HU230325B1 - A valnemulin alkalmazása növekvő állománysűrűség okozta állatbetegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Description

A vaXnemuXin alkalmsáéi nbvekvö állományaárnadg állatbetegségek kezeXéaére alkalmas gyógyazezkésaifcmányak előállítására vonatkozik. A találA találmány pieuromutilín-származékokra ί*όλ%

azaz a 14-0- í 1- í <R) ~2-aminö~3~metil-feutiril~amino] -2-metil~propán~2~ii-tioaeetiX]-mutilin (valnemolín} állatgyögyászatiiag elfogadta tósó ja alkalmazása olyan állat gyógyásza ti betegségek kezelésére alkalmas állatgyógyászati készítmények előállítására, melyeknek a kifejeződését a növekvő állomány sör őség fokozza. Bzt erek után röviden ^találmány szerinti alkalmazásnak* nevezzük.

Az (I) képlete vegyületet, mely szabad bázis vagy áilatgyógyászatíiag elfogadható só formájú (Econor®), a következőkben a találmány szerinti szer*-nek nevezzük. Ez só formában, különösen hidrokiorid só formájában van jelen. Ebben a formában valnemulin-hidroklorid generikus néven ismért.

, Az (I) kópiatü vegyület szabad bázis formában vagy kemoterá-

.... .... ·· * ♦ * « * «♦» »♦ · . » ♦ » ♦ * ί * ♦♦

0Ζ054ΦΛ» P9$W3 2ÖÖS, március piásan vagy állatgyógyászatilag elfogadható só formájában már ismert, például az SP 153 277 európai nyilvánosságrahozatali irat-ból, vagy az eszel ekvivalens leírásokból, például az US 4 675 330 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból, különösen annak 12, példájából,

A vegyületről ismert továbbá, hogy

- inhibitor aktivitású különböző baktériumokkal szemben in vitro körülbelül 0,008-25 pg/ml koncentrációban;

- in vit.ro inhibitor aktivitású általában mikoplazmákkal és klamidiákkal. szemben, körülbelül 0,008-0,5 pg/ml koncentrációban?

~ inhibitor aktivitású in vivő egerekben, különböző baktériumfcörzseket alkalmazva, és tyúkokban, mikoplazma törzseket alkalmazva, körülbelül 12-50 mg/kg testtömeg dózisban;

- antíparazita aktivitású, különösen in vivő kokcídia ellen tyúkokban 20-X50 mg/kg takarmány dózisban? és

- növekedésserkentő aktivitású tyúkokban és sertésekben in vivő, lö-SÖ mg/kg takarmány dózisokban, így a vegyület ant/.bakteriális hatású általános antibiotikumként és állatgyógyászati szerként használható fel, különösen a szárnyasok kokoidiózisainak kemoterápiás kezelésében valamint növekedésserkenteként tyúkban és sertésben.

Meglepő módon úgy találtuk, hogy a találmány szerinti szer különösen 'hatásos olyan állatgyógyászati betegségek keselésére alkalmas állatgyógyászati készítmények előállítására, melyeknek, a kifejeződését a növekvő áliománysúrűség fokozza, mint amilyen »«« ♦*** »* ♦**.* * * * * A

Λ, *♦* **.** » ♦ ** δ?.Ο$φΡΑ«

F990310? 2008, mtóus az enzootiás pneumónia sertésekben, melyet Myooplanma hyopneumoníae fertőzés okoz, a sertés vérhas (dizentéria! _f melyet, a Serpulina (korábban Treponema) hyodysenteriae fertőzés okozza, sertés vastagbélgyulladás (kolitisz), mely a Serpulina pilosícolí fertőzéssel jár együtt, sertés csipőbélgyulladás (ileitis-z) (sertés, proliferatív enteropátia; sertés intesztinális adenomatőzis), mely a Lawsonia intracellularis fertőzéshez kapcsolódik, krónikus légzőszerv! megbetegedés és izületi gyulladás baromfiakban, mely a .Mycoplasma. gallisepticum -fertőzéssel jár együtt, másodlagos tüdőgyulladás (pneumónia) sertésekben, mely a Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae és/vagy a Haemophilus parasuis fertőzéssel jár együtt, tüdőgyulladás bárányokban, judokban és szarvasmarhában (szállítási betegség (Shípping Fever, Transit Fever), borjú légzőszerv! komplex, szarvasmarha tüdőgyulladásos pasztörellózis), moly a Pasteurella haoioliltíca- fertőzéssel jár együtt és a sertések poli.artritis.ze, mely a ífycpplasma hyosynovíae fertőzéshez kapcsolódik.

Továbbá még meglepőbb módon úgy találtuk, hogy a szerrel szemben a rezisztencia rendkívül alacsony, & találmány további tárgya eljárás a fentebb meghatározott alkalmazásra szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, mely során a találmány szerinti szert legalább egy állatgyógyászatiled elfogadható hordozóval vagy oldószerrel keverjük Össze,

A növekvő áiiománysörüség által fokozódó kifejeződésé állatgyógyászati betegségtől szenvedő állatokat valószínűleg mindezidáig nem kezelték a találmány szerinti szert tartalmazó anti~ ♦ «I

2008. iwdss bakteriális készítménnyel.

A #ycoplaama hyopneumoniae fertőzés hagyományos módon diagnosztizáiható, például az állatgyógyászati kézikönyvekben leírt módon, mint például ahogy Taylor# D. J. leírta a Pig Oiseases című művében, 6. kiadás, D. J< Taylor, Glasgow, Egyesült Királyság, .1S4-T6S {1995} . A találmány szerinti szer előnyös hatását ilyen alkalmazással például a következőképpen határozzuk meg;

1. Xo vifexo aktivitás

Különböző kondákfean kitört enzootiás pneumőnia fertőzésekből származó tíz mezéi izolátum és a J típus törzs vesz részt a vizsgálatban. Az izolátumokat £ilfcér-klónozzuk, lemez növekedés gátlás! teszttel azonosítjuk, és a ?-lö. passzálás után alkalmazzuk. A minimális gátlás! koncentráció (MIC) meghatározására a tesztet folyékony tápközegben hajtjuk végre [Friis, N. F. és mtsai, Acta Vet. Scand. 32, 425-429 {1991}} 1,8 ml-es csövekben, melyek kétszeres k.onoentráoxójά valnemulínt és tiamulin-hidrogénfumarátot tartalmaznak. A mikoplazmákat tízszeres hígításokban inokuláljuk, és a tenyészeteket vizuálisan értékeljük ki a növekedésre lO'^-lG⁴ szín képző egységgel beoltott csöveket használva. Az első leolvasást 2-4 nap máivá hajtjuk végre, és az utolsó leolvasást 10-14 nap múlva, amikor már a színeltolódás nem folytatódik tovább. A MIC-et úgy határozzuk meg, begy az a tesztvegyület legalacsonyabb koncentrációja, mely még a növekedés gátlását mutatja a kontrollal összehasonlítva [Friis, K. F. és Szanceer, J., Acta Vet. scand. 35, 389-394 {1994}}.

#♦** : «; * ** , 6W4ZPÁ* 5

F5WÖÖ3 20ÖS. mfehs

Az eredményeket az 1, táblázatban matatjuk, be,

1. táblázat MIC (pg/ml>

ch« hidroklorid# hfu® hidrogéntumarát

Az összes vizsgált M. hycpBéaeaaiae törzs nagyon érzékeny volt a valnemulin hatására_r & MIC értékeik lQ-48-szer kisebbek voltak mint a tiamulinnál, mind a kezdeti mind a végső leolvasásnál, mely a vegyületet különösen jelentőssé teszi arra a célra, hogy a fertőzött Rondák klinikai eseteinek kezelésében alkalmazzuk «

2. Xn vifcéo aktivitás

A szövetmintákat különböző, enzoetiás pneumőniában szenvedő (ÉPP)-fertőzött kondákbói származó sertések tüdejéből kapjuk, A mintákat a tenyésztéshez szárazjégen szállítjuk. Az M. hyo;>neümon.íaet a frissen felszeletelt tüdő-szövetből Micoplasma.

61054/ΡΆ’ F99Ö3W3 2ÖÖS. nskx.-í«s	δ	♦ <*·*. ♦* * 4 ♦ * X 4 ♦ * *4 4 * * * ; «* v *	X 4 X .*
Experience agaron történő )	Közvetlen	tenyésztéssel	nyerjük ki.

Ez a módszer .lehetővé teszi, hogy sz eltérő áf, hyoprjteu/Honiae telepeket felismerjük, és könnyen elkülönítsük ágy, hogy klónozzuk az egyéb gyorsabban növő mikoplazma fajok, mint például a .Myccplasma hyorhínis mellől, mely gyakran jelen van az ÉPP tüdőmintákban. Az ízolátumokat altenyészetekben szaporítjuk, és az M. hyopneumoniae MCTC 10.110 ellen termelt specifikus nyűi antiszérumot alkalmazó lemez növekedés gátlás! vizsgálattal azonosítjuk*

Az antibiotikumos próbához a tenyészetet Mycoplasma Experience táplevesben készítjük el aerob körülmények között 3ó°C-on inkubálva.

Egy kereskedelemben beszerezhető szilárd tápközeget {Plyeeplasma Experienee Ltd.) alkalmazunk az M. hyppneumoniae izolálására tüdőstövetekből. A MIC vizsgálatokhoz egy fenolvöröst és glükózt tartalmazó folyékony tápkőzeget (Mycoplasma Experience Ltd»} használunk.

A tesztvegyület 1 mg/ml ke jók el ionmentesített vízben, tőkön (Sértőtius Minisért, N) ncentrációjű törzsoldatait készít~ Ö,2 pm-es pórusméretű membránézüátszűrve sterilizáljuk, és -20°O on tároljuk. Ahhoz, hogy a MIC tesztekben alkalmazzuk oldatokat tápközeggel hígítjuk, hogy megkettőzzük a a törzsszükséges íg-koncentrációt. A MIC teszteket Tanner & Wu módszere szerint hajtjuk végre [Astían Díaeases 36, 714-71? (1992)}, Aktívan növekedő fertőzéskiváltö tenyészeteket készítünk a -7ö°C-on tárolt tenyészetek vagy az ugaron -?0°C-on tárolt tenyészetek 1 ml-as « » s **♦

X * » *** fr * * *♦ * » * * * « $*

61054,¾¾ P9963W3 2008, xaárdus alíkvotjaiből, A fertőzéskiváltó tenyészeteket addig hígítjuk, hogy líP-lö⁵ szín fertőzéskiváltó egység/'mi végtitert érjünk el, A fertőzéskiváltó inokulatamok Ö#1 ml-as alikvotjait az antibiotikumos hígítások 0,1 ml~es alikvotjaival 'keverjük össze a mikrotítráió lemezek üregeiben, Mindegyik mikrotitráió lemez inokulálafclan S,8-as pM-jú tápközeget CM, hyopneamonlaej (végpont kontroll) és anfcibiotikummentes inokulált fertőzéskíváltó kent.™ roliokat tartalmaz, Mindegyik lemezt egy adhezív filmmel lezárjuk# és aerob módon 36*C~on inkabáljuk, A MlOeket akkor jegyezzük fel, mikor a fertőzéskiváltó kontroli üregekben a színváltozás eléri a végpont kontroll pH-ját. A MIC az a legalacsonyabb koncentráció# melynél még nincs színváltozás.

Az eredményeket a 2, táblázatban mutatjuk be a alnernulinnál és két referencia vegyületnél, a tiamulinnál és az enrofloxaoin-nál, pnewmoníae tíz mezei izolátumának In vitro érzékenysége

♦ ♦*** * « * ***_A ; „Z

. .. ·.. . ·. ... ·.. .·.·.. x^ssSs·; ;sssssv.><.-.x?....... <»· é7,{jM/PÁ‘

200S. Twcke

Úgy találtuk _f hogy az. összes törzs nagyon érzékeny a va Iámul inra. A törzsek nagy része Igen érzékeny volt az enroflozacinra# de az egyedi törzseknél a valnemulin MlC-e légalább ötször alacsonyabb volt, még azoknál a törzseknél is, melyek már 0,0025 ug/ml enrofloxacinra érzékenyek voltak. Ezek az eredmények azt igazolják, hogy a mezei izolátumok rendkívül érzékenyek a valnemulínra.

3. Rezisztencia kialakítása

Az ECTC 10110 áfycoplasma· hynpneumcnlae referencia törzset {beszerezve a National Collection of Type Cultures-tol# London, ÜK) és egy új mezei izolátumot {MEVT Ö23) aerob körülmények között 36°C-on tenyésztünk fenolvöröst tartalmazó Mycoplasma glükóz táplevesben, amíg savas színváltozást nem észlelünk, steril glicerin (S tf%) hozzáadása után a tenyészeteket 1 ml-es alikvötökre osztjuk, és ~70^eC~on lefagyasztjuk. Ezeket a tenyészeteket arra használjuk fel, hogy további tápleves tenyészeteket indítsunk el, melyeket titrálunk, hogy megkapjuk a színt változtató egységek (ccu) számát a mikrotitráló lemezeken az ínkohálás (36’C) után. A több példány készítése lehetővé teszi az antibiotikum hígítások próbálását a ocu előre meghatározott számával a legkisebb gátlás! koncentráció (MIC) tesztekben és a habituációs vizsgálatok első passzázsában.

Egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető, glükózt és fenolvöröst (NEGB) tartalmazó tápközeget (Mycoplasma ExperiéhC.é. Ltd.) használunk ?,6-os pH-n.

♦ *** * * ***$ #1 * * w & ♦#« ** _k *»

- * '♦ < * * ^·. *

d.rnw

P99Ö3Í03

2ÖÖ1 március

1000 pg/ml koncentrációjú törzs tesztvegyület oldatokat készítünk ionmentesített vízben. Vortexelés után az oldatokat Ö„2 ym-ea pórusméretü membránszűrökön (Sartorius Minisart, íí> keresztűlszűrve sterilizáljuk. A MIC tesztekben történő alkalmazáshoz a törzsoldatokat mikópiazma fcáplevessei hígítjuk, begy megkettőzzük a szükséges végkoncentrációt. A habituációs vizsgálatoknál a tőrzsoldatokat 1 ml-es alikvotokra osztjuk, és -2CPCon lefagyasztjuk. Ezeket felolvasztjuk, és 5-7 napos intervallumokban arra használjuk, hogy a szer olyan koncentrációaorozatát készítsük el (két sorozat} MEGB-ben, 1,9 ml~es allkvotokban, mely lefedi a MIC-et mindkét M, hyopnenmoniae törzzsel szemben. Az oxitetraciklin-hidrokloridot minden esetben frissen készítjük el. A hígítás! sorokat fokozatosan, passzázsról passzázsra vetettük alá a fertőzési próbának, hogy lehetővé tegyük a mikópiazmákban a rezisztencia kialakulását.

Teszteljárások:

A MIC teszteket Tanner s Mu eljárása szerint hajtjuk végre t&vián biseases 36, 714-717 (1992)], azelőtt mielőtt a habituácíós vizsgálatot elvégeznénk (lentebb), és a 10. passzálás után a vegyület hígítás Ö, 1 ml-es alikvotjait a fertőzés-kiváltó inokulumok 0,1 ml-es alikvotjaival keverjük össze mikro-titráiő lemezek üregeiben.·, melyek 10³ é.s lö⁵ .közötti színképző· egységet (ccu) tartalmaznak ml-énként. Mindegyik mikrotitráló lemez inokuiálatlan tápközeget, 6,0-as pn-jú tápközeget (végpont kontroli) és antibiotíkummentes inokulált fertőzéskiváitó kontroilokat tartalmaz. Mindegyik lemezt lezárjuk, és aerob körülmények *$# ***- * , *« * * .« »«'*.

· <*$ között 36^eC-on infcubáijek. & MlC-akst akkor jegyezzük fel#· mikor a fertőzéskiváltó kontroll Üregeiben a színváltozás eléri a t_f8-as pH-jó kontrollt (narancssárga) . A MIC az a legalacsonyabb koncentráció, melynél még nincs színváltozás.

Hahituáeiős vizsgálat :·

Az első passzázskísérletben a Ab hysp/íeiasoztiae törzs MXC-ét lefedő koncentrációkban lévő antibiotikumoldstok 1,9 ml mennyi.ségét 0,1 ml, lö^-lö⁵ ceu/mX-t tartalmazó táplevestenyészettel inokuláljuk. Mindegyik passzázskísérlet M. hyppx:eümoniaeval lankaiéit táplevest tartalmazó növekedési kontrollt és egy inokulálatlan tápközegkontrollt tartalmaz, Hétnapos inkübálás után (3€*C) a savas színváltozást matató két legnagyobb koncentrációjú táplevest összegyűjtjük, és arra használjuk, hogy a gyógyszerhígítások friss sorozatát oltsuk be mikoplazma táplevesben (0,1 ml tenyészet 1,9 ml-es gyógyszertartalmú táplevesben) . Ezt az eljárást minden 5-7 napban megismételjük a 10. passzálásig. Amikor a mikoplazma törzsek rezisztenssé válnak bizonyos antibiotikumokkal szemben, vagy a 10. passzázsnál, mindegyik törzset mégegyszer gyógyszertartalmú táplevesben szaporítjuk, és a MIC-eket meghatározzuk.

Eredmények: Az M, hyopneumoniae ,,J törzs és a mezei izolátum az antibiotikumos kezelés előtti és utáni MSC-eit a 3. táblázatban mutatjuk be.

♦*»***..* _φ> * *** * * >*4 ' ’

6Í85WÁ

F9983J83 '2808. tpkeise x táblának

Rezisztencia in vit.ro kialakítása két M« hyooneumoniae yület

Törzs

Fasszálás előtti MIC Cpq/ml)

Passzálás utáni MIC PlO/Pll^ig (pg/ml)

Rezisztencia növekedés (hányssorosra növekedett)

Veineműiin	MCTC 10110	0,0025
(eh)	Mezei ízeiétun j	0,001
		<VW»»«»X\XWW»>>XWAM.
Tiiozin-	NCTC 10110	0,25
tartarát	Mezei izolátnm	0,125

0, 885 0^0025 >SÖÖ^2; 62, 5^2;í >2000

500

Oxitetraoikiin RCTC 10110

-hidrok.Iorid |Mezei izolátu® ^Xí in vifcro passzálás! szint ^Si MIC értéke tiiozínt tartalmazó míkoplazna táplevesben 8 pásszálás után.

Őgy találtuk, hogy az antibiotikumos kitevés előtt mindkét törzs nagyon érzékeny volt a valnemuiínra, a referenciatöxzsnél a MIC 0,0025 pg/inl volt, a mezei i zelátumnál 0,001 pg/ml. Ezek az aktivitási értékek 50-lÖÖ^szor nagyobbak voltak, mint a tiloziunál és az oxitetracikllnnél kapott értékek. Ezeket a MIC értékeket használtuk fel arra, hogy a szerek hígítás! sorát kiválasszuk a habituáciős vizsgálathoz.

Tíz ciklus valnemulinos kitevés után, a tézisztencia kialakulása minimális volt mindegyik .M. bycpnenmoniae törzsnél, a MIC 0,0025 pg/ml-ről 0,005 pg/ml-re növekedett a referenciatörzsnél.

« « 6« ♦* *♦ » « ♦·* δ1δ$4ΦΑ' FWPÖ3 20ÖS. sjárebs ♦ ♦X

X

X *♦ illetőleg 0,001 pg/ml-ről 0,0025 pg/mi-re a mezei izo Iá tusmái. Ezzel szemben jelentős rezisztencia alakult ki a tilozin-tartaráttál szemben mindkét M. hyopneumoniae törzsnél. A referencia törzsben a rezisztencia először a 4-5« passzélásnál jelentkezett a tilozin-tartalmú táplevesben, és a nyolcadik passzáláara a MIC >5ÖÖ pg/ml-re nőtt, ami egy >2000-szeres rezlsztencíanövekedést mutat ezzel az antibiotikummal szemben (3. táblázat). Feltűnő tilozinreziszteneia alakult ki a mezei ízolátumhan a 8 pasazálás alatt, a MIC 50()~szorosára, 62,5 pg/mi-re emelkedett. Ez a rezisztenciaszint a tilozintartalmű táplevesben történő 10-11 passzálás után is fennmaradt. Mindkét hygpneumonia.e törzsben az antibiotikumos kitevés 10 ciklusa alatt az oxitetraciklinnel szembeni rezisztencia négyszeresére növekedett, a MIC 0,25 pg/ml-ről 1 pg/ml-re emelkedett.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a valnemulin jelentősen hatásosabb az M, hyopneursoníueval szemben, mint akár a tilozin akár az oxitetraciklin, téneiát önmagával szemben az M, és nem indukál jelentős reziszbyopneumoniae törzsekben.

vivő:

Az enzoötíás pneumónis egy kísérletes modelljét alkalmaztuk a valnemulin betegséggátló hatásának megállapítására, melyhez eredetileg gnotobiotikus sertések M. hyppne^oniaevel történő fertőzéséből származó passzáit tüdőanyagot használtunk. Három kísérletet végeztünk: Az 1. és a 2. kísérlet az új vegyület dózis titrálásös vizsgálata volt, melyhez az M. hyopnouzsoniae ♦ χ*«· ***♦ «/.ÖM-TA* 2Uök március

Ltó törzsét alkalmaztuk, és a 3. kísérletben, takarmányban lévő, 200 ppm koncentrációjú vegyulet hatásosságát állapítottuk meg egy második fertözéskiváltő törzzsel szemben, M, hyopnetssöniae fertőzéstől mentes állományból származó .6-7 hetes nagy fehér Landrace kan sertéseket alkalmazunk» A fertőzéskiváltó anyagok M. hyopaeumoniset tartalmazó pneumóniás tüdők, melyeket homogenátumként adunk be intranazálisan három egymást követő napon át. Az 1. és a 2. kísérletben alkalmazott anyagban jelenlévő törzzsel szemben a valnemulin minimális gátlást koncentrációja (MIC) 0,016 pg/ml volt, és a 3. kísérletben alkalmazott anyagból izolált törzzsé 0,0078 ug/ml, A fortözéskiváltó anyag eredetileg gnotobiotikus sertések M. h^^gpeeumoeíae fertőzéséből, majd ezt követően SFF (specifikus patogéntol mentes) sertésekbe történő passzálásból származott, melyet -7Ö°C alatt tároltunk.

A következőkben a „valnemulín-hidrokloridos gyógyszer'* kifejezés „valnemulín-hidroklcrídot tartalmazó állatgyógyászati készltmény-ként értelmezendő.

1. kísérlet: Valnemulin-hidrokloridos kezelés gyomorszondán át, egyszer egy nap, 0 (kontroll), 2,S, 5, 7,5 vagy 10 mg/kg testtömeg per nap dózisokban. Csoportonként hat sertést vizsgáltunk .

és gá

2. kísérlet;

100, 200, 300 20 mg/kg/nap tünk.

Valnemulin-hidrokloridos g kezelés takarmányban vagy 400 ppm dózisokkal (megfelel 0, 5, 10, 15 mennyiségnek). Csoportonként hat sertést vizs>χ«φ »Χ*Ψ ** *»Μ ♦ * * * * ««« ** *

A* X ♦ « > * ♦ χ **

P99031Ö3

2(503. írtárcsas

3. kísérlet: Vainemulin-hidrokíorídos kezelés takarmányban ö vagy 200 ppm-es dózisokban (0 és lű mg/kg/napnak felel meg) . Nyolc sertés csoportonként. A gyógyszeres kezelést a .fertőzéskiváltás első napjától a pest morfcem vizsgálatig adtuk, melyet hozzávetőleg a fertőzés után 3 héttel hajtottunk végre. A betegséget a tüdőiézlók számszerű kiértékelésével (Cambridge tüdolézló számoló rendszer {Goodwin, R.F.N. és Nhittlestone, 0«,

7. jLB* 391-397 (1971) 1 , melyben az érték a pneumóniásan megtámadott tüdő megbecsült százaléka), a tüdő-testtömeg arány megállapításával ás az ét hyopneumoniae tüdőből történő izolálásával állapítottuk meg.

Az eredményeket a 4« táblázatban mutatjuk .be:

» «» ♦X * * * * )| #♦ >

» * « * *♦

67.ÖS4ZPA'

IWO3ÍO3 2ÖÖ8. március

4. táblázat

lx kísérlet: Gyógyszeres kezelés gyomorsz-	ondán át, >3X0-0,018 pg/ml1?
Gyógyszeradagolás	Tüdőié 2 ió-é rté k	Tüdő-testtömeg arány (%)
	0	1 a g ,Λ> ΛΛ £ s»	1,35
10	mg/kg/nap	1,7	1,08
7,5	mg/kg/nap	3,8	1,21
5 i	mg/kg/nap	11,1	1, .5 X
Sy	mg/kg/nap	7,7	1,21

2. kísérlet: Öyógyszeradagolás takarmányban, ΜΙΟΟ,ΟΙδ pg/ml

Gyógyszeradagolás Tüdőlézió-érték Tüdő-testtömeg arany (%}

	0	22,1	1,61
400	ppm	(20 :	mg /kg)2?	6,3	1,24
300	ppm	(20	mg/kg)	12,7	1,27
200	ppm	(20	mg /kg)	12	1,29
100	ppm	(20	mg/kg)	25	1,53

3. kísérlet: Gyógyszeradagolás takarmányban, MXO0,ö078

Gyógyszeradagolás Tüdőiézió-érték Tüdő-testtömeg arány (1)

10,8 1,32

200 ppm (lOmg/kg) 2,3 1,21 ^υ A fertőzéskiváltásí anyagból izolált Ab hyopneuisoniaevel szembeni valnemilln MIC értéke pg/ml-ben megadva

A vainemüiin-hidrokloríd hozzávetőleges napi. dózisa sertésenként

.......... .· ··.·.··. ---- -----------------------------. SSí

..»» »»»« »» «»“?

« X * * * + « I» « *♦ * « * * * * * ♦ «* * * .**

67.

2Ö0S, március

Az 1. kísérletben a nem kezelt, fertőzésnek kitett sertések átlagos lézió értéke .13,2 volt. A valnemuiin a lézíókat 71 %-kal a 7,5 mg/kg dózisnál és 87%-kal a 10 mg/kg dózisnál csökkentette, míg a 2,5 és 5 mg/kg/nap némileg kevésbé volt hatásos a lézíék csökkentésében. Kevesebb 10 mg/kg-mal kezelt sertésből izoláltuk éh hyopzjeumoniaef összehasonlítva a 2,5 mg/kg-mai kezeit sertésekkel (l~t szemben az 5-tel).

A 2, kísérletben a gyógyszerrel nem kezelt, fertőzésnek kitett sertések átlagos lézió értéke 22,1 volt, & 2ΘΌ ppm. valnemulinnai kezelt sertések 46%-os, a 3Ö0 ppm valnemulInnal kezeltek 43%-os, a 400 ppm valnemulxnnal kezeltek 71%-os léziőcsökkenést mutattak, A tüdőtömegek, melyek a mikronzkőpikus léziőkra valamint a léaiők összmennyiségére utalnak, még drámaibb hatást mutattak, jelentős csökkentek lefelé haladva 200 ppm-ig. A XÖÖ ppm valnemulint tartalmazó készítménnyel kezelt sertéseknél nem láttunk lézióosökkenést, Az összes kezeletlen sertésből a pest mertem vizsgálatnál újraizoláltuk az M. pneumoniaet, míg a 400 ppm valnemulinnai vagy 300 ppm valnemulinnai kezelt sertésekből a baktérium nem volt izolálható. A 200 ppm valnemulinnai kezelt sertések közöl háromból, a 100 ppm valnémulinnal kezeltek közül 4-ből izoláltuk a baktériumot,

A 3. kisér.lefcben a nem kezelt, fertőzésnek kitett sertések átlagos lézió értéke 10,8 volt; a 200 ppm valnemulin koncentrációjú takarmány a lézíóértékeket 79%-kaI. csökkentette. Nem volt különbség a post mertem vizsgálatnál kimutatott M. óyopreumooise mennyiségben a kezelt és a kezeletlen sertések között.

Φ χ « Φ » X * ♦ Φ # » Φ**

Φ * φ ♦·** « φ !>**

6Λ<ί$4'ΤΆ'

P99Ö31Ö3 20Ö8. mámms

A valnémulin -tehát hatásosnak bizonyul a sertések kísérletesen indukált enzootiás pneumóniájának maggátlésére a két különböző M. hyopneumoniae törzset tartalmazó fertőzéskiváltó anyagot alkalmazó, elkülönített, kísérletekben.

A találmány szerinti szer tehát felhasználható a áíyceplaama hyopneumoniae fertőzés okozta sertés enzootiás pneumőnia kezelésére alkalmas állatgyógyászati készítmények előállítására. Az ilyen alkalmazáshoz a hatásos dózis természetesen változó, ez alkalmazott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától ás a kívánt hatástól függően; például a profi .taktikus kezeléshez viszonylag kisebb dózisokat kell beadni hosszabb időn keresztül. Mindemellett általánosságban kielégítő eredményeket kapunk, ha a szert körülbelül 5 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg állati testtömeg koncentrációjú takarmányban napi dózisban, megfelelően szétosztva alkalmazzuk 2-4-szeri alkalommal naponta, vagy egy lassú felszabadulásé. formában adjuk be. A legtöbb állatnál a teljes napi valnémulin dózis körülbelül 100 mg és körülbelül lööö mg közötti, előnyösen körülbelül 100 mg és körülbelül S00 mg közötti, naponta egyszer vagy kétszer beadva.

Előnyös lehet, ha egyedüli kezelésként adjuk be az állatgyógyászati készítményt„

67AS4/PÁ 18

Ρ9903103 3008. ssércms

Előnyös dózisok az ivóvízben ö,01-0,05 tömeg/térfogat %, különösen a 0,01-0# 025 %, és takarmányban a 100-400 ppm <g/tonna> # különösen 100-200 ppm (g/tonna),

A Serpudina hyodysenfcerxae fertőzést hagyományos módon mutathatjuk ki, például ahogy azt az állatorvosi kézikönyvekben leírták, mint például Taylor, 0, J. (Fig Oiseases, 6, kiadás, kiadó D, J. Taylor, Glasgow# 0. K. 143-144 (19959]. A találmány szerinti szer gyógyító hatását ebben az. alkalmazásban- például a következőképpen határozzuk meg:

1, MXC meghatározás;

A vizsgálat sertés várhas járványkitörésekből származó S.

hyodysenfceriae kilenc mezei izolátumát, ás az ATTGC 31212 típustörzset .foglalja magában, ás. az A'TCC 29790-t (Serpulira innocens,

3-as csoport [Fellstörm, C,, Rés. Vet, Sci, 59, 1-4 (1935)]). Az azonosítás az 5% szarvasmarha. vért tartalmazó TSA-n (tritikáz szója agar) nézett hemollzis-mintázaton és índoltermelésí és a hippurát hidrolízis (Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK) teszten alapul, A baktériumokat az agar lemezekről 0,9%-os sóddá tra visszük át, és a turbiditást s McFarlend skálán 1,0-ra állítjuk be, mielőtt mindegyik izolátum 10 μϊ-ét kétszeres koncén trácrój ú veí n emuidn-hidrok1o r ide t, t íemu1ín-hídrogén £urnarátot, dimetridazplt, i inkomicin-hídrokloridot és tllozint tar» talmazó agarlemezekre inokulálnánk. A szaporodást és a hernádizist az anaerob szaporítás negyedik napja után jegyezzük fel, és κ ·♦ * *♦ *_A φ ♦ * F

67,054/ΡΛ

F99Ö3Í03

2ÜÖS< saárciss a Mic-et úgy határozzuk meg, mint azt a legalacsonyabb antibiotikum koncentrációt, ahol a spirochaeták nem. növekednek.

A MIC meghatározások eredményeit az 5, hyodysenteríaenél &z 5» táblázatban matatjuk be;

S. táblázat

Minimális gátlás! koncentráció (MIC? értékek 10 Serpuiina hyodysenteriae törzsnél

eh - hídroklcríd hfu ~· hidreoénfumazát ♦ *♦** *·* ♦ y ♦ * * ** * ♦ ,,r \ * Uh

d.ÜhkkA’ 2Ö

P99Ü3S83

28Ő8, rsárms

Az összes ő. hyodysenteriae törzs nagyon érzékeny volt a valnemulinra, 2-32-szer kisebb MIC értékeket mutattak mint a tiámulinnál. Az ő. hyodysenteriae nagy válnemulin érzékenysége a vegyületet jelentőssé teszi abból a célból, hogy a fertőzött kendék' klinikai eseteinek kezelésében használjuk fel.

A legkisebb gátlás! koncentrációkat (MlC-eket) sertés ürülékből lizolált d, hyodysenteriae 10 törzsével szemben határozzuk meg, agar higitásos eljárással. NCTC -{National Collection of Type -Cülture) törzseket vagy referenciatőrzseket használunk kontrollként mindegyik MIC tesztben. Az á. hyodyaenferiue-hoz az agar tápkőzeg ?% teljesen .fibrinmentes-ített steril birka vért tartalmazó BAB2~bol (Unipath. CM 271) áll, Mindegyik antimikrobiális szert kétszeres hígításban teszteljük. Az elkészített antibiotikumhigitásokat egy megfelelő térfogatú MH agárhoz adjuk, melyet korábban Sü°C-~ra hűtöttünk, Összekeverjük, és 2Ö mles mennyiségeket öntöttünk ki belőle. Az őss.zes ő. hyopneumoniae inkubáiást egy anaerob munkaterületen hajtjuk végre 37°0~οη (+/ö, S°C) (Don Whitley Scientifie), mely szigorúan 8-ö% nitrogént, 10% hidrogént és 10% széndioxidot tartalmazó anaerob atmoszférát biztosit. Az összes többi inkubáiást törzset anaerob légkörben 3?*€~on 24

7*C-on végezzük. Az árán át inkubáljuk.

Összes

Az organizmusok számát egy Ix

10^s telepképzö egység (cfu) per ml~nek megfelelő optikai denzitásra (00) állítjuk be, vakként MH ti vest használva. Az antibiotikumot tartalmazó lemezeket két péihányban inokulátjuk egy

ItOS inokulátort {Denley *««X *« *í ♦ * $β» «« » * * * *** t ‘ 67.Ö54/PÁ

P99O3IO3 2ÖG8, xntó&s

Instruments) alkalmazva, mely hozzávetőleg 1 μΐ-es kulumokat nyújt, mely az összes törzsnél lÖ*-XÖ^b cfu inokulumnak felel meg [émon, <J. Antimicrob» Chemother. 21, 701-710 (1988); Ericsson et al., Acta Fathol. Microbiol. et Immunoi. Scand. 217 (B) Suppl., 1~SÖ {1971)]. A kontrollemezeket ugyanolyan körülmények között ihkufeéljuk, mint a tesztlemezeket. A MXC-eket 24 és 48 éra múlva olvassuk le, az utóbbi a döntő. A MIC-et úgy határozzuk meg, mint azt a legkisebb antibiotikum koncentrációt, melynél nincs szaporodás, elhanyagolva, ha csak egyetlen telep van, és elhanyagolva ez inokulum okozta gyenge zavarosságot [National Comitte fór Clinical Laboratory Standards, Antimicrobial Susceptíbility Testing, NCCLC Publications SC3, Villanova, PA, USA {1989}].

A Serpulina hyodysenteriaevel szembeni MIC-ek a következük voltak [gg/ml-ben): valnemulin: 0,1; tiamulin; 8,3; linkomicin 50,0; tiloxin 200,0 és dlmetridazol: 30,-0. Mindegyik S.

hyodysenteriae törzs érzékeny volt a valnemulinra, mely a leghatásosabb volt a vizsgált szexek közül, 3-S0ö-szor hatásosabb a többinél.

lemezinopor pötty

Két kísérletet hajtunk végre, melyekben a különböző mennyiségben feletetett valnemulint hasonlítjuk össze a tiámulinnal a sertés vérhas meggátlása tekintetében. A betegség súlyosságát a klinikai betegség bizonyított tüneteivel mérjük, amelyeket a testkondíció., ürülék konzisztenciája és összetételének klinikai értékeivel határozunk meg. A Serpuii.ua byodyseufe.riae ürülékbe ίΨ» 4*4 $ 4 # 4*1

4 4 :·’

4» ’» « ♦ * ***$

6Í054/PA'

P99Ö3W3 2Ö08> március történő kiválasztódását, a pest morfom vizsgálatnál látható láziókat, a növekedés ütemét és a táplálékátalakitási arányt szintén meghatározzuk.

Az alsó kísérletben a 20, 30 és 40 ppm mennyiségben feletetett valnemulin-hidrokloridot hasonlítjuk össze a 30 ppm. mennyiségben feletetett tiamulin-hidrogénfnmaráttal és a kezeletlen kontroliokkal. Kilenc hagyományos módon nevelt (5-6 hetes disznóból) álló öt csoportot használunk mindegyik kezelési csoportban, A sertéseket 14 napon át gyógyszer nélküli takarmánnyal tápláljuk, majd az S. .hyodysenfceriae standard törzsével (PISA) fertőzési próbát végzünk. A fertőzést orálisan két egymást követe napon át végezzük. A gyógyszerkészítményt tartalmazó takarmányt a második fertőzés utáni nap vezetjük be. A második kísérletben hasonló eljárást követünk azzal a kivétellel, hogy négy, körülbelül 9 disznóból álló csoportot használunk. Ezeket 5, 10 és 20 ppm. vainemulín-hídrokioríddal táplálunk, és összehasonlítjuk a kezeletlen kontroliokkal» Ebben a kísérletben használt sertések szabadban tartott kendékből származnak, és olyan ü, byodysenteriae törzzsel végezzük a fertőzési próbát, melyet egy szabad ég alatt tartott Rondából izoláltunk, és melyről korábban kimutattuk, hogy képes sertés vérhas okozására. Mindkét kísérletben naponta megállapítjuk a klinikai betegség bizonyított tüneteit, és a klinikai értékeket meghatározzuk, hetente kétszer végbélkenetet veszünk a S. üyodysenteriae izolálásához, és az összes sertést szabályos időközönként megmérjük, A táplálékfelvételt szintén feljegyezzük. Fost mertem vizsgálatot hajtunk

ás' fb.öWs’ P99031Ö3 20ϋ§. aáicsss végre 21 nappal a fertőzési próba után, és a vastagbált megvizsgáljuk, hogy vannak-e rajta léziók. A vastagbél négy területéről, nyálkakeparéköt is veszünk, ás S. hyodysenteriae jelenlétére tenyésztjük.

Az első kísérletben, a setés vérhas klinikai állapotát először a kezeletlen kontrollcsoportban láttuk nyolc nappal a fertőzési próba után, és a'kilenc sertés közül 3 vált fertőzötté. Szintén a betegség klinikai állapotát észleltük egy sertésnél a 30 ppm valnemuiinnal kezeit csoportban, és két állatnál a tiamulínos csoportban, átlagos klinikai érték per 36 disznő értéket feljegyeztük a kontrollcsoportnál, összehasonlítva a fiamulin-nal kezelt csoport hat sertésének értékével. Az összes kezelési csoportnál feljegyzett értékek közötti különbségek statisztiku-san különböztek a kontrolloktól (p<O,ÖOl). S. hyodysenteriaet izoláltunk a kontroll csoportban lévő összes disznóból és a tiamu Unnál kezelt csoport 2 fertőzött sertéséből vett végbeIkenetékből. S. hyodysenteríaet izoláltunk két olyan disznóból, mely 30 ppm feletetett valnemulint kapott, ez egybevág a. sertés vérhas klinikai tüneteivel, melyeket az ebben a csoportban nem várt fertőzést kővetőén láttunk. íinm izoláltunk ő. hyodysenteriset a 20 és a 40 ppm-es csoportokból. Egy kis különbség volt az összes gyégyszerkészitményt tartalmazó takarmánnyal etetett csoportok tömeggyarapodásában és táplálékátalakítási arányában. A pest móriam vizsgálatnál a klinikai tűnőtökkel rendelkező kontroli és fiamulinnal kezelt csoportokhoz tartozó disznók a sertés vérhas jellemző láziéit mutatták, me~ « *** «« ** •r * **·>

* < '* *4

67.054/ΡΑ

Ρ99Ο35Ο3

2Ö0S. március lyek. a vastagbél nyálkafalszinének elhalásom összenőtt nyálkahártyájából állt. Szintén léziók voltak láthatók a tiamhlinnal kezelt csoport egyik sertésénél és egy kontroll sertésnél.,· melyek egyike sem mutatta korábban a sertés vérhas klinikai tüneteit. 5. hyodysenteriaefc izoláltunk ezeknek a fertőzött állatoknak mindegyikéből vett hyálkakenetfoől. A 30 ppm valnemulinnal kezeit csoport egyik sertésének szintén voltak sertés vérhas léziói, de S. hyodysenfceríaet nem Izoláltunk a nyálkakenebekből, Nem láttunk léziőkat a 20 és 48 ppm valnemul innal etetett csoportok pest mortem vizsgálatánál,

A második kísérletben, sertés vérhas klinikái állapotát először a kezeletlen kontroll sertéseknél láttuk 5 nappal a fertőzési próba után, és azután a csoportban az összes sertés megfertőződött, és közülük hatot meg kellett ölni a betegség előrehaladott sága miatt, Az 5 ppm valnemulinnal etetett csoportban a sertésvérhas klinikai tünetei először 8 nappal a fertőzési próba után voltak láthatóak, és ezt követően a 18 állat közül, öt lett beteg. Azonban az 5 ppm valnemulint kapott csoportban megbetegedettek száma szignifikánsan kevesebb volt mint a konrolloké (p<0,05) . Nem láttuk a betegség klinikai, tüneteit a 10 vagy 20 ppm valnemulint tartalmazó készítménnyel etetett csoportokban. Az 5 ppm vainemulínos csoport 11-es klinikai értéke szignifikánsan kisebb volt mint a kontrollok 77-ee értéke (p<ö,00S). A kísérlet alatt az összes kontroll sertésből .származó Végbél.kénetekből S. hyodysentérlset izoláltunk. Ezzel szemben az 5 ppm vaInamulinna1 kezeit csoportban az 5 megbetegedett állat közül * «·

67.Ö5WA

FW3ÍÖ3

2Ö04. xtürous csak 2 állatból izoláltunk S, hyodysenfcerxaet.. Az összes valnemulinnal etetett sertés szignifikánsan nehezebb volt a kontrolloknál a kísérlet végén (5 ppm, p- 0,05; 10 és 20 ppm, p<G,ÖS). A posf morfcem vizsgálatnál a sertés vérhas jellemed láziéit láttuk a. három még megmaradt kontroll sertés vastagbelében. Az 5 sertésből álló 5 ppm valnemulint kapott csoportban, melyek eredetileg a betegség tüneteit mutatták, csak kettőnek voltak lézíói a post mortem vizsgálatnál, de ezekből az állatokból sem izoláltunk SÍ hyodyserteriaet. Azonban S. hyodysente.riaet izoláltunk 2 másik állatból vett nyálkakenetből, melyek ekkor jellemző lézíőkkal rendelkeztek, pedig nem mutatták a betegség klinikai tüneteit. Nem láttunk lézíókat a 10 vagy 20 ppm valnemulinnal etetett sertésekben, és nem izoláltuk az S. hyodysenteriaet ezekből a csoportokból. Tehát a valnemulin lefelé a 10 ppm belefoglalás! arányig hatásos a sertés vérhas klinikai tünete.! előfordulásának, a spirochaeták ürülékben való kibocsátásának és a léziók előfordulásának meggátlásáfoan a posfc mertem vizsgálat alatt. 30 ppm-nél néhány állat a sertés vérhas klinikai tüneteit mutatta, de ez egybevág egy előre nem látott fertőzéssel, ami lehetséges hegy hatással volt az antibiotikum felvételre. Egy az ugyanabban az időben bekövetkező másik betegség hatásait az antibiotikum felvételre és a sertés vérhas előfordulására már korábban leírták [Burch, 0. G. S., Vet. Esc, 110, 244-246 (1982)j. A tömeggyarapodásí adatok elemzése nem mutatott ki különbséget a kezelt csoportok között, ami azt jelzi, hogy az antibiotikum nem befolyásolta a takarmány ízletességét.

,· >v..v.· ...s .._Λ.,«ν.·,·,·\·.· .·. x * .·,«·» « ·* * <· #* ♦ x « «:*» *♦ X « * ♦ X * **

67&54/FÁ

F99Ö3ÍÖ3

2008, saárdus

Az 5 ppm valnemulin nem. gátolta meg teljesen a betegség klinikai állapotának létrejöttét vagy a spirochaefcák kiboesátódásáfc, de a klinikai értékek jelentősen lecsökkentek összehasonlítva a fconfcrollokkal. Ebben a kísérletben a 30 ppm mennyiségben feletetett tiamulin nem gátolta meg a sertés vérhast, de lecsökkentette a betegség előfordulását a klinikai értékek csökkenésével együtt, összehasonlítva a kontrollcsoporttal. Sőt, ebben a takarmányban beadott gyógyszeres kísérletben a lö ppm valnemulin egyértelműen sokkal hatásosabb mint a 30 ppm a setés vérhas megakadályozásébán.

hagyományos módon tartott sertésből (3,5-4 hetesek.) álló csoportot gyógyszer nélküli takarmánnyal táplálunk 14 napon át, majd kiváltási próbát hajtunk végre az S. hyodysenfceriae standard törzsét (PISA) szájon át beadva. Amikor a betegség klinikai tünetei nyilvánvalóvá válnak, a sertéseket csoportonként 8 csoportból álló hat kezelési csoportba osztjuk, és antibiotikumtartalmú takarmánnyal tápláljuk 10 napon át, majd gyógyszer nélküli takarmánnyal tápláljuk további 14 napon át. A valnemulinhidrokloridot óö, 75, 100 és ISO ppm mennyiségben etetjük fél, és összehasonlítjuk a 108 ppm mennyiségben feletetett tiamulinhidrogénfumaráttal és a kezeletlen kontrollofckal. Mindegyik kezelési csoport tartalmazott olyan sertéseket, melyek a betegség egy sor klinikai tünetét mutatták. Miután kezelési csoportokat alakítottunk·, ki, a klinikai betegség bizonyítékait naponta megállapítjuk, és meghatározzuk a klinikai értéket, végbélkenetet

... R . .**«.<

* * ♦ X *

X «** ·».♦ « ♦ « « « X » * ♦ Μ «« .W

67.Ö54/PA 27

P9903ÍÖ3

2008, mámivs vessünk hetente kétszer az S. hyodyeenfeeriae izolálására, és az összes sertést szabályos időközönként mérjük. A táplálékfeivételt szintén feljegyezzük. .Fost mortem vizsgálatot hajtunk végre 24 nappal a kiváltási próba után, és mindegyik sertés vastagbelét megvizsgáljuk, hogy vannak-e rajta iéziők. A vastagbél négy területéről nyálkakaparékot is veszünk, és S. hyodybenteriaa meglétére tenyésztjük.

A megfertőzés után és a csoportokra bontást megelőzően klinikai sertés vérhast figyeltünk meg 7 nappal a megfertőzés után, és két kezelési csoportot (kontroll és tiamulin) alakítottunk ki 8 nappal a fertőzés után. Á többi csoportot 12, 15, 20 és 28 nappal a fertőzés után alakítottuk ki a kővetkező rendszerben.

Mindegyik csoport olyan sertéseket tartalmazott, melyek széklete vért vagy nyálkát tartalmazott, valamint olyan állatokat, amelyek a betegség enyhe klinikai tüneteit mutatták, azaz lágy volt

náziára v	,-X 1 Ψb.	szüks
te a kéz?	slés	végé
	,Ζ-Ϊ Ν'* 4* Z->
		ítW bxii
és a betí	jgség	: kil
látható.	A í	?. na

a székletük. A kísérlet 4. napján a kontroll csoportban az öszszes sertés a betegség súlyos klinikai tüneteit mutatta és ezeket megöltük. A kezelési idő alatt a tlamulln csoportban mind a 3 állat vagy elpusztult vagy a súlyos sertés vérhas miatt euta, A valnemulinnai kezelt összes állat megélA valnemulin bármekkora mennyiségével tápbetegség klinikai tünetei gyorsan elmúltak, taí állapota a kísérlet 5. napjáig nem volt látható. A 8. napig látható volt ez a javulás a tíamullnt evő túlélő sertéseknél is. A valnemulin átlagos klinikai értéke 4tol 10-ig terjedt,

Összehasonlítva a tiamulin csoportnál fel φ *»♦ ' ♦»· ’ ♦ φ φ φ * φ φ φ φ *

Φ φ Φ: φ -X

Φ * ♦ * φφ

67.Ö54/PA .99903103 2 DOS. mámán jegyzett 3Ö-as átlagértékkel. A 3. naptól a 10. napig a klinikai értékek, statisztikai elemzése azt mutatta, hogy szignifikáns különbség van az összes valnemulinnai kezelt csoport és a tiaraulinnai kezelt csoport között (ρ<0,001). Az összes valnemulint evő sertésnél folytatódott a tömegnövekedés a kezelés ideje alatt, és az összesnél nagyobb napi éiőtömeggyarapodás (DLWGJ volt, mint a tiamuiin csoportban (0,4-tol 0,9-íg terjedt, összehasonlítva a 0,1-gyel}. A tápanyagára!akitusi arányok (FCR) sokkal nagyobbak voltak a tiamulin-nal kezelt csoportban (6,4), összehasonlítva a vainemulínos csoporttal ( 0,9-tol 2,5-ig terjed) a kezelési idő alatt, S, hyodF^enberiaet izoláltunk minden kezelési csoportban a sertések nagy részénél a csoportokra osztás időpontjában. öt nappal, a csoportokba osztás után az S. hyodysenfceriaefc nem tudtuk kimutatni a végbélkenetékből a kezelési csoportokban a sertések egyikéből sem.

A kezelés utáni időszakban az 50 ppm valnemuíínt tartalmazó készítményt kapott csoportban egy sertés a betegség klinikai tüneteit mutatta négy nappal a gyógyszerezett takarmány megvonása után, és a. t iámul innal kezeit csoportban egy sertésnek szintén sertésvérhasa lett a kezelés utolsó napján. Azonban ezeknek a sertéseknek a székletéből nem izoláltunk S. hyodyseaieríeet. Ebben a kezelés utáni időszakban csekély látható különbség volt az összes csoport DLWG-je és FCR-je között. A kezelés végekor a posfc mertem vizsgálatnál a sertés vérhas iézióí nem voltak láthatóak egyik, olyan sertésnél sem, melyet ?5, 100 vagy ISO ppm valnemulinnal kezeltünk. Az 50 ppm valnemulinnai etetett cső* ♦ * * * X « ♦ ♦ ♦ * * ♦ * **♦ * ««.

67.Ő54/PA 29

P9963Í03

2Ö0S, márnám portban 1 sertésnek klinikai sertés vérhasa volt, és egy Másik sertésnek ebben a csoportban a vastagbele némileg vörössé vált ebben az időpontban. S. hyodysenteriaet is izoláltunk ebbői a két sertésből származó nyáikakaparékból, és három másik állatból is a csoportban, melyeknek nem voltak sertés vérhas léziói. Az egyik sertésnél a 75 ppm valnemulint evő csoportból szintén S. hyodysenteriae termelődött a nyáikakaparékból, bár a klinikai sertés vérhas bizonyított tüneteit nem láttuk ebben a sertésben.

Az 50, 7S, .100 és 150 ppm -valnemulin jelenléte a készítményben tehát a sertés vérhas klinikai állapotából való kígyógyuláshoz szükséges napok számának csökkenését eredményezte összehasonlítva a tiámulinnal. Úgyszintén az állatok nem pusztultak el és nem volt. szükség eutanáziára ezekben a valnemulinnál kezelt csoportokban. Szignifikáns eltérés (p<0,ööl) volt a valnemulin készítménnyel kezelt csoportok klinikai értéke között összehasonlítva a tiamulinos csoporttal. Az S< hyodysenteriae kibocsátását az ürülékből szintén meggátolta valnemulin mindegyik menynyieége a gyógyszeres takarmány megvonása után is. Azonban S.

hyodysenfceriaet izoláltunk az 50 és 75 ppm vaInemuiInt kapó sertések nyálkakaparékaiból. Kimutattuk, hogy a 35 ás 40 ppm tiamulin eiímináija az S. hyodisenteriaet az ürülékből, de nem gátolja meg azt, hogy a nyáikakaparékból kinyerjük fTaylor, D. J., Vet. Rec. 106, 526-523 (1960)}, A 100 ppm tiamulint sikeresen alkalmazták kísérleti körülmények között (Taylor, D, J.,

Proc. ?th IPVS Congrsss Mexico, 4.7 (1982) ] a sertés vérhas kezelésére olyan állatokban, ahol nem betegedtek meg olyan súlyosan, x x** * 4« '67,054/FA m&3ÍÖ3 2008. nibeüss hogy étvágytalanok lettek volna. Ebben a kísérletben a 100 tiamulin lecsökkentette az elhalálozást összehasonlítva a kezeletlen kontrollokkal, de nem gátolt meg minden elhalálozást, ennek lehetséges, hogy az volt az oka, hogy e kísérletes fertőzés által indukált betegség túl súlyos volt.

Ebben a kísérletben az 50, 75, 1ÖÖ és 150 ppm valnemulln. készítményt tartalmazó takarmánnyal készítménnyel sikeresen kezeltük a kísérletesen létrehozott sertés várhast, meggátolva az elhalálozást és megszűntetve a klinikai tüneteket.· Az S. hyodysenferíae kiválasztódás gátlödott a kezelés alatt, egy kezelés utáni visszaeséssel, ahol a gátlás egyetlen 50 ppm-mel kezeit sertésnél megszűnt. Az 50 és 75 ppm valnemulin nem elírninálta teljesen az S. hyopnewsoníaet az összes sertésből, de 100 ppm-néi nagyon hatásos volt,

A találmány szerinti szer tehát hasznos a Sezpulina hyodysen£er.jtae fertőzés okozta sertés vérhas kezelésére alkalmas állatgyógyászati készítmények előállítására. Ezen alkalmazás céljából a hatásos dózis természetesen változó, az alkalmazott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától, és a kívánt hatástól függően? például a megelőző 'kezeléshez viszonylag kis dózisokat kell beadni egy hosszú időtartamon keresztül. Mindemellett általánosságban kielégítő eredmények érhetőek el, ha a szer a készítményben körülbelül 1 mg/kg és körülbelül 5 mg/kg állati testtömeg közötti koncentrációban van jelen, (napi dózis)· ' megfelelően megosztott dózisokat alkalmazva 2-4 alkalommal naponta, vagy tetszés szerint takarmányban vagy vízben, vagy

». + *>, ·*♦*:« ·· φ« . ++·χ♦ * * *

X *X* ** « * ♦ ♦ X *

X«*r «

í......

ál&Wá’' MW 2088. rsfaias

3ί lassú felszabadulásé' formában. A legtöbb állatnál a teljes napi valnemulin dózis körülbelül 10 mg-tól körülbelül 400 mg-ig terjed, például körülbelül 10 mg és körülbelül 200 mg közötti a megelőzéshez, vagy körülbelül 20 mg és körülbelül 400 mg közötti a kezeléshez, tetszés szerint takarmányban vagy vízben beadva, vagy egyszer vagy kétszer naponta.

Az előnyben részesített dózisok ivóvízben 0,001-0,05 tö~ meg/térfogat%, különösen 0,001-0,005%, és takarmányban 20-100 g/tonna, különösen 20-75 g/tonna.

A ko-litisz hagyományos módszerrel mutatható ki, például úgy, ahogy azt az állatgyógyászati kézikönyvek leírják, például Taylor, D. 0. [Fig Diseases, €-. kiadás, Fnbl. D. <J. Taylor, U.K., 148-149 (1995) j. A találmány szerinti szer előnybe hatását ebben az alkalmazásban például a követkérőképpen határozzuk meg;

A vizsgálatban hasmenéses és hasmenéstől mentes kendékből származó sertés vérhas járványkitörésből származó kilenc WBHS mezei izolátum és az ATCG 2979S (S’erpaiína Innooena, 3-as csoport) [Fellstörm, C., Rés. Vet. Sci. 59, 1-4 (1995)} vesz részt. Az azonosítás 5% szarvasmarha vért. tartalmazó TSA-n (Tritikáz szója agar) lévő hemolízis mintázaton, -az- indoltermeiés -és a hippurát hidrolízis vizsgálatán [Bosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK) alapul. A, kilenc gyengén béta-hemolitikus spiroehaeta közül egyet a 2. csoportba, négyet a 3. csoportba, és ötöt a 4. csoportba osztottunk [Fellstrőm, ugyanott). A bak6/.854/PÁ 32

P99Ö3J03

2088, március tóriumokat az agar lemezekről 0,9 %-os sóoldatba visszük át, és a turbiditást 1,0-ra állítjuk be a McFarland skálán, mielőtt, minden izolátum 10 μΐ-t agarlemezeken ínokulálnánk, melyeket a következő antimikrobiális szerek kétszeres koncentrációjával egészítünk ki: valneíuulin-hidroklorid, tíamulin-hidrogénfumarát, dímetridazol, linkomícin-hídroklorid és tílozín. A növekedést és a hemolízist négy napos aerob tenyésztés után jegyezzük fel, és a MXC-et úgy határozzuk meg, hogy az a legalacsonyabb antibiotikum koncentráció, ahol a spirochaeták nem növekednek.

A WBHS MIC meghatározásainak eredményei t a 6. táblázatban mutatjuk be. Általánosságban a WHS érzékeny az öt antimikrobiális szer mindegyikére. Nem volt különbség az érzékenységben a három WBHS csoport között az antimikrobiális szerekkel szemben a vizsgálat alatt. A valnemulinnál kapott MIC értékek voltak a legalacsonyabbak a 10 törzs közül kilencnél, míg sokkal magasabbak voltak ezek az értékek azoknak a törzseknek a legnagyobb részében, melyeket a többi négy referénciavegyülebtal kezeltünk.

Mindegyik WBHS-nél a valnemulinnal szemben mutatott nagy érzékenység a vegyülőtét jelentőssé teszi abból a szempontból, hogy a fertőzött kondikban előforduló klinikai esetek kezelésében al kaIma z zu k.

* s * *** f * *

67.Ö54/PA 33

P9903I03

2008, március €< táblátaat.

A legkisebb gátlás! koncentráció (MIC) értékei 10 gyengén béta-hemoixtikus spirochaetánál

a számát jelzi, melyekről meghatároztuk hogy a2 adott MIC értékkel rendelkeznek eb - hidroklorid; hfu « hidrogéntnmarát

Λ · ·..·♦··'· :·< <,···-.< ?:<· * <»·* ♦* *

Í« * * * * *** χ 44

67.054ΖΡΑ

P99Ö31G3

2ÖÖ§. mrcúss

Λ találmány szerinti eze.r tehát - készítmény alakjában, takarmányban vagy ivóvízben - hasznos a Serpulina pilonicolí fertőzéssel járó sertés koiitisz kezelésében. Ezen alkalmazás céljából a hatásos dózis természetesen változó# az alkalmazott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától és a kívánt hatástól függően; például a megelőző kezeléshez viszonylag kin dózisokat kell beadni egy hosszé időtartamon keresztül. Mindemellett általánosságban kielégítő eredmények érhetőek el, ha a szert tartalmazó készítmény hatóanyag koncentrációja körülbelül 1 mg/kg és körülbelül 5 sig/kg állati testtömeg közötti (napi dózis) megfelelően megosztva 2-4 alkalommal naponta.# vagy tetszés szerint takarmányban vagy vízben, vagy lassú felszabadnlású formában. A legtöbb állatnál a teljes napi dózis körülbelül 10 mg-tól körülbelül 400 mg~.ig terjed, például körülbelül 10 mg és körülbelül 200 mg közötti a megelőzéshez, vagy körülbelül 20 mg és körülbelül 400 mg közötti a kezeléshez, tetszés szerint takarmányban vagy vízben beadva, egyszer vagy kétszer naponta·.

Az előnyben részesített dózisok ivóvízben 0,001-0,00 tőneg/térfogat %, különösen 0,001-0,005 ·%, és takarmányban 20-100 g/tonna, különösen 20-75 g/tonna.

A Lswsonia íntraceilularís fertőzés hagyományos módszerrel mutatható ki, például ügy, ahogy azt az állatgyógyászati kézikönyvek leírják, például Taylor, D. J. írig Dlsea.ses# S. kiadás# *

»**♦ * * » »* * ♦ v * X**

♦ ♦4 , »

Xs» *

♦

47,054,ΦΑ P9903103 2008, március

Publ, D. J. Tavlor, Glasgow# Ü.K., 154-157 {1995)1, A találmány szerint előállított készítmény hatóanyagának előnyös hatását ebben az alkalmazásban például a következőképpen határozzuk meg:

1, Xss vitro aktivitás:

.Általánosságban Lawson, G. Η. K. és munkatársai (J, Clín. Microbioi. 31, 1136-1142 (1993)] módszerét követjük, kisebb módosításokkal {a standard Kxrby-Bauer lemez módszerek nem alkalma zhatóak az intracelluláris baktériumoknál);

Sejtek: XEC-18 patkány enterocita sejttenyészetek (ATCC CRL 1589) egyseifcrétegeit hozzuk létre, és standard sejttenyésztési módszerekkel tartjuk fenn. Az osztódó sejtek egynapos egysejtrétegét {hozzávetőleg 30%~os Összefolyás) készítjük el a ö, napon történő fertőzéshez, Üveg fedőlemezeken kis tenyésztőfiolákban (Traes),

Inokulumok; Xnokulnmként a fawsonia intracellnigris három törzséből készült adagokat használunk. Szék olyan sertésekből származnak, melyek pröliferativ enteropátíában, proliferatív haemorrhagiás enteropátíában (PME) és sertés íntesztínális adenomatózísban (PIA) szenvednek, és melyeket sertésbélből preparálunk, és sejttenyészetekbe viszünk át, ahogy a fenti bawson hivatkozásban leírták. Két PHE törzset tesztelünk részlegesen a sertésekre gyakorolt patogenioltásra, ahogy azt MoOrist, S. és munkatársai leírták (Infect Immun. 61, 4286-4292 {1993)J. Az ínokuiumadagokat néhány sejtpasszáiás után összegyűjtjük, és 70^öC-on lefagyasztva 1 ml-es fiolákban tároljuk. Előzetes kísér*4:. »Λλ· * tf.Á.

* < $ Λ ’ ♦ Κ*Α ·* * * ***** 4 «** * ** δ?,8$4/ΡΑ

W9Ö3ÜB 2ÖÖ8. március letekkel megállapítjuk a felolvasztott fiolák megfelelő hígítósaít, hogy gyorsan felismerhető fertőzést kapjunk az ötnapos kísér letekben .

Mindegyik alkalmazáshoz az antibiotikumok lÖÜ-szoros törzsoldatait készítjük el standard Kírby-Saner I

Mindegyik emez módszer antibiotikumadag aktivitását a 'rei igazoljuk Sachcerichia- coli egy laboratóriumi törzsén.

Fertőzések: A 0. napon mindegyik törzs egy fioláját kiölvasztj'Uk, 1/8-től 1/32 arányig tenyésztők.őzeggei hígítjuk abból a célból, hogy az 1-4. csoportoknál felhasználjuk.

A 4. csoportnál (folyamatos kezelés) kezdetben ezt az xnokulumot egy órán át 37°C~on az antibiotikum különböző koncentrációit tartalmazó , mielőtt a sejteket hozzáadnánk.

A 3. csoportnál (exfrscólluláris aktivitás) az inokulumot a tenyésztő közegben készítjük ei, melybe közvetlenül a sejtek hozzáadása előtt különböző koncentrációban tesszük bele az antibiotikumot .

Az 1. csoportnál (kontroll) és a 2. csoportnál (intracelluláris aktivitás) az inokulumokat antibiotikummentes tenyésztő közegben készítjük el, és hozzáadjuk a sejtekhez. A tenyésztő fiolákat (Tracsj a sejtekkel és a hozzáadott inokulummal <4/™ antibiotikumok) összesen 0,5 mi tápközegben, acél edényekbe helyezzük, -40%~os atmoszféráig légtelenítjük hagyjuk, feltöltjük hidrogénnel és végül 10% ezután kivesszük ezekből az edényekből, és (8% Oj), 2 percig C02~vei. A fiolákat n k u bá t o r k é s z le t be ♦* ·.'£ $*_Χ« 4« ·υ<\^Λ, * * * ' * i _# $ * « a * >· ' **♦ · **

67,0'54/ΤΑ

P99Ö3103

2008, máreivs

3?

helyezzük, páráéi tott, 8% Üj-t és 8,8% COa-t és a fennmaradó részben nitrogént tartalmazó atmoszféra biztosítására 3?'^eC-on.

Az 1. és a 2, napon mindegyik fiolát kivesszük, és friss tápközeget teszünk bele, mely vagy tartalmaz antibiotikumot (2. és 4. csoport), vagy nem (1. és 3. csoport), és visszahelyezzük az inkubátorba. Az S. napon az összes fedőlemezt kivesszük, és egy specifikus monoklonáiis antitestet tartalmazó indirekt immunpercxidáz festékkel megfestjük a falsonis intracellularis kimutatására, Mindegyik fedőlemezen a Lawonia íntraeellulsrihszál erősen fertőzött sejtek számát 030 per sejt, erősen fertőzött sejt « HIC) alkalmazzuk a fertőzés fő mérésére. A HXC gócpontok számát és általános sejtmegfigyeléseket is feljegyzünk. A

kontro.1	.Inál	{1. csoport), az
kun esszében	(2. csoport), az
kun esí	szében	(3. csoport) és

istracellulárisan aktív antibiotiextraceliulárisan aktív antihiotia folyamatos kezelési esszében (4.

csoport.) kapott HlC-eket összehasonlítjuk a három példányban elvégzett esszékben, mindhárom törzsnél. Néhány esszét különböző inokulumerősségnél megismétlőnk. A százalékos arányokat a tesztcsoporthoz tartozó kontrollok átlagos KXC-ének deriválása után számoljuk ki. Az átlagos kontroll HXC a HlC-ek teljes száma a kontrolltiolákban osztva a fertőzött kontrolifiolák számával, A t-esztfiolá'k százalékos arányát ezután úgy számoljuk ki, hogy elosztjuk a HXC értéküket az átlagos kontroll HlC-cel, és megszorozzuk százzal, hogy százaiékértéket kapjunk. Azoknál a tesztfloláknál, ahol nincs anfcibiotikumhatás, 1QÖ körüli a százalék*·*# >*Λ* ♦* • ·-· ··&-· ,ν· .....·Λ------λ * ♦ * X « ’ X».’ *' · <χ·χ<

* φ

67*054'FA F90Ö3IÖ3 2ÖOS. márcias

3k arány, és ahol az antibiotikum teljesen gátolja a növekedést, az arány Ö.

A valnemulin-hidrokloríddal kapott eredmények a 7. táblázatban találhatók meg, mely bemutatja azoknak a sejteknek a százalékát, melyek fertőzetlenek maradtak.

éavsonía infracellularis fertőzésének százalékos arányai olyan sejttenyészeteknél, melyekhez valnemulint adtunk

eh - hídroklorld

.... *»*J .·“ ··* , *· * ,». ♦ ·' 'SAÖ54/PA 39

P99Ö3KB

2<Η)ί március

Az eredmények azt. jelzik, hogy a vainemulin-hidroklorid minimális koncentrációja, mely a issesoniu infcracellularis növekedésének szignifikáns gátlását (<1% növekedés) okozza, < 2 pg/ial.

2. Fertőzéskiváltési vizsgálat

Harmincöt.

zéskiváltási

e.n terepét iát elválasztás utáni malacon ugyanazon a napon fertőpróbát hajtunk végre a sertés proliferativ okozó iau’sonia intraceJIuluris (LR185/5/83 törzs) virulens inokulurnával, melyet úgy kaptunk, hogy azt az IEC-18 patkány enterooita sejtvonalban (&TCC CRL 1589) tenyésztjük, ahogy azt hawson és munkatársai (J. Clin. Mícrohiol, 31, 11361.142 (1993)j leírták. Hét kontroll sertésnek pufferoldatot adunk be. A 21 fertőzött sertés közül hetet nem kezelünk. Ennek a hét sertésnek lecsökkent a testtömeggyarapodása, és mindegyiknél proliferativ enteropátiás léziők alakultak ki, melyeket a fertőzés urán három héttel a boncoláskor vett bélmetszeteken mutattunk ki. E hét sertés közül hatnak feltűnően látható léziói voltak, háromnak enyhe vagy mérsékelt hasmenése volt két héttel a fertőzés után. Abból a célból, hogy teszteljük a megelőzés' adagolási stratégiáját, a próbafertözött sertések két másik csoportjának szájon át vainemulin-hidroklorídot adtunk be 25 ppm-ea illetőleg 75 ppm-es dózisban (azaz 1,25 mg/kg és 3,7 mg/kg) premixben két nappal a fertőzési próba előtt, melyet az eutanáziáig folytattunk. A kezelési stratégia teszteléséhez két másik fertőzött sertéscsoportnak szájon át valnemulint adtunk ppm és 75 ppm mennyiségben premixben hét nappal a fertőzés után, melyet az eutanáziáig folytattunk.

χ χ ♦X** ** * * * * χ *·#* ♦♦ <δ®Α

F09O31Ö3

A boncolásnál kivett hőimetsreteken nem voltak, láthatók proilferatív enteropátiás léziók a prevenciós csoportba tartozó 7 sertés közül 3~nál, és a kezelési csoportba tartozó 7 sertés közül ötnél. A kontroll sertések normálisak maradtak, Tehát a váltemuiin a fertőzésnek kitett sertések nagy részénél megelőzte vagy gyógyította a betegséget még a kapott gyógyszer alacsony aktuális dózisai mellett is.

A találmány szerinti eljárással előállított készítmény tehát hasznos a ia&'sonia intraoeliularis fertőzéssel járó sertés iieitísz kezelésében. Ezen alkalmazás céljából a hatásos dózis természetesen változó, az alkalmazott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától és a kívánt hatástól függően; például a megelőző kezeléshez viszonylag kis vaInemuiin dózisokat kell alkalmazni egy hosszabb időtartamon keresztül. Mindemellett általánosságban, kielégítő eredmények érhetőek el, ha a szert körülbelül 1,5 mg/kg és körülbelül 6,5 mg/kg állati testtömeg közötti napi dózisban adjuk Pe, megfelelően elosztott dózisokban

2-4 alkalommal naponta, vagy tetszés szerint takarmányban vagy vízben, vagy lassú felszabadulása formában. A legtöbb állatnál a teljes napi dózis körülbelül 10 mg-tói ' körülbelül 10Ö0 mg-íg terjed naponta egyszer vagy kétszer beadva.

Az előnyben .részesített dózisok ivóvízben 0,001-0,05 tőmeg/téríogat é, különösen 0,001-0,005 %, és takarmányban 20-400 g/tonna, különösen 20-200 g/tonna.

***:*.·.

» ♦ . * ** .,¼

87.Ő54/FA

W03W3

A fertőzés hagyományos módszerrel mutatható ki, például a M^coplasma gallisepticum fertőzésnél úgy, ahogy azt az állatgyógyászati kézikönyvek leírják, például ,¾ Diseases of Poultry, 8, kiadás, Höfstad et ai. (szerk.}, Xowa State Uníversíty Press, 196-198 (1994}. A találmány szerinti szer alkalmazásával előállított készítmény előnyős hatását ebben az alkalmazásban például a következőképpen határozzuk meg:

1« Ση vitro aktivitás: MXC

A valnemulín-hídrökloríd antimíkrohíális hatását standard sorozat mikrchígitásos technikával határozzuk mag a tilozinnal (szo~ lubilis Tyian) ás a tiamulin-hidrogénfumaráttal összehasonlítva.

A tesztvegyület 12,8 mg-ját 100 ml desztillált vízben oldjuk, hogy egy törzsoidatot kapjunk, melyet -2ö^aC-on tárolunk a .^elhasználásig. Az alkalmazott áfyccpXasma gallisepfcieass referencíatörzsek az X95, az S6 Holland, az S6 Benoh (Anglia}, az MS~16 (Japán}, az HK-7 (Japán) és a 1228, és különböző friss mezei izolátumok.

A törzsek antihíotíkumérzékenységét egy módosított mikrotápleves hígítási eljárást (Stípkovits et al., Vet. Microbiol» 15, 65-70 (.1987)} alkalmazva vizsgáljuk meg. A mikrotítrálő lemez minden üregébe tesztelő tápközeget adunk <188 pl}, az antibiotikumokat kétszeres hígításban alkalmazva. Az inokulum (100 pl) 10* pfu/ml-t tartalmaz. A lemezeket celluxszal lezárjuk, és 37^eC-on .3 napon át inknbáijuk. Az antibiotikumnak az a legalacsonyabb koncentrációja a legkisebb gátlás! koncentráció (MIC, mely teljesen meggátolja a tápkőzeg színváltozását a harmadik *** * κ««

9>7,054.ΦΑ

P99ÖH03 2008. márcms napi leolvasásnál), A színváltozást nem mutató Üregeket a miköplazmák életképességére leellenőrizzük oly módon, hogy agar tápközegre helyezzük. A.Z összes mikoplazma törzs szaporodik a B tápkőzeg (Ernr, H. és Stipkovits, L., Acte Vet. Scand. 14, 43Ő-44S (1973)] 10 ml-ében. Miután 37°C-on a korai lóg fázisig szaporítottuk, a tenyészet 1 mi-es alikvotjait oltótenyészetként csövekbe osztjuk szét, és ~2Ö°€~on tároljuk. A glükózfermentáló Mycoplasma törzseket 11 glükózzal kiegészített módosított BG tápközegben (pH«7,8), az argininhídrolizáló törzseket 1% argi-nint tartalmazó Ba tápközegben {[Ernr, H. ás Stipkovits, L., fentebb, 450-463], és a glükóz- és arginin-negatív törzseket 1% trifeniitetrazólium-kloridot tartalmazó B tápközegben vizsgáljuk.

A különböző törzscsoportoknál ás antibiotikumoknál kiszámoljuk az átlagos MIC értékeket figyelembe véve a hígításokat.

A referenciatörzsek MIC értékeit a 8« táblázatban, a Mycoplasma izolátumokét a 9. táblázatban mutatjuk be.

A Mycoplasma gal refersneiatörzs MIC értékei (pg/ml)

eh ~ hidreklóridhfu - hidregénfumaráfc * χ χ * .· ..

♦ * * :<♦·: ♦* x ♦ *

X** * ♦ *> #*

67.Ő54TA P9903JÖ3 2Ö0S. nüscivs

Ci$ .rke m.ikoplazma izolátumok MIC értéke;

A referencia mikopiazma törzsekkel kapott eredmények azt jelzik, hogy a három vegyület. többé kevésbé ugyanolyan aktivitási tartományt mutat. A mezei izolátumok MIC értékei azonban rámutatnak a tesztanyagok közötti hangsúlyozott különbségre; mig a vá inemui ínnal ÍÖ,03-0,06 pg/ral) szemben egységesen nagy j&JÖSi'HA m)3tÖ3 2908, márew **** ♦* ***ΐ * * · * * X ♦ * *·*χ ·*%♦ * i * ** érzékenységet mutattak, a tiamulinnal szemben az érzékenység némileg csökkent (0,06-1 ug/ml), és a tilozínnal szemben még rezísztens törzsek is láthatóak (0,06-32 pg/ml).

ii vizsgálatok:

2.1, /zés

Hím. broíler csirkék csoportjait fertőzzük a #ycoplasma gallisepticum (MG) egy virulens törzsével, és mindegyik csoportot a következők egyikével kezeljük; valnemulin (0,00312, 0,00625, 0,0125 és 0,025 6 koncentráció), tiamulin (0,00625, 0,0125 és 0,025 %), és tilozin (0,05 %} . A fertőzést a 2. napon hajtjuk végre oly módon, hogy mindkét tüdőbe 0,1 ml Mycpplasma galliseptieias. tenyészetet oltunk, mely hozzávetőlegesen 106 cfu életképes szervezetet tartalmaz (Jordán, F. T, $J., The Veterinary Record 127, 502 (1990)], és a győgyszeradagolást a fertőzés órájában kezdjük meg, és hárem egymást követő napon át folytatjuk. Van egy fertőzött kezeletlen és égy nem fertőzött csoportunk is.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a klinikai tünetek és az elhullás megelőzése azonos mértékben kielégítő volt a két nagyobb dózisé valnemulinnai (0,0125 és 0,025 %) és a tiamulih háromféle dózisával és a tilozin adott koncentrációjával, kezelt csoportokban. Kevesebb csirkében láttunk láziót és ezek kevésbé voltak súlyosak a tilozinnál, ezt követte a tiamulin majd a valnemulin két nagyobb dózisa (0,0125 és 0,025 %) . A valnemulin két alacsonyabb dózisa e tekintetben kevésbé volt hatásos. A legnagyobb tömeggyarapodás a tilozínnal kezeit csoportoknál volt; a következő, bár itt a tömeggyarapodás szignifikánsan ki>:»*«» *» ···} * * * . * _u Φ * ** ♦ * ♦·*«>

67.Ö54/PA P99Ö31Ö3 200$. márdes sebfo (p<0,ü5), a fertőzetlen madarak csoportja volt, a tiamulxnos csoport és azok akiknek valnemulint adtunk, de nem alacsony dózisban. A legkisebb tömeggyarapodást a kisdőzísú valnemulinnal kezeit csoportnál és a fertőzött de nem kezelt csoportnál kaptuk, amelyek nem különböztek jelentősen egymástól. Nem nyertünk ki MG-t sem az életük során sem a boncoláskor a fertőzetlen csoportból, a tiamu.lin legnagyobb dózisánál és a tiiozínnál, és csak egyetlen csirkéből izoláltunk MG~fc a legnagyobb dózisó, valnemnlínnál. Magasabb arányú .i zolálást végeztünk az Összes többi fertőzött csoportnál. A szorológiaí eredmények nem teljesen ezt tükrözték a tílozlnnál, mivel az ebben a csoportban viszonylag nagy arányban voltak pozitív reakciók.

Tehát úgy feléltük, hogy a valnemulin két nagyobb dózisé olyan hatásos fiatal csirkékben a Mycoplasma galllseptlcum megelőzésére mint a referenciavegyüietek.

2.2. Kezelés;

Hím broiler csirkék csoportjait fertőzzük a Mycgplaema gaiiisepüicum (MG) egy virulens törzsével, és mindegyik csoportot 0,0125 %,· 0,025 %, 0,05 % valnemulinnal, ugyanilyen koncentrációjú fiamulínnal, 0,05 < tilozinnai, vagy egy 0,083 %-os Xinköspektin-spektinomicin kombinációval (Linco-Spectin) kezeljük. Van egy fertőzőit de kezeletlen és egy nem fertőzött csoportunk is. A csirkéket kétnapos korukban fertőzzük oly módon, hogy mindkét tüdejükbe 3,4 x lö⁵ organizmust oltunk. Az ivóvízbe kevert gyógyszer adagolását 24 órával, később kezdjük el három * * * ***

Φ ♦ « ♦<**.

$* &7,Ö$4M

99903103

2008. núreius egymást követő napon át, kivéve a Linco-Spectint, amelynél 5 napig folytatjuk a kezelést»

A kapott, eredmények azt mutatják, hogy az elhullás gátlása, mely nem több mint 5%-os, a legjobb a valnemulínnál volt, mindhárom koncentrációban, és a Q,0Sá~os tiamulinnál. Kern láttunk léziókat sem a legnagyobb, sem a legkisebb valnemulindózisnől sem, és csak néhányat kaptunk a tiamulinnál és a tilózinnál. A tömeggyarapodás a valnémulin mindegyik koncentrációjánál nagyobb volt mint a tiamulinnal kezelt csoportoké, és azonos volt a tilozinos csoportéval. Nem nyertünk ki mikoplazmát a 23 napos kísérlet végén a három vainemulínos madárcsoportből és azokból sem, akik tilorint. kaptak. Ekkor a szexológiai eredményekben néhány pozitív reakciót kaptunk az összes fertőzött csoportnál.

Az elhullást, a tömeggyarapodást, az MG izolálást és a szérumagglutinációs tesztek eredményeit tekintve, a valnémulin ivóvízben beadott két legnagyobb dózisa <8,825% és 8,85%) legalább olyan jó vagy jobb eredményeket adott mint a 8,85% tiamuiin vágy a 0, 05'% tllozin, és sokkal jobbat mint a Linco-Speetín,

A találmány szerinti szert tartalmazó készítmény tehát hasznos a baromfiak Mycgpiasma gaiiisepticum fertőzésével járó krónikus légzőszervi megbetegedésének és izületi gyulladásának kezelésében. Ezen alkalmazás céljából a hatásos valnémulin dózis természetesen változó, az alkalmazott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától és a kívánt hatástól függően; például a megelőző kezeléshez viszonylag kis dózisokat kell beadni egy hosszú időtartamon keresztül. Mindemellett általánosságban «*«

J *♦ .. *w # s v $ /*

67.054.?PÁ TO03Í03 2008. március kielégítő eredmények érhetőek el, ha a szert ivóvízben körülbelül 0,005 tömeg/térfogat % és körülbelül 0,01-0,03 % közötti dózisban adjuk be, különösen 0,01-0,03 %-ban, és a takarmányban 20-400 g/tonna, különösen 20-200 g/tonna dózisban.

A Pasteurella multocidával, Actinobacíllus (JSáernophilus) pleuropneOToniaevel és/vagy Aaemophilus parasnissal történt másodlagos fertőzés hagyományos módszerrel mutatható ki, például égy, ahogy azt az állatgyógyászati kézikönyvek leírják, például 'Taylor, D. J. [Pig .Diseases, δ. kiadás, Publ. D. J. Taylor, Glasgow, U.K., 185-18?, 188-194 és 194-197 (1995)]. A találmány szerinti szer előnyös hatását ebben -az alkalmazásban például a következőképpen határozzuk meg:

Meghatározzuk a valnemulin-hidroklorid sertés légzőszerv! .szövetéből származó Pasteurella múl focidéval, Haemophilüs pleuropneumoniaevel és haemophilus párásul# jelen izolátornálval szembeni legkisebb gátlás! koncentrációját (MIC), ás összehasonlítjuk a tiamulinnaX. Az utolsó 5 évben megbetegedett sertésekből izolált 10 P. muifcoddat, 10 K. pleuropneumoniaet és 3 H. paraauiut tartalmazd baktériumizolátum tenyészetet alkalmazunk, ahogy azt. a post morfom vizsgálatoknál megállapítottuk, A

PasteureXIo.

zolátumok közül három a

Pasteuréi la múltoddá toki kus törzse vo i t« v i z sgá 1 a t e .1. ő 115.

A P« pleuropneumoniaenél napon mindegyik tiszta és a H. parasztién ál a tenyészetből egyetlen : _ν........................... . . . . . .. .. .....

,· » » » » » : »»« * *« > >

67Ó54/FA 48

P99Ö33Ö3

2QSk március oitókacsnyí mennyiséget 10ml Todd&Hewitt táplevesbe {Unipath CM19O) oltunk, mely 1% donor borjú szérumot és 2 mg/ml nikotinami-d-adenin-dinukléotídot (MAO? tartalmaz. A P. múlfcocídánál a vizsgálat napján a tiszta tenyészetek mindegyikéből egyetlen oltókacsnylt oltunk 10 ml No.2 nutrient táplevesbe (Unipath CMÚ7), mely 1% donor borjú szérumot tartalmaz. Mindegyik elkészített táplevestenyészetet 18 órán ét 37*C-on inkufoáljuk 10%-os Gödben. &z inkubálás után és a vizsgálat napján a 23 táplevestenyészetet iö^s-lö^s organizmus/ml-re állítjuk be steril fiziológiás sóddáttál a MIC tenyésztőközeg inoknlálásához, Mindegyik tesztvegyületnéi az Oxford Staphyílococcus -au-reus MGTC 6SI1 standard kontrolltenyészetejt szintén létrehozzuk, hogy hitelesítsük a MIC tesztek eredményeit. Mindegyik esetben a kontroll organizmusokból létrehozott tápleves tenyészetek azonosak a tesztelt szervezetek, tenyészeteivel. A valnemulin hidroklorid formában van, a t iámul int pedig hidrogén! umarátként. alkalmazzuk.- A vizsgálat napjain a tesztvegyületek 3,2 mg/ml hatóanyagot tartalmazó törzsoldatait készítjük el steril desztillált vízben. Steril vízben további kilencezer kétszerez hígításokat készítünk, melylyel mindegyik antibiotikumnak, egy 320 gg/ml-től 1,25 pg/ml~ig csökkenő tartományát biztosítjuk a MIC tápközegbe történő bevitelhez, Lizáit ló vért (öxoid SR50) tartalmazó érzékenyitett agart (öxoid 0409} készítünk a gyártó útmutatásai szerint, és ha szükséges a pH-t 7,4-re állítjuk be. A két naemophiluz fajjal szembeni MIC esszékhez készített MIC-tápközcg mindegyik tételénél 2mg per mi Mad-ot is adunk hozzá, hogy biztosítsuk a szüksév< * .·*» <·^·:«':·λΧ*Ψ.|<·;<<

/ Í«\ K»%

67.Ö54/M

P9903103 20Ö§. xnárems ges növekedési faktort. 18 ml felolvasztott agart (50 C) keverünk össze a tesztvegyület elkészített hígításainak mindegyikéből 2 ml-rel (a tíz hígításból egy) 90 ss&-es Petri-csészékben. Mindegyik hígításból a lemezek négy példányát készítjük el. Mindegyik MIC esszéhez 18 ml agart és 2 ml steril desztillált vizet tartalmazó lemezt is készítünk négy példányban, hogy azokat a növekedésjelzőként alkalmazzuk.

A megszárított MIC-lemezeket 0,2 pl elkészített tesztorganizmussal oltj-uk be, a ?. meltoeidás lemezeket levegőn inkubáljuk 37*C~on 18 érán át, és a B. pieuropnenmoniae-veX és H. parasoíssal inoknlált lemezeket 3?°C~-on .18 órán át 10%-os COs~ ben inkubáljuk. 'Áz organizmusok növekedését az inokulálás- után kezdetben szabadszemmel, majd egy sztereo zoomos mikroszkópon végzett mikroszkópos vizsgálattal vizsgáljuk. A MIC érték az a legkisebb tesztvegyület koncentráció, melynél nem. mutatható ki növekedés az inokulálás helyén a mikroszkópos vizsgálattal a négy lemez egyikén som.

A kapott eredmények a 10. táblázatban tüntettük feli »»<*♦♦»< ,*«, ♦-•'Z ·. -.<

* /\ » ? .-» * *·

67.054; PA P9OO3IO3 2ÖÖ8. március

IXC-ek (pg/ml)

tartomány eh - hidroklorid hfu « hidregénfumarát

A táblázatból kitűnik, hogy a valnemulin összehasonlítva a tlamuiinnai, átlagosan két és félszeres aktivitásnövekedést mutat a. P. maitooídávai szemben, Öt és félszeres növekedést a pleuropnoumooiaeval szemben és háromszoros növekedést a H. pa rss ni s-s zal s zenben,

A találmány szerinti szert tartalmazó készítmény tehát felhasználható a Fasfceurella maltooida, áotinobaeillus fhuampphilus} pleuropreumoniae és/vagy hl3£emíph.iiu6' parasuia fertőzéssel járó sertés másodlagos pneumónia kezelésében< Az ilyen alkalmazáshoz a hatásos -dózis természetesen változó, az alkalmazott adott sóS7.054/PA PWSW3 /008. «ütőm azonyiag kisebb dózisokat rali peadnx Mindemellett általánosságban kielégítő szert körülbelül 5 mg/kg és körülbelül napi dózisban adjuk be, tetszőlegesen ♦»χ» χ«44 4 4 *4*4 « ·Χ « 4

4*4 *4 4

4 4: X 4 4 ♦ **♦ 4 44

5Í tői, a beadás módjától, az állat méretétől és korától és a kívánt hatástól függően; például a profi taktikus kezeléshez vihosszabb időn keresztül.

eredményeket kapunk, ha a 15 mg/kg állati testtömeg vízben vagy takarmányban, megfelelően szétosztva 2-4-szer naponta, vagy egy lassú felszabadulású formában, A legtöbb állatnál a teljes napi dózis körül* belül 100 mg ás körülbelül 1000 mg közötti, előnyösen körülbelül 100 mg és körülbelül 500 mg közötti, naponta egyszer vagy kétszer beadva.

Előnyös lehet, ha egyedüli kezelést alkalmazunk,

Előnyös dózisok az ivóvízben 0,01-0,05 tÖmag/térfogat%, különösen a 0,01-0,025 %, és takarmányban a 100-400 ppm (g/tonna), különösen 100-200 ppm,

G) ffaafanrella baemolytioa fertőzéa sei járó gmewónle báxaA Pasteureila heemolyfína fertőzést hagyományos módszerrel lehet kimutatni, mint például ; az állatgyógyászati kézi könyvekben leírták, például a Veterinary Mfödi diné,· 8. kiadás,

Radostíts, ö. M., Blood, D< C. és

C. C. (szerk.

bubi,

Ballliere Tindail, London, U. K., 748-770 (1994). Ennél az alkalmazásnál a találmány szerinti szer előnyös hatását in vivő határozzuk meg, például a követkézéképpen;

»_<φφί»><

* ♦«* ♦ * X *♦* «»»»♦» ^x * > » «* * ♦ * « » * #»

Ó7.Ö54/PA Ρ9» 2008. március

Két valnemulin-hidroklorid készítmény klinikai hatékonyságát határozzuk meg Pasteuréiig haemolytlca Al-gyel végzett kontrollált fertőzés okozta pneumónia kezelésénél borjakban;

A -6, napon 24 borjút, akiktől orrnyálka kenetet vettünk, és úgy találtuk, hogy P. Aasmolyfcica Al mentesek, megmérjük, és négy hat tagból álló kezelési csoportba osztjuk testtömeg szerint kiegyenlítve úgy, hogy a csoportok közötti ivar szerinti megoszlás is egyenletes legyen. A borjakat különálló- rekeszekben tartjuk egy hagyományos borjúnevelési egységben, ahol .33 napon át aklimátizái.ódnak a szétosztás előtt. A vizsgálat előtti Időszakban kétszer vérmintát veszünk a leukotoxín antitest elemzéshez, mely a P. Aaeool.it Ica Al első fertőzésének lehetséges indikátora.

A kezelés a :-l. napon kezdődik, hozzávetőleg 2? órával a fertőzés előtt.

1. csoport ~ kontroll;

2. csoport - 2,5% injektálható valnemulin-hidroklorid (2,5 mg/kg naponta kétszer);

3. csoport ~ 10% valnemulin hidroklorid premix orálisan, borj ú tápszerben beadva (5,0 mg/kg naponta kétsser);

Az összes borjút fertőzzük a ö. napon úgy., hogy 30 ml -Pasteuréi la haemolyticá Al táplevest (M4/1/3, Morédon Research Instítufce ~ 1,25 xlO' cfu/ml) helyezünk el endobronchiálisan egy száloptikás bronchoszkóp segítségével.. Klinikai vizsgálatokat hajtunk végre naponta egyszer a -3. és -2. napon, és naponta kétszer a -1. naptól a 3. napig. Klinikai értékeket osztunk ki a ' 67,§54/FA

2008. március $5 *·»*« >í ♦ X « ** ♦ * < ♦ » ♦ * ♦♦ « ♦ < Jí ♦ « X ♦ *>» * X* a négy paraméter mindegyikénél: végbélhömérséklet, légzési gyakoriság, a légzés és a viselkedés milyensége« Az injekció helyeit is megvizsgáljuk. Az olyan borjakon# akik fekszenek és/vagy depressziósak és/vagy nehéz a légzésük, vagy amelyeknek az östszesitett klinikai értéke 5-nél nagyobb a 8. és 3, nap között egyetlen vizsgálatnál is, humánus okokból azonnal eutanáziát hajtunk végre a 20¾ (tömeg/tórfogat) Panto'barhítona Sodium SPiVetl- letális dózisát intravénásán beadva, és ezek 24 érán belül elpusztulnak. Azokon a borjakon, akik megérik a 4. napot a P. haemolitíca fertőzés után# a 4« napon hajtjuk végre az eutanáziát ugyanazt az eljárást követve, amelyet a 0-3. napon elpusztított borjaknál alkalmazunk. Az összes borjúból kivesszük a tüdőket, és vizuálisan megállapítjuk az állandósult léziókat és a mellhártyagynlíadásos összenövéseket. Tüdőszöveti mintákat veszünk nyolc állandó helyről, és P. taemoiityca jelenlétére vizsgáljuk, hogy meghatározzuk az izolációs index értékét. Szív vér™ keneteket vessünk azokból a borjakból, amelyek akut módon, pusztultak el, és P. haamoíytica jelenlétére vizsgáljuk.

A borjakat külön-külön# a caoportösszegeket, a csoportétla™ got és a csoport középértékét az összes paraméternél kiszámoljuk; összesített klinikai érték, állandósult léziók értéke, izolációs index, mellhústyagyulladás értéke és összérték. A borja™ kát küiön-külön, a caoportösszegeket, a csoportátiagct és a csoport középértékét kiszámoljuk az összes kategóriánál egy összesített klinikai értéket készítve; végbélhömérséklet, légzésgyakoriság, a légzés és a viselkedés milyensége. A Kruskal-Wallis k^-SSx-X-áx^.-X ·$$ * . Λ _x .

67.ÖS4'?A P39Ö31Ö3 2ÖÖS. nérw ♦ *« *« ♦ * « > * * ♦ teszttel alapanalízist alkalmazunk (dinitab 3) , hogy meghatározzuk, van-e különbség valamely csoportértékek között mindegyik paraméternél: összesített klinikai érték, állandósult lésiók értéke, izolációs index, mellhártyagyuiladás értéke és az összérték, A Kruskal-Wallis teszt szignifikanoiája azt jelzi, hogy a csoportok nem mind egyformák, és nem mind különbözőek. Annak megvizsgálására, hogy mely csoportok a különbözőek, a csoportokat páronként teszteltük a Mann-Whítney tesztet (Míniteb 3) alkalmazva,

A kezeletlen borjakkal (1. csoport) összehasonlítva, ügy találtuk, hogy az összesített klinikai értékek (p^:“0,0113) szignifikánsan kisebbek azokban a borjakban, amelyeket 10% valnemulinos premíxszel kezeltünk 5,ü mg/kg/dózis mennyiségben naponta kétszer orálisan beadva, tápszerben öt napon át, kezdve 27 órával a

?. Aaemolytiea A1 fertőzés előtt.

Az összesített klinikai érték szintén lecsökkent, de statisztikusan nem szignifikánsan, azokban a borjakban, amelyeket intramuszkulárisan 2,5 % injektálható valnemaiinnal kezeltünk 2,5 mg/kg/dózis mennyiségben, naponta kétszer, öt napon át, 27 órával a P. haemölytíca A1 fertőzés kiváltás előtt kezdve.

Amikor az összesített klinikai értékeket hasonlítottuk Öszsze, nem volt szignifikáns különbség a kezelést kapott csoportok között.

A találmány szerinti szer tehát felhasználható a FasfearelXs haemolytica fertőzéssel járó pneuménía kezelésére alkalmas állatgyógyászati készítmények előállítására bárányok, birkák és ♦♦χχ X*»4 tf-κ «»Ψχ # 4 4 4 4

444 4 4 *

X 4 * * 4 4 χ 4 44 4 44·

S7.054/PÁ

W983W3 . fwcsas szarvasmarha esetében. Az ilyen alkalmazáshoz a hatásos dózis természetesen változó, az alkalmazott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától és a kívánt hatástól függően; például a protilaktíkus kezeléshez viszonylag kisebb dózisokat kell beadni hosszabb időn keresztül. Mindemellett általánosságban kielégítő eredményeket kapunk, ha a készítmény a szert körülbelül 5 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg állat testtömeg koncentrációban (napi dózis) tartalmazza, megfelelő tetszőleges takarmányban, adott esetben szétosztva, 2-4-szer naponta, vagy egy lassú felszabadulásé formában. A legtöbb állatnál a teljes napi vainemuiin dózis körülbelül 250 mg és körülbelül 3000 mg közötti, előnyösen körülbelül 250 mg és körülbelül 1000 mg közötti, naponta egyszer vagy kétszer tetszőleges takarmányban beadva.

S> byoaynovia® fertőzéssel járó poliarfchritíaz ***^ιή*Β»<ΒΒ<<ΜΛ>ΒΒΜΜ«ΜΜΜ«ΜΒηηι^<ηιΐιΐί>οοοΰΰΰθΰι>·«ν»·«···ΐΜΜΜ»>>*»ΒΜ>ΑΑ*Μ·ΜΜ4ΜΐΜΐ*Α,********ΜΒΒ'ιΐήί^ ]ifaarnsni?!:!::' ' i.'l 11ΓΠ .'-j.rrrrr.Trrrf··; nÍCtoeOGC:ri>wwwww4hfifihf sertésekben

A Mycppiaama hyosynoviao fertőzés hagyományos módon mutatható ki, például úgy, ahogy azt az állatgyógyászati kézikönyvek leírják, például Taylor, D. 0, (Plg Dísaases, 6, kiadás, Pubi. D. J. Taylor,Glasgow, U.K., 172-173 (1995)]. A találmány szerinti szer előnyös hatását ebben az alkalmazásban például á következőképpen határozzuk meg:

X. In v-itxo aktivitás szövetizolátnmokban (MIC esoéj ;

A szövetmintákat sertések különböző enzootiás pneumőniával (ÉPP) fertőzött kondáíból származó disznók tüdejéből kapjuk. A mintákat szárazjégben szállítjuk a tenyésztéshez. A kezdetben a áfycopiasma hyopnenmcuiué kinyeréséhez izolált tüdőmintákhól négy >ύ>··χνχ.>χ.;:χν<χ<νΛ^ éW4/PA PWUÖ3 2θ0&. HíárcHis »♦·** **** * «*♦ * * .♦ **^β·

&yr?opXasma hyosynovlae törzset izoláltunk, miután az Al. üyopnenmniae tenyésztés alatt a vizsgált (újra -?O⁰C-on tárolva} tüdömintáknál észleltük, hogy néhány minta a Mytm>piasn?a byosynoviaere jellemző mcrfolőgiájú telepeket eredményezett< Három további izolátumot nyertünk ki a többi rendelkezésre álló tedémintáböi. Az összes izolátumot szerclógiailag azonosítottuk a MycopXssma hyoaynoviae ellen termelt specifikus nyúl antiszéruwsal végzett lemeznövekedés gátlással. Egy kereskedelemben beezeréshetd szilárd tápközeget (Mycoplaama Experíenee Ltd.) alkalmazunk az svnoviae izolálására a tüdő.szövetekböi. A MIC vizsgálatokhoz egy fenolvöröst és glükózt tartalmazó folyékony tápközeget (Myccpiasma Sxperlence Ltd.) használunk,

A tesztvegyüiet 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldatait készítjük el ionmentesitett vízben, 0,2 pm-es porusméretü memforánszdrókön (Sartcrius Minisért, N) átszűrve sterilizáljuk, és -20*Con tároljuk, .Ahhoz, hogy a MIC tesztekben alkalmazzuk, a törzsoldatokat tápközeggel hígítjuk, hogy megkettőzzük a szükséges végkoncentrációt, A MIC teszteket Tanner & Wu módszere szerint hajtjuk végre (Avian Diseases 36, 714-717 (1992Π - Aktivan növekedő fertözéskiváitö tenyészeteket készítünk a -7ü*C“on tárolt tenyészetek vagy az agaron -70°C-on tárolt tenyészetek 1 ml-es alikvotjaifoél, A fertőzéskiváltó tenyészeteket addig hígítjuk, hogy ÍÖ'^J-1Ö^S szín fertözéskiváitö egység/ml végtitert érjünk el. A .fertözéskiváitö inokulátumok 0,1 mi-es alikvotjait az antibiotikumos hígítások 0,Imi-es alikvotjaival keverjük össze a mikrotitráiö lemezek üregeiben. Mindegyik mikretltrálc lemez inokulá•WsSsX'ÍS^k^^SkS’WS'-'SSSSXSSxX'SskSSx'iS.^X-SSxX^XwxSSN-X-^SxXvX-'X^ *$*£ \s<sss\<<;<Í^XX<<^<<X<<<.;.;., < > I » *

67.WkÁ F9903Í03

2éÖ8< március

Xatlan 7,6-os pH~jű tápkbzeget {végpont kontroli) és antibiotikummentes inokulált fertőzéskiváltó kontrollókat tartalmát.

Mindegyik lemezt egy adházlv filmmel lezárjuk, és aerob módon 36^&C~on inkubáljuk. A MIOeket akkor jegyezzük fel, mikor a fértőzéskiváltó kontroll üregekben a színváltozás eléri a végpontkon troli pH~)át. A MIC az a legalacsonyabb koncentráció, melynél.

nincs színváltozás.

Az eredményeket a 11. táblázatban mutatjuk be a valnemurinhldrokloridra és két 'referencia vegyületre, a tiámúlin-hidrogénfumarátra és az enrofloxacinra.

11. táblázat

Mycoplasma hyosynoviae 7 mezei izolátumának in vifcro érzékenysége

1 Vegyület	ΜIC tartomány (μg/mi)
1 Va 1 nemű i in~hídroklori d	0,001-0,0005
	........
j Tiamu1in-hidrogénfumarát	0,0025-0,025
| Enrofloxacin	0,025-0,25

A .Mycoplasma áyosynoviae hét mezei izolátumának valnemulin érzékenysége sokkal nagyobb, mint a két másik vegyülettol szembeni érzékenység, mely azt jelzi, hogy ezek a mezei izolátumok rendkívül érzékenyek a valnemulinra.

A találmány szerinti szer tehát felhasználható a Mycoplasma hyouyüovlae fertőzéssel járó sertés poiiartritisz kezelésére al«x ♦ * * * * * * * 48* * ***{ ** * $ *

67,Ö54/PA 58 mO3JO.3

2608, wre&ís kalmas állatgyógyászati készítmények előállítására. Az ilyen alkalmazáshoz a hatóanyag dózis természetesen változó, az alkalma* zott sótól, a beadás módjától, az állat méretétől és korától és * a kívánt hatástól függően? például a profilaktikus alkalmazás esetében viszonylag kisebb dózisokat kell beadni hosszabb időn keresztül. Mindemellett általánosságban kielégítő eredményeket kapunk, ha a készítmény a szert körülbelül 5. mg/kg és körülbelül mg/kg állati testtömeg (napi dózis) koncentrációban tartalmazza vízben vagy megfelelő tetszés szerinti takarmányban, szétosztva 2-4 részben naponta, vagy egy lassú felszabadulású formában. A legtöbb, állatnál, a teljes napi válnemulin dózis körülbelül 100 mg és körülbelül 1000 mg közötti, előnyösen körülbelül 100 mg és körülbelül 500 mg közötti, a készítményt naponta egyszer vagy kétszer beadva.·

Előnyös lehet, ha egyedüli kezelést alkalmazónk.

Előnyös dózisok az ivóvízben 0,01-0,05 tömeg/térfogat%, különösen a 0,01-0,025 %, és takarmányban a 100-400 ppm (g/tonna), különösen 100-200 ppm (g/tonna),

A találmány szerinti alkalmazáshoz a vegyületet egy állatgyógyászát ilag elfogadható- só formájában, például kvaterner só vagy különösen savaddíciós só formájában alkalmazhatjuk, (&.z ilyen söformák ugyanolyan nagyságrendű aktivitást mutatnak, mint a szabad bázis forma,) Megfelelő savaddíciós sok például a feidrogénfumarát, a fúrna rá t, a naftal.ín-1,5-s.zulfonát· és különösen a hidroklorid.

67áS4á?A 99903(03 2008. március « * ♦# * ♦ ♦ '* # * « * *$ * * β $ *♦* *

A találmány szerinti, készítmény beadható orálisan, lokálisan, parenterálisan, és hagyományos kemoterápiásán elfogadható oldószerekkel és hordozókkal összekeverve, és adott esetben más segédanyagokkal, és beadható tabletták, kapszulák vagy injektálható készítmények formájában. Takarmánykeverékeknél (mint premíx) és ivóvíznél kiváló adalékanyagot képez.

Az előnyben részesített állatgyógyászatilag elfogadható hordozók közé tartoznak például a szokásosan alkalmazott gyógyászati kötőanyagok, mint a onkor, kukoricakeményítő, laktóz, cellulóz valamint a gabonaszemes hordozórendszerek és a gabonaszem melléktermékek, mint az őrölt rízshéj, búzadara és szójaííszt; továbbá szilárd töltőanyagok, mint őrölt mészkő, nátrium-szulfát, kálcium-karbonát és kaolin, vagy folyékony anyagok, mint iául állatgyógyászatilag elfogadható olajok (növényi, olajok vagy ásványi olajok), propilénglíkol és políetílénglikol. Ezeket az alkalmas készítményeket az állatnak szájon át adjuk be, előnyösen a takarmányba keverve gyégyszerezett takarmányliszt vagy gyógyszertartalmú pirula formájában.

Az ivóvízben történő alkalmazáshoz a készítményt jellemzően vizes oldatként készítjük el, mely oldószereket, mint például ebano.lt vagy propíiénglíkolt tartalmazhat, vagy egy állatgyógyászat ilag elfogadható olajban készíthetjük el. Alkalmas olajok például a szezámolaj, a közepes szénlánoú trigliceridek (például Miglyol), az izopropil-mírisztát és az etiloleát. A készítmény tartósítószereket, puffereket és más szokásos kötőanyagokat is tart a1ma zhat » á « < * * *♦« «« * » _k * * * * * * *** * **

6W4/FA mö?hö

2008. március

A találmány szerinti alkalmazás keretében az állatgyógyászati készítményeket az alkotórészek kívánt arányban történő összekeverésével állíthatjuk elő, A készítményt ezután beadásra készen megfelelő tárolóedénybe csomagoljuk.

A következő példával szemléltetjük a találmány szerinti előállítási eljárást:

A találmány szerinti ezer jól tolerálható. A hidrokloríd só formában lévő (1) képletű veqyület akut toxicitását patkányban meghatároztuk oly módon, hogy dőziscsoportónként 5 hím és 5 nőstény patkánynak egyszeri 100 mg/kg vagy 2000 mg/kg dózist adtunk be szájon át. Az elhullás 1-8 napon belül, következett be. A kapott LD50 érték > 1ÖÖÖ mg/kg p.o.

Claims (2)

1. Szabadalmi Igénypontok

   1.. Az (!) általános képletű vegyidet szabad bázis formájának vagy állatgyőgyászatiiag elfogadható sójának alkalmazása olyan állatbetegség kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására, amely betegség megjelenését az állatállomány sűrűsödése elősegíti, azzal jellemezve, hogy az említett állatbetegség a Serpulina pílosicoii fertőzéssel járó sertés vastagbélgyolladás.
2. 2, Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az. (1) általános képlete vegyidet bídroklorid savadOiclős só formájában van jelen.