu grup leczenia po 8 świń w grupie i karmi paszą zawierającą antybiotyk przez 10 dni, a następnie paszą nie zawierającą leku przez dalsze 14 dni. Chlorowodorek walnemuliny podaje się w karmie na poziomie 50, 75, 100 i 150 ppm i porównuje z podawaniem w paszy kwaśnego, fumaranu tiamuliny na poziomie 100 ppm oraz z nieleczonymi zwierzętami kontrolnymi. Świnie z zespołem klinicznych objawów choroby włącza się do każdej leczonej grupy. Po przydzieleniu do tych grup leczenia codziennie oszacowuje się oznaki klinicznej choroby i oznacza kliniczną punktację, dwa razy na tydzień pobiera się wymazy odbytnicze w celu izolowania Serpulina hyodysenteriae i wszystkie świnie waży się w regularnych odstępach czasu. Rejestruje się również spożycie karmy. Badanie pośmiertne wykonuje się 24 dni po prowokacji i bada się jelito grube każdej świni na obecność zmian chorobowych. Pobiera się również wyskrobmy śluzówkowe z 4 obszarów jelita grubego i hoduje na Serpulina hyodysenteriae.

Po prowokacji, a przed przydzieleniem do grup, kliniczną czerwonkę świń zaobserwowano 7 dni po zakażeniu i pierwsze dwie grupy leczenia (kontrolną i tiamulinową) uformowano 8 dni po prowokacji. Inne grupy uformowano po upływie 12, 15, 20 oraz 28 dni od prowokacji w następującej kolejności: walnemulina na poziomie 75, 50, 100 oraz 150 ppm. Każda grupa zawierała świnie, które wykazywały krew i/lub śluz w kale, a także zwierzęta, które miały jedynie łagodne kliniczne objawy choroby, tj. rozluźnione stolce. W czwartym dniu próby wszystkie świnie w nieleczonej grupie kontrolnej wykazywały ciężkie objawy kliniczne i zostały uśmiercone. W okresie leczenia w grupie tiamulinowej ogółem 3 zwierzęta albo padły, albo wymagały eutanazji na skutek ciężkiej czerwonki świń. Wszystkie świnie leczone walnemuliną przeżyły do końca próby. W grupach karmionych paszą z walnemuliną na wszystkich poziomach kliniczne objawy choroby szybko ustąpiły i klinicznej choroby nie obserwowano w 5 dniu próby. W 8 dniu taką poprawę obserwowano u świń leczonych tiamuliną, które przeżyły. Średnie kliniczne punktacje dla grup walnemulinowych wahały się od 4 do 10 w porównaniu ze średnią kliniczną zarejestrowaną dla grupy tiamulinowej, wynoszącą 30. Statystyczna analiza klinicznych punktacji dla dni od 3 do 10 wykazała, że wystąpiła znaczna różnica między wszystkimi grupami leczonymi walnemulina i grupą leczoną tiamuliną (p < 0,001). Wszystkie świnie leczone walnemuliną nadal przybierały na wadze w okresie leczenia i wszystkie wykazywały większy dzienny przyrost żywej wagi (DLWG) niż grupa tiamulinowa (w zakresie od 0,4 do 0,9 w porównaniu z 0,1). W okresie leczenia wartości stosunku przemiany karmy (FCR) były znacznie wyższe w grupie leczonej tiamuliną (6,4) w porównaniu z grupami walnemulinowymi (w zakresie od 1,9 do 2,5). Serpulina hyodysenteriae izolowano u większości świń w każdej leczonej grupie w czasie przydzielania do grup. Po upływie 5 dni od tego przydzielania Serpulina hyodysenteriae nie można było wykryć w wymazach odbytniczych, pobranych od świń z dowolnej leczonej grupy.

W okresie po leczeniu jedna Świnia w grupie karmionej paszą z walnemuliną na poziomie 50 ppm wykazała kliniczne objawy choroby 4 dni po wycofaniu karmy zawierającej lek i jedna Św^;inia w grupie leczonej tiamuliną również miała czerwonkę świń ostatniego dnia próby. Serpulina hyodysenteriae nie wyizolowano jednak z kału tych świń. W tym okresie po leczeniu występowały słabo zauważalne różnice DLWG lub FCR między wszystkimi leczonymi grupami. W badaniach pośmiertnych na zakończenie próby nie zaobserwowano zmian chorobowych czerwonki świń u żadnej ze świń karmionych paszą z walnemuliną na poziomach 75, 100 lub 150 pm. W grupie karmionej paszą z walnemuliną ' na poziomie 50 ppm 1 Świnia miała kliniczną czerwonkę świń oraz inna Świnia z tej grupy wykazywała w tym czasie

189 204 zaczerwienienie jelita grubego. Serpulina hyodysenteriae wyizolowano również z wyskrobin śluzówkowych od tych dwóch świń oraz od 3 innych zwierząt z tej grupy, które nie wykazywały zmian chorobowych czerwonki świń. Jedna ze świń z grupy karmionej paszą z walnemuliną na poziomie 75 ppm również wykazała Serpulina hyodysenteriae z wyskrobin śluzówkowych, choć u tej świni nie zaobserwowano objawów klinicznej czerwonki świń.

Walnemulina na poziomach 50, 75, 100 oraz 150 ppm spowodowała więc zmniejszenie liczby dni potrzebnych do wyzdrowienia z klinicznej czerwonki świń w porównaniu z tiamuliną. W tych grupach leczonych walnemuliną również zwierzęta nie padły ani nie wymagały eutanazji. Występowała znaczna różnica (p < 0,001) w klinicznych punktacjach dla grup leczonych walnemuliną w porównaniu z grupą tiamulinową. Wszystkie poziomy walnemuliny zapobiegały również wydalaniu Serpulina hyodysenteriae z kałem po wycofaniu karmy zawierającej lek. Serpulina hyodysenteriae wyizolowano jednak z wyskrobin śluzówkowych z świń otrzymujących walnemulinę na poziomach 50 i 75 ppm. Tiamulina na poziomie 35 i 40 ppm wykazała, że eliminuje Serpulina hyodysenteriae z kału, ale nie zapobiega uzyskaniu z wyskrobin śluzówkowych (Taylor, D.J., Vet. Rec. 106 [1980] 526-528). Tiamulinę na poziomie 100 ppm skutecznie stosowano w warunkach doświadczalnych (Taylor, D.J., Proc. 7th EWS Congress Mexico [1982] 47) do leczenia czerwonki świń u zwierząt, które nie były tak ciężko dotknięte, aby wykazywać brak łaknienia. W tej próbie tiamuliną na poziomie 100 ppm zmniejszyła umieralność w porównaniu z nieleczonymi zwierzętami kontrolnymi, ale nie zapobiegała pewnym padnięciom, które mogły wynikać z ciężkości choroby, wywołanej tą doświadczalną prowokacją

W niniejszej próbie walnemuliną w karmie na poziomie 50, 75, 100 oraz 150 ppm leczyła więc skutecznie doświadczalnie wywołaną czerwonkę świń, zapobiegając umieralności i usuwając kliniczne objawy.

W czasie leczenia zapobiegała wydalaniu Serpulina hyodysenteriae, a po leczeniu wstrzymała nawrót choroby, który wystąpił tylko u jednego zwierzęcia leczonego dawką 50 ppm. Walnemulina w dawkach 50 i 75 ppm nie usunęła całkowicie Serpulina hyodysenteriae ze wszystkich świń, ale w dawkach 100 ppm była bardzo skuteczna.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest więc użyteczny w terapii czerwonki świń, wywołanej zakażeniem przez Serpulina hyodysenteriae. W tym zastosowaniu skuteczne dawkowanie będzie oczywiście różniło się w zależności od określonej stosowanej soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Najczęściej jednak zadowalające wyniki uzyskuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w dziennych dawkach od około 1 mg/kg do 5 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podawanych w podzielonych dawkach od dwóch do czterech razy dziennie, albo dowolnie w paszy lub w wodzie, lub też w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 10 do około 400 mg, np. od około 10 mg do około 200 mg w celu zapobiegania lub od około 20 mg do około 400 mg w celu leczenia, podawana dowolnie w paszy lub w wodzie, albo raz lub dwa razy dziennie.

Korzystne dawki w wodzie pitnej wynoszą od 0,001 do 0,05% wagowoobjętościowych, zwłaszcza od 0,001 do 0,005%, a w karmie od 20 do 100 g/tonę, zwłaszcza od 20 do 75 g/tonę.

G) Przewlekła choroba układu oddechowego i zapalenie stawów u ptactwa domowego, związane z zakażeniem przez Mycoplasma gallisepticum'.

Zakażenie można rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. w przypadku zakażenia przez Mycoplasma gallisepticum tak, jak to opisano w podręcznikach weterynaryjnych takich, jak Diseases of Poultry (Choroby ptactwa domowego), 8 wyd. (1984), wyd. Hofstad i in., Iowa State University Press, USA, na stronach 196-198. Korzystne działanie środka według mniejszego wynalazku w tym zastosowaniu oznacza się np. w następujący sposób:

1. Działanie in vitro: MIC

Przeciwbakteryjne działanie chlorowodorku walnemuliny oznacza się standardową techniką seryjnych mikrorozcieńczeń w porównaniu z ty lozyną (rozpuszczalny Tylan) i kwaśnym fumaranem tiamuliny.

189 204

12,8 mg badanego związku rozpuszcza się w 100 cm³ destylowanej wody w celu otrzymania podstawowego roztworu, który przechowuje się w -20°C, dopóki się go nie wykorzystuje. Stosuje się szczepy odniesienia Mycoplasma gallisepticum X95, S6 Holland, S6 Bench (Wielka Brytania), MS-16 (Japonia) i 1226 oraz różne świeże izolaty polowe.

Wrażliwość szczepów na antybiotyki bada się z wykorzystaniem zmodyfikowanej procedury mikrorozcieńczania bulionem (Stipkovits i in., Vet. Microbiol. 15 [1987] 65-70). Badane podłoże dodaje się (po 0,1 cm³) do wszystkich wgłębień płytek do mikromiareczkowania, stosując zdublowane rozcieńczenia antybiotyków. Materiał inokulacyjny (0,1 ml) zawiera 10⁵ cfu/ml. Płytki pokrywa się szczelnie taśmą (sellotape) i inkubuje w 37°C przez okres 3 dni. Najniższe stężenie antybiotyku, całkowicie zapobiegające zmianie barwy podłoża przy odczycie trzeciego dnia oznacza najniższe stężenie powstrzymujące (MIC). Zagłębienia bez zmiany barwy sprawdza się na żywotność mykoplazm przez ich posiewanie na pożywce agarowej. Wszystkie szczepy Mycoplasma rozprzestrzenia się w 10 ml pożywki B (Emo, H. i Stipkovits, L., Acta Vet. Scand. 14 [1973] 436-449). Po inkubacji w 37°C do wczesnej fazy wzrostu (log) 1 ml porcje hodowli umieszcza się w probówkach jako hodowle posiewowe i przechowuje w -20°C. Szczepy Mycoplasma fermentujące glukozę bada się w zmodyfikowanej pożywce Bg uzupełnionej 1% glukozy (pH = 7,8), szczepy hydrolizujące argininę w pożywce Ba (Erno, H. i Stipkovits, L., (jak wyżej, 450-463) zawierającej 1% argininy (pH = 7,3), a szczepy glukozo-ujemne i arginino-ujemne w pożywce B zawierającej 1% chlorku trójfenylotetrazolu.

Oblicza się średnie wartości MIC dla różnych grup szczepów i antybiotyków, biorąc pod uwagę rozcieńczenia.

Wartości MIC dla szczepów odniesienia przedstawiono w tabeli 9, a dla izolatów Mycoplasma w tabeli 10:

Tabela 9

Wartości MIC dla szczepów odniesienia Mycoplasma gallisepticum (ątg/emP)

Szczep	Walnemulina (ch)	Tiamulina (hfu)	Tylozyna
Bench	0,0312	0,0312	0,0312
Holland	0,0312	0,0312	0,0312
MK-7	0,0078	0,0312	0,0312
MS-16	0,0312	0,0312	0,0312
1226	0,0312	0,2000	0,0312

ch = chlorowodorek hfu = wodorofumaran

Tabela 10

Wartości MIC dla izolatów mikoplazmowych pochodzenia kurczącego (pg/cm3)

Izolat	Walnemulina (ch)	Tiamulina (hfu)	Tylozyna
1	2	3	4
20002	0,0625	0,2500	0,2500
20006	0,0625	0,0625	0,2500
20008	0,0625	0,0625	0,0625

189 204

c.d. tebeli 10

1	2	3	4
20174	0,0625	0,2500	0,2500
20175	0,0625	0,5000	2,0000
20176	0,0625	0,2500	2,0000
20177	0,0625	0,2500	1,0000
20178	0,6250	0,5000	2,0000
20224	0,0312	1,0000	4,0000
20312	0,0312	0,2500	4,0000
20321	0,0312	0,0312	0,5000
20472	0,0312	1,0000	16,0000
20473	0,0312	0,5000	32,0000
20474	0,0312	1,0000	16,0000
20475	0,0312	0,5000	32,0000

Wyniki otrzymane z użyciem szczepów mykoplazmowych odniesienia wskazują, że te trzy związki wykazują mniej więcej taki sam zakres działania. Natomiast wartości MIC dla ptasich izolatów polowych odzwierciedlają wyraźne różnice między tymi badanymi substancjami, podczas gdy wyróżnia się jednolicie wysoka wrażliwość na walnemulinę (0,03-0,06 pg/ml), to wrażliwość na tiamulinę jest nieco mniejsza (0,06-1 (pg/ml), a w przypadku tylozyny rzucają się w oczy nawet oporne szczepy (0,06-32 ^Ag/cm³).

2. Badania prowokacyjne:

2.1. Zapobieganie

Grupy męskich kurczaków brojlerowych zakaża się wirulentnym szczepem Mycoplasma gallisepticum (MG) i każdą grupę leczy się odpowiednio jednym z następujących środków: walnemuliną (stężenia 0,00312, 0,00625, 0,0125 oraz 0,025%), tiamuliną (0,00625, 0,0125 oraz 0,025%) i tylozyną (0,05%). Zakażenie wykonuje się w dniu 2 przez wstrzyknięcie 0,1 ml hodowli Mycoplasma gallisepticum, zawierającej około 10⁶ cfu żywotnych organizmów do każdego płuca (Jordan, F.T.W., The Record 127 [1990] 502), a leczenie rozpoczyna się w granicach godziny od zakażenia i prowadzi dalej przez trzy dni z rzędu. Występuje również zakażona grupa nieleczona oraz grupa niezakażona.

Otrzymane wyniki wskazują, że zapobieganie klinicznym objawom oraz umieralności było równie zadowalające w przypadku grup leczonych dwiema wyższymi dawkami walnemuliny (0,0125 i 0,025%), trzema dawkami tiamuliny oraz tylozyną o zadanym stężeniu. Zmiany chorobowe obserwowano u mniej licznych piskląt i były one lżejsze w przypadku tylozyny, następnie tiamuliny, a potem dwóch wyższych dawek walnemuliny (0,0125 i 0,025%). Dwie niższe dawki walnemuliny były pod tym względem mniej skuteczne. Największe przyrosty masy występowały w grupach leczonych tylozyną; następnie, choć znacznie mniejsze (p < 0,05), występowały w grupie niezakażonych ptaków, ptaków leczonych tiamuliną i ptaków, którym podawano walnemulinę we wszystkich dawkach z wyjątkiem najmniejszej. Najniższe przyrosty masy otrzymano w grupach leczonych najniższą dawką walnemuliny oraz w grupie zakażonej, lecz nieleczonej, i nie różniły się one znacznie. MG nie udało się wydzielić podczas życia lub w czasie sekcji z grupy niezakażonej, piskląt leczonych najwyższą dawką tiamuliny oraz leczonych tylozyną i udało się wyizolować z jednego tylko ptaka z grupy

189 204 leczonej najwyższą dawką walnemuliny. Wyższy udział izolacji występował w przypadku wszystkich innych zakażonych grup. Wyniki serologiczne niecałkowicie odzwierciedlają dane dla tylozyny, gdyż w tej grupie był stosunkowo wysoki udział dodatnich reakcji.

Stwierdzono więc, że dwie wyższe dawki walnemuliny są tak samo skuteczne, jak związki odniesienia, w zapobieganiu zakażeniu przez Mycoplasma gallisepticum u młodych piskląt.

2.2. Leczenie:

Grupy męskich kurczaków brojlerowych zakaża się wirulentnym szczepem Mycoplasma gallisepticum (MG) i każdą grupę leczy się odpowiednio walnemulinąw stężeniach 0,0125%, 0,025%, 0,05%, tiamuliną w tych samych stężeniach, tylozyną w stężeniu 0,05% oraz linkospektyną-kombinacją spektynomycyny (Linco-Spectin) w stężeniu 0,083%.

Występuje również grupa zakażona, pozostawiona bez leczenia, oraz grupa niezakażona. Pisklęta zakaża się w wieku 2 dni przez wstrzykiwanie 3,4 x 10⁵ organizmów do każdego płuca. Leczenie z użyciem pitnej wody rozpoczyna się 24 godziny później i prowadzi przez trzy kolejne dni z wyjątkiem linkospektyny, przy użyciu, której leczenie prowadzono przez 5 dni.

Otrzymane wyniki wskazują, że powstrzymywanie umieralności do nie większej niż 5% było najlepsze w przypadku wszystkich trzech stężeń walnemuliny oraz tiamuliny w stężeniu 0,05%. Zmian chorobowych nie obserwowano u piskląt leczonych najwyższą i najniższą dawką walnemuliny i tylko u kilku otrzymujących tiamuliną i tylozynę. Przyrosty masy w przypadku walnemuliny we wszystkich stężeniach były wyższe niż w grupach leczonych tiamuliną i takie same, jak w grupie tylozynowej. Mykoplazmy nie wydzielono po zakończeniu doświadczeń po 23 dniach z 3 grup ptaków leczonych walnemuliną oraz tych, którym podawano tylozynę. Równocześnie w wynikach badań serologicznych stwierdzono występowanie kilku dodatnich reakcji we wszystkich zakażonych grupach.

Z uwagi na umieralność, przyrost masy, izolację MG oraz wyniki prób aglutynacji surowicy krwi dwie wyższe dawki (0,025% oraz 0,05%) walnemuliny podawanej w wodzie pitnej dają wyniki przynajmniej tak samo dobre albo lepsze, niż tiamuliną w stężeniu 0,05% lub tylozyna w stężeniu 0,05%, oraz o wiele lepsze niż linkospektyna.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest więc użyteczny w terapii przewlekłej choroby dróg oddechowych oraz zapalenia stawów u ptactwa domowego, związanych z zakażeniem przez Mycoplasma gallisepticum. W tym zastosowaniu skutecznie działające dawki będą oczywiście zmieniać się w zależności od rodzaju poszczególnych stosowanych soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w celu terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Zazwyczaj jednak zadowalające wyniki otrzymuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w wodzie pitnej w dawkach 0,005 do około 0,05% wagowo-objętościowych, zwłaszcza od 0,01 do 0,03%, a w karmie od 20 do 400 g/tonę, zwłaszcza od 20 do 200 g/tonę.

H) Zapalenie wielostawowe u świń, związane z zakażeniem przez Mycoplasma hyosynoviae:

Zakażenie przez Mycoplasma hyosynoviae można rozpoznawać powszechnie stosowanym sposobem, np. opisanym w podręcznikach weterynaryjnych takich, jak: Taylor, D.J., Pig Diseases (Choroby świń), 6 wyd. (1995), wyd. D.J. Taylor, Glasgow, Wielka Brytania, na stronach 172-173. Korzystne działanie środka według niniejszego wynalazku oznacza się np. w następujący sposób:

1. Działanie w izolatach tkanki in vitro (próba MIC):

Próbki tkanki uzyskuje się z płuc świń z różnych stad dotkniętych enzootycznym zapaleniem płuc świń (EPP). Próbki do hodowli przesyła się w suchym lodzie. Cztery izolaty z próbek płuc początkowo wyizolowanych w celu wyodrębnienia Mycoplasma hyopneumoniae poddano wtórnej izolacji Mycoplasma hyosynvide po zaobserwowaniu z próbek płuc poddawanych izolacji (przechowywanych w -70°C) podczas hodowania na M. hyopneumoniae, że niektóre próbki dawały bujny wzrost kolonii, wykazujących typową morfologię Mycoplasma hyosynoviae. Trzy dalsze izolaty wyodrębniono z innych dostarczonych próbek płuc. Wszystkie izolaty identyfikowano serologicznie przez powstrzymywanie wzrostu krążków

189 204 specjalną przeciwsurowicą króliczą, wyhodowaną przeciw Mycoplasma hyosynoviae. Do izolacji M. hyosynoviae z tkanki płucnej stosuje się dostępną w handlu stałą pożywkę (Mycoplasma Experience Ltd.). Do prób MIC stosuje się ciekłą pożywkę (Mycoplasma Experience Ltd.), zawierającą czerwień fenolową oraz argininę (pH = 7,0).

Podstawowe roztwory badanego związku przygotowuje się w stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej, sterylizuje przez przesączanie przez filtry błonowe o wymiarach porów 0,2 p, (Sartorius Minisart, N) i przechowuje w -20°C. Do stosowania w próbkach MIC te roztwory podstawowe rozcieńcza się ciekłą pożywką do dwukrotnego wymaganego stężenia końcowego. Próby MIC prowadzi się metodą Tannera i Wu, Avian Diseases 36 (1992) 714-717. Aktywnie wzrastające hodowle prowokacyjne przygotowuje się albo z 1 ml porcji hodowli bulionowych, przechowywanych w -70°C, albo z hodowli przechowywanych na agarze w -70°C. Te prowokacyjne hodowle rozcieńcza się w celu otrzymania zamierzonego miana od 10³ do 10⁵ jednostek zmieniających barwę w 1 ml. Porcje po 0,1 ml prowokacyjnego materiału inokulującego miesza się z porcjami po 0,1 ml rozcieńczeń antybiotyku w zagłębieniach do mikromiareczkowania. Każda płytka do mikromiareczkowania zawiera nieinokulowaną pożywką o pH = 7,6 (kontrola punktu końcowego) oraz kontrolne próbki prowokacyjne inokulowane, nie zawierające antybiotyku. Wszystkie płytki zamyka się szczelnie folią przylepną i inkubuje aerobowo w 36°C. Wartości MIC rejestruje się wówczas, gdy zmiana barwy w prowokowanych zagłębieniach kontrolnych będzie odpowiadała pH kontrolnej próbki punktu końcowego. Wartość MIC oznacza najniższe stężenie, nie wykazujące zmiany barwy.

Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 11 dla chlorowodorku walnemuliny oraz dwóch związków odnośnikowych: kwaśnego fumaranu tiamuliny i enrofloksacyny:

Tabela 11

Wrażliwość in vitro 7 izolatów polowych Mycoplasma hyosynoviae

Związek	Zakres MIC (pg/ml)
Chlorowodorek walnemuliny	0,0001 - 0,0005
Kwaśny fumaran tiamuliny	0,0025 - 0,025
Enrofloksacyna	0,025 - 0,25

Wrażliwość siedmiu izolatów polowych Mycoplasma hyosynoviae na walnemulinę jest o wiele wyższa niż na pozostałe dwa związki, wskazując, że świeże izolaty polowe są nadzwyczaj wrażliwe na walnemulinę.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku jest więc użyteczny w terapii zapalenia wielostawowego u świń, związanego z zakażeniem przez Mycoplasma hyosynoviae. W tym zastosowaniu skutecznie działające dawki będą oczywiście zmieniać się w zależności od rodzaju poszczególnych stosowanych soli, sposobu podawania, wielkości i wieku zwierzęcia oraz żądanego skutku; np. w celu terapii profilaktycznej podaje się stosunkowo niskie dawki przez długi okres czasu. Zazwyczaj jednak zadowalające wyniki otrzymuje się wówczas, gdy środek ten podaje się w dziennych dawkach od około. 5 mg/kg do około. 15 mg/kg masy ciała zwierzęcia, korzystnie podawanych dowolnie w wodzie lub karmie, albo w podzielonych dawkach od dwóch do czterech razy dziennie, lub też w postaci o przedłużonym uwalnianiu. Dla większości zwierząt całkowita dzienna dawka wynosi od około 100 do około 1000 mg, korzystnie od około 100 mg do około 500 mg, podawana raz lub dwa razy dziennie. Korzystne może być jego podawanie w charakterze wyłącznej terapii.

189 204

We wszystkich tych zastosowaniach związek ten można używać w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie tolerowanych soli, np. soli czwartorzędowych lub zwłaszcza w postaci soli addycyjnych z kwasami. Takie postacie soli wykazują ten sam rząd wielkości działania, jak postać wolnej zasady. Przykładami odpowiednich addycyjnych soli z kwasami są: kwaśny fumaran, fumaran, naftaleno-1,5-sulfonian, a zwłaszcza chlorowodorek:.

Środek stosowany według niniejszego wynalazku można podawać doustnie, miejscowo lub pozajelitowo i domieszkować do powszechnie stosowanych, tolerowanych chemioterapeutycznie rozcieńczalników i nośników oraz ewentualnie innych zarobek i podawać w takich postaciach, jak tabletki, kapsułki lub preparaty do wstrzykiwania. Stanowi on również doskonały dodatek do mieszanek paszowych (jako domieszka) lub do wody pitnej.

Korzystne weterynaryjnie tolerowane nośniki obejmują np. powszechnie stosowane farmaceutycznie zarobki, takie jak cukier, skrobia kukurydziana, laktoza, celuloza, a także ziarniste układy nośnikowe oraz ziarniste produkty uboczne, takie jak zmielone łuski ryżowe, poślad pszeniczny i mąka sojowa; ponadto stałe rozcieńczalniki, takie jak zmielony wapień, siarczan sodowy, węglan wapniowy i kaolin, albo ciekłe substancje, takie jak weterynaryjnie tolerowane oleje (oleje roślinne lub mineralne), glikol propylenowy i poli(glikol etylenowy). Kompozycje te korzystnie podaje się zwierzętom doustnie, zwłaszcza zmieszane z paszą w postaci mącznej karmy zawierającej lek lub granulek zawierających lek.

Do stosowania w wodzie pitnej używa się wodne roztwory bez rozpuszczalników lub z rozpuszczalnikami takimi, jak etanol, glikol propylenowy, poli(glikol etylenowy), tolerowane ciekłe środki powierzchniowo czynne oraz sorbit.

Do wstrzykiwania np. domięśniowego typowo przygotowuje się kompozycje w postaci wodnych roztworów, które mogą zawierać rozpuszczalniki takie jak etanol lub glikol propylenowy, albo weterynaryjnie tolerowanych roztworów olejowych. Przykładami tolerowanych olejów są: olej sezamowy, trójglicerydy o łańcuchach średniej długości (np. Miglyol), mirystynian izopropylowy oraz oleinian etylowy. Kompozycje te mogą zawierać środki konserwujące, bufory i inne zwykle stosowane środki pomocnicze.

Weterynaryjne kompozycje do stosowania według niniejszego wynalazku można wytwarzać przez zmieszanie składników w wymaganych proporcjach. Kompozycje te zapakowuje się następnie do odpowiednich pojemników jako gotowe do podawania.

Następujący przykład ilustruje niniejszy wynalazek:

Składnik	Ilość (g/100 ml)
Chlorowodorek walnemuliny	10,0
Fenol	0,5
Miglyol 80	do 100 ml

Środek jest dobrze tolerowany. Ostrą toksyczność u szczurów związku o wzorze 1 w postaci soli chlorowodorkowej określono przy pojedynczej dawce 1000 mg/kg oraz 2000 mg/kg podawanej doustnie 5 samcom i 5 samicom szczurów w grupie, której podawano wymienione dawki. Śmierć następowała w okresie 1-8 dni. Otrzymana wartość LD50 wynosi > 1000 mg/kg podawanych doustnie.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowańie związku o wzorze I w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie akceptowalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobie weterynaryjnej występującej u zwierząt podatnych na wtórne zakażenia spowodowane zwiększoną obsadą (liczba i wielkość/wiek zwierząt), przy czym wspomniana choroba weterynaryjna jest związana z zakażeniem bakteriami wybranymi z grupy złożonej z Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, oraz ich mieszanin.
2. Zastosowanie związku o wzorze I określonego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobom świń.
3. Zastosowanie według zastrz. 2 związku o wzorze I określonego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw zapaleniu okrężnicy świń związanemu z zakażeniem bakteriami Serpulina pilosicoli.
4. Zastosowanie według zastrz. 1 związku o wzorze I określonego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw zapaleniu krętnicy u świń związanemu z zakażeniem bakteriami Lawsonia intracellularis.
5. Zastosowanie według zastrz. 1 związku o wzorze I określonego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw chorobie weterynaryjnej związanej z zakażeniem bakteriami Pasteurella multocida..
6. Zastosowanie według zastrz. 1 związku o wzorze I określonego w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciw zapaleniu płuc u jagniąt, owiec lub bydła, związanemu z zakażeniem bakteriami Pasteurella haemolytica.

* * *

189 204

Wynalazek dotyczy zastosowania związku o wzorze (I) (I) tj. 14-O-[1-(R)-2-amino-3-metylobutyrylanimo]-2-metylopropan-2-ylotio-acetylo]mutyliny w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie akceptowalnej soli do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeciwko chorobie weterynaryjnej występującej u zwierząt podatnych na wtórne zakażenia spowodowane zwiększoną obsadą (liczba i wielkość/wiek zwierząt), przy czym wspomniana choroba weterynaryjna jest związana z zakażeniem bakteriami wybranymi z grupy złożonej z Serpulina pilosicoli, Lawsonia intracellularis, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, oraz ich mieszanin, określanego dalej jako „zastosowanie według wynalazku”.

Związek o wzorze (I) w postaci wolnej zasady lub w postaci weterynaryjnie tolerowanej soli (Econor®) jest tu krótko zwany dalej „środkiem według niniejszego wynalazku”. Korzystnie występuje on w postaci soli, zwłaszcza soli chlorowodorkowej. W tej postaci jest on znany pod oficjalną nazwą chlorowodorku walnemuliny.

Pod pojęciem „terapia” należy rozumieć zarówno działanie profilaktyczne, jak i lecznicze.

Związek o wzorze I w postaci wolnej zasady lub w postaci chemioterapeutycznie lub weterynaryjnie akceptowalnej soli jest znany np. z opisu EP 153 277. i jego odpowiedników np. US 4,675,330, w szczególności w przykładzie 12 tamże.

Ponadto, z opisu tego znane jest działanie hamujące tego związku wobec różnych bakterii in vitro, przy stężeniach wynoszących około 0,008 do 25 pg/ml; działanie hamujące in vitro ogólnie wobec mykoplazm i chlamydii, przy stężeniach wynoszących około 0,008 do 5 pg/ml; działanie hamujące in vivo u myszy przy zastosowaniu różnych szczepów bakterii oraz u kur przy zastosowaniu szczepów mykoplazm, przy dawkach wynoszących około 12 do 50 mg/kg masy ciała; działanie przeciwpasożytnicze, w szczególności in vivo wobec pierwotniakom z gromady Coccidia u drobiu, przy dawkach wynoszących 20 do 150 mg/kg karmy; oraz działanie stymulujące wzrost u kur i świń in vivo, przy dawkach wynoszących 10 do 50 mg/kg karmy, co sprawia, że związki te są użyteczne jako przeciwbakteryjnie czynne antybiotyki w ogólności oraz jako środki weterynaryjne, w szczególności do zastosowania w chemioterapii chorób wywoływanych przez pierwotniaki z gromady Coccidia u drobiu, jak również jako środki stymulujące wzrost u kur i świń”.

W opisie EP 157 277 i jego ekwiwalencie US 4,675,330 opisano pochodne pleuromutyliny włącznie ze związkiem o wzorze (I) według przedmiotowego wynalazku. Opisano tam również kompozycje chemioterapeutyczne zawierające taką pochodną pleuromutyliny; wspomniane pochodne pleuromutyliny do zastosowania w postaci kompozycji chemioterapeutycznej; zastosowanie tych kompozycji chemioterapeutycznych do wytwarzania

189 204 kompozycji do zwalczania zakażeń bakteryjnych u zwierząt; oraz chemiczny proces otrzymywania tych kompozycji chemioterapeutycznych.

Te odnośniki ujawniają ogólne warunki działania wspomnianych pochodnych pleuromutyliny przeciwko szczepom mykoplazm i pierwotniakom z gromady Coccidia, jak również ich działania jako środków stymulujących wzrost. Jednakże nie przedstawiono w nich żadnych wyników testów biologicznych. W obu odnośnikach nie ma żadnej informacji o zespole chorobowym, którego dotyczy przedmiotowy wynalazek. Wynalazek niniejszy opiera się bowiem na odkryciu, że szczególna pochodna pleuromutyliny opisana tutaj jest zdolna do zapobiegania i leczenia kompleksu chorobowego, który występuje w szczególnych warunkach. Ten kompleks chorobowy jest określony w opisie przedmiotowego zgłoszenia jako choroba weterynaryjna, której ekspresja jest potęgowana przez zwiększoną obsadę (liczba i wielkość/wiek zwierząt), a która jest znana również, na przykład, jako gorączka przewozowa (ang. Shipping Fever, Transit Fever), zespół zaburzeń oddechowych u cieląt (ang. Calf Respiratory Complex) lub bydlęca pastereloza płucna (ang. Bovine Pneumonic Pasteurellosis). Korzystny efekt działania związku o wzorze (i) nie mógł być więc oczekiwany ani przewidziany.

Nieoczekiwanie odkryto, że środek stosowany według niniejszego wynalazku jest szczególnie skuteczny w terapii chorób weterynaryjnych, których ekspresja jest 'wzmagana przez podwyższoną gęstość obsady inwentarza, takich jak enzootyczne zapalenie płuc u świń spowodowane zakażeniem przez Mycoplasma hyopneumoniae, czerwonka świń spowodowana zakażeniem przez Serpulina (dawniej krętek) hyodysenteriae, zapalenie okrężnicy ze świń związane z zakażeniem przez Serpulina pilosicoli, zapalenie krętnicy u świń (świńska enteropatia proliferacyjna; świńska gruczołakowatość jelitowa) związane z zakażeniem przez Lawsonia intracellularis, przewlekła choroba dróg oddechowych i zapalenie stawów u ptactwa domowego związane z zakażeniem przez Mycoplasma gallisepticum, wtórne zapalenie płuc u świń związane z zakażeniem przez Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae i/lub Haemophilus parasuis, zapalenie płuc u jagniąt, owiec i bydła (ostry nieżyt dróg oddechowych w czasie transportu, gorączka przewozowa, cielęcy zespół oddechowy, bydlęca pastereloza płucna) związane z zakażeniem przez Pasteurella haemolytica oraz zapalenie wielostawowe u świń związane z zakażeniem przez Mycoplasma hyosynoviae.

Ponadto, jeszcze bardziej nieoczekiwanie, odkryto, że wywoływanie oporności na ten lek jest nadzwyczaj niskie.