PL189174B1 - Zastosowanie kompozycji zawierającej biologiczniezgodną macierz do pobudzania wzrostu naczyń i zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do hamowania tworzenia się naczyń - Google Patents

Zastosowanie kompozycji zawierającej biologiczniezgodną macierz do pobudzania wzrostu naczyń i zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do hamowania tworzenia się naczyń

Info

Publication number
PL189174B1
PL189174B1 PL97343864A PL34386497A PL189174B1 PL 189174 B1 PL189174 B1 PL 189174B1 PL 97343864 A PL97343864 A PL 97343864A PL 34386497 A PL34386497 A PL 34386497A PL 189174 B1 PL189174 B1 PL 189174B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
cells
gene
proteins
matrix
Prior art date
Application number
PL97343864A
Other languages
English (en)
Other versions
PL343864A1 (en
Inventor
Steven A. Goldstein
Jeffrey Bonadio
Original Assignee
Univ Michigan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24530760&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL189174(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Michigan filed Critical Univ Michigan
Publication of PL343864A1 publication Critical patent/PL343864A1/xx
Publication of PL189174B1 publication Critical patent/PL189174B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6953—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a fibre, a textile, a slab or a sheet
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

1. Zastosowanie kompozycji zawierajacej biologicznie zgodna macierz zawierajaca jed- na lub wiecej czasteczek DNA kodujacych polipeptydy o aktywnosci stymulujacej rozrost naczyn, czasteczki antysensowne lub rybozymowe do wytwarzania leku do pobudzania two- rzenia sie naczyn krwionosnych, przy czym macierz ta dziala jako rusztowanie promujace przenikanie komórek. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz zawierającą jedną lub więcej cząsteczek DNA kodujących polipeptydy o aktywności stymulującej rozrost naczyń, cząsteczki antysensowne lub rybozymowe do wytwarzania leku do pobudzania tworzenia się naczyń krwionośnych, przy czym macierz ta działa jako rusztowanie promujące przenikanie komórek.
W wynalazku, korzystnie co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje czynnik wzrostu lub cytokinę. Również korzystnie co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-1, (FGF)-2, czynnik wzrostu śródbłonkowych komórek naczyń (VEGF) lub płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF). W innym korzystneym wykonaniu wynalazku macierz stanowi kompozycja kolagenowa, metalowa, biodegradowalnego lub zdefiniowanego chemicznie siarczanu wapnia, trifosforanu wapnia, hydroksyapatytu, kwasu polimlekowego, polibezwodnikowa, szkła biologicznego, linianu, materiału bioceramicznego, materiału metalowego, biokompatabilngo i biodegradowalnego polimeru, oczyszczonych białek lub półoczyszczonych macierzy zewnątrzkomórkowych.
Korzystnie, wymienione komórki stanowią w wynalazku komórki śródbłonkowe naczyń. Także korzystnie komórkami są fibroblasty, komórki śródbłonkowe naczyń włosowatych, perycyty, jednojądrzaste komórki zapalne, segmentowe komórki zapalne, lub komórki tkanki ziarnistej.
Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz zawierającą jedną lub więcej cząsteczek DNA kodujących polipeptydy
189 174 o aktywności hamującej rozrost naczyń, cząsteczki antysensowne lub rybozymowe do wytwarzania leku do hamowania tworzenia się naczyń krwionośnych, przy czym macierz ta działa jako.rusztowanie promujące przenikanie komórek.
Korzystnie, w tym wynalazku co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje czynnik antyangiogeniczny.
Korzystnie czynnikiem anty-angiogenicznym może być kodowana przez cząsteczkę DNA trombospodyna, TGF-β lub angiostatyna.
Korzystnie macierz może stanowić kompozycja kolagenowa, metalowa, biodegradowalnego lub zdefiniowanego chemicznie siarczanu wapnia, trifosforanu wapnia, hydroksyapatytu, kwasu polimlekowego, polibezwodnikowa, szkła biologicznego, glinianu, materiału bioceramicznego, materiału metalowego, biokompatabilngo i biodegradowalnego polimeru, oczyszczonych białek lub pół-oczyszczonych macierzy zewnątrzkomórkowych.
Korzystnie komórki mogą stanowić komórki śródbłonkowe naczyń. Bardziej korzystnie komórkami mogą być fibroblasty, komórki śródbłonkowe naczyń włosowatych, perycyty, jednojądrzaste komórki zapalne, segmentowe komórki zapalne, lub komórki tkanki ziarnistej.
W celu stymulacji naprawy twardych i miękkich tkanek i regeneracji tkanek, można stosować transfer DNA do komórek naprawczych ssaka poprzez dostarczanie układowe.
Komórki naprawcze będą tymi komórkami, które normalnie przybywają do obszaru leczonego zranienia. W związku z tym, nie ma trudności związanych z otrzymywaniem odpowiednich komórek docelowych, wobec których powinno się stosować niniejsze kompozycje terapeutyczne. Wszystko, czego się żąda to wszczepienie macierzy aktywowanej genowo do miejsca zranienia. Naturą tego biologicznego środowiska jest to, że odpowiednie komórki naprawcze będą aktywnie wchłaniać i wykazywać ekspresję „przynętowego” DNA przy nieobecności żadnego innego ukierunkowywania lub identyfikacji komórkowej przez osobę praktykującą.
Stosując zarówno macierze biologiczne jak i syntetyczne, można dokonać transferu DNA do komórek naprawczych ssaków, w celu stymulacji regeneracji szkieletu, a także w celu połączenia i naprawy ścięgna, oraz w celu stymulacji naprawy mięśni szkieletowych i/lub naprawy naczyń krwionośnych.
DNA stosowany w praktyce wynalazku może obejmować każdy DNA, kodujący produkty translacji (to jest białka) lub produkty transkrypcji (to jest nonsensowne lub rybozymowe), które pobudzają naprawę tkanek lub są zdolne do przerywania procesu chorobowego. Przykładowo, DNA może obejmować geny, kodujące białka użyteczne terapeutycznie, takie jak czynniki wzrostu, cytokiny, hormony, itd. Dodatkowo, DNA może kodować cząsteczki nonsensowne lub rybozymowe, które mogą hamować translację RNA, kodujących białka hamujące gojenie ran lub które indukują zapalenie.
DNA, kodujący produkt terapeutyczny o którym mowa, związany jest lub przesycony macierzą, tworząc macierz aktywowaną genowo. Raz utworzona, macierz aktywowana genowo znajduje się wewnątrz ssaka w miejscu zranienia.
Wynalazek pokazuje się drogą przykładów, w których ukazuje się skuteczność transferu in vivo i ekspresję genów w czasie odbywającej się naprawy i regeneracji tkanek.
3.1 Definicje
Tak jak się tu stosuje, następujące określenia będą posiadać znaczenia wskazane poniżej.
Macierz aktywowana genowo (GAM) określa się tutaj jako każdy materiał macierzy, zawierający DNA, kodujący czynnik terapeutyczny, o którym mowa. Przykładowo, macierze aktywowane genowo umiejscowione są wewnątrz miejsc zranienia w organizmie gospodarza, którym jest ssak, wzmagając gojenie ran.
Komórkę naprawczą określa się tutaj jako każdą komórkę, stymulowaną do migracji i proliferacji w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki. Komórki naprawcze są składnikiem odpowiedzi gojenia się rany. Komórki takie obejmują fibroblasty, komórki śródbłonka naczyń włoskowatych, pericyty naczyń włoskowatych, jednojądrzaste komórki zapalne, podzielone komórki zapalne, komórki ziaminowania tkanki.
Miejsce zranienia określa się tutaj jako każde miejsce w gospodarzu, które powstaje w wyniku urazowego uszkodzenia tkanki, albo alternatywnie, zniszczenia tkanki albo indukowanego przez, albo wynikającego z procedur chirurgicznych.
189 174
4. Opis rysunków
Figura 1A. Model nacięcia kości udowej braku łączenia włóknistego. Wytworzono chirurgiczne nacięcie kości o wielkości 5 mm u dorosłych odseparowanych samców szczurów rasy Sprague-Dawley. Odstępy tutaj ukazane są reprezentatywne dla całej grupy kontrolnej, gdzie gospodarz, będący ssakiem otrzymuje albo samo nacięcie kości (n=3), nacięcie kości plus gąbkę kolagenową (n=10) albo nacięcie plus gąbkę kolagenową, zawierającą DNA plazmidu kontrolnego (gen markerowy) (n=23). Zwykła błona rentgenowska, ukazująca kość udową szczura kontrolnego zaraz po operacji. Szczelinę stabilizowano przez utrwalenie zewnętrzne, składające się z płytki i 4 szpilek. Nacięcie skóry zamknięto metalową klamerką.
Figura 1B. Zwykła błona rentgenowska, ukazująca nacięcie kości udowej szczura kontrolnego 9 tygodni po operacji. Zaokrąglone brzegi rany operacyjnej (strzałki) spowodowało reaktywne tworzenie kości i są one zgodne z klasycznym ujawnieniem się złamania nie łączącego się.
Figura 1C. Przekrój histologiczny tkanki szczeliny 3 tygodnie po operacji, ukazujący proliferujące fibroblasty naprawcze i włośniczki osadzone w obrzękowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Obecny jest także naciek ogniskowy, składający się z limfocytów i makrofagów.
Figura 1D. Przekrój histologiczny z 9-tygodniowej szczeliny kontrolnej, ukazujący gęstą tkankę włóknistą. 1 cm = 20 μ (C i D).
Figura 2. Schematyczny diagram konstrukcji pGAMl, kodującej BMP-4 myszy. Ukazane są pozycje promotora CMV, sekwencji kodującej BMP-4, epitop HA oraz sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
Figura 3A. Ekspresja BMP-4 przez fibroblasty naprawcze. Ekspresję BMP-4 kodowaną przez plazmid wykrywano w utrwalonych metodą Bouinsa, demineralizowanych, osadzonych w parafinie przekrojach tkankowych, przy użyciu przeciwciała anty-HA i metody immunonadtlenkowej 4 tygodnie po wszczepieniu macierzy aktywowanej genowo, zawierającej DNA plazmidu pGAM1. Strzałki wskazują przykłady dodatniego (czerwono-brązowe) barwienia cytoplazmy fibroblastów (mikrografia w lewej górnej części). Komórki te zidentyfikowano jako fibroblasty na podstawie wrzecionowatej morfologii, wzrostu w wiązce oraz barwienia immunologicznego dodatniego dla prokolagenu typu I (nie ukazano). Seryjne skrawki inkubowane z króliczą surowicą przed-odpomościową lub bez, były ujemne. Ujemne wyniki otrzymano również dla kontroli operowanych w sposób udawany (sama gąbka kolagenowa) inkubowanych z przeciwciałem anty-HA. 11 (mikrografia w prawej górnej części). Fałszywie dodatnie barwienie makrofagów, osteoklastów i osteoblastów obserwowano także w przekrojach kontrolnych inkubowanych z przeciwciałem HA-11. Wysepkę nowo utworzonej kości 3 tygodnie po transferze pGAM1 ukazano na mikrografii w lewej dolnej części. Nowa kość wiąże się z tworzeniem tkanki ziarninowej. Widok dużej siły nowo utworzonej kości ukazuje się na mikrografii na dole, po prawej. Strzałki wskazują przypuszczalne osteoblasty na powierzchni beleczek nowej kości. Tkanki szczeliny zabarwiono przy użyciu hemotoksyliny i eozyny (górny mikrografia) lub metodą trójbarwną Gomori (tkanki bogate w kolagen ujawniają się jako zielone, niższe mikrografie). 1 cm = 20 mm (górne mikrografie).
Figura 3B. Wyraźna błona rentgenowska zwierzęcia (23 tygodnie po operacji). W radiografii ze zwykłą błoną (po lewej) strzałki wskazują przybliżoną pozycję szczeliny nacięcia, wypełnioną tkanką o gęstości radiologicznej. Należy zauważyć, że usunięto zewnętrzne usztywnienie. Jak wskazano przez barwne wzory, ma miejsce wtórne modelowanie kości. Główki strzałek wskazują defekty w kości sąsiadującej ze szczeliną (konsekwencja umieszczenia szpilki). Dwa dystalne miejsca szpilek zagoiły się całkowicie w tym czasie (nie ukazane). Cała górna część fotografii (po prawej) ukazuje przekrój tkankowy barwiony trójbarwną metodą Gomori, ze szczeliny ukazanego zwierzęcia (po uśmierceniu). Strzałki wskazują szczelinę, którą teraz pokrywa dobrze scalona kość korowa. Koliste defekty w przestrzeni szpiku (obie przestrzenie szczeliny) wynikają z umieszczenia wewnętrznych szpilek utrwalających. Przerwanie tkanki na dole mikrografii jest spowodowane uchwytem próbki.
Figura 4A. Schematyczny diagram konstrukcji pGAM2, kodującej ludzki PTH1-34. Ukazuje się pozycję powtórzenia o długim zakończeniu w kierunku do góry, które kieruje ekspresją PTH1-34 (strzałka), sekwencji kodującej PTH1-34, promotora SV40, który kieruje
189 174 nową ekspresją (strzałka), nowej sekwencji kodującej, sekwencji pBR oraz powtórzenia o długim zakończeniu w kierunku w dół.
Figura 4B. Transfer genu PTH1-34 i ekspresja kieruje tworzeniem się nowej kości in vivo. Zwykła błoną rentgenowska ukazująca łączenie nową kością szczeliny nacięcia o wielkości 5 mm 9 tygodni po wszczepieniu do zwierzęcia, które otrzymało macierz aktywowaną genowo, zawierającą DNA plazmidu pGAM2. Strzałki wskazują tkankę o gęstości radiologicznej w szczelinie. Wyniki tu ukazane są reprezentatywne dla doświadczeń z dodatkowym zwierzęciem.
Figura 5. Tworzenie się nowej kości in vivo przez GAM dwuplazmidową. (góra) Radiografia ze zwykłą błoną, ukazująca łączenie nową kością szczeliny o wielkości 5 mm, 4 tygodnie po wszczepieniu zwierzęciu, które otrzymało macierz aktywowaną genowo, zawierającą DNA plazmidu pGAM1 plus pGAM2. Strzałki wskazują tkankę o gęstości radiologicznej w szczelinie (potwierdzoną histologicznie, że jest kością), (dół) Radiografia ze zwykłą błoną szczeliny ukazanej w fotografii na górze, po usunięciu (5 tygodni wcześniej; całkowite 17 tygodni po operacji) usztywnienia zewnętrznego. Strzałki wskazują umiejscowienie szczeliny, którą jest wypełniona tkanką o gęstości radiologicznej z wyjątkiem prążka tkanki nie zdemineralizowanej obok proksymalnego brzegu rany. Jak wskazano dzięki różnobarwnym wzorom, ma miejsce odpowiedź wtórnego modelowania zewnętrznego. Wyniki tu ukazane są reprezentatywne dla doświadczeń z jednym dodatkowym zwierzęciem.
Figura 6. Transfer genu, w którym pośredniczy adenowirus do komórek naprawczych/regenerujących kość in vivo. Implant UltraFiber™ nasycano przez 6 minut w roztworze wirusa AdCMVlazZ (10I°-101 1 jednostek tworzących łysinki lub PFU/ml), a następnie wszczepiono do miejsca nacięcia kości. Ubytek pozostawiono do zagojenia przez 3 tygodnie, w czasie których monitorowano postęp odpowiedzi gojenia rany za pomocą co tygodniowego badania radiograficznego. Po trzech tygodniach oszacowano, że 40% ubytku zostało wypełnione tkanką bliznową. Ssaka-gospodarza uśmiercono i tkanki utrwalono przez utrwalenie Bouins i potem demineralizowano przez 7 dni przy użyciu standardowych roztworów kwasu mrówkowego. Otrzymano fotomikrografie z poprzecznych przekrojów nowej kości (blizna), która utworzyła się w miejscu nacięcia 3 tygodnie po operacji. Górna lewa tablica: należy zauważyć dodatnie (czerwone) barwienie cytoplazmatyczne β-gal komórek tkanki bliznowej z implantu adenowirusowego UltraFiber™. Wynik ten wskazuje, że receptory powierzchni komórkowej, pośredniczące w infekcji, a więc transdukcji wirusowej, podlegają ekspresji przez komórki bliznowe (co najmniej jedną populację) podczas procesu gojenia nacięcia. Górna lewa tablica: seryjne przekroje kontrolne zabarwione ujemnie nośnikiem przeciwciała β-gal plus mieszaniną niespecyficznych przeciwciał króliczych LgG. Tablica pod spodem: należy zauważyć dodatnie (czerwone) zabarwienie jąder β-gal chondrocytów w miejscu nacięcia kości wypełnionego UltraFiber™ i AdRSVlacZ. Wynik ten pokazuje doskonałą specyficzność przeciwciała anty-['S-gal i ukazuje ekspresję produktu genu markerowego w szczelinie nacięcia kości.
Figura 7. Transfer genu plazmidu pGAM2 do fibroblastów naprawczych daje w wyniku wzrost nowej kości w modelu nacięcia kości u szczura. Radiografia ze zwykłą błoną ukazująca łączenie nową kością szczeliny o wielkości 5 mm, 6 tygodni po wszczepieniu, u zwierzęcia, które otrzymało macierz aktywowaną genowo, zawierającą DNA plazmidu pGAMl plus pGAM2. Strzałki wskazują tkankę o gęstości radiologicznej w szczelinie (potwierdzoną histologicznie, że jest kością).
5. Szczegółowy opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu in vivo prezentacji i transferu DNA do komórek naprawczych ssaka, w celu ekspresji czynników terapeutycznych. Sposób według wynalazku obejmuje wszczepienie lub umieszczenie macierzy aktywowanych genowo w miejscu świeżego zranienia.
Gojenie rany jest zwykle koordynowaną, stereotypową sekwencją zdarzeń, które obejmują (a) przerwanie tkanki i utratę zwykłego ukształtowania tkanki; (b) nekrozę komórek i krwawienie; zatrzymanie krwawienia (tworzenie skrzepu); (c) przeniknięcie zapalnych komórek jednojądrzastych i podzielonych; przy przekrwieniu naczyń i obrzęku tkanki; (d) rozpuszczenie skrzepu jak również zniszczonych komórek i tkanek przez komórki jednojądrzaste
189 174 (makrofagi) (e) tworzenie tkanki ziarninowej (rozrost tkanki włókninowej i rozwój naczyń). Tę kolejność zdarzeń komórkowych obserwowano w ranach wszystkich tkanek i narządów utworzonych w wielkiej liczbie gatunków ssaków (Gailet i in., 1994, Cum Opin. Cell. Biol. 6: 717-725). Zatem, opisana wyżej sekwencja zdarzeń jest uniwersalnym aspektem naprawy wszystkich tkanek ssaków.
Wynalazek opiera się na spostrzeżeniu, że komórki naprawcze związane z procesem gojenia zranienia będą naturalnie proliferować i migorawać do miejsca uszkodzenia tkanki i przenikać macierz aktywowaną genowo. Niespodziewanie, te komórki naprawcze, które zwykle są trudne do skutecznej transfekcji zarówno ex vivo jak in vivo, niezwykle skutecznie wchłaniają i wykazują ekspresję DNA po aktywowaniu do proliferacji przez proces gojenia rany.
Z powodu tej korzystnej cechy, można dokonywać skutecznego transferu, jednej lub więcej cząsteczek DNA, kodującego czynniki terapeutyczne, do proliferujących komórek naprawczych. Podawanie macierzy aktywowanej genowo, zawierającej DNA, kodujący produkty translacji (to jest białka terapeutyczne) lub produkty transkrypcji (to jest nonsensowne lub rybozymowe) wewnątrz ssaka-gospodarza w miejscu zranienia. Rana może powstać w wyniku urazowego uszkodzenia tkanki lub alternatywnie, z powodu uszkodzenia tkanki indukowanego przez, lub wynikającego z procedur operacyjnych.
Jako, że proliferujące komórki naprawcze migrują i stykają się z macierzą aktywowaną genowo, wchłaniają i wykazują ekspresję interesującego DNA, zwiększają przez to ilość czynnika terapeutycznego, białka lub RNA. Transfekowane komórki naprawcze służą przez to jako miejscowe bioreaktory, wytwarzające czynniki terapeutyczne, które wpływają na lokalne środowisko naprawcze. Przykładowo, czynniki wzrostu lub cytokiny wytwarzane przez transfekowane komórki naprawcze, będą wiązać się i stymulować nacelowane komórki efektorowe, które wykazują ekspresję pokrewnych receptorów powierzchniowo-komórkowych, stymulując przez to i wzmacniając kaskadę zdarzeń fizjologicznych normalnie towarzyszącą procesowi gojenia rany.
Alternatywnie, komórki naprawcze mogą wchłaniać i wykazywać ekspresję DNA kodującego białka, które hamują aktywność antagonistów procesu gojenia rany. DNA może także kodować cząsteczki nonsensownego lub rybozymowego RNA, których można użyć do hamowania translacji mRNA, kodujących białka zapalne lub inne czynniki hamujące gojenie rany lub powodujące nadmierne włóknienie.
Macierz aktywowana genowo można przenosić do pacjenta przy użyciu różnych technik. Przykładowo, przy stymulacji gojenia i regeneracji rany, macierze przenosi się bezpośrednio do miejsca zranienia, to jest złamanej kości, uszkodzonej tkanki łącznej, itd. Do użytku w naprawianiu skóry, macierze będzie się podawać miejscowo. Do użytku w regeneracji organów, macierze będzie się umieszczać chirurgicznie w zranionym narządzie.
Ponieważ zastosowanie kompozycji według wynalazku opiera się o naturalną migrację i proliferację komórek naprawczych do miejsca zranienia oraz przenikaniu do macierzy aktywowanej genowo zlokalizowanej w miejscu zranienia, po którym następuje wchłanianie DNA, zrozumiałe jest, że macierze muszą być przeniesione do miejsca w organizmie, gdzie proces gojenia rany został indukowany.
Jedną szczególnie ważną cechą niniejszego wynalazku jest to, że proces naprawy można skonstruować tak, aby uzyskać albo tworzenie tkanki bliznowej i/lub regenerację tkanki. Przykładowo nadekspresja białek terapeutycznych w miejscu zranienia, może dawać w wyniku regenerację uszkodzonej tkanki bez utworzenia się blizny.
W wielu przypadkach np., takich jak naprawa kości, taka regeneracja jest pożądana ponieważ tkanka bliznowa nie jest przeznaczona do utrzymywania normalnych firnkcji mechanicznych. Alternatywnie, wokół szwu pożądane może być tworzenie tkanki bliznowej, do utrzymywania nieodłącznie słabej tkanki razem. Zatem, metody te można stosować do stymulacji gojenia rany albo z, albo bez tworzenia się tkanki bliznowej zależnie od rodzaju i poziomu ekspresji białka terapeutycznego.
Bezpośrednie przeniesienie DNA plazmidu z macierzy do komórek naprawczych ssaka poprzez stymulację procesu gojenia rany, oferuje liczne korzyści. Po pierwsze, łatwość wytwarzania i oczyszczania konstrukcji DNA wychodzi na korzyść wobec kosztów tradycyjnych metod wytwarzania białka. Po drugie, macierze mogą działać jako konstrukcje strukturalne,
189 174 które jako takie pobudzają wrastanie komórek i proliferację. Tak więc, ułatwiają one nacelowanie komórek naprawczych dla trasferu genowego. Po trzecie, bezpośredni transfer genu może być korzystną metodą dostarczania leku dla cząsteczek, które normalnie przechodzą kompleks procesów biosyntetycznych, lub dla receptorów, które muszą być prawidłowo ustawione w błonie komórkowej. Te typy cząsteczek będą nieprawidłowo pracować w przypadku zewnętrznego dostarczenia do komórek.
Kompozycji farmaceutycznych, obejmujących macierze, zawierające DNA można stosować do użytku w gojeniu ran. Kompozycje te składają się generalnie z biokompatybilnego lub kompatybilnego z kością materiału macierzy, zawierającej DNA, kodującego białka terapeutyczne, o których mowa.
Wynalazek omija niedogodności związane konkretnie z aktualnymi metodami leczenia białkami rekombinowanymi do stosowania w gojeniu zranień. Po pierwsze bezpośredni transfer genowy jest racjonalną strategią, która pozwala transfekowanym komórkom na (a) modyfikację fizjologicznych ilości białek terapeutycznych w sposób tkankowo- lub kontekstowospecyficzny oraz (b) dostarczenie tego białka do odpowiedniego receptora sygnalizującego na powierzchni komórki w odpowiednich okolicznościach. Z powodów opisanych powyżej, oczekuje się, że egzogeniczne dostarczanie takich cząsteczek, wiąże się ze znacznym dawkowaniem i problemami z dostarczeniem. Po drugie, powtarzalne podawanie chociaż możliwe, nie jest konieczne przy technologii macierzy aktywowanej genowo: wychwyt DNA przez komórkę można dokładnie kontrolować za pomocą dobrze opracowanych technologii dostarczania z przedłużonym uwalnianiem lub alternatywnie, integracja transfekowanego DNA może być związana z długoterminową ekspresją rekombinowanego białka.
Metody te można powszechnie stosować w ranach, które obejmują wiele różnych komórek, tkanek i narządów; komórki naprawcze tkanki ziaminowej (Gailet i in., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 717-725). Wynalazek przedstawia się tutaj w trzech modelach zwierzęcych (psim, szczurzym i króliczym) i pięciu tkankach (kości, ścięgna, łącznej, naczyń krwionośnych i mięśni szkieletowych), przy użyciu trzech genów markerowych ((β-galaktozydazy, lucyferazy i fosfatazy alkalicznej), trzech układów promotorowych (CMV, RSV, LTR i SV40), dwóch rodzajów macierzy (biologicznej i syntetycznej). We wszystkich przypadkach, komórki naprawcze, które migrowały do macierzy aktywowanej genowo, z powodzeniem transfekowano. W szczególności, przedstawiono funkcjonalny rezultat (wzrost kości), następujący po przeniesieniu genu do fibroblastów naprawczych konstrukcji plazmidowej, kodującej albo BMP-4, który działa jak włącznik transdukujący sygnał dla różnicowania się i wzrostu osteoblastów (Wozney 1992, Mol. Reprod. Dev. 32: 160-167; Reddi, 1994, Curr. Opin. Genet. Deve. 4: 737-744) albo PTH1-34, który pobudza kostne komórki rodzicielskie (Orloff, i in., 1992, Endocrinology 131: 1603-16111 Dempster i in., 1995 Endocrin Rev. 4: 247-250).
5.1 Macierz aktywowana genowo
Każdy biokomptabilny materiał macierzy, zawierający DNA, kodujący czynnik terapeutyczny, o którym mowa, taki jak produkt translacji to jest białka terapeutyczne lub produkt transkrypcji to jest nonsensowny lub rybozomowy, można układać i stosować zgodnie z wynalazkiem.
Macierze aktywowane genowo według wynalazku mogą pochodzić z każdego materiału biokompatybilnego. Takie materiały mogą obejmować, lecz bez ograniczania, ulegające lub nie ulegające biorozkładowi materiały, wchodzące w skład struktur, które podtrzymują przyleganie komórek i wzrost, proszki lub żele. Macierze można otrzymywać z syntetycznych polimerów lub naturalnie występujących białek, takich jak kolagen, inne białka macierzy zewnątrzkomórkowej lub inne makrocząsteczki strukturalne.
DNA włączony do macierzy może kodować każde z różnych białek terapeutycznych w zależności od zamierzonego zastosowania terapeutycznego. Takie białka mogą obejmować czynniki wzrostu, cytokiny, hormony lub wszystkie inne białka zdolne do regulacji wzrostu, różnicowania lub fizjologicznego funkcjonowania komórek. DNA może także kodować cząsteczki nonsensowne lub rybozymowe, które hamują translację białek, hamujących naprawę rany i/lub indukujących zapalenie.
Przeniesiony DNA nie musi integrować się z genomem komórki docelowej; zaiste, użycie DNA, który nie integruje w macierzy aktywowanej genowo, jest zalecaną postacią realizacji
189 174 niniejszego wynalazku. W ten sposób, po zakończeniu procesu gojenia rany i gdy produkt genowy nie jest już dłużej potrzebny, nie zachodzi ekspresja produktu genowego.
Zestawy terapeutyczne, zawierające biokompatybilną macierz i DNA, będą zawierać wstępnie utworzone macierze aktywowane genowo, pozwalające przez to lekarzom na bezpośrednie podanie macierzy wewnątrz ciała. Alternatywnie, zestawy mogą zawierać składniki konieczne do utworzenia macierzy aktywowanej genowo. W takich przypadkach lekarz może łączyć składniki, aby utworzyć macierze aktywowane genowo, które następnie można użyć leczniczo przez umieszczenie wewnątrz ciała. Macierze można stosować do powlekania narzędzi chirurgicznych, takich jak materiały do szycia lub implanty. Macierz aktywowana genowo może zawierać gotowe do użytku gąbki, rurki, opaski, składniki liofilizowane, żele, plastry lub proszki oraz tampony typu telfa.
5.1.1 Materiały macierzy
Wytwarza się kompozycje, w których DNA, kodujący interesujący czynnik terapeutyczny, wiąże się albo przesyca macierz, tworząc macierz aktywowaną genowo. Kompozycje macierzy działają (i), aby ułatwić wrastanie komórek naprawczych (nacelowywanie); oraz (ii) aby objąć DNA (dostarczanie). Po utworzeniu macierzy aktywowanej genowo, przechowuje się ją do użytku w przyszłości lub umieszcza bezpośrednio w miejscu zranienia.
Rodzaj macierzy, którą można stosować w kompozycjach, urządzeniach i sposobach według wynalazku, jest w rzeczywistości nieograniczona i może obejmować zarówno macierze biologiczne jak i syntetyczne. Macierz będzie posiadać wszystkie cechy zwykle związane z jej „biokompatybilnością”, czyli będzie występować w postaci, która nie powoduje niekorzystnych, alergicznych lub innych nieukierunkowanych reakcji po podaniu gospodarzowissakowi. Takie macierze można tworzyć z materiałów zarówno naturalnych jak i syntetycznych. Macierze mogą nie ulegać biorozkładowi w przypadkach, gdy pożądane jest pozostawienie stałych struktur w ciele; albo ulegać biorozkładowi, gdy pożądana jest ekspresja białka terapeutycznego tylko przez krótki okres czasu. Macierze mogą przybierać formy gąbek, implantów, rurek, tamponów typu telfa, opasek, bandaży, tamponów, składników liofilizowanych, żeli, plastrów, proszków lub nanocząstek. Poza tym, macierze można przeznaczyć do przedłużonego uwalniania DNA przez wydłużone okresy czasu.
Wybór materiału macierzy będzie się różnił w zależności od poszczególnych okoliczności i leczonego miejsca zranienia. Można wykorzystać macierze takie jak opisano w zgłoszeniu patentowym US. 5 270 300 załączonym tu w charakterze odnośnika. Charakterystyka fizyczna i chemiczna, tak jak np. biokompatybilność, zdolność do ulegania biodegradacji, siła, sztywność, właściwości sprzęgające, a nawet cechy kosmetyczne można brać pod uwagę przy wybieraniu macierzy, jako, że są one dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie. Odpowiednie macierze będą zarówno dostarczać cząsteczkę DNA jak i działać także jako konstrukcja in situ, przez którą mogą migrować komórki naprawcze ssaków.
Jeśli macierze mają być zachowywane przez dłuższy czas, można wykorzystać macierze, które nie ulegają biodegradacji, takie jak spiekany hydroksyapatyt, szkło biologiczne, gliniany, inne materiały ceramiczne i materiały metalowe, zwłaszcza tytan. Odpowiednim ceramicznym układem dostarczającym jest opisany w zgłoszeniu patentowym 4 596 574, załączonym tutaj w charakterze odnośnika. Biologiczne materiały ceramiczne można zmieniać w kompozycji, tak jak wapń-glinian-fosforan; i można je opracowywać w celu zmodyfikowania poszczególnych cech fizycznych i chemicznych, takich jak wielkość porów, wielkość cząstek, kształt cząstek i zdolność do biodegradacji. Można także stosować macierze polimerowe, włączając akrylowe polimery estrowe i polimery kwasu mlekowego, jakie opisano w zgłoszeniach patentowych US 4 521 909 i 4 563 489 odpowiednio, z których każdy załączono tutaj jako odnośnik. Poszczególnymi przykładami użytecznych polimerów są polimery ortoestrowe, bezwodnikowe, propylenowo-kofumaranowe lub polimer jednego lub więcej monomerów kwasu γ-hydroksykarboksylowego, np. kwasu γ-hydroksyzłotowego (kwas glikolowy) i/lub kwasu γ-hydroksypropionowego (kwas mlekowy).
Biologicznie zgodną macierz można stosować w połączeniu z implantami ortopedycznymi i urządzeniami sprzęgającymi oraz sztucznymi łącznikami, włączając same implanty i funkcjonalne części implantów, tak jak np. nici chirurgiczne, szpilki i temu podobne. Zaleca się aby powierzchnię lub powierzchnie metalowe implantu lub jego części tak jak powierzchnia
189 174 tytanu powlekać materiałem, który posiada powinowactwo do kwasów nukleinowych, najkorzystniej hydroksyapatytem, a następnie powleczony metal powlekać dodatkowo genem lub kwasem nukleinowym, który chce się przenieść. Dostępną grupą chemiczną materiałów absorpcyjnych, takich jak hydroksyapatyt, można łatwo manipulować w celu kontroli jego powinowactwa do kwasów nukleinowych, co wiedza fachowcy w tej dziedzinie.
W zalecanych postaciach realizacji, uważa się, że prawie najbardziej użyteczna będzie macierz ulegająca biodegradacji. Macierz ulegającą biodegradacji określa się generalnie jako taką, organizm może wchłonąć. Potencjalne macierze biodegradalne do użytku w połączeniu z kompozycjami, urządzeniami i sposobami według tego wynalazku obejmują, np. biodegradalny i chemicznie określony siarczan wapnia, trifosforan wapnia, hydroksyapatyt, kwas polimlekowy, polibezwodniki, macierze oczyszczonych białek oraz pół-oczyszczone kompozycje macierzy zewnątrzkomórkowej.
Inne biokompatybilne i biodegradalne polimery, które można stosować, są dobrze znane i obejmują, drogą przykładu a nie ograniczenia, poliestry takie jak poliglikolidy, polilaktydy i kopolimery polimlekowe poliglikolowe („PLGA”)(Langer i Folkman, 1976, Natura 263: 797-800); polietery, takie jak polikaprolakton, („PCL”); polibezwodniki; polialkilocyjanoakrylany, takie jak n-butylocyjanoakrylan i izopropylocyjanoakrylan; poliakrylamidy; poli(ortoestry); polifosfazeny; polipeptyd; poliuretany oraz mieszaniny takich polimerów.
Należy rozumieć, że w rzeczywistości w niniejszym wynalazku można zastosować każdy polimer, który jest obecnie znany lub który będzie wykorzystywany później, odpowiedni do przedłużonego lub kontrolowanego uwalniania kwasów nukleinowych.
W zalecanych postaciach realizacji, biokompatybilnym biodegradalnym polimerem jest kopolimer kwasu glikolowego i kwasu mlekowego („PLGA”), o stosunku między jednostkami kwasu mlekowego/kwasu glikolowego, wynoszącym od około 100/0 do około 25/75. Przeciętny ciężar cząsteczkowy („MW”) polimeru będzie zwykle wynosił od około 6000 do 700 000, a korzystnie od około 30 000 do 120 000, jak określono przez chromatografię żelowo-permeacyjną przy użyciu dostępnych w handlu polistyrenu o standardowym ciężarze cząsteczkowym, a wewnętrzna lepkość wynosi 0,5-10,5.
Długość okresu ciągłego, przedłużonego lub kontrolowanego uwalniania kwasów nukleinowych z macierzy zgodnie z wynalazkiem, będzie zależeć w dużej mierze od MW polimeru i stosunku w kompozycji kwasu mlekowego/kwasu glikolowego. Generalnie, wyższy stosunek kwas mlekowy/kwas glikolowy, tak jak np. 75/25 będzie zapewniać dłuższy okres kontrolowanego lub przedłużonego uwalniania kwasów nukleinowych, podczas gdy niższy stosunek kwas mlekowy/kwas glikolowy będzie zapewniać szybsze uwalnianie kwasów nukleinowych. Korzystnie, stosunek kwas mlekowy/kwas glikolowy wynosi 50/50.
Długość okresu przedłużonego lub kontrolowanego uwalniania zależy także od MW polimeru. Generalnie, wyższy MW polimeru będzie zapewniał dłuższy okres kontrolowanego lub przedłużonego uwalniania. W przypadku sporządzania np. macierzy, zapewniających kontrolowane lub przedłużone uwalnianie przez około trzech miesięcy przy stosunku kwas mlekowy/kwas glikolowy 100/0, zalecany przeciętny MW polimeru wynosi od około 7000 do 25 000; przy 90/10 od około 6000 do 30 000; a przy 80/20 od około 12000 do 30 000.
Innym rodzajem materiału biologicznego, który można stosować, jest podśluzówka jelita cienkiego (SIS). Materiał szczepu SIS można sporządzić z fragmentu jelita czczego dorosłej świni. Izolację i próbki tkankowe można wykonać przy użyciu rutynowych technik hodowli tkankowej, takiej jak opisana przez Badybaka i in., 1989 J. Surg. Res. 47” 74-80. Materiał SIS sporządza się przez usunięcie tkanki krezkowej, odwrócenie fragmentu, po czym usunięcie śluzówki i powierzchniowej podśluzówki techniką ścierania mechanicznego. Po odwróceniu fragmentu do jego początkowej orientacji, warstwy błony surowiczej i mięśni spłukuje się i przechowuje do dalszego użycia.
Innym szczególnym przykładem odpowiedniego materiału jest włóknisty kolagen, który można liofilizować po ekstrakcji i częściowym oczyszczeniu z tkanki, a potem wyjałowić. Macierze można także sporządzić ze ścięgna lub kolagenu skóry, które można uzyskać z różnych źródeł komercyjnych, takich jak np. Sigma i Collagen Corporation. Macierze kolagenowe jakie opisano w zgłoszeniach patentowych 4 394 370 i 4 975 527, z których każdy załącza się tu jako odnośnik, można także stosować jako materiał macierzy.
189 174
Różne materiały kolageniczne mogą także występować w postaci mineralizowanego kolagenu. Przykładowo, materiał implantu kolagenu włóknistego nazywany UltraFiber™, który można otrzymać z Norian Corp., (1025 Terra Bella Ave., Mountain View, CA, 94043) można stosować do wytwarzania macierzy. Zgłoszenie patentowe US nr 5 231 169 załączone tutaj jako odnośnik, opisuje wytwarzanie mineealirowanego kolagenu przez tworzenie minerału fosforanu wapnia w warunkach delikatnego mieszania in situ w obecności rozproszonych włókienek kolagenowych. Taki preparat można wykorzystać w kontekście dostarczania fragmentu kwasu nukleinowego do miejsca tkanki kostnej. Mineralizowany kolagen można wykorzystać np. jako część zestawu terapeutycznego macierzy aktywowanej genowo do naprawy złamań.
Zidentyfikowano co najmniej 20 różnych postaci kolagenu i każdy z tych kolagenów można stosować w praktyce wynalazku. Przykładowo, kolagen można oczyścić z chrząstki szklistej, jaką wyizolowano z połączeń dwustawowych lub płytek wzrostowych. Kolagen typu II oczyszczony z chrząstki s^^I^^tej jesl: w handlu i można go nabyć np. w Sigma
Chemical Company, St. Louis. Kolagen typu I ze ścięgna ogonowego szczura można nabyć np. w Collagen Corporation. Można wykorzystać każdą postać rekombinowanego kolagenu, jaki można otrzymać z rekombinowanych komórek gospodarza, wykazującego ekspresję kolagenu, włączając komórki bakteryjne, drożdżowe, ssacze i owadzie. Gdy stosuje się kolagen jako materiał macierzy, korzystne może być usunięcie tego, co określa się jako „telopeptyd”, który leży na końcu cząsteczki kolagenu i wiadomo, że indukuje odpowiedź zapalną.
Kolagen stosowany w wynalazku można, jeśli trzeba, uzupełnić dodatkowymi składnikami mineralnymi, takimi jak wapń, np. w postaci fosforanu wapnia. W ten sposób można uzupełnić zarówno natywny jak rekombinowany rodzaj kolagenu, przez domieszką, wchłonięcie lub z drugiej strony związanie, dodatkowych składników mineralnych.
5.1.2 DNA
Niniejsze sposoby i kompozycje mogą wykorzystywać wiele różnych rodzajów cząsteczek DNA. Cząsteczki DNA mogą obejmować genomowy, cDNA, DNA o pojedynczej nici, DNA o podwójnej nici, DNA o potrójnej nici, oligonukleotydy i Z-DNA.
Cząsteczki DNA mogą kodować różne czynniki, które pobudzają gojenie ran, włączając rewnątrrkomórkowe, powierzchniowo-komórkowe i wewnątrzkomórkowe RNA i białka. Przykładami białek zewnątrzkomórkowych są czynniki wzrostu, cytokiny, białka terapeutyczne, hormony i fragmenty peptydów hormonów, inhibitory cytokin, peptydowe czynniki wzrostu i różnicowania, interleukiny, chemokiny, interferony, czynniki stymulujące wzrost kolonii i czynniki angiogeniczne. Przykłady takich białek obejmują, lecz bez ograniczania, nadeodrinę cząsteczek TGF-β, włączając pięć izoform TGF-β oraz białka morfogenezy kości (BMP), późne białka wiążące TGF-β, LTBP; czynnik wzrostu keratynocytu (KGF); czynnik wzrostu hepatocytu (HGF); czynnik wzrostu pochodzący od płytek krwi (PDGF); czynnik wzrostu podobny do insuliny (IGF); czynniki wzrostu fibroblastów podstawowych (FGF-1, FGF-2 itd.); czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF); czynnik VIII i czynnik IX; erytropoetynę (EPO); aktywator plazminogenu tkankowego (TPA); aktywiny i inhibiny. Hormony, które można stosować w praktyce wynalazku obejmują hormon wzrostu (GH) i hormon przytarczyc (PTH). Przykładami białek zewnątrzkomórkowych są także białka macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak kolagen, laminina i fibronektyna. Przykłady białek powierzchniowokomórkowych obejmują rodzinę cząsteczek adhezyjnych komórki (np. integryny, selektyny, członków rodziny Ig, takich jak N-CAM i LI oraz kadheryny); receptory sygnalizujące cytokin, takie jak receptory TGF-β typu I i typu II oraz receptor FGF; oraz koreceptory nie sygnalizujące, takie jak betaglikan i syndekan. Przykłady RNA i białek wewnątrzkomórkowych obejmują rodzinę kinaz transdukujących sygnał, białka szkieletowe komórki, takie jak talina i winkulina, białka wiążące cytokiny, takie jak rodzina późnych białek wiążących TGF-β i białka jądrowe, działające jako trans, takie jak czynniki transkrypcji i czynniki wzmacniające.
Cząsteczki DNA mogą także kodować białka, które blokują procesy patologiczne, pozwalając przez to na nie zakłócony przebieg naturalnego procesu gojenia rany.
Przykłady czynników blokujących obejmują rybozymy, które niszczą funkcje RNA i DNA, które np. kodują inhibitory tkankowe enzymów niszczących spójność tkanki, np. inhibitory metaloproteinaz związanych z zapaleniem stawów.
189 174
Można otrzymać fragment DNA, kodujący interesujące białko, przy użyciu różnych technik biologii molekularnej, generalnie znanych fachowcom. Przykładowo, można przesiać cDNA lub biblioteki genomowe przy użyciu primerów lub sond za pomocą sekwencji opartych o znane sekwencje nukleotydowe. Można także użyć reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do utworzenia fragmentu DNA, kodującego interesujące białko. Alternatywnie, fragment DNA można otrzymać ze źródła komercyjnego.
Geny, posiadające sekwencje, różniące się od tych opisanych w literaturze także wchodzą w zakres wynalazku, tak długo jak zmieniony lub zmodyfikowany gen wciąż koduje białko, które działa stymulując gojenie rany w każdy sposób bezpośredni lub pośredni. Sekwencje te obejmują takie, które spowodowały mutacje punktowe, takie które powstały w wyniku degeneracji kodu genetycznego lub naturalnie występujące warianty alleliczne, a także modyfikacje wprowadzone przez konstrukcje genetyczne, to jest ręką człowieka.
Techniki wprowadzania zmian w sekwencjach nukleotydowych przeznaczone do zmian właściwości funkcjonalnych kodowanych białek lub polipeptydów, są dobrze znane w tej dziedzinie. Takie modyfikacje obejmują delecję, insercję lub substytucję zasad, które dają w wyniku zmiany w sekwencji aminokwasowej. Zmiany można wykonać w celu zwiększenia aktywności kodowanego białka, aby zwiększyć jego biologiczną stabilność lub okres półtrwania, aby zmienić jego wzór glikozylacji, nadać wrażliwość na temperaturę lub zmienić wzór ekspresji białka i temu podobne. Wszystkie takie modyfikacje wobec sekwencji nukleotydowej wchodzą w zakres tego wynalazku.
DNA, kodujący interesujące produkty translacji lub transkrypcji można wbudowywać w sposób rekombinowany do różnych układów wektorowych, które zapewniają replikację DNA na wielką skalę, w celu wytworzenia macierzy aktywowanych genowo. Wektory te mogą zawierać niezbędne elementy do kierowania transkrypcją i/lub translacją sekwencji DNA wchłoniętego przez komórki naprawcze w ranie in vivo.
Wektory, które można stosować obejmują, lecz bez ograniczania, pochodzące od DNA rekombinowanego faga, DNA plazmidu lub DNA kosmidu. Przykładowo, można stosować wektory plazmidowe, takie jak pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 i szeregi wektorów Ml 3 mp. Wektory bakteriofagów mogą obejmować ygt10, ygtłi, ygt18-23, yZAP/R oraz szeregi wektorów bakteriofagowych EMBL. Wektory kosmidowe, które można wykorzystać, obejmują lecz bez ograniczania pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, UMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 i szeregi wektorów charomid 9. Wektory, pozwalające na transkrypcję RNA in vitro, takie jak wektory SP6, można także stosować do wytwarzania wielkich ilości RNA, wprowadzanych do macierzy. Alternatywnie, można konstruować rekombinowane wektory wirusowe, włączając lecz bez ograniczania, pochodzące od wirusów takich jak wirus opryszczki, wirus krowianki, adenowirusy, wirusy związane z adeno lub wirus brodawczaka bydła. Chociaż można stosować wektory integrujące, do gojenia zranień zaleca się układy nie integrujące, które nie przenoszą produktu genowego do komórek potomnych przez wiele pokoleń. W ten sposób, produkt genowy podlega ekspresji w czasie procesu gojenia rany i kiedy gen rozrzedzi się w pokoleniach potomnych, poziom ekspresji produktu genowego ulega zmniejszeniu.
Do budowania wektorów ekspresji, zawierających sekwencję kodującą białko operacyjnie związaną z odpowiednimi sygnałami kontrolnymi transkrypcji/translacji, można użyć metod dobrze znanych fachowcom. Metody te obejmują techniki in vitro rekombinacji DNA oraz techniki syntetyczne. Patrz np. techniki opisane u Sambrooka i in., 1992, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. oraz Ausubel i in., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y,
Geny, kodujące interesujące białka mogą być operacyjnie związane z różnymi elementami promotorowymi/wzmacniaczowymi. Elementy ekspresji tych wektorów mogą zmieniać swą siłę i specyficzność. W zależności od wykorzystanego układu gospodarz/wektor, można stosować każdy z licznych elementów transkrypcji i translacji. Promotor może występować w postaci promotora naturalnie związanego z interesującym genem. Alternatywnie, DNA można ustawić pod kontrolą rekombinowanego lub heterologicznego promotora, to jest promotora, który nie jest normalnie związany z tym genem. Przykładowo można stosować
189 174 elementy promotora/wzmacniacza specyficzne dla tkanki, do regulacji ekspresji przenoszonego DNA w konkretnych rodzajach komórek.
Przykłady regionów kontrolnych dla transkrypcji, które wykazują specyficzność tkankową, które opisano i które możnaby użyć, obejmują lecz bez ograniczania: region kontrolny genu elastazy I, który jest aktywny w komórkach groniastych trzustki (Swift i in., 1984, Cell 38: 639-646; Omitz i in., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 42S-52S); region kontrolny genu insuliny, który jest aktywny w komórkach beta trzustki (Hanahan 1985, Nature 315: 115-122); region kontrolny genu immunoglobuliny aktywny w komórkach limfoidalnych (Grosschedl i in., 1984, Cell: 38: 647-658; Adams i in., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander i in., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); region kontrolny genu albuminy aktywny w wątrobie (Krumlauf i in., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer i in., 1987, Science 235:53-58); region kontrolny genu alfa-1-antytrypsyny aktywny w wątrobie (Kelsey i in., 1987, Genes i Devel 1: 161-171); region kontrolny genu beta-globiny aktywny w komórkach szpiku (Magram i in., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias i in., 1986, Cell 46: 89-94); region kontrolny genu białka podstawowego mieliny aktywny w komórkach oligodendrocytowych mózgu (Readhead i in., 1987, Cell 48: 703-712); region kontrolny genu lekkiego łańcucha-2 miozyny aktywny w mięśniu szkieletowym (Shani 1985, Nature 314: 283-286); oraz region kontrolny genu gonadotropowego hormonu uwalniającego aktywny w przysadce (Mason i in., 1986, Science 234: 1372-1378). Można stosować promotory izolowane z genomu wirusów, które rosły w komórkach ssaka (np. promotory RSV, wirusa krowianki 7,5K, SV40, HSV, adenowirusów MLP MMTC LtR i CMV), jak również promotory wytworzone technikami rekombinacji DNA lub syntetycznie.
W niektórych przypadkach, elementy promotorowe mogą być promotorami konstytutywnymi lub możliwymi do wywołania i można je stosować w odpowiednich warunkach do kierowania ekspresją interesującego genu na wysokim poziomie lub regulowaną. Ekspresja genów pod kontrolą konstytutywnych promotorów nie wymaga obecności specyficznego substratu do indukcji ekspresji genu i będzie występować we wszystkich warunkach wzrostu komórki. Przeciwnie, ekspresje genów kontrolowanych przez promotory możliwe do indukcji odpowiada na obecność lub nieobecność czynnika indukującego.
Specyficzne sygnały inicjacyjne są także wymagane do wystarczającej translacji wtrąconej sekwencji, kodującej białko. Sygnały te obejmują kodon inicjacyjny ATG i sekwencje sąsiadujące. W przypadkach, gdzie do odpowiednich wektorów ekspresji wtrącono całą sekwencję kodującą, włączając kodon inicjacyjny i sekwencje sąsiednie, nie potrzeba żadnych dodatkowych sygnałów kontrolnych translacji. Jednak w wypadkach gdzie wtrącono tylko część sekwencji kodującej, muszą być dostarczone egzogeniczne sygnały kontrolne translacji, łącznie z kodonem inicjacyjnym ATG. Ponadto, kodon inicjacyjny musi być w fazie z ramką odczytu sekwencji kodujących dla białka, aby zapewnić translację całego insertu. Te egzogeniczne sygnały kontrolne translacji oraz kodony inicjacyjne mogą być rozmaitego pochodzenia, zarówno naturalnego jak i syntetycznego. Skuteczność i kontrolę ekspresji można wzmacniać przez wprowadzanie sekwencji osłabiających translację, elementów wzmacniających itd.
Oprócz sekwencji DNA, kodujących interesujące białka terapeutyczne, w zakres niniejszego wynalazku wchodzi stosowanie rybozymów lub cząsteczek nosensownych DNA, które można przenosić do komórek naprawczych ssaka. Takie rybozymy i cząsteczki nonsensowne można stosować do hamowania translacji RNA, kodującego białka, w genach, które hamują proces chorobowy lub proces gojenia rany, pozwalając przez to na naprawę tkanki.
Ekspresja nonsensownych cząsteczek RNA będzie działać tak, aby bezpośrednio blokować translację mRNA przez wiązanie się z wycelowanym mRNA i zapobieganie translacji białka. Ekspresja rybozymów, które są enzymatycznymi cząsteczkami RNA zdolnymi do katalizy specyficznego rozszczepiania RNA, można także stosować do blokowania translacji białka. Mechanizm działania rybozymu obejmuje hybrydyzację specyficzną dla sekwencji cząsteczki rybozymu z komplementarnym docelowym RNA, po czym rozszczepienie endonukleolityczne. W zakres wynalazku wchodzi skonstruowany motyw główki młotka cząsteczki rybozymu, który spcyficznie i skutecznie katalizuje endonukleolityczne rozszczepienie sekwencji RNA. Cząsteczki RNA można utworzyć przez transkrypcję sekwencji DNA, kodującego cząsteczkę RNA.
189 174
Można także zastosować geny wielokrotnych, połączonych na pojedynczej konstrukcji genetycznej pod kontrolą jednego lub więcej promotorów, lub wytworzonych jako oddzielne konstrukcje tego samego lub innego rodzaju. Tak więc, można wykorzystać niemal niekończące się kombinacje różnych genów i konstrukcji genetycznych. Pewne połączenia genów można przeznaczyć, albo ich zastosowanie może z drugiej strony dać w wyniku, uzyskanie synergistycznych efektów stymulacji i regeneracji komórkowej, przy czym każde i wszystkie takie połączenia w zamierzeniu wchodzą w zakres niniejszego wynalazku. Rzeczywiście, wiele efektów synergistycznych opisano w literaturze naukowej tak, że fachowiec łatwo zidentyfikuje prawdopodobne połączenia synergistyczne genów lub nawet połączenia genowo-białkowe.
5.1.3 Wytwarzanie macierzy aktywowanych genowo
W zalecanych postaciach realizacji, materiał macierzy lub implantu styka się z DNA, kodującym interesujący produkt terapeutyczny przez wysycenie materiału macierzy w roztworze macierzystym rekombinowanego DNA. Ilość dNa i wymagana ilość czasu kontaktu w celu wprowadzenia DNA do macierzy, będzie zależeć od rodzaju użytej macierzy i może być łatwo określona przez fachowca bez niepotrzebnego eksperymentowania. Alternatywnie, DNA można otoczkować wewnątrz macierzy z syntetycznych polimerów, takich jak np. blokowych kopolimerów kwasu polimlekowego-poliglikolowego (patrz Langer i Folkman, 1976, Naturę 263: 797-800, który załącza się tutaj jako odnośnik). Znowu, parametry te fachowiec może łatwo określić bez niepotrzebnego eksperymentowania. Przykładowo, ilość konstrukcji DNA stosowaną do macierzy można określić biorąc pod uwagę różne czynniki biologiczne i medyczne. Należy wziąć pod uwagę poszczególny gen, macierz, miejsce zranienia, wiek gospodarza ssaka, płeć i dietę oraz wszystkie dodatkowe czynniki kliniczne, które mogą wpływać na gojenie rany, takie jak poziom w surowicy różnych czynników i hormonów·.,
W dodatkowych postaciach realizacji wynalazku, kompozycje macierzy zarówno biologicznych jak i syntetycznych oraz DNA można razem liofilizować, tworząc suchy proszek farmaceutyczny. Macierz aktywowaną genowo można ponownie uwodnić przed wszczepieniem do ciała lub alternatywnie macierz aktywowana genowo może się naturalnie uwodnić po umieszczeniu w ciele.
W pewnych przypadkach kompozycjami kwasów nukleinowych można powlekać urządzenia medyczne, takie jak implanty, szwy, opatrunki ran itd., przy użyciu konwencjonalnych technik powlekania dobrze znanych w tej dziedzinie. Takimi metodami są przykładowo i bez ograniczania, zanurzanie urządzenia w kompozycji kwasu nukleinowego, nałożenie kompozycji kwasów nukleinowych za pomocą szczotki i/lub natryskiwanie urządzenia aerozolową kompozycją wspomnianych kwasów nukleinowych. Następnie urządzenie się suszy, albo w temperaturze pokojowej albo za pomocą pieca do suszenia, ewentualnie pod zmniejszonym ciśnieniem. Zalecaną metodę powlekania szwów podaje się w przykładach.
Dla szwów powlekanych macierzą polimerową, zawierającą DNA plazmidu. Zgłaszający stwierdził, że nałożenie kompozycji powlekającej, zawierającej całkowitą ilość około .01 do 10 mg DNA plazmidu, a korzystnie około 1-5 mg DNA plazmidu, na szew o długości 70 cm, stosując około 5-100, korzystnie około 5-50, a korzystniej około 15-30 nałożeń powlekających, dało powleczenie terapeutycznie efektywne i jednorodne.
Można w ten sposób utworzyć szwy powlekane, zwłaszcza szwy powlekane macierzą polimerową zawierającą kwasy nukleinowe, kodujące białka terapeutyczne, które stymulują gojenie zranień in vivo.
Szwy, które można powlekać zgodnie z powyżej opisaną metodą, obejmują każdy szew pochodzenia naturalnego lub syntetycznego. Typowym materiałem szwu jest przykładowo i bez ograniczania, jedwab; bawełna; len; poliolefiny, takie jak polietylen i poliestry, takie jak tereftalan polietylenowy; homopolimery i kopolimery estrów kwasów hydroksykarboksylowych; kolagen (zwykły lub chromowany); katgut (zwykły lub chromowany); oraz substytuty szwu, takie jak cyjanoakrylany. Szwy mogą przyjmować każdą dogodną postać tak jak sploty lub skręty i mogą posiadać szeroki zakres wielkości, tak jak powszechnie stosuje się w tej dziedzinie.
Korzyści szwów powlekanych, zwłaszcza szwów powlekanych macierzą polimerową zawierającą kwasy nukleinowe, kodujące białka terapeutyczne, które stymulują gojenie zranień, rzeczywiście pokrywają wszystkie dziedziny zastosowań chirurgicznych u ludzi i zwierząt.
189 174
5.2 Zastosowania macierzy aktywowanej genowo
Biologicznie zgodną macierz można stosować w wielu różnych sytuacjach gojenia zranień w medycynie ludzkiej. Należą do nich, bez ograniczania, naprawa kości, naprawa ścięgna, łączenie, naprawa, naprawa naczyń krwionośnych, naprawa mięśni szkieletowych oraz naprawa skóry. Przykładowo, stosując technologię macierzy aktywowanej genowo, czynniki wzrostu cytokin wytwarzane przez transfekowane komórki naprawcze będą wpływać na inne komórki w ranie, poprzez wiązanie się z sygnałowymi receptorami powierzchniowo-komórkowymi, stymulując przez to i wzmacniając kaskadę zdarzeń fizjologicznych normalnie związanych z procesem gojenia rany. Wynikiem końcowym jest zwiększenie naprawy i regeneracji tkanki.
Celem klinicznym może też być blokowanie procesu chorobowego, pozwalając przez to na naturalne gojenie tkanki, lub gdy celem jest wymiana genetycznie wadliwej funkcji białka.
Rany mogą powstawać w wyniku uszkodzenia urazowego, lub alternatywnie uszkodzenia tkanki indukowanego, albo będącego wynikiem procedury chirurgicznej. Macierz aktywowana genowo można przenosić do pacjenta przy użyciu różnych technik. Przykładowo, macierze można przenosić bezpośrednio do miejsca zranienia rękami lekarza, albo w postaci implantu terapeutycznego albo w postaci powleczonego narzędzia (np. szwu, rurki stosowanej przy przeszczepach skóry, powlekanego narzędzia, itd.). Macierze można podawać miejscowo, umieszczane także chirurgicznie w miejscu normalnej tkanki w celu leczenia tkanki chorej położonej w pewnym oddaleniu.
Proces gojenia rany jest koordynowaną sekwencją zdarzeń, które obejmują krwawienie, tworzenie skrzepu, rozpuszczenie skrzepu przez konkurencyjne usunięcie zniszczonej tkanki oraz odłożenie się tkanki ziaminowej jako początkowego materiału naprawczego. Tkanka ziaminowa jest mieszaniną fibroblastów i włoskowatych naczyń krwionośnych. Proces gojenia rany obejmuje rozmaite populacje komórkowe, włączając komórki śródbłonka, komórki macierzyste, makrofagi i fibroblasty. Czynniki regulatorowe związane z gojeniem rany, znane są jako hormony układowe, cytokiny, czynniki wzrostu, białka macierzy zewnątrzkomórkowej i inne białka, które regulują wzrost i różnicowanie.
Sposoby transferu DNA i kompozycje macierzy wynalazku będą posiadać szereg zastosowań jako sposób dostarczania leku do stymulacji naprawy i regeneracji tkanki w różnych rodzajach tkanek. Obejmują one lecz bez ograniczania naprawę kości, naprawę skóry, naprawę tkanki łącznej lub regulację tworzenia się naczyń i/lub rozwój naczyń. Zastosowanie macierzy aktywowanych genowo może także mieć miejsce przy leczeniu pacjentów z zaburzoną zdolnością gojenia, wynikającą np. z wpływu wieku lub cukrzycy. Macierze można także stosować w leczeniu zranień, które goją się powoli z powodów naturalnych, np. u osób starszych i takich, które nie odpowiadają na istniejące terapie, czyli osób z chronicznymi zranieniami skóry.
Istotną cechą niniejszego wynalazku jest to, że tworzenie się tkanki bliznowej można regulować przez kontrolę poziomu ekspresji białek terapeutycznych. W przypadkach, takich jak leczenie oparzeń lub uszkodzeń tkanki łącznej, pożądane jest zwłaszcza hamowanie tworzenia się tkanki bliznowej.
Metody terapeutyczne mogą obejmować też przeszczepy macierzy, zawierających interesujący DNA do gospodarza. Procedury przeszczepiania macierzy mogą obejmować umieszczenie chirurgiczne lub wstrzyknięcie macierzy do gospodarza. W przypadkach, gdzie macierze się wstrzykuje, wciąga się je do strzykawki i wstrzykuje pacjentowi w miejscu zranienia. Można przeprowadzić wielokrotne iniekcje na obszarze zranienia. Alternatywnie, macierze można umieszczać chirurgicznie w miejscu zranienia. Ilość macierzy potrzebnej do uzyskania celu według niniejszego wynalazku, to jest stymulacji gojenia i regeneracji rany jest zmienna w zależności od rozmiarów, wieku i ciężaru gospodarza.
Zasadniczą cechą wynalazku jest to, że bez względu na to kiedy przenosi się macierz aktywowaną genowo do gospodarza, czy to przez iniekcję czy operacyjnie, miejscowe zniszczenie tkanki jest wystarczające do indukcji procesu gojenia rany. Jest to konieczny warunek dla indukcji migracji i proliferacji nacelowanych komórek naprawczych ssaka do miejsca macierzy aktywowanej genowo.
189 174
Konkretne postacie realizacji opisuje się w następujących sekcjach.
5.3 Regeneracja kości
Kość ma istotną zdolność do regeneracji po złamaniu. Kompleksowa lecz szeregowa sekwencja naprawy złamania obejmuje zatrzymanie krwawienia, rozpuszczenie skrzepu, wrastanie tkanki ziarninowej, tworzenie blizny i ponowne modelowanie blizny do uzyskania optymalnej struktury (A.W. Ham., 1930, J. Bone Joint Surg. 12, 827-844). Komórki biorące udział w tym procesie to płytki krwi, komórki zapalne, fibroblasty, komórki śródbłonka, pericyty, osteoklasty i przodkowie osteogenezy. Ostatnio zidentyfikowano kilka peptydowych czynników wzrostu i różnicowania, które jak się okazało, kontrolują zdarzenia komórkowe związane z tworzeniem i naprawą kości (A.Erlebacher, i in., 1995 Cell 80, 371-378). Przykładowo białka morfogenezy kości (BMP) są rozpuszczalnymi czynnikami zewnątrzkomórkowymi, które kontrolują przeznaczenie komórek osteogenezy: geny BMP normalnie podlegające ekspresji przez hodowane osteoblasty płodowe (S.E. Harris i in., 1994, J.Bone Min.Res 9, 389-394) oraz przez osteoblasty podczas tworzenia się szkieletu zarodka myszy (K.M. Lyons i in., 1989, Genes Dev. 3, 1657-1668; K.M. Lyons i in., 1990, Development 190, 833-844; M.C. Jones i in., 1991, Development 111, 531-542), rekombinowane białka BMP inicjują różnicowanie komórek progenitorowych chrząstki i kości (A.Yamaguchi i in., 1991, J. Cell. Biol. 113, 681-687; M.Ahrens i in., 1993, J.Bone Min. Res. 12, 871-880; S.E. Gitelman i in., 1994, J.Cell. Biol. 126, 1595-1609; V.Rosen i in., 1994, J.Cell.Biol.i27, 1755-1766), dostaczenie rekombinowanych BMP indukuje sekwencję tworzenia podobną do wewnątrzchrząstkowego tworzenia kości (J.M.Wozney 1992, Mol. Reprod. Dev. 32, 160-167; A.H. Reddi, 1994 Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 737-744), a ekspresja genu BMP-4 nie jest regulowana wcześnie w procesie naprawy złamania (T.Nakase i in., 1994, J. Bone Min. Res. 9 651-659). Osteogeniczne białko-1, członek rodziny cząsteczek spokrewnionych z BMP (E.Ozkaynak i in., 1990 EMBO J. 9, 2085-2093) jest zdolne do podobnych efektów in vitro i in vivo (T.K.Sampath i in., (1994) J. Bone Joint Surg. 76-A, 827-838). TGF-β także okazał się stymulować tworzenie się chrząstki i kości in vivo (M.Centrella i in., 1994, Endocrine Rev. 15, 27-38; D.R. Sumner i in., 1995, J. Bone Joint Surg. 77A, 1135-1147). Wreszcie, hormon przytarczyc (PTH) jest hormonem o 84 aminokwasach, który podnosi stężenie Ca1 w osoczu i płynie zewnątrzkomói^kowym. W tkankach szkieletowych, sporadyczne podawanie fragmentu PTH, posiadającego strukturalne wymagania dla aktywności biologicznej (aminokwasy 1-34) daje prawdziwy wpływ anaboliczny: liczne badania in vivo i in vitro dostarczają silny dowód, że podawanie PTH 1-34 zwierzętom (włączając szczury) daje w wyniku nie sprzężone, wysokiej jakości tworzenie kości spowodowane połączonym wpływem hamującym na osteoklasty oraz wpływem stymulującym na komórki osteogenezy (D.W. Dempster i in., 1993, Endocrine Rev. 14, 690-709). Peptyd PTH1 znany jest jako współdziałający synergistycznie z BMP-4, który reguluje w górę ekspresję funkcjonalnych receptorów PTH na powierzchni komórki w różnicujących się osteoblastach in vitro (M. Ahrens i in., 1993, J. Bone Min. Res. 12, 871-880).
Tak jak białka rekombinowane, peptydowe czynniki wzrostu i różnicowania, takie jak BMP i TGF-β stanowią obiecujące alternatywy terapeutyczne naprawy złamań (J.M. Wozney, 1992, Mol. Reprod. Dev. 32, 160-167; A.H. Reddi, 1994, curr. Opin. Genet. Dev. 4, 737-744; M.Centrella i in., 1994, Endocrine Rev. 15, 27-38; D.R. Sumner i in., 1995, J. Bone Joint Surg. 77A, 1135-1147). Jednak wymaga się relatywnie wielkich dawek (ilości mikrogramowe) do stymulacji istotnego tworzenia się kości u zwierząt, podnosząc kwestię, że przyszłe terapie człowieka mogą być drogie i mogą posiadać zwiększone ryzyko toksyczności.
Macierze aktywowane genowo wszczepia się chirurgicznie do miejsca nacięcia kości o wielkości 5 mm u szczura, modelu kompleksowego, nie gojącego się złamania u człowieka. Niniejsi wynalazcy odkryli, że można łatwo uzyskać transfer genu do komórek naprawczych w szczelinie nacięcia kości.
Defekty w procesie naprawy i regeneracji kości wiążą się ze znacznymi komplikacjami w klinicznej praktyce ortopedycznej, np. włóknistym nie łączeniem się po złamaniu, niemożnością połączenia się implantu oraz niewydolnością wielkich przeszczepów allogenicznych. Wiele złamań złożonych leczy się aktualnie przy użyciu przeszczepów autogenicznych lecz technika ta nie jest skuteczna i wiąże się z komplikacjami.
Naturalnie, każda nowa technika przeznaczona do stymulacji naprawy kości byłaby wartościowym narzędziem w leczeniu złamań kości. Znaczną część złamanych kości wciąż leczy się przez unieruchomienie, pozwalające na naprawę zranienia przez wpływ naturalnych machanizmów. Mimo, że w ostatnich latach nastąpiło zaawansowanie leczenia złamań, włączając poprawę narzędzi, rozwój nowych procesów, stymulujących lub uzupełniających mechanizmy naprawy zranień, byłby znacznym postępem w tej dziedzinie.
Biologicznie zgodną macierz można stosować do transferu genu wzrostu kości, w celu pobudzenia naprawy złamania. Inne ważne aspekty tej technologii obejmują stosowanie transferu genów do leczenia pacjentów ze „słabymi kośćmi”, jak w chorobach, takich jak osteoporoza; do polepszania .słabego gojenia, które może mieć miejsce z różnych powodów, np. włóknistego nie łączenia; do pobudzania integracji implantu i działania sztucznych łączników; do stymulacji gojenia innych tkanek szkieletowych, takich jak ścięgna Achillesa; oraz jako adjuwant do naprawy dużych ubytków.
Wiadomo, że tkanka kostna posiada zdolność naprawy i regeneracji i zrozumiałe są komórkowe i cząsteczkowe podstawy tych procesów. Inicjacja tworzenia nowej kości obejmuje pobudzenie, ekspansję klonalną i różnicowanie się komórek naprawczych. Po zainicjowaniu tworzenie się kości jest pobudzane przez różne polipeptydowe czynniki wzrostu. Nowo utworzona kość utrzymywana jest potem przez szeregi lokalnych i układowych czynników wzrostu i różnicowania.
Ostatnio sklonowano kilka genów białek morfogenetycznych kości (Wozney i in., 1988; Rosen i in., 1989, Connect. Tissue Res., 20: 313:319; omówione u Alpera, 1994) i dzięki tej pracy ustalono, że BMP są członkami nadrodziny transformującego czynnika wzrostu-β (TGF-β) na podstawie homologii sekwencji DNA. Klonowanie różnych genów BMP doprowadziło do oznaczenia poszczególnych genów BMP i białek takich jak BMP-1 do co najmniej BMP-8. BMP 2-8 uważa się generalnie za osteogeniczne, choć BMP-1 może być bardziej ogólnym morfogenem; Shimell i in., 1991, Cell, 67:469-481). BMP-3 nazywa się także osteogenem (Luyten i in., 1989, J.Biol. Chem. 264: 13377-13380), a BMP-7 nazywa się także OP-1 (Ozkaynak i in., 1990, EMBO J. 9: 2085-2093). Każdy z tGf i BMP działa na komórki poprzez kompleksowe, tkankowo-specyficzne interakcje z rodzinami receptorów powierzchniowo-komórkowych (Roberts i Sporn, 1989, M.B Sporn i A.B. Roberts, Wyd., Springer-Verlag, Heidelberg, 95 (część 1); Aralkar i in., 1991).
Transformujące czynniki wzrostu (TGF) także okazały się odgrywać centralną rolę w regulacji gojenia tkanek przez wpływ na proliferację komórkową, ekspresję genową i syntezę białka macierzy (Roberts i Sporn, 1989, M.B. Sporn i A. B. Roberts, Wyd., Springer-Verlag. Heidelberg, 95 (część 1)). Przykładowo, TGF^l i TGF^2 mogą inicjować zarówno chondrogenezę jak i osteogenezę (Joyce i in., 1990, J.Cell Biol., 110: 195-2007; Izumi i in., 1992, J.Bone Min. Res., 7: 115-11; Jingushi i in., 1992, J.Orthop. Res., 8:364-371).
W praktyce wynalazku można stosować inne czynniki wzrostu/hormony oprócz TGF i BMP, aby wpływać na tworzenie się nowej kości po złamaniu. Przykładowo, czynnik wzrostu fibroblastu wstrzyknięty do miejsca złamania u szczura (Jingushi i in., 1990) w wielu wysokich dawkach (1,0 mg/ml) daje znaczne zwiększenie tkanki chrząstkowej w szczelinie złamania, podczas gdy niskie dawki nie mają żadnego wpływu.
Można także stosować hormony regulujące wapń, takie jak hormon przytarczyc (PTH). PTH jest regulowanym wapniem hormonem o 84 aminokwasach, którego naczelnym zadaniem jest zwiększanie stężenia Ca'*' w osoczu i płynie zewnątrzkomórkowym. Ukazano, że nieuszkodzony PTH stymuluje reabsorpcję w hodowli narządowej ponad 30 lat temu i o hormonie wiadomo, że zwiększa liczbę i aktywność osteoklastów. Badania nad natywnym hormonem i nad peptydami syntetycznymi ujawniły, że koniec aminowy cząsteczki (aminokwasy 1-34) zawiera wymagania strukturalne dla aktywności biologicznej (Tregear i in., 1973; Hermann-Erlee i in., 1976, Endocrine Research Commnications. 3: 21-35; Riond, 1993, Clin. Sei. 85: 223-228).
Macierze aktywowane genowo wszczepia się chirurgicznie do miejsca złamania kości. Takie procedury chirurgiczne mogą obejmować bezpośrednie wstrzyknięcie preparatu GAM do miejsca złamania, naprawę chirurgiczną złamania kompleksowego lub operację artroskopową. W przypadkach, gdzie do naprawy złamanej kości stosuje się macierze aktywowane
189 174 genowo, komórki naprawcze ssaka będą naturalnie migrować i proliferować do miejsca uszkodzenia kości.
Niniejsi twórcy wynalazku niespodziewanie stwierdzili, że łatwo można uzyskać transfer genu do komórek naprawczych w tkance regeneracyjnej w szczelinie nacięcia kości. Aktualnie, zalecane metody uzyskiwania transferu genowego, generalnie obejmują stosowanie materiału implantu kolagenu włóknistego, nasyconego w roztworze DNA krótko przed umieszczeniem w miejscu, w którym pożądany jest wzrost kości, albo stosowanie preparatu DNA plazmidowego otoczkowanego w macierzy syntetycznej, takiej jak blokowy kopolimer PLGA. Jak ukazują badania tutaj przedstawione, materiał implantu ułatwia celowy wychwyt egzogenicznych kontrukcji plazmidowych przez komórki w szczelinie nacięcia kości, które wyraźnie partycypują w regeneracji/naprawie kości. Transgeny, po wychwycie przez komórki, kierują ekspresją rekombinowanych polipeptydów, jak udowodniono przez ekspresję in vivo funkcjonalnych produktów genów markerowych.
Przedstawia się tu dalsze badania, pokazujące, że transfer genu osteotropowego daje w wyniku ekspresję komórkową rekombinowanej cząsteczki osteotropowej, której ekspresja bezpośrednio wiąże się z stymulacją tworzenia się nowej kości. Konkretnie, wektor transferu genu, kodującego BMP-4 i wektor transferu genu, kodującego fragment ludzkiego PTH1-34, sam lub w połączeniu, będzie stymulować tworzenie się nowej kości. Wziąwszy pod uwagę stosunkowo wielką liczbę genów kandydatów, wektor transferu genu, kodującego fragment ludzkiego hormonu przytarczyc, hPTH1-34, będzie stymulować tworzenie się nowej kości u szczurów Sprague-Dawley, wskazując, że peptyd ludzki może skutecznie wiązać się z receptorem PTH/PTHrP na powierzchni komórkowej osteoblastu szczura.
5.4 Tkanki miękkie
Można także stosować genowo aktywowaną macierz do stymulacji wzrostu i regeneracji tkanek miękkich, takich jak łączna, ścięgnista, chrzestna i skóry.. Zniszczenie szkieletowej tkanki łącznej spowodowane uszkodzeniem urazowym można leczyć przy użyciu macierzy, zawierających geny, kodujące różne czynniki wzrostu.
Tkanka łączna normalnie składa się z komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej zorganizowanej w charakterystycznej architekturze tkankowej. Zranienie tkanki może przerwać tę architekturę i stymulować odpowiedź gojenia się rany. Sposoby według niniejszego wynalazku są szczególnie odpowiednie do stymulacji wzrostu i regeneracji tkanki łącznej jako, że ważne jest aby uszkodzona tkanka łączna regenerowała się bez tworzenia tkanki bliznowej, ponieważ tkanka bliznowa może zakłócać normalne funkcje mechaniczne tkanki łącznej.
Do pobudzania naprawy tkanki łącznej można stosować różne czynniki wzrostu. Są nimi lecz bez ograniczania, członkowie nadrodziny TGF-β (np. sam TGF-β), którzy stymulują ekspresję genów, kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej, oraz inne cytokiny, takie jak EGF i PDGF. Przykładami innych genów, które można stosować są (a) cytokiny, takie jak peptydowe czynniki wzrostu i różnicowania; (b) czynniki angiogeniczne takie, jak FGF i VEGF; (c) białka macierzy zewnątrzkomórkowej takie, jak kolagen, laminina i fibronektyna; (d) rodzina komórkowych cząsteczek ądhezyjnych (np. integryny, selektyny, członkowie rodziny Ig, tak jak N-CAM i LI, oraz kadheryny); (e) powierzchniowo-komórkowe receptory sygnalizujące cytokin takie, jak receptory TGF-β typu I i typu II; (f) koreceptory nie sygnalizujące, takie jak betaglikan i syndekan; (g) rodzina kinaz transdukujących sygnał; (h) białka szkieletu komórkowego, takie jak talina i winkulina (i) białka wiążące cytokiny, takie jak rodzina późnych białek wiążących TGF-β; oraz (j) białka jądrowe działające jako trans, takie jak czynniki transkrypcji.
Po utworzeniu, takie macierze można potem umieścić w gospodarzu-ssaku w obszarze zranienia tkanki łącznej. Macierze aktywowane genowo można wstrzyknąć bezpośrednio do obszaru uszkodzenia tkanki łącznej.
Alternatywnie można stosować techniki chirurgiczne, takie jak artroskopia, aby dostarczyć macierz do obszaru zranienia tkanki łącznej.
5.5 Regeneracja narządu
Macierze aktywowane genowo można także stosować do stymulacji naprawy i regeneracji tkanki narządu. Można też leczyć zniszczenie narządu spowodowane uszkodzeniem urazowym lub operacją. W przypadku wątroby, można ją uszkodzić przez nadmierną konsumpcję
189 174 alkoholu lub przez różnego rodzaju infekcje rozmaitymi typami czynników infekcyjnych, takich jak rodzina wirusów zapalenia wątroby. Normalne działanie nerek może być podobnie zaburzone w wyniku uszkodzenia spowodowanego chorobą nerek. Błony śluzowe przełyku, żołądka i dwunastnicy mogą zawierać owrzodzenia spowodowane przez kwas i pepsynę w sokach żołądkowych. Owrzodzenia mogą także powstawać w wyniku kolonizacji komórek błony śluzowej żołądka bakteriami Helicobacter pylori. Narządy te i choroby służą tylko jako przykłady, w rzeczywistości sposoby według wynalażku można stosować do leczenia chorób lub do stymulacji regeneracji narządowej w każdym narządzie w organizmie.
Macierze, zawierające DNA, kodujący cytokiny, które stymulują proliferację i różnicowanie się komórek i/lub regulują morfogenezę tkanki, można przeszczepiać do odpowiedniego miejsca narządu. Takie czynniki mogą obejmować, lecz bez ograniczania, rodzinę transformującego czynnika wzrostu białek czynnika wzrostu, pochodzącego od płytek (PDGF), czynnika wzrostu podobnego do insuliny (IGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF). W pewnych przypadkach, użyteczną może być ekspresja czynników wzrostu i/lub cytokin, które stymulują proliferację typów komórek specyficznych dla danego narządu, to jest hepatocytów, komórek nerki lub serca, itd. Przykładowo, ekspresja czynnika wzrostu hepatocytów może stymulować proces gojenia rany w wątrobie. Do leczenia wrzodów, wynikających z infekcji Helicobacter, macierze aktywowane genowo mogą zawierać DNA, kodujący białka antydrobnoustroj owe.
Macierze aktywowane genowo można wszczepiać chirurgicznie do narządu, który poddaje się leczeniu. Alternatywnie, można skorzystać z procedur laparoskopii chirurgicznej, aby przenieść macierze aktywowane genowo do organizmu. W przypadkach leczenia w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki, naturalny proces gojenia będzie stymulować migrację i proliferację komórek naprawczych do przeszczepionych macierzy. Alternatywnie, gdzie macierze aktywowane genowo przenosi się do narządów, które nie zostały uszkodzone, np. gdy macierze wszczepia się w celu ekspresji białek terapeutycznych nie związanych z gojeniem rany, proces gojenia rany można stymulować przez indukcję uszkodzenia tkanki.
5.6 Regulacja rozwoju naczyń
Niniejszy wynalazek stosuje się do regulacji tworzenia i rozprzestrzeniania naczyń krwionośnych lub odpowiednio, naczyniogenezy i angiogenezy. Oba te fizjologiczne procesy odgrywają ważną rolę w gojeniu zranień i regeneracji narządu.
Początkowo, w miejscu zranienia odkłada się tkanka ziaminowa, która jest mieszaniną kolagenu, macierzy i naczyń krwionośnych, i zapewnia siłę ranie podczas naprawy tkanki. Tworzenie nowych naczyń krwionośnych obejmuje proliferację, migrację i przenikanie komórek śródbłonkowych naczyń i wiadomo, że regulują go różne polipeptydowe czynniki wzrostu. Zidentyfikowano kilka polipeptydów, mających aktywność pobudzającą wzrost komórek śródbłonka, włączając kwasowe i zasadowe czynniki wzrostu fibroblastów (FGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz czynnik wzrostu pochodzący z płytek (PDGF).
W celu stymulacji tworzenia się i rozprzestrzeniania naczyń krwionośnych DNA, kodujący takie czynniki wzrostu można wprowadzić do macierzy i te macierze wszczepić gospodarzowi. W pewnych przypadkach, konieczna może być indukcja procesu gojenia rany przez uszkodzenie tkanki.
Może być pożądana inhibicja proliferacji tworzenia się naczyń krwionośnych, tak jak angiogeneza związana z wzrostem guzów stałych, który polega na unaczynieniu w celu wzrostu. Angiogenezę guza można hamować przez przeniesienie DNA, kodujących inhibitory ujemne angiogenezy, takie jak trombospondyna czy angiostatyna. W specyficznych postaciach realizacji wynalazku, DNA, kodujący np. trombospondynę lub angiostatynę, można wprowadzić do macierzy po wszczepieniu macierzy pacjentowi w miejscu guza.
5.7. Naprawa skóry
Aktywowaną genowo macierz można także stosować do stymulacji wzrostu i naprawy tkanek skóry. W zranieniach, które obejmują uszkodzenie obszarów skóry, a zwłaszcza w przypadku znacznych oparzeń, istotne jest, aby skóra rosła bardzo szybko, w celu zapobieżenia zakażeniom, zmniejszenia utraty płynów i zmniejszenia obszaru potencjalnego bliznowacenia. Zniszczenie skóry, wynikające z oparzeń, nakłuć, rozcięć i/lub otarć można leczyć stosując macierze aktywowane genowo. Można także leczyć schorzenia skórne, takie jak łuszczyca,
189 174 atopowe zapalenie skóry lub uszkodzenie skóry, powstałe w wyniku infekcji grzybowych, bakteryjnych i wirusowych, leczenia raków skóry, takich jak czerniak.
Macierze, zawierające DNA, kodujący cytokiny, które stymulują proliferację i różnicowanie się komórek skóry, włączając centralne podstawowe komórki macierzyste, keratynocyty, melanocyty, komórki Langerhansa i komórki Merkela, można stosować do leczenia uszkodzeń i schorzeń skóry. Macierz aktywowane genowo służą dwóm celom, zabezpieczeniu rany przed infekcjami i odwodnieniem oraz zaopatrzeniu w DNA, który wychwytują komórki naprawcze. Macierze aktywowane genowo według wynalazku mogą obejmować plastry skórne, skórę ze zwłok, bandaże, gaziki, szkielety kolagenowe, takie jak opisane w zgłoszeniu patentowym US 4 505 266 lub US 4 485 097, kremów miejscowych lub żeli. Przed nałożeniem macierzy na miejsce zranienia, można usunąć uszkodzoną skórę lub tkankę martwiczą. DNA wprowadzany do macierzy może kodować różne czynniki wzrostu, włączając czynnik wzrostu keratynocytów (KGF) lub czynnik wzrostu naskórka (EGF). DNA, kodujący lL-1, która jak wiadomo jest silnym induktorem migracji i proliferacji komórek nabłonkowych, będących częścią procesu gojenia, można także wprowadzić do macierzy według wynalazku.
6. Przykład: Materiał implantu do użytku w transferze genu do kości
W celu przenoszenia genów do miejsca naprawy i/lub regeneracji kości in vivo, można stosować wiele materiałów implantowych. Materiały te nasyca się w roztworze, zawierającym DNA lub gen, który ma być przeniesiony do miejsca wtórnego wzrostu kości. Alternatywnie. DNA można wprowadzić do macierzy, co jest zalecanym sposobem wykonania.
Szczególnym przykładem odpowiedniego materiału jest kolagen włóknisty, który można liofilizować po ekstrakcji i częściowym oczyszczeniu z tkanki i potem wyjałowić. Innym szczególnie zalecanym kolagenem jest kolagen typu II, przy czym najbardziej zalecanym kolagenem jest albo rekombinowany kolagen typu II albo mineralizowany kolagen typu II. Przed umieszczeniem w miejscach uszkodzeń, materiały implantów nasyca się w roztworach DNA (lub wirusa) w jałowych warunkach. Nasycanie może trwać przez każdy odpowiedni i dogodny okres, np. od 6 minut do całej nocy. Roztwór DNA (np. plazmidu) będzie jałowym roztworem wodnym, takim jak jałowa woda lub dopuszczalny bufor, o stężeniu generalnie wynoszącym około 0,5-1,0 mg/ml. Aktualnie zalecanymi plazmidami są takie jak pGL2 (Promega), pSV4p-gal, pAd.CMVlazZ i pcDNA3.
7. Przykła d: Detekcja białka in vivo po ekspresji transgenu
7.1. Transgen β-galaktozydazy β-galaktozydazę bakteryjną można wykryć immunohistochemicznie. Próbki tkanki nacięcia kości utrwalono w utrwalaczu Bouinsa, demineralizowanó i potem podzielono na pół wzdłuż płaszczyzny podłużnej. Jedną połowę każdej próbki osadzono w parafinie do następującej potem identyfikacji immunohistochemicznej białka β-galaktozydazy bakteryjnej.
Dla immunohistochemii przekroje poprzeczne (2-3 mm grubości) przeniesiono na szkiełka mikroskopowe powleczone poli-L-lizyną i utrwalono w acetonie w tempraturze 0°C przez co najmniej 20 minut. Przekroje uwodniono w PBS. Aktywność endogenicznej peroksydazy zobojętniono przez zanurzenie przekrojów tkankowych w 0,1% nadtlenku wodoru (w 95% metanolu) w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zobojętnione przekroje przemyto 3x w PBS. W pewnych przypadkach, skrawki sklepienia czaszki demineralizowano przez zanurzenie w 4% EDTA, 5% pirohdonie poliwinylu i 7% sacharozie, pH 7,4, przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Demineralizowane przekroje przemyto 3x przed stosowaniem wobec przeciwciał. Użyto pierwotnych przeciwciał bez rozcieńczania w postaci supernatantu hybrydomy. Oczyszczone przeciwciała nałożono na przekroje tkankowe przy stężeniu 5 mg/ml. Pierwotne przeciwciała wykrywano za pomocą biotynylowanej króliczej IgG antymysiej i streptoawidyny sprzężonej z peroksydazą (Zymed Histostain-SPkit). Po zabarwieniu peroksydazy, przekroje barwiono przeciwnie hematoksyliną.
Bakteryjną β-gal wykrywano także przez oznaczenia zużycia substratu, stosując dostępne w handlu zestawy (np. Promega) zgodnie z instrukcjami producentów.
7.2. Transgen lucyferazy
Lucyferazę wykrywano przez oznaczenia zużycia substratu, stosując dostępne w handlu zestawy (np. Promega) zgodnie z instrukcjami producentów.
189 174
7.3. Transgen PTH
Rekombinowany PTH, taki jak peptyd hPTHl-34, oznaczano w homogenatach tkanki szczeliny uszkodzenia kości, np. stosując dwa dostępne w handlu zestawy do oznaczeń radioimmunologicznych, zgodnie z protokołami producentów (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA).
Jeden zestaw jest Intact PTH-Parathyroid Hormone 100T Kit. To oznaczenie radioimmunologiczne wykorzystuje przeciwciało wobec końca karboksy nieuszkodzonego hormonu i stosuje się je do pomiaru endogen^nego poziomu hormonu w tkance szczeliny uszkodzenia kości. Oznaczenie to można stosować do ustalenia linii podstawowej wartości ekspresji PTH w modelu nacięcia kości u szczura.
Drugi zestaw jest dwustronnym zestawem immunoradiometrycznym do pomiaru PTH szczura. Zestaw ten wykorzystuje powinowactwo oczyszczonych przeciwciał specyficznych wobec końca aminowego nieuszodzonego hormonu szczura (PTH 1-34) i w ten sposób będzie mierzyć wytwarzanie endogenicznego PTH jak również białka rekombinowanego. Wcześniejsze badania ukazały, że te przeciwciała reagują krzyżowo z ludzkim PTH i możliwe jest rozpoznanie rekombinowanych cząsteczek in vivo.
Wartości otrzymane przy zestawie #1 (przeciwciało wobec końca karboksylowego) odjęto od wartości otrzymanych dla zestawu #2 (przeciwciało wobec końca aminowego), aby uzyskać dokładne o czułe pomia ry.
Poziom rekombinowanego peptydu skorelowano więc ze stopniem tworzenia nowej kości.
7.4 Transgen BMP
Białka BMP, takie jak mysi produkt peptydowy transgenu BMP-4, wykrywano immunohistochemicznie przy użyciu specyficznego przeciwciała, które rozpoznaje epitop HA (Majmudar i in., 1991, J. Bone and Min. Res. 6: 869-881), tak jak przeciwciało monoklonalne dostępne w Boehringer-Mannheim. Można także stosować przeciwciała wobec samych białek BMP. Takie przeciwciała, razem z różnymi metodami oznaczania immunologicznego opisano w zgłoszeniu patentowym US 4 857 456 załączonym tu jako odnośnik.
Próbki tkanki nacięcia kości utrwalono przez utrwalenie Bouinsa, demineralizowano i potem podzielono podzielono na pół wzdłuż płaszczyzny podłużnej. Jedną połowę każdej próbki osadzono w parafinie do następującej potem identyfikacji immunohistochemicznej rekombinowanej mysiej cząsteczki BMP-4.
8. P r z y k ł a d: Transfer genu osteotropowego stymuluje regenerację/naprawę kości in vivo.
Następujące doświadczenie miało na celu prześledzenie, czy transfer genu można wykorzystać do utworzenia komórek transfekowanych, które konstytutywnie wykazują ekspresję rekombinowanego hPTHl-34 in vivo, oraz czy ten transgen może stymulować tworzenie się kości. Tempo tworzenia nowej kości analizowano następująco. W czasie sekcji miejsce nacięcia kości ostrożnie rozwarstwiono w celu analizy histomorfometrycznej. Wymiary A-P i M-L tkanki bliznowej zmierzono przy użyciu cyrkla.
Następnie próbki utrwalono przez zanurzenie w utrwalaczu Bouinsa, przemyto w etanolu i demineralizowano w buforowanym kwasie mrówkowym. Zastosowano osadzenie odwapnionego materiału w plastiku, z powodu stabilności wymiarowej metakrylanu podczas sporządzania i krojenia próbki.
Bloki tkanki odwodniono w zwiększającym się stężeniu alkoholu i osadzono. Przekroje o grubości 5 mm cięto w płaszczyźnie wieńcowej przy użyciu mikrotomu Reichert Polycot. Przekroje sporządzono od środka poprzez szerokość jamy szpikowej, aby ochronić losowość próbki. Przekroje do mikroskopii świetlnej zabarwiono przy użyciu trójbarwnego barwienia Goldnera, aby zróżnicować tkankę kostną, osteoidową, chrzęstną i włóknistą. Przekroje przykryto przy użyciu pożywki osadzającej Eukitta (Calibrated Instruments, Ardsley, NY). Przeprowadzono analizy histomorfometryczne w jasnym polu przy użyciu mikroskopu Nikon Optiphot Research oraz standardowych technik stereologicznych liczenia punktów, z użyciem okularu 10 mm x 10 mm z siatką kratkową.
Zmierzono całkowity obszar tkanki blizny przy powiększeniu 125x jako indeks całkowitej intensywności reakcji gojenia. Frakcje obszaru tkanki kostnej, chrzestnej i włóknistej zmierzono przy powiększeniu 250x, aby przebadać stosunkowy udział każdej tkanki w tworzeniu blizny. Ponieważ wymiary szczeliny nacięcia kości odzwierciedlają linię podstawową
189 174 (czas 0), stosowano pomiar obszaru kości w kolejnych odstępach czasu, aby oznaczyć tempo wypełnienia kości. Istotność statystyczną oszacowano przy użyciu analizy wariancji, z porównaniem między grupami post-hoc przeprowadzonym z użyciem testu przedziałów Tukey'a opartego o rozkład t-Studenta.
W modelu nacięcia kości o szerokości 5 mm u szczura, opisanego powyżej, odkryto, że ekspresja transgenu PTH może stymulować regenerację/naprawę kości u żywego zwierzęcia. Jest to szczególnie ważne odkrycie, jako, że wiadomo, że hPTHl-34 jest silniejszym czynnikiem anabolicznym przy podawaniu z przerwami w przeciwieństwie do ciągłego, i jest dostatarczaniem typu ciągłego, które wynika ze sposobów transferu genu tu stosowanych.
9. Przykład: Bezpośredni transfer genu do regenerowanej kości in vivo
Macierze aktywowane genowo, zawierające DNA plazmidu ekspresji ssaka, wszczepiono do wielkich szczelin segmentowych utworzonych w kości udowej dorosłego samca. Wszczepienie macierzy aktywowanych genowo, zawierających plazmidy p-galaktozydazy lub lucyferazy prowadziło do wychwytu DNA i funkcjonalnej ekspresji enzymu przez komórki naprawcze, rosnące do szczeliny. Oprócz tego, wszczepienie macierzy aktywowanej genowo, zawierającej albo plazmid białka morfogenetycznego 4 kości albo plazmid, kodujący fragment hormonu przytarczyc (aminokwasy 1-34), daje w wyniku odpowiedź biologiczną wypełniania szczeliny nową kością. Wreszcie, wszczepienie dwu-plazmidowej macierzy aktywowanej genowo, kodującej białko morfogenetyczne kości 4 i fragment hormonu przytarczyc, które jak się okazało działają synergistycznie in vitro, spowodowało szybsze tworzenie się nowej kości niż przy obu czynnikach oddzielnie. Badania te pokazują po raz pierwszy, że komórkami naprawczymi w kości można genetycznie manipulować in vivo. Mimo tego, że służy ona jako użyteczne narzędzie do badań biologii fibroblastów naprawczych i odpowiedzi gojenia zranień, macierze aktywowane genowo według niniejszego wynalazku mają także szerokie zastosowanie terapeutyczne.
9.1 Materiały i metody
9.1.1. Model gospodarza ssaka
Aby utworzyć nacięcie o szerokości 5 mm, wkręcono cztery szpilki o średnicy 1,2 mm do trzonu kości udowej dorosłych szczurów Sprague-Dawley w uśpieniu ogólnym i przy stałym przepłukiwaniu. Za pomocą matrycy chirurgicznej prowadzono równoległe umieszczenie szpilek, co potwierdzono przez fluorografię (szpilki usytuowano 3,5 mm od brzegu miejsca utrwalenia i w odległości 2,5 mm od siebie). Następnie zewnętrzne miejsce utrwalenia (30 x 10 x 5 mm) zabezpieczono na szpilkach. Płytki utrwalenia zewnętrznego wytworzono ze stopu glinu na młynie CNC, aby zapewnić wysoką tolerancję. Prefabrykowane łączniki razem z podkładkami oraz nagwintowane szpilki wykonano ze stali nierdzewnej. Wszystkie części unieruchomienia wyjałowiono przed operacją gazowym tlenkiem etylenu. Ubytki segmentowe o szerokości 5 mm utworzono w środku trzonu kości za pomocą piły oscylacyjnej Hall Micro 100 (Zimmer Inc., Warsaw, IN). Gąbki kolagenowe umieszczono i utrzymywano w szczelinie nacięcia do momentu otoczenia przez zakrzepłą krew; wstępne badania wykazały, że ten manewr umocował gąbkę w miejscu nacięcia. Nacięcie skóry zamknięto za pomocą klamerek. Unieruchomienie zapewniło konieczną stabilność tak, że chodzenie gospodarza ssaka było nieograniczone przez okres kilku tygodni.
9.1.2. Immunohistochemia
Sporządzono tkanki do mikroskopii świetlnej i przeprowadzono immunohistochemię jak opisano (Wong i in., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5592-5598). Przekroje histologiczne inkubowano z dostępnym w handlu przeciwciałem anty-p-gal (rozcieńczenie 1:200, 5 prim—3 prim) i z dostępnym w handlu przeciwciałem poliklonalnym anty-HAH (rozcieńczenie 1:500, BAbCO).
9.1.3. Oznaczenia lucyferazy i enzymu β-gal
Określono aktywność lucyferazy przy użyciu Luciferase Assay System (Promega) i Enzyme Assay System (Promega) dla β-galaktozydazy, zgodnie z protokołami dostarczonymi przez 15 wytwórców.
9.1.4. Plazmid ekspresji pGAMl
Aby zmontować pGAMl wytworzono mRNA zarodków mysich z 13,5 dnia po zapłodnieniu przy użyciu odczynników zestawu i protokołów (Poly AT Tract mRNA Isolation System I,
189 174
Promega). Do utworzenia cDNA użyto równych ilości mRNA, stosując odczynniki komercyjne (Reverse Transcriptase System, Promega). Pełnej długości sekwencję kodującą cDNA BMP-4 myszy utworzono przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w następujących warunkach: 94°C, 4 minuty, 1 cykl; 94°C, 1 minutę, 65°C, 1 minutę, 72°C, 1 minutę, 30 cykli; 72°C. 8 minut, 1 cykl. Sekwencję primerów PCR oparto na znanej sekwencji mysiego bMP-4 (GenBank): primer w górę 5'-CCATGATTCCTGGTAACCGAATGCTG-3'; primer w dół 5'-CTCAGCGGCATCCGCACCCCTC-3'. Pojedynczy produkt PCR oczekiwanej wielkości (1,3 kb) oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i klonowano do wektora kloningowego TA Invitrogen). Koniec 5' insertu BMP-4 5 modyfikowano dodatków (PCR), dodając 27-nukleotydową sekwencję, która koduje epitop HA i insert BMP-4 klonowano do wektora ekspresji pcDNA3 (InVitrogen). DNA plazmidu wytworzono i sekwencjonowano (obie nici), aby zapewnić orientację i spójność insertu BMP-4.
Ekspresję plazmidu pGAM1 spowodowano przy użyciu zestawu do transkrypcji i translacji in vitro (TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega) zgodnie z protokołami dostarczonymi przez wytwórców. Radioznacznikowanie, immunoprecypitację, wytwarzanie próbek i SDS-PAGE, autoradiografię, chwilową transfekcję i analizę Western, przeprowadzono jak opisano (Yin i in., 1995, J. Biol. Chem. 270: 10147-10160).
9.1.5. Plazmid ekspresji pGAM2
Fragmenty cDNA ludzkiego hormonu przytarczyc, kodujące aminokwasy preprol-34, utworzono przez pCR. Sekwencję primerów PCR oparto o znaną sekwencje ludzkiego PTH (GenBank): primer w górę 5'-GCGGATCCGCGATGATACCTGCAAAAGACATG-3'; primer w dół 5'-GCGGATCCGCGTCAAAAATTGTGCACATCC-3'. Ta para primerów tworzyła miejsca BamHI na obu końcach fragmentu PCR. Fragment trawiono za pomocą BamHI i poddano ligacji do miejsca kloningowego BamHI w wektorze retrowirusowym PLJ (Wilson i in., 1992, Endocrinol. 130: 2947-2954). Klon z insertem w orientacji kodowania (pGAM2) ewentualnie izolowano i scharakteryzowano przez analizę sekwencji DNA.
Aby utworzyć szczepy retrowirusowe, upakowaną linię komórkową φ CRIP (J.M.Wilson i in., 1992, Endocrinology 130: 2947-2954) transfekowano za pomocą 10 pg rekombinowanego DNA wektora przy użyciu metody fosforanu wapnia. Po całonocnej inkubacji pożywkę hodowlaną (pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco), uzupełnioną 10% surowicą płodu bydlęcego, penicyliną (100 jenostek/ml) i streptomycyną (100 mg/ml) (wszystkie odczynniki od Gibco-BRL Life Technologies, Inc.), zawierającą cząsteczki retrowiriona zebrano i nałożono na hodowane komórki Rat-1. Niezależne klony transdukowane z powodzeniem otrzymano przez standardowe procedury infekcji i selekcji. W skrócie, hodowane komórki Rat-1 hodowano do konfluencji, podzielono 1:10 i poddano selekcji w G418 (1 mg/ml, Gibco-BRL Life Technologies, Inc.). W pewnych przypadkach kolonie odporne na antybiotyki zlano do pojedynczej hodowli. W innych przypadkach, pojedyncze kolonie opornych komórek zachowywano. Podobnych metod użyto do utworzonych klonów komórek Rat-1 transdukowanych retrowirusem BAGT, które kodują bakteryjny enzym β-gal.
Stężenie hPTH1-34 w pożywkach hodowli komórek oszacowano przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczeń radioimmunologicznych (INS-PTH, Nichols) i zgodnie z protokołem wytwórcy. Aktywność biologiczną peptydu kodowanego przez pGAM2 oceniano jak opisano (McCauley i in., 1994, Mol. Cell. Endocrinol. 101: 331-336).
9.1.6. Wytwarzanie gąbek kolagenowych aktywowanych genowo
Dla każdej szczeliny nacięcia kości, liofilizowany kolagen z tchawicy bydlęcej (10 mg, Sigma) zamoczono całkowicie w jałowym roztworze 0,5-1,0 mg DNA plazmidu i pozostawiono do inkubacji przez 1-16 godzin w temperaturze 4°C przed wszczepieniem.
9.1.7. Radiografia
Co tygodniowe radiografy ze zwykłą błoną (widok tył-przód) otrzymywano w czasie czuwania gospodarza-ssaka, przy użyciu przenośnego urządzenia rentgenowskiego (GE, model 100). Ekspozycja wynosiła 1/10 sekundy, przy 57 kV i 15 ma.
9.2. Wyniki
9.2.1. Model osteotomii
W naszym modelu stosowaliśmy 5 mm osteotomię pośrodku trzonu kości udowej dorosłego szczura. Miejsce osteotomii stabilizowano aparatem mocującym zaopatrzonym w cztery
189 174 szpilki. Do odbudowy kości po osteotomii dochodzi u szczura 9 tygodni po zabiegu; sposób odbudowy zależy od wielkości przerwy; przerwa o długości 2 mm goi się przez wytworzenie kostniny, lecz przerwa o długości 5 mm goi się przez wytworzenie połączenia włóknistego (Rouleau, J.P. i wsp., Trans. Ortho. Res. Soc. 20:). W warunkach kontrolowanych u ssaków obserwowanych przez 13 tygodni po zabiegu potwierdzono, że przerwy o długości 5 mm typowo goją się poprzez wytworzenie połączenia włóknistego. Cotygodniowe zwykłe zdjęcia rentgenowskie i badania histologiczne udowodniły, że nie dochodziło do wytwarzania kostniny u ssaków, u których dokonano jedynie 5 mm osteotomii (n=3), 5 mm osteotomii wraz z założeniem gąbki kolagenowej (n=10) lub dokonano 5 mm osteotomii wraz z założeniem gąbki kolagenowej zawierającej odsłonięty gen markerowy plazmidu DNA (n=23). We wszystkich 36 przypadkach kontrolnych zagojenie przerw dokonało się poprzez nagromadzenie tkanki włóknistej. W kontrolnych kościach udowych stwierdzono miejscowe okołokostne wytwarzanie nowej kości (powikłanie po umieszczeniu szpilek). Po zabiegu operacyjnym obserwowano również miejscową przejściową odpowiedź zapalną w tkance przerw.
9.2.2. Badania genu markerowego
W badaniach wstępnych dokonano z powodzeniem transferu plazmidów ekspresyjnych DNA lacZ i (--gal in vivo. Celem była standaryzacja sposobu wytwarzania macierzy aktywowanej genem i przebiegu pooperacyjnego. Lucyferazę kodującą GAM umieszczono w przerwie po osteotomii jednego szczura, a (-gal kodujący macierz umieszczono w przerwie po osteotomii u drugiego zwierzęcia. Trzy tygodnie później wytworzono homogenizat z przerw (zawierający tkankę ziaminową), po dokładnym usunięciu otaczającej kości, chrząstki i mięśni szkieletowych. Próbki z każdego homogenizatu oceniano pod względem ekspresji enzymów w teście wykorzystania substratu. W każdej próbce homogenizatu wykrywano oczekiwaną aktywność enzymu. W innych doświadczeniach, w zmienionych warunkach (np. dawka DNA, czas do ekspresji białka badanego) uzyskano dodatnie wyniki.
9.2.3. Transferowanie genu BMP-4
Po udowodnieniu, że komórki przerwy wykazują ekspresję enzymów czynnościowych po wychwyceniu plazmidu DNA z macierzy, postawiliśmy pytanie, czy transfer genu można wykorzystać do modulacji odnowy kości. Do nadekspresji dobraliśmy BMP-4, czynnik pobudzający odnowę kości, ulegający w warunkach prawidłowych ekspresji w komórkach macierzystych w trakcie zrostu kości po złamaniu. Wytworzono za pomocą PGR cDNA BMP-4 myszy, o pełnej długości, i subklonowano do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcDNAS (Imritrogen) (fig. 2). Dla swoistego wykrywania białek rekombinacyjnych, koniec 3' sekwencji kodującej BMP-4 zmodyfikowano przez dodanie epitopu hemaglutyniny (HA). Z tej struktury (pGAMI) dokonano ekspresji rekombinacyjnego BMP-4, stosując sposoby transkrypcji i translacji in vitro. Badania immunoprecypitacji potwierdziły zdolność epitopu HA do rozpoznawania przez przeciwciała poliklonalne anty-HA. Oceniono biosyntezę rekombinacyjnego BMP-4 po przejściowej transfekcji hodowlanych komórek 293T plazmidem DNA pGAMI. Cząsteczki BMP-4, jak to udowodniono przez immunoprecypitację, ulegały połączeniu w homodimery, wydzieleniu i dalszej obróbce, jak tego oczekiwano. Wyniki te łącznie potwierdzają rozpoznawanie epitopu HA przez przeciwciała poliklonalne anty-HA.
Gąbki kolagenowe zawierające GNA pGAMI umieszczono w przerwach u dziewięciu dorosłych szczurów utrzymywanych przy życiu przez 4-24 tygodnie. U jednego ssaka, uśmierconego 4 tygodnie po zabiegu, badania immunohistochemiczne z zastosowaniem przeciwciał anty-HA udowodniły ekspresję pGAMI przez fibroblasty odnowy w obrębie przerwy. Było to istotne, biorąc pod uwagę, że nie obserwowaliśmy barwienia fałszywie dodatniego w obserwacji tkanki przerwy pochodzącej od trzynastu ssaków kontrolnych Widoczne mikroskopowo ogniska kostniny, pochodzące z obu brzegów rany chirurgicznej, obserwowano również w próbkach uzyskanych po 4 tygodniach od zabiegu. Podobnie jak to uprzednio opisywano odnośnie tworzenia kości poprzez autoindukcję (Urist, 1965, Science 150:893-899), ogniska te były utworzone z płytek kostnych pokrytych wielkimi osteoblastami o kształcie sześcianu i wsparte komórkową tkanką łączną utworzoną z wrzecionowatych różnokształtnych fibroblastów i naczyń włosowatych. U siedmiu ssaków uśmierconych 5-12 tygodni po zabiegu operacyjnym, ilość radiograficznej kostniny stabilnie rosła (fig. 3A), mimo że immunohistochemicznie nie wykrywano BMP-4 kodowanej przez transgen. Wytwarzanie mostków, defi189 174 niowane jako rozprzestrzenianie się kostniny z brzegów rany chirurgicznej przez przerwę po osteotomii, obserwowano typowo po 9 tygodniach. Dziewiąty ssak przeżył bez powikłań 24 tygodni po zabiegu. Po 18 tygodniach ilość nagromadzonej kostniny była wystarczająca dla usunięcia aparatu mocującego; ssak był w stanie chodzić dobrze przez następne 6 tygodni (fig. 3A). Po uśmierceniu stwierdzono, że przerwę wypełniła kostnina ulegająca czynnemu remodelowaniu, z wyjątkiem cienkiego pasma częściowo przepuszczalnej dla promieniowania rentgenowskiego tkanki w okolicy dystalnego (dalszego) brzegu przerwy. Jako że ssak był w stanie chodzić bez aparatu mocującego, uważamy, że pasmo to uległo częściowej mineralizacji. Z tą hipotezą zgodny jest wynik badań biomechanicznych (Frankenburg i wsp., 1994, Trans. Ortho. Res. Soc. 19:513), który udowodnił, że wytrzymałość mechaniczna zagojonej przerwy jest w zasadzie taka sama, jak nieoperowanej kości udowej tego samego ssaka (różnica 6,3% w teście maksymalnego obciążenia skręcającego). Radiologiczny wygląd przeciwstronnej (nieoperowanej) kości udowej pozostał niezmieniony we wszystkich dziewięciu przypadkach, co wskazuje, że działanie transferu genu i nadekspresji BMP-4 było ograniczone do przerwy po osteotomii.
9.2.4. Transfer i ekspresja koktajlu plazmidowego (BMP-4 + PTH1-34)
Odnowa kości w warunkach prawidłowych zależy od wielu czynników, działających w określonej kolejności; zastanawialiśmy się zatem, czy ekspresja kilku czynników anabolicznych pobudzałaby tworzenie kości silniej, niż pojedynczy czynnik. Dla sprawdzenia tej hipotezy postanowiliśmy zastosować GAM dwuplazmidowy, kodujący BMP-4 i fragment peptydowy parathormonu (PTH). PTH stanowi 84-aminokwasowy hormon zwiększający stężenie Ca2ł w osoczu i płynie zewnątrzkomórkowym. W tkankach szkieletowych, okresowe podawane fragmentu PTH spełniającego strukturalne kryteria aktywności biologicznej (aa 1-34) daje prawdziwy efekt anaboliczny: liczne badania in vivo i in vitro dostarczają dowodów na to, że podawane PTH 1-34 u ssaków (w tym szczurów) powoduje tworzenie pozbawionej wiązań tkanki kostnej wysokiej jakości, na skutek połączonego działania hamującego na osteoklasty i działania pobudzającego na komórki osteogenne (Dempster i wsp., 1993, Endocrin Rev. 14: 690-709). Wiadomo, że peptyd PTH 1-34 działa synergistycznie z BMP-4, który powoduje regulację w górę ekspresji czynnościowych receptorów PTH powierzchni komórki w różnicujących się osteoblastach (Ahrens i wsp., 1993, J. Bone Min. Res. 12: 871-880).
Metodą PGR wytworzono fragment cDNA kodujący ludzki PTH1-34. Dla ustalenia jego aktywności biologicznej fragment subklonowano do wektora retrowirusowego PLJ (Wilson i wsp., 1992, Endocrin, 130: 2947-2954), wytwarzając plazmid ekspresyjny pGAM2 (fig. 4A). Wytworzono zapas niezdolnego do replikacji rekombinacyjnego retrowirusa i podano do hodowli komórek Rat-I. Wytworzono niezależne komórki transdukowanych komórek Rat-I i udowodniono stabilną integrację i ekspresję DNA retrowirusa analizami Southern i Northern. Dla ustalenia stężenia ludzkiego PTH 1-34 w pożywkach poszczególnych klonów zastosowano test radioimmunologiczny. Komórki ROS 17/2.8 posiadają receptory PTH na powierzchni komórki; receptory te należą do nadrodziny receptorów związanych z białkiem G (Dempster i wsp., 1993, Endocrin. Rev. 14: 690-709). Inkubacja komórek ROS 17/2.8 z próbkami pożywki z stabilnie transdukowanej linii komórkowej (wydzielającej >2 pg/ml poprzez test radioimmunologiczny) spowodowała 2,7-krotny wzrost odpowiedzi CAMP w porównaniu z kontrolą; wynik ten potwierdza aktywność biologiczną wydzielonego peptydu PTH 1-34.
Gam zawierający sam tylko plazmid DNA pGAM2 i pobudzony GAM zawierający oba plazmidy ekspresyjne DNA BMP-4 i PTH1-34 wszczepiano następnie do przerwy po osteotomii dalszych trzech ssaków. Wytwarzanie mostków po 4 tygodniach obserwowano u wszystkich trzech ssaków (w tym momencie jednego ssaka uśmiercono w celu wykonania badań histologicznych), a po 12 tygodniach od zabiegu ilość wytworzonej nowej tkanki kostnej u pozostałych ssaków umożliwiała usunięcie zewnętrznego aparatu mocującego (fig. 5). Oba ssaki chodziły dobrze w czasie publikacji, to znaczy, odpowiednio, 15 i 26 tygodni po dokonaniu wszczepu. W oparciu o zwykłe zdjęcia rentgenowskie można stwierdzić, że działanie transferu genu i nadekspresji wydawało się ograniczone do przerwy po osteotomii.
W następstwie badań z użyciem gąbki kolagenowej udowodniono również, że DNA plazmidu można dostarczać do komórek w sposób powolny, umożliwiający otorebkowanie wewnątrz preparatu blokowych kopolimerów cząstek polimleczanowo-poliglikolowych. Wyniki
189 174 wskazują, że hodowlę komórek można transfekować DNA plazmidu uwolnionym z cząstek polimleczanowo-poliglikolowych. Wyniki wskazują również, że fibroblasty naprawcze (model osteotomii u szczura) in vivo wychwytują DNA plazmidu pGAM2, który ulega w nich ekspresji, po uwolnieniu DNA z cząstek polimleczanowo-poliglikolowych. Jak to pokazano na fig. 7, ekspresji kodowanego przez plazmid PTH1-34 towarzyszy tworzenie znacznej ilości kostniny w przerwie po osteotomii.
W sumie badania te wykazują, że technika macierzy aktywowanej genami nie wymaga zastosowania macierzy z kolagenu. Tak więc technika ta jest dostatecznie szeroka dla połączenia jej z macierzami zarówno biologicznymi, jak i syntetycznymi.
10: Przykład: Transfer genów do regenerującego ścięgna i do regenerującego więzadła krzyżowego in vivo
Istnieje potrzeba kliniczna pobudzenia tworzenia blizny w czasie odnowy ścięgna Achillesa i więzadeł (barku i kolana) w celu zwiększenia odporności mechanicznej tkanki po urazie. Opracowano układ modelowy, w którym tworzy się odcinkowe ubytki ścięgna Achillesa i jako wszczep do ścięgna/środek dostarczający cząsteczki stosuje się nowy materiał biologiczny, warstwę podśluzówkową jelita cienkiego lub SIS. W tym przykładzie udowodniono zdolność dostarczania i ekspresji struktur z genem markerowym w regenerującej tkance ścięgna z zastosowaniem przeszczepu SIS.
10.1. Materiał i metody
Wytworzono odcinkowe ubytki ścięgna Achillesa i jako wszczep do ścięgna/środek dostarczający cząsteczki zastosowano preparat SIS. Wytworzono roztwory podstawowe plazmidów (psVogal, Promega) według rutynowych sposobów (Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Materiał przeszczepowy SIS wytworzono z odcinka jelita czczego dorosłych świń (Badylak i wsp., 1989, J. Surg. Res. 47:74-80). Po zebraniu usunięto tkanki krezki, odcinek wywrócono i usunięto śluzówkę i powierzchniową warstwę tkanki podśluzówkowej poprzez mechaniczną abrazję. Po ponownym wywróceniu odcinka warstwę surowiczą i mięśniową przepłukano, wyjałowiono poprzez obróbkę rozcieńczonym kwasem paraoctowym i przechowywano w temperaturze 4°C do czasu użycia.
Psy (kundle) (we wszystkich badaniach) znieczulono, zaintubowano, umieszczono w pozycji leżącej na prawym boku na ogrzewanej podkładce i utrzymywano w znieczuleniu poprzez inhalację. Dla uwidocznienia ścięgna Achillesa wykonano boczne nacięcie od połączenia mięśniowo-ścięgnistego do powięzi podeszwy. Dookoła środkowej części ścięgna owinięto podwójną warstwę SIS, oba końce zeszyto, usunięto 1,5 cm odcinek ścięgna z bocznego otwarcia w materiale przeszczepu i zamknięto ranę. Kończynę unieruchomiono na 6 tygodni, a następnie umożliwiono zwierzęciu swobodne posługiwanie się nią przez 6 tygodni. Tkankę przeszczepu pobrano w niżej wymienionych punktach czasowych, utrwalono w roztworze Bouinsa i zatopiono w parafinie. Wykonano skrawki (przekroje tkanki) (8 pm) i zastosowano je do badań immunohistochemicznych.
10.2. Wyniki
W pierwszym badaniu wszczepienie samego tylko materiału SIS (przeszczep „tylko SIS”) zwiększało odnowę ścięgna Achillesa po wytworzeniu odcinkowego ubytku u psów kundli przez aż 6 miesięcy po zabiegu. Na skutek procesu remodelowania doszło do szybkiego wytworzenia tkanki ziaminowej i w końcu do rozpadu przeszczepu. Nie wytworzyła się tkanka bliznowa i nie obserwowano objawów immunologicznego odrzucenia przeszczepu.
W drugim badaniu SIS namoczono w roztworze DNA plazmidu (przeszczep „SIS + plazmid”) i następnie wszczepiono jako przeszczep do ścięgna Achillesa (n=2 psy) lub przeszczep do więzadła krzyżowego (n=2 psy) u zdrowych psów kundli. Plazmid pSVPgal, wykorzystujący sekwencje regulatorowe małpiego wirusa 40 dla aktywności β-galaktozydazy β-gal) był wykrywalny immunohistochemicznie przy zastosowaniu przeciwciała swoistego u 4/4 ssaków. W kontroli ujemnej nie wykrywano aktywności β-gal w nieoperowanym ścięgnie Achillesa i więzadle krzyżowym tych ssaków. Wydaje się zatem, że SIS ułatwia wychwyt zwrotny i następnie ekspresję DNA plazmidu przez komórki nowej tkanki ścięgna, zarówno w ścięgnie, jak i w więzadle.
W trzecim badaniu oceniano czas ekspresji transgenu P-gal. Wszczepiano przeszczepy SIS + plazmid na 3, 6, 9 i 12 tygodni (n=2 psy na każdy punkt czasowy) i immunohistochemicznie badano ekspresję transgenu. Wykonano skrawki z poprzecznego przekroju (8 μιη) utrwalonej w roztworze Bouinsa i zatopionej w parafinie tkanki i osadzono je na szkiełkach Probeon Plus (Fisher). Zgodnie z protokołem wykonano badanie immunohistochemiczne z zastosowaniem zestawu Histostain-SP (Zymed). Pokrótce, szkiełka inkubowano wraz z przeciwciałami skierowanymi przeciwko P-galaktozydazie, o znanej charakterystyce (rozcieńczenie 12:00, Prime-33 Prime), płukano PBS, inkubowano z biotynylowanym drugim przeciwciałem, płukano, barwiono koniugatem enzymatycznym z mieszaniną substratchromogen, i następnie barwiono kontrastowo hematoksyliną i eozyną.
Aktywność (-gal bakteryjnej wykrywano w ścięgnach z wszczepami SIS+plazmid (8/8 ssaków). Jakkolwiek nie stwierdzono ścisłej zależności ilościowej, ekspresja trangenu wydawała się osiągać maksimum po 9-12 tygodniach. U 35 ssaków, które otrzymały wszczep „tylko SIS,, nie wykrywano ekspresji bakteryjnego genu P-gal.
11Przykład: Adenowirusowy transfer genu do regenerującej kości in vivo
Alternatywnym sposobem osiągnięcia transferu genu in vivo do regenerującej tkanki jest wykorzystanie transferu, którego mediatorem jest adenowirus. Uzyskano skuteczny adenowirusowy transfer genu - struktury genu markerowego - do komórek odnowy kości w modelu osteotomii u szczura.
11.1. Materiały i metody
Adenowirusowy wektor pAd, CMVlacZ, stanowi przykład 10 pozbawionego zdolności do replikacji wektora adenowirusowego, zdolnego do replikacji w komórkach permisywnych (Stratford-Perricaudet i wsp., 1992, J. Clin. Invest. 90:626-630). W tym wektorze do prowadzenia transkrypcji lacZ z sekwencją poliadenylacji SV40, klonowaną w kierunku końca 3' od genu reporterowego, stosuje się wczesny wzmacniacz/promotor cytomegalowirusowy (CMV) (Davidson i wsp., 1993, Nature Genetics 3:219-223).
pAd.RSV4 ma w zasadzie taki sam rdzeń, jak pAdCMVlacZ, jednakże promotor CMV i miejsce klonujące Bglll zastąpiono w sposób kasetowy fragmentem Bglll, zawierającym promotor RSV, wielokrotne miejsce klonujące i miejsce poli(A+). Większa elastyczność tego wektora jest korzystna w subkloncwaniu genów osteotropowych, takich jak fragment cDNA hPTHl-34, do zastosowania w dalszych badaniach.
Wszczep Ultra Fiber™ namoczono na 6 minut w roztworze wirusa AdCMVlacZ (101ο-1011 jednostek tworzenia łysinek, czyli PFU/ml) i następnie wszczepiono do miejsca osteotomii. Pozostawiono ubytek do zagojenia na 3 tygodni; w tym czasie monitorowano gojenie się rany przez cotygodniowe badanie rentgenowskie. Po trzech tygodniach oceniono, że 4% ubytku wypełniło się tkanką kalusową. Ssaka uśmiercano, a tkanki utrwalano w roztworze Bouinsa i następnie demineralizowano przez 7 dni w standardowych roztworach kwasu mrówkowego.
11.2 Wyniki
Wyniki udowodniły ekspresję produktu genu markerowego w chondrocytopodobnych komórkach przerwy po osteotomii (fig. 6). Również w preosteoblastach obserwowano sygnał ukierunkowany na jądro.
12. Przykład: Transfer genów do mięśnia szkieletowego
Istnieje potrzeba kliniczna pobudzenia tworzenia blizny w czasie odnowy tkanek miękkich innych niż ścięgno Achillesa i więzadła (barku i kolana) w celu zwiększenia odporności mechanicznej tkanki po urazie. Opracowano układ modelowy, w którym tworzy się nacięcia w mięśniu szkieletowym dorosłego szczura i jako wszczep do mięśnia szkieletowego/środek dostarczający gen stosuje się szew pokryty preparatem cząstek PLGA o powolnym uwalnianiu i DNA plazmidu. Dla udowodnienia możliwości zastosowania kompozycji pokrywających i sposobów według wynalazku, szew chirurgiczny pokryto DNA markerowym (kodującym ludzką łożyskową fosfatazę zasadową) i zastosowano go do zszycia tkanki mięśniowej szczura. W tym przykładzie udowodniono zdolność transferowania i ekspresji DNA w tkance zeszytej pokrytym szwem.
12.1. Materiały i metody
12.1.1. Wytwarzanie kompozycji pokrywającej DNA-PLGA
189 174
Do 1,5 ml roztworu PLGA/chloroformu (3% ((stężenie wagowe) 50/50 polimeru polimleczanówo-poliglikolanówego PLGA, o średniej masie cząsteczkowej 90000 i naturalnej lepkości 1,07), dodano 0,2 ml roztworu zawierającego markerowe DNA kodujące ludzką łożyskową fosfatazę zasadową (1 mg DNA, 0,5 mM Tris-EDTA, 0,5 mM EDTA, pH 7,3). Roztwór zemulgowano poprzez mieszanie wirowe przez 2 minuty i następnie sonikację przez 30 sekund w temperaturze około 0°C, z zastosowaniem sondowego sonikatora o mikrozakończeniu i mocy wyjściowej 55 watów. W wyniku tego procesu uzyskano emulsję o bardzo mlecznym wyglądzie.
12.1.2. Pokrywanie szwu chirurgicznego
W kawałku pokrytej teflonem folii (Norton Performance Plastic Corp., Akron. OH) przebito otwór igłą o przekroju 22. Na otworze umieszczono kroplę (około 60 β) emulsji DNA-PLGA. Przez otwór przeciągnięto szew chromowy 3-0 (Ethicon) o długości 70 cm, w celu pokrycia szwu. W czasie przechodzenia szwu przez otwór dochodziło do pokrycia go cienką (grubość ok. 30 βΐη) jednolitą warstwą kompozycji pokrywającej. Szew pozostawiono do wyschnięcia w powietrzu przez około 3 minuty, i proces pokrywania powtarzano 15 razy, pozostawiając każdą warstwę powłoki do wyschnięcia. Pokryty szew badano w mikroskopie elektronowym (150X) i stwierdzono, że szew jest pokryty jednolitą warstwą DNA-PLGA. Ponadto powłoka pozostawała nienaruszona nawet po wielokrotnym przewleczeniu szwu przez tkankę.
12.1.3. Odnowa mięśnia szkieletowego z użyciem pokrywanego szwu
Szwem wytworzonym według powyższego opisu zeszyto tkankę mięśni szkieletowych zdrowych dorosłych szczurów, uzyskując zadowalający efekt chirurgiczny. Jakość zeszycia tym szwem była dobra. Tydzień później mięsień wraz ze szwem rozdzielono, zamrożono szybko w ciekłym azocie i zmielono na proszek. Proszek inkubowano w 200 p1 bufora litycznego, eksponowano na trzy cykle zamrażania i rozmrażania i klarowano. Klarowną ciecz badano pod kątem aktywności fosfatazy zasadowej standardowymi metodami po inkubacji w temperaturze 65 °C.
12.2. Wyniki
Wyniki wskazują, że mięsień szkieletowy szczura zszyty pokrytym szwem i wyjęty tydzień później wykazywał aktywność fosfatazy zasadowej, co oznacza, że markerowy gen fosfatazy zasadowej uległ ekspresji w tkance mięśniowej. W próbkach kontrolnych nie stwierdzono istotnej aktywności fosfatazy zasadowej. Dane te wskazują, że emulsje można stosować do skutecznego pokrywania szwów i dostarczania genów do proliferujących komórek odnowy in vivo.
13. Przykład: Transfer genów do naczyń krwionośnych
Istnieje kliniczna potrzeba zapobiegania nadmiernemu włóknieniu (restenozie), do której może dochodzić na przykład w czasie odnowy naczyń krwionośnych po angioplastyce. Można to osiągnąć na przykład poprzez podawanie genów kodujących inhibitory lizylooksydazy, lub poprzez transferowanie genów kodujących niektóre TGF-β. Istnieje ponadto kliniczna potrzeba regulacji angiogenezy, jak na przykład w zaburzeniach, w których dochodzi do niewydolności naczyń, kiedy to celem byłoby pobudzenie tworzenia nowych naczyń w celu zapobiegania niedotlenieniu i śmierci komórek. Opracowano układ modelowy, w którym komórki odnowy w dużych naczyniach krwionośnych u królika transfekuje się preparatem cząstek PLGA o opóźnionym uwalnianiu i DNA plazmidu. Komórki odnowy są obecne, ponieważ w takich naczyniach krwionośnych królika obecne są uszkodzenia komórek piankowatych, podobne do klinicznej miażdżycy u ludzi. Niniejszy przykład dowodzi możliwości dostarczania i ekspresji struktur genu markerowego do komórek odnowy dużych naczyń krwionośnych.
13.1. Materiały i metody
Do tego badania zastosowano białe króliki nowozelandzkie obu płci, o masie ciała 3,1-3,5 kg. Króliki znieczulono ketaminą (35 mg/kg) i ksylazyną(5 mg/kg), podawanymi domięśniowo, po czym podawano znieczulenie podtrzymujące - ketaminę dożylnie (8 mg/kg) do żyły kątowej. Izolowano odcinki, o długości około 2 cm, obu tętnic biodrowych, między miejscem podziału aorty zstępującej a więzadłem pachwinowym, zaszyto je proksymalnie i pod189 174 wiązano wszystkie małe gałęzie tych odcinków tętnic. Zapobiegano powstaniu skrzeplin miejscowych poprzez podawanie heparyny (100 mg) do usznej żyły kątowej. Do odcinków tętnic biodrowych przez arteriotomię biodrową wprowadzono cewnik do angioplastyki z balonikiem (balonik 2,0 mm) i balonik nadmuchiwano przez 1 minutę pod ciśnieniem 8 atm.
Po nadmuchaniu balonika usunięto cewnik i wstrzyknięto dotętniczo 20 mg heparyny dla zapobieżenia dystalnej zakrzepicy. Oba końce tętnicy biodrowej zaszyto szwem jedwabnym 10.0 i do każdej z tętnic biodrowych podawano 5 mg/ml zawiesiny DNA-nanocząsteczek przez 3 minuty pod ciśnieniem 0,5 atm. Ranę zaszyto. Króliki uśmiercono 2 tygodnie po angioplastyce balonikowej i podaniu nanocząstek. Wyizolowano obie tętnice biodrowe przez pionowe nacięcie podbrzusza. Obustronnie wycięto 2 cm odcinek tętnicy biodrowej. Jako próbki kontrolne pobrano tętnice szyjne królików. Tkankę utrwalono w ciekłym azocie do badania fosfatazy zasadowej.
13.2. Wyniki
Wyniki badania ekspresji fosfatazy wskazują, że preparat nanocząstek z DNA był zdolny do dostarczania kwasów nukleinowych w celu odnowy komórek tętnic biodrowych dorosłych królików po urazie cewnikiem balonikowym. Zarówno prawa, jak i lewa tętnica biodrowa były dodatnie pod względem aktywności fosfatazy po ekspozycji na preparat nanocząstek z DNA. W kontrolnej tętnicy nie stwierdzono aktywności fosfatazy·'. Te dodatnie wyniki wskazują, że po ekspozycji na macierz aktywowaną genami komórki naprawcze dużych naczyń krwionośnych mogą wychwytywać cząsteczki kwasów nukleinowych, które mogą ulegać w nich ekspresji.
Zakres niniejszego wynalazku nie jest ograniczony przez przedstawione wykonania, które są ilustracją niektórych aspektów wynalazku; wszelkie klony i sekwencje DNA i aminokwasów, czynnościowo równoważne, są objęte zakresem niniejszego wynalazku. Specjalista może dokonać rozmaitych innych modyfikacji wynalazku na podstawie powyższego opisu i rysunków. Modyfikacje takie są objęte zakresem niniejszego wynalazku, określonym w załączonych zastrzeżeniach. Należy również rozumieć, że wszystkie wielkości par zasad podane dla nukleotydów są przybliżone i zastosowane dla ilustracji.
189 174
STRUKTURA pGA/Wi
Fig. 2
Fig. 3A
189 174
tygodnie po wszczepieniu (przed uśmierceniem)
Fig. 3B
Fig. 4 A-B
189 174
Fig. 5
189 174
Fig. 6
Fig. 7
189 174
Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz zawierającą jedną lub więcej cząsteczek DNA kodujących polipeptydy o aktywności stymulującej rozrost naczyń, cząsteczki antysensowne lub rybozymowe do wytwarzania leku do pobudzania tworzenia się naczyń krwionośnych, przy czym macierz ta działa jako rusztowanie promujące przenikanie komórek.
  2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje czynnik wzrostu lub cytokinę.
  3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)-l, (FGF)-2, czynnik wzrostu śródbłonkowych komórek naczyń (VEGF) lub płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF).
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że macierz stanowi kompozycja kolagenowa, metalowa, biodegradowalnego lub zdefiniowanego chemicznie siarczanu wapnia, trifosforanu wapnia, hydroksyapatytu, kwasu polimlekowego, polibezwodnikowa, szkła biologicznego, glinianu, materiału bioceramicznego, materiału metalowego, biokompatabilngo i biodegradowalnego polimeru, oczyszczonych białek lub pół-oczyszczonych macierzy zewnątrzkomórkowych.
  5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że komórki stanowią komórki śródbłonkowe naczyń.
  6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że komórkami są fibroblasty, komórki śródbłonkowe naczyń włosowatych, perycyty, jednojądrzaste komórki zapalne, segmentowe komórki zapalne, lub komórki tkanki ziarnistej.
  7. 7. Zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz zawierającą jedną lub więcej cząsteczek DNA kodujących cząsteczki antysensowne lub rybozymowe do wytwarzania leku do hamowania tworzenia się naczyń krwionośnych, przy czym macierz ta działa jako rusztowanie promujące przenikanie komórek.
  8. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje czynnik anty-angiogeniczny.
  9. 9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że co najmniej jedna cząsteczka DNA koduje trombospodynę, TGF-β lub angiostatynę.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że macierz stanowi kompozycja kolagenowa, metalowa, biodegradowalnego lub zdefiniowanego chemicznie siarczanu wapnia, trifosforanu wapnia, hydroksyapatytu, kwasu polimlekowego, polibezwodnikowa, szkła biologicznego, glinianu, materiału bioceramicznego, materiału metalowego, biokompatabilngo i biodegradowalnego polimeru, oczyszczonych białek lub pół-oczyszczonych macierzy zewnątrzkomórkowych.
  11. 11. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że komórki stanowią komórki śródbłonkowe naczyń.
  12. 12. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że komórkami są fibroblasty, komórki śródbłonkowe naczyń włosowatych, perycyty, jednojądrzaste komórki zapalne, segmentowe komórki zapalne, lub komórki tkanki ziarnistej.
    Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do pobudzania wzrostu naczyń i zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do hamowania tworzenia się naczyń.
    189 174
    W niniejszym wynalazku wykorzystuje się sposób in vivo prezentacji i bezpośredniego transferu DNA, kodującego białko lecznicze, do komórek naprawczych ssaków. Sposób obejmuje wszczepienie macierzy, zawierającej DNA, o którym mowa (przytaczanej tu jako „macierz aktywowana genowo”), do miejsca świeżego zranienia. Komórki naprawcze, które powstają zwykle w żywej tkance, otaczającej ranę, proliferują i migrują do macierzy aktywowanej genowo, w której napotykają, wchłaniają i wykazują ekspresję DNA. Transfekowane komórki naprawcze działają zatem jako bioreaktory in situ (umiejscowione wewnątrz miejsca zranienia), które wytwarzają czynniki (RNA kodowane przez DNA, białka itd.), powodujące gojenie rany. Kompozycję stosowaną zgodnie z wynalazkiem można wykorzystać do przenoszenia DNA.
    Takie kompozycje obejmują każdą odpowiednią macierz w połączeniu z DNA, o którym mowa.
    2. Tło wynalazku
    2.1 Gojenie rany
    Aktualnie dostępne terapie, dotyczące gojenia ran obejmują podawanie białek terapeutycznych. Takie terapeutyczne białka mogą być czynnikami regulatorowymi, związanymi z normalnym procesem gojenia, takimi jak hormony układowe, cytokiny, czynniki wzrostu i inne białka, które regulują proliferację i różnicowanie się komórek. Czynniki wzrostu, cytokiny i hormony, które jak wiadomo, posiadają taką zdolność gojenia ran, obejmują, np. nadrodzinę czynnika wzrostu-β transformującego białka (D.A.Cox 1995, Cell Biology International, 19:357-371), kwasowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) (J.Slavin, 1995, Cell Biology International, 19:431-444), czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów (M-CSF) oraz czynniki regulatorowe wapnia, takie jak hormon przytarczyc (PTH).
    Stosowaniu białek terapeutycznych, czyli cytokin, towarzyszy wiele problemów w leczeniu zranień. Po pierwsze, oczyszczanie i/lub wytwarzanie rekombinacyjne białek terapeutycznych jest często drogie i czasochłonne. Jednak mimo najlepszych starań, preparaty oczyszczonych białek są często nie stabilne, czyniąc przechowywanie i stosowanie niewygodnym, a niestabilność białka może prowadzić do nieoczekiwanych reakcji zapalnych (na produkty rozpadu białek), które są toksyczne dla gospodarza.
    Po drugie, układowe dostarczanie białek terapeutycznych, to jest cytokin, może wiązać się z poważnymi nieoczekiwanymi skutkami ubocznymi w tkance niezranionej. Z powodu nieskutecznego dostarczenia do konkretnych komórek i tkanek organizmu, wymaga się podawania wysokich dawek białka, aby zapewnić wystarczającą ilość białka, osiągającego odpowiedni cel tkankowy. W związku z krótkim okresem półtrwania w organizmie spowodowanym rozkładem proteolitycznym, białka muszą także być podawane w sposób powtarzany, czego wynikiem może być wzrost reakcji odpornościowej na białka terapeutyczne. Krążenie wysokich dawek białek terapeutycznych jest często toksyczne z powodu skutków plejotropowych podawanych białek i w ich wyniku mogą mieć miejsce poważne skutki uboczne.
    Po trzecie, egzogeniczne dostarczenie rekombinowanych białek jest nieskuteczne. Dokonywano prób ograniczania podawania wysokich poziomów białek aż do unieruchamiania białek terapeutycznych w docelowym miejscu. Jednak takie podejście terapeutyczne komplikuje ponowne podanie białka w dawkowaniu powtarzającym się.
    Po czwarte, z powodu różnorodności białek, takich jak receptory błonowe, czynniki transkrypcyjne i wewnątrzkomórkowe białka wiążące, aktywność biologiczna zależy od prawidłowej ekspresji i lokalizacji w komórce. Dla wielu białek, prawidłowa lokalizacja komórkowa występuje, gdy białko jest zmodyfikowane w wyniku translacji, wewnątrz komórki. Zatem, takich białek nie można podawać egzogenicznie w taki sposób, aby były one prawidłowo wchłonięte i umiejscowione w komórce.
    W związku z tymi problemami, aktualne terapie gojenia ran białkami rekombinowanymi są nieskuteczne, ponieważ nie prezentują racjonalnej metody dostarczania egzogenicznych białek. Białka te, to jest cytokiny, wytwarzane są normalnie w miejscu ich działania w ilościach fizjologicznych i skutecznie dostarczane do powierzchniowo-komórkowych receptorów sygnalizujących.
    2.2 Terapia genowa
    Terapię genową wyobrażano sobie początkowo jako terapię zamiany specyficznego genu, w celu korekcji wad wrodzonych, polegającą na dostarczeniu funkcjonalnie aktywnych genów terapeutycznych do docelowych komórek.
    189 174
    Początkowe podejścia w kierunku terapii genów somatycznych polegały na pośrednich sposobach wprowadzania genów do tkanek, i nazywano je terapią genową ex vivo, np. komórki docelowe usuwa się z organizmu, transfekuje lub infekuje wektorami, przenoszącymi rekombinowane geny i powtórnie wszczepia do organizmu („autologiczny transfer komórkowy”). Aktualnie dostępne są rozmaite techniki transfekcyjne i stosuje się je do trasferu DNA in vitro do komórek; włączając strącanie wapniowo-fosforanowe DNA, transfekcję DEAEdek-stranową, elektroporację, transfer lub transdukcję DNA, w której pośredniczą liposomy, za pomocą rekombinowanych wektorów wirusowych. Takie protokoły lecznicze ex vivo proponowano do przenoszenia DNA do różnych rodzajów komórek, włączając komórki naskórka (zgłoszenie patentowe US 4 868 116; Morgan i Mulligan WO 30 87/00201; Morgan i in., 1987, Science 237: 1476-1479; zgłoszenie patentowe US 4 980 286 Morgan i Mulligan), komórki śródbłonka (WO 89/05345), hepatocyty (WO 89/07136; Wolff i in., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344-3348; Ledley i in., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5335-5339; Wilson i Mulligan, WO 89/07136; Wilson i in., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8437-8441), fibroblasty (Palmer i in., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055-1059; Anson i in., 1987 Mol. Biol. Med. 4:11-20; Roseberg i in., 1988, Science 242: 1575-1578; Naughton i Naughton, zgłoszenie patentowe US nr 4 963 489) limfocyty (Andreson i in., zgłoszenie patentowe US nr 5 399 346; R.M. Blaese i in., 1995, Science 270: 475-480) oraz krwiotwórcze komórki macierzyste (B.Lim i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8892-8896; Anderson i in., zgłoszenie patentowe US nr 5 399 346).
    Obecnie podjęto próbę bezpośredniego transferu genu in vivo z preparatami DNA zamkniętego w liposomach (Ledley i in., 1987, J. Pediatrics 110:1); lub w proteoliposomach, które zawierają białka receptorowe otoczki wirusowej (Nicolau i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1086); i DNA sprzężonego z kompleksem polilizyna-nośnik glikoproteinowy. Poza tym .stosowano „karabiny genowe” w celu dostarczenia genu do komórek (australijskie zgłoszenie patentowe nr 9 068 389).
    Przypuszczano nawet, że nagi DNA lub DNA związany z liposomami, może wchodzić w skład roztworów na płynnym podłożu, do wstrzyknięć do przestrzeni międzyj elitowych w celu przeniesienia DNA do komórek (Feigner WO 90/11092).
    Prawdopodobnie jednym z największych problemów związanych z aktualnie opracowanymi terapiami genowymi, czy ex vivo czy in vivo, jest niemożność skutecznego przeniesienia DNA do docelowej populacji komórek i uzyskania wysokiego poziomu ekspresji produktu genowego in vivo. Uważa się, że wektory wirusowe są układem najskuteczniejszym i rekombinowane wektory wirusowe niezdolne do powielania stosowano do transdukcji (to jest infekcji) komórek zarówno ex vivo jak in vivo. Takie wektory obejmowały wektory retrowirusowe, adenowirusowe i związane z adenowirusami oraz herpeswirusowe. Mimo wysokiej skuteczności przenoszenia genów głównymi wadami stosowania wektorów wirusowych są niemożność wielu wektorów wirusowych do zakażania komórek nie dzielących się; problemy związane z mutagenezą przy wprowadzaniu; reakcje zapalne wobec wirusa i możliwość wytwarzania wirusa pomocniczego i/lub wytwarzanie i transmisja wirusów szkodliwych dla innych pacjentów.
    Oprócz niskiej skuteczności większości rodzajów komórek wchłaniania i ekspresji obcego DNA, wiele populacji komórek docelowych znajduje się w organizmie w tak małych ilościach, że skuteczność prezentacji DNA wobec specyficznych rodzajów komórek docelowych jest nawet dodatkowo pomniejszona. Obecnie nie istnieje protokół czy metoda zwiększania skuteczności kierowania DNA do docelowej populacji komórkowej.
    3. Streszczenie wynalazku
    Niniejszy wynalazek wykorzystuje nową metodę specyficznego kierunkowania i transferu DNA do komórek naprawczych ssaka, związanych z gojeniem rany, w celu ekspresji terapeutycznych produktów w miejscu zranienia. Metoda ta obejmuje podawanie macierzy aktywowanej genowo do miejsca świeżego zranienia w organizmie. W tym położeniu komórki naprawcze umiejscawiają się w miejscu zranienia, gdzie są transfekowane i ewentualnie wytwarzają czynniki kodowane przez DNA (RNA, białka itd.), które wzmagają gojenie rany.
    Wynalazek opiera się częściowo na odkryciu, że komórki naprawcze aktywne w procesie gojenia rany, proliferują i migrują z tkanki otaczającej do obszaru zranienia i przenikają
    189 174 macierz aktywowaną genowo. Macierz działa jako rusztowanie, które pobudza wrastanie komórek i odwrotnie, transfer genów, poprzez miejscową akumulację komórek naprawczych blisko DNA. Chociaż w macierzy komórki naprawcze zaskakująco skutecznie wchłaniają DNA i wykazują jego ekspresję w postaci produktów translacji, to jest białek lub produktów transkrypcji, to jest nonsensownych lub rybozymowych. Transfekowane komórki naprawcze służą więc jako miejscowe bioreaktory wzmacniające wytwarzanie produktu genowego in vivo.
    Mimo, że jak wydaje się można stosować każdą liczbę sekwencji DNA, zaleca się sekwencje DNA, kodujące produkty translacji (to jest białkowe) lub produkty transkrypcji (to jest nonsensowne lub rybozymowe), które (a) pobudzają naprawianie tkanki; lub (b) są zdolne do przerwania procesu chorobowego (pozwalając przez to na normalne gojenie tkanki).
    Niniejszy wynalazek omija niedogodności procedur stosowanych aktualnie przy gojeniu ran, obejmujących podawanie białek terapeutycznych. Po pierwsze DNA, który jest zarówno stabilny jak i nie toksyczny, można bezpieczenie podawać w wysokich dawkach in vivo. Po drugie, podawanie powtarzające się, chociaż możliwe, nie jest potrzebne. Komórki, które wchłaniają i wykazują ekspresję DNA zapewniaaą dostarczenie produktu genowego w miejscu zranienia. Po trzecie, wynalazek możnaby praktykować w sposób, który bierze pod uwagę wymagania dawkowania czasowego. Przykładowo, DNA może być prezentowany w wektorach, które integrują się z genomem komórki docelowej. W tym przypadku, wszystkie komórki potomne będą zawierać i wykazywać ekspresję przeniesionego DNA działając przez to jako ciągłe źródło czynnika terapeutycznego. Dla kontrastu, można wykorzystać układy nie integrujące, w których DNA nie integruje się z genomem i gen nie przechodzi przez komórki potomne. W takim przypadku, gdy proces gojenia rany kończy się i produkt genowy nie jest więcej potrzebny, produkt genowy nie będzie podlegał ekspresji.
    Wynalazek pokazany jest w przykładach, które ukazują, że geny można przenosić w sposób powtarzalny i powodować ekspresję w różnych zranionych tkankach twardych i miękkich in vivo. Wynalazek omija problemy związane z aktualnie dostępnymi protokołami terapii genowej. Sposób według wynalazku ujawnia transfer genów do stosownej liczby komórek naprawczych, aby uzyskać efekty funkcjonalne, to jest przy nieobecności żadnego dodatkowego ukierunkowywania lub identyfikacji komórkowej przez osobę praktykującą. W metodach in vivo terapia in vivo wymaga pewnych form kierunkowania, które bardzo często nie działają. W wynalazku, ukierunkowanie nie jest problemem. Przez analogię, DNA działa bardziej jak „przynęta w „pułapce”: DNA napotyka „nieświadome” komórki naprawcze, które proliferowały i potem przemieściły się do macierzy aktywowanej genowo. Komórki te, odwrotnie, są zaskakująco zdolne do wchłaniania DNA i ekspresji w postaci czynnika terapeutycznego.
PL97343864A 1996-04-12 1997-04-11 Zastosowanie kompozycji zawierającej biologiczniezgodną macierz do pobudzania wzrostu naczyń i zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do hamowania tworzenia się naczyń PL189174B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/631,334 US5962427A (en) 1994-02-18 1996-04-12 In vivo gene transfer methods for wound healing
PCT/US1997/007301 WO1997038729A1 (en) 1996-04-12 1997-04-11 In vivo gene transfer methods for wound healing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL343864A1 PL343864A1 (en) 2001-09-10
PL189174B1 true PL189174B1 (pl) 2005-06-30

Family

ID=24530760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97343864A PL189174B1 (pl) 1996-04-12 1997-04-11 Zastosowanie kompozycji zawierającej biologiczniezgodną macierz do pobudzania wzrostu naczyń i zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do hamowania tworzenia się naczyń

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5962427A (pl)
EP (2) EP0892644B1 (pl)
JP (1) JP4114952B2 (pl)
CN (2) CN102274522A (pl)
AT (1) ATE298253T1 (pl)
AU (1) AU710386B2 (pl)
CA (1) CA2251655C (pl)
DE (1) DE69733605T2 (pl)
NO (1) NO323843B1 (pl)
PL (1) PL189174B1 (pl)
RU (1) RU2170104C2 (pl)
WO (1) WO1997038729A1 (pl)

Families Citing this family (126)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6653291B1 (en) * 1992-11-13 2003-11-25 Purdue Research Foundation Composition and method for production of transformed cells
US6551618B2 (en) * 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6528483B2 (en) 1995-06-07 2003-03-04 André Beaulieu Method of producing concentrated non-buffered solutions of fibronectin
US7112320B1 (en) 1995-06-07 2006-09-26 Andre Beaulieu Solid wound healing formulations containing fibronectin
EP1486565B1 (en) * 1995-10-11 2007-11-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination of PDGF, KGF, IGF, and IGFBP for wound healing
US6143037A (en) * 1996-06-12 2000-11-07 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for coating medical devices
US6387700B1 (en) 1996-11-04 2002-05-14 The Reagents Of The University Of Michigan Cationic peptides, Cys-Trp-(LYS)n, for gene delivery
DE69830320T2 (de) * 1997-03-07 2006-02-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Verwendung von Adenoviralen Vektoren, die PDGF oder VEGF exprimieren, ZUR HEILUNG VON GEWEBSDEFEKTEN UND ZUR INDUZIERUNG DER HYPERVASKULITÄT IN SÄUGERGEWEBEN
US20050186283A1 (en) 1997-10-10 2005-08-25 Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemistrie Industrie Collagen carrier of therapeutic genetic material, and method
US8858981B2 (en) 1997-10-10 2014-10-14 Ed. Geistlich Soehne Fuer Chemistrie Industrie Bone healing material comprising matrix carrying bone-forming cells
CA2311643C (en) * 1997-12-04 2009-04-07 Genzyme Corporation Compositions and methods for inducing gene expression
NL1007908C2 (nl) * 1997-12-24 1999-06-25 Fuji Photo Film Bv Zilverhalide-emulsies met recombinant collageen die geschikt zijn voor fotografische toediening alsmede de bereiding daarvan.
US6475994B2 (en) * 1998-01-07 2002-11-05 Donald A. Tomalia Method and articles for transfection of genetic material
US6395253B2 (en) 1998-04-23 2002-05-28 The Regents Of The University Of Michigan Microspheres containing condensed polyanionic bioactive agents and methods for their production
US20030039694A1 (en) * 1998-04-28 2003-02-27 Martin John Francis Periadventitial delivery device
WO1999058656A2 (en) * 1998-05-13 1999-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Sustained dna delivery from structural matrices
US6458109B1 (en) 1998-08-07 2002-10-01 Hill-Rom Services, Inc. Wound treatment apparatus
DK1163018T3 (da) * 1999-03-19 2003-09-29 Univ Michigan Technology Man W Mineralisering og cellulær mønstring på biomaterialeoverflader
US6767928B1 (en) * 1999-03-19 2004-07-27 The Regents Of The University Of Michigan Mineralization and biological modification of biomaterial surfaces
US6258124B1 (en) * 1999-05-10 2001-07-10 C. R. Bard, Inc. Prosthetic repair fabric
EP1100380B1 (en) * 1999-05-29 2011-11-02 Tyco Healthcare Group LP Bioabsorbable blends and surgical articles therefrom
WO2000078358A2 (en) * 1999-06-18 2000-12-28 The Collaborative Group, Ltd. Hyaluronic acid microspheres for sustained gene transfer
US6576618B1 (en) * 1999-06-22 2003-06-10 Research Development Foundation Methods to enhance wound healing and enhanced wound coverage material
US6770740B1 (en) 1999-07-13 2004-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods
AU6499800A (en) * 1999-07-28 2001-02-19 Regeneration Technologies, Inc. Cartilage or bone matrix as a nucleic acid delivery vehicle
WO2001019186A1 (en) * 1999-09-14 2001-03-22 University Of Virginia Patent Foundation Composition and method for treating wounds
EP1114862A3 (de) * 1999-11-17 2003-08-06 Switch Biotech Aktiengesellschaft Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankungen sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
US6764462B2 (en) 2000-11-29 2004-07-20 Hill-Rom Services Inc. Wound treatment apparatus
US6824533B2 (en) 2000-11-29 2004-11-30 Hill-Rom Services, Inc. Wound treatment apparatus
US20010044413A1 (en) * 1999-12-01 2001-11-22 Glenn Pierce In situ bioreactors and methods of use thereof
JP4751556B2 (ja) 2000-02-28 2011-08-17 ジーンシーグス， インコーポレイテッド ナノカプセルカプセル化システムおよび方法
US6527801B1 (en) * 2000-04-13 2003-03-04 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Biodegradable drug delivery material for stent
DE10020125A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-25 Friedrich Schiller Uni Jena Bu Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von Knochentumoren
US6319715B1 (en) 2000-04-21 2001-11-20 Cornell Research Foundation, Inc. Method of enhancing the delivery of nucleic acids using silica nanoparticles
WO2001082973A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Viral and non-viral vectors as vehicles for delivering transgenes for treating bone pathologies
WO2001089431A1 (en) 2000-05-22 2001-11-29 Coffey Arthur C Combination sis and vacuum bandage and method
DE10025609A1 (de) * 2000-05-24 2001-12-13 Univ Ludwigs Albert Transfektionssystem
EP1176200A3 (de) * 2000-06-20 2005-01-12 Switch Biotech Aktiengesellschaft Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
US6939540B1 (en) 2000-07-31 2005-09-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method of enhancing bone density
PL366000A1 (pl) 2000-08-08 2005-01-24 M.G.V.S.Ltd. Konstrukty kwasu nukleinowego, transformowane przez nie komórki naczyniowe oraz kompozycje farmaceutyczne i sposoby, wykorzystujące je do indukowaniarozwoju naczyń
US20020061861A1 (en) * 2000-08-17 2002-05-23 Hans Herweijer Nucleic acid expression from linear nucleic acids
AUPR030900A0 (en) 2000-09-22 2000-10-12 Queensland University Of Technology Growth factor complex
EP1349565A2 (en) * 2000-10-06 2003-10-08 HOLICK, Michael F Regulation of cell proliferation and differentiation using topically applied nucleic acid molecules
US6685681B2 (en) 2000-11-29 2004-02-03 Hill-Rom Services, Inc. Vacuum therapy and cleansing dressing for wounds
US6855135B2 (en) 2000-11-29 2005-02-15 Hill-Rom Services, Inc. Vacuum therapy and cleansing dressing for wounds
ES2326467T3 (es) * 2000-12-08 2009-10-13 Osteotech, Inc. Implante para aplicaciones ortopedicas.
US6752831B2 (en) 2000-12-08 2004-06-22 Osteotech, Inc. Biocompatible osteogenic band for repair of spinal disorders
US9080146B2 (en) 2001-01-11 2015-07-14 Celonova Biosciences, Inc. Substrates containing polyphosphazene as matrices and substrates containing polyphosphazene with a micro-structured surface
US7098374B2 (en) * 2001-02-09 2006-08-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Human disease modeling using somatic gene transfer
AU2002233619A1 (en) * 2001-02-26 2002-09-12 Zur Pierre Beserman Systems devices and methods for intrabody targeted delivery and reloading of therapeutic agents
US6949251B2 (en) 2001-03-02 2005-09-27 Stryker Corporation Porous β-tricalcium phosphate granules for regeneration of bone tissue
US20060094112A1 (en) * 2001-03-07 2006-05-04 Omotunde Babalola Biological scaffold
DE10121255A1 (de) * 2001-04-30 2002-11-07 Switch Biotech Ag Verwendung von alpha 1-Antichymotrypsin Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren, oder einer ein ACT Polypeptid oder diese kodierende Nukleinsäure exprimierende Zelle, zur Behandlung und/oder Prävention von diabetes-assoziierten und/oder arteriellen schlecht heilenden Wunden und zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
AU2002305444A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-18 New York University Microvascular free flaps for local or systemic delivery
US8257737B2 (en) * 2001-08-09 2012-09-04 Giuseppe Intini Tissue implants and methods for making and using same
US7217570B2 (en) * 2001-08-23 2007-05-15 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Organotypic intestinal culture and methods of use thereof
US7534774B2 (en) * 2001-10-03 2009-05-19 Tissue Repair Company Traversal of nucleic acid molecules through a fluid space and expression in repair cells
US20030134811A1 (en) * 2001-10-09 2003-07-17 John Jackson Methods and compositions comprising hydroxyapatite useful for the administration of therapeutic agents
EP1450878A1 (en) 2001-10-11 2004-09-01 Hill-Rom Services, Inc. Waste container for negative pressure therapy
US20040031067A1 (en) * 2001-10-11 2004-02-12 Meenhard Herlyn Regulation of human skin healing
KR20030035047A (ko) * 2001-10-29 2003-05-09 (주)바이오코돈 Bmp-4 유전자 발현을 이용한 편평태선 질환의 치료 및진단방법
WO2003048298A2 (en) * 2001-12-05 2003-06-12 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nanoparticles containing polymeric nucleic acid homologs, pharmaceutical compositions and articles of manufacture containing same and methods of use thereof
RU2191388C1 (ru) * 2001-12-18 2002-10-20 Закрытое акционерное общество "РЕМЕТЭКС" Культура нервных стволовых клеток, биотрансплантат для аллопересадки и способ его приготовления
DE60225480T2 (de) 2001-12-26 2009-03-19 Hill-Rom Services, Inc., Batesville Vakuumbindenverpackung
AU2002359830A1 (en) 2001-12-26 2003-07-24 Hill-Rom Services, Inc. Wound vacuum therapy dressing kit
AU2002359828A1 (en) 2001-12-26 2003-07-24 Hill-Rom Services Inc. Vented vacuum bandage and method
AU2002323845A1 (en) * 2002-04-02 2003-10-13 "Asgl-Farmatsevticheskie Innovatsii", Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo Recombinant chimeric protein for the target delivery of dna to eukariotic target cells
US20040038303A1 (en) * 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
CA2481016C (en) 2002-04-10 2012-04-03 Hill-Rom Services, Inc. Access openings in vacuum bandage
US20050142208A1 (en) * 2002-05-09 2005-06-30 Won Min Yoo Pharmceutical composition for treatment of wounds conntaining blood plasma or serum
US20030235580A1 (en) * 2002-06-24 2003-12-25 Fen Zhang Amniotic membrane mediated delivery of bioactive molecules
US20040009155A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-15 Maria Palasis Method for sustaining direct cell delivery
WO2004018020A1 (en) 2002-08-21 2004-03-04 Hill-Rom Services, Inc. Wound packing for preventing wound closure
RU2296588C2 (ru) * 2002-09-30 2007-04-10 Реджен Байотек, Инк. Заливочная композиция для стимуляции образования кости и сращения кости, содержащая сульфат кальция и вязкие биополимеры
US7682392B2 (en) * 2002-10-30 2010-03-23 Depuy Spine, Inc. Regenerative implants for stabilizing the spine and devices for attachment of said implants
WO2004041319A1 (ja) * 2002-11-07 2004-05-21 Pentax Corporation 骨形成治療デバイス
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
AU2003279570A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering Delivery agent, method of delivering a target substance to cells, method for producing delivery agent, composition for producing delivery agent, and kit for producing delivery agent
AU2003900481A0 (en) 2003-02-05 2003-02-20 Queensland University Of Technology Synthetic modulators of cell migration and growth
US20100143442A1 (en) 2003-02-05 2010-06-10 Queensland University Of Technology Growth factor complexes and modulation of cell migration and growth
US7153905B2 (en) * 2003-03-21 2006-12-26 The General Hospital Corporation Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof
US20070031465A1 (en) * 2003-10-15 2007-02-08 Japan Science And Technology Agency Implant for regenerating bone or cartilage with the use of transcriptional factor
WO2005062868A2 (en) 2003-12-19 2005-07-14 Osteotech, Inc. Tissue-derived mesh for orthopedic regeneration
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US20050244451A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-03 Robert Diaz Method and device for reducing susceptibility to fractures in vertebral bodies
US20050244499A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-03 Robert Diaz Method and device for reducing susceptibility to fractures in long bones
CN102727880A (zh) 2004-06-01 2012-10-17 西奈山医学院 遗传工程猪流感病毒及其应用
CA2573671A1 (en) * 2004-07-21 2006-02-23 Medtronic, Inc. Methods for reducing or preventing localized fibrosis using sirna
WO2006020231A2 (en) * 2004-07-21 2006-02-23 Medtronic, Inc. Medical devices and methods for reducing localized fibrosis
US9107850B2 (en) 2004-10-25 2015-08-18 Celonova Biosciences, Inc. Color-coded and sized loadable polymeric particles for therapeutic and/or diagnostic applications and methods of preparing and using the same
KR101153785B1 (ko) 2004-10-25 2012-07-09 셀로노바 바이오사이언시스 저머니 게엠베하 치료 및/또는 진단용으로 부가할 수 있는 중합체 입자 및이의 제조 및 사용 방법
US9114162B2 (en) 2004-10-25 2015-08-25 Celonova Biosciences, Inc. Loadable polymeric particles for enhanced imaging in clinical applications and methods of preparing and using the same
US20210299056A9 (en) 2004-10-25 2021-09-30 Varian Medical Systems, Inc. Color-Coded Polymeric Particles of Predetermined Size for Therapeutic and/or Diagnostic Applications and Related Methods
US20060089642A1 (en) * 2004-10-27 2006-04-27 Diaz Robert L Prefracture spinal implant for osteoporotic unfractured bone
US20060206139A1 (en) * 2005-01-19 2006-09-14 Tekulve Kurt J Vascular occlusion device
US20070087059A1 (en) * 2005-10-17 2007-04-19 Frank Everaerts Bioactive delivery matrix compositions and methods
WO2007050793A2 (en) 2005-10-25 2007-05-03 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of marfan syndrome and associated disorders
EP2230252A1 (en) 2006-03-13 2010-09-22 The Johns Hopkins University Augmentation of endothelial thromboresistance
SG170819A1 (en) 2006-03-30 2011-05-30 Ptc Therapeutics Inc Methods for the production of functional protein from dna having a nonsense mutation and the treatment of disorders associated therewith
US20080119433A1 (en) * 2006-07-06 2008-05-22 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
US8632797B2 (en) * 2006-10-31 2014-01-21 University Of Rochester Targeted delivery of therapeutic agents with lyophilized matrices
DE102006051623A1 (de) 2006-11-02 2008-07-31 Horn, Peter A. Verfahren und Stoffgemisch zur Verbesserung eines in vivo Genfransfers
JP5566294B2 (ja) 2007-10-09 2014-08-06 ボード オブ リージェンツ オブ ザ ネバダ システム オブ ハイアー エデュケーション オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネバダ リーノー 筋肉再生治療用のラミニン−１を含む治療用医薬
WO2011008904A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Tabor Aaron T Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
RU2012127364A (ru) 2009-11-30 2014-01-10 Квинсленд Юниверсити Оф Текнолоджи Химеры фибронектин: фактор роста
US9265857B2 (en) 2010-05-11 2016-02-23 Howmedica Osteonics Corp. Organophosphorous, multivalent metal compounds, and polymer adhesive interpenetrating network compositions and methods
US8551525B2 (en) 2010-12-23 2013-10-08 Biostructures, Llc Bone graft materials and methods
US8956868B2 (en) 2010-12-27 2015-02-17 Lsip, Llc Induced pluripotent stem cells produced with a connexin inhibitor and a TGF-β signaling inhibitor
US8765189B2 (en) 2011-05-13 2014-07-01 Howmedica Osteonic Corp. Organophosphorous and multivalent metal compound compositions and methods
ES2917222T3 (es) 2011-12-28 2022-07-07 Kyoto Prefectural Public Univ Corp Normalización del cultivo de células endoteliales de la córnea
RU2519326C2 (ru) 2011-12-29 2014-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения
WO2013134822A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 James Cook University Method for treating inflammation
US9566310B2 (en) 2012-09-10 2017-02-14 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Methods of treating muscular dystrophy
WO2014144606A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno Methods of treating muscular dystrophy
WO2015039189A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 James Cook University Modified anti-inflammatory proteins and method of use
JPWO2015064768A1 (ja) 2013-10-31 2017-03-09 京都府公立大学法人 角膜内皮の小胞体細胞死関連疾患治療薬
CA2959660A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Genesegues, Inc. Therapeutic nanoparticles and related compositions, methods, and systems
RU2597786C2 (ru) * 2015-02-10 2016-09-20 Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" Способ создания персонализированного ген-активированного имплантата для регенерации костной ткани
US10882903B2 (en) 2015-05-18 2021-01-05 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods and compositions for treating an alphavirus infection
WO2017092808A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Dna Essence Gmbh Oligonucleotides in food, beverage, cosmetic and medicinal formulations
WO2018013993A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 University Of Southern California Methods and composition for producing and using immune cells and stem cells for cell-based therapies
US12171809B2 (en) * 2016-07-18 2024-12-24 University Of Delaware Collagen-mimetic peptide mediated delivery of nucleic acid carriers for efficient delivery from collagen
CN107913436A (zh) * 2016-10-09 2018-04-17 刘英芹 作用于伤残组织原位的骨与软组织同步再生诱导剂
CA3206148A1 (en) 2021-01-24 2022-07-28 Michael David FORREST Therapeutic modifiers of the reverse mode of atp synthase

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4300565A (en) * 1977-05-23 1981-11-17 American Cyanamid Company Synthetic polyester surgical articles
US4243775A (en) * 1978-11-13 1981-01-06 American Cyanamid Company Synthetic polyester surgical articles
US4137921A (en) * 1977-06-24 1979-02-06 Ethicon, Inc. Addition copolymers of lactide and glycolide and method of preparation
US4166800A (en) * 1977-08-25 1979-09-04 Sandoz, Inc. Processes for preparation of microspheres
US4181983A (en) * 1977-08-29 1980-01-08 Kulkarni R K Assimilable hydrophilic prosthesis
DE2843963A1 (de) * 1978-10-09 1980-04-24 Merck Patent Gmbh Im koerper resorbierbare geformte masse auf basis von kollagen und ihre verwendung in der medizin
US4390519A (en) * 1978-05-19 1983-06-28 Sawyer Philip Nicholas Bandage with hemostatic agent and methods for preparing and employing the same
FR2439003A1 (fr) * 1978-10-20 1980-05-16 Anvar Nouvelles pieces d'osteosynthese, leur preparation et leur application
JPS6032505B2 (ja) * 1979-03-19 1985-07-29 株式会社吉野工業所 液体噴霧器
US4384975A (en) * 1980-06-13 1983-05-24 Sandoz, Inc. Process for preparation of microspheres
US4455256A (en) * 1981-05-05 1984-06-19 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein
US4789732A (en) * 1980-08-04 1988-12-06 Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein composition
US4619989A (en) * 1981-05-05 1986-10-28 The Regents Of The University Of Cal. Bone morphogenetic protein composition
US4761471A (en) * 1980-08-04 1988-08-02 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein composition
US5366734A (en) 1981-02-16 1994-11-22 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
IE52535B1 (en) * 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4585797A (en) * 1981-04-13 1986-04-29 Seton Company Cosmetic and pharmaceutical sheet material containing polypeptides
US4591501A (en) * 1981-04-13 1986-05-27 Seton Company Cosmetic and pharmaceutical sheet material containing polypeptides
US4472840A (en) * 1981-09-21 1984-09-25 Jefferies Steven R Method of inducing osseous formation by implanting bone graft material
US4409332A (en) * 1982-01-12 1983-10-11 Jefferies Steven R Collagen-enzyme conjugates that exhibit no inflammatory response and method for making the same
US4670393A (en) * 1982-03-22 1987-06-02 Genentech, Inc. DNA vectors encoding a novel human growth hormone-variant protein
FR2524312B1 (fr) * 1982-04-01 1985-10-04 Tech Cuir Centre Nouvelles formes de micro-encapsulation de substances medicamenteuses par des couches homogenes de collagene natif
US4538603A (en) * 1982-04-22 1985-09-03 E. R. Squibb & Sons, Inc. Dressings, granules, and their use in treating wounds
US4798786A (en) * 1982-05-06 1989-01-17 Stolle Research And Development Corporation Living cells encapsulated in crosslinked protein
US4539981A (en) * 1982-11-08 1985-09-10 Johnson & Johnson Products, Inc. Absorbable bone fixation device
US4588682A (en) * 1982-12-13 1986-05-13 Integrated Genetics, Inc. Binding nucleic acid to a support
US4795804A (en) * 1983-08-16 1989-01-03 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic agents
US4818542A (en) * 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US5197977A (en) 1984-01-30 1993-03-30 Meadox Medicals, Inc. Drug delivery collagen-impregnated synthetic vascular graft
US4623588A (en) * 1984-02-06 1986-11-18 Biotek, Inc. Controlled release composite core coated microparticles
US4568559A (en) * 1984-02-06 1986-02-04 Biotek, Inc. Composite core coated microparticles and process of preparing same
US4563489A (en) * 1984-02-10 1986-01-07 University Of California Biodegradable organic polymer delivery system for bone morphogenetic protein
US4578384A (en) * 1984-02-15 1986-03-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Polylactic-polyglycolic acids combined with an acidic phospholipid-lysozyme complex for healing osseous tissue
MX163953B (es) * 1984-03-27 1992-07-03 Univ New Jersey Med Procedimiento para preparar una matriz biodegradable a base de colageno
US4837285A (en) * 1984-03-27 1989-06-06 Medimatrix Collagen matrix beads for soft tissue repair
US4596574A (en) * 1984-05-14 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Biodegradable porous ceramic delivery system for bone morphogenetic protein
US4789663A (en) * 1984-07-06 1988-12-06 Collagen Corporation Methods of bone repair using collagen
US4563350A (en) * 1984-10-24 1986-01-07 Collagen Corporation Inductive collagen based bone repair preparations
US5001169A (en) * 1984-10-24 1991-03-19 Collagen Corporation Inductive collagen-based bone repair preparations
IE58110B1 (en) * 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5128326A (en) * 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
US5273964A (en) 1985-03-20 1993-12-28 Lemons J E Inorganic and organic composition for treatment of bone lesions
JPH0662679B2 (ja) * 1985-06-21 1994-08-17 新田ゼラチン株式会社 組織親和性コラ−ゲンとその製法
US4889119A (en) * 1985-07-17 1989-12-26 Ethicon, Inc. Surgical fastener made from glycolide-rich polymer blends
US4741337A (en) * 1985-07-17 1988-05-03 Ethicon, Inc. Surgical fastener made from glycolide-rich polymer blends
US4806523A (en) * 1985-08-06 1989-02-21 Collagen Corporation Method of treating inflammation
JPH0624964B2 (ja) * 1985-09-23 1994-04-06 東燃株式会社 リン酸カルシウム系ヒドロキシアパタイト及びその製造方法
US4776890A (en) * 1985-12-18 1988-10-11 Collagen Corporation Preparation of collagen hydroxyapatite matrix for bone repair
US5011692A (en) * 1985-12-28 1991-04-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Sustained pulsewise release pharmaceutical preparation
US5133755A (en) 1986-01-28 1992-07-28 Thm Biomedical, Inc. Method and apparatus for diodegradable, osteogenic, bone graft substitute device
EP0248531A3 (en) * 1986-05-02 1988-09-28 Southern Research Institute Encapsulated nucleic acids
ZA874681B (en) * 1986-07-01 1988-04-27 Genetics Inst Novel osteoinductive factors
US4877864A (en) * 1987-03-26 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Osteoinductive factors
US5013649A (en) * 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
US5106748A (en) * 1986-07-01 1992-04-21 Genetics Institute, Inc. Dna sequences encoding 5 proteins
US5108922A (en) * 1986-07-01 1992-04-28 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-1 products
US5366875A (en) 1986-07-01 1994-11-22 Genetics Institute, Inc. Methods for producing BMP-7 proteins
US5187076A (en) 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
US5037749A (en) * 1986-07-08 1991-08-06 Protein Foods Group Inc. Porous immobilization support prepared from animal bone
US4839130A (en) * 1986-07-17 1989-06-13 United States Surgical Corporation Process of making an absorbable surgical device
US4744365A (en) * 1986-07-17 1988-05-17 United States Surgical Corporation Two-phase compositions for absorbable surgical devices
JPS6368155A (ja) * 1986-09-11 1988-03-28 グンゼ株式会社 骨接合ピン
US5227157A (en) 1986-10-14 1993-07-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Delivery of therapeutic agents
FI80605C (fi) * 1986-11-03 1990-07-10 Biocon Oy Benkirurgisk biokompositmaterial.
US4833125A (en) * 1986-12-05 1989-05-23 The General Hospital Corporation Method of increasing bone mass
US5051272A (en) * 1988-07-19 1991-09-24 United States Surgical Corporation Method for improving the storage stability of a polymeric article susceptible to hydrolytic degradation and resulting article
GB2209937B (en) 1987-09-21 1991-07-03 Depiopharm S A Water insoluble polypeptides
US4844854A (en) * 1987-09-22 1989-07-04 United States Surgical Corporation Process for making a surgical device using two-phase compositions
FR2623402B1 (fr) * 1987-11-19 1994-04-29 Solvay Article en polymere d'acide lactique utilisable notamment comme prothese biodegradable et procede pour sa realisation
US4916193A (en) * 1987-12-17 1990-04-10 Allied-Signal Inc. Medical devices fabricated totally or in part from copolymers of recurring units derived from cyclic carbonates and lactides
US4961707A (en) * 1987-12-22 1990-10-09 University Of Florida Guided periodontal tissue regeneration
US4898734A (en) * 1988-02-29 1990-02-06 Massachusetts Institute Of Technology Polymer composite for controlled release or membrane formation
US5137669A (en) * 1988-03-02 1992-08-11 Endocon, Inc. Manufacture of partially fused peptide pellet
US5039660A (en) * 1988-03-02 1991-08-13 Endocon, Inc. Partially fused peptide pellet
US5108753A (en) * 1988-04-08 1992-04-28 Creative Biomolecules Osteogenic devices
US5266683A (en) 1988-04-08 1993-11-30 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5011691A (en) * 1988-08-15 1991-04-30 Stryker Corporation Osteogenic devices
US5162114A (en) * 1989-02-23 1992-11-10 Stryker Corporation Bone collagen matrix for xenogenic implants
US5258494A (en) 1988-04-08 1993-11-02 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5354557A (en) 1988-04-08 1994-10-11 Stryker Corporation Osteogenic devices
US4975526A (en) * 1989-02-23 1990-12-04 Creative Biomolecules, Inc. Bone collagen matrix for zenogenic implants
US5344654A (en) 1988-04-08 1994-09-06 Stryker Corporation Prosthetic devices having enhanced osteogenic properties
US5324819A (en) 1988-04-08 1994-06-28 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5250302A (en) 1988-04-08 1993-10-05 Stryker Corporation Osteogenic devices
US4968590A (en) * 1988-04-08 1990-11-06 Stryker Corporation Osteogenic proteins and polypeptides
US4882150A (en) * 1988-06-03 1989-11-21 Kaufman Herbert E Drug delivery system
US4865846A (en) * 1988-06-03 1989-09-12 Kaufman Herbert E Drug delivery system
US5124155A (en) * 1988-06-21 1992-06-23 Chiron Ophthalmics, Inc. Fibronectin wound-healing dressings
US5110604A (en) * 1988-06-30 1992-05-05 Collagen Corporation Processes for producing collagen matrixes and methods of using same
US4956178A (en) * 1988-07-11 1990-09-11 Purdue Research Foundation Tissue graft composition
US4902508A (en) * 1988-07-11 1990-02-20 Purdue Research Foundation Tissue graft composition
DE3825211A1 (de) * 1988-07-25 1990-02-01 Henkel Kgaa Verbesserte koerperresorbierbare knochenwachse (iii)
US5250584A (en) 1988-08-31 1993-10-05 G-C Dental Industrial Corp. Periodontium-regenerative materials
US4938763B1 (en) * 1988-10-03 1995-07-04 Atrix Lab Inc Biodegradable in-situ forming implants and method of producing the same
US5106626A (en) * 1988-10-11 1992-04-21 International Genetic Engineering, Inc. Osteogenic factors
US5470829A (en) 1988-11-17 1995-11-28 Prisell; Per Pharmaceutical preparation
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
JPH06104116B2 (ja) * 1988-11-29 1994-12-21 三菱化成株式会社 創傷被覆材
US5324520A (en) 1988-12-19 1994-06-28 Vipont Pharmaceutical, Inc. Intragingival delivery systems for treatment of periodontal disease
US4957902A (en) * 1988-12-20 1990-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Peptide inhibitors of wound contraction
ATE105177T1 (de) 1988-12-22 1994-05-15 American Cyanamid Co Verfahren zur behandlung von periodontitis durch protrahierte wirkstoffabgabe von arzneimitteln in der zahnhoehle, zusammensetzung davon und vorrichtung zur verabreichung.
US4988358A (en) * 1988-12-28 1991-01-29 Eppley Barry L Method for promoting hard tissue growth and repair in mammals
SU1637808A1 (ru) * 1989-01-20 1991-03-30 Украинский научно-исследовательский ветеринарный институт Способ получени препарата дл перорального введени
US4884854A (en) * 1989-03-16 1989-12-05 Joffe Edward J Interconnecting panels for knockdown structures
US5698531A (en) 1989-03-31 1997-12-16 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US4946450A (en) * 1989-04-18 1990-08-07 Biosource Genetics Corporation Glucan/collagen therapeutic eye shields
US5108755A (en) * 1989-04-27 1992-04-28 Sri International Biodegradable composites for internal medical use
US5171670A (en) 1989-05-12 1992-12-15 The General Hospital Corporation Recombinant dna method for production of parathyroid hormone
US5077049A (en) * 1989-07-24 1991-12-31 Vipont Pharmaceutical, Inc. Biodegradable system for regenerating the periodontium
US5324519A (en) 1989-07-24 1994-06-28 Atrix Laboratories, Inc. Biodegradable polymer composition
US5723119A (en) 1989-07-28 1998-03-03 Schering Corporation Method for enhancing wound healing/repair with IL-4
US5196185A (en) 1989-09-11 1993-03-23 Micro-Collagen Pharmaceutics, Ltd. Collagen-based wound dressing and method for applying same
US5268178A (en) 1989-09-25 1993-12-07 The Board Of Regents, The University Of Texas System Biodegradable antibiotic implants and methods of their use in treating and preventing infections
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5304121A (en) 1990-12-28 1994-04-19 Boston Scientific Corporation Drug delivery system making use of a hydrogel polymer coating
CN1052695A (zh) 1989-12-22 1991-07-03 中国科学院生物物理研究所 一种转移基因的方法及其转移基因的粒子枪
US5185152A (en) 1990-01-10 1993-02-09 Peyman Gholam A Method and apparatus for controlled release drug delivery to the cornea and anterior chamber of the eye
US5350580A (en) 1990-03-05 1994-09-27 Minnesota Mining And Manufacturing Company Device and method for extended delivery of pharmacologically active agents to the ear
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5103840A (en) * 1990-05-07 1992-04-14 Kavoussi Harold P Viscoelastic collagen gel for ophthalmic surgery
US5059123A (en) * 1990-05-14 1991-10-22 Jernberg Gary R Periodontal barrier and method for aiding periodontal tissue regeneration
US5288496A (en) 1990-05-15 1994-02-22 Stolle Research & Development Corporation Growth promoters for animals
WO1991017772A1 (en) 1990-05-16 1991-11-28 Southern Research Institute Controlled release dopamine and its use to stimulate nerve fiber growth
US5168050A (en) * 1990-05-24 1992-12-01 Genentech, Inc. Mammalian expression of the bone morphogenetic protein-2b using bmp2a/bmp2b fusion
US5080665A (en) * 1990-07-06 1992-01-14 American Cyanamid Company Deformable, absorbable surgical device
US5120322A (en) * 1990-06-13 1992-06-09 Lathrotec, Inc. Method and apparatus for treatment of fibrotic lesions
US5460831A (en) 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Targeted transfection nanoparticles
US5324307A (en) 1990-07-06 1994-06-28 American Cyanamid Company Polymeric surgical staple
US5081106A (en) * 1990-07-16 1992-01-14 The Oregon Health Sciences University Wound dressing protocol utilizing collagen gelatin formed with iodine
US5128136A (en) * 1990-07-16 1992-07-07 The Oregon Health Sciences University Wound healing kit comprised of gelable collagen
US5263985A (en) 1990-08-14 1993-11-23 Pfizer Hospital Products Group, Inc. Bone growth stimulator
EP0550625B1 (en) * 1990-09-26 2003-11-05 Genetics Institute, LLC Bmp-5 derivatives
ES2099245T3 (es) * 1990-11-26 1997-05-16 Robert R Recker Tratamiento de la osteoporosis usando factor de liberacion de hormona de crecimiento (grf) en combinacion con hormona paratiroidea (pth).
US5206028A (en) 1991-02-11 1993-04-27 Li Shu Tung Dense collagen membrane matrices for medical uses
US5320624A (en) 1991-02-12 1994-06-14 United States Surgical Corporation Blends of glycolide and/or lactide polymers and caprolactone and/or trimethylene carbonate polymers and absorbable surgical devices made therefrom
US5208219A (en) 1991-02-14 1993-05-04 Celtrix Pharmaceuticals Inc. Method for inducing bone growth
US5171217A (en) * 1991-02-28 1992-12-15 Indiana University Foundation Method for delivery of smooth muscle cell inhibitors
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US5208041A (en) 1991-05-23 1993-05-04 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Essentially pure human parathyroid hormone
CA2082411A1 (en) 1991-06-28 1992-12-29 Robert D. Rosenberg Localized oligonucleotide therapy
US5270300A (en) 1991-09-06 1993-12-14 Robert Francis Shaw Methods and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage or bone
US5281422A (en) 1991-09-24 1994-01-25 Purdue Research Foundation Graft for promoting autogenous tissue growth
US5317010A (en) 1991-10-10 1994-05-31 Peter K. T. Pang Parathyroid hormone analogues substituted at AA 25, 26, 27, and use in osteoporosis treatment
US5171579A (en) * 1991-10-11 1992-12-15 Genetics Institute, Inc. Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins
US5298422A (en) 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5306303A (en) 1991-11-19 1994-04-26 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Bone induction method
US5326357A (en) 1992-03-18 1994-07-05 Mount Sinai Hospital Corporation Reconstituted cartridge tissue
US5792751A (en) 1992-04-13 1998-08-11 Baylor College Of Medicine Tranformation of cells associated with fluid spaces
FI91713C (fi) * 1992-04-23 1994-08-10 Axidental Oy Uusia bioaktiivisia pinnotteita ja niiden valmistus ja käyttö
US5326350A (en) 1992-05-11 1994-07-05 Li Shu Tung Soft tissue closure systems
AU684050B2 (en) * 1992-07-13 1997-12-04 Baylor College Of Medicine Targeting somatic gene therapy to joints
US5281419A (en) 1992-09-28 1994-01-25 Thomas Jefferson University Biodegradable drug delivery system for the prevention and treatment of osteomyelitis
US5352463A (en) 1992-11-13 1994-10-04 Badylak Steven F Tissue graft for surgical reconstruction of a collagenous meniscus and method therefor
US5275826A (en) 1992-11-13 1994-01-04 Purdue Research Foundation Fluidized intestinal submucosa and its use as an injectable tissue graft
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
US5464650A (en) 1993-04-26 1995-11-07 Medtronic, Inc. Intravascular stent and method
US5942496A (en) * 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
JP2002515731A (ja) * 1995-11-06 2002-05-28 マウント・サイナイ・ホスピタル・コーポレイション 再形成した鉱質化軟骨組織

Also Published As

Publication number Publication date
DE69733605T2 (de) 2006-05-11
NO323843B1 (no) 2007-07-09
WO1997038729A1 (en) 1997-10-23
EP0892644A4 (en) 1999-07-14
CN1226835A (zh) 1999-08-25
CA2251655A1 (en) 1997-10-23
JP2001519767A (ja) 2001-10-23
EP0892644B1 (en) 2005-06-22
RU2170104C2 (ru) 2001-07-10
AU2821297A (en) 1997-11-07
DE69733605D1 (de) 2005-07-28
PL343864A1 (en) 2001-09-10
ATE298253T1 (de) 2005-07-15
WO1997038729A8 (en) 1999-04-22
NO984729D0 (no) 1998-10-09
JP4114952B2 (ja) 2008-07-09
EP1510224A1 (en) 2005-03-02
US5962427A (en) 1999-10-05
CN102274522A (zh) 2011-12-14
NO984729L (no) 1998-12-14
AU710386B2 (en) 1999-09-16
CA2251655C (en) 2010-09-21
EP0892644A1 (en) 1999-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL189174B1 (pl) Zastosowanie kompozycji zawierającej biologiczniezgodną macierz do pobudzania wzrostu naczyń i zastosowanie kompozycji zawierającej biologicznie zgodną macierz do hamowania tworzenia się naczyń
DE69830320T2 (de) Verwendung von Adenoviralen Vektoren, die PDGF oder VEGF exprimieren, ZUR HEILUNG VON GEWEBSDEFEKTEN UND ZUR INDUZIERUNG DER HYPERVASKULITÄT IN SÄUGERGEWEBEN
Li et al. Effect of cell‐based VEGF gene therapy on healing of a segmental bone defect
Fang et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes.
ES2139889T5 (es) Metodos y composiciones para estimular las celulas oseas.
US5851521A (en) Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis
US20130190391A1 (en) Traversal of nucleic acid molecules through a fluid space and expression in repair cells
JP2002518464A (ja) ニューロンの成長、再生、および生存を変化させるための因子の送達のための組成物および方法
JP2007532153A (ja) Ｅｃｍを基材としたグラフト材料
JP2002502822A (ja) 骨芽細胞の前駆細胞による骨欠損の治療
ES2305246T3 (es) Composiciones para la administracion sistemica de secuencias que codifican proteinas oseas morfogeneticas.
WO1999053961A1 (en) Peptides for efficient gene transfer
JP2001514026A (ja) 骨形態形成蛋白を発現する遺伝子操作された細胞
US20020193338A1 (en) In vivo gene transfer methods for wound healing
US20120100107A1 (en) In vivo transfer methods for wound healing
KR100543994B1 (ko) 상처치료를위한invivo유전자전달방법
US20020071828A1 (en) Method of stimulating nerve regeneration
JP2024543513A (ja) 腱骨界面を修復するための方法及び組成物
CA3199402A1 (en) Painless nerve growth factor for fracture repair
MXPA98008427A (es) Metodos de transferencia de genes in vivo para curacion de lesiones
US20070123486A1 (en) Composition for coordinated VEGF and PDGF expression, and methods of use
JPWO2005089810A1 (ja) エレクトロポレーション法を用いたヒト骨形成因子遺伝子導入による骨誘導方法
CZ337599A3 (cs) Zařízení ke stimulaci nervové regenerace

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20130411