SK25496A3 - Polymeric matrices and their uses in pharmaceutical compositions - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich polymérne matrice, predovšetkým matrice obsahujúce IL-6 na liečenie chorôb mediovaných IL-6 alebo/a TNF-α, napríklad chronických zápalových stavov. Ukázalo sa, že tu opísané polyméry podlá vynálezu, predovšetkým poly(etylénkarbonát)ové polyméry, sú vo všeobecnosti použiteľné ako matricové materiály v prostriedkoch s plynulým uvoľňovaním účinnej látky obsahujúcich farmakologicky účinné zlúčeniny a predovšetkým majú novú, neočakávanú a vysoko požadovanú schopnosť nehydrolytickej povrchovej erózie in vivo. Preto sú tu opísané okrem spôsobov prípravy uvedených polymérov a farmaceutických prostriedkov, ktoré tieto polyméry obsahujú, tiež matrice obsahujúce i iné účinné látky. Okrem toho je nové i použitie IL-6 na liečenie stavov mediovaných IL-1 alebo/a TNF-α, pričom toto použitie je neočakávané vzhľadom k tomu, že sa prv predpokladalo, že mnoho takýchto stavov sa prítomnosťou IL-6 naopak aktivuje. Vzhľadom k tomu, vynález poskytuje nové použitie IL-6 pri liečení napríklad chronických patogénom indukovaných zápalových stavov, demyelizačných chorôb a akútnych a hyperakútnych zápalových stavov, akým je napríklad septický šok.

Doterajší stav techniky

I Liečenie chorôb mediovaných IL-1 alebo/a TNF-a

Mnoho spontánne prepukajúcich chronických zápalových stavov má neznámu (azda autoimunitnú) etológiu a predpokladá sa, že tieto stavy sú mediované IL-1 alebo/a TNF-α. Napríklad už celý rad rokov sa pozornosť výskumných ústavov sústreďuje na roztrúsenú sklerózu (MS - multiple sclerosis), čo je degeneratívna nervová porucha charakterizovaná roztrúsením demyelizačnej aktivity v mozgu a mieche. I keď mechanizmus roztrúsenej sklerózy nie je ešte celkom známy, predpokladá sa, že má silnú autoimunitnú zložku, ako to vyplýva napríklad zo zvýšeného výskytu niektorých antigénov HLA u pacientov trpiacich touto chorobou. Ukázalo sa, že bežne dostupné protizápalovo účinné látky, ako napríklad ACTH (adrenokortikotropný hormón) alebo kortikosteroidy, ako napríklad prednisone, síce podporujú zlepšenie zdravotného stavu pacienta v prípade akútneho záchvatu tejto choroby, avšak nepostihujú pôvodnú etiológiu tejto choroby. Dlhodobé podávanie kortikosteroidov alebo imunosupresívnych činidiel naopak zvyšuje riziko vedľajších účinkov. Nedávno sa zistilo, že rekombinantná forma IFN-B krátkodobo znižuje tvorbu mnohých drobných ložísk, avšak nedokázalo sa, že by táto rekombinantná forma pôsobila proti dlhodobej progresii choroby. Vyhodnotenie účinnosti liečenia je v danom prípade veľmi komplikované vzhľadom ku skutočnosti, že prirodzený rozvoj choroby prebieha v periódach spontánnych remisií a chronických recidív. Vo všeobecnosti možno konštatovať, že napriek dlhoročnému intenzívnemu výskumu nebola ešte určená všeobecne prijatá špecifická terapia na liečenie tejto veľmi vážnej choroby.

ostatných chronických zápalových stavoch sa predpokladá, že sú indukované vedľajšími činidlami, napríklad patogénmi. Tak napríklad Lymeova choroba je vážnych chronickým stavom iniciovaným infekciou spirechétou Borrelia burgdorferi, ktorú prenášajú kliešte. Po počiatočnej akútnej fáze charakterizovanej léziami kože a chrípkovými symptómami prechádza táto choroba do chronickej fázy, ktorá sa môže charakterizovať artritickými a chronicky neurologickými anomáliami. Táto choroba sa zvyčajne lieči antibiotikami a nesteroidnými protizápalovými činidlami, avšak až doteraz nebola ešte stanovená optimálna terapia, predovšetkým pre rozvinuté štádium choroby.

Akútne alebo hyperakútne nekontrolovateľné zápalové stavy môžu byť taktiež spôsobené externými činidlami, napríklad prudkými infekčnými faktormi. Napríklad septický šok a predovšetkým respiračný tiesňový syndróm dospelých (ARDS - adult respirátory distress syndróme) je život ohrozujúcim stavom, na ktorý až doteraz neexistuje žiadny účinný spôsob liečenia. Začiatok tejto choroby je je rýchly a úmrtnosť bežne presahuje

%. K septickému šoku dochádza v dôsledku prudkej infekcie a toto ochorenie je typicky charakterizované horúčkou, často nasledovanou hypotermiou v neskorých štádiách choroby, fluktuujúcim krvným tlakom (hyperdynamický syndróm) nasledovaný hypotenziou v neskorých štádiách, metabolickou acidózou, zhoršenou mentálnou funkciou a rozsiahlou orgánovou dysfunkciou, pričom táto choroba napokon v mnohých prípadoch končí smrťou. K septickému šoku najčastejšie dochádza v dôsledku infekcie gram-pozitívnymi baktériami (endotoxický šok), i keď k septickému šoku môže prísť i v dôsledku infekcie gram-pozitívnymi baktériami alebo v dôsledku i iných infekcií. Výraz septický šok by v tu použitom zmysle mal byť interpretovaný ako šokový stav zahrňujúci i ARDS, ku ktorému dochádza následkom mikrobiálnej infekcie, predovšetkým bakteriálnej infekcie a predovšetkým gram-negatívnej bakteriálnej infekcie.

IL-6 je známym cytokínom. 0 tomto činidle je známe, že sa používa na liečenie rôznych stavov, napríklad trombocytopénie a niektorých druhov rakovín. V tele sa produkuje zvyčajne ako odozva na bakteriálnu infekciu a bol implikovaný pri mediácii zápalu, horúčky a septického šoku. Toto činidlo je potentným imunostimulátorom a je pravdou, že v niektorých publikáciách sa uvádza, že mechanizmy aktivované týmto IL-6 spôsobujú niektoré autoimunitné alebo zápalové choroby, medzi ktoré patrí lupus erythematosis, roztrúsená skleróza a reumatoidná artritída, ako aj septický šok.

Podstata vynálezu

Vzhľadom k vyššie uvedenému je teda prekvapujúcim zistením skutočnosť, že IL-6 sa dá použiť pri liečení chronických zápalových ochorení (iných ako glomerulonefritída) medzi ktoré patrí napríklad roztrúsená skleróza, a pri liečení akútnych a hyperakútnych zápalových stavov, medzi ktoré patrí napríklad septický šok. Mechanizmus tohoto účinku je zatiaľ nejasný, avšak predpokladá sa, bez toho, že by tu bola snaha nadviazať na akúkoľvek špecifickú teóriu, že mechanizmom spätnej väzby môže IL-6 potlačiť alebo inhibovať expresiu, vylučovanie alebo funkciu ostatných cytokínov, predovšetkým činidiel TFN-a4

-receptora alebo/a IL-I, zrejme reguláciou zvýšeného vylučovania rozpustného antagonižujúceho činidla ZNF-a-receptora alebo/a IL-I receptora, čím sa potlačí aktivita rezultujúcich autoimunitnýchj zápalových alebo šokových v podstate mediované uvedenými cytokínmi. charakterizovaných komplexami IL-6 mediovaný stavov, ktoré sú V prípade stavov kômp1ement-aktivujúci antigén-protilátka (IgG), predovšetkým v prípade glo merulonefritídy (ktorá je zvyčajne spôsobená agregáciou takých komplexov v obličke), sa však ukázalo, že v tomto prípade IL-6 skôr podporuje rozvoj tohto stavu.

V rámci tohto vynálezu sa teraz dokázalo, že IL-6 má kuratívny účinok pri zvieracom modeli roztrúsenej sklerózy a Lymeovej artritídy, o ktorých sa predpokladá, že sú predovšetkým indukované. IL-I alebo/a THF-α, avšak aktivizuje glomerulonefritídu u myší s lupus erythematosis, o ktorej sa predpokladá, že je priamo riadená IL-6. Rovnako sa dokázalo, že IL-6 ako taký má kuratívny účinok v rámci modelu endotoxického šoku u myší, kde existuje hypotéza, že táto choroba je v podstate riadená IL-I alebo/a TNF-a.

IL-6 sa takto môže považovať za činidlo, ktoré je použiteľné pre potlačenie alebo inhibíciu expresie, uvoľňovanie alebo funkcie TNF-α alebo/a IL-I a predovšetkým použiteľné pri liečení zápalových stavov iných ako glomerulobefritída a pri liečení septického šoku. Zápalovými stavmi, ktoré sa môžu liečiť použitím IL-6, sú napríklad artritické stavy, predovšetkým patogénom indukované artritické stavy, napríklad Lymeova artritická choroba, bakteriálne indukovaná artritída a polioartritída, roztrúsená skleróza a ďalšie demyelinizačné choroby (t.j. choroby charakterizované demyelinizáciou v nervoch, mozgu alebo/a mieche, vrátane napríklad roztrúsenej sklerózy, akútnej roztrúsenej encefalomyelitídy alebo poinfekčnej encefalitídy, tinitu, difúznej cerebrálnej sklerózy, Schilderovej choroby, adenoleukodystrofie, terciárnej Lymeovej choroby, tropickej spazmatickej parapoezie a ostatných chorôb, pri ktorých je prevažujúcim symptómom demyelinizácia, predovšetkým autoimunitne mediovaná demyelinizácia), vážne zápalové stavy, ako popáleniny, septický šok, meningitída a pneumónia, a chronické autoimunitné choroby, medzi ktoré patrí polychondritída, skleredém, Wegenerova granulomatóza, dermatomyositída, chronická aktívna hepatitída, myasténia gravis, psoriáza, psoriatická artritída, Steven-Jongsonov syndróm, idiopatická sprua, autoimuntné zápalové črevné choroby (vrátane napríklad ulceratívnej kolitídy a Crohnovej choroby), endokrinná oftalmopatia, Gravesova choroba, sarkoidóza, primárna biliárna cirhóza, juvenilná diabetes (diabetes mellitus, typ I), uveitída (anteriórna i postarteriórna), keratokonjuktivitis sicca a vernálna keratokonjuktivitída a intersticiálna pľúcna fibróza.

Vynález poskytuje:

i) spôsob inhibície expresie, uvoľňovania alebo funkcie TNF-a alebo/a IL-I, liečenia alebo prevencie zápalových stavov iných ako glomerrulonefritída, liečenia alebo prevencie stavu mediovaného IL-I alebo/a TNF-a, liečenia alebo prevencie demyelinizačných chorôb, napríklad roztrúsenej sklerózy, liečenia alebo prevencie externe indukovaného zápalového stavu, liečenia alebo prevencie zápalovej odozvy na prudkú akútnu infekciu, napríklad septického šoku, meningitídy alebo pneumónie, liečenia popálenín, liečenia alebo prevencie chronického patogénom indukovaného zápalového stavu, napríklad Lymeovej choroby, ktorého podstata spočíva v tom, že sa pacientovi, napríklad cicavcovi, napríklad ľudskej bytosti, ktorý prípadne ktorá takéto liečenie alebo profylaxiu potrebuje, podá terapeuticky alebo profylaktický účinné množstvo IL-6, napríklad množstvo IL-6 inhibujúce TNF-α alebo/a IL-I, napríklad rhIL-6 (napríklad predovšetkým, ak sa IL-6 podá ako jediné terapeutické alebo profylaktické činidlo alebo prípadne podané v kombinácii s antimikrobiálnymi alebo vazoaktívnymi činidlami, napríklad nie v kombinácii s agonistami alebo antagonistami TNF-α alebo s protilátkou anti-TNF-α), prípadne v depotnej forme alebo vo forme s pomalým uvoľňovaním účinnej látky, napríklad v kombinácii s polymérnou matricou, napríklad s poly(etylénkarbonát)ovou matricou, ktorá je opísaná ďalej, ii) použitie IL-6, napríklad rhIL-6, pri výrobe liečiva pri spôsobe podľa i), napríklad na liečenie alebo prevenciu niektorého zo stavov uvedených vo výpočte podľa i), pričom uvedené liečivo je prípadne vo forme s pomalým uvoľňovaním účinnej látky a napríklad prípadne vo forme s pomalým uvoľňovaním účinnej látky a napríklad ďalej obsahuje polymérnu matricu, napríklad poly(etylénkarbonát)ovú matricu, ktorá bude opísaná ďalej, iii) použitie IL-6, napríklad rhIL-6, na liečenie alebo prevenciu niektorého zo stavov uvedených vo výpočte podľa i) a iv) farmaceutický prostriedok obsahujúci IL-6, napríklad rhIL-6, na použitie pri spôsobe podľa i), napríklad na liečenie alebo prevenciu niektorého zo stavov opísaných vi), prípadne vo forme s pomalým uvoľňovaním účinnej látky a ktorá prípadne ďalej obsahuje polymérnu matricu, napríklad poly(etylénkarbonát)ovú matricu, ktorá bude opísaná ďalej, napríklad prostriedok s plynulým uvoľňovaním účinnej látky (t.j. prostriedok, ktorý je biologicky odbúrateľný in vivo v priebehu dní, týždňov alebo mesiacov), obsahujúci IL-6 v polymérnej matrici, napríklad vo forme mikročastíc alebo depozitu, kde polymér podstupuje nehydrolytickú povrchovú eróziu in vivo, predovšetkým niektorý z tu opísaných systémov na dodávanie účinnej látky, na použitie pri liečení niektorých z vyššie uvedených stavov, napríklad na liečenie chronického zápalového stavu.

Pod označením IL-6 sa tu rozumie lubovoľná zlúčenina zodpovedajúca známym typom interleukínu-6 (ktorý je tiež známy ako interferón β-2 (IFN-B_ix), stimulačný faktor B-buniek 2 (BSF-2), interleukím HP-1 (HR1), hepatocytný stimulačný faktor (HSF), hybridomný plazmatický rastový faktor (HPGF) a 26kDfaktor). Výhodný je rekombinantný IL-6, i keď sa môže taktiež použiť nerekombinantný IL-6, napríklad interleukín produkovaný rakovinovými bunkovými radmi so sekréciou IL-6. IL-6 je komerčne dostupný alebo sa môže produkovať známymi spôsobmi, napríklad spôsobmi, ktoré sú opísané v EPA 0 220 574, EPA 0 257 406, EPA 0 326 120, WO 88/00206, GB 2 063 882 alebo GB 2 217 327. IL-6 sa môže glykozylovať, napríklad vo forme, ktorú produkujú eukaryotické bunky, napríklad bunky CHO, alebo neglykozylovaný, napríklad vo forme, ktorú produkujú prokaryotické bunky, napríklad E. coli. Výhodný je rekombinantný ľudský IL-6 (rhIL-6), i keď IL-6 je známy ako aktívne krížové činidlo (cross. species), takže sa môže použiť i IL-6 odvodený z neľudského zdroja a i takýto interleukín je zahrnutý pod označenie IL-6. Pod toto označenie spadajú i proteíny, ktoré majú mierne modifikované sekvencie IL-6, napríklad adície, delécie alebo mutácie 1,2 alebo 3 alebo viac aminokyselín, kondenzované proteíny obsahujúce IL-6 a ďalší proteín, účinné fragmenty IL-6 alebo/a variantné, obmedzené alebo mutantné formy IL-6, ktoré majú účinnosť IL-6.

Vhodné farmakologické prostriedky obsahujúce IL-6 spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom sú známe. IL-6 sa môže podávať parenterálne, napríklad vo forme injektovateľného roztoku alebo emulzie, napríklad v rámci opisu uvedeného v Remington's Pharmaceutical Science, 16. vydanie (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980) alebo analogicky s týmto opisom. Vhodné nosiče zahrňujú vodné nosiče, akými sú roztoky solí, Ringerov roztok, dextrózový roztok, Hankov roztok, ako aj nevodné nosiče, akými sú netuhnúce oleje a etyloleát. Pre obyčajné parenterálne podanie je IL-6 dostupný v lyofilizovanej forme v jednotlivých dávkových množstvách, ktoré sa môžu zmiešať s nosičom za vzniku vhodného injekčného roztoku alebo vhodnej injekčnej suspenzie.

IL-6 sa môže alternatívne podávať pri použití implantovateľného dávkovacieho systému alebo systému s plynulým uvoľňovaním účinnej látky, napríklad vo forme mikročastíc alebo v depotnej forme, v kombinácii s polymérom vytvárajúcim polymérmi matricu, z ktorej sa účinná látka potom postupne uvoľňuje. Takáto forma je výhodnou formou, napríklad v prípade, že sa má liečiť chronický stav, napríklad chronický zápalový stav, kedy sa liečba uskutočňuje v priebehu niekoľkých týždňov alebo mesiacov. Pod pojmom polymér sa tu rozumie ľubovoľná vhodná (napríklad farmakologicky prijateľná) lineárna·, vysokomolekulárna molekula tvorená opakujúcimi sa jednotkami (vrátane homopolymérov, kopolymérov a heteropolymérov) a prípadne rozvetvená alebo zosieťovaná, ktorá sa môže získať napríklad polymerizáciou jedného typu molekúl alebo kopolymerizáciou rôznych typov molekúl (napríklad poly(etylénkarbonát) z etylénoxidu a oxidu uhličitého, ako je opísané ďalej), a ktorá prípadne obsahuje interupcie v polymérnom reťazci s ostatnými jednotkami. Polymérom je s výhodou lineárny polymér, ktorý je tvorený uhlíkom, kyslíkom a vodíkom, napríklad poly-DL-laktid-ko-glykolid, polyetylénglykol alebo poly(etylénkarbonát). S výhodou polymér vykazuje nehydrolytickú povrchovú eróziu, ako napríklad ďalej opísaný poly(etylénkarbonát).

Použité dávky sa budú pochopiteľne meniť v závislosti od špecifického typu použitého IL-6, od druhu pacienta, spôsobu podania a od povahy a závažnosti stavu, ktorý sa má liečiť. IL-6 sa podáva veľkým cicavcom, napríklad ľuďom, pri subkutánnej injekcii alebo vo forme s plynulým uvoľňovaním účinnej látky v množstve poskytujúcom dávku od 0,5 Mg/kg/deň, alebo inú ľubovoľnú dávku, ktorá je bezpečná a účinná pre zabezpečenie účinnosti in vivo pri známych terapeutických aplikáciách. V prípade vážnych akútnych zápalových stavoch, akým je napríklad septický šok, môže byť vhodné podávať intravenózne i dávky vyššie ako na zabezpečenie rýchlej a silnej odozvy. Frekvencia podávania IL-6 sa môže prípadne redukovať z denného podávania na podávanie každý druhý deň alebo každý týždeň alebo aplikácia IL-6 môže byť dlhodobá v prípade použitia foriem s plynulým uvoľňovaním účinnej látky, pričom táto forma podania je výhodná v prípade, kedy sa liečenie uskutočňuje počas dlhšieho časového obdobia. Liečenie pomocou IL-6 môže mať za následok mrazenie, horúčku a chrípkové príznaky, ktoré sa môžu liečiť alebo ktoré sa môžu preventívne eliminovať súčasným podávaním nenarkotických analgetík, akými sú aspirín, acetaminofen alebo indometacin. Ďalšie výraznejšie vedľajšie účinky sa zvyčajne prejavujú až pri vyšších dávkach, napríklad pri dávkach nad 10 gg/kg/deň, a môžu sa zvyčajne odstrániť znížením dávkovania.

II) Polymérne matrice na plynulé uvolňovanie účinnej látky

Vynález ďalej poskytuje farmaceutické prostriedky vhodné na plynulé uvolňovanie účinných látok, ktoré sú vhodné napríklad na podanie IL-6, napríklad v rámci vyššie uvedených aplikácií, ako aj na podanie ďalších účinných látok. Týmito farmaceutickými prostriedkami sú predovšetkým prostriedky, ktoré obsahujú polyméry poly(etylénkarbonát)u, ktoré sa niekedy označujú ako poly(etylénkarbonát)y alebo PECs.

I keď sú v rámci doterajšieho stavu techniky známe niektoré príklady poly(etylénkarbonát)ov vhodných na použitie v systémoch na dodávania účinných látok, neopisuje doterajší stav techniky špecifické polyméry podľa vynálezu a neuvádza polyméry schopné podstúpiť nehydrolytickú povrchovú eróziu in vivo. Doterajší stav techniky taktiež neuvádza systémy na dodávanie niektorých zo špecifických drog, ktoré sú tu opísané a akým je napríklad IL-6, ani nenaznačujú, že systém s plynulým uvoľňovaním účinnej látky sa požaduje na dodávanie tohto typu účinných látok.

Predovšetkým prekvapujúce sú degradačné charakteristiky polymérov podľa vynálezu. Na základe všeobecných chemických znalostí by sa dalo očakávať, že karbonátová esterová väzba bude v podstate štiepiteľná. Ukázalo sa však, že polykarbonáty sú pri miernych podmienkach fyziologicky stabilné.

Podľa Chem. Pharm. Bull. 31(4), 1400-1403 (1983) sú poly-(etylénkarbonát)y odbúrateľné in vivo, avšak tieto testované polyméry neboli jednoznačne identifikované, napríklad modernými spektroskopickými metódami. Podľa skutočností uvedených na str. 1402 sa táto degradácia in vivo dá vysvetliť iba ako dôsledok vplyvu hydrolytických enzýmov.

Podľa Chem. Pharm. Bull. 32(1), 1795-2802 (1984) sa pripravili poly(etylénkarbonát)y obsahujúce Dibucaine. I keď sa opis vzťahoval k prv citovanému typu, zistilo sa, že k uvoľňovaniu Dibucaine nedochádzalo v dôsledku degradácie in vitro alebo in vivo štruktúry polyméru, ale v dôsledku difúzie cez polymér. Taktiež ani tu neboli fyzikálne a chemické vlastnosti testovaného poly(etylénkarbonát)u dostatočne stanovené.

Podľa Macromol. Chem. 183, 2085-2092 (1982) a predovšetkým podľa str. 2086, sú oxid uhličitý-epoxidové polyméry považované za biologicky odbúrateľné, pričom sa uvádza, že predbežné výsledky potvrdili biologickú odbúrateľnosť oxid uhličitý-etylénoxidové polyméry a teda aj ich použiteľnosť v rámci regulovateľného uvoľňovania účinnej látky. Ako tvrdenie o uvedenej biologickej odbúrateľnosti je tu citovaný Jinko Zoki 3 (Suppl.), 212 (1974). V tejto publikácii sa uvádza, že poly(etylénkarbonát) patrí do skupiny zlúčenín, ktoré sa najľahšie hydrolyzujú a pri ich rozklade nedochádza k problémom ani dokonca pri použití pronázy. To znamená, že by bola možná enzymatická hydrolýza in vitro a in vivo, pretože pronáza je tvorená zmesou hydrolytických enzýmov. Napriek tomu sa tento komentár zdá byť veľmi počhybným. Poly( etylénkarbonát )y podľa vynálezu boli vystavené, vo forme zlisovaných diskov s priemerom 5 mm a hmotnosťou 25 mg, účinku 10 mg/ml pronázy A a 5 mM CaCl^.2 H^O vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) s pH 7,4 a 10 mg/ml pronázy E a 5 mM CaCl₂.2 H_a0 vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku s pH

7,4 (pri teplote 37 ’C) a nepozorovala sa žiadna degradácia (pozri obr. 1). Roztok pronázy sa obnovoval každý deň.

Teraz sa s prekvapením zistilo, že vybrané poly(etylénkarbonát )y, ktoré majú špecifický etylénkarbonátový obsah, špecifickú viskozitu a špecifickú teplotu prechodu do sklovitého stavu a ktoré nie sú odbúrateľné hydrolýzou (napríklad v prítomnosti hydrolytických enzýmov, napríklad v prítomnosti pronázy, alebo pri zásaditých podmienkach), sú však odbúrateľné in vitro a in vivo, najmä a výlučne povrchovou eróziou. Výraz povrchová erózia sa používa v literatúre predovšetkým v spojitosti s hydrolytickým odbúraním polyanhydridov a polyortoesterov, pričom tento výraz nebol až doteraz jednoznačne definovaný.

K povrchovej erózii dochádza v prípade, kedy sa hmota odbúrava iba na povrchu polymérnych častíc, bez toho aby pri tom dochádzalo ku zníženiu molekulovej hmotnosti polymérneho zvyšku. Vždy, keď sa v literatúre tvrdilo, že sa pozorovala povrchová erózia, nikdy sa neuskutočnilo stanovenie molekulových hm)t polymérneho zvyšku paralelne so stanovením úbytku hmotnosti a teda v skutočnosti povrchová erózia nebola až doteraz nikdy dokázaná.

V skutočnosti sa takmer pri všetkých prípadoch pozorovala pri testovaných polyméroch erózia prebiehajúca v celej hmote polyméru. Takéto systémy vykazujúce eróziu v celej hmote polyméru majú významný nedostatok spočívajúci v tom, že ak polymér nesie účinnú zlúčeninu, napríklad peptid, ktorá je relatívne nestabilná pod vplyvom biologického média do ktorého sa má uvoľňovať, potom je táto zlúčenina uvedená i vo vnútornej časti hmoty polyméru do kontaktu s médiom a môže takto stratiť svoju účinnosť ešte pred tým, (a to značne dlho) ako sa môže z polyméru uvoľniť. Ak však má polymér iba schopnosť povrchovej erózie, čo znamená, že nedochádza k erózii v celej hmote polyméru, potom zostane v polymére zapuzdrená účinná zlúčenina, napríklad peptid, chránené pred nepriaznivým vplyvom uvedeného biologického média až bezprostredne do okamihu, kedy sa postupujúca povrchová erózia polyméru dostane k časticiam účinnej látky a príslušná častica účinnej látky sa uvoľní z povrchu zostávajúcej polymérnej hmoty. V prípade dodávkového systému účinnej látky s polymérnou matricou vykazujúcou povrchovú eróziu je častica účinnej látky v porovnaní s matricou vykazujúcou eróziu v celej hmote polyméru vystavená nepriaznivému vplyvu biologického prostredia počas kratšej časovej periódy, v dôsledku čoho sa dosiahne dlhšie, účinnejšie a konzistentnejšie uvoľňovanie farmakologicky účinnej látky z polymérnej matrice.

Pre polyanhydridy opísané v nedávno dostupných publikáciách Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90, 552-556 (1990) a 2Q_, 4176-4180 (1993) boli špecifikované niektoré charakteristiky chovania pripomínajúceho povrchovú eróziu. Javí sa však, že tu dochádzalo k odbúravaniu v celej hmote polyméru, a neboli tu vykonané žiadne stanovenia molekulovej hmotnosti. Okrem toho sa tu jedná o eróziu hydrolytického typu. Na rozdiel od toho sa teraz zistilo, že vybraná skupina poly(etylénkarbonát)ov, ktorá je definovaná ďalej, vykazuje ako in vitro, tak in vivo výlučne nehydrolytickú povrchovú eróziu.

Vynález takto poskytuje polymér odbúrateľný in vivo a in vitro povrchovou eróziou, ktorá je riadená nehydrolytickým mechanizmom, pričom tento polymér má etylénkarbonátové jednotky vzorca A

-(-C(O)-O-CH_a-CH₂-O-)- (A) etylénkarbonátový obsah 70 až 100 mol.%, vnútornú viskozitu 0,4 až 4,0 dl/g meranú v chloroforme pri teplote 20 ’C a teplotu prechodu do sklovitého stavu 15 až 50 ’C.

Etylénkarbonátový obsah polyméru podľa vynálezu sa rovná 70 až 100 mol.%, predovšetkým 80 až 100 mol.%, s výhodou 99 až 99,9 mol.%, ako napríklad od 94 do 99,9 mol.%. Vnútorná viskozita polyméru predstavuje 0,4 až 4,0 dl/g meraná v chloroforme pri teplote 20 ’C. Výhodne má polymér vnútornú viskozitu meranú pri teplote 20 ’C a pri koncentrácii 1 g/dl v chloroforme 0,4 až 3,0 dl/g.

Teplota prechodu do sklovitého stavu polyméru sa rovná 15 až 50 ’C, s výhodou 18 až 50 ’C.

V literatúre boli opísané poly(etylénkarbonát)y s teplotou prechodu do sklovitého stavu 5 až 17 ’C.

Polyméry podľa vynálezu sa výhodne vyrábajú kopolymerizáciou etylénoxidu a oxidu uhličitého, pričom tento spôsob prípravy uvedených polymérov tvorí taktiež súčasť vynálezu. Vzhľadom k tomuto spôsobu prípravy polyméru obsahuje tento polymér vo väčšine prípadov ako ko-jednotku etylénoxidovú jednotku vzorca B

-(-CH -CH -0—)- (B)

V prípade, že polyméry podľa vynálezu sú vystavené účinku vodného prostredia, akým je napríklad fosfátom pufrovaný fyziologický roztok s pH 7, potom prakticky nedochádza k transportu tohto média do vnútra hmoty polyméru, ako je to napríklad zrejmé z obr. 2. Preto nedochádza k žiadnej erózii v hmote a zostávajúca hmota polyméru sa udržiava konštantná (100 %) počas najmenej 28 dní, ako je to zrejmé z pravého grafu obr. 3.

Vo väčšine zvyčajne používaných matricových materiáloch pre systémy s plynulým uvoľňovaním účinnej látky sú prítomné poly-DL-laktid-ko-glykolidy. Takéto polyméry sú však na rozdiel od polymérov podľa vynálezu degradovateľné hydrolyticky. Tak napríklad hmotové odbúravanie vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku, ktoré je graficky znázornené v ľavej časti obr. 3 pre jeden z najoptimálnejších poly-DL-laktid-ko-glykolidových typov, ktorým je glukózou iniciovaný poly-DL-laktid-ko-glykolid (DL-PLGGLU), opísaný v britskom patente GB 2145 422.

Rozdiel v odbúravaní medzi poly(etylénkarbonát)mi podľa vynálezu a poly-DL-laktid-ko-glykolidmi (DL-PGL) in vivo je zrejmý tiež z obr. 3. Zatiaľ čo poly-DL-laktid-ko-glykolidy podstupujú eróziu v celej hmote, ako je to zrejmé z klesajúcej molekuovej hmotnosti zostávajúcej hmoty DL-PLGGLU, zostávajúca molekulová hmotnosť zostávajúcej hmoty poly(etylénkarbonát)ov je konštantá (100 %).

Reziduálna hmotnosť celkového implantátu klesá in vivo v oboch prípadoch k nule v priebehu jedného mesiaca, čo znamená, že poly(etylénkarbonát)y podstupujú povrchovú eróziu a nie eróziu v celej hmote polyméru. V dôsledku neprebiehajúcej erózie v celej hmote polyméru je polymér nesúci účinnú látku počas skladovania, t. j. pred jeho podaním, inertný voči vlhkosti a zostáva v rovnako suchom stave, v akom bol vyrobený. V prípade, že je účinná látka, ktorú polymér nesie, citlivá voči vlhkosti, potom zostáva pri skladovaní v prítomnosti vlhkosti stabilná.

Vynález taktiež poskytuje spôsob výroby polyméru, pri ktorom sa etylénoxid a oxid uhličitý polymerizujú v molárnom pomere 1:4 až 1:5 vplyvom katalyzátora. Je zrejmé, že v rámci tejto reakcie je možné zavedenie etylénoxidových jednotiek do polymérneho reťazca v prípade, kedy navzájom reagujú dve epoxidoví molekuly bez intervencie molekuly C0₂, t.j. v prípade, kedy oxy-anión intermediálne atakuje ďalšiu etylénoxidovú molekulu ešte predtým, ako sa karboxyluje oxidom uhličitým. Takto je pravdepodobné, že polymér obsahuje niekoľko etylénoxidových jednotiek. V prípade, že polymér podľa vynálezu obsahuje niekoľko etylénoxidových jednotiek, potom má náhodilú distribúciu etylénkarbonátových a etylénoxidových jednotiek v súlade so sumárnym vzorcom A -B =

-(C(O)-O-CH -CH —O—)--(-CH -CH -0-)' ' ' 2 2 m 2 2 n v ktorom m ---------- x 100 = 70 až 100 n + m

Avšak väčšina etylénoxidových jednotiek má v polyméroch podľa vynálezu štatisticky vo svojom susedstve priľahlé etylénkarbonátové jednotky a predovšetkým v tých prípadoch, kedy je molárny podiel etylénoxidových jednotiek malý. To znamená, že v týchto prípadoch sú výsledné éterové funkcie náhodilo distribuované medzi karbonátovými fúnkciami v celom polymérnom reťazci. Protónové nukleárne magnetickorezonančné spektrá (^XH-NMR) polymérov podľa vynálezu stanovené v CDC1₃ potvrdzujú túto domnienku. Tieto spektrá majú signály delta = asi 4,37 (integrál la) etylénkarbonátových jednotiek (etylénové jednotky medzi dvoma karbonátovými funkciami, asi 4,29 a 3,73 ppm (integrály Ib a Ic) etylénových jednotiek medzi jednou karbonátovou jednotkou a jednou éterovou funkciou a asi 3,65 ppm (integrál Id) etylénových jednotiek medzi dvoma éterovými funkciami. Podiel etylénkarbonátových jednotiek (A) sa potom vypočíta v rámci medzí presnosti NMR podľa nasledujúceho vzorca:

Podiel etylénkarbonátových jednotiek A (mol. %) = la

X 100 la + Ib + Ic + Id

Ako štruktúrny znak poly(etylénkarbonát)ov sa v literatúre často uvádza obsah ich éterových funkcií namiesto ich etylénkarbonátového obsahu. Podiel éterových funkcií (E) v polyméroch podľa vynálezu sa môže vypočítať podľa nasledujúceho vzorca:

Podiel éterových funkcií E (mol. %) =

Ic + Id --------------------- x ioo la + Ib + Ic + Id

Podľa údajov uvedených v PCT patentovej prihláške WO 92/22600 sa poly(etylénkarbonát)y pripravia s obsahom etylénoxidových jednotiek a etylénkarbonátových jednotiek v molárnom pomere 2 až 400 : 2, čo znamená, že polymér obsahuje najmenej 50 % etylénoxidu a teda menej ako 50 mol. % etylénkarbonátových jednotiek. V prihláške sa diskutuje biologická odbúrateľnosť týchto polymérov a ich použitie v biologicky odbúrateľných matriciach pre plynulé uvoľňovanie farmakologicky účinných zlúčenín. Avšak nie sú tu uvedené žiadne údaje svedčiace o tom, že tieto polyméry skutočne biologicky odbúrateľné. Vo všeobecnosti sú poly(etylénkarbonát)y, ktoré majú takýto vysoký podiel éterových funkcií len ťažko biologicky odbúratelné. V uvedenej patentovej prihláške nie je ani naznačená možnosť povrchovej erózie uvedených polymérov.

V príkladoch patentu US 3 248 415 sú opísané nízkomolekulárne poly(etylénkarbonát)y s molekulovou hmotnosťou (Mw) 700 až 5000, ktoré obsahujú menej ako 70 mol. % etylénkarbonátových jednotiek a ktoré sú teda odlišné od polymérov podľa vynálezu, pričom v súvislosti s týmito polymérmi nie je žiadna zmienka o ich biologickej odbúrateľnosti.

V PCT patentovej prihláške WO 89/05664 sú opísané poly(etylénkarbonát)y, ktoré obsahujú v opísanej štruktúre II etylénoxidové a etylénkarbonátové jednotky v molárnom pomere 1 až 8 : 1, čo znamená, že tieto polyméry obsahujú najmenej 50 mol. % etylénoxidových jednotiek a tieto polyméry sú teda odlišné od polymérov podľa vynálezu. I keď sa tu uvádza, že tieto polyméry sa môžu použiť na biologicky odbúratelné lekárske systémy, napríklad na implantáty, ktoré môžu obsahovať farmakologicky účinnú zlúčeninu, nie je tu žiadna zmienka o povrchovej erózii.

Pri spôsobe podľa vynálezu je obsah etylénoxidových jednotiek a teda i obsah éterových, ktorý oneskoruje alebo inhibuje rýchlosť biologickej odbúrateľnosti polyméru, značne zredukovaný vymedzením reakčných podmienok, akými sú molárny pomer reakčných zložiek a reakčná teplota, a ďalej voľbou vhodného katalyzátora, akým je napríklad katalyzátor pripravený zo Zn(C₌H_s)₂ a vody alebo acetónu alebo di- alebo trifenolu, napríklad z ucínu, v molárnom pomere 0,9 : 1 až 1 : 0,9 alebo 2:1 až 1,2, alebo s výhodou pripravený zo Zn(C₂H_s)₂ a diolu, predovšetkým etylénglykolu, v molárnom pomere od 0,9 : Idol : 0,9.

Tento spôsob sa s výhodou uskutočňuje v rozpúšťadlovom alebo disperznom systéme organického rozpúšťadla, napríklad dioxánu alebo oxidu uhličitého. Oxid uhličitý sa s výhodou použije v kvapalnej forme a je prítomný v prebytku. Tlak sa s výhodou rovná 2 až 7 MPa a teplota sa s výhodou pohybuje od 10 do 80 ‘C, predovšetkým od 20 do 70 ’C.

Takto získané polyméry podľa vynálezu zvyčajne obsahujú menej ako 15 % éterových funkcií, s výhodou menej ako 10 % éterových funkcií, napríklad menej ako 3 % éterových funkcií. V prípade, že poly(etylénkarbonát)y sa pripravia pri použití katalyzátora z etylénglykolu alebo acetónu a dietylzinku, potom vykazujú nízku polydisperzitu (Mw/Mn), zvyčajne nižšiu ako 5, napríklad nižšiu ako 2,5.

Pri spôsobe podľa vynálezu sa katalyzátor alebo jeho časť považuje za reťazový iniciátor kopolyméru. Keď sa reakcia ukončí . a reťazec je úplný, je jeho finálnou terminálnou skupinou hydroxylová skupina. Opačná strana reťazca, .na ktorej bol reťazec naštartovaný, sa môže obsadiť katalyzátorou skupinou alebo jej fragmentom. V prípade, že katalyzátor sa pripraví z etylénglykolu a dietylzinku, alebo z vody a dietylzinku, predpokladá sa, že obidva konce polymérneho reťazca sú identické. Avšak v prípade, že sa katalyzátor pripraví z dih alebo trifenolu a dietylzinku, bude aromatická skupina inkorporovaná na tom konci reťazca, na ktorom sa reťazec naštartoval, zatiaľ čo druhý koniec reťazca bude tvorený hydroxylovou skupinou. Zo obr. 4 je zrejmé, že v prípade, kedy je jedna z terminálových skupín poly(etylénkarbonát)u blokovaná, napríklad aromatickým iniciátorom, akým je fluoroglucín, je polymér pomalšie biologicky odbúrateľný. Z toho dôvodu sa predpokladá, že degradácia polymérneho reťazca začína na terminálnej hydroxylovej skupine alebo na terminálnych hydroxylových skupinách. Alternatívne je možne neskoršou derivatizáciu terminálnej hydroxylovej skupiny, napríklad jej esterifikáciou, zablokovať koncovú hydroxylovú skupinu a regulovať tak biologickú odbúrateľnosť poly(etylénkarbonát)u podľa vynálezu. Vhodnými terminálovými esterovými skupinami sú biologicky zlučiteľné esterové skupiny, ako esterové skupiny mastných kyselín s 1 až 48 atómami uhlíka, s výhodou esterové skupiny mastných kyselín s 1 až 30 atómami uhlíka, predovšetkým esterové skupiny mastných kyselín a 1 až 18 atómami uhlíka, napríklad esterové skupiny kyseliny octovej a kyseliny steárovej alebo esterové skupiny uhličité, napríklad etylénkarbonátová skupina alebo esterová skupina kyseliny palmovej alebo esterová skupina kyseliny mliečnej alebo kyseliny glykolovej alebo kyseliny polymliečnej alebo kyseliny polyglykolovej alebo kyseliny polymliečnej-ko-glykolovej.

Poly(etylénkarbonát)y podľa vynálezu sú stále počas niekoľkých hodín v horúcej vode (90 až 100 ’C), bez toho aby pritom prišlo k akémukoľvek významnému zníženiu molekulovej hmotnosti. Významné zvýšenie teploty prechodu do skleného stavu sa dá destilovanej pozorovať po vystavení účinku vriacej dvakrát vody počas 5 hodín, napríklad až na teplotu vyššiu ako 18 ’C, napríklad 28 ’C.

Uskutočnením tohto reakčného stupňa sa získa polymér s vyššou čistotou. Zistilo sa, že polyméry spracované týmto spôsobom sadajú lepšie spra covávať .

Poly(etylénkarbonát)ová časť polymérov podľa vynálezu je, ako už bolo uvedené predtým, nehydrolyzovateľná, to znamená počas najmenej jedného mesiaca hydrolytickými enzýmami pri fyziologických podmienkach alebo vodou pri pH 12 a teplote 37 ’C (pozri obr. 1 a 8). Zistilo sa však, že polyméry podľa vynálezu sú odbúrateľné in vivo a in vitro povrchovou eróziou vplyvom superoxidového radikálového aniónu O “. Superoxidové radikálové anióny 0 sú generované v zápalových bunkách in vivo v prítomnosti poly(etylénkarbonát)ov podľa vynálezu, ako je zrejmé z obr. 5. Polylaktid-ko-glykolidy, ktoré predstavujú najčastejšie používané matricové materiály pre systémy s plynulým uvoľňovaním účinnej látky v rámci doterajšieho stavu techniky a ktoré sa odbúravajú hydrolýzou v celej hmote polyméru, neindukujú tvorbu superoxidových radikálových aniónov O , čo je ilustrované na tom istom obrázku pre glukózou iniciovaný poly-DL-laktid-ko-glykolid, ktorý je tiež použitý pre obr. 3.

In vitro sa realizoval vodný systém obsahujúci peroxid draslíka ako zdroj peroxidových radikálových aniónov O a vykazujúci povrchovú eróziu poly(etylénkarbonát)ov podľa vynálezu (pozri obr. 8). In vitro sa zvolilo pH 12, pretože peroxi dový radikál 0_z~ je pri tejto hodnote pH dostatočne stabilný.

Pre zaujímavosť treba uviesť, že poly(propylénkarbonát)y, ktoré sa od poly(etylénkarbonát)ov odlišujú substitúciou vodíka etylénovej jednotky metylovou skupinou, nie sú vôbec biologicky odbúrateľné, ako to dokázali japonskí autori v Chem. Pharm. Bull. 31(4), 144-1403 (1983).

Pri použití suspenzie mikročastíc poly(etylénkarbonát)ov podľa vynálezu sa vykonala toxikologická štúdia pre 48 krýs počas 21 dní a pre 24 psov počas 35 dní. Pre každý z uvedených živočíšnych druhov sa vykonali dve podania v deň 1 a deň 17. Po subkutánnej a intramuskulárnej aplikácii 10 a 40 mg polymérnych mikročastíc na kilogram telesnej hmotnosti sa nepozorovali žiadne klinické príznaky systémovej toxicity, žiadne relevantné účinky na hematologické parametre, na parametre klinickej chémie krvi, na telesnú hmotnosť a na spotrebu potravy. Miesta aplikácie sa testovali na histopatologické zmeny 4a 21 dní po aplikácii pri krysách a 18 a 35 dní po aplikácii pri psoch. Okrem očakávanej zápalovej odozvy sa nezistili žiadne histopatologické zmeny.

Rýchlosť odbúravania polymérov podľa vynálezu sa môže nastaviť širokých medziach v závislosti od ich molekulovej hmotnosti, ich etylénoxidovom obsahu, identite terminálnych skupín, napríklad biologicky zlučiteľných esterových skupín, a od prítomnosti skevendžrov radikálových peroxidových aniónov 0₂~, napríklad vitamínu C, pričom toto odbúravanie sa môže uskutočňovať v intervale medzi 5 dňami až 6 mesiacmi alebo dlhšie, napríklad až do jedného roka. Uvedený radikálový skevendžer môže byť s výhodou zapuzdrený v polymére ako prísada.

Molekulová hmotnosť Mw kopolyméru podľa vynálezu predstavuje od 80 000, s výhodou 100 000, predovšetkým od 200 000, do 2 000 000 Daltonov, ako sa stanovilo gélovou permeačnou chromatografiou pri použití metylénchloridu ako elučného činidla a polystyrénu ako referenčného štandardu.

Vyššie uvedený Chem. Pharm. Bull. 32(7), 2795-2802 (1984) uvádza, že poly(etylénkarbonát)y, ktoré majú molekuovú hmotnosť od 50 000 do 150 000 Daltonov sa použili v rámci testov opísaných v tomto literárnom odkaze. Teraz sa zistilo, že odbúranie polyméru in vitro a in vivo sa môže v dostatočnej miere dosiahnuť iba v prípade, keď je molekulová hmotnosť polyméru vyššie ako 80 000, s výhodou vyššia ako 100 000 (obr. 6). Toto je výhodný znak vynálezu.

Polyméry podlá vynálezu sa môžu použiť vo farmaceutických prostriedkoch, predovšetkým ako matricové materiály na zapuzdrenie farmakologicky účinných látok. Vzhľadom k tomu, že nedochádza in vitro a in vivo k erózii v hmote polyméru a účinná zlúčenina je takto chránená polymérom, uvoľňuje sa účinná zlúčenina až v okamihu (a nie skôr), kedy sa objaví na povrchu matrice v dôsledku povrchovej erózie matrice. Vo vodnom systéme, ktorý má pH 7,4 a neobsahuje peroxidové radikálové anióny 0 sa uvoľňujú iba stopové množstvá účinnej zlúčeniny (pozri obr. 9).

Ďalšia výhoda povrchovej erózie spočíva v tom, že veľkosť molekuly farmakologicky účinnej zlúčeniny nemá vplyv na rýchlosť jej uvoľňovania.

Vynález preto poskytuje farmaceutický prostriedok účinnej zlúčeniny v polymére, vykazujúci nehydrolytickú povrchovú eróziu, predovšetkým s lineárnou, najmä 1 : 1 lineárnou, koreláciou uvoľňovania účinnej zlúčeniny a nehydrolytického odbúravania hmoty polyméru a ochranu účinnej zlúčeniny v polymérne j matrici.

Tieto prostriedky sa s výhodou použijú vo forme mikročastíc alebo implantátov.

Príprava farmaceutických foriem podľa vynálezu sa môže uskutočniť všeobecne známymi metódami, pričom mikročastice sa pripravia vhodným rozprašovacím sušením alebo emulgačnou technikou a implantáty sa pripravia zmiešaním účinnej zlúčeniny a poly(etylénkarbonát)ov, pričom sa obidve tieto zložky použijú v partikulárnom pevnom stave, pri vyšších teplotách, pri ktorých sa poly(etylénkarbonát)y stávajú mäkkými a teda spracovateľnými, a prípadne následným ochladením zmesi do pevného stavu a modelovaním tejto zmesi do vhodného tvaru. Taktiež je možné zmiešať farmakologicky účinnú zlúčeninu v rozpustenom stave s roztokom poly(etylénkarbonát)u a potom odpariť rozpúšťadlo a vytvarovať pevný zvyšok do vhodnej implantátovej formy.

Farmaceutické prostriedky obsahujúce mikročastice sa získajú pridaním vhodných galenických pomocných látok počas ich spracovania a prípadne ich naplnením do vhodných dispenzorov.

V závislosti od vlastností účinnej látky a od procesu výroby sa môže obsah účinnej látky v polymére meniť v širokých medziach, t.j. rádovo od 0,001 do asi 70 %, napríklad od 0,001 do 20 %, s výhodou od 0,001 do 5 % hmotnosti. Perkolácii média do polyméru v dôsledku vysokého obsahu účinnej látky by sa malo zabrániť obmedzením hornej hranice obsahu účinnej látky.

V rámci lekárskej praxe podávania farmakologicky účinných zlúčenín sa môže v kombinácii s poly(etylénkarbonát)om podľa vynálezu použiť ľubovoľný typ farmakologicky účinnej zlúčeniny. V prípade mikročastíc sa s výhodou použijú tie typy farmakologicky účinných zlúčenín, ktoré sú farmakologicky účinné v malých množstvách a ktorých neprerušovaná hladina v krvi sa musí udržiavať počas dlhšieho časového obdobia, napríklad hormóny, peptidy alebo proteíny, napríklad somatostatíny, interferóny alebo interleukíny, pričom sa však s výhodou takto podávajú parenterálne predovšetkým tie účinné zlúčeniny, ktoré sú nestabilné a ktorých rozklad by po perorálnom podaní nastal v gastrointestinálnom trakte.

Uvedené depotné formulácie podľa vynálezu sa môžu použiť na podanie širokého spektra účinných látok, napríklad farmakologicky účinných látok, akými sú antikoncepčné prostriedky, sedatíva, steroidy, sulfónamidy, vakcíny, vitamíny, protimigrénovo účinné látky, enzýmy, bronchodilatátory, kardiovasku lárne účinné látky analgetiká, antibiotiká, antigény, protikŕčové účinné látky, protizápalové účinné látky antiparkinzoniká, inhibítory prolaktínovej sekrécie, antiplazmatiká, geriatriká a protimalarijné účinné látky. Účinné činidlo sa môže zvoliť zo širokého spektra chemických zlúčenín, akými sú napríklad lipofilné alebo/a hydrofilné účinné látky, vrátane peptidov, akým je napríklad oktreotid (opísaný v britskom patente GB 2 234 896 A).

Účinnými proteínmi alebo peptidmi sú s výhodou cytokíny, napríklad interleukíny, G-CSF, M-CSF, GM-CSF alebo LIF, interferóny, erytropoetíny, cyklosporíny alebo hormóny alebo ich analgetiká, napríklad oktreotid.

Uvedené farmaceutické prostriedky sa môžu použiť na:

imunomoduláciu, v ktorej účinná zložka obsahuje cytokín, napríklad interleukín (IL-3, IL-6), alebo faktory stimulujúce hematopoetické kolónie (G-CSF, napríklad Filgrastim, GM-CSF, napríklad Molgramostim, Sargramostim, M-CSF), napríklad ako vakcínovú prísadu, dosiahnutie hematopoetickej rekonštitúcie po myelosupresívnej terapii alebo po transplantácii kostnej drene, pričom účinná zložka obsahuje hematopoetický rastový faktor, napríklad GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-6, leukémiu inhibujúci faktor (LIF), stem celí factor (SCF) alebo ich kombinácie, dosiahnutie vysokej lokálnej koncentrácie účinnej látky, pričom účinná zložka napríklad obsahuje farmakologicky účinnú látku alebo cytokín, GM-CSF, IL-6, IL-2, IL-4 alebo ich kombinácie, s cieľom stimulovania protektívnej imunitnej odozvy, napríklad v prípade, keď sa podávajú súčasne s ožiarenými nádorovými bunkami alebo vakcínami antigény (analógia s ožiarenými bunkami transfektovanej príslušnými cytokínovými génmi), indukovanie potentnej imunitnej odozvy, pričom účinná zložka napríklad obsahuje GM-CSF podaný v kombinácii s antigénmi, najmä nádorovými antigénmi, vírusovými antigénmi alebo bakteriálnymi antigénmi, indukovanie hojenia rán pri použití lokálnej injekcie prostriedkov, pričom účinná zložka obsahuje GM-CSF, indukovanie Ag-špecifickej imunitnej tolerancie, pričom účinná zložka obsahuje napríklad GM-CSF kombinovaný s inhibítormi druhotných molekúl (koreceptory, predovšetkým inhibítormi pre CD28-B7-interakciu, pre CD40-CD40ligandovú interakciu, pre interakciu adhézneho faktora, na sprievodnú terapiu pri cytostatickom liečení alebo vakcínovú prísadu, pričom účinná zložka obsahuje napríklad cytokín, predovšetkým interleukín (IL-3, IL-6) alebo induktor cytokínovej sekrécie, napríklad lipidové deriváty, napríklad zlúčeninu opísanú v európskom patente EP 0 309 411, najmä v príklade 1, ktorá je tiež známa ako MRL 953, špecifickú imunitnú supresiu, pričom účinnou zložkou je napríklad imunofilínové väzbové imunospresívne činidlo, napríklad cyklosporín (napríklad Cyklosporin A), ascomycín (napríklad FK506) alebo rapamycín alebo derivát, ktorý je opísaný vo WO 94/09010, napríklad 40-0-hydroxyetyl-rapamycín), liečenie alebo profylaxiu autoimunitných chorôb a zápalových stavov pomalým uvoľňovaním protizápalových citokínov, napríklad IL-6, IL-10 alebo TGF-Ô, alebo interferónov, napríklad IFN-B_x alebo Betaserónu, alebo rozpustných cytokínových receptorov alebo antagonistov cytokínových receptorov, napríklad pre IL-I, TNF-a alebo IL-4, liečenie alebo profylaxiu alergických ochorení pomalým uvoľňovaním rozpustného α-raťazca receptora s vysokou afinitou pre IgE (Fc^RI), liečenie rakovín, napríklad pri použití oktreotidu, cytokínov a predovšetkým interleukínov, selektívne zacielenie účinných látok, napríklad pri liečení leishmaniózy, fungálnych infekcií a enzymo-akumulačnej choroby (enzýme storage illnesses, Tay Sachs, Gauckerova choroba), liečení AIDS alebo ARC, očkovaní, napríklad tetanovou toxoidnou vakcínou hematopoesu, pričom účinnou zložkou je napríklad arytropoetín a na intraartikulárnu injekciu do zapálených kĺbov, pričom účinnou zložkou je napríklad protizápalová účinná látka, predovšetkým účinná látka, ktorá nie je biologicky dostupná pri perorálnom podaní alebo má veľmi krátky polčas rozkladu, napríklad inhibítory enzymatickej konverzie IL-Ιβ, inhibítory metaloproteázy.

Spôsob zlepšenia imunitnej odozvy cicavca na vakcínu zahrňujúci podanie cicavcovi, ktorý očkovanie potrebuje, účinné množstvo GM-CSF v kombinácii s vakcínou bol opísaný v PCT prihláške WO 94/01133. Avšak GM-CSF nebol pri tomto spôsobe tak starostlivo retardovaný ako je to pri spôsobe podľa vynálezu, pri ktorom sa dosahuje takmer konštantné uvoľňovanie účinnej látky počas dlhšieho časového obdobia, v dôsledku čoho sa takto môže znížiť počet opakovaných podaní.

Vynález poskytuje predovšetkým farmaceutický prostriedok účinnej látky v polymére vykazujúcom nehydrolytickú povrchovú eróziu pre parenterálne podanie interleukínu alebo CSF, predovšetkým vo vyššie definovanom polymére.

Vynález takto poskytuje spôsob podania takéhoto prostriedku pacientovi, ktorý zahrňuje parenterálne podanie uvedeného prostriedku pacientovi, ktorý takéto liečenie potrebuje.

Uvedené depotné formulácie podľa vynálezu sa môžu použiť na známe indikácie špecifických farmakologicky účinných zlúčenín, ktoré sú v týchto prostriedkoch obsiahnuté.

Presné množstvá podanej účinnej zlúčeniny a depotné formulácie závisia od množiny faktorov, medzi ktoré patrí napríklad stav, ktorý sa má liečiť, požadovaný čas liečenia, rýchlosť uvoľňovania účinnej zlúčeniny a odbúrateľnosť poly(etylénkarbonát)u.

Požadované formulácie sa môžu získať všeobecne známym spôsobom. Množstvo farmakologicky jeho uvoľňovania sa môžu stanoviť vitro alebo in vivo, pri ktorých účinného činidla a rýchlosť na báze známych techník in sa napríklad stanovuje, ako dlho zostáva koncentrácia špecifickej účinnej látky v krvnej plazme na požadovanej úrovni. Odbúrateľnosť polymérnej matrice sa môže taktiež stanoviť technikami in vitro alebo predovšetkým in vivo, pri ktorých sa napríklad stanovuje množstvo matricového materiálu v subkutánnom tkanive po danej časovej perióde.

Depotné formulácie podľa vynálezu sa môžu podať vo forme mikročastíc, napríklad perorálne, nasálne alebo pulmonálne, s výhodou subkutánne, intramuskulárne alebo intravenózne, predovšetkým vo forme suspenzie vo vhodnom kvapalnom nosiči, alebo vo forme implantátov, napríklad subkutánne.

Opakované podanie depotných formulácií sa môže uskutočniť v prípade, keď prišlo k dostatočnému odbúraniu polymérnej matrice, napríklad po 1, 2 alebo 3 týždňoch alebo po jednom mesiaci.

Výhoda poly(etylénkarbonát)ovej matrice podľa vynálezu spočíva v tom, že počas uvoľňovania účinnej zlúčeniny sa polymérne reťazce odbúravajú na časti s malou veľkosťou molekuly, ktoré sa dopravujú telesnými tekutinami z miesta podania.

Príklady obsahov účinnej látky pre výhodnú zlúčeninu oktreotid v prípade akromegálie sú demonštrované parenterál nymi kvapalnými depotnými formuláciami obsahujúcimi mikročastice, ktoré obsahujú uvedený peptid v množstve najmenej 0,1, s výhodou od najmenej 0,5 do 20 % hmotnostných, vztiahnuté na hmotnosť (ko)polymérnej matrice, s výhodou 2,0 až 10, predovšetkým 3 až 6 % hmotnostných, vztiahnuté na hmotnosť (ko)polymérnej matrice. Celková dávka oktreotidu predstavuje 20 až 30 mg v prípade akromegálie a až 100 až 200 mg v prípade rakoviny prsníka, napríklad počas jednomesačného liečenia.

Čas uvoľňovania peptidu z mikročastíc môže predstavovať 5 dní až asi 2 týždne alebo ešte dlhšie.

Výhodne obsahuje formulácia s plynulým uvoľňovaním účinnej látky oktreotid v (ko)polymérnom nosiči, ktorá v prípade, že sa podáva králikovi alebo kryse subkutánne v dávke 2 mg oktreotidu na kilogram telesnej hmotnosti, poskytne koncentráciu oktreotidu v krvnej plazme rovnú najmenej 0,3 ng/ml a s výhodou nižšiu ako 20 ng/ml počas dlhšieho časového obdobia.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu môžu obsahovať ďalšie prísady, ktoré sú výhodne tiež zapuzdrené v (ko)polymére, napríklad radikálové skevendžre, predovšetkým skevendžer peroxidového radikálového aniónu O^^-. Prítomnosť takého skevendžra, akým je napríklad menadión alebo vitamín C, znižuje rýchlosť odbúravania poly(etylénkarbonát)u (obr. 7).

Ďalším typom prísady je skevendžer hydroxylového radikálu prípadne generovaného vplyvom peroxidového radikálového aniónu 0₂~, napríklad polyol, predovšetkým cukorný alkohol, najmä manitol. Zistilo sa, že táto prísada má taktiež priaznivý vplyv na zisk telesnej hmotnosti pokusných zvierat, ktorým sa napríklad podával mikrozapuzdrený IL-3. Bez tejto prísady je zisk telesnej hmotnosti postponovaný. V prípade, že prostriedok má formu mikročastíc, môže sa rovnaká alebo iná prísada externe pridať k jestvujúcim mikročasticiam, pretože to má priaznivý vplyv na stabilitu mikročasticovej suspenzie voči flokulácii a zrážaniu.

V prípade, že je prísada prítomná, potom je s výhodou prítomná v množstve 1 až 99 % hmotnostných, vztiahnuté na celkovú hmotnosť prostriedku.

Priaznivé odbúravanie hmoty polyméru in vitro a in vivo pri vplyve radikálového aniónu 0_z~ je demonštrované na obr. 8. Degradačné krivky pre reziduálnu hmotu polyméru sú približne lineárne a majú odlišný sklon, pretože podmienky odbúravania in vivo a in vitro sú odlišné. Množstvo odbúranej hmoty polyméru za časovú jednotku je takmer konštantné.

Krivky vynesené pre uvoľňovanie farmakologicky účinnej látky in vivo, napríklad ľudského XL-3, pri vplyve peroxidového radikálového aniónu 0 “ sú rovnako ako uvedené degradačné krivky približne lineárne (obr. 10), čo znamená, že tiež množstvo uvoľnenej farmakologicky účinnej látky za časovú jednotku je takmer konštantné.

Kombinácia ako uvoľňovania in vivo ľudského IL-3, tak i degradácia polyméru in vivo je zachytená na obr. 11, ktorý takto demonštruje koreláciu 1 : 1 medzi odbúravaním hmoty polyméru in vivo a uvoľňovaním účinnej látky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a v ničom neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený definíciou patentových nárokov.

Príklady 1 až 5

Všeobecný postup syntézy poly(etylénkarbonát)ov pri použití katalyzátora pripraveného z dietylzinku a vody

200 ml bezvodého dioxánu a 19,5 g (158 mmol) Zn(C₂H_g)₂ sa zavedie do banky s obsahom 750 ml pod dusíkovou atmosférou. Banka je opatrená mechanickým miešadlom, prikvapkávacím lievikom, teplomerom a prívodom dusíka. Prikvapkávací lievik je opatrený trubicou s chloridom vápenatým. Roztok obsiahnutý v banke sa ochladí na teplotu 10 ’ C na ľadovom kúpeli, potom sa k takto ochladenému roztoku pomaly pridáva roztok 2,7 ml vody v dioxáne (pozri tabuľka 1) tak, aby sa teplota udržiavala v teplotnom rozmedzí od 10 do 15 C. Reakčná zmes sa mieša počas ďalších 45 minút pri laboratórnej teplote až do okamihu, keď sa pôvodne bezfarebný roztok slabo žlto sfarbí. Tento roztok katalyzátora sa zavedie do autoklávu, kam sa pridá 40 g oxidu uhličitého a obsah autoklávu sa zahrieva pri teplote 125 ’C počas obdobia uvedeného v tabuľke 1. Zmes sa potom ochladí na laboratórnu teplotu, následne sa k nej pridá 560 g (12,7 mol) etylénoxidu v priebehu 1 hodiny. Reakcia sa potom ponechá počas doby uvedenej v tabuľke 1. Po tomto čase sa autokláv pomaly počas niekoľkých hodín odtlakuje. Produkt, ktorý tvorí lepkavú kašu, sa zriedi dioxánom a vyzráža naliatím dioxánového roztoku do 0,25 M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Zrazenina sa rozpustí vo vhodnom množstve metylénchloridu (2 až 4 litre), roztok sa premyje 0,5 M vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej (dvakrát) a vodou (jedenkrát) . Roztok sa vysuší nad bezvodým síranom sodným a odparí sa na finálny objem 0,5 až 1,5 litra, v závislosti od viskozity roztoku. Produkt sa vyzráža naliatím metylénchloridového roztoku do štvornásobného objemu metanolu. Biela zrazenina sa odfiltruje a vysuší cez noc pri tlaku 50 Pa a teplote 50 ’C. Surový produkt sa opätovne vyzráža z acetónu s cieľom ďalšieho prečistenia (pozri tabuľka 2). Všetky produkty poskytujú identické ^XH-NMR spektrá s výnimkou relatívnych intenzít signálov pri 3,65, 3,73, 4,29 a 4,37 mmp, čo je spôsobené rozdielmi v obsahu etylénkarbonátových jednotiek.

Tabuľka 1

Pokusy týkajúce sa prípravy poly(etylénkarbonát)ov

Príklad	Etylénoxid C02	Zn(C2Hs)2 (mmol)	Dioxán (ml)	Teplota (’C)	Čas (h)
(mol)	(mol)
1	3	13,6	158	300	50	64
2	3	9,1	158	500	20	64
3	3	13,6	158	300	20	240
4	3	13,6	158	300	20	40
5	3	13,6	158	300	20	22
6	3	13,6	238	300	50	64

Všetky pokusy sa uskutočňovali v jednolitrovom autokláve NB2. Molárny pomer H₂0 : Zn(C₂H_s)₂ = 0,95 pre všetky pokusy. Katalyzátor sa predspracoval pri použití 40 g oxidu uhličitého pri teplote 125 ’C počas jednej hodiny s výnimkou príkladu 1 (10 hodín).

Tabuľka 2

Niektoré vybrané fyzikálne vlastnosti syntetizovaných poly(etylénkarbonát)ov

Príklad	Mw (kDa)	Mn (kDa)	Mw/Mn	Tgs (•C)	Vnútorná viskozita (dl/g) v CHCI a)	Etylkarbonátový obsah (%)
1	141,9	32,2	4,40	19,3	0,6087
2	627,3	133,5	4,70	23,5	1,4691
3	477,0	83,6	5,71	18,7	1,2791
4	758,0	97,5	7,77	20,6	1,7590
5	721,6	80,7	8,95	22,9	2,44 b)	90
6	310,9	130,1	3,02	20,1		88

Tg = teplota prechodu so sklovitého stavu

a) pri 20 °C a koncentrácii 10 mg/ml v prípade, že nie je uvedené inak

b) pri koncentrácii 1 mg/ml

Príklady 7 až 11

Všeobecný postup syntézy poly(etylénkarbonát)ov pri použití katalyzátora pripraveného z diéty1zinku a diolu

Príprava katalyzátora

200 ml bezvodého dioxánu sa pod dusíkovou atmosférou zavedie do suchej štvorhrdlej banky s obsahom 750 ml. Pomocou sklenenej injekčnej striekačky sa do banky pridá 19,50 g (158 mmol) dietylzinku. Banka je opatrená mechanickým miešadlom, prikvapkávacím lievikom, teplomerom a prívodom argónu. Do prikvapkávacieho lievika sa potom predloží 100 ml bezvodého dioxánu a prikvapkávací lievik sa uzatvorí uzatvorí trubičkou s chloridom vápenatým. Zariadenie sa potom uloží pod prúd argónu. Do dioxánu v prikvapkávacom lieviku sa pod prúdom argónu pridá 9,00 g (145 mmol, 0,92 mol ekv.) čerstvo destilovaného etylénglykolu (udržiavaného nad molekulovým sitom). Mechanicky miešaný obsah banky sa ochladí na teplotu 10 ’C na ľadovom kúpeli a pod argónovou atmosférou. K roztoku dietylzinku v dioxáne sa za miešania počas 30 minút po kvapkách pridá roztok etylénglykolu v dioxáne, pričom sa v priebehu tohto času udržiava teplota obsahu banky v teplotnom rozmedzí od 10 do 14 ’C. Po pridaní etylénglykolového roztoku sa dá súčasne pozorovať vývoj plynného etánu a zrážanie. Po ukončení tohto prídavku sa chladiaci kúpeľ odstaví a zmes sa mieša počas ďalších 60 minút a v priebehu tohto času sa zmes zahreje na laboratórnu teplotu. Získaná heterogénna zmes sa potom prenesie do autoklávu (jednolitrový autokláv NB2) pod argónovou atmosférou. Do autoklávu sa zavedie asi 40 g (0,9 mol) oxidu uhličitého a obsah autoklávu sa zahrieva pri teplote 125 ’C počas jednej hodiny za miešania, pre účel predspracovania katalyzátora s oxidom uhličitým.

2. Polymerizácia

Autokláv s predspracovaným katalyzátorom sa ochladí na laboratórnu teplotu, následne sa do autoklávu zavedie ďalších 560 g (12,7 mol) oxidu uhličitého. K zmesi v autokláve sa potom za miešania pomalým vstrekovaním pridá 132 g (3 mol) etylénoxidu (99,8 %). Po ukončení tohto prídavku sa autokláv zahrieva pri teplote uvedenej v tabuľke 3 a zmes sa mieša pri tejto teplote po uvedený čas.

3. Spracovanie

Autokláv sa ochladí na laboratórnu teplotu a autokláv sa pomaly odtlakuje až na atmosférický tlak. Produkt, ktorým je biela penivá kaša sa vytrepe celkom 7 litrami dichlórmetánu, následne sa pridá 1035 ml 0,4 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej a získaná zmes sa mieša počas 3 hodín pri laboratórnej teplote. Fáza sa rozdelí a organická vrstva sa dvakrát premyje troma litrami 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej a dvakrát 4,5 litrami vody. Dichlórmetánový roztok sa potom vysuší nad 120 g síranu sodného a zahustí sa na konečný objem asi 2 litrov. Produkt sa vyzráža pomalým pridaním uvedeného roztoku do 6 litrov metanolu. Zrazenina sa suší počas 16 hodín za vákua pri teplote 40 ’C, pričom sa získa surový polymér, ktorý sa prečistí nasledujúcim spôsobom.

Surový produkt sa rozpustí v dichlórmetáne a získaný roztok sa naleje do 5-násobného objemu acetónu počas 15 minút, aby sa dosiahlo vyzrážanie produktu. Zrazenina sa suší počas 16 hodín vo vákuu pri teplote 40 ’C, pričom sa získa zodpovedajúci poly(etylénkarbonát). Fyzikálne vlastnosti tohto produktu sú uvedené v tabuľke 4. Všetky produkty vykazujú silnú IR-absorpciu v oblasti 1750 a 1225 cm^-1. ^XH-NMR signál etylénkarbonátových jednotiek je možné pozorovať v oblasti 4,37 ppm.

Syntéza poly(etylénkarbonát)ov pri použití katalyzátora pripraveného z dietylzinku a diolu

Tabuľka 3

Prík.	Etylénoxid	CO 2 (mol)	Rozpúš-a)	1=) Diol (ml)	Reakčná teplota (’C)	Reakčný čas (h)
ťadlo (ml)	Zn(C H ) ' 2 S ' 2 (mmol)
7	3,0	13,6	300	158	145	20	96
8	3,0	13,6	300	158	145	50	96
9	3,0	13,6	300	158	145	60	96
10	3,0	13,6	300° >	158	145	50	144
11	3,0	13,6	300	158	145λ>	50	96

a) dioxán v prípade, že nie je uvedené inak

b) etylénglykol v prípade, že nie je uvedené inak

c) tetrahydrofurán ako rozpúšťadlo namiesto dioxánu

d) 1,4-butándiol namiesto etylénglykolu

Tabuľka 4

Niektoré vybrané vlastnosti poly(etylénkarbonát)ov syntetizovaných pri použití katalyzátora pripraveného z dietylzinku a diolu

Príklad	MW (kDa)	Mn (kDa)	Mw/Mn	TgB (’C)	Vnútorná viskozita (dl/g) v CHCI ' 3	Etylkarbonátový obsah (%)
7	—	—	—	16,7	2,88b>	98
8	328,0	149,0	2,20	16,4	0,97	95
9	207,0	103,0	2,00	21,1	0,65	92
10	231,0	83,8	2,76	32,6	0,72	96
11	110,0	53,4	2,06	31,1	0,49	90

Tg = teplota prechodu do sklovitého stavu

a) pri 20 ’ C a koncentrácii 10 mg/ml v prípade, že nie je uvedené inak

b) pri koncentrácii 1 mg/ml.

Príklad 12

Experimentálny postup syntézy poly(etylénkarbonát)u pri použití katalyzátora pripraveného z dietylzinku a floroglucínu

1. Príprava katalyzátora

Do štvorhrdlej banky s obsahom 750 ml sa pod dusíkovou atmosférou zavedie 200 ml dioxánu. Do banky sa potom pridá pomocou sklenenej injekčnej striekačky 19,60 g (158,7 mmol) dietylzinku. Banka je opatrená mechanickým miešadlom, prikvapkávacím lievikom, teplomerom a prívodom argónu. Do prikvapkávacieho lievika sa predloží 100 ml bezvodého dioxánu a prikvapkávací lievik sa uzatvorí trubičkou obsahujúcou chlorid vápenatý. Celá aparatúra sa uloží pod prúd argónu. Do prikvapkávacieho lievika sa pridá 13,34 g (105,8 mmol, 0,92 mol ekv.) bezvodého fluoroglucínu pod argónovou atmosférou. Mechanicky miešaný obsah banky sa ochladí na teplotu 10 ’C na ľadovom kúpeli a pod argónovou atmosférou. K roztoku dietylzinku v dioxáne sa za miešania počas 30 minút po kvapkách pridá z prikvapkávacieho lievika roztok fluoroglucínu dietylzinku a v počas tohto obdobia sa udržiava teplota obsahu banky v teplotnom rozmedzí od 10 do 14 ’C. Po pridaní fluoroglucínového roztoku sa dá súčasne pozorovať vývoj plynného etánu a zrážanie. Po ukončení tohto prídavku sa chladiaci kúpeľ odstaví a zmes sa mieša počas ďalších 30 minút a v priebehu tohto času sa zmes nechá zahriať na laboratórnu teplotu. Získaná heterogénna zmes sa potom prenesie do autoklávu (jednolitrový autokláv NB2) a to pod argónovou atmosférou. Do autoklávu sa zavedie asi 40 g (0,9 mol) oxidu uhličitého a obsah autoklávu sa zahrieva pri teplote 125 ’C počas jednej hodiny za miešania, pre účel predspracovania katalyzátora s oxidom uhličitým.

2. Polymerizácia

Autokláv s predspracovaným katalyzátorom sa ochladí na laboratórnu teplotu, následne sa do autoklávu zavedie ďalších 560 g (12,7 mol) oxidu uhličitého, potom sa pridá 132 g (3 mol) etylénoxidu (99,8 %), pričom pridávanie etylénoxidu do zmesi sa uskutočňuje pomalým vstrekovaním etylénoxidu za miešania počas jednej hodiny. Po ukončení prídavku etylénoxidu sa zmes v autokláve mieša počas 260 hodín pri teplote 21 ’C.

3. Spracovanie

Autokláv sa pomaly odtlakuje na atmosférický tlak. Produkt sa vytrepe celkom 4 litrami dichlórmetánu, následne sa pridá 1035 ml 0,4 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej a získaná zmes sa mieša počas 3 hodín pri laboratórnej teplote. Fáza sa oddelí a organická vrstva sa dvakrát premyje 1,5 litrami 0,5 M roztoku kyseliny chlorovodíkovej a dvakrát sa premyje 2 litrami vody. Dichlórmetánový' roztok sa potom vysuší nad 120 g síranu sodného a zahustí sa na konečný objem asi 1 litra. Produkt sa vyzráža pomalým pridaním tohto roztoku do 3 litrov metanolu. Zrazenina sa vysuší počas 16 hodín za vákua pri teplote 40 ’C, pričom sa získa surový polymér, ktorý sa ďalej prečistí nasledujúcim spôsobom.

Získaný surový produkt sa rozpustí v dichlórmetáne a takto získaný roztok sa pridá do päťnásobného objemu acetónu počas 15 minút, pričom nastane vyzrážanie produktu. Zrazenina sa opäť rozpustí v dichlórmetáne, znova sa vyzráža z metanolu a vysuší sa za vákua pri teplote 40 ’C počas 16 hodín, pričom sa z í ska z odpovedá j úci poly(etylénkarbonát).

Fyzikálne vlastnosti získaného produktu:

Mw = 258000 Da, Mn = 35600 Da, Tg = 15,4 ’C.

Infračervené spektrum: silné absorpcie v oblasti 1751 a 1225 cm^-1.

Podľa výsledkov ^H-nukleárnej magnotickorezonančnej spektroskopie má produkt etylénkarbonátový obsah asi 96 %. 4,37 ppm.

Príklad 13

Experimentálny postup syntézy poly(etylénkarbonát)u pri použití katalyzátora pripraveného z dietylzinku a acetónu

132 g (3 mol) etylénoxidu sa kopolymerizuje s 600 g (13,6 mol) oxidu uhličitého počas 96 hodín pri teplote 50 ‘C a pri použití katalyzátora pripraveného z 8,43 g (145,16 mmol) acetónu a 19,62 g (159 mmol) dietylzinku.

Príprava katalyzátora a polymerizácia sa uskutočnili spôsobom, ktorý je analogický so spôsobom opísaným v príkladoch 7 až 11 s výnimkou spočívajúcou v tom, že pri príprave katalyzátora sa namiesto diolu použil acetón.

Takto získaný poly(etylénkarbonát) má etylénkarbonátový obsah 93 % a nasledujúce vlastnosti:

Mw = 233 kDa, Mn = 109 kDa, Mw/Mn = 2,14 a Tg = 22,4 ’C.

Príklad 14

Syntéza na koncovej skupine stearoylového poly(etylénkarbonát)u g poly(etylénkarbonát)u, ktorý má Mw = 153000 Da, Mn = 68900 Da a Tg = 29,1 ’C sa rozpustí v 30 ml bezvodého dichlórmetánu. K získanému roztoku sa postupne pridá 0,98 g (12,83 mmol) pyridínu a 10 g (33,0 mmol) stearolychloridu. Reakčná zmes sa mieša pri laboratórnej teplote počas 48 hodín, potom sa zriedi 50 ml dichlórmetánu a postupne sa premyje 2 x 50 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a vodou. Organická vrstva sa vysuší nad bezvodým síranom sodným a pro36 dukt sa vyzráža pridaním (po kvapkách) dichlórmetánového roztoku do 300 ml n-hexánu. Takto získaný surový produkt sa ďalej prečistí rozpustením v dichlórmetáne a vyzrážaním z trojnásobného objemu dietyléteru. Napokon sa produkt vysuší vo vákuu pri teplote 40 ’C poly(etylénkarbonát), ktorý skupine.

Mw = 144000 Da,

Mn = 71000 Da,

Tg = 25,6 ’C.

Príklad 15 počas 16 hodín, pričom sa získa je stearoylovaný na koncovej

Syntéza na koncovej skupine acetylovaného poly(etylénkarbonát)u g poly(etylénkarbonát)u, ktorý má Mw = 153000 Da, Mn = 68900 Da a Tg = 29,1 ’C sa rozpustí v 10 ml bezvodého dichlórmetánu. K získanému roztoku sa postupne pridá 0,98 g (12,83 mmol) pyridínu a potom ešte 10,08 g (98,7 mmol) anhydridu kyseliny octovej. Reakčná zmes mieša pri laboratórnej teplote počas 120 hodín. Reakčná zmes sa potom sa zriedi 50 ml dichlórmetánu a následne sa pomaly naleje 200 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného. Získaná zmes sa mieša počas 30 minút, potom sa vrstvy oddelia. Organická vrstva sa opäť premyje 150 ml nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a napokon vodu. Dichlórmetánový roztok sa vysuší nad bezvodým síranom sodným a produkt sa vyzráža pridaním tohto roztoku (po kvapkách) do 300 ml dietyléteru. Získaná zrazenina sa znova rozpustí v dichlórmetáne a opätovne vyzráža z dietyléteru. Získaný produkt sa vysuší vo vákuu pri teplote 40 ’C počas 16 hodín, pričom sa získa poly(etylénkarbonát) s terminálnou esterovou acetátovou skupinou.

Mw = 150000 Da,

Mn = 69100 Da, Tg = 26,8 ’C.

Príklad 16

Prečistenie poly(etylénkarbonát)u pôsobením vriacej vody g poly(etylénkarbonát)u (z príkladu 8, ktorý má Mw = 328000 Da, Mn = 149000 Da, Tg = 16,4 ’C) sa nakrája na malé kúsky a mieša sa v 50 ml vriacej dvakrát destilovanej vody počas 2 hodín. Voda sa odstráni a nahradí čerstvou vodou, ktorá sa znova zahreje na teplotu varu. Po ďalších 3 hodinách sa kúsky polyméru izolujú a vysušia za vákua pri teplote 40 ’C počas 16 hodín. Získaný produkt má nasledujúce fyzikálne vlastnosti:

Mw = 340000 Da,

Mn = 148000 Da, Tg = 28,3 ’C.

Je možné pozorovať dramatické zvýšenie teploty prechodu do sklovitého stavu, ktoré nie je možné pripísať zmene molekuovej hmotnosti polyméru.

Príklad 17

Prostriedok (mikročastice) s 1 % obsahom účinnej látky hIL-3

1. Príprava mikročastíc obsahujúcich účinnú látku g poly(etylénkarbonát)u (ktorý má Mw = 328000 Da z príkladu 8 (PEC)) sa rozpustí v 10 ml metylénchloridu, pričom toto rozpustenie sa uskutočňuje za miešania, následne sa k získanému roztoku pridá 12,1 mg ľudského interleukínu 3 (hIL-3) rozpusteného v 0,6 ml vody. Získaná zmes sa intenzívne mieša počas jednej minúty pri 20 000 otáčkach za minútu ( = vnútorná W/O fáza). 1 g želatíny A sa rozpustí v 2000 ml deionizovanej vody pri teplote 50 ’C a získaný roztok sa ochladí na teplotu 20 ’C (= vonkajšia W-fáza). W/O-fáza a W-fáza sa dôkladne zmiešajú. Týmto zmiešaním sa dosiahne, že vnútorná W/O-fáza sa homogénne disperguje vo vonkajšej W-fáze vo forme jemných kvapôčok. Výsledná trojitá emulzia sa pomaly mieša počas jednej hodiny. Pri tom dochádza k odpareniu metylénchloridu a z kvapôčok vnútornej fázy vzniknú mikročastice, ktoré následne stuhnú.

Po usadení mikročastíc sa supernatant odsaje a mikročastice sa izolujú filtráciou a odstredením a prepláchnu sa vodou, aby sa odstránila želatína. Napokon sa mikročastice lyofilyzujú pri použití manitolu ako sypkosť modifikujúceho činidla alebo sa vysušia vo vákuovej sušiarni (formulácie bez neobsahujúce manitol) počas 72 hodín, potom sa preosejú (sito s veľkosťou ôk 0,125 mm), pričom sa získa finálny produkt.

2. Placebo-formulácia g PEC z príklad 8 (Mw = 328 000) sa rozpustí v 10 ml metylénchloridu za miešania (vnútorná O-fáza). 1 g želatíny A sa rozpustí v 2000 ml deionizovanej vody pri teplote 50 ’C a roztok sa ochladí na 20 ’C (vonkajšia W-fáza). Ο-Fáza a W-fáza sa dokonale zmiešajú, čím sa dosiahne homogénne dispergovanie O-fázy vo forme drobných kvapôčok vo W-fáze. Získaná emulzia sa pomaly mieša počas jednej hodiny a potom sa spracuje vyššie opísaným postupom.

Príklady 18 až 26

Všetky ďalej opísané galenické formulácie sa pripravili pri použití poly(etylénkarbonát)ov syntetizovaných podľa príkladu 8 (tabuľka 3) a potom prečistili spôsobom, ktorý je analogický so spôsobom opísaným v príklade 16. Všetky tieto poly(etylénkarbonát)y majú Mw v rozmedzí od 300000 do 450000, etylénkarbonátový obsah vyšší ako 94 % a teplotu prechodu do sklovitého stavu (Tg) v rozmedzí od 18 do 50 ’C.

Príklad 18

Prostriedok (mikročastice) s obsahom hIL-2

2,9 mg ľudského interleukínu 2 (hIL-2) sa rozpustí v 1,5 ml vody a mikročastice s obsahom IL-2 sa pripravia spôsobom opísaným v príklade 17. Takto získané mikročastice sa lyofilizujú pri použití manitolu ako sypkost modifikujúceho činidla a preosejú sa (sito s veľkosťou ôk 0,125 mm), pričom sa získa finálny produkt.

Príklad 19

Prostriedok (mikročastice) s 0,2 % obsahom hIL-2 (bezvodý)

Táto formulácia sa pripraví spôsobom opísaným v príklade 18 s výnimkou spočívajúcou v tom, že 2,9 g ľudského interleukínu 2 priamo disperguje v organickej fáze (PEC rozpustený v metylénchloride).

Príklad 20

Prostriedky (implantáty) s 0,8 % obsahom hIL-3

1. Tvarované lisovanie (kompresné tvarovanie) mg mikročastíc tvorených 100 hmotnostnými % poly(etylénkarbonát) u (placebo) alebo 99 hmotnostnými % poly(etylénkarbonát) u a 1 hmotnostným % ľudského interleukínu 3 alebo

79,2 hmotnostnými % poly(etylénkarbonát)u, 20 hmotnostnými % manitolu a 0,8 hmotnostnými % ľudského interleukínu 3 sa _ŕ tvarovali lisovaním počas 3 minút pri teplote medzi 60 až °C a tlaku 16 MPa do tvaru implantátov (tabliet) s prieme* rom 5 mm. Tieto tablety sa potom skladovali pri teplote 4 ’C v uzatvorených liekovkách až do okamihu použitia pri testoch stanovujúcich uvolňovanie účinnej látky in vitro a in vivo.

2. Testy stanovujúce uvoľňovanie účinnej látky in vitro

Vždy tri tablety formulácie bez obsahu manitolu a manitol obsahujúcej formulácie obsahujúce ľudský interleukín 3 a placebo formulácie sa pretrepávali pri teplote 37 ‘C v syntetickom kultivačnom prostredí obsahujúcom 2,5 % objemu N- (2-hydroxyetyl) -piperazín-N ’ - (2-etánsulf ónove j kyseliny) (IM), 10 % objemu fetálneho teľacieho séra a 2 % objemu penicilín/streptomycínového roztoku. V časoch 0,5, 1, 2a 5 hodín a 1, 2, 3, 7, 14 a 20 dní od začiatku pretrepávania sa odoberajú vzorky kultivačného média a médium sa vždy obnoví. V odobraných vzorkách sa stanovuje obsah ľudského interleukínu pri použití testu ELISA.

3. Test stanovujúci uvolňovanie účinnej látky in vivo

Samčekovia krýs udržiavaní pri optimálnych podmienkach sa anestetizujú inhaláciou narkotika, potom sa každému pokusnému zvieraťu implantuje do subkutánnej kožnej tobolky jedna tableta formulácie s obsahom ľudského interleukínu 3 alebo jedna tableta placebo formulácie. Po 1, 4, 7, 14 a 21 dňoch sa krysy usmrtia predávkovaním inhalovaného narkotika. Zostávajúce časti tabliet sa vyberú, zbavia adherujúceho tkaniva a vysušia. Úbytok hmotnosti tabliet sa stanoví gravimetrický. Obsah ľudského interleukínu 3 v zostávajúcich častiach tabliet sa stanoví vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou alebo testom ELISA.

Príklad 21

Prostriedky ((w/o/w-mikročastice) s obsahom 0,0002 až 2 % hIL-2 g poly(etylénkarbonát)u sa rozpustí v 80 ml metylénchloridu za miešania magnetickým miešadlom. K získanému roztoku sa pridá príslušné množstvo IL-2 (113,2 mg pre 2 % obsah, 11,32 mg pre 0,2 % obsah, atď.) rozpustené v 6 ml destilovanej vody alebo vody s niekoľkými kvapkami etanolu. Zmes sa intenzívne premieša pri použití zariadenia Ultra-Turax, aby sa dosiahlo dispergovanie roztoku IL-2 v polymérne j fáze (= vnútorná W/O-fáza). 1 g želatíny A sa rozpustí v 200 ml 1/15 M fosfátového pufru (pH 7,4) pri teplote 50 °C a získaný roztok sa potom ochladí na teplotu 20 ’C (= vonkajšia W-fáza). W/O-Fázy a W-fáza sa dôkladne premiešajú, čím sa dosiahne to, že sa vnútorná W/O-fáza separuje do malých kvapôčok, ktoré sú homogénne dispergované vo vonkajšej W-fáze. Výsledná trojitá emulzia sa potom pomaly mieša počas jednej hodiny. V priebehu tohto času sa odparí metylénchlorid, čím príde k vytvoreniu mikročastíc z kvapôčok vnútornej fázy.

Po sedimentácii (alebo odstredení) mikročastíc sa supernatant odsaje a mikročastice sa izolujú vákuovou filtráciou a premyjú vodou, aby sa odstránila želatína. Napokon sa mikročastice vysušia vo vákuovej sušiarni počas 24 hodín, následne sa preosejú, pričom sa získa finálny produkt.

Účinnosť zapuzdrenia, stanovená vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou a bio-testom, sa pohybuje medzi 10 a 100 %.

Príklad 22

Prostriedok (s/o/w-mikročastice) s 0,0002 až 2 % obsahom IL-2

Táto formulácia sa pripraví spôsobom opísaným v príklade 21 s výnimkou spočívajúcou v tom, že IL-2 sa nerozpustí vo vode. Namiesto rozpustenia IL-2 sa táto účinná látka priamo disperguje v polymérnej fáze (= O-fáza). Účinnosť zapuzdrenia, stanovená vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou a biotestom, sa pohybuje medzi 10 a 100 % , Poznámka: množstvo polyméru, metylénchloridu, vody a účinnej látky sa mení v širokom rozmedzí, bez toho, aby sa menila ·* kvalita produktu. Dosiahol sa ešte vyšší obsah účinnej látky a to obsah až 20 %. Vo vonkajšej fáze je želatína nahradená ďalšími emulgátormi, akými sú napríklad polyvinylalkohol a podobné látky, alebo/ sa mení koncentrácia emulgátora/pufra. Separačné a sušiace postupy sa môžu nahradiť inými veľmi dobre známymi farmaceutickými technikami, ako napríklad filtráciou, lyofilizáciou a sušením rozprašovaním.

Príklad 23

Prostriedok (w/o/w- a a/o/w-mikročastice) s obsahom 1 % hGMCSF

Príprava tejto formulácie sa uskutočňuje spôsobom opísaným v príkladoch 21 a 22. Tu opísanými postupmi sa pripravia S/O/W- a W/O/W-preparáty. Účinnosť zapuzdrenia predstavuje pre W/O/W-formulácie 60 %, zatiaľ čo S/O/W-formulácie vykazujú nižšiu zapuzdrovaciu účinnosť.

Príklad 24

Prostriedok (w/o/w- a s/o/w-mikročastice) s 1 až 100 % obsahom oktretid-pamoátu (SMS-PA)

Príprava tejto formulácie sa uskutočňuje spôsobom opísaným v príkladoch 19 a 20. SMS-PA je však nerozpustný vo vode. Preto sa táto ^účinná látka disperguje a nie rozpustí vo vode pri príprave W/O/W-formulácií. Účinnosť zapuzdrenia, stanovená vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou, sa pohybuje medzi 20 a 100 %.

Príklad 25

Prostriedok w/o/w- a s/o/w-mikročastice) s 1 až 10 % obsahom oktreotid-acetátu

Príprava tejto formulácie sa uskutočňuje spôsobom opísaným v príkladoch 21 a 22. Účinnosť zapuzdrenia, stanovená vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou, sa pohybuje medzi 2 a 40 %, čo je jednoznačne nižšia účinnosť ako pri lipofilnom SMS-PA. Vyššie hodnoty sa získali pre S/O/W-formulácie potom, ako sa použila lyofilizovaná účinná látka (menšie častice účinnej látky).

Príklad 26

Uvoľňovanie oktreotid-pamoátu (SMS-PA z mikročastíc aplikovaných králikom a z implantátov aplikovaných králikom a krysám

Samčekom králikom (chinchilla bastard, telesná hmotnosť asi 3 kg) sa subkutánne implantujú poly(etylénkarbonát)ové disky alebo sa injikujú poly(etylénkarbonát)ové mikročastice (obsah účinnej látky 1,95 %) v množstve asi 2 mg účinnej látky/kg telesnej hmotnosti, zatiaľ čo samčekom krýs (Wistar, telesná hmotnosť asi 375 g) sa subkutánne implantujú poly(etylénkarbonát)ové disky. Každému pokusnému zvieraťu sa podá 40 mg (krysy) alebo 300 mg (králiky) polyméru s obsahom účinnej látky vo forme mikročastíc, prípadne mikročastíc zlisovaných do formy implantátu alebo vo forme suspenzie.

Diskové implantáty aplikovaná krysám a králikom mali priemer 0,5 resp. 1 cm a tieto implantáty sa získali postupom opísaným v príklade 20.

Pre stanovenie uvoľňovania účinnej látky sa po 14 a 21 dňoch odobrali vzorky krvi krysám, resp. králikom a zvyšky účinnej látky v implantátoch sa zmerali rádioimunologickýcm testom a vysokovýkonnou chromatografiou.

Stanovila sa lineárna korelácia medzi úbytkom hmoty poly(etylénkarbonát)u a uvoľňovaním SMS-PA (obr. 13) a to rovnako ako v prípade vysokomolekulárneho hIL-3 (obr. 11). Hlavný 75 % podiel implantovaného materiálu sa odbúral počas 3 týždňov po aplikácii králikom, zatiaľ čo hlavný podiel 95 % implantovaného materiálu sa odbúral počas 2 týždňov po aplikácii krysám. Zápalová reakcia (vrátane invázie polymorfojadrových leukocytov a ďalších buniek) je nevyhnutným predpokladom biologického odbúravania poly(etylénkarbonát)u. Dá sa predpokladať, že priebeh zápalovej reakcie bude druhovo špecifický pri zvýšení druhovo-špecifických profilov účinnej látky v krvnej plazme. Toto sa zistilo pre SMA-PA (obr. 12). Pri krysách prebieha biologické odbúravanie poly(etylénkarbonát)u oveľa rýchlejšie ako pri králikoch. U králikov rastie hladina SMS-PA pomaly až do okamihu, kedy sa dosiahne fáza konštatného uvoľňovania účinnej látky asi až deviaty deň a táto fáza trvá najmenej do dvadsiateho prvého dňa.

Príklad 27

Prostriedok (w/ó/w-mikročastice) s 0,0002 až 2 % obsahom rhIL-6 g poly(etylénkarbonát)u sa rozpustí v 80 ml metylénchloridu za miešania magnetickým miešadlom. K získanému roztoku sa pridá príslušné množstvo rhIL-6 (113,2 mg pre 2 % obsah, 11,32 mg pre 0,2 % obsah atď.) rozpustenej v 6 ml destilovanej vody alebo vody s niekoľkými kvapkami etanolu. Táto zmes sa potom intenzívne mieša pri použití zariadenia Ultra-Turax pre dispergovanie roztoku IL-6 v polymérnej fáze (= vnútorná W/O-fáza). 1 g želatíny A sa rozpustí v 200 ml 1/15 M fosfátového pufru (pH 7,4) pri teplote 50 ‘C a získaný roztok sa ochladí na teplotu 20 ‘C (= vonkajšia W-fáza). W/0a W-fáza sa intenzívne zmiešajú. Tým sa dosiahne, že W/O-fáza sa separuje do malých kvapôčok, ktoré sú homogénne dispergované vo vonkajšej W-fáze. Získaná trojitá emulzia sa pomaly mieša počas jednej hodiny, pričom sa metylénchlorid odparí a vytrdením kvapôčok vnútornej fázy vzniknú mikročastice.

Po usadení (alebo odstredení) mikročastíc sa supernatant odsaje a mikročastice sa izolujú vákuovou filtráciou a premyjú vodou pre odstránenie želatíny. Napokon sa mikročastice vysušia vo vákuovej sušiarni počas 24 hodín a preosejú sa, pričom sa získa finálny produkt.

Účinnosť zapuzdrenia, stanovená vysokovýkonnou kvapalinovou chromátografiou a bio-testom, sa pohybuje medzi 10 a 100 %.

Príklad 28

Prostriedok (s/o/w-mikročastice s obsahom 0,0002 až 2 % rhIL-6

Tieto formulácie sa pripravia spôsobom opísaným v príklade 27 s výnimkou spočívajúcou v tom, že sa IL-6 nerozpustí vo vode. Namiesto rozpustenia IL-6 sa táto účinná látka priamo disperguje v polymérnej fáze (= O-fáza). Účinnosť zapuzdrenia, stanovená vysokovýkonnou kvapalinovou chromátografiou, sa pohybuje medzi 10 a 100 %.

Poznámka: množstvo polyméru, metylénchloridu, vody a účinnej látky sa mení v širokom rozmedzí, bez toho aby prišlo k zmene kvality produktu. Dosiahli sa i vyššie obsahy účinnej látky a to až do 20 %. Vo vonkajšej fáze sa želatína nahradí ostatnými emulgačnými činidlami, napríklad polyvinylalkoholom a podobne. alebo/a sa môže meniť koncentrácia emulgačného činidla/pufru. Separačné a sušiace postupy, ktoré boli opísané vyššie, sa môžu nahradiť inými všeobecne známymi farmaceutickými postupmi, akými sú filtrácia, lyofilizácia a sušenie rozprašovaním.

Príklady 29 až 31

Použitie IL-6 pri liečení stavov mediovaných TFN-α alebo IL-1

Príklad 29

Zvierací model roztrúsenej sklerózy: chronicky recidívny experimentálne indukovaný alergický encefalomyelitický model pri krysách Lewis (CR-EAE)

Experimentálne indukovaný alergický encefalomyelitický stav (EAE) pri krysách je veľmi dobre preštudovaným modelom pre roztrúsenú sklerózu u ľudí (Paterson, Adv. Immunol. 51. 131-208 (1966), Levine a kol., Am. J. Parh, 47, 61 (1965), McFarlin a kol., J. Immunol. 113. 712 (1974), Borel, Transplant and Clin. Immunol 13., 3 (1981)). Krysám sa injikuje nervové tkanivo od iných druhov spoločne s adjuvans výsledná alergická odozva vedie k léziám na nervoch krýs, ktoré imitujú autoimunitné lézie produkované roztrúsenou sklerózou. Krysy čiastočne alebo celkom ochrnú, pričom závažnosť tohto chorobného stavu sa meria pri podaní a bez podania účinnej látky. Určitý počet účinných látok, akými sú napríklad steroidy a imunosupresívne činidlá, sú schopné oddialiť prepuknutie choroby, avšak nie sú schopné zabrániť recidívam po tom, ako už choroba prepukla.

Tento chronický recidívny experimentálne indukovaný alergický encefalitický model (CR-EAE) (Feúrer a kol., J. Neuroimmunol. 10, 159-166 (1985)) sa preto považuje za žiadúci model, ktorý veľmi presne imituje príznaky a ťažkosti pri roztrúsenej skleróze u pacientov, u ktorých táto choroba prepukla. V rámci tohto modelu sa choroba indukuje injekciou zmesi miechy morčaťa a Freudovho úplného adjuvans obohateného mikroorganizmom Mycobacterium tuberculosis. Typicky sa pri 75 až 80 % senzitizovaných krýs rozvinie CR-EAE vo forme 2 až 3 klinických recidív počas prvých 40 dní. Po 60 až 80 dňoch nastane pri približne 50 % krýs s CR-EAE ďalšia recidíva, po ktorej nasleduje úplná rekonvalescencia iba pri 35 % prípadoch. Zostávajúcich 65 % týchto zvierat vykazuje progresívny rozvoj choroby. Liečenie účinnou látkou začína na deň 16 po remisii z prvého prepuknutia choroby.

Každej kryse sa intraperitoneálne injikuje každý druhý deň po uvedenom šestnástom dni rekombinantný ľudský interleukín 6 (rh IL-6, Sandoz) rozpustený vo fyziologickom roztoku pri použití 10 mikrogramov IL-6 pre každú krysu (asi ⁵⁰ P9/^kg)· Kontrolné pokusné zvieratá a IL-6 skupina absolvuje zvyčajné prudké prepuknutie choroby (akútne) 11. až 14. deň. Pri použití stupnice závažnosti choroby od 0 do 4, kde 0 znamená stav bez príznakov choroby a 4 znamená úplné ochrnutie zvieraťa, má kontrolná skupina priemerné hodnotenie 3,0 a IL-6 skupina má priemerné hodnotenie 3,2. Podávanie IL-6 každý druhý deň počnúc uvedeným šestnástym dňom a končiac tridsiatym dňom (celkom 7 podaní) má za následok takmer úplnú inhibíciu choroby. Iba jedna z piatich krýs ošetrených účinnou látkou IL-6 vykazuje druhé mierne prepuknutie choroby (hodnotenie 0,4). Pri všetkých piatich kontrolných zvieratách nastalo druhé prepuknutie choroby s priemerným hodnotením 1,8 po šestnástom dni a tretie prepuknutie choroby v dňoch 22 až 29. Pri skupine pokusných zvierat ošetrených IL-6 sa nepozorovala žiadna ďalšia recidíva.

Príklad 30

Zvierací model pre artritídu: Borrelia-indukovaná artritída u myší s vážnou kombinovanou imunitnou nedostatočnosťou SCID - severe combined immunodeficiency)

Lymeova artritída (alebo Lymeova artritická choroba) predstavuje výlučnú formu chronickej artritídy. Táto choroba je jedným z prominentných znakov indukovaných infekciou spirochetou Borrelia burgdorferi prenášanou klieštami. Charakteristiky synoviálnych lézií u pacientov s Lymeovou artritídou sa veľmi podobajú charakteristikám synoviálnych lézií pacientov s reumatoidnou artritídou. Pri oboch skupinách pacientov sa dá pozorovať, hypertrofia výstelky kĺbovej dutiny, hyperplázia synoviálnych buniek, vaškulárna proliferácia a infiltrácia jednojadrových buniek do subsynoviálnych oblastí. Dochádza k výskytom mnohých plazmových buniek, endoteliálnych žiliek, rozptýlených makrofágov a obmedzeného počtu dentritických buniek pri intenzívnej antigénovej prezentácii MHC, trieda II. Okrem toho sa u pacientov trpiacich rôznymi artritídami detegovali v synoviálnej tekutine cytokíny, ako IL-1, IL-6 a TNF-α, čo vedie k domnienke, že tieto cytokíny môžu prispievať k patogenéze deštrukcie kĺbov. V nedávnom období bol vyvinutý myšací model Lymeovej artritídy pre myši s SCID, ktorým chýbajú funkčné T- a B-bunky (M.M. Šimon a kol., Immunolgy Today 12, 11 (1991)). Infekcia týchto imunodeficitných myší mikroorganizmom Borrelia burgdorferi vedie k prominentnej a perzistentnej oligoartritíde. Borrelia-indukovaná artritída u myší s SCID vykazuje odozvu na kortikosteroidy (prednisolon 30 mg/kg, subkutánne), avšak nevykazuje odozvu na imunosupresívne činidlá ako SIM (cyklosporín A) až po dávky 30 mg/kg, . subkutánne. Tento model sa preto považuje za dobrý model pre cytokínmi aktivovanú artritídu, vrátane ostatných typov attri* tídy, u ktorých nie je s istotou známy iniciačná príčina.

Šesť dní staré myši C.B-17 SCID (homozygotné pre mutáciu SCID, dostupné u Bomholtgard, Dánsko, 5 až 6 zvierat v skupine) sa inokulovali 100 mio. Borrelia burgdorferi subkutánnou injekciou do úpätia chvosta. Ako kontrolné pokusné zvieratá sa použili imunokompetentné myši C.B-17 (rovnaký zdroj). U týchto zvierat nedošlo po injekcii Borrelia burgdorferi k žiadnemu prepuknutiu choroby. Rekombinantný ľudský IL-6 (rhIL-6, Sandoz, zásobný roztok 5 mg/ml) sa zriedil fyziologickým roztokom a tento roztok sa podával päťkrát týždenne v celkovom počte 17 injekcií pri dávke 10 mikrogramov na myš intraperitoneálne.

Myši sa denne monitorovali pri porovnaní s kontrolnými zvieratami s cieľom zistenia klinických príznakov artritídy v tibiotarzálnych a ulnakarpálnych kĺboch. Klinická artritída sa vyhodnotila podľa nasledujúcej stupnice:

žiadny príznak ? diskutabilný príznak (+) sčervenanie kĺbov + mierny opuchanie ++ stredné opuchanie +++ silné opuchanie tibiotarzálnych a ulnakarpálnych kĺbov

Vo vrcholnom štádiu klinickej artritídy sa myši usmrtili a kĺby sa fixovali Schafferovým roztokom, zapuzdrené do plastickej hmoty 9100 a vyfarbené hematoxilíneozínom.

Skupina	Klinické znaky (počet počet) v dňoch:	opuchnutých kĺbov/celkový
13	14	15	16	17	20
Kontrolná skupina	0/30	0/30	0/30	0/30	0/30	0/30
SCID, bez IL-6	6,5/36 12,5/36	15/36	21/36	30/36	35/36
Artritída (%)	18	35	42	58	83	97
SCID, pri použití IL-6	4/30	3,5/30	11/30	7,5/30	12/30	10,5/30
Artritída (%)	13	12	37	25	40	35

Z vyššie uvedenej tabuľky je zrejmé, že myši SCID, ktoré neboli liečené IL-6, vykazujú vážne príznaky artritídy spôsobenej infekciou Borrelia burgdorferi počínajúc asi 13. deň po injekcii antigénu. Nízka dávka rhIL-6 znižuje závažnosť artritídy v priemere o asi 30 až 75 % pri všetkých infikovaných zvieratách.

Príklad 31

Murínny model pre septický šok

V rámci tohto príkladu bolo rozhodnuté skúmať účinky IL-6 na myšací model endotoxického šoku pri použití myší senzitivovaných d-galaktozamínom vzhľadom k tomu, že tento model sa v širokej miere používa ako model pre ľudský septický šok. Použila sa nasledujúca metóda a získali sa nasledujúce výsledky.

Samičky myší s telesnou hmotnosťou 18 až 22 g prinútené k odozve intraperitoneálnou injekciou 0,2 ml fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku obsahujúceho 0,15 mg/kg lipopolysacharidového endotoxínu (LPS) a 500 mg/kg d-galaktozamínu. Tieto myši sa potom rozdelili do skupín po 10 zvieratách, potom boli ošetrené nasledujúcim spôsobom:

Pokus 1

Cas		11:00	14:00	16:00
Skupina	1	PBS	LPS+d-Gal	PBS
Skupina	2	IL-6(50 Mg)	LPS+d-Gal	PBS
Skupina	3	PBS	LPS+d-Gal+IL-6(50 μ. g)	PBS
Skupina	4	PBS	LPS+d-Gal	IL-5(50 gg)

PBS = fosfátom pufrovaný fyziologický roztok

Pokus 2

Čas	11:00	14:00	16:00
Skupina 1	PBS	LSP+d-GAL	PBS
Skupina 2	IL-6(50 Mg)	LSP+d-GAL	PBS
Skupina 3	PBS	LSP+d-GAL+IL-6(100 gg)	PBS
Skupina 4	PBS	LSP+d-GAL+IL-6(20 pg)	PBS
Skupina 5	PBS	LSP+d-GAL+IL-6(5 Mg)	PBS
Skupina 6	PBS	LSP+d-GAL+IL-6(0,8 pg)	PBS
Skupina 7	PBS	LSP+d-GAL+IL-6(100 μς)	PBS
Skupina 8	PBS	LSP+d-GAL+IL-6(50 μς)	PBS
Skupina 9	PBS	LSP+d-GAL	IL-6(50 Mg)
rhIL-6 (ILS	969, Sandoz)	, rhIL-2 (Sandoz) a rhIL-4	(Sandoz) sa

zriedili vo fyziologickom roztoku. Všetky injekcie (objem 0,2 ml) sa aplikovali intraperitoneálne. V skupine 3 (pokus 1) a v skupinách 3 až 8 (pokus 2) IL-6 a IL-2 sa zriedili roztokom LPS/d-GAL, takže myši dostali jedinú 0,2 ml injekciu. Údaje o vzorkách v zátvorkách uvádzajú dávku interleukínu podanú každej myši. Násobné dávkovanie PBS bolo potrebné z dôvodu kontroly medziskupinovej variability v dôsledku stresom vyvolaných odoziev následkom manipulácie v rôznych časoch pred podaním LBS a po tomto podaní.

Prežitie pokusných zvierat sa pozorovalo počas 48 hodín. Pre účely štatistických výpočtov sa použil Chi-štvorcový model. Ako je zrejmé z obr. 1 uhynulo 9 z 10 kontrolných myší 24 hodín po podaní LBS. Podanie IL-6 3 hodiny pred injekciou LPS alebo 2 hodiny po injekcii LPS znížilo úmrtnosť na 60 % (p=0,12), resp. na 70 % (p=0,26). Naproti tomu podanie IL-6 v rovnakom čase, ako sa aplikovala injekcia LPS, znižuje úmrtnosť v skupine na 10 % (p < ako 0,01). Ochranný účinok je dlhodobý, pretože po 48 hodinách úmrtnosť v skupine 3 mierne vzrástla na 30 %, čo je stále ešte vysoko významná ochrana vzhľadom na kontrolnú skupinu. Úmrtnosť v skupine 4 sa zmenila zo 70 % na 80 %, zatiaľ čo žiadne zmeny sa nepozorovali v skupinách 1 a 2.

Na základe týchto výsledkov sa testoval účinok IL-6 pri rôznych dávkach. IL-6 sa podával v rovnakom čase ako sa aplikovala injekcia LPS, pretože podľa prvého pokusu sa zistilo, že takéto podanie je optimálne. Taktiež sa skúmal účinok IL-3 a IL-4, ktoré sa podávali tiež súčasne s LPS a to z dôvodu vylúčenia možnej existencie artefaktu v dôsledku použitia rekombinantných proteínov v preparáte LPS/d-GAL. Taktiež sa skúmalo, či bude IL-6 účinný pri ochrane myší proti endotoxickej smrti pri dávke 100 g/myš podanej pred injekciou LPS alebo po tejto injekcii.

Výsledky pokusu 2 (obr. 2) sú v súlade s výsledkami pokusu 1. Taktiež pri tomto pokuse chráni liečenie pri použití IL-6 myši pred endotoxickou smrťou. V prípade, že IL-6 sa podal spoločne s LPS, bola výsledná ochrana 24 hodín po podaní LPS dávkovo dependentná pri dávke 20 g/myš (30 % úmrtí, p=0,03), 4 g/myš (50 % úmrtí, p=0,16) a 0,8 g/myš (70 % úmrtí, p=0,61), zatiaľ čo pri dávke 100 g/myš (60 % úmrtí, p=33) boli myši chránené menej účinne ako pri dávke 20 g/myš. Preaplikácia alebo postaplikácia dávky 100 g IL-6/myš má za následok ochranu, ktorá je porovnateľná s ochranou dosiahnutou pri rovnakej dávke IL-6 v prípade, že IL-6 sa podáva spoločne s LPS. Rovnaké miery prežitia myší sa dosiahnu 48 hodín po podaní LPS.

IL-4 podaný súčasne s injekciou LPS sa stanovil ako neúčinný pre ochranu myší pred endotoxickou smrťou, zatiaľ čo IL-2 znižoval počet myší, ktoré prežili.

Claims (47)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Biologicky odbúrateľný polymér obsahujúci etylénkarbonátové jednotky vzorca A

   -(-C(0)-O-CH₂-CH₂-O-)- (A) ktorý má etylénkarbonátový obsah 70 až 100 mol. %, vnútornú viskozitu 0,4 až 4,0 dl/g v chloroforme a teplotu prechodu do sklovitého stavu 15 až 50 ’C.
2. 2. Polymér podľa nároku 1, ktorý má molekulovú hmotnosť (Mw) 100 000 až 2 000 000 stanovenú stanovenú gélovou permeačnou chromatografiou pri použití metylénchloridu ako elučného činidla a polystyrénu ako referenčnej látky.
3. 3. Polymér podľa nároku 1, ktorý má etylénkarbonátový obsah 90 až 100 mol %.
4. 4. Polymér podľa nároku 1, ktorý má vnútornú viskozitu 0,4 až 3,0 dl/g meranú pri koncentrácii 1 g/dl v chloroforme.
5. 5. Polymér podľa nároku 1, ktorý má teplotu prechodu do sklovitého stavu 18 až 50 ’C.
6. 6. Polymér podľa nároku 1, ktorý má etylénkarbonátové jednotky a etylénoxidové jednotky.
7. 7. Polymér podľa nároku 1, ktorý je vystavený účinku vriacej, dvakrát destilovanej vody počas 5 hodín a ktorý má po tomto spracovaní teplotu prechodu do sklovitého stavu 18 až 50 ’c.
8. 8. Polymér podľa niektorého z nárokov 1 až 7, ktorý ako ko-jednotku obsahuje etylénoxidovú jednotku vzorca B

   -(-CH -CH -O-)- (B) '22' '
9. 9. Polymér podľa niektorého z nárokov 1 až 8, ktorý má hydroxylovú skupinu ako koncovú polymérnu skupinu.
10. 10. Spôsob prípravy polyméru podľa niektorého z nárokov 1 až 8, vyznačený tým, že sa etylénoxid a oxid uhličitý polymerizujú pri teplote 10 až 80 ’C v molárnom pomere 1 : 4 až 1 : 5 v prítomnosti katalyzátora, ktorý sa pripraví reakciou dietylzinku a vody, acetónu, diolu, dial ebo trifenolu.
11. 11. Spôsob podľa nároku 10,vyznačený tým, že sa použije katalyzátor pripravený z dietylzinku a vody alebo acetónu v molárnom pomere od 0,9 : 1 do 1 : 0,9.
12. 12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačený tým, že sa použije katalyzátor pripravený z dietylzinku a di- alebo trifenolu v molárnom pomere od 2 : 1 do 1 : 2.
13. 13. Spôsob podľa nároku 10, vyznačený tým, že sa použije katalyzátor pripravený z dietylzinku a diolu v molárnom pomere 0,9 : 1 až 1 : 0,9.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13,vyznačený tým, že sa použije katalyzátor pripravený z dietylzinku a etylénglykolu.
15. 15. Spôsob podľa nároku 12, v y z n a č e n ý tým, že sa použije katalyzátor pripravený z dietylzinku a fluóroglucínu.
16. 16. Spôsob podľa niektorého z nárokov 10 až 15, v y z n ač e n ý t ý m, že sa uskutočňuje v rozpúšťadlovom alebo disperznom systéme organického rozpúšťadla a oxidu uhličitého.
17. 17. Spôsob podľa niektorého z nárokov 10 až 16, v y z n ač e n ý t ý m, že sa uskutočňuje pri tlaku od 2 do 7 MPa pri teplote od 10 do 80 C.
18. 18. Spôsob prípravy polyméru obsahujúceho hydroxylovú skupinu ako (ko)-polymérnu koncovú skupinu podľa nároku 9, vyznačený tým, že sa uskutočňuje spôsobom podľa z nárokov 11 až 16.
19. 19. Farmaceutický prostriedok, vyznačený tým, že obsahuje farmakologicky účinnú látku v polymére vykazujúcom nehydrolytickú povrchovú eróziu.
20. 20. Farmaceutický prostriedok farmaceutický účinnej látky v polymére podľa nároku 19,vyznačený tým, že vykazuje lineárnu koreláciu medzi uvoľňovaním účinnej látky a nehydrolytickým odbúravaním hmoty polyméru a účinnú ochranu účinnej látky v polymérnej matrici.
21. 21. Farmaceutický prostriedok, vyznačený tým, že obsahuje polymér podľa niektorého z nárokov 1 až 9.
22. 22. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 19 alebo 20, vyznačený tým, že obsahuje účinný proteín alebo peptid.
23. 23. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 22, vyznačený t ý m, že obsahuje cytokín.
24. 24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, vyznačený t ý m, že obsahuje interleukín.
25. 25. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 19, v y z n a č en ý t ý m, že má formu mikročastíc alebo implantátu.
26. 26. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 19 až 22, vyznačený tým, že v polymére alebo na pplymére obsahuje prísadu.
27. 27. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 26, vyznačený t ý m, že ako prísadu obsahuje radikálový skevendžer.
28. 28. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 26, vyznačený t ý m, že ako prísadu obsahuje polyol.
29. 29. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 28, vyznačený t ý m, že ako prísadu obsahuje alkoholový cukor.
30. 30. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 29, vyznačený t ý m, že ako prísadu obsahuje manitol.
31. 31. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 26 až 28,vyznačený tým, že obsahuje 1 až 90 % hmotnosti prísady, vztiahnuté na celkovú hmotnosť prostriedku.
32. 32. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 19, vyznačený t ý m, že je určený na parenterálne podanie interleukínu alebo CSF.
33. 33. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 32, vyznačený t ý m, že interleukín alebo CSF je v polymére podľa nároku 1.
34. 34. Spôsob podávania prostriedku podľa nároku 32 pacientovi, vyznačený tým, že sa prostriedok podá parenterálne pacientovi, ktorý potrebuje takéto liečenie.
35. 35. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 19 až 33, vyznačený tým, že ako prísadu obsahuje IL-6.
36. 36. Farmaceutický prostriedok, vyznačený tým, že obsahuje IL-6 v polymérnej matrici.
37. 37. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 36, vyznačený tým, že má mikročasticovú alebo implantoyateľnú formu.
38. 38. Farmaceutický prostriedok podľa č e n ý tým, že je určený na nároku 37, vyználiečenie autoimunitného alebo zápalového stavu.
39. 39. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 38, vyznačený tým, že je určený na liečenie roztrúsenej sklerózy.
40. 40. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 38, vyznačený tým, že je určený na liečenie reumatoidnej artritídy.
41. 41. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 38, vyznačený tým, že je určený na liečenie Lymeovej choroby.
42. 42. Použitie IL-6 pri výrobe liečiva určeného na obmedzenie alebo inhibíciu účinku IL-I alebo TNF-a.
43. 43. Použitie IL-6 podľa nároku 42 pri výrobe liečiva určeného na liečenie chronického alebo akútneho patogénom indukovaného zápalového stavu alebo demyelizačnej choroby.
44. 44. Použitie podľa nároku 43, pri ktorom je chorobou alebo stavom septický šok.
45. 45. Použitie podľa nároku 43, pri ktorom je chorobou alebo stavom roztrúsená skleróza.
46. 46. Použitie IL-6 podľa nároku 43, pri ktorom je chorobou alebo stavom Lymeova choroba.
47. 47. Použitie podľa niektorého z nárokov 42 až 46, pri ktorom je IL-6 chorobou rekombinantným ľudským IL-6.