SK286431B6 - Použitie derivátu pleuromutilínu na liečenie veterinárneho ochorenia - Google Patents

Abstract

Opisuje sa použitie derivátu pleuromutilínu vzorca (I), t. j. valnemulínu, vo forme voľnej bázy alebo veterinárne prijateľnej soli na prípravu liečiva na liečenie pneumónie jahniat, oviec a hovädzieho dobytka spojenej s infekciou vyvolanou mikroorganizmom Pasteurella haemolytica. Opísané je tiež použitie valnemulínu vo forme voľnej bázy alebo veterinárne prijateľnej soli pri liečení ďalších veterinárnych ochorení, ktorých expresia je zvýšená rastúcou hustotou chovu.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka derivátov pleuromutilínu. Predmetom vynálezu je zlúčenina vzorca (I)

to znamená 14-O-[l-[(R)-2-amino-3-metylbutyrylamino]-2-metylpropan-2-yltioacetyl]mutilinu vo forme voľnej zásady alebo veterinárne prijateľnej soli na použitie na liečbu veterinárnych ochorení vyskytujúcich sa pri zvieratách náchylných na sekundárne infekcie zapríčinené rastúcou hustotou chovu, čo sa ďalej nazýva „využitie vynálezu“.

Doterajší stav techniky

Zlúčenina všeobecného vzorca (I) vo forme voľnej zásady alebo vo forme veterinárne prijateľnej soli (Econor®) sa nazýva „činidlo podľa vynálezu“. Výhodne sa vyskytuje vo forme soli, najmä hydrochloridu. V tejto forme je látka známa pod názvom hydrochlorid valnemulínu.

Termín „liečba“ znamená použitie na profylaxiu a tiež na liečbu.

Zlúčenina všeobecného vzorca (I) vo forme voľnej zásady alebo vo forme chemoterapeuticky alebo veterinárne prijateľnej soli je známa napríklad z EP 153 277 a jej ekvivalentov, napríklad USP 4 675 330, najmä v uvedenom príklade 12.

Odtiaľ je ďalej známa:

- inhibičná aktivita proti rôznym baktériám in vitro, pri koncentrácii asi 0,008 až 25 ^g/ml;

- inhibičná aktivita in vitro proti mykoplazmám a chlamýdii všeobecne, pri koncentrácii asi 0,008 až 0,5 ^g/ml;

- inhibičná aktivita in vivo pri myšiach, s využitím rôznych kmeňov baktérií, a pri sliepkach, s využitím kmeňov mykoplazmy, v dávkach asi 12 až 50 mg/kg telesnej hmotnosti;

- antiparazitálna aktivita, najmä in vivo proti kokcídii pri sliepkach, v dávkach 20 až 150 mg/kg krmiva; a

- aktivita podporujúca rast pri sliepkach a ošípaných in vivo, pri dávkach 10 až 50 mg/kg krmiva, z čoho vyplýva, že zlúčenina je vhodná ako antibakteriálne účinné antibiotikum všeobecne a ako veterinárne činidlo, najmä na chemoterapeutickú liečbu kokcidiózy pri sliepkach, rovnako ako činidlo podporujúce rast sliepok a ošípaných.

Zistilo sa, že činidlá podľa predloženého vynálezu sú zvlášť účinné pri liečbe veterinárnych ochorení, ktorých expresia sa zvyšuje vzrastom hustoty chovu, ako je enzootická pneumónia pri ošípaných spôsobená infekciou Mycoplasma hyopneumoniae, črevná úplavica ošípaných spôsobená infekciou Serpulina (skôr Treponema) hyodysenteriae, kolitída ošípaných (zápal hrubého čreva) súvisiaci s infekciou Serpulina pilosicoli, ileitida ošípaných (proliferatívna enteropatia ošípaných; intestinálna adenomatóza ošípaných) súvisiaca s infekciou Lawsonia intracellularis, chronické dýchacie ochorenie a artritída pri hydine spojená s infekciou Mycoplasma gallisepticum, sekundárna pneumónia pri ošípaných súvisiaca s infekciou Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae a/alebo Haemophilus parasuis, pneumónia jahniat, oviec a dobytka (lodná horúčka, prepravná horúčka, dýchací komplex teliat, hovädzia pneumonická pasteurelóza) spojená s infekciou Pasteurella haemolytica a polyartritída ošípaných spojená s infekciou Mycoplasma hyosynoviae.

Ďalej sa zistilo, že indukcia odolnosti proti liečivu je veľmi nízka.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka už definovaného veterinárneho použitia.

Tiež sa týka použitia činidla podľa vynálezu na prípravu liečiva na použitie pri liečbe veterinárnych ochorení, ktorých expresia sa zvyšuje vzrastom hustoty chovu.

Ďalej sa vynález týka spôsobu liečby veterinárnych ochorení, ktorých expresia sa zvyšuje vzrastom hustoty chovu, ktorý zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva činidla podľa vynálezu živočíchom v prípade, že takú liečbu potrebujú. Ďalej sa týka veterinárneho činidla na použitie pri liečbe veterinárnych ochorení, ktorých expresia sa zvyšuje vzrastom hustoty chovu, ktoré obsahuje zlúčeninu všeobecného vzorca (I) vo forme voľnej zásady alebo veterinárne prijateľnej soli, spolu s najmenej jedným veterinárne prijateľným nosičom alebo riedidlom.

Ďalej sa predložený vynález týka spôsobu prípravy liečiva na použitie, ako už bolo definované, ktorý zahŕňa zmiešanie činidla podľa predloženého vynálezu s najmenej jedným veterinárne prijateľným nosičom alebo riedidlom.

Zvieratá trpiace veterinárnymi ochoreniami, ktorých expresia sa zvyšuje vzrastom hustoty chovu, môžu byť napríklad liečené antibakteriálne, činidlom podľa vynálezu a už nemusia dostávať činidlo podľa vynálezu na podporu rastu.

A) Infekcia Mycoplasma hyopneumoniae

Infekcia Mycoplasma hyopneumoniae môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad ako je opísané vo veterinárnej príručke Taylor, D. J., Pig Diseases, šieste vydanie (1995), vydal D. J. Taylor, Glasgow, U.K. na stranách 164-165. Úspešnosť pôsobenia činidla podľa predloženého vynálezu pri tomto využití sa určí napríklad nasledujúcim spôsobom:

1. Aktivita in vitro

Test zahŕňa desať poľných izolátov po vypuknutí enzootickej pneumónie v rôznych štádiách a kmeňov typu „J“. Izoláty sa filtračné klonujú, identifikujú pomocou diskového testu inhibície rastu a použije sa sedem až desať cyklov. Test na minimálnu inhibičnú koncentráciu (MIC) sa uskutočňuje v kvapalnom médiu (Friis, N. F. a kol., Acta Vet. Scand. 32, (1991) 425-429) v skúmavkách s 1,8 ml obsahujúcich dvojnásobnú koncentráciu valnemulínu a hydrogenfumarátu tiamulínu. Mykoplazmy sa inokulujú v desaťnásobných zriedeniach a rast kultúry sa vyhodnocuje vizuálne s použitím skúmaviek vybavených 10^{2 *} až 10⁴ jednotiek tvoriacich farbivo. Prvé vyhodnotenie sa uskutočňovalo po 2 až 4 dňoch a posledné vyhodnotenie sa uskutočňovalo po 10 až 14 dňoch, keď sa už prestala meniť farba. MIC sa určila ako najnižšia koncentrácia testovanej zlúčeniny majúca inhibíciu rastu v porovnaní s kontrolným pokusom (Friis, N. F. a Szancer, J., Acta Vet. Scand. 35 (1994)389-394).

Výsledky sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Číslo kmeňa	Valnemulín (ch)	Tiamulín (hfú)
	prvý	posledný	Prvý	posledný
1	0,0010	0,0025	0,025	0,050
1	0,0010	0,0025	0,025	0,100
2	0,0010	0,0025	0,050	0,100
5*	0,0025	0,0025	0,050	0,100
1	0,0025	0,0025	1,100	0,100
*) obsahuje typový kmeň ch=hydrochlorid hfú=hydrogenfumarát

Všetky testované kmene M. hyopneumoniae sú vysoko citlivé na pôsobenie valnemulínu s MIC hodnotami 10 až 40 krát nižšími ako sú hodnoty pre tiamulín, tak pri prvom, ako pri poslednom vyhodnotení, z čoho vyplýva, že zlúčeniny sú zvlášť zaujímavé na použitie pri liečbe klinických prípadov nakazených stád.

2. Aktivita in vivo

Vzorky tkanív sa získali z pľúc ošípaných rôznych skupín postihnutých enzootickou pneumóniou ošípaných (EPP). Vzorky sa pred kultiváciou umiestnia na suchý ľad. M. hyopneumoniae sa získa z čerstvo vybraných pľúcnych tkanív priamym prevedením na agar „Mycoplasma Experience“. Postup umožňuje rozlíšiť a ľahko oddeliť odlišné kolónie M. hyopneumoniae, pomocou klonovania z iných, rýchlejšie rastúcich druhov mykoplazmy, ako je Mycoplasma hyorhinis, obvykle prítomných v EPP pľúcnych vzorkách. Izoláty sa subkultivujú a identifikujú pomocou diskovej inhibície rastu s použitím špecifického králičieho antiséra vybaveného M. hyopneumoniae NCTC 10110.

Kultúry na vyvolanie antibiotickej odozvy sa pripravia v bujóne Mycoplasma Experience, inkubujú sa aeróbne pri 36 °C.

Na izoláciu M. hyopneumoniae z pľúcneho tkaniva sa použije komerčne dostupné pevné médium (Myco3 lasma Experience Ltd.). Kvapalné médium (Mycolasma Experience Ltd.) obsahujúce fenolovú červeň a glukózu (pH 7,6) sa použije na MIC test.

Zásobné roztoky testovanej zlúčeniny sa pripravia pri koncentrácii 1 mg/ml v deionizovanej vode, sterilizujú sa filtráciou cez filtračnú membránu s veľkosťou pórov 0,2 pm (Sartorius Minisart, N) a skladujú sa pri -20 °C. Na použitie pri teste Mic sa zásobné roztoky zriedia v kvapalnom médiu na dvojnásobok konečnej požadovanej koncentrácie. MIC testy sa uskutočňujú podľa spôsobu opísaného v Tanner & Wu, Avian Diseases 36, (1992) 714-717. Aktívne rastúce nakazené kultúry sa pripravia buď z 1 ml alikvotného dielu bujónu kultúry skladovanej pri -70 °C alebo z kultúry skladovanej na agare pri -70 °C. Nakazené kultúry sa zriedia za získania požadovaného titra 10³ až 10⁵ jednotky meniacej farbu/ml. 0,1 ml alikvotné diely nakazeného inokula sa zmiešajú s 0,1 ml alikvotného dielu roztoku antibiotika v mikrotitračnej jamke. Každá mikrotitračná doska obsahuje inokulované médium s pH 6,8 (M. hyopneumoniae) (kontrola ukončenia) a inokulovanú nakazenú kontrolnú vzorku bez antibiotika. Všetky dosky sa potom utesnia adhéznym filmom a aeróbne sa inkubujú pri 36 °C. MIC sa zaznamená, keď zmena farby v jamkách meniacich farbu dosiahne pH kontroly ukončenia. MIC je najnižšia koncentrácia nevykazujúca zmenu farby.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 2 pre valnemulín a dve referenčné zlúčeniny tiamulín a enrofloxacín.

Tabuľka 2

In vitro citlivosť desiatich poľných izolátov M. hyopneumoniae

Antibiotikum	MIC (gg/ml) Poľné kmene (n = 10)	Typ kmeňa J (NCTC 10110)
	50%	90%	Rozsah
Valnemulín (ch)	0,0005	0,001	0,00025 - 0,001	0,0025
Tiamulín (hfu)	0,025	0,05	0,01 - 0,05	0,1
Enrofloxacín	0,005	0,01	0,0025 - 0,025	0,025

Ukázalo sa, že všetky kmene sú veľmi citlivé na valnemulín. Väčšina kmeňov má veľmi dobrú citlivosť na enrofloxacín, ale pre jednotlivé kmene bolo MIC valnemulínu najmenej päťkrát nižšie, dokonca pre enrofloxacín bola citlivosť 0,0025 ftg/ml. Výsledky potvrdzujú, že polia izolátov sú extrémne citlivé na valnemulín.

3. Vývoj odolnosti

Referenčný kmeň Mycoplasma hyopneumoniae NCTC 10110 (získaný od National Collection of Type Cultures, Londýn, VB) a nový poľný izolát (MEVT G23) sa aeróbne kultivujú pri 36 °C v Mykoplasma glukózovom bujóne obsahujúcom fenolovú červeň, pokiaľ prebieha kyslá zmena farby. Po pridaní sterilného glycerolu (5 % objem/objem) sa suspenzia rozdelí do 1 ml alikvotných dielov a zmrazí sa na -70 °C. Kultúry sa použijú na iniciáciu ďalších bujónov kultúr, ktoré sa titrujú za získania mnohých jednotiek meniacich farbu (ccu) v mikrotitračných doštičkách po inkubácii (36 °C). Reprodukcia umožňuje nakazenie roztokov antibiotík s vopred určenými počtami ccu pri testoch minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) a pri prvom prechode pri návykových štúdiách.

Použije sa komerčne dostupné médium (Mycoplasma Experience Ltd.) obsahujúce glukózu a fenolovú červeň pri pH 7,6.

Zásobné roztoky testovanej zlúčeniny sa pripravia pri 1000 gg/ml v deionizovanej vode. Po premiešaní sa roztoky sterilizujú filtráciou cez filtračnú membránu s veľkosťou pórov 0,2μ (Sartorius Minisart, N). Na použitie pri MIC testoch sa zásobné roztoky zriedia v bujóne mykoplazmy na dvojnásobok konečnej požadovanej koncentrácie. Pri návykových štúdiách sa zásobné roztoky rozdelia na 1 ml alikvotné diely a zmrazia sa na -20 °C. Potom sa rozmrazia a použijú sa v 5 až 7 denných intervaloch na prípravu škály koncentrácií liečiva (dvojité série) v MEGB, v 1,9 ml alikvotných dieloch, obsahujúcich MIC proti obidvom kmeňom M. hyopneumoniae. Hydrochlorid oxytetracyklínu sa v každom prípade pripraví čerstvý. Rozsahy zriedenia sa postupne menia od prechodu k prechodu, čím sa umožní vývoj odolnosti v mykoplazmách.

Postup testu:

MIC testy sa uskutočňujú spôsobom opísaným v Tanner & Wu, Avian Diseases 36 (1992) 714-717 pred vykonaním návykovej štúdie (ďalej) a po 10 prechodoch sa 0,1 ml alikvotného dielu roztoku zlúčeniny zmieša v mikrotitračných jamkách s 0,1 ml alikvotného dielu nakazeného inokula, obsahujúceho 10³ až 10⁵ jednotiek meniacich farbu (ccu) na ml. Každá mikrotitračná doska obsahuje inokulované médium, médium s pH 6,8 (kontrola konečného bodu) a kontrolnú inokulovanú nakazenú vzorku bez liečiva. Všetky dosky sa uzatvoria a aeróbne sa inkubujú pri 36 °C. MIC sa zaznamenajú, keď zmena farby v kontrolných jamkách meniacich farbu dosiahne pH 6,8 (oranžovožltá). MIC je najnižšia koncentrácia, ktorá nevykazuje zmenu farby.

Návyková štúdia: Pri prvom cykle experimentu sa 1,9 ml objemy roztokov antibiotika pri koncentráciách zahŕňajúcich MIC testovaného kmeňa M. hyopneumoniae inokulujú s 0,1 ml bujónu kultúry obsahujúcej 10³ až 10⁵ ccu/ml. Kontrola rastu zahŕňa bujón bez liečiva inokulovaný M. hyopneumoniae a kontrolné inokulované médium je zahrnuté pri každom cykle experimentu. Po 7 dňoch inkubácie (36 °C) sa bujóny dvoch najvyšších koncentrácií obsahujúce liečivo vykazujúce farebnú zmenu spoja a použijú sa na inokuláciu čerstvej série roztokov liečiva v bujóne mykoplazmy (0,1 ml kultúry do 1,9 ml bujónu obsahujúceho liečivo). Tento postup sa opakuje každých 5 až 7 dni až do desiatich cyklov. Pokiaľ sa kmene mykoplazmy stanú odolné proti určitým antibiotikám alebo pri 10. cykle, každý kmeň sa kultivuje ešte raz v bujóne obsahujúcom liečivo a určí sa MIC.

Výsledky: MIC kmeňa „J“ M. hyopneumoniae a poľných izolátov pred a po vystavení antibiotikám sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3

In vitro vývoj odolnosti dvoch kmeňov M. hyopneumoniae

Zlúčenina	Kmeň	Pred prechodom MIC (pg/ml)	Po prechode MIC P10/P11 0 (pg/ml)	Vzrast odolnosti do (násobok rastu)
Valnemulín(ch)	NCTC 10110	0,0025	0,005	2
	poľný izolát	0,001	0,0025	2,5
Tylozín tartrát	NCTC 10110	0,25	> 5002)	>2000
poľný izolát	0,125	62,5 2)	500
Oxytetracyklín	NCTC 10110	0,25	1,0	4
hydrochlorid	poľný izolát	0,25	1,0	4
0 hladina prechodu in vitro 2) MIC po 8 prechodoch v bujóne mykoplazmy obsahujúcej tylozín

Ukázalo sa, že pred vystavením boli obidva kmene veľmi citlivé na valnemulín, s MIC 0,0025 pg/ml pre referenčný kmeň a 0,001 pg/ml pre poľný izolát. Tieto hladiny aktivity boli 50 až 100-krát vyššie ako hodnoty tylozínu a oxytetracyklínu. Tieto MIC výsledky sa použili na výber rozsahu roztokov pre liečivá v návykovej štúdii.

Po 10 cykloch vystavenia valnemulínu bol vývoj odolnosti minimálny pri obidvoch kmeňoch M. hyopneumoniae, MIC rástlo od 0,0025 pg/ml do 0,005 pg/ml a od 0,001 pg/ml do 0,0025 pg/ml pre referenčný kmeň a pre poľný izolát, v tomto poradí. Naproti tomu sa pri obidvoch kmeňoch M. hyopneumoniae vyvinula značná odolnosť na tartrát tylozínu. Pri referenčnom kmeni sa pri bujóne obsahujúcom tylozín prvá odolnosť objavila po 4 až 5 cykloch a pri ôsmom cykle vzrástla hodnota MIC nad 500 pg/ml, čo je viac ako 2000-násobný nárast odolnosti na toto antibiotikum (tabuľka 3). Značná odolnosť na tylozín sa vyvinula pri poľných izolátoch po ôsmich cykloch, vzrástla 500-krát na 62,5 pg/ml. Hladina odolnosti trvala pri bujóne obsahujúcom tylozín po 10 až 11 prechodoch. Štvornásobný vzrast odolnosti na oxytetracyklín sa pri obidvoch kmeňoch M. hyopneumoniae objavil po 10 cykloch vystavenia, hodnoty MIC vzrástli z 0,25 pg/ml na 1 pg/ml.

Výsledky ukazujú, že valnemulín je značne aktívnejší proti M. hyopneumoniae ako tylozín alebo oxytetracyklín, a že proti sebe nevyvoláva pri kmeňoch M. hyopneumoniae významnú odolnosť.

4. Prevencia experimentálne vyvolanej enzootickej pneumónie in vivo

Na odhadnutie potenciálu valnemulínu na prevenciu ochorení sa využil experimentálny model enzootickej pneumónie využívajúci spracovaný pľúcny materiál pôvodne pochádzajúci od gnotobiotických ošípaných s M. hyopneumoniae. Uskutočnili sa tri pokusy: Pokusy 1 a 2 boli dávkové titračné štúdie nových zlúčenín s použitím štandardného nakazeného kmeňa M. hyopneumoniae a v pokuse 3 sa odhadovala účinnosť zlúčeniny pri 200 ppm v krmive proti druhotne nakazenému kmeňu. Použili sa samce veľkých bielych ošípaných Landrace, staré 6 až 7 týždňov, z chovu bez infekcie M. hyopneumoniae. Nakazenými materiálmi sú pneumonické pľúca obsahujúce M. hyopneumoniae podávané ako homogenát intranazálne v troch po sebe nasledujúcich dňoch. Minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) valnemulínu proti kmeňu prítomnému v materiáli použitá v testoch 1 a 2 bola 0,016 pg/ml a MIC pre kmeň izolovaný z materiálu použitého v teste 3 bola 0,0078 pg/ml. Nakazený materiál bol pôvodne získaný pomocou infekcie gnotobiotických ošípaných M. hyopneumoniae a následným prechodom SPF (špecifický bez patogénu) ošípaných a skladovaný pod -70 °C.

Test 1: Medikácia hydrochloridom valnemulínu pomocou žalúdočnej trubice (žalúdočná sonda) raz denne pri 0 (kontrola), 2,5, 5, 7,5 alebo 10 mg/kg telesnej hmotnosti na deň. Šesť ošípaných na skupinu.

Test 2: Medikácia hydrochloridom valnemulínu v krmive pri 0, 100, 200, 300 alebo 400 ppm (ekvivalent 0, 5, 10, 15 alebo 20 mg/kg/deň). Šesť ošípaných v skupine.

Test 3: Medikácia hydrochloridom valnemulínu v krmive pri 0 alebo 200 ppm (ekvivalent 0 a 10 mg/kg/deň). Osem ošípaných v skupine. Medikácia sa uskutočňovala od prvého dňa vyvolania infekcie do posmrtného testovania uskutočňovaného asi 3 týždne po vyvolaní infekcie. Ochorenie sa stanovilo podľa počtu lézií na pľúcach [Camridgeský systém počítania lézií (Goodwin R.F.W. a Whittlestone, P., J. Hyg. 69 (1971) 391-397), kde počet je aproximáciou percentuálnej hodnoty pľúcneho tkaniva napadnutého pneumóniou], pomocou odhadu pomeru pľúca-telesná hmotnosť a pomocou izolácie M. hyopneumoniae z pľúc.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

Test 1: Medikácia pomocou žalúdočnej sondy, MIC 0,016 ^g/ml1)
Medikácia	Počet pľúcnych lézií	Pomer pľúca, telesná hmotnosť (%)
0	13,2	1,35
10 mg/kg/deň	1,7	1,08
7,5 mg/kg/deň	3,8	1,21
5 mg/kg/deň	11,1	1,31
2,5 mg/kg/deň	7,7	1,21

Test 2: Medikácia krmivom, MIC 0,016 gg/ml
Medikácia	Počet pľúcnych lézií	Pomer pľúca, telesná hmotnosť (%)
0	22,1	1,61
400 ppm, (20 mg/kg) 2)	6,3	1,24
300 ppm, (15 mg/kg)	12,7	1,27
200 ppm, (10 mg/kg)	12	1,29
100 ppm, (5 mg/kg)	25	1,53

Test 3: Medikácia krmivom, MIC 0,0078 μg/ml
Medikácia	Počet pľúcnych lézií	Pomer pľúca, telesná hmotnosť (%)
0	10,8	1,32
200 ppm, (10 mg/kg)	2,3	1,21

¹¹MIC hydrochloridu valnemulínu v ^g/ml proti M. hyopneumoniae izolovanej z nakazeného materiálu, ²¹ Približná denná dávka hydrochloridu valnemulínu na ošípanú

V teste 1 mali neliečené, nakazené ošípané stredný počet lézií 13,2. Valnemulín zníži počet lézií zo 71 % a 87 % pri dávkach 7,5 a 10 mg/kg, v tomto poradí, zatiaľ čo pri dávkach 2,5 a 5 mg/kg/deň sa počet lézií znížil s nižšou účinnosťou. M. hyopneumoniae sa znova izolovala z menej ošípaných medikovaných 10 mg/kg, v porovnaní s ošípanými medikovanými 2,5 mg/kg (1:4 ošípaným).

V teste 2 mali neliečené, nakazené ošípané stredný počet lézií 22,1. Ošípané medikované valnemulínom pri 200, 300 alebo 400 ppm mali zníženie počtu lézií zo 46 %, 43 % a 71 % v tomto poradí. Hmotnosti pľúc, ktoré môžu odrážať mikroskopické lézie rovnako ako veľké lézie, majú dramatickejší účinok, s výraznejším znížením hladiny smerom k 200 ppm. Pri ošípaných medikovaných 100 ppm nebolo pozorované žiadne zníženie počtu lézií. M. hyopneumoniae bola pri posmrtnom teste znova izolovaná zo všetkých neliečených ošípaných, ale nebola izolovaná z ošípaných medikovaných 400 ppm alebo 300 ppm valnemulínu. Izolovaná bola z 3 a 4 ošípaných medikovaných 200 ppm a 100 ppm, v tomto poradí.

V teste 3 mali neliečené ošípané stredný počet lézií 10,8; po medikácii valnemulínom pri 200 ppm v krmive sa znížil počet lézií zo 79 %. Nebol žiadny rozdiel v hladine M. hyopneumoniae detegovaného pri posmrtnom teste medzi liečenými a neliečenými ošípanými.

Valnemulín má preventívny účinok pri experimentálne vyvolanej enzootickej pneumónii pri ošípaných pri oddelených pokusoch s použitím nakazeného materiálu obsahujúceho dva rôzne kmene M. hyopneumoniae.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je vhodné pri liečbe enzootickej pneumónie pri ošípaných spôsobenej infekciou Mycoplasma hyopneumoniae. Na takéto použitie účinná dávka závisí od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa relatívne malá dávka podáva dlhý čas. Všeobecne sa však uspokojivé výsledky dosiahnu, keď sa činidlo podáva pri dennej dávke 5 mg/kg až 15 mg/kg telesnej hmotnosti, výhodne v rozdelených dávkach dvakrát až štyrikrát denne, alebo vo forme prostriedku s postupným uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat sa celková denná dávka pohybuje v rozsahu 100 mg až 1000 mg, výhodne 100 mg až asi 500 mg, pri podávaní raz alebo dvakrát denne.

Výhodne sa môže podávať pri samostatnej liečbe.

Výhodné dávky v pitnej vode sú 0,01 až 0,05 % hmotnosti vzhľadom na objem, najmä 0,01 až 0,025 %, a v krmive 100 až 400 ppm (g/metrická tona), výhodne 100 až 200 ppm (g/metrická tona).

B) Infekcia Serpulina hyodysenteriae

Infekcia Serpulina hyodysenteriae môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad tak, ako je opísané vo veterinárnej príručke, ako je Taylor D.J., v Pig Diseases, šieste vydanie (1995), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB na stranách 143 - 144. Výhodná aktivita činidla podľa vynálezu pri tomto použití sa určí napríklad nasledujúcim spôsobom:

1. Určenie MIC

Zahrnutých je deväť poľných izolátov infekcie S.hyodysenteriae z epidémie črevnej úplavice ošípaných a kmeň typu ATCC 31212 a ATCC 29796 {Serpulina innocens, skupina 3 (Fellstrom, C., Res. Vet. Sci. 59, (1995) 1-4). Identifikácia je založená na vzore hemolýzy na TSA („Tryticase“ sójový agar) s 5 % hovädzej krvi a na teste produkcie indolu a hydrolýze hipurátu (Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK). Baktérie sa prevedú z dosiek agaru do 0,9 % soľného roztoku a zákal sa upraví na hodnotu 1,0 na McFarlandovej stupnici, potom 10 μΐ každého izolátu inokuluje na doskách agaru dvojnásobnými koncentráciami hydrochloridu valnemulínu, hydrogenfumarátu, tiamulínu, dimetridazolu, hydrochloridu lincomycmu a tylozínu. Rast a hemolýza sa zaznamená po 4 dňoch anaerobného rastu a MIC sa určí ako najnižšia koncentrácia antibiotika, pri ktorej spirochéty nerastú.

Výsledky určenia MIC pre S. hyodysenteriae sú uvedené v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Hodnoty minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) pre 10 kmeňov Serpulina hyodysenteriae

Antimikrobiálna látka
MIC (Mg/ml)	Valnemulín (ch)	Tiamulín (HFU)	Dimetridazol	Lincomycín	Tylozín
0,0156	2	-
0,0312	4	-
0,0625	3	-	-
0,125		6	-
0,250		1	-
0,500		1	2	-
1	1	2	2	-
2			1		-
4
8			1		-
16			1
32				-
64			3	1
128				3	1
> 128				6	9
ch = hydrochlorid hfu = hydrogenfumarát

Všetky kmene S. hyodysenteriae boli vysoko citlivé na valnemulín, mali hodnoty MIC 2 - 32-krát nižšie ako pri tiamulíne. Vysoká citlivosť valnemulínu na S. hyodysenteriae robí zlúčeniny zaujímavé na použitie pri liečbe klinických prípadov infikovaných stád.

2. Určenie MIC

Minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) sa určí proti 10 kmeňom S. hyodysenteriae izolovaných z výkalov ošípaných, pomocou spôsobu riedenia agaru. NCTC (National Collection of Type Cultures) kmene alebo referenčné kmene sa použijú ako kontrola pri všetkých MIC testoch. Agarové médium pre S. hyodysenteriae obsahuje BAB2 (Unipath CM271) obsahujúce 7 % úplne defibrínovanej sterilnej krvi oviec. Všetky antimikrobiálne činidlá sa testovali v zdvojených roztokoch. Pripravené roztoky antibiotík sa pridajú k príslušnému objemu MH agaru, vopred ochladenému na 50 °C, zmiešajú sa a dolejú na objem 20 ml. Všetky inkubácie

S. hyodysenteriae sa uskutočňujú v anaeróbnej komore pri 37 °C (+/- 0,5 °C) (Don Whitley Scientific), ktorá poskytuje prísne anaeróbnu atmosféru obsahujúcu 80 % dusíka, 10 % vodíka a 10 % oxidu uhličitého. Všetky ostatné inkubácie sa uskutočňujú pri 37 °C. Všetky kmene sa inkubujú v aeróbnej atmosfére pri 37 °C 24 hodín. Počet organizmov sa upraví na optickú hustotu (OD) rovnajúcu sa lxlO⁸ jednotiek tvoriacich kolóniu (cfu) na ml s použitím MH bujónu ako blanku. Dosky obsahujúce antibiotikum sa duplicitne inokulujú s použitím multibodového inokulátora (Denley Instruments), čím sa získa doska inokula asi 1 μΐ poskytujúca inokulum 10⁴-10⁵ cfu na škvrnu pre všetky kmene (Amon, J. Antimicrob. Chemother. 21 [1988] 701-710; Ericson a kol., Acta Pathol. Microbiol. Et Immunol. Scand. 217 [1971] (B) dod. 1-90). Kontrolné dosky sa inkubujú za rovnakých podmienok ako testovacia doska. Hodnoty MIC sa odpočítajú po 24 a 48 hodinách, pričom druhý odpočet je konečný. MIC je definovaná ako najnižšia koncentrácia antibiotika, na ktorom neprebieha žiadny rast, bez ohľadu na jednotlivú kolóniu alebo nejasné zahmlenie spôsobené kolóniou (National Committee for Clinical Laboratory Standards [1989]), Antimicrobial Susceptibility Testing, NCCLC Publications SC3, Villanova, PA, USA).

MIC (v μg/ml) proti Serpulina hyodysenteriae boli pre valnemulín (0,1), tiamulín (0,3), lincomycín (50,0), tylozín (200,0) a dimetridazol (30,0). Všetky kmene S. hyodysenteriae boli citlivé na valnemulín, ktorý bol najaktívnejším činidlom testovaným 3-600-násobne.

2. Test vyvolania odpovede

Uskutočňovali sa dva testy prevencie dyzentérie ošípaných, keď sa valnemulín podávaný v rôznych inkluzných hladinách prirovnával k tiamulínu. Závažnosť ochorení sa stanovila pomocou evidencie klinického ochorenia, ktorá sa určí pomocou klinického skóre pre telesný stav, konzistenciu a zloženie výkalov. Určilo sa tiež vylučovanie Serpulina hyodysenteriae vo výkaloch, lézie pri posmrtnom teste, rýchlosť rastu a pomer konverzie krmiva pri podávaní.

Pri prvom teste sa podával hydrochlorid valnemulínu pri 20, 30 a 40 ppm a porovnával sa s hydrogenfumarátom tiamulínu podávaným pri 30 ppm a neliečenou kontrolnou vzorkou. V každej liečenej skupine sa použije päť skupín s 9 (5 až 6 týždňov starých) bežne chovaných ošípaných. Ošípané sa kŕmia nemedikovanou potravou 14 dní, potom sa nakazia štandardným kmeňom S. hyodysenteriae (P18A). Nakazenie sa uskutoční orálnou cestou v dvoch nasledujúcich dňoch. Medikované krmivo sa začne podávať deň po druhom nakazení. Druhý test sa uskutoční podobným spôsobom okrem toho, že sa použijú 4 skupiny s 9 ošípanými. Ošípaným sa podáva hydrochlorid valnemulínu v množstve 5, 10 a 20 ppm a porovnávajú sa s neliečenými kontrolnými zvieratami. Pri tomto teste sa použijú ošípané zo skupiny chovanej vonku a nakazia sa kmeňom S. hyodysenteriae izolovaným zo skupiny chovanej vonku, pri ktorom sa vopred preukázala schopnosť spôsobiť dyzentériu ošípaných. Pri obidvoch testoch sa kontrola klinického ochorenia uskutočňuje denne a zaznamenáva sa klinický stav ochorenia, rektálny výter sa odoberá dvakrát týždenne a izoluje sa z neho S. hyodysenteriae a v pravidelných intervaloch sa ošípané vážia. Tiež sa zaznamenáva príjem krmiva. Posmrtný test sa uskutočňuje 21 dní po nakazení a hrubé črevo sa testuje na prítomnosť lézií. Zo štyroch miest hrubého čreva sa odoberú zvyšky hlienu a kultivujú sa na 5. hyodysenteriae.

Pri prvom teste sa klinická dyzentéria ošípaných pozoruje najskôr pri neliečenej skupine 8 dní po nakazení a postihne 8 z 9 ošípaných. Klinické ochorenie bolo tiež pozorované pri 1 ošípanej zo skupiny, ktorej bol podávaný valnemulín v množstve 30 ppm a pri 2 z 9 zvierat z tiamulínovej skupiny. Výskyt ochorenia sa nepozoroval pri valnemulínových skupinách liečených 20 a 40 ppm. Pre kontrolnú skupinu bolo zaznamenané stredné klinické skóre 36 na ošípané v porovnaní so skóre 6 pre skupinu liečenú tiamulínom. Rozdiely medzi skóre zaznamenanými pre všetky liečené skupiny boli štatisticky iné ako pri kontrolných skupinách (p<0,001). Ľ5. hyodysenteriae Osa izolovala z rektálnych výterov odobraných všetkým ošípaným v kontrolnej skupine a tiež dvom chorým ošípaným zo skupiny liečenej tiamulínom. S. hyodysenteriae bola tiež izolovaná z dvoch ošípaných, ktoré dostali valnemulín v množstve 30 ppm, čo sa zhoduje s klinickými príznakmi dyzentérie ošípaných pozorovanej následne po náhodilom nakazení v tejto skupine. S. hyodysenteriae nebola izolovaná zo skupiny liečenej 20 a 40 ppm. Malý rozdiel bol v hmotnosti alebo pomere konverzie krmiva pri všetkých skupinách kŕmených medikovaným krmivom. Pri posmrtnom teste ošípané z kontrolnej skupiny a skupiny liečenej tiamulínom, ktoré mali klinické príznaky ochorenia, mali typické lézie dyzentérie ošípaných obsahujúce prichytený hlien s odumretím sliznicového povrchu hrubého čreva. Lézie boli tiež pozorované pri jednej ošípanej zo skupiny liečenej tiamulínom a kontrolnej ošípanej, pričom obidve skôr nemali klinické príznaky dyzentérie ošípaných. S.hyodysenteriae bola izolovaná zo všetkých hlienových výterov od všetkých týchto postihnutých ošípaných. Jedna ošípaná zo skupiny, kŕmenej valnemulínom pri 30 ppm, mala tiež lézie dyzentérie ošípaných, ale z hlienového výteru nebola izolovaná S¹, hyodysenteriae. Lézie neboli pozorované pri posmrtnom teste pri skupine liečenej valnemulínom pri 20 a 40 ppm.

Pri druhom teste bola klinická dyzentéria ošípaných pozorovaná najskôr pri neliečených kontrolných ošípaných 5 dní po nakazení a následne bolo postihnutých všetkých 9 ošípaných a 6 ošípaných z tejto skupiny muselo byť usmrtených z dôvodu závažnosti ochorenia. V skupine kŕmenej valnemulínom pri 5 ppm boli klinické príznaky dyzentérie ošípaných prvý raz pozorované 8 dní po nakazení a následne sa ochorenie prejavilo pri 5 z 10 zvierat. Ale počet postihnutých zvierat v skúpme liečenej valnemulínom pri 5 ppm bol výrazne nižší ako pri kontrolnej skupine (p<0,05). Klinické príznaky ochorenia neboli pozorované pri skupinách kŕmených valnemulínom pri 10 alebo 20 ppm. Stredný klinický stav 11 pre skupinu liečenú valnemulínom pri 5 ppm bol výrazne nižší ako stav 77 pre kontrolnú skupinu (p<0,005). S. hyodysenteriae bola izolovaná z rektálneho výteru odobratého všetkým kontrolným ošípaným v priebehu testu. Ale z 5 postihnutých zvierat zo skupiny liečenej valnemulínom pri 5 ppm bola S. hyodysenteriae izolovaná iba pri dvoch z týchto zvierat. Na konci testu boli ošípané kŕmené valnemulínom vo všetkých dávkach výrazne ťažšie ako kontrolné ošípané (5 ppm, p=0,05; 10 a 20 ppm, p<0,05, v tomto poradí). Pri posmrtnom teste boli lézie typické pre dyzentériu ošípaných pozorované na sliznici hrubého čreva 3 zostávajúcich kontrolných ošípaných. V skupine kŕmenej valnemulínom pri 5 ppm z 5 ošípaných, ktoré pôvodne mali príznaky ochorenia, iba 2 mali pri posmrtnom teste lézie, ale z týchto zvierat nebola izolovaná S. hyodysenteriae. Ale S. hyodysenteriae bola izolovaná z hlienového výteru z 2 ďalších zvierat, ktoré mali súčasne typické lézie, ale nemali príznaky ochorenia. Lézie neboli pozorované pri ošípaných kŕmených valnemulínom ani v množstve 10, ani v množstve 20 ppm a pri týchto skupinách nebola izolovaná <S. hyodysenteriae.

Valnemulín podávaný v množstve nižšom ako 10 ppm je účinný pri prevencii výskytu klinických príznakov dyzentérie ošípaných, zvyškov spirochét vo výkaloch a prítomnosti lézií pri posmrtnom teste. Pri 30 ppm niekoľko ošípaných nemalo klinické príznaky dyzentérie ošípaných, čo sa zhoduje s náhodnou nákazou, ktorú môže ovplyvniť podávanie antibiotík. Tieto vplyvy konkurenčného ochorenia pri podávaní antibiotík a výskyt dyzentérie ošípaných boli už opísané (Burch, D.G.S., Vet. Rec. 110 [1982] 244-246). Pri analýze hmotnosti sa nezistili žiadne rozdiely medzi liečenými skupinami, čo naznačuje, že antibiotiká nepôsobia na chuť krmiva. Pri 5 ppm valnemulínu nedochádza úplne k prevencii klinického ochorenia alebo vylučovania spirochét, ale dochádza k významnej redukcii klinických stavov a vylučovaniu spirochét v porovnaní s kontrolnými zvieratami. Pri tomto teste tiamulín podávaný pri 30 ppm nepôsobí preventívne na dyzentériu ošípaných, ale znižuje výskyt ochorení v porovnaní s kontrolnou skupinou za zníženia klinických stavov. Pri tomto teste medikácia v krmive je pri prevencii dyzentérie ošípaných valnemulínom pri 10 ppm jasne účinnejšia ako tiamulínom pri 30 ppm.

4. Ďalšia skúška vyvolania odpovede

Skupina 60 (3,5 až 4 týždne staré) bežne chované ošípané sa kŕmia nemedikovaným krmivom 14 dní, potom sa nakazia orálnou cestou štandardným kmeňom S. hyodysenteriae (P18A). Keď sú zrejmé klinické príznaky ochorenia, ošípané sa rozdelia do šiestich skupín po 8 ošípaných na skupinu a 10 dní sa im podáva krmivo obsahujúce antibiotiká, potom ďalších 14 dní nemedikované krmivo. Hydrochlorid valnemulínu sa podáva v množstve 50, 75, 100 a 150 ppm a na porovnanie sa podáva hydrogenfumarát tiamulínu v množstve 100 ppm a ďalej sa porovnáva s neliečenou kontrolnou skupinou. V každej skupine sa vyskytujú ošípané s mnohými príznakmi ochorenia. Po rozdelení do skupín sa výskyt klinického ochorenia sleduje denne a zaznamenáva sa klinický stav, rektálne výtery sa na izoláciu S. hyodysenteriae uskutočňujú dvakrát týždenne a ošípané sa v pravidelných intervaloch vážia. Zaznamenáva sa tiež prísun krmiva. Posmrtný test sa uskutočňuje 24 dní po nakazení a hrubé črevo každej ošípanej sa testuje na prítomnosť lézií. Zo 4 miest v hrubom čreve sa odoberá hlienový výter a kultivuje sa na S.hyodysenteriae.

Po nakazení a pred rozdelením bola pozorovaná klinická dyzentéria ošípaných 7 dní po nakazení a prvé dve liečené skupiny (kontrolná a tiamulínová) vznikli 8 dní po nakazení. Ďalšie skupiny vznikli po 12, 15, 20 a 28 dňoch po nakazení v nasledujúcom poradí: valnemulín pri 75, 50, 100 a 150 ppm. Každá skupina obsahovala ošípané, ktoré mali krv a/alebo hlien vo výkaloch, rovnako ako zvieratá, ktoré mali iba slabé klinické príznaky ochorenia, napríklad mäkké výkaly. Vo 4. dni testu všetky ošípané v neliečenej skupine mali závažné klinické príznaky ochorenia a boli usmrtené. V priebehu liečenia v tiamulínovej skupine celkom 3 zvieratá buď zomreli, alebo im bola poskytnutá eutanázia z dôvodov závažnosti dyzentérie ošípaných. Všetky ošípané liečené valnemulínom prežili do konca testu. V skupine kŕmenej valnemulínom vo všetkých množstvách klinické príznaky ochorenia rýchlo zmizli a klinické ochorenie nebolo pozorované do 5 dní testu. Vo 8. dni bolo toto zlepšenie tiež pozorované pri prežívajúcich ošípaných liečených tiamulínom. Stredné klinické skóre pri skupine valnemulínu sa pohybovalo od 4 do 10 v porovnaní so stredným skóre 30 zaznamenaným pri tiamulínovej skupine. Štatistická analýza klinického skóre pre dni 3 a 10 ukázala, že nebol významný rozdiel medzi všetkými skupinami liečených valnemulínom a tiamulínom (p<0,001). Pri všetkých ošípaných liečených valnemulínom pokračoval v priebehu liečby nárast hmotnosti a všetky mali vyšší denný nárast živej hmotnosti (DLWG) ako tiamulínová skupina (rozsah 0,4 až 0,9 v porovnaní s 0,1). Pomer konverzie krmiva (FCR) bol v priebehu liečby ďaleko vyšší pri skupine liečenej tiamulínom (6,4) v porovnaní so skupinou liečenou valnemulínom (rozsah 1,9 až 2,5). S. hyodysenteriae bola v čase rozdelenia izolovaná z väčšiny ošípaných v každej skupine. 5 dní po rozdelení nemohla byť S. hyodysenteriae detegovaná v rektálnom výtere odobratom od ošípaných vo všetkých liečených skupinách.

V čase po liečení jedna ošípaná zo skupiny kŕmenej valnemulínom pri 50 ppm mala klinické príznaky ochorenia 4 dni po ukončení podávania medikovaného krmiva a jedna ošípaná zo skupiny liečenej tiamulínom mala tiež dyzentériu ošípaných v poslednom dni testu. S. hyodysenteriae však nebola z výkalov týchto ošípaných izolovaná. V tomto čase po liečení sa vyskytli malé pozorovateľné rozdiely v DLWG alebo FCR medzi všetkými liečenými skupinami. Pri posmrtnom teste na konci pokusu neboli lézie dyzentérie ošípaných pozorované pri žiadnej ošípanej liečenej valnemulínom pri 75, 100 alebo 150 ppm. V skupine kŕmenej valnemulínom pri 50 ppm mala 1 ošípaná klinickú dyzentériu ošípaných a jedna ďalšia ošípaná z tejto skupi ny mala v tomto čase trocha červené hrubé črevo. 5. hyodysenteriae bola izolovaná tiež z hlienového výteru z týchto 2 ošípaných a z ďalších 3 zvierat z tejto skupiny, ktorá nemala lézie dyzentérie ošípaných. Jedna ošípaná v skupine kŕmenej valnemulínom pri 75 ppm mala tiež S. hyodysenteriae v hlienovom výtere, aj keď nemala klinické príznaky dyzentérie ošípaných.

Valnemulín pri 50, 75, 100 a 150 ppm poskytol zníženie počtu dní, ktoré boli potrebné na zotavenie sa z klinickej dyzentérie ošípaných v porovnaní s tiamulínom. V týchto skupinách liečených valnemulínom zvieratá nezomreli alebo nevyžadovali eutanáziu. Významný bol rozdiel (p<0,001) v klinických stavoch pri skupine liečenej valnemulínom v porovnaní so skupinou liečenou tiamulínom. Preventívne sa tiež pri všetkých hladinách valnemulínu pôsobilo na vylučovanie S. hyodysenteriae vo výkaloch po ukončení liečby. 5. hyodysenteriae však bola izolovaná z hlienového výteru z ošípaných liečených valnemulínom pri dávkach 50 a 75 ppm. Ukázalo sa, že tiamulín v množstve 35 a 40 ppm znižuje S. hyodysenteriae vo výkaloch, ale nepôsobí preventívne na zlepšenie hlienových výterov (Taylor, D. J., Vet. Rcc. 106, [1980] 526-528). Tiamulín pri 100 ppm bol úspešne použitý za experimentálnych podmienok (Taylor, D. J., Proc. 7* IPVS Congress Mexico [1982] 47) na liečbu dyzentérie ošípaných pri zvieratách, ktoré neboli tak závažne napadnuté, že by boli necitlivé. Pri tomto teste tiamulín pri 100 ppm znížil úmrtnosť v porovnaní s neliečenými kontrolnými zvieratami, ale nepôsobil preventívne proti niektorým úmrtiam, čo mohlo byť spôsobené závažnosťou ochorenia vyvolaného pri experimentálnom nakazení.

Pri tomto teste valnemulín v krmive pri 50, 75,100 a 150 ppm úspešne lieči experimentálne vyvolanú dyzentériu ošípaných pri prevencii úmrtnosti a zníženie klinických príznakov. V priebehu testu dochádzalo k prevencii vylučovania 5. hyodysenteriae za recidívy po ukončení liečby iba pri jednom zvierati liečenom 50 ppm. Valnemulín pri 50 a 75 ppm celkom nevylúči S. hyodysenteriae pri všetkých ošípaných, ale množstvo 100 ppm je veľmi účinné.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je preto vhodné pri liečbe dyzentérie ošípaných spôsobenej infekciou Serpulina hyodysenteriae. Na toto použitie sa bude účinné dávkovanie samozrejme meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu by sa podávalo relatívne malé množstvo dlhý čas. Všeobecne sa však uspokojivé výsledky získajú, pokiaľ sa činidlo podáva v dennej dávke od 1 mg/kg až 5 mg/kg hmotnosti zvieraťa, vhodne podávanej v rozdelenej dávke dvakrát až štyrikrát denne alebo ľubovoľne v krmive alebo vo vode, alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat je celková denná dávka 10 mg až 400 mg, napríklad 10 mg až 200 mg ako prevencia alebo 20 mg až 400 mg na liečbu, podávaná ľubovoľne v krmive alebo vo vode, alebo raz, alebo dvakrát denne.

Výhodné dávkovanie v pitnej vode sa pohybuje v rozsahu 0,001 až 0,05 % hmotnosť/objem, najmä 0,001 až 0,005 % a v krmive 20 až 100 g/metrická tona, najmä 20 až 75 g/metrická tona.

C) Kolitída ošípaných súvisiaca s infekciou Serpulina pilosicoli

Kolitída môže byť zisťovaná bežným spôsobom, napríklad ako je opísané vo veterinárnej príručke, ako od Taylor, D. J., v Pig Deseases, šieste vyd. (1995), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB na stranách 148 - 149. Výhodnosť aktivity činidla podľa predloženého vynálezu pri tomto použití sa určí napríklad nasledujúcim spôsobom:

1. Hodnoty MIC

Deväť poľných izolátov WBHS z epidémie dyzentérie ošípaných bolo získaných od skupín s a bez hnačky a ATCC 29796 (Serpulina innocens, skupina 3) (Fellstrôm C., Res. Vet. Sci. 59 [1995] 1-4. Identifikácia je založená na vzore hemolýzy na TSA („Tryticase“ sójovom agare) s 5 % hovädzej krvi a na teste produkcie indolu a hydrolýzy hipurátu (Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK). Z deviatich slabo 0-hemolytických spirochét bola jedna označená ako skupina 2, štyri ako skupina 3 a päť ako skupina 4 (Fellstrôm). Baktérie sa preniesli z dosiek agaru do 0,9 % soľného roztoku a zákal sa upravil na 1,0 podľa McFarlandovej stupnice, potom sa 10 pil každého izolátu inokulovalo na dosky agaru s dvojnásobnými koncentráciami nasledujúcich antimikrobiálnych látok: hydrochlorid valnemulínu, hydrogenfumarát tiamulínu, dimetridazol, hydrochlorid linkomycínu a tylozin. Rast a hemolýza sa zaznamenali po 4 dňoch anaeróbneho rastu a MIC sa určilo ako najnižšia koncentrácia antibiotík, pri ktorej spirochéty nerastú.

Výsledky určenia MIC pre WBHS sú uvedené v tabuľke 6. Všeobecne bolo WBHS citlivé na všetkých päť antimikrobiálnych činidiel. Pre všetky testované antimikrobiálne látky nebol zistený žiadny rozdiel v citlivosti medzi troma skupinami WBHS. Hodnoty MIC získané pre valnemulín sú na najnižšej hodnote pre 9 z 10 kmeňov, zatiaľ čo pre všetky 4 uvedené zlúčeniny sú tieto hodnoty ďaleko vyššie pre veľkú väčšinu kmeňov.

Vyššia citlivosť valnemulínu na obidve WBHS ju robí zaujímavou na použitie pri liečbe klinických prípadov nakazených skupín.

Tabuľka 6

Hodnoty minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) pre 10 slabo 0-hemolytických spirochét

Antimikrobiálne činidlo IJ
MIC (ug/ml)	Valnemulín (ch)	Tiamulín (HFU)	Dimetridazol	Lincomycín	Tylozín
0,0156	9	4
0,0312	-	2
0,0625	-	3	2
0,125		-	4
0,250		-	4
0,500		-	-	4
1	1	1	-	1
2			-		2
4
8			-		1
16			-
32				1
64			-	1
128				3	-
> 128				-	7
υ číslica je počet slabo β-hemolytických spirochét, pri ktorých sa zistilo, že majú takú hodnotu MIC, ch = hydrochlorid; hfu = hydrogenfumarát

Činidlo podľa predloženého vynálezu je vhodné pri liečbe kolitídy ošípaných spojenej s infekciou Serpulina pilosicoli. Na toto použitie sa bude samozrejme účinné množstvo meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa bude podávať relatívne malé množstvo dlhý čas. Všeobecne sa však dosiahli uspokojivé výsledky, keď sa činidlo podávalo v dennej dávke 1 mg/kg až 5 mg/kg hmotnosti zvieraťa, vhodne podávané v rozdelených dávkach dvakrát až Štyrikrát denne alebo ľubovoľne v krmive alebo vode, alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat sa celková denná dávka pohybuje v rozsahu 10 mg až 400 mg, napríklad 10 mg až 200 mg pri prevencii alebo v rozsahu 20 mg až 400 mg pri liečbe, pri podávaní ľubovoľne v krmive alebo vo vode, alebo raz, alebo dvakrát denne.

Výhodné dávky v pitnej vode sa pohybujú v rozsahu 0,001 až 0,05 % hmotnosť/objem, zvlášť 0,001 až 0,005 % a v krmive 20 až 100 g/metrická tona, výhodne 20 až 75 g/metrická tona.

D) Ileitída pri ošípaných súvisiaca s infekciou Lawsonia intracellularis

Infekcia Lawsonia intracellularis môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad ako je opísané vo veterinárnej príručke Taylor, D. J., v Pig Deseases, šieste vyd. (1995), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB na stranách 148-149. Výhodnosť aktivity činidla podľa predloženého vynálezu pri tomto použití sa urči napríklad nasledujúcim spôsobom:

1. Aktivita in vitro

Všeobecne sa postupovalo podľa spôsobu opísaného v Lawson G. H. K. a kol., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142, ale uskutočnili sa niektoré úpravy (štandardné Kirby-Bauerove diskové metódy nie sú použiteľné pre intraceluláme baktérie):

Bunky: Pripravili sa monovrstvy bunkových kultúr enterocytov krýs IEC-18 (ATCC CRL 1589) a udržiavali sa pomocou štandardných metód kultivácie buniek. Jeden deň staré monovrstvy delených buniek (asi 30 % splývanie) sa na infekciu v dni 0 nanesú na krycie sklíčko v malých kultivačných fiolkách (Tracs).

Inokulum: Ako inokulum sa použijú šarže troch kmeňov Lawsonia intracellularis. Tieto sa získajú z ošípaných postihnutých proliferatívnou enteropatiou, z foriem proliferatívnej hemoragickej enteropatie (PHE) a intestinálnej adenomatózy (PIA) pripravených z vnútorností ošípaných a nechajú sa prejsť bunkovými kultúrami, ako je už skôr opísané v Lawsonovom odkaze. Dva kmene PHE sa čiastočne testovali na patogenitu pri ošípaných, ako je opísané v McOrist, S. a kol., Infect. Immun. 61 (1993) 4286-4292. Šarže inokula sa po niekoľkých bunkových cykloch zozbierajú a skladujú sa zmrazené pri -70 °C v 1 ml fiolkách. Predbežným testom sa stanovia vhodné zriedenia vo fiolkách po roztopení, ktoré môžu viesť k ľahko rozlíšiteľným bunkovým infekciám pri 5 dňovej skúške.

Antibiotiká sa na každé použitie pripravia ako 1 OOx zásobné roztoky. Aktivita každej šarže antibiotika sa potvrdí pomocou štandardnej Kirby-Bauerovej diskovej metódy s laboratórnym kmeňom Escherichia coli.

Infekcia: V dni 0 sa fiolka každého kmeňa nechá roztopiť, zriedi sa kultivačným médiom 1/8 až 1/32 a použije sa v skupinách 1 až 4.

Pre skupinu 4 (kontinuálne pôsobenie) sa toto inokulum najskôr pred pridaním buniek inkubuje 1 hodinu pri 37 °C v kultivačnom médiu obsahujúcom antibiotiká s rôznymi koncentráciami.

Pre skupinu 3 (extraceluláme pôsobenie) sa toto inokulum pripraví v kultivačnom médiu obsahujúcom antibiotiká s rôznymi koncentráciami, pridaných bezprostredne pred pridaním buniek.

Pre skupinu 1 (kontrolná) a 2 (intraceluláme pôsobenie) sa inokulá pripravia v kultivačnom médiu bez antibiotík a pridajú sa k bunkám. Kultivačné fiolky (Tracs) s bunkami s pridaným inokulom (+/-antibiotiká) v celkom 0,5 ml média sa umiestnia do oceľovej nádoby, evakuujú sa na 40 % atmosférického tlaku (8 % kyslíka), nechajú sa 2 minúty, naplnia sa vodíkom a nakoniec 10 % oxidu uhličitého. Kultivačné fiolky sa potom vyberú z nádob a umiestnia sa do inkubátora, ktorý má nastavenú vlhkú atmosféra obsahujúcu 8 % kyslíka, 8,8 % oxidu uhličitého a zvyšok dusíka, pri 37 °C.

V dvoch dňoch 1 a 2 sa všetky fiolky vyberú a znova sa naplnia čerstvým médiom, ktoré obsahuje buď antibiotiká, skupiny 2 a 4, alebo neobsahuje antibiotiká, skupiny 1 a 3, a umiestnia sa do inkubátora. V dni 5 sa všetky krycie sklíčka vyberú a poškvrní sa Lawsonia intracelularis pomocou neprítomných imunoperoxidázových škvŕn obsahujúcich špecifickú monoklonálnu protilátku. Ako hlavné meradlo infekcie sa použije počet buniek na každom krycom sklíčku, ktoré sú ťažko infikované Lawsonia intracelularis (>30 na bunku, ťažko infikovaná bunka=HIC). Tiež sa zaznamenáva počet ložísk z HIC a všeobecné pozorovanie buniek. HIC v kontrolnej skupine (skupina 1), test intraceluláme aktívnych antibiotík (skupina 2), test extraceluláme aktívnych antibiotík (skupina 3) a test kontinuálneho pôsobenia (skupina 4) sa porovnávajú v trojnásobných testoch, vždy až pre tri kmene. Niektoré testy sa opakujú pre rôzne sily inokula. Percentuálne pomery sa vypočítajú po odvodení strednej hodnoty HIC kontrolného testu zodpovedajúceho príslušnej testovanej skupine. Stredná hodnota HIC kontrolného testu je celkový počet HIC v kontrolných kultivačných fiolkách delený počtom infikovaných kontrolných kultivačných fioliek. Percentuálny pomer testovaných kultivačných fioliek sa potom vypočíta delením ich hodnôt HIC strednou hodnotou kontrolnej HIC, násobené 100 za získania percentuálnej hodnoty. To znamená, že testované kultivačné fiolky, kde nepôsobili antibiotiká, môžu mať percentuálny pomer asi 100, a kde antibiotiká spôsobili úplnú inhibíciu rastu, môže byť pomer 0.

Získané výsledky s hydrochloridom valnemulínu tak, ako boli zaznamenané, sú uvedené v tabuľke 7, ktorá uvádza percentuálny obsah buniek, ktoré po spracovaní zostávajú neinfikované.

Tabuľka 7

Percentuálne pomery infekcie Lawsonia intracelularis bunkových kultúr s pridaním valnemulínu

Valnemulín (ch) koncentrácia (/zg/rnl)	Kmeň skupiny	Kmeň skupiny
2	3	4	2	3	4
8	0	0	0	0,86	0,2	0,5
	0	0	0	0	0	1,4
	0	0	0	0	1,4	0,2
4				0	0	0,8
				0	0,83	2,5
2	0	0	0
	0	0	0
	0	-	28
ch = hydrochlorid

Výsledky ukazujú, že minimálna koncentrácia hydrochloridu valnemulínu spôsobujúca výraznú inhibíciu rastu Lawsonia intracelularis (<1 % rast) je 2 μg/ml.

2. Test vyvolania odpovede

Tridsaťpäť odstavených ošípaných sa nakazilo v rovnaký deň virulentným inokulom Lawsonia intracelularis (kmeň LR 189/5/83), izolát kauzatívneho činidla proliferatívnej enteropatie ošípaných sa získa kultiváciou v bunkovom kmeni enterocytov krýs IEC-18 (ATCC CRL 1589), ako je opísané v Lawson a kol., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142. Sedem kontrolných ošípaných sa dávkuje roztokom pufra. Sedem z 21 nakazených ošípaných sa nechá neliečených. Pri týchto 7 ošípaných sa znížila hmotnosť a pri všetkých sa vyvinuli lézie proliferatívnej enteropatie, ktoré boli nájdené v častiach zažívacieho traktu odobratého pri nekropsii tri týždne po teste. Šesť z týchto 7 ošípaných malo silne viditeľné lézie, tri mali miernu hnačku dva týždne po teste. Na testovanie „preventívnej“ dávkovacej stratégie boli dve ďalšie skupiny nakazených ošípaných dávkované orálne hydrochloridom valnemulínu v dávkach 25 ppm a 75 ppm, v tomto poradí (t. j. 1,25 mg/kg a 3,7 mg/kg) pomocou zmesi podávanej 2 dni pred nakazením, ktoré pokračovalo až do eutanázie. Na testovanie „liečenej“ stratégie boli dve ďalšie skupiny nakazených ošípaných dávkované orálne valnemulínom pri 25 ppm a 75 ppm pomocou zmesi podávanej sedem dní po nakazení, až do eutanázie.

Pri nekropsii neboli viditeľné v častiach čreva žiadne lézie proliferatívnej enteropatie pri 3 zo 7 ošípaných v preventívnej skupine a pri 5 zo 7 ošípaných v liečenej skupine. Kontrolné ošípané zostali normálne. Preto valnemulín pôsobí preventívne alebo liečebne pri ochoreniach veľkej časti nakazených ošípaných dokonca aj pri nízkych účinných dávkach liečiva.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je teda vhodné pri liečbe ileitídy ošípaných spojenej s infekciou Lawsonia intracelularis. Na toto použitie sa bude samozrejme účinné množstvo meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa bude podávať relatívne malé množstvo dlhý čas. Ale všeobecne sa dosiahli uspokojivé výsledky, keď sa činidlo podávalo v dennej dávke 1,5 mg/kg až 6,5 mg/kg hmotnosti zvieraťa, vhodne podávanej v rozdelených dávkach dvakrát až štyrikrát denne alebo ľubovoľne v krmive alebo vode, alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat sa celková denná dávka pohybuje v rozsahu 10 mg až 1000 mg, výhodne 15 mg až 500 mg, pri podávaní raz alebo dvakrát denne.

Výhodné dávky v pitnej vode sa pohybujú v rozsahu 0,001 až 0,05 % hmotn./objem, zvlášť 0,001 až 0,005 % a v krmive 20 až 400 g/metrická tona, výhodne 20 až 200 g/metrická tona.

E) Chronické respiračné ochorenia a artritída hydiny súvisiace s infekciou Mycoplasma gallisepticum

Infekcia môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad testom na Mycoplasma gallisepticum, ktorý je opísaný vo veterinárnej príručke, ako je Diseases of Poultry, 8. vyd. (1984), vyd. Hofstad a kol., Iowa State University Press, na stranách 196 - 198. Výhodná aktivita činidla podľa predloženého vynálezu pri tomto použití sa určí napríklad nasledujúcim spôsobom:

1. Aktivita in vitro: MIC

Antimikrobiálne pôsobenie hydrochloridu valnemulínu sa určí pomocou štandardnej sériovej techniky mikroriedenia v porovnaní s tylozínom (Tylan soluble) a hydrogenfumarátom tiamulínu.

12,8 mg testovanej zlúčeniny sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody za získania zásobného roztoku, ktorý sa skladuje pred použitím pri -20 °C. Použitými referenčnými kmeňmi Mycoplasma gallisepticum sú X95, S6 Holland, S6 Bench (Anglicko), MS-16 (Japonsko), MK-7 (Japonsko) a 1226 a rôzne čerstvé poľné izoláty.

Citlivosť kmeňov na antibiotiká sa testovala s použitím modifikovaného postupu „mikrobujónového“ riedenia (Stipkovits a kol., Vet. Microbiol. 15 [1987] 65-70). S použitím dvojnásobného zriedenia antibiotika sa testovacie médium pridalo (100 μΐ) do každej jamky mikrotitračnej dosky. Inokulum (100 μΐ) obsahuje 10⁵ cfu/ml. Dosky sa utesnia izolepou a inkubujú sa tri dni pri 37 °C. Najnižšia koncentrácia antibiotika, ktorá pôsobí kompletne preventívne na farebnú zmenu média v treťom dni odpočítania, je minimálna inhibičná koncentrácia (MIC). Pri jamkách bez farebnej zmeny sa kontroluje životaschopnosť mykoplazmy jej prenesením na agar. Všetky kmene mykoplazmy sa kultivujú v 10 ml média B (Emo H. a Stipkovits L., Acta Vet. Scand. 14 [1973] 436-449). Po inkubácii pri 37 °C do skorej logaritmickej fázy rastu sa 1 ml alikvotné diely kultúry rozdelia do skúmaviek ako očkovacie kultúry a skladujú sa pri -20 °C. Kmene Mycoplasmy fermentujúce glukózu sa testujú v modifikovanom médiu Bg doplnenom 1 % glukózy (pH 7,8), kmene hydrolyzujúce arginín v médiu Ba (Emo H. a Stipkovits L., 450-463) obsahujúcom 1 % arginínu (pH 7,3) a kmene negatívne na arginín a glukózu v médiu B obsahujúcom 1 % trifenyltetrazóliumchloridu.

Vypočítajú sa stredné hodnoty MIC pre rôzne skupiny kmeňov a antibiotík s ohľadom na zriedenie.

Hodnoty MIC referenčných kmeňov sú uvedené v tabuľke 8, hodnoty MIC izolátov Mycoplasmy v tabuľke 9.

Tabuľka 8

Hodnoty MIC referenčných kmeňov Mycoplasma gallisepticum ^g/ml)

Kmene	Valnemulín (ch)	Tiamulín (hfu)	Tylozín
Bench	0,0312	0,0312	0,0312
Holland	0,0312	0,0312	0,0312
MK-7	0,0078	0,0312	0,0312
MS-16	0,0312	0,0312	0,0312
1226	0,0312	0,25	0,0312
ch = hydrochlorid, hfu = hydrogenfumarát

Tabuľka 9

Hodnoty MIC izolátov Mycoplasmy hydinového pôvodu

Izolát	Valnemulín (ch)	Tiamulín (hfu)	Tylozín
20002	0,0625	0,25	0,25
20006	0,0625	0,0625	0,25
20008	0,0625	0,0625	0,0625

Izolát	Valnemulín (ch)	Tiamulín (hfu)	Tylozín
20174	0,0625	0,25	0,25
20175	0,0625	0,5	2,0
20176	0,0625	0,25	2,0
20177	0,0625	0,25	1,0
20178	0,0625	0,5	2,0
20224	0,0312	1,0	4,0
20312	0,0312	0,25	4,0
20321	0,0312	0,0312	0,5
20472	0,0312	1,0	16,0
20473	0,0312	0,5	32,0
20474	0,0312	1,0	16,0
20475	0,0312	0,5	32,0

Výsledky získané s referenčnými kmeňmi mykoplazmy ukazujú, že tri zlúčeniny majú viacmenej rovnaký rozsah pôsobenia. Hodnoty MIC vtáčích poľných izolátov však odrážajú zreteľný rozdiel medzi testovanými zlúčeninami: ukázala sa jednotne vysoká citlivosť proti valnemulínu (0,03 až 0,06 Mg/ml), citlivosť proti tiamulínu je trocha nižšia (0,06 až 1 Mg/ml) a na tylozín sú kmene dokonca necitlivé (0,06 - 32 Mg/ml ).

2. Štúdia vyvolania odpovede

2.1. Prevencia

Skupiny samcov kuriat sa nakazia virulentným kmeňom Mycoplasma gallisepticum (MG) a každá skupina sa medikuje v tomto poradí nasledujúcim spôsobom: valnemulín (koncentrácia 0,00312, 0,00625, 0,0125 a 0,025%), tiamulín (0,00625, 0,0125 a 0,025 %) a tylozín (0,05 %). Infekcia sa uskutoční v dni 2 pomocou injekcie 0,1 ml kultúry Mycoplasma gallisepticum obsahujúcej asi 10⁶ cfu životaschopných organizmov do každého pľúca (Jordán F. T. W., The Veterinary Record 127 [1990] 502) a medikácia sa začne v hodine infekcie a pokračuje tri nasledujúce dni. Tiež sa sleduje infikovaná neliečená skupina a nenakazená skupina.

Získané výsledky ukazujú, že prevencia klinických príznakov a mortalita boli dostatočne uspokojivé pre skupiny liečené dvoma vyššími dávkami valnemulínu (0,0125 a 0,025 %), troma dávkami tiamulínu a koncentráciou tylozínu. Lézie boli menej pozorované pri kurčatách a boli menej závažné s tylozínom, potom s tiamulínom a s dvoma vyššími dávkami valnemulínu (0,0125 a 0,025 %). Dve nižšie dávky valnemulínu boli v tomto ohľade menej účinné. Najväčší prírastok hmotnosti bol pri skupinách medikovaných tylozínom; ďalej, ale výrazne nižší (p<0,05) bol pri skupine neinfikovaných vtákov, pri tiamulínovej skupine a valnemulínovej skupine, ale pri najnižších dávkach. Najnižší prírastok hmotnosti sa dosiahol so skupinou medikovanou najnižšou dávkou valnemulínu a infikovanou a neliečenou skupinou, ale nebol medzi nimi veľký rozdiel. MG sa znova nezískala v priebehu života alebo nekropsie z nenakazenej skupiny kuriat zo skupiny s najvyššími dávkami tiamulínu a tylozínu a bola izolovaná iba pri jednom vtákovi zo skupiny liečenej najvyššou dávkou valnemulínu. Pri všetkých ostatných nakazených skupinách bol dosiahnutý vyšší podiel izolácie. Sérologické výsledky nie sú v tomto ohľade dokonalé, pretože v tejto skupine bol relatívne vysoký podiel pozitívnych reakcií.

Zistilo sa, že dve vyššie dávky valnemulínu sú účinné rovnako ako referenčné zlúčeniny pri prevencii infekcie Mycoplasma gallisepticum mladých kuriat.

2.2. Liečba

Skupiny samcov kuriat sa nakazia virulentným kmeňom Mycoplasma gallisepticum (MG) a každá skupina sa medikuje v tomto poradí valnemulínom pri koncentrácii 0,0125 %, 0,025 %, 0,05 %, tiamulínom pri rovnakých koncentráciách, tylozínom pri koncentrácii 0,05 % a kombináciou lincospectín-spectinomycín (Linco-Spectin) pri koncentrácii 0,083 %. Vytvorená bola tiež jedna infikovaná neliečená skupina a neinfikovaná skupina. Kuratá sa nakazia v druhom dni veku pomocou injekcie 3,4xl0⁵ organizmu do každého pľúca. Medikácia pomocou pitnej vody sa začala o 24 hodín neskôr a nasledovala ďalšie 3 dni okrem Linco-Spectinu, ktorého liečba trvala 5 dní.

Získané výsledky ukázali, že kontrola mortality, nižšia ako 5 %, je najlepšia so všetkými troma koncentráciami valnemulínu a s tiamulínom pri koncentrácii 0,05 %. Lézie neboli pozorované pri kurčatách liečených najvyššími a najnižšími dávkami valnemulínu a iba pri niekoľkých kurčatách liečených tiamulínom a tylozínom. Prírastok hmotnosti pre skupiny liečené valnemulínom pri všetkých koncentráciách bol vyšší ako pre skupiny liečené tiamulínom a rovnaký pre skupinu liečenú tylozínom. Mycoplazma nebola znova získaná pri ukončení experimentu po 23 dňoch z 3 skupín vtákov dostávajúcich valnemulín a tiamulín. Zo súčasne uskutočnených sérologických testov je zrejmé, že vo všetkých nakazených skupinách boli aj pozitívne reakcie.

Vzhľadom na mortalitu, prírastok hmotnosti, izoláciu MG a výsledky aglutinačného testu séra, dve vyššie dávky (0,025 % a 0,05 %) valnemulinu podávaného v pitnej vode poskytujú najmenej rovnako dobré alebo lepšie výsledky ako tiamulín pri 0,05 % alebo tylozín pri 0,05 % a ďaleko lepšie ako Linco-Spectin.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je vhodné pri liečbe chronického respiračného ochorenia a artritídy hydiny spojenej s infekciou Mycoplasma gallisepticum. Na toto použitie sa bude účinné množstvo meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa bude podávať relatívne malé množstvo dlhý čas. Všeobecne však boli dosiahnuté uspokojivé výsledky, keď sa činidlo podávalo v pitnej vode v dávkach 0,005 až 0,05 % hmotn./objem, vhodne 0,01 až 0,03 % a v krmive 20 až 400 g/metrická tona, výhodne 20 až 200 g/metrická tona.

F) Sekundárna infekcia Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae a/alebo infekcia Haemophilus parasuis

Sekundárna infekcia Pasteurella multocida, Actinobacillus (haemophilus) pleuropneumoniae a/alebo infekcia Haemophilus parasuis môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad ako je opísané vo veterinárnej príručke, ako je Taylor D. J., Pigs Diseases, šieste vydanie, (1195), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB, na stranách 185 - 187; 188 - 194 a 194 - 197. Výhodné pôsobenie činidla podľa predloženého vynálezu sa určí napríklad nasledujúcim spôsobom:

Určí sa minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) hydrochloridu valnemulinu proti novým izolátom Pasteurella multocida, Haemophilus pleuropneumoniae a Haemophilus parasuis pochádzajúcim z dýchacieho ústrojenstva ošípaných a porovná sa s tiamulínom. Použijú sa kultúry bakteriálnych izolátov obsahujúce 10 P. multocida, 10 H. pleuropneumoniae a 3 //. parasuis izolované v posledných 5 rokoch z chorých ošípaných, na ktorých sa uskutočňovali posmrtné testy. Tri z izolátov Pasteurella boli toxigénne kmene Pasteurella multocida. Pre H. pleuropneumoniae a H. parasuis bolo jeden deň pred testovaním jedno očko každej čistej kultúry inokulované do 10 ml bujónu Todd & Hewitt (Unipath CM 190) obsahujúceho 1 % donomého hovädzieho séra a 2 mg na ml nikotmamidadeníndinukleotidu (NAD). Pre P. multocida bolo v deň testovania jedno očko každej čistej kultúry naočkované do 10 ml živného bujónu č. 2 (Unipath CM67) obsahujúceho 1 % donomého hovädzieho séra. Každý z pripravených kultivačných bujónov sa inkubuje 18 hodín pri 37 °C v 10 % oxide uhličitom. Po inkubácii a v deň testu sa pri 23 kultivačných bujónoch zníži pomocou fyziologického soľného roztoku počet organizmov v prostriedku na inokuláciu MIC kultivačného média na I0⁵-10⁶ na ml. Aby sa overili výsledky testu MIC, stanoví sa pre každú testovanú zlúčeninu štandardnej kontrolnej kultúry z Oxford Staphylococcus aureus NCTC 6571. V každom prípade kultúra bujónu získaná z kontrolných organizmov je identická ako kultúra z testovaných organizmov. Valnemulínje hydrochlorid, tiamulín sa použije ako hydrogenfumarát. V deň testovania sa v destilovanej vode pripravia zásobné roztoky testovaných zlúčenín obsahujúce 3,2 mg/ml aktívnej zložky. Deväť dvojnásobných zriedení sa potom ďalej pripraví v sterilnej destilovanej vode za získania rozsahu 320 pg až 1,25 pg na ml každého antibiotika na pridanie do MIC média. Citlivý agar (Oxoid CM409) obsahujúci lyzovanú konskú krv (Oxoid SR50) sa pripraví podľa odporúčania výrobcu a pokiaľ je to potrebné, pH sa upraví na 7,4. Pre všetky šarže MIC média pripraveného na testy MIC proti dvom druhom Haemophilus sa na dosiahnutie potrebného rastového faktora pridajú 2 mg NAD na ml. 18 ml rozohriatého agaru (50 °C) sa zmieša s 2 ml (jeden v desiatich zriedeniach) každého pripraveného zriedenia testovanej zlúčeniny v 90 mm Petriho miskách. Z každého zriedenia sa pripravia 4 kópie zriedenia. Pre každý test MIC sa tiež pripravia 4 kópie dosiek obsahujúcich 18 ml agaru a 2 ml sterilnej destilovanej vody, pomocou ktorých sa indikuje rast.

Sušené MIC dosky sa inokulujú 0,2 pl pripravených testovaných organizmov, tie, ktoré sa inokulujú P. multocida, sa inkubujú na vzduchu pri 37 °C 18 hodín a tie, ktoré sa inokulujú H. pleuropneumoniae a H. parasuis, sa inkubujú pri 37 °C 18 hodín v 10 % oxide uhličitom. Po inokulácii sa rast organizmov testuje najskôr vizuálne a potom mikroskopicky pomocou „stereo zoom“ mikroskopu. Hodnoty MIC sú uvedené ako najnižšia koncentrácia testovanej zlúčeniny, pri ktorej sa nedeteguje žiadny rast vo chvíli inokulácie na všetkých štyroch doskách pomocou mikroskopického pozorovania.

Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 10.

Tabuľka 10

Hodnoty MIC (Tg/ml)

Patogén	Zlúčenina
	Valnemulín (ch)	Tiamulín (hfu)
Pasteurella multicida
Rozsah	2,0 - 8,0	4,0 - 16
Priemer	3,8	9,2
Haemophilus pleuropnemoniae

Patogén	Zlúčenina
	Valnemulín (ch)	Tiamulín (hfu)
Rozsah	0,125-4,0	0,125-16
Priemer	0,85	4,5
Haemophilus parasuis
Rozsah	0,25	0,5 - 1,0
Priemer	0,25	0,7
ch = hydrochlorid hfu = hydrogenfumarát

Zistilo sa, že valnemulín v porovnaní s tiamulínom má strednú aktivitu proti P. multocida 2,5-krát vyššiu, 5,5-krát vyššiu aktivitu proti H. pleuropneumoniae a trikrát vyššiu aktivitu proti H. parasuis.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je vhodné pri liečbe sekundárnej pneumónie ošípaných spojenej s infekciou Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae a/alebo Haemophillus parasuis. Na toto použitie sa bude účinné množstvo meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa bude podávať relatívne malé množstvo dlhý čas. Všeobecne však boli dosiahnuté uspokojivé výsledky, keď sa činidlo podávalo v dennej dávke 5 mg/kg až 15 mg/kg hmotnosti zvieraťa, vhodne podávané ľubovoľne v krmive alebo vode, alebo v rozdelených dávkach dvakrát až štyrikrát denne alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat sa celková denná dávka pohybuje v rozsahu 100 mg až 1000 mg, výhodne 100 mg až 500 mg, pri podávaní raz alebo dvakrát denne.

Výhodne môže byť zlúčenina podávaná v samostatnej terapii.

Výhodné dávky v pitnej vode sa pohybujú v rozsahu 0,01 až 0,5 % hmotn./objem, výhodne 0,01 až

O, 025 % a v krmive 100 až 400 ppm (g/metrická tona), výhodne 100 až 200 ppm.

G) Pneumónia pri jahňatách, ovciach a hovädzom dobytku súvisiaca s infekciou Pasteurella haemolytica

Infekcia Pasteurella haemolytica môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad ako je opísané vo veterinárnej príručke, ako je Veterinary Medicíne, ôsme vydanie (1994), vyd. Radostits O. M., Blood D.C. a Gay C. C., publ. Bailliere Tindal, Londýn, VB, na stranách 748-770. Výhodná aktivita zlúčeniny podľa predloženého vynálezu pri tomto použití môže byť preukázaná napríklad nasledujúcim spôsobom:

Klinická účinnosť sa určí pri dvoch prostriedkoch hydrochloridu valnemulínu pri liečbe pneumónie teliat spôsobenej kontrolovanou nákazou Pasteurella haemolytica Al:

V dni -6 sa 24 teliat, pri ktorých bol uskutočnený nosný výter a bolo preukázané, že nemajú P. haemolytica Al, odvážilo a rozdelilo do štyroch liečebných skupín po šiestich. Skupiny boli vyvážené podľa telesnej hmotnosti a podľa pohlavia. Teľatá sa umiestnili do jednotlivých ohrád v bežnej chovnej jednotke pre teľatá, kde sa aklimatizovali 33 dní pred rozdelením. Krvné vzorky boli v čase pred testom odoberané dvakrát a analyzovali sa leukotoxínové protilátky ako možný indikátor predchádzajúceho vystavenia P. haemolytica Al.

Liečba sa začala v dni -1, asi 27 hodín pred nakazením: skupina 1 - kontrolná;

skupina 2 - hydrochlorid valnemulínu 2,5 % injekčné (2,5 mg/kg dvakrát denne); skupina 3 - hydrochlorid valnemulínu 10 % orálne pomocou mlieka (5,0 mg/kg dvakrát denne).

Všetky teľatá boli nakazené v dni 0 pomocou endobronchiálneho nanesenia 30 ml bujónu kultúry Pasteurella haemolytica Al (M4/1/3, Moredun Research Inštitúte - 1,25xl0⁷ cfu/ml) s použitím vláknového optického bronchoskopu. Klinické pozorovania sa uskutočňovali raz denne v dňoch -3 a -2 a dvakrát derme od dňa -1 do dňa 3. Klinické stavy boli rozdelené podľa štyroch parametrov: rektálna teplota, rýchlosť dýchania, povaha dýchania a chovanie. Injekčné miesta boli tiež testované. Všetkým teľatám, ktoré ležali a/alebo mali depresiu, a/alebo známky dýchacích ťažkostí, alebo ktoré mali celkové klinické skóre vyššie ako 5 pri jednom testovaní v rozsahu dní 0 až 3, bola z humánnych dôvodov okamžite poskytnutá eutanázia pomocou vnútrožilového podania letálnej dávky sodnej soli pentabarbitonu BP(Vet) 20 % hmotn./objem a nekropsia bola uskutočnená v priebehu 24 hodín. Teľatám, ktoré prežili do dňa 4 po nakazení P. haemolytica, bola podaná eutanázia v dni 4 rovnakým spôsobom, ako bolo opísané pre dni 0 až 3. Všetkým teľatám boli vybraté pľúca a testovali sa vizuálne na zlúčené lézie a pleuritickú adhéziu. Z ôsmich štandardných miest boli vyrezané vzorky pľúcneho tkaniva a testovali sa na prítomnosť P. haemolytica, aby sa určili hodnoty pre index izolácie. Teľatám, ktoré práve zomreli, boli odobraté výtery krvi zo srdca a boli testované na prítomnosť

P. haemolytica.

Jednotlivé teľatá a súčty skupín, priemery skupín a stredy skupín sa vypočítali pre všetky nasledujúce parametre: celkové klinické skóre, skóre zlúčených lézií, index izolácie, skóre pohrudnice a celkové skóre. Jednotlivé teľatá a súčty skupín, priemery skupín a stredy skupín sa vypočítali pre všetky kategórie tvoriace celkové klinické skóre: rektálna teplota, rýchlosť dýchania, povaha dýchania a chovanie. Na určenie, či je rozdiel medzi akýmkoľvek skóre skupín pre všetky parametre sa použila základná analýza podľa Kruskal-Wallisovho testu (Minitab 9): celkové klinické skóre, skóre zlúčených lézií, index izolácie, skóre pohrudnice a celkové skóre. Kruskal-Wallisov test ukazuje, že skupiny nie sú ani všetky rovnaké, ani každá iná. Na zistenie, ktoré skupiny sú rôzne, sa páry skupín testovali s použitím Mann-Whitneyovho testu (minitab 9).

Na porovnanie s neliečenými teľatami (skupina 1), celkové klinické skóre (p=0,013) bolo významne nižšie pri teľatách, ktoré boli liečené valnemulínom pri 10 % v zmesi pri 5,0 mg/kg/dávka dvakrát denne orálne pomocou mlieka 5 dní, pričom sa liečba začala 27 hodín pred nakazením P, haemolytica Al.

Celkové klinické skóre bolo tiež znížené, ale štatisticky nie významne, pri teľatách liečených intramuskuláme valnemulínom 2,5 % injekčné pri 2,5 mg/kg/dávka dvakrát denne 5 dní, pričom sa liečba začala 27 hodín pred nakazením P. haemolytica Al.

Keď sa porovná celkové klinické skóre, neexistovali žiadne významné rozdiely medzi liečenými skupinami.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je vhodné pri liečbe pneumónie jahniat, oviec a dobytka spojenej s infekciou Pasteurella haemolytica. Na toto použitie sa bude účinné množstvo meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa bude podávať relatívne malé množstvo dlhý čas. Všeobecne sa však dosiahli uspokojivé výsledky, keď sa činidlo podávalo v dennej dávke 5 mg/kg až 15 mg/kg hmotnosti zvieraťa, vhodne podávané ľubovoľne v krmive alebo v rozdelených dávkach dvakrát až štyrikrát denne, alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat sa celková denná dávka pohybuje v rozsahu 250 mg až 3000 mg, výhodne 250 mg až 1000 mg, pri podávaní raz alebo dvakrát denne alebo pri podávaní ľubovoľne v krmive.

H) Polyartritida ošípaných súvisiaca s infekciou Mycoplasma hyosynoviae

Infekcia Mycoplasma hyosynoviae môže byť diagnostikovaná bežným spôsobom, napríklad ako je opísané vo veterinárnej príručke, ako je Taylor D. J., Pig Diseases, šieste vydanie (1995), vyd. Taylor D. J., Glasgow, VB, strany 172 - 173. Výhodná aktivita činidla podľa predloženého vynálezu na toto použitie môže byť určená napríklad pomocou nasledujúcich testov:

1. Aktivita tkanivových izolátov in vitro (MIC test)

Vzorky tkanív sa získajú z pľúc ošípaných z rôznych skupín napadnutých enzootickou pneumóniou (EPP). Vzorky na kultiváciu sa umiestnia na suchý ľad. Štyri izoláty z pľúcnych vzoriek pôvodne izolovaných na opakované získame Mycoplasma hyopneumoniae sa znova izolovali pre Mycoplasma hyosynoviae, po čom bolo z uvedených pľúcnych vzoriek zistené (znova skladovaných pri -70 °C) v priebehu kultivácie M. hyopneumoniae, že niektoré vzorky poskytli veľký rast kolónií s typickou morfológiou Mycoplasma hyosynoviae. Z iných pľúcnych vzoriek boli znova získané tri ďalšie izoláty. Všetky izoláty boli sérologicky identifikované pomocou diskovej inhibície rastu pomocou špecifického králičieho antiséra proti Mycoplasma hyosynoviae. Na izoláciu M. hyosynoviae z pľúcneho tkaniva sa použije komerčne dostupné pevné médium (Mycoplasma Experience Ltd.j. Na MIC test sa použije kvapalné médium (Mycoplasma Experience Ltd.) obsahujúce fenolovú červeň a arginín (pH 7,0).

Zásobné roztoky testovanej zlúčeniny sa pripravia pri koncentrácii 1 mg/ml v deionizovanej vode, sterilizujú sa filtráciou cez filtračnú membránu s veľkosťou pórov 0,2 μ (Sartorius Minisart, N) a skladujú sa pri -20 °C. Na použitie pri MIC testoch sa zásobné roztoky zriedia v kvapalnom médiu na dvojnásobok konečnej požadovanej koncentrácie. MIC testy sa uskutočňujú podľa spôsobu Tanner a Wu, Avian Diseases 36, (1992) 714-717. Aktívne rastúce nakazené kultúry sa pripravia buď z 1 ml alikvotných dielov bujónov kultúr skladovaných pri -70 °C alebo z kultúr skladovaných na agare pri -70 °C. Nakazené kultúry sa zriedia na získame cieľového titra 10³ až 10⁵ jednotiek meniacich farbu/ml. 0,1 ml alikvotné diely nakazeného inokula sa na mikrotitračnej doske zmiešajú s 0,1 ml alikvotných dielov roztoku antibiotika. Každá mikrotitračná doska obsahuje neinokulované médium s pH 7,6 (kontrola konca testu) a inokulovanú nakazenú kontrolu bez antibiotika. Všetky dosky sa uzatvoria priliehavým filmom a aeróbne sa inkubujú pri 36 °C. MIC sa zaznamenajú, keď farebná zmena v kontrolných nakazených jamkách je rovnaká ako pH kontroly konca testu. MIC je najnižšia koncentrácia nemajúca žiadnu farebnú zmenu.

Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 11 pre hydrochlorid valnemulínu a dve referenčné zlúčeniny, hydrogenfumarát tiamulínu a enrofloxacín.

Tabuľka 11

In vitro citlivosť 7 poľných izolátov Mycoplasma hyosynoviae

Zlúčenina	Rozsah MIC (pg/ml)
Hydrochlorid valnemulínu	0,0001 - 0,0005
Hydrogenfumarát tiamulínu	0,0025 - 0,025
Enrofloxacín	0,025 - 0,25

Citlivosť siedmich poľných izolátov Mycoplasma hyosynoviae na valnemulín je ďaleko vyššia ako na ostatné dve zlúčeniny, čo naznačuje, že nové poľné izoláty sú extrémne citlivé na valnemulín.

Činidlo podľa predloženého vynálezu je vhodné pri liečbe polyartritídy ošípaných spojenej s infekciou Mycoplasma hyosynoviae. Na toto použitie sa bude účinné množstvo meniť v závislosti od konkrétnej použitej soli, spôsobu podávania, veľkosti a veku zvieraťa a od požadovaného účinku; napríklad na profylaktickú liečbu sa bude podávať relatívne malé množstvo dlhý čas. Všeobecne však boli dosiahnuté uspokojivé výsledky, keď sa činidlo podávalo v dennej dávke 5 mg/kg až 15 mg/kg hmotnosti zvieraťa, vhodne podávané vo vode alebo v krmive, alebo v rozdelených dávkach dvakrát až štyrikrát denne alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním. Pre väčšinu zvierat sa celková denná dávka pohybuje v rozsahu 100 mg až 1000 mg, výhodne 100 mg až 500 mg, pri podávaní raz alebo dvakrát denne.

Zlúčenina môže byť výhodne podávaná v samostatnej terapii. Výhodné dávky v pitnej vode sú 0,01 až 0,05 % hmotn./objem, zvlášť 0,01 až 0,025 % a v krmive 100 až 400 ppm (g/metrická tona), zvlášť 100 až 200 ppm (g/metrická tona).

Na všetky využitia môže byť zlúčenina použitá vo forme voľnej zásady alebo vo forme veterinárne prijateľnej soli, napríklad kvartémej soli, alebo najmä vo forme kyslej adičnej soli. Tieto formy solí majú rovnakú aktivitu ako forma voľnej zásady. Príklady vhodných kyslých adičných solí sú hydrogenfumarát, fumarát, naftalén-l,5-sulfonát a najmä hydrochlorid.

Činidlá podľa predloženého vynálezu môžu byť podávané orálne, miestne alebo parenterálne a v zmesi s bežne chemoterapeuticky prijateľnými riedidlami a nosičmi a, prípadne inými prísadami, môžu byť podávané vo forme tabliet, toboliek alebo prostriedkov na injekčné podávanie. Tvoria tiež vynikajúce prísady pre kŕmne zmesi (vopred pripravené) alebo je možné ich pridávať do pitnej vody.

Medzi výhodné veterinárne prijateľné nosiče patria napríklad bežne používané farmaceutické prísady, ako je cukor, kukuričný škrob, laktóza, celulóza, rovnako ako nosné systémy zo zrna a vedľajších produktov zo zrna ako ryžové šupky, pšeničné zvyšky a sójová múčka; ďalej pevné riedidlá, ako je vápenec, síran sodný, uhličitan vápenatý a kaolín, alebo kvapalné látky, ako veterinárne prijateľné oleje (rastlinné oleje alebo minerálne oleje), propylénglykol a polyetylénglykol. Vhodne sa tieto prostriedky podávajú zvieratám orálne, výhodne v zmesi s krmivom vo forme medikovanej múčky alebo medikovaného krmiva.

Na podávanie v pitnej vode sa použijú roztoky vo vode s alebo bez rozpúšťadiel, ako sú etanol, propylénglykol, polyetylénglykol, osvedčené povrchovo aktívne látky a sorbitol.

Na medzisvalovú injekciu sa napríklad prostriedok typicky pripraví ako roztok vo vode, ktorý môže obsahovať rozpúšťadlá, ako je etanol alebo propylénglykol, alebo vo veterinárne prijateľnom oleji. Príklady prijateľných olejov sú sezamový olej, triglyceridy so stredným reťazcom (napríklad Miglyol), izopropyl myristát a etyloleát. Prostriedky môžu obsahovať konzervačné látky, pufre a iné bežné prísady.

Veterinárne prostriedky na použitie podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené zmiešaním zložiek v príslušných pomeroch. Prostriedky sa potom balia do nádob vhodných na podávanie.

Predložený vynález ilustruje nasledujúci príklad:

Zložka	Množstvo (g/100 μΐ)
hydrochlorid valnemulínu	10,0
fenol	0,5
Miglyol 840	do 100 ml

Činidlo podľa predloženého vynálezu je dobre znášané. Akútna toxicita zlúčeniny všeobecného vzorca (I) vo forme hydrochloridu pri krysách bola určená pri jednotlivej dávke 1000 mg/kg a 2000 mg/kg pri orálnom podávam 5 samcom a 5 samiciam krýs v skupine. K úmrtiu došlo za 1 - 8 dní. Hodnota LD₅₀ je >1000 mg/kg p.o..

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie derivátu pleuromutilínu vzorca (I) vo forme voľnej bázy alebo veterinárne prijateľnej soli na prípravu liečiva na liečenie veterinárneho ochorenia, expresia ktorého je zvýšená rastúcou hustotou chovu, pričom veterinárnym ochorením je pneumónia jahniat, oviec a hovädzieho dobytka spojená s infekciou vyvolanou mikroorganizmom Pasteurella haemolytica.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, pričom zlúčenina všeobecného vzorca (I) je vo forme adičnej soli s kyselinou 5 chlorovodíkovou.