CZ298446B6

CZ298446B6 - Lécivo pro lécbu ileitidy vepru obsahující derivát pleuromutilinu a zpusob jeho prípravy

Info

Publication number: CZ298446B6
Application number: CZ20070004A
Authority: CZ
Inventors: George Sidney Burch@David; Howard Ripley@Paul; Zeisl@Erich
Original assignee: Biochemie Gesellschaft M.B.H.
Priority date: 1996-07-04
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 2007-10-03
Also published as: EP1810672A1; AU718701B2; SK2799A3; IL127299A; EP1808171A1; NO986198L; ATE503475T1; DK0910363T3; JP2000514072A; PL330726A1; DE69740162D1; UA56173C2; NO326117B1; CZ298385B6; AU3692997A; ATE509625T1; PT910363E; EP1813272A1; IL127299A0; OA10951A

Abstract

Použití slouceniny vzorce I ve forme volné báze nebo veterinárne prijatelné soli výhodne ve forme hydrochloridové adicní soli s kyselinou, k prípraveléciva pro lécbu ileitidy vepru spojené s infekcíLawsonia intracellularis a zpusob prípravy takového léciva smícháním terapeuticky úcinného množstvíslouceniny vzorce I ve forme volné báze nebo veterinárne prijatelné soli dohromady s alespon jednímveterinárne prijatelným nosicem nebo redidlem.

Description

Léčivo pro léčbu ileitidy vepřů obsahující derivát pleuromutilinu a způsob jeho přípravy

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů pleuromutilinu. Předmětem vynálezu je veterinární použití sloučeniny vzorce I

^NHz

Η ^Xch₃ (I) , tj. 14-0-[l-[(R)-2-amino-3-methylbutyrylomino]-2-methylpropan-2-ylthioacetyl]mutilinu, ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli k přípravě léčiva pro léčbu ileitidy vepřů spojené s infekcí Lawsonia intracelullaris, cm se dále stručně označuje jako „použití vynálezu“.

Dosavadní stav techniky

Sloučenina obecného vzorce I ve formě volné báze nebo ve formě veterinárně přijatelné soli (Econor^(R)) se níže stručně nazývá „činidlo podle vynálezu“. S výhodou se vyskytuje ve formě soli, zejména hydrochloridu. V této formě je tato látka známá pod názvem hydrochlorid valnemulinu.

Termín „léčba“ znamená použití pro profylaxi a také pro léčbu.

Sloučenina obecného vzorce I ve formě volné báze nebo ve formě chemoterapeuticky nebo veterinárně přijatelné soli, je známá například zEP 153 277 a jejích ekvivalentů, například US 4 675 330, zejména v příkladu 12 zde uvedeném.

Odtud je dále známa:

• inhibiční aktivita proti různým bakteriím in vitro, při koncentraci asi 0,08 až 25 pg/ml;

• inhibiční aktivita in vitro proti mykoplasmám s chlamydii obecně, při koncentraci asi 0,008 až 0,5 pg/ml;

• inhibiční aktivita in vivo u myší, s využitím různých kmenů bakterií, a u slepic, s využitím kmenů mykoplasmy, v dávkách asi 12 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti;

• antiparazitální aktivita, zejména in vivo proti kokcidii u slepic, v dávkách 20 až 150 mg/kg krmivá; a • aktivita podporující růst u slepic a vepřů in vivo, při dávkách 10 až 50 mg/kg krmivá, z čehož vyplývá, že sloučenina je vhodná jako antibakteriálně účinné antibiotikum obecně a, jako veterinární činidlo, zejména pro chemoterapeutickou léčbu konkcidiózy u slepic, stejně jako činidlo podporující růst u slepic a vepřů.

-1 CZ 298446 B6

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že činidlo podle předkládaného vynálezu je zvláště účinné při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese se zvyšuje při rostoucí hustotě chovu, jako je ileitida vepřů (proliferativní enteropathie vepřů; intestinální adenomatóza vepřů) spojená s infekcí Lawsonia intracelluraris.

Dále se ještě překvapivě zjistilo, že indukce odolnosti k léčivu je extrémně nízká.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se tedy týká veterinárního použití definovaného výše.

Dále se předpokládaný vynález týká způsobu přípravy léčiva, jak je definováno výše, který zahrnuje smísení činidla podle předkládaného vynálezu s nejméně jedním veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Léčivo připravené podle vynálezu lze použít při způsobu léčby výše uvedené ileitidy vepřů, jejíž exprese se zvyšuje při rostoucí hustotě chovu, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství činidla podle vynálezu živočichům v případě, že takovou léčbu potřebují.

Zvířata trpící veterinárními onemocněními, jejichž exprese se zvyšuje při rostoucí hustotě chovu, mohou například být léčena antibakteriálně činidlem podle vynálezu a již nemusí dostávat činidlo podle vynálezu pro podporu růstu.

Ileitida u vepřů související s infekcí Lawsonia intracellularis:

Infekce Lawsonia intracelllularis může být diagnostikována běžným způsobem, například jak je popsáno ve veterinární příručce jako je popsáno ve veterinární příručce Taylor, D.J., v Pig Deseases, šesté vyd. (1995), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB na stranách 148-149. Výhodnost aktivity činidla podle předkládaného vynálezu při tomto použití se určí například následujícím způsobem:

1. Aktivita in vitro

Obecně se postupovalo podle způsobu popsaného v Lawson G.H. K. a kol., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142, ale provedly se některé úpravy (standardní Kirby-Bauerovy diskové metody nejsou použitelné pro intracelulámí bakterie):

Buňky: Příprava se monovrstvy buněčných kultur enterocytů krys IEC-18 (ATCC CRL 1589) a udržovaly se pomocí standardních metod kultivace buněk. Jeden den staré monovrstvy dělených buněk (asi 30% splývání) se pro infekci ve dni 0 na krycí sklíčko v malých kultivačních viálkách (Tracs).

Inokula: jako inokula se použijí šarže tří kmenů Lawsonia intracellularis. Tyto se získají z vepřů postižených proliferativní enteropathií, z forem proliferativní hemoragické enteropathie (PHE) a intestinální adenomatosy (PIA připravených z vnitřností vepřů a nechají se projít buněčnými kulturami, jak je popsáno výše v Lawsonově odkazu. Dva kmeny PHE se částečně testovaly na pathogenitu u vepřů, jak je popsáno v McOrist, S. a kol., Infect, Immun. 61 (1993) 4286-4292. Šarže inokula se po několika buněčných cyklech sklidí a skladují se zmrazená při -70 °C v 1 ml viálkách. Předběžným testem se ustanoví vhodná zředění ve viálkách po roztátí, která mohou vést ke snadno rozlišitelným buněčným infekcím při 5denní zkoušce.

Antibiotika se pro každé použití připraví jako lOOx zásobní roztoky. Aktivita každé šarže antibiotika se potvrdí pomocí standardní Kirby-Bauerovy diskové metody s laboratorním kmenem Escherichia coli.

Infekce: Ve dni 0 se viálka každého kmenu nechá roztát, zředí se kultivačním médiem 1/8 až 1/32 a použije se ve skupinách 1 až 4.

-2CZ 298446 B6

Pro skupinu 4 (kontinuální působení) se toto inokulum nejprve před přidáním buněk inkubuje 1 hodinu při 37 °C v kultivačním médiu obsahujícím antibiotika při různých koncentracích.

Pro skupinu 3 (extracelulámí působení) se toto inokulum připraví v kultivačním médiu obsahujícím antibiotika při různých koncentracích, přidaná bezprostředně před přidáním buněk.

Pro skupinu 1 (kontrolní) a 2 (intracelulární působení) se inokula připraví v kultivačním médiu prostém antibiotik a přidají se k buňkám. Kultivační viálka (Tracs) s buňkami s přidaným inokulem (+/- antibiotika) v celkem 0,5 ml média se umístí do ocelové nádoby, evakuují se na 40 % atmosférického tlaku (8% kyslíku), nechají se 2 minuty, naplní se vodíkem a nakonec 10% oxidu uhličitého. Kultivační viálky se potom vyjmou z těchto nádob a umístí se do inkubátoru, který má nastavenou vlhkou atmosféru obsahující 8 % kyslíku, 8,8 % oxidu uhličitého a zbytku dusíku, při 37 °C.

Ve dnech 1 a 2 se všechny viálky vyjmou a znovu se naplní čerstvým médiem, které obsahují buď antibiotika, skupiny 2 a 4, nebo neobsahují antibiotika, skupiny a 3, a umístí se do inkubátoru. Ve dni 5 se všechny krycí sklíčka vyjmou a potřísní se Lawsonia intracelularis pomocí nepřímých imunoperoxidázových skvrn obsahujících specifickou monoklonální protilátku. Jako hlavní měřítko infekce se použije počet buněk na každém krycím sklíčku, které jsou těžce infikované Lawsonia intracelularis (>30 na buňku, těžce infikovaná buňka=HIC). Také se zaznamenává počet foci z HIC a obecná pozorování buněk. HIC v kontrolní skupině (skupina 1), test intracelulámě aktivních antibiotik (skupin a2), test extracelulámě aktivních antibiotik (skupina 3) a test kontinuálního působení (skupina 4) se porovnávají v trojnásobných testech, vždy až pro tři kmeny. Některé testy se opakují pro různé síly inokula. Procentuální poměry se vypočtou po odvození střední hodnoty HIC kontrolního testu odpovídajícího příslušné testované skupině. Střední hodnota HIC kontrolního testu je celkový počet HIC v kontrolních kultivačních viálkách dělený počtem infikovaných kontrolních kultivačních viálek. Procentuální poměr testovaných kultivačních viálek se potom vypočte dělením jejich hodnot HIC střední hodnotou kontrolní HIC, násobeno 100 za získání procentuální hodnoty. To znamená, že testované kultivační viálky, kde nepůsobila antibiotika, mohou mít procentuální poměr okolo 100, a kde antibiotika způsobila úplnou inhibici růstu, může být poměr 0.

Získané výsledky s hydrochloridem valnemulinu tak, jak byly zaznamenány, jsou uvedeny v tabulce 1, která uvádí procentuální obsah buněk, které po zpracování zůstávají neinfikované:

Tabulka 1

Procentuální poměry infekce Lawsonia intracelularis buněčných kultur za přidání velnemulinu

Valnemulin (ch) koncentrace (pg/ml)	2	Kmen skupiny 3	4	2	Kmen skupiny 3	4
8	0	0	0	0,86	0,2	0,5
	0	0	0	0	0	1,4
	0	0	0	0	1,4	0,2
4				0	0	0,8
				0	0, 83	2,5
				1,7	1,7	2, 5
2	0	0	0
	0	0	0
	0	-	28
ch = hydrochlorid

-3CZ 298446 B6

Tyto výsledky ukazují, že minimální koncentrace hydrochlorid valnemulinu způsobují výraznou inhibici růstu Lawsonia intracelularis (<1% růst) je 2 pg/ml.

2. Test vyvolání odezvy:

Třicetpět odstavených vepřů se nakazilo ve stejný den virulentním inokulem Lawsonia intracelularis (kmen LR 189/5/83), izolát kauzativního činidla proliferativní interopatie vepřů se získá kultivací v buněčném kmeni enterocytů krys IEC-18 (ATCC CRL 1589), jak je popsáno v Lawson a kol., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142. Sedm kontrolních vepřů se dávkuje roztokem pufru. Sedm z 21 nakažených vepřů se nechá neléčených. U těchto sedmi vepřů se snížila hmotnost a u všech se vyvinuly léze proliferativní enteropathie, které byly nalezeny v částech zažívacího traktu odebraného při nekropsii tři týdny po testu. Šest z těchto sedmi vepřů mělo silně viditelné léze, tři měly mírný průjem dva týdny po testu. Pro testování „preventivní“ dávkovači strategie byly dvě další skupiny nakažených vepřů dávkovány orálně hydrochloridem valnemulinu v dávkách 25 ppm a 75 ppm, v tomto pořadí (tj. 1,25 a 3,7 mg/kg) pomocí směsi podávané 2 dny před nakažením, které pokračovalo až do euthanazie. Pro testování „léčebné“ strategie byly dvě další skupiny nakažených vepřů dávkovány orálně valnemulinem při 25 a 75 ppm pomocí ve směsi podávané sedm dní po nakažení, až do euthanazie.

Při nekropsii nebyly viditelné v částech střeva žádné léze proliferativní enteropathie u 3 ze 7 vepřů v preventivní skupině a u 5 ze 7 vepřů v léčebné skupině. Kontrolní vepři zůstali normální. Proto valnemulin působí preventivně nebo léčebně při onemocněních velké části nakažených vepřů dokonce i při nízkých účinných dávkách léčiva.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě ileitidy vepřů spojené s infekcí Lawsonia itracelularis. Pro toto použití se bude samozřejmě účinné množství měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v denní dávce 1,5 až 6,5 mg/kg hmotnosti zvířete, vhodně podávané v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně nebo libovolně v krmivu nebo vodě nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 10 až 1000 mg, s výhodou 15 až 500 mg, při podávání jednou nebo dvakrát denně.

Výhodné dávky v pitné vodě se pohybují mezi 0,001 až 0,05 % hmotnost/objem, zvláště 0,001 až 0,005 % a v krmivu 20 až 400 g/metrickou tunu, s výhodou 20 až 200 g/metrickou tunu.

Pro použití podle vynálezu může být sloučenina použita ve formě volné báze nebo ve formě veterinárně přijatelné soli, například kvartemí soli, nebo, zejména, ve formě adiční soli s kyselinou. Tyto solné formy mají stejný druh účinku jako sloučenina ve formě volné báze. Příklady vhodných adičních solí skyselinou jsou hydrogenfumarát, fumarát, naftalen-l,5-sulfonát a zejména hydrochlorid.

Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být podávána orálně, místně nebo parenterálně a ve směsi s běžně chemoterapeuticky přijatelnými ředidly a nosiči a, popřípadě, jinými přísadami a mohou být podávána ve formě tablet, tobolek nebo prostředků pro injekční podávání. Také tvoří vynikající přísady pro krmné směsi (předem připravené) neboje možné je přidávat do pitné vody.

Mezi výhodné veterinárně přijatelné nosiče patří například běžně používané farmaceutické přísady jako je cukr, kukuřičný škrob, laktóza, celulóza, stejně jako nosné systémy ze zrní a vedlejších produktů ze zrní jako rýžové slupky, pšeničné zbytky a sojová moučka; dále pevná ředidla, jako je vápenec, síran sodný, uhličitan vápenatý a kaolin, nebo kapalné látky, jako veterinárně přijatelné oleje (rostlinné oleje nebo minerální oleje), propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodně se

-4CZ 298446 B6 tyto prostředky podávají zvířatům orálně, s výhodou ve směsi s krmivém ve formě medikované moučky nebo medikované píce.

Pro podávání v pitné vodě se použijí roztoky ve vodě s nebo bez rozpouštědel, jako jsou ethanol, propylenglykol, polyethylenglykol, osvědčené povrchové aktivní látky a sorbitol.

Například pro mezisvalovou injekci se prostředek typicky připraví jako roztok ve vodě, který může obsahovat rozpouštědla, jako je ethanol nebo propylenglykol nebo ve veterinárně přijatelném oleji. Příklady přijatelných olejů jsou sesamový olej, triglyceridy se středním řetězcem (například Miglyol), isopropyl myristát a ethyloleát. Prostředky mohou obsahovat konzervační látky, pufry a jiné běžné přísady.

Veterinární prostředky pro použití podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny smísením složek v příslušných poměrech. Prostředky se potom balí do vhodných nádob vhodných pro podávání.

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález ilustruje následující příklad:

Složka	Množství (g/100 μΐ)
hydrochlorid valnemulinu	10,0
fenol	0,5
Miglyol 840	do 100 ml

Činidlo podle předkládaného vynálezu je dobře snášenlivé. Akutní toxicita sloučeniny obecného vzorce I ve formě hydrochloridu u krys byla určena při jednotlivé dávce 10000 a 2000 mg/kg při orálním podávání 5 samcům a 5 samicím krys ve skupině. K úmrtí došlo za 1 až 8 dní. Hodnota LD₅₀ je >1000 mg/kg p.o.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití sloučeniny vzorce I ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli k přípravě léčiva pro léčbu ileitidy vepřů spojené s infekcí Lawsonia intracellularis.
2. Použití podle nároku 1, při němž je sloučenina vzorce I ve formě hydrochloridové adiční soli s kyselinou.
5 3. Způsob přípravy léčiva z nároku 1, vyznačující se tím, že se smísí terapeuticky účinné množství sloučeniny vzorce I (I) , ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli dohromady s alespoň jedním veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Konec dokumentu