CZ438198A3 - Použití derivátu pleuromutilinu pro veterinární účely, veterinární činidlo, které jej obsahuje a způsob jeho přípravy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká derivátů pleuromutilinu. Předmětem vynálezu je veterinární použití sloučenin obecného vzorce I

t.j. 14-0-[1-[(R)-2-amino-3-methylbutyrylamino]-2-methylpropan2-ylthioacetyl]mutilinu ve formě volné báze nebo ve veterinárně přijatelné formě, při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese je zvýšena rostoucí hustotou chovu, což se níže stručně nazývá „využití vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Sloučenina obecného vzorce I ve formě volné báze nebo ve formě veterinárně přijatelné soli (Econor®) se níže stručně nazývá „činidlo podle vynálezu. S výhodou se vyskytuje ve formě soli, zejména hydrochloridu. V této formě je tato látka známá pod názvem hydrochlorid valnemulinu.

Termín „léčba znamená použití pro profylaxi a také pro léčbu.

Sloučenina obecného vzorce I ve formě volné báze nebo ve formě chemoterapeuticky nebo veterinárně přijatelné soli, je ·· ·* ·· • · · * · · známá například z EP 153 277 a jejích ekvivalentů, například

USP 4 675 330, zejména v příkladu 12 zde uvedeném.

Odtud je dále známa:

• inhibiční aktivita proti různým bakteriím in vitro, při koncentraci asi 0,008 až 25 pg/ml;

• inhibiční aktivita in vitro proti mykoplasmám a chlamydii obecně, při koncentraci asi 0,008 až 0,5 pg/ml;

• inhibiční aktivita in vivo u myší, s využitím různých kmenů bakterií, a u slepic, s využitím kmenů mykoplasmy, v dávkách asi 12 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti;

• antiparazitální aktivita, zejména in vivo proti kokcidii u slepic, v dávkách 20 až 150 mg/kg krmivá; a • aktivita podporující růst u slepic a vepřů in vivo, při dávkách 10 až 50 mg/kg krmivá, z čehož vyplývá, že sloučenina je vhodná jako antibakteriálně účinné antibiotikum obecně a, jako veterinární činidlo, zejména pro chemoterapeutickou léčbu kokcidiózy u slepic, stejně jako činidlo podporující růst u slepic a vepřů.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že činidla podle předkládaného vynálezu jsou zvláště účinná při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese se zvyšuje vzrůstem hustoty chovu, jako je enzootická pneumonie u vepřů způsobená infekcí Mycoplasma hyopneumoniae, střevní úplavice vepřů způsobená infekcí Serpulina (dříve Treponema) hyodysenteriae, kolitida vepřů (zánět tlustého střeva) související s infekcí Serpulina pilosicoli, ileitida vepřů (proliferativní enteropathie vepřů; intestinální adenomatosa vepřů) související s infekcí Lawsonía intracellularis, chronické dýchací onemocnění a arthritida u ··,<· ·· • · · • · · • * » > · · * ·· ··

« » « · ·*· ···· ·* *· drůbeže spojená s infekcí Mycoplasma gallisepticum, sekundární pneumonie u vepřů související s infekcí Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae a/nebo

Haemophilus parasuis, pneumonia u jehňat, ovcí a dobytka (lodní horečka, přepravní horečka, dýchací komplex telat, hovězí pneumonická pasteurellosa) spojená s infekcí Pasteurella haemolytica a polyarthritida u vepřů spojená s infekcí Mycoplasma hyosynoviae.

Dále se ještě překvapivěji zjistilo, že indukce odolnosti k léčivu je velice nízká.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se tedy týká veterinárního použiti definovaného výše.

Také se týká použití činidla podle vynálezu pro přípravu léčiva pro použití při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese se zvyšuje vzrůstem hustoty chovu.

Dále se vynález týká způsobu léčby veterinárních onemocnění, jejichž exprese se zvyšuje vzrůstem hustoty chovu, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství činidla podle vynálezu živočichům v případě, že takovou léčbu potřebují. Dále se týká veterinárního činidla pro použiti při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese se zvyšuje vzrůstem hustoty chovu, které obsahuje sloučeninu obecného vzorce I ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli, společně s nejméně jedním veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Dále se předkládaný vynález týká způsobu přípravy léčiva pro použití, jak je definováno výše, který zahrnuje smísení činidla podle předkládaného vynálezu s nejméně jedním veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.

• ·

Zvířata trpící veterinárními onemocněními, jejichž exprese se zvyšuje vzrůstem hustoty chovu, mohou například být léčena antibakteriálně činidlem podle vynálezu a již nemusí dostávat činidlo podle vynálezu pro podporu růstu.

A) Infekce Mycoplasma hyopneumoniae

Infekce Mycoplasma hyopneumoniae může být diagnostikována běžným způsobem, například jak je popsáno ve veterinární příručce Taylor, D. J. , Pig Diseases. šesté vydání (1995), vydal D. J. Taylor, Glasgow, U.K. na stranách 164-165. Prospěšnost působení činidla podle předkládaného vynálezu při tomto využití se určí například následujícím způsobem:

I. Aktivita in vitro

Test zahrnuje deset polních izolátů po vypuknutí enzootické pneumónie v různých stádech a kmen typu „J. Izoláty se filtračně klonují, identifikují pomocí diskového testu inhibice růstu a použije se sedm až 10 cyklů. Test na minimální inhibiční koncentraci (MIC) se provádí v kapalném médiu (Friis, N. F. a kol., Acta Vet. Scand. 32. (1991) 425-429) ve zkumavkách o 1,8 ml obsahujících dvojnásobnou koncentraci valnemulin a hydrogenfumarátu tiamulinu. Mykoplasmy se inokuluji v desetinásobných zředěních a růst kultury se vyhodnocuje visuálně za použití zkumavek opatřených 10² až 10⁴ jednotek tvořících barvivo. První vyhodnocení se provádělo po 2 až 4 dnech a poslední vyhodnocení se provádělo po 10 až 14 dnech, kdy se již přestala měnit barva. MIC se určila jako nejnižší koncentrace testované sloučeniny vykazující inhibici růstu ve srovnání s kontrolním pokusem (Friis, N. F. a Szancer,

J. , Acta Vet. Scand. 35 (1994) 389-394).

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1:

• · • · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · ·· · · ·······

Tabulka 1

Číslo kmene	Valnemulin (ch)	Tiamulin (hfu)
první	poslední	první	poslední
1	0,0010	0,0025	0,025	0,050
1	0,0010	0,0025	0,025	0,100
2	0,0010	0,0025	0,050	0,100
5*	0,0025	0,0025	0,050	0,100
1	0,0025	0,0025	0,100	0,100
* obsahuje	typový kmen	ch=hydrochlorid	hfu=hydrogenfumarát

Všechny testované kmeny M. hyopneumoniae jsou vysoce citlivé na působeni valnemulinu s MIC hodnotami 10 až 40krát nižšími než jsou hodnoty pro tiamulin, jak při prvním, tak při posledním vyhodnocení, z čehož plyne, že jsou sloučeniny zvláště zajímavé pro použití při léčbě klinických případů nakažených stád.

2. Aktivita in vivo

Vzorky tkání se získaly z plic vepřů různých skupin postižených enzootickou pneumonií vepřů (EPP). Vzorky se před kultivací umísti na suchý led. M. hyopneumoniae se získá z čerstvě vyjmutých plicních tkání přímým převedením na agar „Mycoplasma Experience. Postup umožňuje rozlišit a snadno oddělit odlišné kolonie M. hyopneumoniae, pomocí klonování z jiných, rychleji rostoucích druhů mykoplasmy, jako je Mycoplasma hyorhinis, obvykle přítomných v EPP plicních vzorcích. Izoláty se subkultivují a identifikují pomocí diskové inhibice růstu za použití specifického králičího antiséra opatřeného M. hyopneumoniae NCTC 10110.

Kultury pro vyvolání antibiotické odezvy se připraví v bujónu Mycoplasma Experience, inkubují se aerobně při 36 °C.

Pro izolaci M. hyopneumoniae z plicní tkáně se použije komerčně dostupné pevné médium (Mycolasma Experience Ltd.). Kapalné • · médium (Mycolasma Experience Ltd.) obsahující fenolovou červeň a glukózu (pH 7,6) se použije pro MIC test.

Zásobní roztoky testované sloučeniny se připraví při koncentraci 1 mg/ml v dejonisované vodě, sterilizují se filtrací přes filtrační membránu o velikosti pórů 0,2 pm (Sartorius Minisart, N) a skladují se při -20 °C. Pro použití při testu MIC se zásobní roztoky zředí v kapalném médiu na dvojnásobek konečné požadované koncentrace. MIC testy se provádí podle způsobu popsaného v Tanner & Wu, Avian Diseases 36, (1992) 714-717. Aktivně rostoucí nakažené kultury se připraví bud' z 1 ml alikvotního dílu bujónu kultury skladované při -70 °C nebo z kultury skladované na agaru při -70 °C. Nakažené kultury se zředí za získání požadovaného titru 10³ až 10⁵ jednotky měnící barvu/ml. 0,1 ml alikvotní díly nakaženého inokula se smísí s 0,1 ml alikvotního dílu roztoku antibiotika v mikrotitrační jamce. Každá mikrotitrační deska obsahuje inokulované médium o pH 6,8 (M. hyopneumoniae) (kontrola ukončení) a inokulovaný nakažený kontrolní vzorek bez antibiotika. Všechny desky se potom utěsní adhezním filmem a aerobně se inkubuj í při 3 6 °C. MIC se zaznamená, když změna barvy v jamkách měnících barvu dosáhne pH kontroly ukončení. MIC je nejnižší koncentrace nevykazující změnu barvy.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 pro valnemulin a dvě referenční sloučeniny tiamulin a enrofloxacin:

• · · ·

Tabulka 2

In vitro citlivost deset polních izolátů M. hyopneumoniae

Antibiotikum	50 %	MIC (pg/ml) Polní kmeny	Typ kmene J (NCTC 10110)
90 %	Rozsah
Valnemulin (ch)	0,0005	0,001	0,00025-0,001	0,0025
Tiamulin (hfu)	0,025	0,05	0,01-0,05	0,1
Enrofloxacin	0,005	0,01	0,0025-0,025	0,025

Ukázalo se, že všechny kmeny jsou velmi citlivé na valnemulin. Většina kmenů má velmi dobrou citlivost na enrofloxacin, ale pro jednotlivé kmeny bylo MIC valnemulinu nejméně pětkrát nižší, dokonce pro enrofloxacin byla citlivost 0,0025 pg/ml. Tyto výsledky potvrzují, že pole izolátů jsou extrémně citlivá na valnemulin.

3. Vývoj odolnosti

Referenční kmen Mycoplasma hyopneumoniae NCTC 10110 (získaný od National Collection of Type Cultures, Londýn, VB) a nový polní izolát (MEVT G23) se aerobně kultivují při 36 °C v Mykoplasma glukózovém bujónu obsahujícím fenolovou červeň, dokud probíhá kyselá změna barvy. Po přidání sterilního glycerolu (5% objem/objem) se suspenze rozdělí do 1 ml alikvotních dílů a zmrazí se na -70 °C. Tyto kultury se použijí pro iniciaci dalších bujónů kultur, které se titrují za získání mnoha jednotek měnících barvu (ccu) v mikrotitračních destičkách po inkubaci (36 °C). Reprodukce umožňuje nakažení roztoků antibiotik s předem určenými počty ccu při testech minimální inhibiční koncentrace (MIC) a při prvním průchodu při návykových studiích.

Použije se komerčně dostupné médim (Mycoplasma Experience Ltd.) obsahuj-ící glukózu a fenolovou červeň při pH 7,6.

• ·

Zásobní roztoky testované sloučeniny se připraví při 1000 pg/ml v deionizované vodě. Po promíchání se roztoky sterilizují filtrací přes filtrační membránu o velikosti pórů 0,2 μ (Sartorius Minisart, N). Pro použití při MIC testech se zásobní roztoky zředí v bujónu mykoplasmy na dvojnásobek konečné požadované koncentrace. Při návykových studiích se zásobní roztoky rozdělí na 1 ml alikvotni díly a zmrazí se na -20 °C. Potom se rozmrazí a použijí se v 5 až 7 denních intervalech pro přípravu škály koncentrací léčiva (dvojité série) v MEGS, v 1,9 ml alikvotních dílech, obsahujících MIC proti oběma kmenům

M. hyopneumoniae. Hydrochlorid oxytetracyklinu se v každém případě připraví čerstvý. Rozsahy zředění se postupně mění od průchodu k průchodu, čímž se umožní vývoj odolnosti v mykoplasmách.

Postup testu:

MIC testy se provádí způsobem popsaným v Tanner & Wu, Avian Diseases 36 (1992) 714-717 před provedením návykové studie (níže) a po 10 průchodech se 0,1 ml alikvotniho dílu roztoku sloučeniny smísí v mikrotitračních jamkách s 0,1 mi alikvotniho dílu nakaženého inokula, obsahujícího 10³ až 10⁵ jednotek měnících barvu (ccu) na ml. Každá mikrotitrační deska obsahuje inokulované médium, médium o pH 6,8 (kontrola konečného bodu) a kontrolní inokulovaný nakažený vzorek bez léčiva. Všechny desky se uzavřou a aerobně se inkubují při 36 °C. MIC se zaznamenají, když změna barvy v kontrolních jamkách měnících barvu dosáhne pH 6,8 (oranžovožlutá) . MIC je nejnížší koncentrace, která nevykazuje změnu barvy.

Návyková studie: Při prvním cyklu experimentu se 1,9 ml objemy roztoků antibiotika při koncentracích zahrnujících MIC testovaného kmene M. hyopneumoniae inokulují s 0, 1 ml bujónu kultury obsahující 10³ až 10⁵ ccu/ml. Kontrola růstu zahrnuje bujón prostý léčiva inokulovaný M. hyopneumoniae a kontrolní • · ··· · · ·»·· ·· ·· · · · ···· · ···· ·· ··· ·· ·· ··· ···· ·· ·· inokulované médium je zahrnuto při každém cyklu experimentu. Po 7 dnech inkubace (36 °C) se bujóny dvou nejvyšších koncentrací obsahující léčivo vykazující barevnou změnu spojí a použijí se pro inokulaci čerstvé série roztoků léčiva v bujónu mykoplasmy (0,1 ml kultury do 1,9 ml bujónu obsahujícího léčivo) . Tento postup se opakuje každých 5 až 7 dní až do deseti cyklů. Pokud se kmeny mykoplasmy stanou odolné vůči určitým antibiotikům, nebo při 10 cyklu, každý kmen se kultivuje ještě jednou v bujónu obsahujícím léčivo a určí se MIC.

Výsledky: MIC kmene „J M. hyopneumoniae a polních izolátů před a po vystavení antibiotikům jsou uvedeny v tabulce 3:

Tabulka 3

In vitro vývoj odolnosti u dvou kmenů M. hyopneumoniae

Sloučenina	Kmen	Před průchodem MIC (pg/ml)	Po průchodu MIC do P10/P1111 (pg/ml)	Vzrůst odolnosti (násobek vzrůstu)
Valnemulin (ch)	NCTC 10110	0,0025	0,005	2
	polní izolát	0,001	0,0025	2,5
Tylosin tartrát	NCTC 10110	0,25	>50021	>2000
	polní izolát	0,125	62,521	500
Oxytetracyklin	NCTC 10110	0,25	1,0	4
hydrochlorid	polní izolát	0,25	1,0	4
11 hladina průchodu in vitro
2! MIC po 8 průchodech v bujónu	mykoplasmy obsahující	tylosin
Ukázalo se, že	před vystavením	byly oba	kmeny velice	citlivé na

valnemulin, s MIC 0,0025 pg/ml pro refenční kmen a 0,001 pg/ml pro polní izolát. Tyto hladiny aktivity byly 50 až lOOkrát vyšší než hodnoty tylosinu a oxytetracyklinu. Tyto MIC výsledky • · · · • · • · ··· · · · · · • · · · · ·

v návykové se použily pro výběr rozmezí roztoků pro léčiva studii.

Po 10 cyklech vystavení valnemulinu byl vývoj odolnosti minimální u obou kmenů M. hyopneumoniae, MIC rostlo od 0,0025 pg/ml do 0,005 pg/ml a od 0,001 pg/ml do 0,0025 pg/ml pro referenční kmen a pro polní izolát, v tomto pořadí. Naproti tomu se u obou kmenů M. hyopneumoniae vyvinula značná odolnost na tartrát tylosinu. U referenčního kmene se u bujónu obsahujícího tylosin první odolnost objevila po 4 až 5 cyklech a při osmém cyklu vzrostla hodnota MIC nad 500 pg/ml, což je více než 2000násobný vzrůst odolnosti na toto antibiotikum (tabulka 3) . Značná odolnost na tylosin se vyvinula u polních izolátu po osmi cyklech, vzrostlo 500krát na 62,5 pg/ml. Tato hladina odolnosti trvala u bujónu obsahujícího tylosin po 10 až 11 průchodech. Čtyřnásobný vzrůst odolnosti na oxytetracyklin se u obou kmenů M. hyopneumoniae objevil po 10 cyklech vystavení, hodnoty MIC vzrostly z 0,25 pg/ml na 1 pg/ml.

Tyto výsledky ukazují, že valnemulin je značně aktivnější proti M. hyopneumoniae než tylosin nebo oxytetracyklin, a že proti sobě nevyvolává u kmenů M. hyopneumoniae významnou odolnost.

. Prevence experimentálně vyvolané enzootické pneumonie in vivo

Pro odhadnutí potenciálu valnemulinu pro prevenci onemocnění se využil experimentální model enzootické pneumonie využívající zpracovaný plicní materiál původně pocházející od gnotobiotických vepřů s M. hyopneumoniae. Provedly se tři pokusy: Pokusy 1 a 2 byly dávkové titrační studie nových sloučenin za použití standardního nakaženého kmene M. hyopneumoniae a v pokusu 3 se odhadovala účinnost sloučeniny při 200 ppm v krmivu proti druhotně nakaženému kmeni. Použily se samci velkých bílých vepřů Landrace, 6 až 7 týdnů staří, ······ · ·· ·· ·· • · · · · · · ···· • · · · · ·*·· • · ·· · · · ···· · ···· ·· ··· • · · · ······· · · ·· z chovu prostého infekce M. hyopneumoniae. Nakaženými materiály jsou pneumonické plíce obsahující M. hyopneumoniae podávané jako homogenát intranasálně ve třech po sobě následujících dnech. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) valnemulinu proti kmeni přítomnému v materiálu použitá v testech 1 a 2 byla 0,016 pg/ml a MIC pro kmen izolovaný z materiálu použitého v testu 3 byla 0,0078 pg/ml. Nakažený materiál byl původně získaný pomocí infekce gnotobiotických vepřů M. hyopneumoniae a následným průchodem SPF (specifický prostý pathogenu) vepřů a byl skladován pod -70 °C.

Test 1: Medikace hydrochloridem valnemulinu pomoci žaludeční trubice (žaludeční sonda) jednou denně při 0 (kontrola), 2,5,

5, 7,5, nebo 10 mg/kg tělesné hmotnosti na den. Šest vepřů na skupinu.

Test 2: Medikace hydrochloridem valnemulinu v krmivu při 0,

100, 200, 300 nebo 400 ppm (ekvivalent 0, 5, 10, 15 nebo mg/kg/den). Šest vepřů ve skupině.

Test 3: Medikace hydrochloridem valnemulinu v krmivu při 0 nebo 200 ppm (ekvivalent 0 a 10 mg/kg/den) . Osm vepřů ve skupině. Medikace se prováděla od prvního dne vyvolání infekce do posmrtného testování prováděného asi 3 týdny po vyvolání infekce. Onemocnění se stanovilo podle počtu lézí na plicích [Camridgeský systém počítání lézí (Goodwin R. F. W. a Whittlestone, P., J. Hyg. 69 (1971) 391-397), kde počet je aproximací procentuální hodnoty plicní tkáně napadené pneumonií], pomocí odhadu poměru plíce-tělesná hmotnost a pomocí izolace M. hypneumoniae z plic.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4:

• · · · • · • · • ·

Tabulka 4

Test 1: Medikace ]	pomocí žaludeční sondy,	MIC 0,016	pg/ml11 * * V
Medikace	Počet plicních lézí	Poměr	plíce	těl.
		hmotn. (	:%)
0	13,2	1,35
10 mg/kg/den	1,7	1,08
7,5 mg/kg/den	3,8	1,21
5 mg/kg/den	11,7	1,31
2,5 mg/kg/den	7,7	1,21

Test 2: Medikace	krmivém, MIC 0,016	pg/ml
Medikace	Počet plicních	lézí	Poměr hmotn.	plíce (%)	těl.

0	22,1	1,61
400 ppm (20 mg/kg)21	6,3	1,24
300 ppm (15 mg/kg)	12,7	1,27
200 ppm (10 mg/kg)	12	1,29
100 ppm (5 mg/kg)	25	1,53

Test 3 :	Medikace krmivém, MIC 0,0078	gg/ml
Medikace	Počet plicních	lézí	Poměr hmotn.	plíce (%)	těl.
0 200 ppm	10,8 (10 mg/kg) 2,3		1,32 1,21

¹¹ MIC hydrochloridu valnemulinu v pg/ml proti M. hyopneumoniae izolované z nakaženého materiálu ²¹ Přibližná denní dávka hydrochloridu valnemulinu na vepře

V testu 1 měli neléčení, nakažení vepři střední počet lézí

13,2. Valnemulin sníží počet lézí z 71 % a 87 % při dávkách

7,5 a 10 mg/kg, v tomto pořadí, zatímco při dávkách 2,5 a • » · · « · · · · · * ·· ·· · · * ···· ···· · * * * • · · « ·«··«·· · » mg/kg/den se počet lézí snížil s poněkud nižší účinností. M hyopneumoniae se znovu izolovala z méně vepřů medikovaných 10 mg/kg, ve srovnání s vepři medikovanými 2,5 mg/kg (1:4 vepřům).

V testu 2 měli neléčení, nakažení vepři střední počet lézí 22,1. Vepři medikovaní valnemulinem při 200, 300 nebo 400 ppm vykazovali snížení počtu lézí z 46 %, 43 % a 71 % v tomto pořadí. Hmotnosti plic, které mohou odrážet mikroskopické léze stejně jako velké léze, vykazují dramatičtější účinek, s výraznějším snížením hladiny směrem k 200 ppm. U vepřů medikovaných 100 ppm nebylo pozorováno žádné snížení počtu lézí. M. hyopneumoniae byla při posmrtném testu znovu izolována ze všech neléčených vepřů, ale nebyla izolována z vepřů medikovaných 400 ppm nebo 300 ppm valnemulinu. Byla izolována ze 3 a 4 vepřů medikovaných 200 ppm a 100 ppm, v tomto pořadí.

V testu 3 měli neléčení vepři střední počet lézí 10,8; po medikaci valnemulinem při 200 ppm v krmivu se snížil počet lézí ze 79 %. Nebyl žádný rozdíl v hladině M. hyopneumoniea detekovaného při posmrtném testu mezi léčenými a neléčenými vepři.

Valnemulin tedy vykazuje preventivní účinek při experimentálně vyvolané enzootické pneumonii u vepřů při oddělených pokusech za použití nakaženého materiálu obsahujícího dva různé kmeny M. hyopneumoniae.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě enzootické pneumonie u vepřů způsobené infekcí Mycoplasma hyopneumoniae. Pro takové použití účinná dávka samozřejmě závisí na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikost a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se relativně malá dávka podává dlouhou dobu. Obecně se však uspokojivých výsledků dosáhne, když se činidlo podává při denní dávce 5 mg/kg až 15 mg/kg tělesné hmotnosti, vhodně v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně, nebo ve formě prostředku s postupným uvolňováním. Pro většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 100 mg až 10 0 0 mg, s výhodou 100 mg až asi 500 mg, při podávání jednou nebo dvakrát denně.

S výhodou se může podávat při samostatné léčbě.

Výhodné dávky v pitné vodě jsou 0,01 až 0,05 % hmotnosti vzhledem k objemu, zejména 0,01 až 0,025 %, a v krmivu 100 až 400 ppm (g/metrická tuna), s výhodou 100 až 200 ppm (g/metrická tuna).

B) Infekce Serpulina hyodysenteriae

Infekce Serpulina hyodysenteriae může být diagnostikována běžným způsobem, například tak, jak je popsáno ve veterinární příručce, jako je Taylor D. J. , v Pig Diseases, šesté vydání (1995), vyd. D. J: Taylor, Glasgow, VB na stranách 143-144. Výhodná aktivita činidla podle vynálezu při tomto použití se určí například následujícím způsobem:

1. Určení MIC

Je zahrnuto devět polních izolátů infekce S. hyodysenteriae z epidemie střevní úplavice vepřů a kmen typu ATCC 31212 a ATCC 29796 (Serpulina innocens, skupina 3 (Fellstrom, C., Res. Vet. Sci . 59, (1995) 1-4) . Identifikace je založena na vzoru hemolýzy na TSA („Tryticase sójový agar) s 5 % hovězí krve a na testu produkce indolu a hydrolýze hipurátu (Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK) . Bakterie se převedenou z desek agaru do 0,9% solného roztoku a zákal se upraví na hodnotu 1,0 na McFarlandově stupnici, potom 10 μΐ každého izolátu inokuluje na deskách agaru dvounásobnými koncentracemi hydrochloridu valnemulinu, hydrogenfumarátu tiamulinu, dimetridazolu, hydrochloridu lincomycinu, a tylosinu. Růst a hemolýza se zaznamená po 4 dnech anaerobního růstu a MIC se určí jako • · ··· · · ·«·· ·· ·· · · · ··»* · • · · · ·· ··· • · ·· ······· ·· ·· nejnižší koncentrace antibiotika, při které spirochety nerostou.

Výsledky určení MIC pro S. hyodysenteriae jsou uvedeny v tabulce 5:

Tabulka 5

Hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro 10 kmenů Serpulina hyodysenteriae

Antimikrobiálni látka
MIC	Valnému-	Tiamulin Dimetri-	Lincomy-	Tylosin
(pg/ml)	lin (ch)	(HFU) dazol	cin
0,0156	2	-
0,0312	4	-
0,0625	3	-
0 , 125		6
0,250		1
0,500		1 2	-
1	1	2 2	-
2		1		-
4
8		1		-
16		1
32			-
64		3	1
128			3	1
>128			6	9
ch = hydr	ochlorid	hfu = hydogenfumarát
Všechny	kmeny S.	hyodysenteriae byly	vysoce	citlivé na

valnemulin, vykazovaly hodnoty MIC 2-32krát nižší než u tiamulinu. Vysoká citlivost valnemulinu na S. hyodysenteriae činí sloučeniny zajímavými pro použití při léčbě klinických případů infikovaných stád.

• · · ·

2. Určení MIC:

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) se určí proti 10 kmenům

S. hyodysenteriae izolovaných z výkalů vepřů, pomocí způsobu ředění agaru. NCTC (National Collection of Type Cultures) kmeny nebo referenční kmeny se použijí jako kontrola při všech MIC testech. Agarové médium pro S. hyodysenteriae obsahuje BAB2 (Unipath CM271) obsahující 7 % úplně defibrinované sterilní krve ovcí. Všechna antimikrobiální činidla se testovala ve zdvojených roztocích. Připravené roztoky antibiotik se přidají k příslušnému objemu MH agaru, předem ochlazenému na 50 °C, smísí se a dolijí na objem 20 ml. Všechny inkubace S. hyodysenteriae se provádějí anaerobní komoře při 37 °C (+/0,5 °C) (Don Whitley Scientific), které poskytuje přísně anaerobní atmosféru obsahující 80 % dusíku, 10 % vodíku a 10 % oxidu uhličitého. Všechny ostatní inkubace se provádějí při 37 °C. Všechny kmeny se inkubují v aerobní atmosféře při 37 °C 24 hodin. Počet organisrmi se upraví na optickou hustotu (OD) rovnou 1x10® jednotek tvořících kolonii (cfu) na ml za použití MH bujónu jako blanku. Desky obsahující antibiotikum se duplicitně inokulují za použití multibodového inokulátoru (Denley Instruments), čímž se získá deska inokula přibližně 1 μΐ poskytující inokulum 10⁴-10⁵ cfu na skvrnu pro všechny kmeny (Amon, J. Antimicrob. Chemother. 21 [1988] 701-710;

Ericson a kol., Acta Pathol. Microbiol. Et Immunol. Scand. 217 [1971] (B) dod. 1-90) . Kontrolní desky se inkubují za stejných podmínek, jako testovací deska. Hodnoty MIC se odečítají po 24 a 48 hodinách, přičemž druhý odečet je konečný. MIC je definována jako nejnižší koncentrace antibiotika, na kterém neprobíhá žádný růst, bez ohledu na jednotlivou kolonii nebo nejasné zamlžení způsobené kolonií

Clinical Laboratory Standards

Susceptibility Testing, NCCLC Publications SC3, Villanova, PA, USA) .

(National Committee for [1989]), Antimicrobial • · · · «·· · · · * · · ·· ·· · · · · · · · ···· · · ·· •· ·· ······· ·· *·

MIC (v pg/ml) proti Serpulina hyodysenteriae byly pro valnemulin (0,1), tiamulin (0,3), lincomycin (50,0), tylosin (200,0) a dimetridazol (30,0). Všechny kmeny S. hyodysenteriae byly citlivé na valnemulin, který byl nejaktivnějšim činidlem testovaným 3-600násobně.

2. Test vyvolání odezvy:

Prováděly se dva testy prevence dysenterie vepřů, kdy se valnemulin podávaný v různých ikluzních hladinách přirovnával k tiamulinu. Závažnost onemocnění se stanovila pomocí evidence klinického onemocnění, která určí pomocí klinického skóre pro tělesný stav, konzistenci a složení výkalů. Určilo se také vylučování Serpulina hyodysenteriae ve výkalech, léze při posmrtném testu, rychlost růstu a poměr konverze krmivá při podávání.

Při prvním testu se podával hydrochlorid valnemulinu při 20, 30 a 40 ppm a srovnával se s hydrogenfumarátem tiamulinu podávaným při 30 ppm a neléčeným kontrolním vzorkem. V každé léčené skupině se použije pět skupin o 9 (5 až 6 týdnů starých) běžně chovaných vepřů. Vepři se krmí nemedikovanou potravou 14 dní, potom se nakazí standardním kmenem S. hyodysenteriae (P18A). Nakažení se provede orální cestou ve dvou následujících dnech. Medikované krmivo se začne podávat den po druhém nakažení. Druhý test se provede podobným způsobem kromě toho, že se použijí 4 skupiny o 9 vepřích. Vepřům se podává hydrochlorid valnemulinu v množství 5, 10 a 20 ppm a srovnávají se s neléčenými kontrolními zvířaty. Při tomto testu se použijí vepři ze skupiny chované venku a nakazí se kmenem S. hyodysenteriae izolovaným ze skupiny chované venku, u kterého se předem prokázala schopnost způsobit dysenterii vepřů. Při obou testech se kontrola klinického onemocnění provádí denně a zaznamenává se klinický stav onemocnění, rektální výtěr se odebírá dvakrát týdně a izoluje se z něj S. hyodysenteriae a

	18	• · · · · · • · · • · · · • · · · • · t ·	• · · · · · · • · · «· · · • · · ··»· · • · · · · ······· · · ··
v pravidelných	intervalech se vepři váží	Také se	zaznamenává
příjem krmivá.	Posmrtný test se provádí	21 dní po	nakažení a
tlusté střevo	se testuje na přítomnost	lézí. Ze	čtyř míst
tlustého střeva	se odeberou zbytky hlenu	a kultivují se na S.

hyodysenteriae.

vepře, pricemz dysenterie vepřů

Při prvním testu se klinická dysenterie vepřů pozoruje nejprve u neléčené skupiny 8 dní po nakažení a postihne 8 z 9 vepřů. Klinické onemocnění bylo také pozorováno u 1 vepře ze skupiny, které byl podáván valnemulin v množství 30 ppm a u 2 z 9 zvířat z tiamulinové skupiny. Výskyt onemocnění nebyl pozorován u valnemulinových skupin léčených 20 a 40 ppm. Pro kontrolní skupinu bylo zaznamenáno střední klinické skóre 3δ na vepře ve srovnání se skóre 6 pro skupinu léčenou tiamulinem. Rozdíly mezi skóre zaznamenanými pro všechny léčené skupiny byly statisticky jiné než u kontrolních skupin (p<0,001). S. hyodysenteriae se izolovala z rektálních výtěrů odebraných všem vepřům v kontrolní skupině a také dvěma nemocným, vepřům ze skupiny léčené tiamulinem. S. hyodysenteriae byla také izolována z dvou vepřů, kteří dostali valnemulin v množství 30 ppm, což se shoduje s klinickými příznaky dysenterie vepřů pozorované následně po nahodilém nakažení v této skupině. S. hyodysenteriae nebyla izolována ze skupiny léčené 20 a 40 ppm. Byl malý rozdíl v hmotnosti nebo poměru konverze krmivá u všech skupin krmených medikovaným krmivém. Při posmrtném testu vepři z kontrolní skupiny a skupiny léčené tiamulinem, kteří měli klinické příznaky onemocnění, vykazovali typické léze dysenterie vepřů obsahující přichycený hlen s odumřením sliznicového povrchu tlustého střeva. Léze byly také pozorovány u jednoho vepře ze skupiny léčené tiamulinem a kontrolního ?a dříve nevykazovali klinické příznaky

S. hyodysenteriae byla izolována ze všech hlenových výtěrů od všech těchto postižených vepřů. Jeden vepř ze skupiny krmené valnemplinem při 30 ppm měl také léze dysenterie vepřů, ale z hlenového výtěru nebyla izolována S. hyodysenteriae. Léze nebyly pozorovány při posmrtném testu u skupiny léčené valnemulinem při 20 a 40 ppm.

Při druhém testu byla klinická dysenterie vepřů pozorována nejprve u neléčených kontrolních vepřů 5 dní po nakažení a následně bylo postiženo všech 9 vepřů a 6 vepřů z této skupiny muselo být usmrceno z důvodu závažnosti onemocnění. Ve skupině krmené valnemulinem při 5 ppm byly klinické příznaky dysenterie vepřů poprvé pozorovány 8 dní po nakažení a následně se onemocnění projevilo u 5 z 10 zvířat. Avšak počet postižených zvířat ve skupině léčené valnemulinem při 5 ppm byl výrazně nižší než u kontrolní skupiny (p<0,05). Klinické příznaky onemocnění nebyly pozorovány u skupin krmených valnemulinem při 10 nebo 20 ppm. Střední klinický stav 11 pro skupinu léčenou valnemulinem při 5 ppm byl výrazně nižší než stav 77 pro kontrolní skupinu (p<0,005). S. hyodysenteriae byla izolována z rektálního výtěru odebraného všem kontrolním vepřům během testu. Avšak z 5 postižených zvířat ze skupiny léčené valnemulinem při 5 ppm byla S. hyodysenteriae izolována pouze u dvou z těchto zvířat. Na konci testu byli vepři krmení valnemulinem ve všech dávkách výrazně těžší než kontrolní vepři (5 ppm, p=0,05; 10 a 20 ppm, p<0,05, v tomto pořadí) . Při posmrtném testu byly léze typické pro dysenterii vepřů pozorovány na sliznici tlustého střeva 3 zbývajících kontrolních vepřů. Ve skupině krmené valnemulinem při 5 ppm z 5 vepřů, kteří původně vykazovali příznaky onemocnění, pouze 2 měly při posmrtném testu léze, ale z těchto zvířat nebyla izolována S. hyodysenteriae. Avšak S. hyodysenteriae byla izolována z hlenového výtěru z 2 dalších zvířat, které měly současně typické léze, ale nevykazovali příznaky onemocnění. Léze nebyly pozorovány u vepřů krmených valnemulinem ani v množství 10, ani v množství 2 0 ppm a u těchto skupin nebyla izolována S. hyodysenteriae.

····· · · ··

Tedy valnemulin podávaný v množství nižším než 10 ppm je účinný při prevenci výskytu klinických příznaků dysenterie vepřů, zbytků spirochet ve výkalech a přítomnosti lézí při posmrtném testu. Při 30 ppm několik vepřů nevykazovalo klinické příznaky dysenterie vepřů, což se shoduje s náhodnou nákazou, kterou může ovlivnit podávání antibiotik. Tyto vlivy konkurenčního onemocnění při podáváni antibiotik a výskyt dysenterie vepřů byly již popsány (Burch, D.G.S, Vet. Rec. 110 [1982] 244-246). Při analýze hmotnosti se nezjistily žádné rozdíly mezi léčenými skupinami, což naznačuje, že antibiotika nepůsobí na chutnost krmivá. Při 5 ppm valnemulinu nedochází úplně k prevenci klinického onemocnění nebo vylučování spirochet, ale dochází k významné redukci klinických stavů a vylučování spirochet ve srovnání s kontrolními zvířaty. Při tomto testu tiamulin podávaný při 30 ppm nepůsobí preventivně na dysenterii vepřů, ale snižuje výskyt onemocnění ve srovnání s kontrolní skupinou za snížení klinických stavů. Avšak při tomto testu medikace v krmivu je při prevenci dysenterie vepřů valnemulin při 10 ppm jasně účinnější než thiamulin při 30 ppm.

4. Další zkouška vyvolání odezvy:

Skupina 60 (3,5 až 4 týdny starých) běžně chovaných vepřů se krmí nemedikovaným krmivém 14 dní, potom se nakazí orální cestou standardním kmenem S. hyodysenteriae (P18A). Když jsou zřejmé klinické příznaky onemocnění, vepři se rozdělí do šesti skupin po 8 vepřích na skupinu a 10 dní se jim podává krmivo obsahující antibiotika, potom dalších 14 dní nemedikované krmivo. Hydrochlorid valnemulinu se podává v množství 50, 75,

0 a 15 0 ppm a pro srovnání se podává hydrogenfumarát tiamulinu v množství 100 ppm a dále se srovnává s neléčenou kontrolní skupinou. V každé skupině se vyskytují vepři s mnoha příznaky onemocnění. Po rozdělené do skupin se výskyt klinického onemocnění sleduje denně a zaznamenává se klinický stav, rektální výtěry se pro izolaci S. hyodysenteriae • · · · provádějí dvakrát týdně a vepři se v pravidelných intervalech váží. Také se zaznamenává přísun krmivá. Posmrtný test se provádí 24 dní po nakažení a tlusté střevo každého vepře se testuje na přítomnost lézí. Ze 4 míst v tlustém střevě se odebírá hlenový výtěr a kultivuje se na S. hyodysenteriae.

(kontrolní a tiamulinová) skupiny vznikly po 12,

Po nakažení a před rozdělením, byla pozorována klinická dysenterie vepřů 7 dní po nakažení a první dvě léčené skupiny vznikly 8 dní po nakažení. Další 15, 20 a 28 dnech po nakažení v následujícím pořadí: valnemulin při 75, 50, 100 a 150 ppm.

Každá skupina obsahovala vepře, kteří měly krev a/nebo hlen ve výkalech, stejně jako zvířata, která měla pouze slabé klinické příznaky onemocnění, například měkké výkaly. Ve 4 dni testu všichni vepři v neléčené skupině vykazovali závažné klinické příznaky onemocnění a byli usmrceni. Během léčení v tiamulinové skupině celkem 3 zvířata bud' zemřela nebo jim byla poskytnuta euthanasie z důvodu závažnosti dysenterie vepřů. Všichni vepři léčení valnemulinem přežili do konce testu. Ve skupině krmené valnemulinem ve všech množstvích klinické příznaky onemocnění rychle mizely a klinické onemocnění nebylo pozorováno do 5 dní testu. Ve dni 8 bylo toto zlepšení také pozorovánc přežívajících vepřů léčených tiamulinem. Střední klinické skóre u skupiny valnemulinu se pohybovalo od 4 do 10 ve srovnání se středním skóre 30 zaznamenaným u tiamulinové skupiny. Statistická analýza klinického skóre pro dny 3 a 10 ukázala, že nebyl významný rozdíl mezi všemi skupinami léčeným valnemulinem a tiamulinem (p<0,001). U všech vepřů léčených valnemulinem pokračoval během léčby nárůst hmotnosti a všichni měli vyšší denní nárůst živé hmotnosti (DLWG) než tiamulinová skupina (rozmezí 0,4 až 0,9 ve srovnání s 0,1) . Poměr konverze krmivá (FCR) byl během léčby daleko vyšší u skupiny léčené tiamulinem (6,4) ve srovnání se skupinou léčenou valnemulinem (rozmezí 1,9 až 2,5) . S. hyodysenteriae byla v době rozdělení izolována • · · ·

z většiny vepřů v každé skupině. 5 dní po rozdělení nemohla být

S. hyodysenteriae detekována v rektálním výtěru odebraném od vepřů ve všech léčených skupinách.

V době po léčení jeden vepř ze skupiny krmené valnemulinem při 50 ppm vykazoval klinické příznaky onemocnění 4 dny po ukončení podáváni medikovaného krmivá a jeden vepř ze skupiny léčené tiamulinem měl také dysenterii vepřů v posledním dni testu. Avšak S. hyodysenteriae nebyla z výkalů těchto vepřů izolována.

V této době po léčení se vyskytly malé pozorovatelné rozdíly v DLWG nebo FCR mezi všemi léčenými skupinami. Při posmrtném testu na konci pokusu nebyly léze dysenterie vepřů pozorovány u žádného vepře léčeného valnemulinem při 75, 100 nebo 150 ppm. Ve skupině krmené valnemulinem při 50 ppm měl 1 vepř klinickou dysenterii vepřů a jeden další vepř z této skupiny měl v této době trochu zarudlé tlusté střevo. S. hyodysenteriae byla izolována také z hlenového výtěru z těchto 2 vepřů a z dalších 3 zvířat z této skupiny, která neměla léze dysenterie vepřů. Jeden vepř ve skupině krmené valnemulinem při 75 ppm měl také

S. hyodysenteriae v hlenovém výtěru, ačkoli nevykazoval klinické příznaky dysenterie vepřů.

Valnemulin při 50, 75, 100 a 150 ppm tedy poskytl snížení počtu dni, které byly potřebné pro zotaveni se z klinické dysenterie vepřů ve srovnání s tiamulinem. V těchto skupinách léčených valnemulinem také zvířata nezemřela nebo nevyžadovala euthanasii. Byl významný rozdíl (p<0,001) v klinických stavech u skupiny léčené valnemulinem ve srovnáni se skupinou léčenou tiamulinem. Preventivně se také při všech hladinách valnemulinu působilo na vylučování S. hyodysenteriae ve výkalech po ukončení léčby. Avšak S. hyodysenteriae byla izolována z hlenového výtěru z vepřů léčených valnemulinem při dávkách 50 a 75 ppm. Ukázalo se, že tiamulin v množství 35 a 40 ppm snižuje S. hyodysenteriae ve výkalech, ale nepůsobí preventivně na zlepšení hlenových výtěrů (Taylor, D. J. , Vet. Rec. 106, • ♦ · · [1980] 526-528). Tiamulin při 100 ppm byl s úspěchem použit za experimentálních podmínek (Taylor, D. J. , Proč. 7^uh IPVS Congress Mexico [1982] 47) pro léčbu dysenterie vepřů u zvířat, která nebyla tak závažně napadena, že by byla netečná. Při tomto testu tiamulin při 100 ppm snížil úmrtnost ve srovnání s neléčenými kontrolními zvířaty, ale nepůsobil preventivně proti některým úmrtím, což mohlo být způsobeno závažností onemocnění vyvolaného při experimentálním nakažení.

Při tomto testu valnemulin v krmivu při 50, 75, 100 a 150 ppm tedy úspěšně léčí experimentálně vyvolanou dysenterii vepřů za prevence úmrtnosti a snížení klinických příznaků. Během testu docházelo k prevenci vylučování S. hyodysenteriae za recidivy po ukončení léčby právě u jednoho zvířete léčeného 50 ppm. Valnemulin při 50 a 75 ppm úplně nevyloučí S. hyodysenteriae u všech vepřů, ale množství 100 ppm je velmi účinné.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je proto vhodné při léčbě dysenterie vepřů způsobené infekcí Serpulina hyodysenteriae. Pro toto použití se bude účinné dávkování samozřejmě měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu by se podávalo relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně se uspokojivé výsledky získají, pokud se činidlo podává v denní dávce od 1 mg/kg až 5 mg/kg hmotnosti zvířete, vhodně podávané v rozdělené dávce dvakrát až čtyřikrát denně nebo podle libosti v krmivu nebo ve vodě nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro většinu zvířat je celková denní dávka 10 mg až 400 mg, například 10 mg až 200 mg jako prevence nebo 20 mg až 400 mg pro léčbu, podávaná libovolně v krmivu nebo ve vodě, nebo jednou nebo dvakrát denně.

Výhodné dávkování v pitné vodě se pohybuje mezi 0,001 až 0,05 % hmotnost/objem, zejména 0,001 až 0,005 % a v krmivu 20 až 100 g/metrickou tunu, zejména 20 až 75 g/metrickou tunu.

C) Kolitida vepřů souvisej ící s infekcí Serpulina pilosicoli

Kolitida může být zjišťována běžným způsobem, například jak je popsáno ve veterinární příručce, jako od Taylor, D. J. , v Pig Deseases, šesté vyd. (1995), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB na stranách 148-149. Výhodnost aktivity činidla podle předkládaného vynálezu při tomto použití se určí například následujícím způsobem:

1. Hodnoty MIC:

Devět polních izolátů WBHS z epidemie dysenterie vepřů bylo získáno od skupin s a bez průjmu a ATCC 29796 (Serpulina innocens, skupina 3) (Fellstróm C., Res. Vet. Sci. 59 [1995] 14. Identifikace je založena na vzoru hemolýzy na TSA („Tryticase sojovém agaru) s 5% hovězí krve a na testu produkce indolu a hydrolýzy hipurátu (Rosco Diagnostic Tablets, Taastrup, DK). Z devíti slabě beta hemolytických spirochet byla jedna označena jako skupina 2, čtyři jako skupina 3 a pět jako skupina 4 (Fellstróm, výše). Bakterie se přenesly z desek agaru do 0,9% solného roztoku a zákal se upravil na 1,0 podle McFarlandovy stupnice, potom se 10 μΐ každého izolátu inokulovalo na desky agaru s dvojnásobnými koncentracemi následujících antimikrobiálních látek: hydrochlorid valnemulinu, hydrogenfumarát tiamulinu, dimetridazol, hydrochlorid linkomycinu a tylosin. Růst a hemolýza se zaznamenaly po 4 dnech anaerobního růstu a MIC se určilo jako nejnižší koncentrace antibiotik, při které spirochety nerostou.

Výsledky určení MIC pro WBHS jsou uvedeny v tabulce 6. Obecně bylo WBHS citlivé na všech pět antimikrobiálních činidel. Pro všechny testované antimikrobiální látky nebyl zjištěn žádný rozdíl v citlivosti mezi třemi skupinami WBHS. Hodnoty MIC získané pro valnemulin jsou na nejnižší hodnotě pro 9 z 10 kmenů, zatímco pro všechny 4 uvedené sloučeniny jsou tyto hodnoty daleko vyšší pro velkou většinu kmenů.

• · · ·

Vyšší citlivost valnemulinu na obě WBHS jej činí zajímavým pro použití při léčbě klinických případů nakažených skupin.

Tabulka 6

Hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro 10 slabě beta hemolytických spirochet

Antimikrobiální činidlo1’
MIC	Valnemulin Tiamulin	Dimetrida-	Lincomycin	Tylosin
(,ug/ml)	(ch) (hfu)	zol
0,0156	9 4
0,0312	2
0,0625	3	2
0, 125	-	4
0,250	-	4
0,500	-	-	4
1	1 1	-	1
2		-		2
4
8		-		1
16		-
32			1
64		-	1
128			3	-
>128			-	7
1! číslice	; je počet slabě beta	hemolytických	spirochet, u	kterých se
zjistilo,	že mají takovou hodnotu	MIC
ch = hydrochlorid; hfu = hydrogenfumarát
Činidlo	podle předkládaného	vynálezu je	tedy vhodné	při léčbě
kolitidy	vepřů spojené s infekcí Serpulina pilosicoli	. Pro toto
použití	se bude samozřejmě	účinné množství měnit v	závislosti

na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v denní dávce 1 mg/kg až 5 mg/kg hmotnosti

zvířete, vhodně podávané v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně nebo libovolně v krmivu nebo vodě nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 10 mg až 400 mg, například 10 mg až 200 mg při prevenci nebo mezi 20 mg až 400 mg při léčbě, při podávání libovolně v krmivu nebo ve vodě nebo jednou nebo dvakrát denně.

Výhodné dávky v pitné vodě se pohybují mezi 0,001 až 0,05 % hmotnost/objem, zvláště 0,001 ař 0,005 % a v krmivu 20 až 100 g/metrickou tunu, s výhodou 20 až 75 g/metrickou tunu.

D) Ileitida u vepřů související s infekcí Lawsonia intracellularis:

Infekce Lawsonia intracellularis může být diagnostikována běžným způsobem, například jako je popsáno ve veterinární příručce Taylor, D. J., v Pig Deseases, šesté vyd. (1995), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB na stranách 148-149. Výhodnost aktivity činidla podle předkládaného vynálezu při tomto použití se určí například následujícím způsobem:

1. Aktivita in vitro

Obecně se postupovalo podle způsobu popsaného v Lawson G. Η. K. a kol., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142, ale provedly se některé úpravy (standardní Kirby-Bauerovy diskové metody nejsou použitelné pro intracelulární bakterie):

Buňky: Připravily se monovrstvy buněčných kultur enterocytů krys IEC-18 (ATCC CRL 1589) a udržovaly se pomocí standardních metod kultivace buněk. Jeden den staré monovrstvy dělených buněk (asi 30% splývání) se pro infekci ve dni 0 na krycí sklíčko v malých kultivačních viálkách (Tracs).

Inokula: Jako inokula se použijí šarže tří kmenů Lawsonia intracellularis. Tyto se získají z vepřů postižených proliferativní enteropathií, z forem proliferativní hemoragické ···· ·· ··· ·· * · ······· · · ·· enteropathie (PHE) a intestinální adenomatosy (PIA) připravených z vnitřností vepřů a nechají se projít buněčnými kulturami, jak je popsáno výše v Lawsonově odkazu. Dva kmeny PKE se částečně testovaly na pathogenitu u vepřů, jak je popsáno v McOrist, S. a kol., Infect. Immun. 61 (1993) 42864292. Šarže inokula se po několika buněčných cyklech sklidí a skladují se zmrazená při -70 °C v 1 ml vialkách. Předběžným testem se ustanoví vhodná zředění ve vialkách po roztátí, která mohou vést ke snadno rozlišitelným buněčným infekcím při 5denní zkoušce.

Antibiotika se pro každé použití připraví jako lOOx zásobní roztoky. Aktivita každé šarže antibiotika se potvrdí pomocí standardní Kirby-Bauerovy diskové metody s laboratorním kmenem Escherichia coli.

Infekce: Ve dni 0 se viálka každého kmenu nechá roztát, zředí se kultivačním médiem 1/8 až 1/32 a použije se ve skupinách 1 až 4 .

Pro skupinu 4 (kontinuální působení) se toto inokulum nejprve před přidáním buněk inkubuje 1 hodinu při 37 °C v kultivačním médiu obsahujícím antibiotika při různých koncentracích.

Pro skupinu 3 (extracelulární připraví v kultivačním médiu různých koncentracích, přidaná buněk.

působení) se toto inokulum obsahujícím antibiotika při bezprostředně před přidáním

Pro skupinu 1 (kontrolní) a 2 (intracelulární působení) se inokula připraví v kultivačním médiu prostém antibiotik a přidají se k buňkám. Kultivační viálky (Tracs) s buňkami s přidaným inokulem (+/- antibiotika) v celkem 0,5 ml média se umístí do ocelové nádoby, evakuuji se na 40 % atmosférického tlaku (8 % kyslíku), nechají se 2 minuty, naplní se vodíkem a 'nakonec 10 % oxidu uhličitého. Kultivační viálky se potom

vyjmou z těchto nádob a umístí se do inkubátoru, který má nastavenu vlhkou atmosféru obsahující 8 % kyslíku, 8,8 % oxidu uhličitého a zbytek dusíku, při 37 °C.

Ve dnech 1 a 2 se všechny viálky vyjmou a znovu se naplní čerstvým médiem, které obsahuje buď antibiotika, skupiny 2 a 4, nebo neobsahuje antibiotika, skupiny 1 a 3, a umístí se do inkubátoru. Ve dni 5 se všechna krycí sklíčka vyjmou a potřísní se Lawsonia intracelularis pomocí nepřímých imunoperoxidázových skvrn obsahujících specifickou monoklonální protilátku. Jako hlavní měřítko infekce se použije počet buněk na každém krycím sklíčku, které jsou těžce infikované Lawsonia intracelularis (>30 na buňku, těžce infikovaná buňka=HIC). Také se zaznamenává počet foci z HIC a obecná pozorování buněk. HIC v kontrolní skupině (skupina 1) , test intracelulárně aktivních antibiotik (skupina 2), test extracelulárně aktivních antibiotik (skupina 3) a test kontinuálního působení (skupina 4) se porovnávají v trojnásobných testech, vždy až pro tři kmeny. Některé testy se opakují pro různé pro různé síly inokula. Procentuální poměry se vypočtou po odvození střední hodnoty HIC kontrolního testu odpovídajícího příslušné testované skupině. Střední hodnota HIC kontrolního testu je celkový počet HIC v kontrolních kultivačních viálkách dělený počtem infikovaných kontrolních kultivačních viálek. Procentuální poměr testovaných kultivačních viálek se potom vypočte dělením jejich hodnot HIC střední hodnotou kontolní HIC, násobeno 100 za získání procentuální hodnoty. To znamená, že testované kultivační viálky, kde nepůsobila antibiotika, mohou mít procentuální poměr okolo 100, a kde antibiotika způsobila úplnou inhibici růstu, může být poměr 0.

Získané výsledky s hydrochloridem valnemulinu tak, jak byly zaznamenány, jsou uvedeny v tabulce 7, která uvádí procentuální obsah buněk, které po zpracování zůstávají neinfikované:

Tabulka 7

Procentuální poměry infekce Lawsonia intracelularis buněčných kultur za přidání valnemulinu

Valnemulin (ch) koncentrace (pg/ml)	2	Kmen skupiny 3	4	Kmen skupiny
2	3	4
8	0	0	0	0,86	0,2	0,5
	0	0	0	0	0	1,4
	0	0	0	0	1,4	0,2
4				0	0	0,8
				0	0,83	2,5
				1,7	1,7	2,5
2	0	0	0
	0	0	0
	0	-	28
ch = hydrochlorid

Tyto výsledky ukazují, že minimální koncentrace hydrochloridu valnemulinu způsobující výraznou inhibici růstu Lawsonia intracelularis (<1% růst) je 2 μ9/πτ1.

2. Test vyvolání odezvy:

Třicetpět odstavených vepřů se virulentním inokulem Lawsonia izolát kauzativního nakazilo ve stejný den intracelularis (kmen LR činidla proliferativní

189/5/83), enteropatie vepru se získá kultivací v buněčném kmeni enterocytů krys IEC-18 (ATCC CRL 1589), jak je popsáno v Lawson a kol., J. Clin. Microbiol. 31 (1993) 1136-1142. Sedm kontrolních vepřů se dávkuje roztokem pufru. Sedm z 21 nakažených vepřů se nechá neléčených. U těchto sedmi vepřů se snížila hmotnost a u všech se vyvinuly léze proliferativní enteropathie, které byly nalezeny v částech zažívacího traktu odebraného při nekropsii tři týdny po testu. Šest z těchto sedmi vepřů mělo silně viditelné léze, tři měly mírný průjem • · · · dva týdny po testu. Pro testování „preventivní dávkovači strategie byly dvě další skupiny nakažených vepřů dávkovány orálně hydrochloridem valnemulinu v dávkách 25 ppm a 75 ppm, v tomto pořadí ( t.j. 1,25 mg/kg a 3,7 mg/kg) pomocí směsi podávané 2 dny před nakažením, které pokračovalo až do euthanazie. Pro testování „léčebné strategie byly dvě další skupiny nakažených vepřů dávkovány orálně valnemulinem při 25 ppm a 75 ppm pomocí ve směsi podávané sedm dní po nakažení, až do euthanasie.

Při nekropsii nebyly viditelné v částech střeva žádné léze proliferativní enteropathie u 3 ze 7 vepřů v preventivní skupině a u 5 ze 7 vepřů v léčebné skupině. Kontrolní vepři zůstaly normální. Proto valnemulin působí preventivně nebo léčebně při onemocněních velké části nakažených vepřů dokonce i při nízkých účinných dávkách léčiva.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě ileitidy vepřů spojené s infekcí Lawsonia intracelularis. Pro toto použití se bude samozřejmě účinné množství měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v denní dávce 1,5 mg/kg až 6,5 mg/kg hmotnosti zvířete, vhodně podávané v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně nebo libovolně v krmivu nebo vodě nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 10 mg až 1000 mg, s výhodou 15 mg až 500 mg, při podávání jednou nebo dvakrát denně.

Výhodné dávky v pitné vodě se pohybují mezi 0,001 až 0,05 % hmotnost/objem, zvláště 0,001 až 0,005 % a v krmivu 20 až 400 g/metrickou tunu, s výhodou 20 až 200 g/metrickou tunu.

• » · « • · • · · · • ·

E) Chronické respirační onemocnění a arthritida u drůbeže související s infekcí Mycoplasma gallisepticum

Infekce může být diagnostikována běžným způsobem, například testem na Mycoplasma gallisepticum, který je popsán ve veterinární příručce jako je Diseases of Poultry, 8 vyd. (1984), vyd. Hofstad a kol., Iowa State University Press, na stranách 196-198. Výhodná aktivita činidla podle předkládaného vynálezu při tomto použiti se určí například následujícím způsobem:

1. Aktivita in vitro: MIC

Antimikrobiální působení hydrochloridu valnemulinu se určí pomocí standardní sériové techniky mikroředšní ve srovnání s tylosinem (Tylan soluble) a hydrogenfumarátem tiamulinu.

12,8 mg testované sloučeniny se rozpustí v 100 ml destilované vody za získání zásobního roztoku, který se skladuje před použitím při -20 °C. Použitými referenčními kmeny Mycoplasma gallisepticum jsou X95, S6 Holland, S6 Bench (Anglie), MS-16 (Japonsko), MK-7 (Japonsko) a 1226 a různé čerstvé polní izoláty.

Citlivost kmenů na antibiotika se testovala za použití modifikovaného postupu „mikrobujónového ředění (Stipkovits a kol., Vet. Microbiol. 15 [1987] 65-70). Za použití dvojnásobného zředění antibiotika se testovací médium přidalo (100 μΐ) do každé jamky mikrotitrační desky. Inokulum (100 μΐ) obsahuje 10⁵ cfu/ml. Desky se utěsní izolepou a inkubují se tři dny při 37 °C. Nejnižší koncentrace antibiotika, která působí kompletně preventivně na barevnou změnu média ve třetím dnu odečítání je minimální inhibiční koncentrace (MIC). U jamek bez barevné změny se kontroluje životaschopnost mykoplasmy jejím přenesením na agar. Všechny kmeny mykoplasmy se kultivují v 10 ml média B (Erno H. a Stipkovits L. , Acta Vet. Scand. 14 • · · · ·· ·«

A ♦ · · * · · • * · · · ·» · • · 9 · · • · · ··· · · • · · · r ««··«·· » · 9 9 [1973] 436-449) . Po inkubaci při 37 °C do časné logaritmické fáze růstu, se 1 ml alikvotní díly kultury rozdělí do zkumavek jako očkovací kultury a skladují se při -20 °C. Kmeny Mycoplasmy fermentující glukózu se testují v modifikovaném médiu Bg doplněném 1 % glukózy (pH 7,8), kmeny hydrolyzující arginin v médiu Ba (Erno H. a Stipkovits L. , výše, 450-463) obsahujícím 1 % argininu (pH 7,3) a kmeny negativní na arginin a glukózu v médiu B obsahujícím 1 % trifenyltetrazoliumchloridu.

Vypočtou se střední hodnoty MIC pro různé skupiny kmenů a antibiotik s ohledem na zředění.

Hodnoty hodnoty

MIC referenčních kmenů jsou uvedeny MIC izolátú Mycoplasmy v tabulce 9:

v tabulce

8,

Tabulka 8

Hodnoty MIC referenčních kmenů Mycoplasma gall isepticum (pg/ml)

Kmeny	Valnemulin (ch)	Tiamulin (hfu)	Tylosin
Bench	0,0312	0,0312	0,0312
Holland	0,0312	0,0312	0,0312
MK-7	0,0078	0,0312	0,0312
MS-16	0,0312	0,0312	0,0312
1226	0,0312	0,25	0,0312
ch = hydrochlorid	hfu = hydrogenfumarát

·«·· *· • · • *· ·» ·· • · · · « · l· Ί • « » · · • ···*-» · * * · ► r <···«·· · · ··

Tabulka 9

Hodnoty MIC	izolátů mycoplasmy	drůbežího	původu
Izolát	Valnemulin (ch)	Tiamulin (	hfu)	Tylosin
20002	0,0625	0,25		0,25
20006	0,0625	0,0625		0,25
20008	0,0625	0,0625		0,0625
20174	0,0625	0,25		0,25
20175	0,0625	0,5		2,0
20176	0,0625	0,25		2 , 0
20177	0,0625	0,25		1,0
20178	0,0625	0,5		2,0
20224	0,0312	1,0		4,0
20312	0,0312	0,25		4,0
20321	0,0312	0,0312		0,5
20472	0,0312	1,0		16,0
20473	0,0312	0,5		32,0
20474	0,0312	1,0		16,0
20475	0,0312	0,5		32,0

Výsledky získané s referenčními kmeny mykoplasmy ukazují, že tři sloučeniny vykazují více méně stejný rozsah působení. Hodnoty MIC ptačích polních izolátů avšak odrážejí zřetelný rozdíl mezi testovanými sloučeninami: ukázala jednotně vysoká citlivost proti valnemulinu (0,03 až 0,06 pg/ml), citlivost proti tiamulinu je trochu nižší (0,06 až 1 pg/ml) a na tylosin jsou kmeny dokonce netečné (0,06-32 pg/ml).

. Studie vyvolání odezvy

2.1 Prevence:

Skupiny samců kuřat se nakazí virulentním kmenem Mycoplasma gallisepticum (MG) a každá skupina se medikuje v tomto pořadí následujícím způsobem: valnemulin (koncentrace 0,00312, 0,00625, 0,0125 a 0,025 %), tiamulin (0,00625, 0,0125 a 0,025 %) a tylosin (0,05 %). Infekce se provede ve dni 2 pomocí injekce 0,1 ml kultury Mycolasma gallisepticum obsahující • · · · · * · · · * v · · · · · · přibližně 10⁶ cfu životaschopných organismů do každé plíce (Jordán F. T. W., The Veterinary Record 127 [1990] 502) a medikace se zahájí v hodině infekce a pokračuje tři následující dny. Také se sleduje infikovaná neléčená skupina a nenakažená skupina.

Získané výsledky ukazují, že prevence klinických příznaků a mortalita byly dostatečně uspokojivé pro skupiny léčené dvěma vyššími dávkami valnemulinu (0,0125 a 0,025 %), třemi dávkami tiamulinu a koncentrací tylosinu. Léze byly pozorovány u méně kuřat a byly méně závažné s tylosinem, potom s tiamulinem a potom s dvěma vyššími dávkami valnemulinu (0,0125 a 0,025 %) . Dvě nižší dávky valnemulinu byly v tomto ohledu méně účinné. Největší přírůstek hmotnosti byl u skupin medikovaných tylosinem; dále, ale výrazně nižší (p<0,05), byl u skupiny neinfikovaných ptáků, potom u tiamulinové skupiny a valnemulinové skupiny, ale při nej nižších dávkách. Nej nižšího přírůstku hmotnosti bylo dosaženo se skupinou medikovanou nejnižší dávkou valnemulinu a infikovanou a neléčenou skupinou, ale nebyl mezi nimi velký rozdíl. MG nebyla znovu získána během života nebo nekropsie z nenakažené skupiny, kuřat ze skupiny s nejvyššími dávkami tiamulinu a tylosinu a byla izolována pouze u jednoho ptáka ze skupiny léčené nej vyšší dávkou valnemulinu. U všech ostatních nakažených skupin bylo dosaženo vyššího podílu izolací. Serologické výsledky nejsou v tomto ohledu dokonalé, protože byl v této skupině relativně vysoký podíl pozitivních reakci.

Zjistilo se tedy, že dvě vyšší dávky valnemulinu jsou účinné stejně jako referenční sloučeniny při prevenci infekce Mycoplasma gallisepticum u mladých kuřat.

2.2. Léčba:

Skupiny samců kuřat se nakazí virulentním kmenem Mycoplasma gallisepticum (MG) a každá skupina se medikuje v tomto pořadí • · · · valnemulinem při koncentraci 0,0125 %, 0,025 %, 0,05 %, tiamulinem při stejných koncentracích, tylosinem při koncentraci 0,05 % a kombinací lincospectin-spectinomycin (Linco-Spectin) při koncentraci 0,083 %. Byla také vytvořena jedna infikovaná neléčená skupina a neinfikovaná skupina. Kuřata se nakazí ve druhém dni věku pomocí injekce 3,4xlO^s organismu do každé plíce. Medikace pomocí pitné vody se zahájila o 24 hodin později a následovala další 3 dny kromě Linco-Spectinu, u kterého trvala léčba 5 dní.

Získané výsledky ukázaly, že kontrola mortality, nižší než 5 %, je nej lepší se všemi třemi koncentracemi valnemulinu a s tiamulinem při koncentraci 0,05 %. Léze nebyly pozorovány u kuřat léčených nejvyššími a nejnižšími dávkami valnemulinu a pouze u několika kuřat léčených tiamulinem a tylosinem. Přírůstek hmotnosti pro skupiny léčené valnemulinem při všech koncentracích byl vyšší, než pro skupiny léčené tiamulinem a stejný pro skupinu léčenou tylosinem. Mycoplasma nebyla znovu získána při ukončení experimentu po 23 dnech z 3 skupin ptáků dostávajících valnemulin a tiamulin. Ze současně provedených serologických testů je zřejmé, že ve všech nakažených skupinách byly nějaké pozitivní reakce.

S ohledem na mortalitu, přírůstek hmotnosti, izolaci MG a výsledky aglutinačního testu séra, dvě vyšší dávky (0,025 % a 0,05 %) valnemulinu podávaného v pitné vodě poskytují nejméně stejně dobré nebo lepší než tiamulin při 0,05 % nebo tylosin při 0,05 % a daleko lepší než Linco-Spectin.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě chronického respiračního onemocnění a arthritidy u drůbeže spojené s infekcí Mycoplasma gallisepticum. Pro toto použití se bude samozřejmě účinné množství měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude • · • · · • · · • · · • · * • · · · podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v pitné vodě v dávkách 0,005 až 0,05 % hmotnost/objem, vhodně 0,01 až 0,03 % a v krmivu 20 až 400 g/metrickou tunu, s výhodou 20 až 200 g/metrickou tunu.

F) Sekundární infekce Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus)pleuropneumoniae a/nebo infekcí Haemophilus parasuis

Sekundární infekce Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus)pleuropneumoniae a/nebo infekcí Haemophilus parasuis může být diagnostikována běžným způsobem, například jak je popsáno ve veterinární příručce jako je Taylor D. J., Pigs Diseases, šesté vydání, (1195), vyd. D. J. Taylor, Glasgow, VB, na stranách 185-187; 188-194 a 194-197. Výhodné působení činidla podle předkládaného vynálezu se určí například následujícím způsobem:

Určí se minimální inhibiční koncentrace (MIC) hydrochloridu valnemulinu Haemophilus pocházej ícím s tiamulinem

Pasteurella multocida,

Haemophilus parasuis vepřů a porovná se bakteriálních izolátů proti novým izolátům pleuropneumoniae a z dýchacího ústrojí Použijí se kultury obsahující 10 P. multocida, 10 H. pleuropneumoniae a 3 H. parasuis izolované v posledních 5 letech z nemocných vepřů, na kterých se prováděly posmrtné testy. Tři z izolátů Pasteurella byly toxigenní kmeny Pasteurella multocida. Pro H. pleuropneumoniae a H. parasuis bylo jeden den před testováním jedno očko každé čisté kultury inokulováno do 10 Ml bujónu Todd & Hewitt (Unipath CM 190) obsahujícího 1 % donorního hovězího séra a 2 mg na ml nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) . Pro P. multocida bylo v den testování jedno očko každé čisté kultury naočkováno do 10 ml živného bujónu č. 2 (Unipath CM67) obsahujícího 1 % donorního hovězího séra. Každý z připravených • · · ·

kultivačních bujónů se inkubuje 18 hodin při 37 °C v 10 % oxidu uhličitého. Po inkubaci a v den testu se u 23 kultivačních bujónů sníží pomocí fyziologického solného roztoku počet organismů v prostředku pro inokulaci MIC kultivačního média na 10⁵-10^s na ml. Aby se ověřily výsledky testu MIC, ustanoví se pro každou testovanou sloučeninu standardní kontrolní kultury z Oxford Staphylococcus aureus NCTC 6571. V každém případě kultura bujónu získaná z kontrolních organismů je identická jako kultura z testovaných organismů. Valnemulin je hydrochlorid, tiamulin se použije jako hydrogenfumarát. V den testování se v destilované vodě připraví zásobní roztoky testovaných sloučenin obsahující 3,2 mg/ml aktivní složky. Devět dvojnásobných zředění se potom dále připraví ve sterilní destilované vodě za získání rozmezí 320 pg až 1,25 pg na ml každého antibiotika pro přidání do MIC média. Citlivý agar (Oxoid CM409) obsahující lyžovanou koňskou krev (Oxoid SR50) se připraví podle doporučeni výrobce a pokud je to nutné, pH se upraví na 7,4. Pro všechny šarže MIC média připraveného pro testy MIC proti dvěma druhům Haemophilu se pro dosažení potřebného růstového faktoru přidají 2 mg NAD na ml. 18 ml rozehřátého agaru (50 °C) se smísí s 2 ml (jeden v deseti zředěních) každého připraveného zředění testované sloučeniny v 90 mm Petriho miskách. Z každého zředění se připraví 4 kopie zředění. Pro každý test MIC se také připraví 4 kopie desek obsahujících 18 ml agaru a 2 ml sterilní destilované vody, pomocí kterých se indikuje růst.

Sušené MIC desky se inokulují 0,2 μΐ připravených testovaných organismů, ty, které se inokulují P. multocida se inkubují na vzduchu při 37 °C 18 hodin a ty, které se inokulují H. pleuropneumoniae a H. parasuis se inkubují při 37 °C 18 hodin v 10 % oxidu uhličitého. Po inokulaci se růst organismů testuje nejprve vizuálně a potom mikroskopicky pomocí „stereo zoom ' mikroskopu. Hodnoty MIC jsou uvedeny jako nejnížší koncentrace • · testované sloučeniny, při chvíli inokulace na mikroskopického pozorování které se nedetekuje žádný růst ve všech čtyřech deskách pomocí

Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 10:

Tabulka 10

Hodnoty MIC ^g/ml)

Pathogen Sloučenina

Valnemulin (ch) Tiamulin (hfu)

Pasteurella multocida

Rozmezí		2,0-8,0	4,0-16
Průměr		3 , 8	9,2
Haemoohilus	pleuropneumoniae
Rozmezí		0,125-4,0	0,125-16
Průměr		0,85	4,5
Haemophilus	oarasuis
Rozmezí		0,25	0,5-1,0
Průměr		0,25	0,7

ch = hydrochlorid hfu = hydrogenfumarát

Zjistilo se tedy, že valnemulin ve srovnání s tiamulinem má střední aktivitu proti P. multocida dvaapůlkrát vyšší, pětapůlkrát vyšší aktivitu proti H. pleuropneumoniae a třikrát vyšší aktivitu proti H. parasuis.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě sekundární pneumónie vepřů spojené s infekcí Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae a/nebo Haemophillus parasuis. Pro toto použití se bude samozřejmě účinné množství měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v denní dávce 5 mg/kg až 15 mg/kg hmotnosti zvířete, vhodně podávané libovolně v krmivu nebo vodě nebo v rozdělených • · dávkách dvakrát až čtyřikrát denně nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 100 mg až 1000 mg, s výhodou 100 mg až 500 mg, při podávání jednou nebo dvakrát denně.

S výhodou může být sloučenina podávána v samostatné terapii.

Výhodné dávky v pitné vodě se pohybují mezi 0,01 až 0,5 % hmotnost/objem, s výhodou 0,01 až 0,02 5 % a v krmivu 100 až 400 ppm (g/metrická tuna), s výhodou 100 až 200 ppm.

G) Pneumonie u jehňat, ovcí a hovězího dobytka souvisej ící s infekcí Pasteurella haemolytica

Infekce Pasteurella haemolytica může být diagnostikována běžným způsobem, například jak je popsáno ve veterinární příručce jako je Veterinary Medicine, osmé vydání (1994), vyd. Radostits O. M. Blood D. C. a Gay C. C., publ. Bailliere Tindal, londýn, VB, na stranách 748-770. Výhodná aktivita sloučeniny podle předkládaného vynálezu při tomto použití může být prokázána například následujícím způsobem:

Klinická účinnost se určí u dvou prostředků hydrochloridu valnemulinu při léčbě pneumonie u telat způsobené kontrolovanou nákazou Pasteurella haemolytica AI:

Ve dni -6 se 24 telat, u kterých byl proveden nosní výtěr a bylo prokázáno, že nemají P. haemolytica AI, zvážilo a rozdělilo do čtyř léčebných skupin po šesti. Skupiny byly vyvážené podle tělesné hmotnosti a podle pohlaví. Telata se umístila do jednotlivých ohrad v běžné chovné jednotce pro telata, kde se aklimatizovala 33 dní před rozdělením. Krevní vzorky byly v období před testem odebírány dvakrát a analyzovaly se leukotoxinové protilátky jako možný indikátor předchozího vystavení P. haemolytica AI.

Léčba byla zahájena ve dni -1, asi 27 hodin před nakažením:

Skupina	1 - kontrolní;
Skupina	2 - hydrochlorid	valnemulinu	2,5 %	inj ekčně (2,5	mg/kg
dvakrát	denně;
Skupina	3 - hydrochlorid	valnemulinu	10 %	orálně pomocí	mléka
(5,0 mg/	kg dvakrát denně)	/

Všechna telata byla nakažena ve dni 0 pomoci endobronchiálního nanesení 30 ml bujónu kultury Pasteurella haemolytica AI (M4/1/3, Moredun Research Institute - l,25xl0⁷ cfu/ml) za použití vláknového optického bronchoskopu. Klinická pozorování se prováděla jednou denně ve dnech -3 a -2 a dvakrát denně od dně -1 do dne 3 . Klinické stavy byly rozděleny podle čtyř parametrů: rektální teplota, rychlost dýchání, povaha dýchání a chování. Injekční místa byla také testována. Všem telatům, která ležela a/nebo vykazovala depresi a/nebo známky dýchacích obtíží, nebo která měla celkové klinické skóre vyšší než 5 při jednom testování mezi dny 0 až 3, byla z humánních důvodů okamžitě poskytnuta euthanasie pomocí nitrožilního podání letální dávky sodné soli pentabarbitonu BP(Vet) 20 % hmotnost/objem a nekropsie byla provedena během 24 hodin. Telatům, která přežila do dne 4 po nakažení P. haemolytica, byla podána euthanasie ve dni 4 stejným způsobem, jako bylo popsáno pro dny 0 až 3 . Všem telatům byly vyjmuty plíce a testovaly se vizuálně na sloučené léze a pleuritickou adhezi. Z osmi standardních míst byly vyříznuty vzorky plicní tkáně a testovaly se na přítomnost P. haemolytica, aby se určily hodnoty pro index izolace. Telatům, která právě zemřela, byly odebrány výtěry krve ze srdce a byly testovány na přítomnost P. haemolytica.

Jednotlivá telata a součty skupin, průměry skupin a středy skupin se vypočetly pro všechny následující parametry: celkové klinické skóre, skóre sloučených lézí, index izolace, skóre pohrudnice a celkové skóre. Jednotlivá telata a součty skupin, průměry skupin a středy skupin se vypočetly pro všechny kategorie tvořící celkové klinické skóre: rektální teplota, rychlost dýchání, povaha dýchání a chování. Pro určení, zda je rozdíl mezi jakýmkoli skóre skupin pro všechny parametry se použila základní analýza podle Kruskal-Wallisova testu (Minitab

9): celkové klinické skóre, skóre sloučených lézí, index izolace, skóre pohrudnice a celkové skóre. Kruskal-Wallisův test ukazuje, že skupiny nejsou ani všechny stejné, ani každá jiná. Pro zjištění, které skupiny jsou různé, se páry skupin testovaly za použití Mann-Whitneyova testu (Minitab 9).

Pro srovnání s neléčenými telaty (skupina 1), celkové klinické skóre (p=0,013) se ukázalo být významně nižší u telat, která byla léčena valnemulinem při 10 % ve směsi při 5,0 mg/kg/dávku dvakrát denně orálně pomocí mléka 5 dní, přičemž se léčba zahájila 27 hodin před nakažením P. haemolytica AI.

Celkové klinické skóre bylo také sníženo, ale statisticky ne významně, u telat léčených intramuskulárnš valnemulinem 2,5 % injekčnš při 2,5 mg/kg/dávku dvakrát denně 5 dní, přičemž se léčba zahájila 27 hodin před nakažením P. haemolytica AI.

Když se porovná celkové klinické skóre, neexistovaly žádné významné rozdíly mezi léčenými skupinami.

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě pneumonie u jehňat, ovcí a dobytka spojené s infekcí Pasteurella haemolytica. Pro toto použití se bude samozřejmě účinné množství měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v denní dávce 5 mg/kg až 15 mg/kg hmotnosti zvířete, vhodně podávané libovolně v krmivu nebo v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro • 3 většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 250 mg až 3000 mg, s výhodou 250 mg až 1000 mg, při podávání jednou nebo dvakrát denně nebo při podávání libovolně v krmivu.

H) Polyarthritida u vepřů související s infekcí Mycoplasma hyosynoviae

Infekce Mycoplasma hyosynoviae může být diagnostikována běžným způsobem, například jak je popsáno ve veterinárních příručkách jako je Taylor D. J., Pig Diseases, šesté vydání (1995), vyd. Taylot D. J., Glasgow, VB, strany 172-173. Výhodná aktivita činidla podle předkládaného vynálezu pro toto použití může být určena například pomocí následujících testů:

1. Aktivita u tkáňových izolátů in vitro (MIC test):

Vzorky tkání se získají z plic vepřů z různých skupin napadených enzootickou pneumonií (EPP). Vzorky pro kultivaci se umístí na suchý led. Čtyři izoláty z plicních vzorků původně izolovaných pro opětovné získání Mycoplasma hyopneumoniae se znovu izolovaly pro Mycoplasma hyosynoviae, po čemž bylo z uvedených plicních vzorků zjištěno(znovu skladovaných při -70 °C) během kultivace M. hyopneumoniae, že některé vzorky poskytly hojný růst kolonií s typickou morfologií Mycoplasma hyosynoviae. Z jiných plicních vzorků byly znovu získány tři další izoláty. Všechny izoláty byly serologicky identifikovány pomocí diskové inhibice růstu pomocí specifického králičího antiséra proti Mycoplasma hyosynoviae. Pro izolaci M. hyosynoviae z plicní tkáně se použije komerčně dostupné pevné médium (Mycoplasma Experienc e Ltd.). Pro MIC test se použije kapalné médium (Mycoplasma Experience Ltd.) obsahující fenolovou červeň a arginin (pH 7,0).

Zásobní roztoky testované sloučeniny se připraví při koncentraci 1 mg/ml v deionisované vodě, sterilizují se filtrací přes filtrační membránu o velikosti póru 0,2 μ (Sartorius Minisart, N) a skladují se při -20 °C. Pro použití při MIC testech se zásobná roztoky zředí v kapalném médiu na dvojnásobek konečné požadované koncentrace. MIC testy se provádějí podle způsobu Tanner a Wu, Avian Diseases 36, (1992) 714-717. Aktivně rostoucí nakažené kultury se připraví bud' z 1 ml alikvotních dílů bujónů kultur skladovaných při -70 °C nebo z kultur skladovaných na agaru při -70 °C. Nakažené kultury se zředí na získání cílového titru 10³ až 10⁵ jednotek měnících barvu/ml. 0,1 ml alikvotní díly nakaženého inokula se na mikrotitrační desce smísí s 0,1 ml alikvotních dílů roztoku antibiotika. Každá mikrotitrační deska obsahuje neinokulované médium o pH 7,6 (kontrola konce testu) a inokulovanou nakaženou kontrolu bez antibiotika. Všechny desky se uzavřou přilnavým filmem a aerobně se inkubuj í při 36 °C. MIC se zaznamenají, když barevná změna v kontrolních nakažených jamkách je stejná jako pH kontroly konce testu. MIC je nejnižší koncentrace nevykazující žádnou barevnou změnu.

Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 11 pro hydrochlorid valnemulinu a dvě referenční sloučeniny, hydrogenfumarát tiamulinu a enrofloxacin:

Tabulka 11

In vitro citlivost 7 polních izolátů Mycoplasma hyosynoviae

Sloučenina		Rozmezí MIC ^g/ml)
Hydrochlorid	valnemulinu	0,0001-0,0005
Hydrogenfumarát tiamulinu	0,0025-0,025
Enrofloxacin		0,025-0,25
Citlivosti	sedmi polních	izolátů Mycoplasma	hyosynoviae	na
valnemulin	jsou dalek vyšší	než na ostatní dvě	sloučeniny,	což
naznačuj e,	že nové polní	izoláty jsou extrémně citlivé	na
valnemulin

• · · · • ·

Činidlo podle předkládaného vynálezu je tedy vhodné při léčbě polyarthritidy u vepřů spojené s infekcí Mycoplasma hyosynoviae. Pro toto použití se bude samozřejmě účinné množství měnit v závislosti na konkrétní použité soli, způsobu podávání, velikosti a věku zvířete a na požadovaném účinku; například pro profylaktickou léčbu se bude podávat relativně malé množství dlouhou dobu. Avšak obecně bylo dosaženo uspokojivých výsledků, když se činidlo podávalo v denní dávce 5 mg/kg až 15 mg/kg hmotnosti zvířete, vhodně podávané ve vodě nebo v krmivu nebo v rozdělených dávkách dvakrát až čtyřikrát denně nebo ve formě s pomalým uvolňováním. Pro většinu zvířat se celková denní dávka pohybuje mezi 100 mg až 1000 mg, s výhodou 10 0 mg až 500 mg, při podávání jednou nebo dvakrát denně.

Sloučenina může být s výhodou podávána v samostatné terapii. Výhodné dávky v pitné vodě jsou 0,01 až 0,05 / hmotnost/objem, zvláště 0,01 až 0,025 % a v krmivu 100 až 400 ppm (g/metrickou tunu), zvláště 100 až 200 ppm (g/metrickou tunu).

Pro všechna využití může být sloučenina použita ve formě volné báze nebo ve formě veterinárně přijatelné soli, například kvarterní soli, nebo, zejména, ve formě kyselé adiční soli. Tyto formy solí mají stejnou aktivitu jako forma volné báze. Příklady vhodných kyselých adičních solí jsou hydrogenfumarát, fumarát, naftalen-1,5-sulfonát a zejména hydrochlorid.

Činidla podle předkládaného vynálezu mohou být podávána orálně, místně nebo parenterálně a ve směsi s běžně chemoterapeuticky přijatelnými ředidly a nosiči a, popřípadě, jinými přísadami a mohou být podávána ve formě tablet, tobolek nebo prostředků pro injekční podávání. Také tvoří vynikající přísady pro krmné směsi (předem připravené) nebo je možné je přidávat do pitné vody.

• · · · • · «► · · • · I» · • · I» · · • · · '» · • · · · · ·

Mezi výhodné veterinárně přijatelné nosiče patří například běžně používané farmaceutické přísady jako je cukr, kukuřičný škrob, laktóza, celulóza, stejně jako nosné systémy ze zrní a vedlejších produktů ze zrní jako rýžové slupky, pšeničné zbytky a sojová moučka; dále pevná ředidla, jako je vápenec, síran sodný, uhličitan vápenatý a kaolin, nebo kapalné látky, jako veterinárně přijatelné oleje (rostlinné oleje nebo minerální oleje), propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodně se tyto prostředky podávají zvířatům orálně, s výhodou ve směsi s krmivém ve formě medikované moučky nebo medikované píce.

Pro podávání v pitné vodě se použijí roztoky ve vodě s nebo bez rozpouštědel, jako jsou ethanol, propylenglykol, polyethylenglykol, osvědčené povrchově aktivní látky a sorbitol.

Například pro mezisvalovou injekci se prostředek typicky připraví jako roztok ve vodě, který může obsahovat rozpouštědla, jako je ethanol nebo propylenglykol nebo ve veterinárně přijatelném oleji. Příklady přijatelných olejů jsou sesamový olej, triglýceridy se středním řetězcem (například Miglyol), isopropyl myristát a ethyloleát. Prostředky mohou obsahovat konzervační látky, pufry a jiné běžné přísady.

Veterinární prostředky pro použití podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny smísením složek v příslušných poměrech. Přistředky se potom balí do vhodných nádob vhodných pro podávání.

* Předkládaný vynález ilustruje následující příklad:

Složka	Množství (g/100 μΐ)
	hydrochlorid valnemulinu	10,0
	fenol	0,5
	Miglyol 840	do 100 ml

» ·

Činidlo podle předkládaného vynálezu je dobře snášenlivé. Akutní toxicita sloučeniny obecného vzorce I ve formě hydrochloridu u krys byla určena při jednotlivé dávce 1000 mg/kg a 2000 mg/kg při orálním podávání 5 samcům a 5 samicím krys ve skupině. K úmrtí došlo za 1-8 dní. Hodnota LD_S0 je >1000 mg/kg p.o.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití sloučeniny obecného vzorce I ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli pro léčbu veterinárních onemocnění, jejichž exprese je zvýšena rostoucí hustotou chovu.
2. 2. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě enzootické pneumonie u vepřů způsobené infekcí Mycoplasma hyopneumoniae.
3. 3. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě kolitidy vepřů spojené s infekcí Serpulina pilosicoli.

   . Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě ileitidy vepřů spojené s infekcí Lawsonia intracellularis.
4. 5. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě chronického dýchacího onemocnění a arthritidy u drůbeže spojeného s infekcí Mycoplasma gallisepticum.

   • · · ·
5. 6. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě sekundární infekce infekcemi Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus)pleuromoniae a/nebo Haemophilus parasuis.
6. 7. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě pneumonie u jehňat, ovcí a hovězího dobytka spojené s infekcí Pasteurella haemolytica.
7. 8. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 ve formě volné báze nebo veterinárně přijatelné soli při léčbě polyarthritidy vepřů spojené s infekcí Mycoplasma hyosynoviae.
8. 9. Použití podle nároku 1 až 8 sloučeniny obecného vzorce I ve formě hydrochloridové kyselé adiční soli.
9. 10. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 9 pro přípravu léčiva pro použití při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese je zvýšena vzrůstem hustoty chovu.
10. 11. Způsob léčby veterinárních onemocnění, jejichž exprese je zvýšena vzrůstem hustoty chovu, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 9 vepřům v případě, že takovou léčbu potřebují.
11. 12. Veterinární činidlo pro použití při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese je zvýšena vzrůstem hustoty chovu, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 9 společně s nejméně jedním veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.

    . Způsob přípravy léčiva pro použití při léčbě veterinárních onemocnění, jejichž exprese je zvýšena vzrůstem hustoty chovu, vyznačující se tím, že zahrnuje smísení • · sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 9 s nejméně jedním veterinárně přijatelným nosičem nebo ředidlem.