PL182569B1 - Kompozycja farmaceutyczna zawierająca polimer ulegający biodegradacji - Google Patents

Abstract

Kompozycja farmaceutyczna, zawierajaca polimer ulegajacy biodegradacji, zwiazek far- maceutycznie czynny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne srodki dodatkowe, znamienna tym, ze zawarty w kompozycji polimer obejmuje jednostki weglanu etylenu o wzorze -(-C(O)-O-CH2 -CH 2-O-)- przy ilosci weglanu etylenu 70 do 100% molowych, ma mase czasteczkowa (Mw) 80 000 do 2 000 000, lepkosc istotna 0,4 do 4,0 dl/g mierzona w chloroformie oraz temperature zesz- klenia od 15° do 50°C, przy czym zwiazek farmaceutycznie czynny jest cytokina i jest obecny w kompozycji w ilosci od 0,001% do 70% wagowych, farmaceutycznie dopuszczalne srodki dodat- kowe zawieraja poliole w ilosci od 1% do 90% wagowych, natomiast polimer jest obecny w kompo- zycji w ilosci stanowiacej uzupelnienie do 100% wagowych w stosunku do calej masy kompozycji. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca polimer ulegający biodegradacji, zwłaszcza kompozycja zawierająca IL-6. Kompozycja ta jest szczególnie skuteczna w leczeniu chorób, w których pośredniczy IL-1 i/lub TNFa, np. w przewlekłych stanach zapalnych. Specyficzne polimery stosowane w tej kompozycji, a mianowicie określona grupa poliwęglanów etylenu), posiadających zdolność do niehydrolitycznej erozji powierzchniowej in vivo, nadająjej nowe, nieoczekiwane i wysoce pożądane własności, a przede wszystkim pozwalają, na odpowiednio długotrwałe podtrzymywanie uwalniania leku.

Zupełnie nowe i nieoczekiwane jest stwierdzenie, że kompozycja według wynalazku, zawierająca przykładowo jako substancję czynnąIL-6, może być stosowana do leczenia stanów, w których pośredniczy IL-1 i/lub TNFa. Panował bowiem pogląd, że IL-6 pogarsza i zaostrza takie stany, jak np. przewlekłe stany zapalne wywoływane czynnikami chorobotwórczymi, choroby demielinizacyjne i ostre lub hiperostre stany zapalne (wstrząs septyczny).

W dalszej części opisu są przedstawione poglądy na mechanizm działania leku zawartego w kompozycji według wynalazku, kierunki jej zastosowań, różne substancje podstawowe zawierające związki farmaceutycznie czynne, stosowane polimery i sposoby ich wytwarzania.

1. Leczenie chorób, w których pośredniczy IL-1 i/lub TNFa

Wiele samorzutnie pojawiających się, przewlekłych stanów zapalnych ma nieznaną (przypuszczalnie autoimmunizacyjną) etiologię i uważa się, że pośredniczy w nich IL-1 i/lub TNFa. Na przykład, stwardnienie rozsiane (MS), zaburzenie okaleczające nerwy charakteryzujące się rozsianymi plamami demielinizacyjnymi w mózgu i rdzeniu kręgowym jest przedmiotem badań od wielu lat. Chociaż dokładna etiologia stwardnienia rozsianego nie jest w pełni zrozumiała, przypuszcza się, że występuje w niej silny składnik autoimmunizacyjny. U pacjentów mających tę chorobę wykazano zwiększone występowanie pewnych antygenów HLA. Obecnie dostępne leki przeciwzapalne takie jak ACTH (hormon adrenokortykotropowy) lub kortykosteroidy, np. prednison, wydaj ą się poprawiać stan w ostrych atakach choroby, zwłaszcza gdy podawane sąwe wczesnym stadium, ale nie wpływają skutecznie na czynniki powodujące chorobę. Długoterminowe podawanie kortikosteroidów lub środków immunosupresyjnych niesie ryzyko poważnych działań ubocznych. Rekombinantowa postać IFN-β, powoduje, jak wykazały ostatnie badania, zredukowanie krótkoterminowego tworzenia płytek, ale nie wpływa na długoterminowy rozwój choroby. Ocena skuteczności leczenia jest skomplikowana poprzez fakt, że naturalny rozwój choroby ulega to samoistnej remisji, to przewlekłemu nawrotowi choroby. Pomimo wielu lat

182 569 intensywnych badań, nie ma dotychczas ogólnie akceptowalnego, specyficznego leczenia tej bardzo poważnej choroby.

Przypuszcza się, że inne przewlekłe stany zapalne wywoływane są środkami zewnętrznymi np. zarazkami. Na przykład, choroba Lyme'a jest poważnym stanem przewlekłym, wywoływanym zakażeniem krętkiem Borrelia burgdorferi pochodzącym od kleszcza. Po początkowej ostrej fazie charakteryzującej się uszkodzeniami skóry i objawami grypopodobnymi, choroba rozwija się do fazy przewlekłej, która może charakteryzować się zapaleniem stawów i nienormalnymi stanami neurologicznymi. Chorobę zwykle leczy się antybiotykami i niesterydowymi środkami przeciwzapalnymi, ale optymalna terapia nie zostałajeszcze opracowana, zwłaszcza dla choroby w jej ustalonym już stanie.

Ostre lub hiperostre, niekontrolowane stany zapalne mogą również być powodowane czynnikami zewnętrznymi, np. poważnym oparzeniem lub poważnymi infekcjami. Na przykład, wstrząs septyczny, a w szczególności zespół zaburzeń oddechowych u dorosłych (ARDS) jest stanem zagrażającym życiu, na który do tej pory nie istnieje skuteczne leczenie. Zapaść następuje gwałtownie, przy czym śmiertelność przekracza 50%. Wstrząs septyczny powodowany jest poważną infekcją bakteryjną i zwykle charakteryzuje się gorączką, po której następuje hipotermia, zmienne ciśnienie krwi (objaw hiperdynamiczny), a następnie, w późniejszych stadiach, obniżone ciśnienie, metaboliczna acydoza, osłabione funkcje mentalne oraz szeroka dysfunkcja organów, co w końcu, w wielu przypadkach, kończy się śmiercią. Najpowszechniej, wstrząs septyczny spowodowany jest infekcją bakteriami gram-ujemnymi (wstrząs endotoksyczny), ale może również być rezultatem infekcji bakteryjnych gram-dodatnich lub innych infekcji. Stosowane tu określenie „wstrząs septyczny” należy interpretować szeroko i oznacza stan wstrząsu, łącznie z ARDS, spowodowany infekcjąmikroorganizmami, zwłaszcza infekcją bakteryjną, a w szczególności zakażeniem bakteriami gram-ujemnymi.

IL-6 jest cytokiną znaną ze swej przydatności w leczeniu różnych stanów, np. małopłytkowości i niektórych nowotworów Produkowana jest przez organizm zwykle w odpowiedzi na infekcje bakteryjne i pośredniczy w zapaleniach, gorączce i wstrząsie septycznym. Jest silnym środkiem immunostymulującym i część literatury sugeruje, że mechanizm napędowy IL-6 powoduje niektóre choroby immunizacyjnie zapalne, łącznie z ogólnoustrojowym toczeniem rumieniowatym, stwardnieniem rozsianym i reumatoidalnym zapaleniem stawów, jak również wstrząsem septycznym.

W świetle danych literaturowych, nieoczekiwane jest więc stwierdzenie, że IL-6 jest przydatna w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych (innych niż zapalenie kłębuszków nerkowych), np. stwardnienia rozsianego i w leczeniu ostrych łub hiperostrych stanów zapalnych, np. wstrząsu septycznego. Mechanizm tego działania nie jest jasny, ale bez intencji wiązania się z jakąś szczególną teorią, można przypuszczać, że poprzez mechanizm zwrotny, IL-6 może tłumić lub inhibitować ekspresję, uwalnianie lub czynność cytokin, zwłaszcza TNFa i/lub IL-1, ewentualnie przez uregulowanie uwalniania rozpuszczalnego antagonisty receptora TNFa i/lub receptora IL-1, może tłumić aktywność i spowodowane stany autoimmunizacji, zapalne lub wstrząsu, w których głównie pośredniczą wymienione cytokiny. Jednak w przypadku stanów charakteryzowanych przez pośredniczenie IL-6 w tworzeniu kompleksów uzupełniająco-aktywujących, typu antygen-przeciwciało (IgG), zwłaszcza w przypadku zapalenia kłębuszków nerkowych (które zwykle powodowane jest agregacją takich kompleksów w nerce), wykazano, że IL-6 zaostrza te stany. Badania przeprowadzone na modelu zwierzęcym dla MS i zapalenia stawów Lyme'a, potwierdziły, że IL-6 ma działanie lecznicze w przypadku chorób, które jak się przypuszcza, sąw pierwszej kolejności kierowane przez IL-1 i/lub TNFa, ale, u myszy, zaostrza takie stany jak zapalenie kłębuszków nerkowych z rumieniem. Jest to prawdopodobnie spowodowane bezpośrednim działaniem IL-6. Badania przeprowadzone na modelu mysim potwierdziły, że samo IL-6 ma działanie leczące wstrząs endotoksyczny, przy czym jest on prawdopodobnie powodowany głównie przez IL-1 i/lub TNFa.

Uważa się więc, że IL-6 jest przydatna jako środek do tłumienia lub inhibitowania ekspresji, uwalniania lub czynności TNFa i/lub IL-1, a zwłaszcza do leczenia stanów zapalnych, innych

182 569 niż zapalenie kłębuszków nerkowych i do leczenia wstrząsu septycznego. Stany zapalne, które mogą być leczone przez zastosowanie IL-6 obejmują na przykład: stany zapalenia stawów, zwłaszcza zapalenia stawów wywołane zarazkami, na przykład zapalenie stawów Lyme'a, zapalenie stawów bakteryjne i zapalenie stawów polio, stwardnienie rozsiane i inne choroby demielinizacyjne (tj. choroby charakteryzujące się demielinizacją nerwów, mózgu i/lub rdzenia kręgowego np. stwardnienie rozsiane, ostre rozsiane zapalenie mózgu i rdzenia lub poinfekcyjne zapalenie mózgu, zapalenie rdzenia i nerwu wzrokowego, szum w uszach, rozproszone stwardnienie mózgu, choroba Schildera, adrenoleukodystrofia, trzeciorzędowa choroba Lyme'a, tropikalna choroba paraspastyczna i inne choroby, w których głównym objawem jest demielinizacja, zwłaszcza demielinizacja, w której pośredniczy autoimmunizacja); ostre poważne stany zapalne takie jak oparzenie, wstrząs septyczny, zapalenie opon i zapalenie płuc; oraz choroby autoimmunizacyjne łącznie z zapaleniem wielochrząstkowym, stwardnienie tkanki, ziarnica Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe czynne zapalenie wątroby, ciężkie osłabienie mięśni, łuszczyca, łuszczycowe zapalenie stawów, syndrom Stevena-Johnsona, idiopatyczna psyloza, autoimmunizacyjne zapalenie jelit (łącznie np. z wrzodowym zapaleniem okrężnicy i chorobą Crohna), wewnątrzwydzielnicza oftalmopatia, choroba Gravesa, sarkoidoza, pierwotna żółciowa marskość wątroby, cukrzyca młodzieńcza (cukrzyca typu I), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniej i tylnej), zapalenie rogówki i spojówki suche oraz zapalenie rogówki i spojówki wiosenne, a także śródmiąższowe zwłóknienie płuc.

Przez IL-6 należy rozumieć dowolny związek odpowiadający znanej odmianie interleukiny-6 (znanej również jako interferon beta-2 (TNF-β,,), B-komórkowy czynnik stymulujący 2 (B SF-2), interleukina HP-1 (HR-1), hepatocytowy czynnik stymuluj ący (HSF), czynnik wzrostu hybrydoma plazmacytoma (HPGF) i czynnik 26 kD). Korzystny jest rekombinant IL-6, chociaż może być również stosowana IL-6 nierekombinantowa, np. wyprodukowana przez linię komórkowąraka wydzielającego IL-6. IL-6 jest dostępna w handlu lub może być wytworzona znanymi sposobami, np. jak opisano w EPA 0.220.574, EPA 0.257.406, EPA 0.326.120, WO 88/00206, Gb 2.063.882 lub GB 2.217.327. IL-6 może być glikolizowana, np. wyprodukowana przez komórki eukariotyczne, np. komórki CHO, lub nie glikolizowana, np. wyprodukowana przez takie komórki prokariotyczne jak E. coli. Korzystny jest ludzki rekombinant IL-6, chociaż wiadomo, że IL-6 jest aktywnym rodzajem krzyżówkowym, a więc IL-6 pochodząca ze źródeł nie ludzkich może być również stosowana. Może też być stosowana IL-6, mająca zmiany wprowadzone do sekwencji aminokwasowej, tzn. dodane, usunięte lub zmutowane 1,2,3 lub więcej aminokwasów. Mogą to być również białka otrzymane w wyniku fuzji IL-6 i innego białka; aktywne fragmenty IL-6; i/lub inne warianty IL-6, zachowujące aktywność IL-6.

Znane jest stosowanie IL-6 w kompozycjach farmaceutycznych, zawierających IL-6 oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik lub nośnik. IL-6 może być podawana pozajelitowo, np. w postaci roztworów lub zawiesin do iniekcji, np. według lub analogicznie do sposobów opisanych w Remington's Pharmaceutical Science, wyd. 16 (Mack Publishing Company, Easton Pa 1980). Jako nośniki stosowane są: nośniki wodne takie jak roztwór solanki, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i roztwór Hanka oraz nośniki niewodne takie jak utrwalony olej lub oleinian etylu. Do zwykłego podawania pozajelitowego, IL-6 udostępniany jest w postaci liofilizowanej, w ilościach odpowiadających pojedynczym dawkom, które mogą być zmieszane z nośnikiem, aż do utworzenia odpowiedniego roztworu lub zawiesiny do iniekcji.

Alternatywnie, IL-6 może być podawana za pomocą układów dostarczania wszczepialnych lub o przedłużonym działaniu, np. w postaci mikrocząsteczek lub porcji leku o przedłużonym działaniu umieszczonych w tkankach, w połączeniu z polimerem stanowiącym materiał substancji podstawowej, z której lek jest powoli uwalniany. Jest to korzystne w leczeniu stanów przewlekłych, np. przewlekłych stanów zapalnych, kiedy wymagane leczenie przedłuża się na tygodnie lub miesiące.

Polimer może być każdą odpowiednią, liniową cząsteczką (tj. farmaceutycznie dopuszczalną), o wysokim ciężarze cząsteczkowym utworzoną z powtarzających się jednostek (łącznie z homopolimerami, kopolimerami i heteropolimerami), ewentualnie rozgałęzioną lub siecio182 569 waną, która może być otrzymana, np. przez polimeryzację pojedynczej cząsteczki lub kopolimeryzację więcej niżjednej cząsteczki (np. poli(węglan etylenu) ztlenku etylenu i dwutlenku węgla jak opisano poniżej) i ewentualnie zawierającą przerwy w łańcuchu polimeru z innymi jednostkami. Korzystnie, polimer jest liniowy i składa się z węgla, tlenu i wodoru, np. poli-DL-laktydo-ko-glikolid, glikol polietylenowy lub poli(węglan etylenu). Korzystnie polimer wykazuje erozję powierzchniową niehydrolityczną, tak jak, np. opisany dalej poli(węglan etylenu).

II. Polimeryczne substancje podstawowe do długotrwałego uwalniania

Znane jest stosowanie poliwęglanów etylenu) w układach do dostarczania leków, przy czym nieoczekiwanie stwierdzono, że występuje szczególna grupa tych polimerów, o szczególnie korzystnych właściwościach. Polimery należące do tej grupy posiadają zdolność do podlegania niehydrolitycznej erozji in vivo i są szczególnie korzystne do stosowania w układach do długotrwałego uwalniania leków, a zwłaszcza do uwalniania IL-6.

Charakterystyki degradacji tej grupy polimerów okazały się niezwykle interesujące. Należałoby oczekiwać, na podstawie ogólnej wiedzy chemicznej, że wiązania estrowe w poliwęglanach powinny łatwo ulegać odszczepianiu. W tej szczególnej jednak grupie, wiązania estrowe okazały się trwałe w umiarkowanych warunkach in vitro.

Według Chem. Pharm. Bull. 31(4), 1400-1403 poli(węglany etylenu) ulegają degradacji in vivo, przy czym badany polimer nie był jednoznacznie zidentyfikowany, np. za pomocą nowoczesnych metod spektroskopowych. Według informacji podanej na str. 1402, degradację in vivo można było wyjaśnić jedynie jako wpływ enzymów hydrolitycznych.

Według Chem. Pharm. Bull. 32(7), 2795-2802 (1984) właściwość uwalnianie dibukainy z cząsteczek wykonanych z poli(węglanu etylenu) zawierającego dibukainę jest związana z dyfuzjąprzez polimer, a nie z procesem degradacji in vitro lub in vivo polimeru. Również tutaj własności fizyczne i chemiczne badanego poli(węglanu etylenu) nie były dostatecznie ocenione.

Według Makromol. Chem. 183,2085-2092, zwłaszcza informacji na str. 2086, epoksydowe polimery dwutlenku węgla są uważane za ulegające biodegradacji. Stwierdzono, że wstępne wyniki przeprowadzonych badań potwierdziły biodegradacyjność polimerów dwutlenku węgla i tlenku etylenu oraz możliwość ich stosowania w kontrolowanym uwalnianiu leku. Dla poparcia tego twierdzenia dotyczącego biodegradacyjności cytowano Jinko Zoki 3 (Suppl.), 212 (1974). W publikacji tej podano, że poli(węglan etylenu) należy do grupy związków, które najłatwiej ulegają hydrolizie i nawet enzym pronaza nie ma trudności w rozłożeniu go. Oznacza to, że hydroliza enzymatyczna in vitro i in vivo byłaby możliwa, ponieważ pronaza jest złożona z mieszaniny enzymów hydrolitycznych. Badania przeprowadzone z wąską grupąpoliwęglanów, której charakterystyka zostanie przedstawiona niżej nie potwierdza tych wyników.

Poli(węglany etylenu) z tej grupy, z postaci sprasowanych krążków o średnicy 5 mm i o wadze 25 mg, zostały poddane działaniu 10 mg/ml pronazy E i 5 milimoli CaCl₂2H₂O w buforowanej fosforanem solance o pH 7,4 (w temperaturze 37°C) i nie zaobserwowano żadnej degradacji (patrz fig. 1) pomimo, że roztwór pronazy odnawiano codziennie.

Stwierdzono, że te szczególne właściwości mająpoli(węglany etylenu) o szczególnie dużej zawartości węglanu etylenu, a więc o odpowiednio wysokiej lepkości i zakresie temperatury zeszklenia. Polimery te nie ulegają degradacji przez hydrolizę (np. w obecności enzymów hydrolitycznych, np. pronazy lub w warunkach zasadowych), tym niemniej ulegają rozkładowi in vitro i in vivo, przy czym wykazująwyłącznie erozję powierzchniową. Wyrażenie „erozja powierzchniowa” chociaż jest stosowane w literaturze zwłaszcza w związku z hydrolityczną degradacją poliwęglanów i poliortoestrów, jednak nigdy nie było dokładnie sprecyzowane.

Erozja powierzchniowa występuje, jeśli ma miejsce zwyczajna degradacja masy na powierzchni cząstek, bez redukcji ciężaru cząsteczkowego pozostałej reszty polimeru. Jeżeli nawet w literaturze padały stwierdzenia, że zaobserwowano erozję powierzchniową, to nigdy nie zostały przeprowadzone oznaczenia ciężaru cząsteczkowego pozostałości masy równolegle z oznaczeniami utraty masy, a zatem nigdy nie udowodniono erozji powierzchniowej.

W rzeczywistości, prawie we wszystkich dotychczas badanych polimerach, obserwowano masową erozję polimeru. Układy wykazujące masową erozję polimeru mają znaczną niedogod6

182 569 ność, polegającą na tym, że jeśli do polimeru zostanie wprowadzony związek stanowiący lek, np. peptyd, który jest stosunkowo nietrwały pod wpływem środowiska biologicznego do którego będzie uwalniany, to związek stanowiący lek kontaktuje się ze środowiskiem częścią masy i może utracić swojąaktywność na długo zanim uwolni się z polimeru. Gdyby polimer podlegał tylko erozji powierzchniowej, tj. gdyby nie występowała erozja masowa, zatopiony (w polimerze) związek stanowiący lek np. peptyd, powinien pozostać ochroniony od szkodliwego wpływu środowiska biologicznego do czasu, aż progresywna erozja powierzchni dosięgnie cząsteczki leku i ta cząsteczka leku zostanie uwolniona z powierzchni pozostałego polimeru. W przypadku polimerycznej substancji podstawowej w układach dostarczania leku wykazujących tylko erozję powierzchniową, w przeciwieństwie do erozji masowej, cząsteczka lekujest wystawiona na szkodliwe działanie środowiska biologicznego w krótszym okresie czasu, pozwalając na dłuższe, wyższe i bardziej trwałe uwalnianie farmaceutycznie czynnego związku z polimerycznej substancji podstawowej.

W publikacjach Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90,552-556 (1993) i 90,4176-4180 (1993) zostały podane niektóre charakterystyki erozji powierzchniowej dla polibezwodników. Nie zostały natomiast wykonane oznaczenia ciężaru cząsteczkowego i wydaje się, że występująca tu erozja ma wpływ na całą masę, przy czym jest to erozja typu hydrolitycznego.

Wybrana grupa poli(węglanu/ów etylenu) szczególnie korzystna do stosowania w kompozycji według wynalazku, wykazuje in vitro, jak również in vivo wyłącznie niehydrolityczną erozję powierzchniową. Polimery te obejmująjednostki węglanu etylenu o wzorze A.

-(-C(O)-O-CH2-CH2-O-)- a, mają zawartość węglanu etylenu 70 do 100% molowych, zwłaszcza 80-100%, a korzystnie 90-99,9%, na przykład od 94 do 99,9%. Lepkość istotna polimeru mierzona w chloroformie w temperaturze 20°C wynosi od 0,4 do 4,0 dl/g. Korzystnie polimer ma lepkość właściwą mierzoną w temperaturze 20°C i stężeniu 1g/dl w chloroformie 0,4 do 3,0 dl/g. Temperatura zeszklenia tego polimerujest w zakresie od 15°C do 50°C, korzystnie od 18° do 50°C, przy czym według danych literaturowych poli(węglany etylenu) mają temperaturę zeszklenia od 5 do 17°C.

Polimery stosowane w kompozycji według wynalazku są korzystnie sporządzone przez kopolimeryzację tlenku etylenu i dwutlenku węgla i zawierają w większości przypadków jako współjednostki, jednostki tlenku etylenu o wzorze B

-(-CH2-CH2-O-)- B

Jeżeli stosowane polimery zostaną wystawione na działanie środowiska wodnego, np. solanki buforowanej fosforanem o pH 7,4, praktycznie żadne środowisko nie jest wprowadzone do ich masy. Pokazane to zostało, np. na fig. 2. Zatem nie występuje żadna erozja masy i pozostała masa będzie utrzymywana bez zmiany (100%) przez okres co najmniej 28 dni, np. jak pokazano na fig. 3, na prawym wykresie.

Najpowszechniej stosowanymi materiałami substancji podstawowej dla układów o długotrwałym uwalnianiu leku są obecnie poli-DL-laktydo-ko-glikolidy. Polimery te ulegają degradacji przez hydrolizę. Na przykład, degradację masową w PBS pokazano na fig. 3, na lewym wykresie, dla wysoce specyficznego poli-DL-laktydo-ko-glikolidu, tzn. inicjowanego glukoząpoli-DL-laktydo-ko-glikolidu (DL-PLGGLU), opisanego w brytyjskim opisie patentowym GB 2. 145.422.

Na fig. 3 pokazana różnica zachowania degradacyjnego pomiędzy stosowanym poliwęglanem etylenu) i znanymi poli-DL-laktydo-ko-glikolidami (DL-PLG) in vivo. Podczas gdy polilaktydo-ko-glikolid podlega erozji masowej, jak widać ze zmniejszonego ciężaru cząsteczkowego pozostałości masy DL-PLGGLU, ciężar cząsteczkowy pozostałości masy poliwęglanu etylenu) pozostaje stały (100%).

Pozostałościowa masa całego implantu obniża się in vivo w obu przypadkach do zera w ciągu 1 miesiąca, co znaczy, że poli(węglan etylenu) ulega raczej erozji powierzchniowej niż erozji masowej. W konsekwencji nieobecności erozji masowej, wypełniony polimer w okresie magazynowania, tj. przed jego podaniem, jest nieprzenikliwy dla wilgoci i pozostaje w tym samym suchym stanie wjakim został wyprodukowany. Włączony do niego lek, jeśli jest wrażliwy na wilgoć, pozostaje trwały.

182 569

Polimery stosowane w kompozycji według wynalazku wytwarzane są w reakcji, w której tlenek etylenu i CO₂ polimeryzują w stosunku molowym od 1:4 do 1:5 pod wpływem katalizatora. Wprowadzanie jednostek tlenku etylenu do łańcucha polimeru jest możliwe, jeśli dwie cząsteczki epoksydu reagująze sobą bez interwencji cząsteczki CO₂, tzn. jeżeli oksoanion natychmiast atakuje inną cząsteczkę tlenku etylenu zanin zostanie karboksylowany przez CO2. Zatem jest prawdopodobne, że polimer zawiera kilka jednostek tlenku etylenu i że wówczas ma przypadkowy rozkład węglanu etylenu i jednostek tlenku etylenu zgodnie ze wzorem sumarycznym Am-B,©

-(-C(O)-O-CH₂-CH₂-O-)-_m-(-CH₂-CH2-O-)-n w którym x 100 = 70 do 100 n+ m

Statystycznie jednak, większość jednostek tlenku etylenu ma w tych polimerach, przyległe jednostki węglanu etylenu, zwłaszcza w tych przypadkach, w których stosunek molowy jednostek tlenku etylenu jest mały. Oznacza to, że w tych przypadkach większość otrzymanych funkcj i eterowych jest rozłożona przypadkowo pomiędzy węglanowymi grupami funkcyjnymi wzdłuż łańcucha polimeru. Widma ’H-NMR polimerów w CDCl₃ potwierdzają to założenie. Wykazują one sygnały przy 5 = około 4,37 ppm (całka la) jednostek węglanu etylenu (jednostki etylenowe pomiędzy dwoma grupami węglanowymi), przy około 4,29 i 3,73 ppm (całki Ib i Ic) jednostek etylenowych pomiędzy jedną grupą węglanową i jedną grupą eterową i przy około 3,65 ppm (całka Id) jednostek etylenowych pomiędzy dwoma grupami eterowymi. Proporcja jednostek węglanu etylenu (A) obliczanajest następnie w granicach dokładności NMR zgodnie ze wzorem:

la % molowy jednostek węglanu etylenu (A):-100

Ia+ Ib+ Ic-ι- Id

Jako cechę strukturalną poli(węglanu/ów/ etylenu) w literaturze często podaje się ich zawartość funkcyjnych grup eterowych zamiast ich zawartości węglanu etylenu. Stosunek eterowych grup funkcyjnych (E) w stosowanych polimerach można obliczyć ze wzoru:

Ic+ Id % molowy grup eterowych (E) = -100

Ia+ Ib-ι- Ic+ Id

Według zgłoszenia patentowego PCT WO 92/22600 sporządza się poli(węglan/y/ etylenu), które zawierająjednostki tlenku etylenu i jednostki węglanu etylenu w stosunku molowym 2 do 400:2 co oznacza, że polimer zawiera co najmniej 50% molowych tlenku etylenu, a zatem mniej niż 50% molowych jednostek węglanu etylenu. Zgłoszenie to wymienia biodegradowalność polimerów i ich zastosowanie jako ulegających biodegradacji substancji podstawowych dla długotrwałego uwalniania farmakologicznie czynnych związków. Jednak nie podano żadnych danych, że polimery rzeczywiście ulegają biodegradacji. Na ogół, poli(węglany etylenu) mające tak dużąliczbę funkcyjnych grup eterowych ledwo ulegająbiodegradacji. W zgłoszeniu brakjest jakichkolwiek wzmianek o możliwości powierzchniowej erozji polimerów.

W przykładach opisu patentowego US 3 248 415 opisano poli(węglany etylenu) o niskim ciężarze cząsteczkowym o Mw = 700 - 5000 mającej mniej niż 70% jednostek węglanu etylenu, różne od polimerów według wynalazku i nic nie wzmiankowano o ich zdolności biodegradacji.

Według zgłoszenia PCT WO 89/05664 poliwęglany etylenu) zawierąjąw swej strukturze jednostki tlenku etylenu i węglanu etylenu w molowym stosunku 1do 8:1, co oznacza, że polimer ten zawiera co najmniej 5 0% molowych tlenku etylenu a zatem mniej niż 50% jednostek węglanu etylenu. Chociaż opisane jest stosowanie tych polimerów w ulegających biodegradacji układach medycznych, np. w implantach, zawierających lek, nie ma żadnej informacji odnośnie ich erozji powierzchniowej.

Zawartość jednostek tlenku etylenu, a zatem zawartość funkcyjnych grup eterowych, które opóźniia^lub inhibitująszybkość biodegradacji polimeru, jest zależna od warunków prowadzenia reakcji, takich jak stosunek molowy składników reakcji, temperatura reakcji i dalej przez dobór odpowiedniego katalizatora. Korzystne jest stosowanie katalizatora sporządzonego

182 569 z Zn(C2H₅)2 i wody lub acetonu i di- lub trifenolu, np. floroglucyny, w stosunku molowym od 0,9 do 1 do 1:0,9 lub 1:1 do 1:2 odpowiednio, lub korzystnie sporządzonego z Zn(C2H₅)2 i diolu, zwłaszcza glikolu etylenowego w stosunku molowym od 0,9:1 do 1:0,9.

Korzystnejest prowadzenie reakcji w układzie rozpuszczalnika lub środka dyspergującego z rozpuszczalnika organicznego, np. dioksanu i CO2. CO2 korzystnie stosuje się w postaci ciekłej i w nadmiarze. Korzystnie stosowane ciśnienie wynosi 20 do 70 x 105 Pa, a stosowana temperatura 10 do 80°C, zwłaszcza 20 do 70°C.

Tak otrzymane polimery zawierają zwykle mniej niż 15% grup eterowych, korzystnie mniej niż 10%, zwłaszcza mniej niż 5%, np. mniej niż 3%. Poli(węglan/y/ etylenu), jeśli sporządzone są przy użyciu katalizatora z glikolu etylenowego lub acetonu i dietylocynku wykazują niską polidyspergowalność (Mw/Mn), zwykle mniejszą niż 5, taką jak mniejsza niż 2,5.

Katalizator lub jego część uważane są za inicjator łańcucha dla (ko)-polimeru. Gdy reakcja dojdzie do końca i łańcuchjest zakończony, jego końcowągrupątermmalnąjest grupa hydroksylowa. Przeciwna strona łańcucha, która była stroną od której rozpoczynał się łańcuch, może być zajęta przez grupę katalizatora lub jego fragment. Jeśli katalizator sporządzony jest z glikolu etylenowego i dietylocynku lub wody i dietylocynku, oba końce łańcucha polimeru przypuszczalnie są identyczne. Jednak, jeśli katalizator sporządzony jest z di- lub trifenolu i dietylocynku, grupa aromatyczna zostanie włączona do końca łańcucha, gdzie łańcuch zaczynał się, podczas gdy drugim końcem łańcucha będzie grupa hydroksylowa. Z fig. 4 widać, że poliwęglan etylenu), jeśli jedna z jego grup terminalnych jest zablokowana np. przez inicjator aromatyczny taki jak floroglucyna, wolniej ulega biodegradacji. Z tego powodu zakłada się, że degradacja łańcucha polimeru rozpoczyna się przy terminalnej grupie/ach hydroksylowych. Alternatywnie, może być również brana pod uwagę ostatnia derywatyzacja terminalnej grupy hydroksylowej np. przez estryfikację, w celu blokowania terminalnych grup hydroksylowych i regulacji biodegradacji poli(węglanu/ów/ etylenu). Odpowiednimi terminalnymi grupami estrowymi sąbiokompatybilne grupy estrowe, jak grupy estrowe kwasów tłuszczowych (C₁-_l8), korzystnie grupy estrowe kwasów tłuszczowych (C1_3₀), zwłaszcza (C^g), np. grupy estrowe kwasu octowego i kwasu stearynowego lub grupy estrowe kwasu węglowego, np. grupa węglanu etylenu lub grupa estrowa kwasu pamowego lub mlekowego lub glikolowego lub polimlekowego lub poliglikolowego lub grupa estrowa kwasu polimlekowo-ko-glikolowego.

Otrzymane poli(węglany etylenu) są trwałe przez kilka godzin w gorącej wodzie (90-100°C) bez znacznej redukcji ciężaru cząsteczkowego. Zaobserwowano znaczny wzrost temperatury zeszklenia po wystawieniu na działanie dwukrotnej gotowanej wody w przeciągu 5 godzin, np. w temperaturze powyżej 18°C, np. w 28°C. Przez przeprowadzenie tego etapu reakcji, uzyskuje się wyższą czystość polimeru i polimer łatwiejszy w obróbce.

Nie ulegająca hydrolizie grupa poliwęglanów etylenu) nie jest degradowana w ciągu co najmniej 1 miesiąca przez enzymy hydrólityczne w warunkach fizjologicznych lub przez wodę przy pH 12 i wtemperaturze 37°C (patrz fig. 1 i 8). Jednak stwierdzono, że polimery te ulegajądegradacji in vivo i in vitro za pomocą erozji powierzchniowej pod wpływem nadtlenkowego anionorodnika O2. Nadtlenkowe anionorodniki O2 są generowane w komórkach zapalnych in vivo i ex vivo w obecności poli(węglanów etylenu), jak przedstawiono na fig. 5. Polilaktydo-ko-glikolidy, obecnie najpowszechniej stosowane substancje podstawowe dla układów dla długotrwałego uwalniania leku i degradowane przez hydrolizę masową, nie wywołują generowania nadtlenkowych anionorodników O2 co przedstawiono na tej samej figurze dla inicjowanego glukozą poli-DL-laktydo-ko-glikolidu, który również był stosowany w przykładzie przedstawionym na fig. 3.

Przygotowano in vitro wodny układ zawierający nadtlenek potasu jako źródło O2. Układ ten potwierdza występowanie powierzchniowej erozji w przypadku stosowanej grupy poliwęglanów etylenu) (patrz fig. 8). In vitro wybrano wartość pH 12, ponieważ rodnik O2 jest wystarczająco trwały przy tej wartości pH.

Interesujące jest, że poli(węglan propylenu) różniący się od poli(węglanu etylenu) przez zastąpienie wodoru w jednostce etylenowej grupą metylową, w ogóle nie ulega biodegradacji.

Wykazali to japońscy autorzy w Chem. Pharm. Bull 31(4), 1400-1403 (1983).

182 569

Stosując zawiesiny mikrocząsteczek stosowanego w kompozycji według wynalazki poli(v,ęglanu etylenu) przeprowadzono badanie toksyczności na 48 szczurach przez 21 dni i 24 psach przez 35 dni. Wykonano dwa stosowania na każdym gatunku dnia 1 i dnia 17. Po podskórnym i domięśniowym podaniu 10 i 40 mg mikrocząstek/kg wagi ciała nie zaobserwowano klinicznych objawów toksyczności ogólnoustrojowej, żadnego związanego wpływu na parametry hematologiczne, na parametry klinicznej chemii krwi, na wagę ciała i na spożywanie pożywienia.

Miejsca stosowania były badane na zmiany histopatologiczne 4 i 21 dni po zastosowaniu na szczurach i 18 oraz 35 dni po zastosowaniu na psach. Poza oczekiwaną reakcją zapaleniową nie znaleziono żadnych niezwykłych zmian histopatologicznych.

Szybkość rozkładu polimerów może być dostosowana w szerokich granicach w zależności od ich ciężaru cząsteczkowego, ich zawartości tlenku etylenu, identyczności grup terminalnych, np. biokopatybilnych grup estrowych i obecności wychwytywacza rodnika O2, np. witaminy C i może trwać od 5 dni do 6 miesięcy lub dłużej, np. nawet do 1 roku. Wychwytywacz rodników może korzystnie być wprowadzony do polimeru jako dodatek.

Ciężar cząsteczkowy Mw (ko)-polimerów stosowanych w kompozycji według wynalazku wynosi od 80.000, korzystnie od 1θ0.000, zwłaszcza od 200.000 do 2.000.000 Daltonów, według oznaczenia za pomocą chromatografii permeacyjnej na żelu z chlorkiem etylenu jako eluentem i zpolistyrenem jako produktem odniesienia.

Omówiony powyżej Chem. Pharm. Bull. 32 (7) 2795-2802 (1984) wzmiankuje, że stosowane były poli(węglany etylenu) mające ciężar cząsteczkowy od 50.000 do 150.000 Daltonów.

Stwierdzono natomiast, że degradację polimeru in vitro i in vivo można tylko uzyskać w zadowalającej proporcji, gdy ciężar cząsteczkowy jest wyższy od 80.000, korzystnie powyżej 100.000 (fig. 6) i właśnie takie polimery są stosowane w kompozycjach farmaceutycznych, według wynalazku, zwłaszcza jako materiały substancji podstawowych do wprowadzenia do nich związków farmakologicznie aktywnych.

Zgodnie z wynalazkiem kompozycja farmaceutyczna, zawiera polimer ulegający biodegradacji, związek farmaceutycznie czynny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne środki dodatkowe. Kompozycja ta charakteryzuje się tym, że zawarty w niej polimer obejmuje jednostki węglanu etylenu o wzorze A

-(-C(O)-O-CH2-CH2-O-)- a, zawiera węglan etylenu w ilości 70 do 100% molowych, ma masę cząsteczkową (Mw) 80 000 do 2 000 000, lepkość istotną 0,4 do 4,0 dl/g mierzoną w chloroformie oraz temperaturę zeszklenia od 15° do 50°C. Związek farmaceutycznie czynny w kompozycji jest cytokinąi jest obecny w ilości od 0,001% do 70% wagowych. Farmaceutycznie dopuszczalne środki dodatkowe zawierająpoliole w ilości od 1 % do 90% wagowych, natomiast polimer jest obecny w kompozycji w ilości stanowiącej uzupełnienie do 100% wagowych w stosunku do całej masy kompozycji.

W polimerze stosowanym w kompozycji według wynalazku, w warunkach in vitro i in vivo nie występuj e erozj a masowa a związek aktywny jest chroniony przez polimer. Związek aktywny uwalnia się tak szybko jak tylko pojawia się na powierzchni substancji podstawowej (anie przedtem), z uwagi na, występującąwyłącznie, erozję powierzchniową substancji podstawowej. W układzie wodnym in vitro przy pH 7,4 nie zawierającym O2, uwalniały się tylko ślady związku aktywnego (patrz fig. 9).

Dalszą zaletą występowania erozji powierzchniowej, przy braku erozji masowej jest to, że wielkość cząsteczki związku farmakologicznie czynnego nie wpływa na jego uwalnianie.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje zatem związek farmakologicznie czynny, chroniony w polimerze wykazującym nie hydrolityczną erozję powierzchniową.

Kompozycje według wynalazku korzystnie stosuje się w postaci mikrocząstek lub implantów, przy czym te postacie leku wytwarza się znanymi sposobami. Przy wytwarzaniu mikrocząstek stosuje się takie techniki jak suszenie rozpyłowe lub emulgowanie. Przy wytwarzaniu implantów, rozdrabnia się dokładnie związek będący lekiem i poli(węglan etylenu), pozostające w stanie stałym obydwie substancje miesza się w podwyższonej temperaturze, przy której poli(węglany etylenu) stają się miękkie, a następnie schładza się uzyskaną mieszankę i modeluje

182 569 masę do pożądanego kształtu. Możliwe jest również mieszanie leku z rozpuszczonym lub zdyspergowanym roztworem poliwęglanu etylenu), odparowanie rozpuszczalnika i ukształtowanie stałej pozostałości do żądanej postaci implantów.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające mikrocząstki można wytworzyć przez ich przerób z odpowiednimi zarobkami galenowymi i ewentualnie przez wprowadzenie ich do odpowiednich zasobników.

W zależności od własności leku i sposobu wytwarzania obciążenie zawartością leku może zmieniać się w szerokich granicach rzędu 0,001 do około 70% np. 0,001 do 20%, korzystnie 0,001 do 5% wagowo. Powinno się unikać perkolacji ośrodka do polimeru z uwagi na wysokie obciążenie lekiem i ograniczenie górnej wartości zawartości obciążenia.

Kompozycja według wynalazku umożliwia podawanie terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości leku. Np. IL-6 w ilości inhibitującej TNFa i/lub IL-1, np. rhIL-6 (zwłaszcza, gdy IL-6 podawanajestjako jedyny środek terapeutyczny lub profilaktyczny lub ewentualnie podawana w połączeniu ze środkami przeciwmikrobowymi lub naczyniowoczynnymi, przy czym nie w połączeniu z agonistami lub antagonistami TNFa lub z przeciwciałem anty-TNFa.

Dawkowanie jest oczywiście różne w zależności od dokładnego typu zastosowanej IL-6, gospodarza, sposobu podawania i charakteru oraz ostrości leczonego stanu. IL-6 podawana jest większym ssakom, np. człowiekowi przez iniekcje podskórne lub w postaci leku o długotrwałym uwalnianiu dla zapewnienia dawki od 0,5 (g/kg/dziuń do 30 pg/kg/dzień, korzystnie od

2,5 pg/kg/dzień do 10 ppgkg/dzzeń, lub kiUdej innej dawką która ma cdżałłaue beerpiecczne i skuteczne in vivo w znanych zastosowaniach IL-6, np. w dawkach powodujących wzrost ilości płytek. W przypadku poważnych ostrych stanów zapalnych np. we wstrząsie septycznym może być pożądane podawanie wyższych dawek i.v. dla uzyskania szybkiej i silnej reakcji. Częstotliwość p_odawania IL-6 może być, ewentualnie, zmniejszona od podawania codziennie, do podawania _co d_rugi d_zień, lub co tydzień lub nawet w dłuższych odstępach czasu. Jest to możliwe przy stosow_aniu postaci leku o długotrwałym uwalnianiu, korzystnym zwłaszcza w przypadkach, gdy lu_czenie jest długotrwałe. Leczenie za pomocą IL-6 może powodować dreszcze, gorączkę i objawy grypo_we, które normalnie mogą być leczone lub stosowane profilaktycznie przy równoczesnym p_od_awani_u nienarkotycznych środków przeciwbólowych takich jak aspiryna, acetaminofen l_ub indometacyna. Inne znaczące działania uboczne pojawiają się tylko przy wyższych dawkach, np. powyżej 10 pg/kg/dzień i zwykle uslępująpo zmniejszeniu dawki.

W p_rakty_ce medycznej, każdy typ farmakologicznie czynnego związku można stosować w k_ombi_nacji _z poliwęglanami etylenu) nie ulegającymi erozji masowej. W przypadku mikro_czą_stek korzystnie stosuje się te typy leków, które są farmakologicznie czynne w małych iloś_ci_ach i wymagają nieprzerwanego stężenia we krwi przez długie okresy czasu. Są to takie _związki j_ak: h_ormony, peptydy lub białka, np. somatostatyny, interferony lub interleukiny, ale w _sz_czegól_ności te, które są nietrwałe i ulegają dezintegracji po podaniu doustnym w układzie żołądkowo jelitowym i są zatem podawane pozajelito_wo.

Preparaty leku _o przedłużonym działaniu umieszczane w tkankach mogą być stosowane do p_od_awania różnych klas środków aktywonych, uip. środków farmakologicmme czynnych tzkiah j_ak aitydcm^piww, uspokaiające, sterydy, sulfonamidy, szczepionki, witaminy, środki przeriwmgre^^, enzymy, leki rozszerzające oskrzela, leki sureowo-aacuymowu, przeciw bólowe, imtybiotyki, _aatygeay, leki przeciw drgawkowe, leki przeciw zapalne, leki pizeciw-pankenso_now_e, wydzielania prolaktyny, lek ^zeciw astmctyczne, środki guriatyczde i przeciw maarycaK. Środek aktywny może być dobrany z szerokiej gamy związków chemicznych, _np. środków lipofilowo i/lub hydrofilowo czynnych, łączni- z puptydami takimi jak oktreotyd (opisany w brytyjskim opisie GB 2 234 896 A).

Ak bwtwmi Νζ^ριϊ lub puptydami korzystni- są c^okny, np. inturluukmy, G-CSF,

M_-CSF, GM_-CSF l_ub LIF, interferony, erytropouzy, cyklosporyny lub hormony, lub ich analogi, np. oktruotyd.

Komp_ozycj_u f_aramcuutyczne według wynalazku są stosowane do: immunomodulacji, w której składnik aktywny zawiura cytokinr, np. iaturluukenę (IL_-3, IL-6) lub czrmmki _stym_u182 569 lujące kolonie hematopoezy (G-CSF np. Filgrastim, GM-CSF, np. Molgramostim, Sargramostim, M-CSF), np. jako substancje pomocnicze dla szczepionek; osiągnięcia przywrócenia tworzenia się krwinek po terapii myelosupresyjnej lub po transplantacji szpiku kostnego, w której składnik aktywny zawiera czynnik wzrostu hematopoezy, np. GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-6, czynnik inhibitujący białaczkę (LIF), Stem Cell Factor (SCF) lub ich kombinacje; osiągnięcia lokalnie wysokiego stężenia składnika aktywnego, np. gdzie składnik aktywny zawiera lek lub cytokinę, GM- CSF, IL-6, IL-2, IL-4 lub ich kombinacje, w celu stymulowania ochronnej reakcji immunologicznej np. przy podawaniu razem z napromieniowanymi komórkami guza lub antygenami szczepionki (analogia do napromieniowanych komórek guza transfektowanych odpowiednimi genami cytokiny); wywołania silnych reakcji odpornościowych, gdzie składnik aktywny zawiera np. GM-CSF podawany w kombinacji z antygenami, zwłaszcza z antygenami guza, antygenami wirusowymi lub antygenami bakteryjnymi; wywołania gojenia rany przy miejscowej iniekcji kompozycji, np. w której składnik aktywny zawiera GM-CSF; wywołania specyficznej tolerancji immunologicznej Ag, w której składnik aktywny jest np. GM-SCF kombinowany z inhibitorami dodatkowych cząstek (ko-receptorów), zwłaszcza inhibitorami dla wzajemnego oddziaływania z CD28-B7, dla wzajemnego oddziaływania z ligandem CD40-CD40, dla wzajemnego oddziaływania z czynnikami adhezji; w terapii towarzyszącej leczeniu cytostatycznemu lub jako substancja pomocnicza dla szczepionki, w której składnik aktywnym jest np. cytokiną, zwłaszcza interleukiną(IL-3, IL-6) lub czynnikiem wywołującym wydzielanie cytokiny, np. pochodną lipidową np. związkiem opisanym w EP 0309411, zwłaszcza w przykładzie 1, również znanym jako MRL953; przy specyficznej immunosupresji, np. gdzie składnik aktywny jest czynnikiem immunosupresyjnym wiążącym immunofilinę, np. cyklosporyną(np. Cyklosporyną A), askomycyną(np. FK506) lub rapamycyną (np. rapamycynąlub pochodnąopisaną w WO 94/09010, np. 40-O-hydroksyetylorapamycyną); w leczeniu lub zapobieganiu chorobom autoimmunizacyjnym i stanom zapalnym poprzez powolne uwalnianie cytokin przeciwzapalnych np. IL-6, IL-10 lub TGFp; lub interferonów, np. IFN-β lub Betaseron; lub rozpuszczalnych receptorów cytokiny lub antagonistów receptorów cytokiny np., IL-1, TNFa lub IL-4; w leczeniu lub zapobieganiu chorobom alergicznym przez powolne uwalnianie rozpuszczalnego łańcucha a receptorów IgE o wysokim powinowactwie (Fc_ERI); w leczeniu raka np. oktreotydem, cytokinami, zwłaszcza interleukinami; przy selektywnym docieraniu do celu, np. w celu leczenia leiszmaniozy, infekcji grzybiczych, choroby spichrzania enzymów (Tay Sachs, Gauckerillness); w leczeniu AIDS lub ARC; przy szczepieniach, np. szczepionką przeciw tężcowi toksycznemu; przy leczeniu hematopoezy, w przypadku gdy składnikiem aktywnym jest erytropoeza; przy wewnątrzstawowej iniekcji leku przeciwzapalnego do stawu w stanie zapalnym, zwłaszcza leku, który nie jest biodostępny przez podawanie doustne lub ma bardzo krótki okres półtrwania, jak np. inhibitory przekształcania enzymu IL-1 (3 lub inhibitory metaloproteazy.

Sposób wzmacniania reakcji odpornościowej ssaków na szczepionkę, obejmujący zaszczepienie, w razie potrzeby, ssaków skuteczną ilością GM-CSF w połączeniu ze szczepionkąjest opisany w międzynarodowym zgłoszeniu PCT WO 94/01133. Jednak w tym sposobie, GM-CSF nie był starannie opóźniany, co w konsekwencji daje prawie stałe uwalnianie związku aktywnego przez dłuższe okresy czasu, w którym to czasie krotność podawania GM-CSF może być zmniejszona.

Kompozycja według wynalazku może być stosowana dla podawania pozajelitowego interleukiny lub CSF lub stosowanajako preparat typu depot, umieszczony w tkankach do powolnego wchłaniania.

Dokładne ilości podawanego leku i receptura depotu zależy od wielu czynników, np. stanu pacjenta, pożądanego okresu leczenia, szybkości uwalniania związku i zdolności degradacji poli(węglanu etylenu). Ilość wymaganego środka farmakologicznie czynnego i szybkość jego uwalniania może być określona na podstawie znanych technik in vitro lub in vivo, np. przez określenie, jak długo stężenie danego środka aktywnego pozostaje w osoczu krwi na akceptowalnym poziomie. Zdolność rozkładu substancji podstawowej może być określona in vitro lub technikami in vivo, na przykład technikami, w których ilość materiałów substancji podstawowej w tkance podskórnej może być oznaczona po poszczególnych okresach czasu.

182 569

Preparaty typu depot mogąbyć podawane w postaci np. mikrocząstek drogądoustną donosowąlub dopłucną, korzystnie podskórnie, domięśniowo lub dożylnie, zwłaszcza w postaci zawiesiny w odpowiednim ciekłym nośniku lub w postaci implantów, np. podskórnie.

Powtórne podanie preparatów typu depot, z kompozycją według wynalazku jest możliwe, gdy substancja podstawowa polimeru ulegnie odpowiednio rozkładowi, np. po 1, 2 lub 3 tygodniach lub po 1 miesiącu.

Zaletą substancji podstawowych w kompozycji według wynalazku jest to, że w trakcie uwalniania związku leku łańcuch polimeru rozkłada się na części o małej wielkości cząsteczki, które są transportowane w płynach organizmu z miejsca podania.

Przykłady obciążenia lekiem dla korzystnego związku oktreotydu przy akromegalii wynoszą, w pozajelitowym ciekłym preparacie o przedłużonym działaniu typu depot mającym mikrocząstki, które zawierająpeptyd w ilości od co najmniej 0,1 korzystnie 0,5 do 20% wagowo w stosunku do (ko)-polimerycznej substancji podstawowej, korzystnie 2,0 do 10, zwłaszcza 3 do 6% wagowo. Całkowita dawka okreotydu wynosi 20 do 30 mg w akromegalii i do 100 do 200 mg przy raku piersi, np. w ciągu leczenia trwającego 1 miesiąc.

Czas uwalniania peptydu z mikrocząstek może wynosić do 5 dni do około 2 tygodni lub może być dłuższy.

Dogodnie, preparaty o długotrwałym uwalnianiu zawierąiąoktreotyd w nośniku (ko)-polimerycznym, który przy podawaniu królikowi lub szczurowi podskórnie w dawce 2 mg oktreotydu na kg wagi ciała zwierzęcia, wykazuje stężenie oktreotydu w osoczu krwi co najmniej 0,3 ng/ml a korzystnie mniej niż 20 ng/ml w dłuższym okresie.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać dalsze dodatki, korzystnie również wprowadzone do (ko)-polimeru, np. środek wychwytujący rodniki, zwłaszcza środek wychwytujący nadtlenkowy anionorodnik O2. Obecność takiego środka wychwytującego, np. menadionu lub witaminy C, obniża szybkość rozkładu poli(węglanu etylenu) (fig. 7). Innym typem dodatku jest środek wychwytujący rodnik hydroksylowy, prawdopodobnie powstającego pod działaniem nadtlenkowego anionorodnika O2, np. poliolu, zwłaszcza alkoholu cukrowego, zwłaszcza mannitolu. Stwierdzono, że dodatek ten ma sprzyjający wpływ na przyrost wagi ciała badanych zwierząt, którym podano, np. mikrokapsułkowany IL-3. Bez tego dodatku przyrost wagi ciała był opóźniony. Gdy kompozycja jest w postaci mikrokapsułek ten sam lub inny dodatek może być dodany zewnętrznie do istniejących mikrocząstek, ponieważ wówczas będzie miał korzystny wpływ na trwałość zawiesiny mikrocząstek. Przeciwdziała bowiem flokulacji i wytrącaniu. Jeśli obecny jest dodatek, to korzystnajego ilość wynosi 1 do 90% wagowo w przeliczeniu na całą ilość wagową preparatu.

Korzystaądegradację masową ta vitro i in vivo pod wpływem nadtlenkowego anionorodnika O2 zilustrowano na fig. 8. Krzywe degradacji dla pozostałości masy sąw przybliżeniu liniowe i mająróżne nachylenie, ponieważ warunki degradacji in vivo i in vitro są różne. Ilość degradowanej masy na jednostkę czasu jest prawie stała. Krzywe dla uwalniania in vivo farmakologicznie aktywnego związku, np. ludzkiego IL-3, pod wpływem nadtlenkowego anionorodnika O2 są, tak jak krzywe degradacji w przybliżeniu liniowe (fig. 10), co oznacza, że ilość uwalnianego związku leku na jednostkę czasu jest prawie stała.

Kombinacja uwalniania in vivo ludzkiego IL-3 i degradacji masowej in vivo została przedstawiona na fig. 11, wykazując korelację 1: 1 pomiędzy degradacją masową in vivo, a uwalnianiem leku.

Przykłady 1-5. Synteza poli(węglanu/ów etylenu) z katalizatorem sporządzonym z dietylocynku i wody.

Ilość reagentów, rozpuszczalnika, katalizatora itd, dla poszczególnych prób zostały podane w tabeli 1.

200 ml suchego dioksanu i 19,5 g (158 mmola) Zn^Hs^ umieszczono w 750 ml kolbie w atmosferze N2. Kolbę wyposażono w mieszadło mechaniczne, wkraplacz, termometr i wlot^.

Wkraplacz zaopatrzono w rurkę z CaC^. Roztwór schłodzono do temperatury 10°C na łaźni lodowej i powoli dodano roztwór 2,7 ml H2O w dioksanie (patrz tabela 1) tak, aby utrzymywać

182 569 temperaturę pomiędzy 10-15°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 45 minut w temperaturze pokojowej, aż początkowo bezbarwny roztwór stał się bladożółty. Otrzymany roztwór katalizatora przeniesiono do autoklawu, zadano 40 g CO₂ i ogrzewano w temperaturze 125°C przez czas wskazany w tabeli 1. Mieszaninę następnie schłodzono do temperatury pokojowej i dodano 560 g (12,7 mola) CO₂, po czym powoli dodawano 132 g (3 mole) tlenku etylenu przez okres 1 godziny. Reakcję prowadzono przez czas wskazany w tabeli 1. Po tym czasie, w ciągu kilku godzin powoli obniżano ciśnienie. Produkt, lepką zawiesinę, rozcieńczono dioksanem i wytrącono poprzez wlanie roztworu dioksanowego do 0,25 M wodnego HCl. Wytrącony osad rozpuszczono we właściwej ilości CH₂Cl₂ (2-4 litry), przemyto wodnym 0,5 M HCl (2x) i H2O (1x). Roztwór ten wysuszono bezwodnym Na₂SO₄ i odparowano do końcowej objętości 0,5 do 1,5 litra, w zależności od lepkości roztworu. Produkt wytrącono poprzez wlanie roztworu CI I₂Cl₂ do 4 krotnej objętości metanolu. Biały osad odsączono i suszono przez noc w warunkach 0,5 x 102 Pa/50°C. Surowy produkt ponownie wytrącono z acetonu w celu dalszego oczyszczania, patrz tabela 2. Wszystkie otrzymane produkty miały identyczne widma 'H-NMR, za wyjątkiem względnych intensywności sygnałów przy 3,65, 3,73,4,29,4,37 ppm, z uwagi na różnice w zawartości jednostek węglanu etylenu.

Tabela 1

Próby wytwarzania poliwęglanów etylenu)

Przykład	Tlenek etylenu	CO2	Zn(C2H5)2	Dioksan	Temp.	Czas
[mol]	[mol]	[mmol]	[ml]	[°C]	[h]
1	3	13,6	158	300	50	64
2	3	9,1	158	500	20	64
3	3	13,6	158	300	20	240
4	3	13,6	158	300	20	40
5	3	13,6	158	300	20	22
6	3	13,6	238	300	50	64

Wszystkie próby prowadzono w 1,0 litrowym autoklawie NB2. Molowy stosunek H2O :Zn(C₂H₅)2 = 0,95 we wszystkich próbach. Katalizator traktowano wstępnie 40 g CO₂ w temperaturze 125°C przez 1 godzinę za wyjątkiem przykładu 1 (10 godzin).

Tabela 2

Wybrane własności fizyczne syntetyzowanych poli(węglanów etylenu)

Przykład	Mw	Mn	Mw/Mn	Tg	Liczba lepkościowa w CHCl3 a)	Zawartość węglanu etylenu
[kDa]	[kDa]	[°C]	[dl/g]	[%]
1	141,9	32,2	4,40	19,3	0,60	87
2	627,3	133,5	4,70	23,5	1,46	91
3	477,0	83,6	5,71	18,7	1,27	91
4	758,0	97,5	7,77	20,6	1,75	90
5	721,6	80,7	8,95	22,9	2,44 b)	90
6	310,9	103,1	3,02	20,1		88

a) w temperaturze 20°C i stężeniu 10 mg/ml, o ile nie zaznaczono inaczej;

b) w stężeniu 1 mg/ml

182 569

Przykłady 7-11. Ogólne postępowanie w celu syntezy poli(węglanu/ów/ etylenu) z katalizatorem sporządzonym z dietylocynku i diolu.

1. Wytwarzanie katalizatora

200 ml suchego dioksanu umieszczono w suchej, 4-szyjnej 750 ml kolbie w atmosferze azotu. Dodano 19,50 (15 8 mmoli) dietylocynku za pomocą strzykawki szklanej. Kolbę wyposażono w mieszadło mechaniczne, wkraplacz, termometr i wlot argonu. We wkraplaczu umieszczono 100 ml suchego dioksanu i zaopatrzono go w rurkę z chlorkiem wapnia. Aparat następnie ustawiono pod strumieniem argonu. Do dioksanu we wkraplaczu w atmosferze argonu dodano 9,00 g (145 mmoli, 0,92 równoważników molowych) świeżo przedestylowanego glikolu etylenowego (trzymanego nad sitem molekularnym). Mechanicznie mieszanąkolbę schłodzono do temperatury 10°C na łaźni lodowej utrzymując atmosferę argonu. Do mieszanego roztworu dietylocynku w dioksanie wkroplono w przeciągu 30 minut roztwór glikolu etylenowego utrzymując w tym czasie temperaturę pomiędzy 10-14°C. Jednocześnie z dodawaniem roztworu glikolu etylenowego obserwowano wydzielanie się gazowego etanu i wytrącanie osadu. Po zakończeniu dodawania, usunięto łaźnię chłodzącą i mieszaninę mieszano przez dalsze 60 minut pozwalając na ogrzanie się do temperatury pokojowej. Heterogeniczną mieszaninę przeniesiono następnie do autoklawu (1 litrowy autoklaw NB2) w atmosferze argonu. Autoklaw załadowano około 40 g (0,9 mola) dwutlenku węgla i ogrzewano w temperaturze 125°C przez 1 godzinę mieszając, w celu wstępnego traktowania katalizatora dwutlenkiem węgla.

2. Polimeryzacja

Autoklaw z traktowanym wstępnie katalizatorem ochłodzono do temperatury pokojowej i załadowano dodatkowymi 560 g (12,7 molami) dwutlenku węgła. Następnie do mieszanej mieszaniny w autoklawie dodano 132 g (3 mole) tlenku etylenu (99,8%) za pomocąpowolnej iniekcji w przeciągu 1 godziny. Po zakończeniu dodawania, autoklaw ogrzano do temperatury wskazanej w tabeli 3 i mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez dany okres czasu.

3. Przerób

Autoklaw ochłodzono do temperatury pokojowej i powoli zwolniono ciśnienie do ciśnienia atmosferycznego. Produkt, białą lepką zawiesinę, rozprowadzono w sumie w 7 litrach dichlorometanu, dodano 1035 ml 0,4 m HCl i mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Fazy rozdzielono i warstwę organicznąprzemyto dwukrotnie 3 litrami 0,5 m HCl i dwukrotnie

4,5 liti^ranm wody. Roztwór dichloromettam osuszono na 12 g siaaczanu sodu i do końcowej objętości około 2 litry. Produkt wytrącił się przez powolne dodanie tego roztworu do 6 litrów metanolu. Wytrącony osad suszono przez 16 godzin in vacuo w temperaturze 40°C otrzymując surowy polimer, który dalej oczyszczano następująco:

Surowy produkt rozpuszczono w dichlorometanie i roztwór przelano do 5 krotnej objętości acetonu w przeciągu 15 minut do wytrącenia produktu. Wytrącony osad suszono przez 16 godzin pod próżnią w temperaturze 40°C otrzymując odpowiadający poli(węglan etylenu). Własności fizyczne produktów podano w tabeli 4. Wszystkie produkty wykazały silną absorpcję IR przy 1750 i 1225 cmT Sygnał Ή-NMR jednostek węglanu etylenu pojawił się przy 4,37 ppm.

Tabela 3

Synteza poli(węglanów/etylenu) z katalizatorem sporządzonym z dietylocynku i diolu

Przykład	Tlenek etylenu	CO2	Rozpuszczalnika	Zn(C2H5)2	Diolb	Temp. reakcji	Czas reakcji
[mol]	[mol]	[ml]	[mmol]	[mmol]	[°C]	[godz.]
7	3,0	13,6	300	158	145	20	96
8	3,0	13,6	300	158	145	50	96
9	3,0	13,6	300	158	145	60	96
10	3,0	13,6	300c)	158	145	50	144
11	3,0	13,6	300	158	145d	50	96

a) Dioksan, o ile nie zaznaczono inaczej. d) 1,4-butanodiol w miejsce glikolu etylenowego.

b) Glikol etylenowy, o ile nie zaznaczono inaczej.

c) Tetrahydrofuran jako rozpuszczalnik w miejsce dioksanu.

182 569

Tabela 4

Wybrane własności fizyczne poli(węganu/ów/ etylenu) zsyntezowanych przy użyciu katalizatora sporządzonego z dietylocynku i diolu

Przykład	Mw	Mn	Mw/Mn	Tg	Liczba lepkościowa w CHClj*)	Zawartość węglanu etylenu
[kDa]	[kDa]	[°C]	[dl/g]	[%]
7	-	-	-	16,7	2,88b)	98
8	328,0	149,0	2,20	16,4	0,97	95
9	207,0	103,0	2,00	21,2	0,65	92
10	231,0	83,8	2,76	32,6	0,72	96
11	110,0	53,4	2,06	31,1	0,49	90

a) W temperaturze 20°C i stężeniu 10 mg/ml, o ile nie zaznaczono nic ponadto;

b) W stężeniu 1 mg/ml.

Przykład 12: Doświadczalne postępowanie w celu syntezy poli(węglanu etylenu) z katalizatorem sporządzonym z dietylocynku i fluoroglucyny

1. Wytwarzanie katalizatora

200 ml suchego dioksanu umieszczono w suchej 4-szyjnej 750 ml kolbie w atmosferze azotu. Dodano 19,60 g (158,7 mmola) dietylocynku za pomocą szklanej strzykawki. Kolbę wyposażono w mieszadło mechaniczne, wkraplacz, termometr i wlot dla argonu. Wkraplacz załadowano 100 ml suchego dioksanu i wyposażono w rurkę z chlorkiem wapnia. Aparat ustawiono pod strumieniem argonu. Do dioksanu we wkraplaczu dodano 13,34 g (105,8 mmola, 0,92 równoważnika molowego) floroglucyny w strumieniu argonu. Mechanicznie mieszaną kolbę schłodzono do temperatury 10°C na łaźni lodowej pod argonem. Roztwór floroglucyny w dioksanie wkroplono do mieszanego roztworu dietylocynku w dioksanie w przeciągu ponad 30 minut, utrzymuj ąc w tym czasie temperaturę pomiędzy 10-14°C. W trakcie dodawania roztworu floroglucyny zaobserwowano jednoczesne wydzielanie się gazowego etanu i wytrącanie osadu. Po zakończeniu dodawania, usunięto łaźnię chłodzącą i mieszaninę mieszano przez dodatkowe 30 minut, pozwalając jednocześnie na ogrzanie się do temperatury pokojowej. Mieszaninę heterogeniczną przeniesiono następnie do autoklawu (1 litrowy autoklaw BN2) utrzymując atmosferę argonu. Autoklaw załadowano 40 g (0,9 mola) dwutlenku węgla i ogrzewano w temperaturze 125°C przez 1 godzinę w warunkach mieszania w celu wstępnego traktowania katalizatora dwutlenkiem węgla.

2. Polimeryzacja

Autoklaw z wstępnie traktowanym katalizatorem schłodzono do temperatury pokojowej i załadowano dodatkowymi 560 g (12,7 mola) dwutlenku węgla. Wówczas do mieszaniny mieszanej w autoklawie dodano 132 g (3 mole) tlenku etylenu (99,8%) przez powolną iniekcję w przeciągu 1 godziny. Po zakończeniu dodawania tlenku etylenu autoklaw mieszano w temperaturze 21°C przez 260 godzin.

3. Przerób

Ciśnienie w autoklawie uwolniono powoli do ciśnienia atmosferycznego. Produkt rozprowadzono w sumie 4 litrami dichlorometanu, dodano 1035 ml 0,4 m roztworu HCl i mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Fazy rozdzielono i warstwę organiczną przemyto dwukrotnie 1,5 litra 0,5 m HCl i dwukrotnie 2 litrami wody. Roztwór dichlorometanowy następnie osuszono na 120 g siarczanu sodu i zatężono do końcowej objętości około 1 litr. Produkt wytrącono przez powolne dodanie tego roztworu do 3 litrów metanolu. Wytrącony osad suszono przez 16 godzin in vacuo w temperaturze 40°C otrzymując surowy polimer, który dalej oczyszczano następująco:

182 569 nownie w dichlorometanie, ponownie wytrącono z metanolu i suszono przez 16 godzin in vacuo w temperaturze 40°C otrzymując odpowiadający poli(węglan etylenu).

Własności fizyczne produktu:

Mw = 258000 Da, Mn = 35600 Da, Tg = 15,4°C.

IR: Silne absorpcje przy 1751 i 1225 c-1.

Zgodnie z 1H-NMR produkt miał zawartość węglanu etylenu około 96%.

Przykład 13. Doświadczalne postępowanie w celu syntezy poli(węglanu etylenu) z katalizatorem sporządzonym z dietylocynku i acetonu

132 g (3 mole) tlenku etylenu kopolimeryzowano z 600 g (13,6 mola) CO₂ w temperaturze 50°C w przeciągu 96 godzin stosując katalizator sporządzony z 8,43 g (145,16 mmola) acetonu

19,62 g (159 mmoli) dietylocynku.

Wytwarzanie katalizatora jak również polimeryzację przeprowadzono podobnie do postępowania opisanego w przykładach 7-11, z tym wyjątkiem, że do sporządzenia katalizatora stosowano aceton zamiast diolu.

Tak otrzymany poli(węglan etylenu) miał zawartość węglanu 93% i następujące własności: Mw = 233 kDa, Mn=109kDa, Mw/Mn = 2,14, Tg = 22,4°C.

Przykład 14: Synteza poli(węglanu etylenu) stearoilowanego przy grupie końcowej g poli(węglanu etylenu) (mającego Mw = 153000 Da, Mn=68900 Da, Tg = 29,1 °C) rozpuszczono w 30 ml suchego dichlorometanu. Roztwór zadano kolejno 0,98 g (12,38 mmola) pirydyny i 10 g (33,0 mmola) chlorku steroilu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin, następnie rozcieńczono 50 ml dichlorometanu i przemyto kolejno x 150 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i wodą. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i produkt wytrącono przez wkroplenie roztworu dichlorometanowego do 300 ml n-heksanu. Tak otrzymany surowy produkt oczyszczano dalej przez rozpuszczenie w dichlorometanie i wytrącenie z 3 krotnej objętości eteru etylowego. W końcu, produkt suszono in vacuo w temperaturze 40°C przez 16 godzin otrzymując poli(węglan etylenu) stearylowany przy grupach końcowych.

Mw= 144000 Da, Mn = 71000 Da, Tg = 25,6°C.

Przykład 15: Synteza poli(węglanu etylenu) acetylowanego przy grupach końcowych g poli(węglanu etylenu) (mającego Mw = 153000 Da , Mn = 68900 Da, Tg = 29,1°C) rozpuszczono w 10 ml suchego dichlorometanu. Dodano 0,98 g (12,38 mmola) pirydyny a następnie dodano 10,08 g (98,7 mmola) bezwodnika octowego. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 120 godzin. Wówczas rozcieńczono 50 ml dichlorometanu i przelano powoli do 200 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Mieszaninę mieszano przez 30 minut, po czym rozdzielono warstwy. Warstwę organiczną ponownie przemyto 150 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i w końcu wodą. Roztwór dichlorometanowy osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i produkt wytrącono przez wkroplenie tego roztworu do 300 ml eteru etylowego. Wytrącony osad rozpuszczono ponownie w dichlorometanie i ponownie wytrącono z eteru etylowego. Produkt suszono przez 16 godzin w temperaturze 40°C in vacuo otrzymując poli(węglan etylenu) z terminalnymi grupami estru octanowego.

Mw = 150000 Da, Mn = 69100 Da, Tg = 26,8°C.

Przykład 16. Oczyszczanie poli (węglanu etylenu) przez traktowanie gotującą wodą gpoli(węglanu etylenu) (przykład 8 mającego Mw = 328000 Da, Mn = 149000 Da, Tg = 16,4°C) pocięto na małe kawałki i mieszano w 50 ml wrzącej, dwukrotnie destylowanej wody przez 2 godziny. Wodę usunięto i zastąpiono świeżą wodą, ponownie ogrzano do temperatury wrzenia. Po dodatkowych 3 godzinach, kawałki polimeru wyodrębniono i osuszono in vacuo w temperaturze 40°C w ciągu 16 godzin. Otrzymany produkt miał następujące własności fizyczne: Mw = 340000 Da, Mn = 148000 Da, Tg = 28,3°C. Tak więc, zaobserwowano poważny wzrost temperatury zeszklenia, którego nie dało się przypisać zmianie ciężaru cząsteczkowego polimeru.

182 569

Przykład 17. Kompozycja (mikrocząsteczki) z 1 % zawartością leku hIL-3

1. Sporządzenie leku zawierającego mikrocząsteczki g poli(węglanu etylenu), Mw = 328000 z przykładu 8 (PEC) rozpuszczono w 10 ml chlorku etylenu podczas mieszania, po czym dodano 12,1 mg ludzkiej interleukiny 3 (hIL-3) rozpuszczonej w 0,6 ml wody. Mieszaninę intensywnie mieszano zapomocąUltra-Turrax przez 1 minutę przy szybkości 20.000 obr./minutę (= wewnętrzna faza W/O). 1 g żelatyny A rozpuszczono w 2000 ml wody dejonizowanej w temperaturze 50°C i roztwór ochłodzono do temperatury 20°C (= zewnętrzna faza W). Fazę W/O i fazę W intensywnie mieszano. Tym sposobem wewnętrzna faza W/O została homogenicznie zdyspergowana w zewnętrznej fazie W do drobnych kropelek. Otrzymaną potrójną emulsję powoli mieszano przez 1 godzinę. Tą drogą odparowano chlorek metylenu i wytworzono mikrocząsteczki z kropelek wewnętrznej fazy i utwardzono.

Po osadzeniu się mikrocząsteczek warstwę supernatantu odessano i cząsteczki odebrano przez filtrację próżniową lub odwirowanie i przemyto wodą w celu wyeliminowania żelatyny. W końcu, mikrocząsteczki były bądź liofilizowane przy użyciu mannitolu jako środka zwiększającego masę bądź suszone w suszarce próżniowej (preparaty wolne od mannitolu) przez 72 godziny i przesiane (0,125 mm wielkość oczek) otrzymując produkt końcowy.

2. Preparaty placebo

1g PEC Mw = 328000 z przykładu 8 rozpuszczono w 10 ml chlorku metylenu podczas mieszania (wewnętrzna faza O). 1 g żelatyny A rozpuszczono w 2000 ml dejonizowanej wody w temperaturze 50°C i roztwór schłodzono do temperatury 20°C (= zewnętrzna faza W). Fazy O i W intensywnie mieszano. Tym sposobem fazę O homogenicznie zdysprgowano do drobnych cząsteczek w zewnętrznej fazie W. Otrzymaną emulsję powoli mieszano przez 1 godzinę i traktowano w sposób opisany powyżej.

Przykłady 18 -26

Wszystkie preparaty galenowe opisane poniżej sporządzono z zastosowaniem PEC /syntezowanego według przykładu 8 w tabeli 3 i dalej oczyszczano w sposób podobny do opisanego w przykładzie 16. Wszystkie z nich miały Mw 300000 do 450000, zawartość węglanu etylenu wyższą niż 94% i Tg w zakresie 18 do 50°C.

Przykład 18: Kompozycja (mikrocząsteczki) o zawartości 0,2% hIL-2

2,9 mg ludzkiej interleukiny 2 (hIL-2) rozpuszczono w 1,5 ml wody i sporządzono mikrocząsteczki zawierające IL-2 jak opisano w przykładzie 17. Mikrocząsteczki liofilizowano przy użyciu mannitolu jako środka zwieszającego masę i przesiano (0,125 mm wielkość oczek) otrzymując końcowy produkt.

Przykład 19: Kompozycja (mikrocząsteczki) o zawartości 0,2% hIL-2 (wolna od wody)

Preparat sporządzono jak opisano w przykładzie 18, jednak 2,9 mg ludzkiej interleukiny 2 zdyspergowano w fazie organicznej (PEC rozpuszczony w chlorku metylenu).

Przykład 20: Kompozycja (implanty) o zawartości 0,8% hIL-3

1. Formowanie przez prasowanie mg mikrocząsteczek składających się w 100% (wag/wag) poli(węglanu etylenu) (placebo), 99% (wag/wag poli(węglanu etylenu) i 1% (wag/wag ludzkiej interleukiny^ lub 79,2% (wag/wag) poliwęglanu etylenu), 20% (wag/wag) mannitolu i 0,8% (wag/wag) ludzkiej interleukiny-3 sprasowano w formie przez 3 minuty w temperaturze 60-70°C i 160 · 10⁵Pa do implantów (tabletek) o średnicy 5 mm. Tabletki przechowywano w temperaturze 4° w zamkniętych fiolkach szklanych, aż do użycia w próbach uwalniania leku in vitro i in vivo.

2. Próba uwalniania leku in vitro

Po trzy tabletki z każdego: wolnej od mannitolu i zawierającej mannitol ludzkiej interleukiny-3 oraz preparat placebo wytrząsano w temperaturze 37°C w syntetycznym środowisku hodowlanym zawierającym 2,5% (wag/wag) kwasu N-^-hydroksy^ylo^piperazyno-N'-(2-rtanosulfonowego) (1 m), 10% (wag/wag) cielęcej surowicy płodowej i 2% (wag/wag) roztworu penicyliny/streptomycyny. Próbki odciągano po 0,5,1,2, 5 godzinach i 1,2, 3, 7,14, 20 dniach i następnie środowisko odnawiano. Zawartość ludzkiej interleukiny^ w próbkach mierzono za pomocą ELISA.

182 569

3. Próba uwalniania leku in vivo

Samce szczurów trzymane w optymalnych warunkach, uśpiono przez inhalację narkotyku i każdemu szczurowi wszczepiono 1 tabletkę preparatów ludzkiej interleukiny-3 w podskórną skórzanątorebkę. Po 1,4,7,14,21 dniach szczury zabito przez przedawkowanie narkotyku w inhalacji. Pozostałość tabletek pobrano, uwolniono od przylegającej tkanki i wysuszono. Utratę masy tabletki oznaczano grawimetrycznie. Następnie oznaczono zawartość ludzkiej interleukiny-3 pozostałą w tabletkach za pomocą HPLC i ELISA.

Przykład 21

Kompozycja (mikrocząsteczki w/o/w) o zawartości 0,0002% - 2% hIL-2 g PEC rozpuszczono w 80 ml chlorku metylenu z pomocą mieszania magnetycznego. Do roztworu tego dodano odpowiedmąilość IL-2 (113,2 mg dla 2%, 11,32 mg dla 0,2% itd.) rozpuszczonej w 6 ml wody destylowanej z dodanymi kilkoma kroplami etanolu. Mieszaninę intensywnie mieszano przy użyciu Ultra-Turax do zdyspergowania roztworu IL-2 w fazie polimeru (= wewnętrzna faza W/O). 1 g żelatyny A rozpuszczono w 200 ml 1/15 m buforu fosforanowego (pH 7,4) w temperaturze 50°C i roztwór schłodzono do temperatury 20°C (= zewnętrzna faza W). Fazy W/O i W intensywnie mieszano. Tym sposobem wewnętrzną fazę W/O rozdzielono na małe kropelki, które zostały zdyspergowane homogenicznie w zewnętrznej fazie W. Otrzymaną potrójną emulsję powoli mieszano przez 1 godzinę. Tą drogą odparowano chlorek metylenu i mikrocząsteczki utwardzano z kropelek w fazie wewnętrznej.

Po sedymentacji (lub odwirowaniu) mikrocząsteczek supernatant odessano i mikrocząsteczki odzyskano drogą filtracji próżniowej i przemyto wodą w celu wyeliminowania żelatyny. W końcu, wysuszono mikrocząsteczki w suszarce próżniowej w przeciągu 24 godzin i przesiano otrzymując produkt finalny.

Skuteczność zakapsułkowania, badana za pomocą HPLC i próby biologicznej wyniosła 10 do 100%.

Przykład 22

Kompozycja (mikrocząsteczki (s/o/w) o zawartości 0,0002% do 2% IL-2

Preparaty sporządzone tak j ak opisano w przykładzie 21, z tym wyj ątkiem, że IL-2 nie był rozpuszczony w wodzie. Poza rozpuszczeniem IL-2 lek zdyspergowano bezpośrednio do fazy polimeru (= faza O). Skuteczność zakapsułkowania, badana za pomocą HPLC i próby biologicznej wyniosła pomiędzy 10 a 100%.

Uwaga: Ilość polimeru, chlorku metylenu, wody i leku była różna w szerokim zakresie bez zmiany jakości produktu. Otrzymano wyższą zawartość leku, aż do 20%. W fazie zewnętrznej żelatynę zastąpiono emulgatorami takimi jak poli(alkohol winylowy) itd., i/lub zmieniono stężenie emulgator/bufor. Opisane procedury oddzielania i suszenia zastąpiono innymi dobrze znanymi technikami farmaceutycznymi, takim jak filtracja, liofilizacja i suszenie rozpyłowe.

Przykład 23

Kompozycja (mikrocząsteczki w/o/w i s/o/w) o zawartości 1% hGM-CSF

Wytwarzanie prowadzono sposobem według opisanego w przykładach 21 i 22. Takjak opisano tam sporządzono preparaty S/O/W i W/O/W. Jednak skuteczność zakapsułkowania preparatów W/O/W wyniosła 60%, podczas gdy preparatów S/O/W wykazała niższe skuteczności kapsułkowania.

Przykład 24

Kompozycja (mikrocząsteczki w/o/w i s/o/w) mające 1 do 10% zawartości pamonianu oktreotydu (SMS-PA)

Wytwarzanie prowadzono sposobem według opisanego w przykładach 19 i 20. Jednak SMS-PA nie jest rozpuszczalne w wodzie. Tak więc, lek zdyspergowano a nie rozpuszczono w wodzie w celu otrzymania preparatów W/O/W. Skuteczność zakapsułkowania oznaczona za pomocą HPLC wyniosła pomiędzy 20 a 100%.

182 569

Przykład 25

Kompozycja (mikrocząsteczki w/o/w i s/o/w) o zawartości 1 do 10% octanu oktreotydu

Wytwarzanie prowadzono zgodnie ze sposobem opisanym w przykładach 21 i 22. Skuteczność kapsułkowania oznaczono zapomocąHPLC i wynosiła pomiędzy 2 a 40%, co jest wyraźnie niższe od lipofilowego SMS-PA.

Wyższe wartości otrzymano w preparatach S/O/W po zastosowaniu liofilizowanego materiału związku aktywnego (mniejsze cząsteczki leku).

Przykład 26

Uwalnianie pamonianu oktreotydu (SMS-PA) z mikrocząsteczek u królika i implanty u królika i szczura

Podskórną implantację krążków poli(węglanu etylenu) lub iniekcję mikrocząsteczek poliwęglanu etylenu) (przy zawartości leku 1,95%) w ilości około 2 mg substancji leczącej/kg wagi ciała przeprowadzono na królikach (mieszańce czinczila o wadze ciała około 3 kg) i podskórną implantację krążków na samcach szczura (Wistar, waga ciała około 375 g ). Podano na szczura i królika ilości około 40 odpowiednio 300 mg polimeru zawierającego lek w postaci mikrocząsteczek odpowiednio sprasowanych do implantu lub jako zawiesinę.

Krążki implantów dla szczurów i królików miały średnicę 0,5 i 1 cm odpowiednio i były wytworzone jak opisano w przykładzie 20.

Dla oznaczenia uwalniania leku, próbki krwi pobierano dnia 14 i 21 u szczurów i królików odpowiednio i pozostałość leku mierzono w implantach za pomocą testu radioimmunologicznego i HPLC.

Można było stwierdzić liniowa korelację utraty masy poli(węglanu etylenu) i uwalniania SMS-PA (fig. 13) jak pokazano dlahIL-3 o wysokiej masie cząsteczkowej (fig. 11). Maksymalnie 75% implantowanego materiału uległo degradacji po 3 tygodniach po podaniu u królików, maksymalnie 95% implantowanego materiału uległo degradacji po 2 tygodniach u szczurów. Reakcja zapalna (włączając inwazję leukocytów o różnokształtnych jądrach komórkowych i innych komórek) jest wstępnym warunkiem biodegradacji poli(węglanu etylenu). Można oczekiwać, że przebieg reakcji zapalenia może być swoisty dla danego gatunku dając swoisty dla gatunku profil wzrostu poziomów w osoczu. Stwierdzono to dla SMS-PA (fig. 12). U szczurów biodegradacja poli(węglanu etylenu) jest znacznie szybsza niż u królików U królików, poziomy SMS-PA w plazmie zwiększają się powoli do osiągnięcia fazy stałego uwalniania około 9 dnia, trwającego co najmniej do dnia 21.

Przykład 27

Kompozycja (mikrocząsteczki (w/o/w) o zawartości 0,0002% do 2% rhIL-6 g pEc rozpuszczono w 80 ml chlorku metylenu z pomocąmieszadła magnetycznego. Do tego roztworu dodano odpowiednią ilość rhIL-6 (113,2 mg dla 2% itd.) rozpuszczonej w 6 ml wody destylowanej lub wody z kilkoma kroplami etanolu. Mieszaninę intensywnie mieszano za pomocą Ultra-Turax w celu zdyspergowania roztworu IL-6 w fazie polimeru (= wewnętrzna faza W/O). 1 g żelatyny A rozpuszczono w 200 ml 1/15 m buforu fosforanowego (pH 7,4) w temperaturze 50°C i roztwór schłodzono do temperatury 20°C (= zewnętrzna faza W). Fazy W/O i W intensywnie mieszano. Tym sposobem wewnętrzna faza W/O ulega rozbiciu na małe kropelki, które uległy zdyspergowaniu homogenicznemu w zewnętrznej fazie W. Otrzymaną potrójną emulsję powoli mieszano przez 1 godzinę, odparowano chlorek metylenu i mikrocząsteczki stwardniały z kropelek fazy wewnętrznej.

Po sedymentacji (lub odwirowaniu) mikrocząsteczek, supernatant odessano i mikrocząsteczki odebrano przez filtrację próżniowąi przemyto wodąw celu wyeliminowania żelatyny. W końcu, mikrocząsteczki wysuszono w suszarce próżniowej w przeciągu 24 godzin i przesiano otrzymując produkt.

Skuteczność zakapsułkowania oznaczona za pomocą HPLC i próby biologicznej, wyniosła pomiędzy 10 a 100%.

182 569

Przykład 28

Kompozycja (mikrocząsteczki s/o/w) o zawartości 0,0002% - 2% rhIL-6

Preparaty sporządzono tak jak opisano w przykładzie 27, z tym wyjątkiem, że IL-6 nie rozpuszczono w wodzie. Zamiast rozpuszczania IL-6, lek zdyspergowano bezpośrednio w fazie polimeru (= faza O). Skuteczność kapsułkowania oznaczona za pomocąHPLC i próby biologicznej wyniosła pomiędzy 10 a 100% . Uwaga: Ilość polimeru, chlorku metylenu, wody i leku różni się w szerokim zakresie bez zmiany jakości produktu. Otrzymano wyższe zawartości leku, aż do 20%. W fazie zewnętrznej żelatynę zastąpiono innym emulgatorem takim jak poli(alkohol winylowy) itd., i/lub zmieniono stężenie emulgatora/bufora. Opisane procedury oddzielania i suszenia zastąpiono dobrze znanymi technikami farmaceutycznymi takimi jak filtracja, liofilizacja i suszenie rozpyłowe.

Przykłady 29-31

Zastosowanie IL-6 do leczenia stanów, w których pośredniczy TNFa i/lub IL-1

Przykład 29

Zwierzęcy model stwardnienia rozsianego: przewlekle powracające, doświadczalnie wywołane uczuleniowe zapalenie mózgu i rdzenia na modelu szczura Lewisa (CR-EAE).

Eksperymentalnie wywołane uczuleniowe zapalenie mózgu i rdzenia (EAER) u szczura jest dobrze przebadanym doświadczalnym modelem dla stwardnienia rozsianego u ludzi. Paterson, ADV. IMMUNOL. 5 (1966) 131-208; Levine i wsp. AM. J. PATH. 47 (1965) 61; McFarlin i wsp. J.IMMUNOL. 113 (1974) 712; Borel, TRANSPLANT & CLIN. IMMUNOL. 13 (1981) 3], Szczurom wstrzyknięto tkankę nerwową z innego gatunku wraz z substancjami pomocniczymi i uzyskana reakcja alergiczna prowadzi do uszkodzeń nerwów szczura, które naśladują uszkodzenia autoimmunologiczne tworzone w stwardnieniu rozsianym. Szczury stały się częściowo lub całkowicie sparaliżowane i poważny stan choroby mierzono z i bez podawania leków testowych. Wiele leków, takich jak sterydy i leki immunosupresyjne są aktywne przy spowolnianiu początku choroby ale nie były w stanie zapobiec nawrotowi już ustalonej choroby.

Przewlekłe nawroty doświadczalnie wywołanego uczuleniowego zapalenia mózgu i rdzenia (CR-EAE) na modelu [Feurer i wsp. J. NeUROIMMUNOL; 10 (1985) 159-166] są zatem uważane za szczególnie wymagający model, który ściśle naśladuje rzeczywiste trudności w leczeniu pacjentów, którzy mają ustaloną chorobę stwardnienia rozsianego. W tym modelu, choroba jest wywołana przez iniekcję mieszaniny rdzenia kręgowego świnki morskiej i kompletnego adjuwanta Freunda wzbogaconych Mycobacterium tuberculosis. Zwykle 75-80% uczulonych szczurów rozwinęło CR-EAE wykazujące 2-3 nawrotów klinicznych w ciągu pierwszych 40 dni. Po 60-80 dniach, około 50% szczurów z CR-EAER miało dalsze nawroty, po których nastąpiło całkowite wyleczenie w tylko 35% przypadków. Pozostałe 65% tych zwierząt wykazywało postępujący stan choroby. Leczenie lekiem rozpoczęto 16 dnia, po wyzdrowieniu po pierwszym nawrocie choroby.

Rekombinant ludzkiej interleukiny 6 (rh IL-6, Sandoz) rozpuszczony w roztworze solanki wstrzykiwano i.p. co drugi dzień rozpoczynając dnia 16 stosując 10 pg IL-6 na szczura (około 50 pg/kg). Zwierzęta kontrolne i zwierzęta w grupie pobierającej IL-6 miały zwyczajny stan poważny choroby (ostry) w dniu 11 -14. W skali ostrości 0 = brak choroby do 4 = całkowity paraliż zwierzęcia, przeciętna grupy kontrolnej wynosiła 3,0 a przeciętna grupy IL-6 wynosiła 3,2. Stosowanie IL-6 co drugi dzień począwszy od dnia 16 do dnia 30 (w sumie 7 stosowań) dało prawie całkowite wstrzymanie choroby. Tylko jeden z 5 szczurów traktowanych IL-6 wykazał lekki drugi nawrót choroby (ostrość 0,4). Pięć z 5 zwierząt kontrolnych miało drugi nawrót choroby ze średnią ostrości wynoszącą 1,8 po 16 dniach i trzeci atak choroby w dniach 22-29. W grupie traktowanej IL-6 nie zaobserwowano dalszych nawrotów choroby.

Przykład 30

Model zwierzęcy dla zapalenia stawów: zapalenie stawów wywołane Borrelia w ciężkim kombinowanym braku odporności (SCID) u myszy

Zapalenie stawów Lyme'a (lub choroba Lyme'a zapalenia stawów) przedstawia unikalną postać przewlekłego zapalenia stawów, ponieważ początek jej jest znany z pewnością. Choroba

182 569 ma jedną z wyróżniających cech wywołanych zakażeniem przez kleszcza krętkiem Borrelia burgdorferi. Charakterystyczne uszkodzenia maziówkowe u pacjentów z zapaleniem stawów Lyme a ściśle przypominąjąuszkodzenia maziówkowe pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów. W obu grupach pacjentów można zaobserwować przerost komórek wyściółki maziówkowej, rozrost komórek maziówkowych, rozrost naczyniowy i infiltrację komórek jednojądrzastych w obszarach wyściółki podmaziówkowej. Stwierdzono wiele komórek osocza krwi, wysoce śródbłonkowe żyłki, rozrzucone makrofagi i kilka komórek dendrytowych z intensywną prezentacjąantygenu MHC klasy II. Ponadto, w płynie maziówkowym od pacjentów z różnymi wysypkami skórnymi w gośćcu wykryto cytokiny takie jak IL-1, IL-6 i TNFa sugerując, że te cytokiny mogąprzyczyniać się do patogenezy destrukcji stawów. Ostatnio, dla zapalenia stawów Lyme’a opracowano model mysi w myszach SCID, które mająbrak funkcjonalnych komórek T i B (M.M. Simon i wsp. (1991) Immunology Today 12:11). Zainfekowanie myszy, z brakiem odporności, przez Borrelia burgdorferi prowadzi do znacznego i trwałego oligoartretyzmu. Zapalenie stawów wywołane przez Borrelia u myszy SCID reaguje na kortykosteroidy (prednisolon 30 mg/kg sc), ale nie na środki innunosuprcsyine takie jak SIM (cyklosporyna A), do dawek 30 mg/kg sc. Uważane jest to za dobry model dla zapalenia stawów kierowanego cytokinami, łącznie z innymi typami artretyzmu, dla których początkowe przyczyny nie są znane z całą pewnością.

Sześciotygodniowe myszy C.B-17 SCID (homozygotyczne dla mutacji SCID, otrzymane z Bomholtgard, Dania, 5-6 zwierząt na grupę) zaszczepiono 100 mio. organizmami Borrelia burgdorferi drogąiniekcji sc u podstawy ogona. Wydolne immunologicznie myszy C.B-17 (z tego samego źródła) służyły za zwierzęta kontrolne. Nie rozwinęła się u nich żadna choroba po zaszczepieniu Borrelia burgdorferi. Rekombinant ludzkiej IL-6 (rhIL-6, Sandoz, roztwór podstawowy 5 mg/ml) rozcieńczono soląfizjologioczną i podawano 5 razy w tygodniu w sumie 17 iniekcji w dawce 10 pg/mysz i.p. Myszy monitorowano codziennie na ślepo w celu ustalenia klinicznych oznak zapalenia stawów w stawach piszczelowo-stępowych i łokciowo-nadgarstkowych.

Kliniczne zapalenie stawów oceniano według następujących parametrów:

- brak oznak ? oznaki niepewne (+) zaczerwienienie stawów + lekkie spuchnięcie ++ umiarkowane spuchnięcie +++ silne spuchnięcie stawów piszczelowo-stępowych i łokciowo-nadgarstkowych

W szczytowym punkcie klinicznego zapalenia stawów, myszy uśmiercano i stawy utrwalano w roztworze Schaffera, zatapiano w plastyku 9100 i barwiono eozyną hematoksylinową.

Grupa	Oznaki kliniczne (liczba spuchniętych stawów/suma)
dni 13	14	15	16	17	18
Kontrola	0/30	0/30	0/30	0/30	0/30	0/30
SCID, nr IL-6	6,5/36	12, 5/36	15/36	21/36	30/36	35/36
% wag. zapalenia	18%	35%	42%	58%	83%	97%
SCID, IL-6 traktowane	4/30	3,5/30	11/30	7,5/30	12/30	10,5/30
% wag. zapalenia	13%	12%	37%	25%	40%	35%

U myszy SCID, które nie były traktowane IL-6 rozwinęło się silne zapalenie stawów spowodowane infekcją Borrelia burgdorferi począwszy od dnia 13 po iniekcji antygenu. Mała dawka rh IL-6 redukuje ostrość zapalenia stawów przeciętnie o 60-75% we wszystkich zwierzętach dotkniętych chorobą.

182 569

Przykład 31

Model mysi dla wstrząsu septyczwego

Zdecydowano przebadać wpływy IL-6 na mysim modelu wstrząsu eadotoksycznugo przy użyciu myszy uczulonej d-galaktozoaminą, poaiuważ just to szeroko stosowane jako model dla septyczwugo wstrząsu u człowieka. Naszu metody i wyniki były następujące:

Samicu myszy OF1 o wadzu 18-22 g, sprowokowano poprzez iniekcję 0,2 ml i.p. roztworu PBS zawierającego 0,15 mg/kg eadotoksynr lipopolisacharydowej (LPS) i 500 mg/kg d-galaktozoamiay. Myszy podzielono na grupy po 10 myszy w każdej grupie i traktowano następująco:

Ekspurymuat 1
Czas Grupa 1: Grupa 2: Grupa 3: Grupa 4:	11:00 PBS IL-6 (50 pg) PBS PBS	14:00 LPS + d-GAL LPS + d-GAL LPS + d-GAL + IL-6 (50 pg) LPS + d-GAL	16:00 PBS PBS PBS IL-5 (50 pg)
Eksperyment 2
Czas	11:00	14:00	16:00
Grupa 1:	PBS	LPS + d-GAL	PBS
Grupa 2:	IL-6 (50 pg)	LPS + d-GAL	PBS
Grupa 3:	PBS	LPS + d-GAL + IL-6 (100 pg)	PBS
Grupa 4:	PBS	LPS + d-GAL + IL-6 (20 pg)	PBS
Grupa 5:	PBS	LPS + d-GAL + IL-6 (5 pg)	PBS
Grupa 6:	PBS	LPS + d-GAL + IL-6 (0,8 pg)	PBS
Grupa 7:	PBS	LPS + d-GAL + IL-2 (100 pg)	PBS
Grupa 8:	PBS	LPS + d-GAL + IL-4 (50 pg)	PBS
Grupa 9:	PBS	LPS + d-GAl	IL-6 (50 pg)

rhIL-6 (ILS 969, Sawdoz), rhIL-2 (Sawdoz) i rhIL-4 (Sandoz) rozcieńczono w PBS. Wszystkie iaiukcje (o objętości 0,2 mml) podano dootrzewnowo. W grupiu 3 (eksperyment 1) i grupach 3 do 8 (ukspurrmuat 2) IL-6 i IL-2 były rozcieńczone do roztworu LPS/d-GAL tak, żu myszy otrzymały pojedyaczą0,2 ml iniekcję. Liczba w nawiasiu wskazuj- dawkę inturleukiny podanej każdej myszy. Wymagane było wielokrotnu dawkowaniu PBS w culu kontroli umiewaości między grupami w wyniku reakcji wywołanych stresem z uwagi na różne czasy przed lub po próbie LPS.

Myszy, które przeżyły obserwowano przez 48 godzin. Dla obliczeń statystycznych stosowaliśmy tust Chi kwadrat. Jak pokazano na fig. 1, po 24 godzinach od próby LPS, 9 z 10 myszy kontrolnych zdechło. Traktowaniu IL-6 3 godziny przud iniekcją LPS lub 2 godziny po iriukcji LPS, zredukowało śmiertelność odpowiudnio do 60% (p=0,12) i 70% (p=0,26). Z drugiej strony, IL=6 podane w czasiu podawania LPS zredukowało śmiurtulaość grupy do 10% (< 0,01). Działaniu ochioaAu było długotrwałe, ponieważ po 48 godzinach śmiertelność w grupiu 3 wzrosła aieunacuaie, tj. do 30%, stalu wykazując wysocu znaczącą ochronę w stosunku do grupy kontrolnej (p <0,01). ŚmiurtelAOŚć grupy 4 przeszła od 70% do 80%, podczas, gdy niu zaobserwowano żadnych zmian w grupie 1 i 2.

W oparciu o tu wyniki, przebadaliśmy działaniu IL-6 w różnych dawkach. Podaliśmy IL-6 w czasiu iniukcji LPS, ponieważ zgodnie z piurwszrm eksperymentem był to czas optymalny. Przebadaliśmy również działaniu IL-3 i IL-4 podanego w czasiu LPS jako drogę wykluczenia -w-wtualnych artefaktów z uwagi na zastosowaniu protein iukombinaatowych w pruparaciu LPS/d-GAL. Przetestowaliśmy rówaiuż czy IL-6 była skuteczna do ochrony myszy od śmiurci undotoksyczwej w dawce 100 pg/mysz podanej przud i po LPS.

Wyniki ukspurymeatu 2 (fig. 2) sąw liaii z wynikami ekspurymuntu 1. Rówaiuż w tym uksperymeaciu traktowanie IL-6 chroniło myszy od śmiurci endotoksycznuj. Gdy IL-6 było dawaau razem z LPS, uzyskana ochrona 24 godziwy po LPS była zależna od dawki przy dawcu 20

182 569 (30% śmiertelności, p=0,03), 4 (50% śmiertelności, p=0,16) i 0,8 (70% śmiertelności, p=0,61) pg/mysz, podczas gdy w dawce 100 pg/mysz (60% śmiertelności, p=33) myszy były chronione mniej skutecznie niż przy 20 pg/mysz. Traktowanie przed i po z dawką 100 pg IL-6/mysz powodowało ochronę porównywalną z zaobserwowaną gdy tę samą dawkę IL-6 podawano razem z LPS. Podobne wyniki przeżycia myszy otrzymano 48 godzin po podaniu LPS.

IL-4 podawane w czasie prowokacji LPS było nieskuteczne dla ochrony myszy przed śmierciąendotoksycznąpodczas, gdy IL-2 zmniejszało przeżycie myszy.

182 569

FIG. 1 fi _4J oj fi _fi

IŁ

4P

o fi.	f*7 II fi
fi7	a
c	4J
o	tn
tn	I
fi 2	+
4P	• M
·—5	s
U	O
fi	OJ
3	u
fi
u	s—
bJD	o
4»
3	4-#
fi	’>
3	fl
>.
N
fi
3
O
b.
fi.
£

c.

£

fi u

a fi .3 tn fi

N

U

W

- ^R

Λ N N fi fi fi g £ ·fi. fi tń 77 3 W 4» m V3 ~ •S2 n Ł· Λ 6JD _C tn O 4> SU fi.

>> ”

Stn 3

O 4) tn

O.-C « ω 07 «2 N £ fi

C>> £ n ~ 3 CZ) V

4» fi N fi ⁵⁵

S ^N fi s« N aj tn fi 4) o

a.

£?

fi <j

O tn

O

N

O fi.

182 569

FIG. 2 u

α

Λ

O £ ¹¹ £ fi 3

-a S ϊ % s

ju £*

4>

.2 e

xs u

Um

fi	SZ)
fi
ω co
<u	ca
	a.
3
a	ź
	o
ź o	3 «5 4.
3 JS	<2 C/l
a	«2
ε	W
”--	-i
.ω	c
’S _aj	o
5	cn
N
U
4*
CU

e

Ό

O' «

X

C

Cn

N <Z3 ca

CU <5

Δ

O a

>.

c

Ό

1P

Έί)

N £

182 569

FIG. 3

182 569

FIG. 4

182 569

FIG. 5

182 569

FIG. 6

182 569

FIG. 7

Wpływ środka usuwającego rodnik nadtlenkowy na degradację masową poliwęglanu etylenu) 14 dni po podskórnym zastosowaniu u szczurów (średnio +/- sem; n=3)

poli(weglan etylenu) + 10% menadionu poli(weglan etylenu) + 10% witaminy C

182 569

FIG. 8

182 569

U

P

Cm

FIG. 9 s

aj £

ω

S _3

M aj “3 a

N o

k.

k. — >

.fi m

P

MM

J3 .aj e

a

N U N <z)

O.

N O U O V) £

O TJ o *“ Z <u &< .=> CZ 3 w S- P •S“ m N » <*>

II s

ε aj </5 +

.c

TJ aj

P

MM

P .N *3

-Ξ CS CS *S?

> fi* p S

o (Z o

OJ .2

Έ £

C/5

N aj

ŁC

O

P

O

MM

Hi g 2 s b e fi so 3 j' 3 g O fi ^H C4 ^C 2 N g

P <? p 3 p © JS

2 O -fi

U U U Ρ Ρ P POP β c & CS CS CS Q« & G* ε ε ε <i o f*5 .o Ρ mm aj fi 3

U s

fi £ p P Ć2aj

182 569

FIG. 10

182 569 u 3 « s:

's' <*i S j £3 «> «5 .Η « fi — II « § c

53d ee χχ* ω fi £ fe © ® 3 i a ³ + >> « .2 s -1

S ³ © ^‘3 £ “ «5 .2, c © «β .2 a © — ·— « o £ fi

>>

(Z!

ε '37 £

o er

N ©

o a

U ω

cl >>

c/3 ε

w

Ł.

_3

O w

'fi fi ε

J3 «*?

I

LC .© .2 'S β

© ·(<

fi fi ε

o

N rn

I

J ίΛ

Cg ε

o ϋ ϋ 3

W taj 3 CL CL '5 £* £» ~ a β 2

Cg Cg fi α 5 ε g -a o <1 <*ł

I

J *·< .3 _© 'fi .2 £

£ e

182 569

Ό fi

ί.

FIG. 12 fc fi ·- en 3 II N C CJ

N -~ (Λ a <

cu i

<U

CO +

£•3 i3 J.

N so CJ ' O co

O >, a

.o

N o

CU lA «—I

esj

CJ

O co

O cj ee a

_2

a.

S

M c/5

Λ

S u

I I I

I I I ♦ <1 o

I I I

I I I

UD a < 3 fi o N £ fi co

182 569

FIG. 13

c.

§ U

U ·· w S

Cu 3: ' es

I!

£>2

CZ3 £

υ <Z>

cc Słl Γ ii ił

Je₂

ο.'Ο -O ł£

W “

S 3

_. ^N 3 U T? ^N « ^1/3 5 3 4)

U

O

W

</] «5 £

’«?

£ o

u*

Ί-» es'

N u

O a

U cu cu >>

«1 cs u

Usi

JU .2 '£ es

N

U

N <ZI <

CU

I cc cc

IC σ>

es £

2= co £ |

9$

ί.

<

t; °t —I CC :=,2 u cc

-2 s?

ił οχ

O £

U =5 u

CU es W

CU £>

^5 o- 8 £ ^ω '£ £ 3 JS a £ <3 · O

CU
cc 2 tzi
u
3	2
.2	£
Jś	95
es	Ό
£ U3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca polimer ulegający biodegradacji, związek farmaceutycznie czynny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalne środki dodatkowe, znamienna tym, że zawarty w kompozycji polimer obejmuje jednostki węglanu etylenu o wzorze

   -(-C(O)-O-CH2-CH2-O-)przy ilości węglanu etylenu 70 do 100% molowych, ma masę cząsteczkową (Mw) 80 000 do 2 000 000, lepkość istotną 0,4 do 4,0 dl/g mierzoną w chloroformie oraz temperaturę zeszklenia od 15° do 50°C, przy czym związek farmaceutycznie czynny jest cytokiną i jest obecny w kompozycji w ilości od 0,001% do 70% wagowych, farmaceutycznie dopuszczalne środki dodatkowe zawierająpoliole w ilości od 1 % do 90% wagowych, natomiast polimerjest obecny w kompozycji w ilości stanowiącej uzupełnienie do 100% wagowych w stosunku do całej masy kompozycji.

   * * *