PL177914B1

PL177914B1 - Nowe pochodne difluoropentapeptydu i środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL177914B1
Application number: PL93309638A
Authority: PL
Inventors: John Mcmillan Mciver
Original assignee: Procter & Gamble
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-16
Publication date: 2000-01-31
Also published as: PE5195A1; NO952485L; JPH08505143A; AU697299B2; AU5803994A; FI953106A0; CA2152267A1; BR9307728A; CZ286126B6; FI953106A; RU95113497A; RU2141971C1; KR950704350A; PL309638A1; NO952485D0; CZ164595A3; WO1994014842A1; HUT72977A; CN1095072A; EP0675901A1

Abstract

1 . Nowa pochodna difluoropentapeptydu o wzorze w którym (a) -X oznacza grupe cykloalkilowa zawierajaca od 4 do 15 atomów wegla, (b) n oznacza liczbe calkowita od 0 do 2, (c) -V- oznacza grupe -OC(O)-, (d) Z oznacza -NH-, (e)-R 1 wybrany jest z grupy obejmujacej prosta lub rozgaleziona grupe alkilowa, nasycona lub menasycona z jednym albo dwoma wiazaniami podwójnymi, zawierajaca od 1 do 6 atomow wegla, a atom wegla polaczony z R 1 jest w konfiguracji D lub L, (f) -R2 wybrany jest z grupy obejmujacej grupe aryloalkilowa w której czesc alkilowa jest nasycona i zawiera 1 -2 atomy wegla, a atom wegla polaczony z R2 jest w konfiguracji L, (i) -R3 oznacza grupe -(CH2 )m -A-NH2 lub -(CH2 )m - A-B-C(NH2 )=NH, w której m oznacza liczbe calkowita od 1 do 6, -A- oznacza wiazanie kowalencyjne, a -B- oznacza grupe -NH-, a atom wegla polaczony z -R3 - jest w konfiguracji L, (j) -R4 wybrany jest z grupy obejmujacej prosta lub rozgaleziona grupe alkilowa, nasycona lub nienasycona z jednym albo dwoma wiazaniami podwójnymi, zawierajaca od 1 do 6 atomow wegla, a atom wegla polaczony z R4 jest w konfiguracji D lub L, (k) -R5 oznacza grupe -(CH2 )m -A-NH2 lub -(CH2 )m -A-B-C(NH2 )=NH, w której m oznacza liczbe calkowita od 1 do 6, -A- oznacza wiazanie kowalencyjne, a -B- oznacza grupe -NH-, a atom wegla polaczony z -R5 jest w konfiguracji D lub L, oraz (1) Y oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, oraz jej farmaceutycznie dopuszczalne sole i hydraty PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne difluoropentapeptydu, przydatne jako leki przeciwzapalne.

Innym przedmiotem wynalazku sąnowe pochodne difluoropentapeptytu zmniejszające resorpcję kości i/lub heterotopowe tworzenie się kości, związane z reumatoidalnym zapaleniem stawów.

Przedmiotem wynalazku są również nowe środki farmaceutyczne zawierające pewne pochodne difluoropentapeptydu.

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna difluoropentapeptydu o wzorze

X-(CH₂)n -V-Z-CH-C(O)-NH-CH-C(O)-NH-CH

R'

C=O

YO-C(O)-CH-NH-C(O)-CH-NH-C(O)-CF₂ w którym (a) -X oznacza grupę cykloalkiłową zawierającą od 4 do 15 atomów węgla, (b) n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 2, (c) -V- oznacza grupę -OC(O)-, (d) Z oznacza -NH-, (e) -R¹ wybranyjest z grupy obejmującej prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową, nasyconą lub nienasycona z jednym albo dwoma wiązaniami podwójnymi, zawierającą od 1 do 6 atomów węgla; a atom węgla połączony z R1 jest w konfiguracji D lub L;

(f) -R² wybrany jest z grupy obejmującej grupę aryloalki lowća w której część alkilowa jest nasycona i zawiera 1-2 atomy węgla; a atom węgla połączony z R* jest w konfiguracji L;

(i) -R³ oznacza grupę -(CH2)_m-A-NH2 lub -(CH2)_m-A-B-C(NH2)=NH, w której m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a -B- oznacza grupę -NH-; a atom węgla połączony z -R3- jest w konfiguracji L;

(j) -R⁴ wybrany jest z grupy obejmującej prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową nasyconą lub nienasyconą/, jednym albo dwoma wiązaniami podwójnymi, zawierającą od 1 do 6 atomów węgla, a atom węgla połączony z R4 jest w konfiguracji D lub L;

(k) -R5 oznacza grupę -(CH2)m-A-NH2 lub -(CH2)m-A-B-C(NH2)=NH, w której m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a -B- oznacza grupę -NH-; a atom węgla połączony z -R⁵ jest w konfiguracji D lub L; oraz (l) Y oznacza atom wodoru lub grupę metylową, oraz jej farmaceutycznie dopuszczalne sole i hydraty.

177 914

Korzystnie w nowej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku (a) -V- oznacza grupę -OC(O)-, a -Z- oznacza grupę -NH-, (b) n równe jest 0 lub 1;

(c) m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5;

(d) -X oznacza nasyconą i nienasyconą grupę bicyklo lub tricykloalkilową zawierającą od 8 do 12 atomów węgla, (e) -R¹ wybrany jest spośród prostych lub rozgałęzionych grup alkilowych zawierających od 1 do 5 atomów węgla,

-R² oznacza grupę benzylową,

-R⁴ wybrany jest spośród prostych lub rozgałęzionych grup alkilowych zawierających od 1 do 5 atomów węgla.

Korzystnie w nowej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku (a) -R³ oznacza grupę -(CH2)_m-A-NH2, w której -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a m wynosi od 3 do 5;

(b) -Η⁵ oznacza grupę -(CIUjmA-B-CNlty^NH, w której -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, -B- oznacza grupę -NH-, a m wynosi od 2 do 4;

(c) -Y oznacza grupę metylową;

(d) -V- oznacza grupę -OC(O)-.

Korzystnie w nowej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku (a) -X oznacza grupę tricykloalkilową;

(b) -R1 oznacza nasycone i niepodstawione grupy alkilowe o prostym łańcuchu lub rozgałęzione, zawierające od 1 do 4 atomów węgla, a -R2 oznacza grupę benzylową.

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna difluoropentapeptydu o wzorze

O

X¹ - AA¹ - AA² - Aa3 - CF2 - C - Aa4 - Aa5 - OY w którym (a) -AA)- wybrany jest z grupy obejmującej tert-butyloglicyl, walil, izoleucyl, leucyl;

(b) -AA2- wybrany jest z grupy obejmującej fenyloalanyl, naftyloalanyl;

(c) -AA3-' wybrany jest z grupy obejmującej arginyl, lizyl, p-guanidynofenyloalanyl, p-amidynofenyloalanyl;

(d) -AA4- wybrany jest z grupy obejmującej leucyl i izoleucyl;

(e) -AA⁵- wybrany jest z grupy obejmującej arginyl, homoarginyl, lizyl;

(f) -X1 oznacza adamantyloksykarbonyl;

(g) -Y oznacza grupę metylowa, i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole i wodziany.

Korzystnie w nowej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku (a) -Aa⁵- oznacza arginyl;

(b) -AA3- oznacza lizyl;

(c) -X¹ oznacza adamantyloksykarbonyl.

Korzystnie w nowej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku (a) -AA1- wybrany jest z grupy obejmującej tert-butyloglicyl, walil i izoleucyl;

(b) -AA2- oznacza fenyloalanyl;

(c) -AA4- oznacza leucyl.

Korzystnie w nowej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku (a) -Aa1- oznacza tert-butyloglicyl;

(b) -X1 oznacza adamantyloksykarbonyl;

(c) -Y oznacza grupę metylową.

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny zawierający substancję czynnąi nośnik, charakteryzujący się tym, że jako substancję czynną zawiera od 0,1 do 95% wagowych no·

177 914 wej pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku i w uzupełnieniu do 100% wagowych farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, wybrany z grupy obejmującej odpowiedni stały lub ciekły wypełniacz, rozcieńczalniki lub substancje kapsułkujące odpowiednie dla podawania ludziom _ lub zwierzętom.

Środki farmaceutyczne zawierające związki według wynalazku stosowane są w leczeniu stanu zapalnego albo bólu.

W opisie wykorzystano następujące skróty. Skróty odnoszące się do aminokwasów mogą dotyczyć samych aminokwasów, albo jeszcze częściej reszt aminokwasów stanowiących część struktury peptydu lub pochodnej peptydu.

Arg	Arginyl
Om	Ornityl
Leu	Leucyl
Gly	Glicyl
t-Bug	tert-butyloglicyl
Phe	Fenyloalanyl
Adoc	Adamantyloksykarbonyl
Z	Benzyloksykarbonyl
Boc	tert-butyloksykarbonyl
DECP	Dietylocyjanofosfonian
Me	Metyl
Et	Etyl
TEA	Trietyloamina
TFA	Trifluorooctan
ipa	Izopropanol
Bn	Benzyl
Lys	Lizyl
TSA	Kwas toluenosulfonowy
THF	Tetrahydrofuran
HOBt	Hydroksybenzotriazol
DCC	Dicykloheksylokarbodiimid
DIPEA	N,N-diizopropyloetyloamina
Chg	Cykloheksyloglicyl
Cha	Cykloheksyloalanyl
Nal	Naftyloalanyl
Trp	Tryptofyl
Adg	Adamantyloglicyl
pGphe	p-guanidynofenyloalanyl
3,5-Dmadoc	3,5-dimetyloadamantyloksykarbonyl
eBroc	endo-bomyloksykarbonyl
Noc	N aftyloksykarbonyl
Moc	Mentyloksykarbonyl
Ad	Adamantoil
Fmoc	Fluorenylometoksykarbonyl
Ada	Adamantanoacetyl
Adac	Adamantyloaminokarbonyl
Mnoc	Morfolinyl
Norad	Noradamantoil
Hadoc	Homoadamantyloksykarbonyl
Foc	F enchyloksykarbonyl
Imoc	Izomentyloksykarbonyl
Ipoc	Izopinokamfanyloksykarbonyl
Ac	Acetyl
DMF	Dimetyloformamid

177 914

Do korzystnych przeciwzapalnych związków według wynalazku należą farmaceutycznie dopuszczalne sole powyższych związków. Do szczególnie korzystnych soli należą sole addycyjne utworzone między mocnymi kwasami i powyższymi związkami. Szczególnie korzystne sątakie sole addycyjne, w których -R³ i/lub -R5 sąprotonowane, tak że uzyskuje się dodatni ładunek przy grupach -R3 i -R⁵. Korzystne związki według wynalazku są często zasocjowane zjednąlub więcej , cząsteczkami wody w postaci hydratów.

Środki farmaceutyczne

Środki farmaceutyczne według wynalazku zawierająbezpieczną i skutecznąilość pochodnej difluoropentapeptydu określonej powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Środki takie zawierają, zazwyczaj od około 0,1 do około 95% wagowych pochodnej difluoropentapeptydu, korzystnie od około 1 do około 90%, a jeszcze korzystniej od około 5 do około 75%.

W użytym znaczeniu określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” oznacza jeden lub więcej kompatybilnych stałych lub ciekłych rozcieńczalników-wypełniaczy, albo substancji kapsułkujących, odpowiednich do podawania ludziom lub niższym zwierzętom. W użytym znaczeniu określenie „kompatybilny” oznacza, że składniki środka farmaceutycznego można mieszać z pochodną difluoropentapeptydu według wynalazku lub między sobą, w taki sposób, że nie wystąpią oddziaływania, które zasadniczo zmniejszą skuteczność farmaceutyczną środka w zwykłych warunkach stosowania. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki muszą być oczywiście nośnikami o wystarczająco wysokiej czystości i wystarczająco małej toksyczności, aby możnaje było podawać leczonym ludziom lub niższym zwierzętom.

Do pewnych przykładowych substancji, które mogą służyć jako farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, należącukry takiejak laktoza, glukoza i sacharoza; skrobie takiejak skrobia kukurydziana i skrobia ziemniaczana; celuloza i jej pochodne, takie jak sól sodowa karboksymetylocclulozy, etyloceluloza i octan celulozy; sproszkowana żywica tragakant; słód, żelatyny; talk; kwas stearynowy; stearynian magnezowy; siarczan wapniowy; oleje roślinne takie jak olej arachidowy, olej bawełniany, olej sezamowy, oliwa, olej kukurydziany i olej kakaowy; poliole takie jak glikol propylenowy, gliceryna, sorbitol, mannitol i glikol polietylenowy; kwas alginowy; woda pozbawiona pirogenów; izotoniczny roztwór soli; buforowe roztwory fosforanowe; masło kakaowe (podłoże czopków); emulgatory takie jak Tweens®, środki zwilżające i smarujące takie jak laurylosiarczan sodowy; środki barwiące; środki smakowo-zapachowe; stabilizatory; antyutleniacze; środki konserwujące; oraz inne nietoksyczne, kompatybilne substancje stosowane w środkach farmaceutycznych. Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik stosowany w środkach według wynalazku może zawierać inne kompatybilne dodatki farmaceutyczne i składniki czynne.

Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik wykorzystywany w połączeniu z pochodną difluoropentapeptydu według wynalazku stosuje się w stężeniu odpowiednim do uzyskania praktycznej zależności między wielkością i dawką. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki zazwyczaj stano wiałącznie od około 5 do około 99,9% wagowych, korzystnie od około 10 do około 99%, a jeszcze korzystniej od około 25 do około 95% środka farmaceutycznego według wynalazku.

Całkowite pojedyncze dawki pochodnych difluoropentapeptydu według wynalazku w środkach farmaceutycznych wynoszą zazwyczaj od około 1 mg do około 1000 mg, korzystnie od około 50 mg do około 800 mg, a jeszcze korzystniej od około 100 mg do około 500 mg.

Dobór farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika stosowanego w połączeniu z pochodnymi difluoropentapeptydu według wynalazku uzależniony jest od sposobu podawania składnika aktywnego. Do korzystnych sposobów podawania składników aktywnych według wynalazku należy iniekcja, podawanie doustne, inhalacja i stosowanie miejscowe.

Sposoby i materiały do wytwarzania środków do iniekcji znaleźć można w Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17 Ed., 1985, rozdział 85, str. 1518, przy czym pozycję tę wprowadza się jako źródło literaturowe. Zazwyczaj korzystne są 3 typy środków do iniekcji: (1) roztwory wodne; (2) roztwory niewodne; oraz (3) emulsje. Środek do iniekcji zawiera zazwyczaj od około 0,001 do około 10 mg/ml, a korzystnie od około 0,4 do około 0,6 mg/ml związku według wynalazku. Do korzystnych środków do iniekcj i według wynalazku należą sterylne wodne roztwory lub emulsje o pH od około 3 do około 8 (a jeszcze korzystniej o pH od około 4 do około 6).

Do korzystnych nośników farmaceutycznych, w których pochodne difluoropentapeptydu według wynalazku podawać można doustnie, należąmikrokapsułki proteinowe ujawnione w na177 914 stępujących opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 895 725, 4 925 673, 4 976 968,4 983 402, przy czym wszystkie cztery opisy wprowadza sięjako źródła literaturowe.

Sposoby uzyskiwania działania przeciwzapalnego i znieczulającego u ludzi lub niższych zwierząt w wyniku podawania wymagaj ącemu takiego leczenia człowiekowi lub niższemu zwierzęciu bezpiecznej i skutecznej ilości pochodnej difluoropentapeptydu według wynalazku. Ilość tą można podawać w postaci jednej dawki lub wielu dawek w czasie leczenia. Jakkolwiek dawki wyższe od podanych w opisie skutecznie ograniczają, stan zapalny i działają znieczulająco, w przypadku pewnych osobników należy zachować ostrożność, tak aby zapobiec niekorzystnym skutkom ubocznym. Pochodne difluoropentapeptydu i środki według wynalazku stosować można w celu zmniejszenia stanu zapalnego w różnych zaburzeniach głębszych narządów, mięśni, ścięgien, kaletek i stawów, związanych z chorobą i urazem, w celach leczniczych i w celu zapobiegania bólom.

Do korzystnych sposobów podawania pochodnych difluoropentapeptydu według wynalazku należy iniekcja, podawanie doustne, inhalacja i stosowanie miejscowe. Do konkretnych sposobów stosowania należy, bez żadnych ograniczeń, podawanie doustne; iniekcja, np. domięśniowa, dożylna, dootrzewnowa, śródskórna; inhalacja; oraz stosowanie miejscowe, np. przezskórnie, doustnie, dośluzówkowo i podjęzykowo.

W użytym znaczeniu określenie „bezpieczna i skuteczna ilość” oznacza ilość pochodnej difluoropentapeptydu lub środka farmaceutycznego na tyle wysoką, aby znacząco dodatnio zmodyfikować leczony stan, ale równocześnie na tyle niską, aby uniknąć poważnych skutków ubocznych (przy rozsądnym stosunku korzyści do ryzyka), w zakresie uznanej wiedzy medycznej. Bezpieczna i skuteczna ilość pochodnej difluoropentapeptydu lub środka farmaceutycznego będzie zmieniać się w zależności od konkretnego leczonego stanu, wieku i stanu fizycznego leczonego pacjenta, ostrości stanu chorobowego, czasu leczenia, charakteru równoczesnej terapii i konkretnego stosowanego składnika aktywnego, konkretnego stosowanego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika i innych podobnych czynników, w zakresie wiedzy i doświadczenia nadzorującego lekarza.

Korzystne dzienne dawki pochodnych difluoropentapeptydu według wynalazku wynosi od około 0,1 do około 500 mg/kg wagi ciała, jeszcze korzystniej od około 1 do około 100 mg/kg, a szczególnie korzystnie od około 2 do około 50 mg/kg. Dziennie podawać można od 1 do około 4 pojedynczych dawek, a jeszcze korzystniej od około 2 do około 3 pojedynczych dawek. Korzystne ilości pochodnych difluoropentapeptydu podawanych przez iniekcję wynoszą od około 0,1 do około 50 mg/kg/dzień, ajeszcze korzystniej od około 1 do około 10 mg/kg/dzień. Korzystne ilości pochodnych difluoropentapeptydu przy podawaniu doustnym wynoszą od około 1 do około 500 mg/kg/dzień, a jeszcze korzystniej od około 5 do około 100 mg/kg/dzień. Korzystne ilości pochodnych difluoropentapeptydu przy inhalacji wynoszą od około 0,11 do około 500 mg/kg/dzień, a jeszcze korzystniej od około 5 do około 100 mg/kg/dzień. Korzystne ilości pochodnych difluoropentapeptydu przy stosowaniu miejscowymwynosząod około 1 do około 500 mg/kg/dzień, ajeszcze korzystniej od około 50 do około 250 mg/kg/dzień.

Sposoby syntezy związków

Poniższe schematy i przykłady nie ograniczając zakresu wynalazku ilustrują sposoby wytwarzania pochodnych difluoropentapeptydu według wynalazku.

I. Wytwarzanie Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys-C(O)-CF2-C(O)-Leu-Arg-OMe

Adoc-D-t-Bug-OH - Do roztworu 48,8 g (0,370 mola) D-tert-butyloglicyny w 371 ml 1N NaOH i 159 ml dioksanu w 0°C dodano 33,9 g (0,40 mola) NaHCO3, a następnie wkroplono roztwór 80,0 g (0,40 mola) fluoromrówczanu adamantylu w 371 ml dioksanu w ciągu 3 godzin. Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 0,5 godziny, po czym łaźnię chłodzącą usunięto. Roztwór mieszano przez 3 godziny, po czym pH doprowadzono do 10 za pomocą 1N NaOH. Roztwór wyekstrahowano EtOAc, a pozostałą fazę wodną zakwaszono do pH 3. Kwaśny roztwór wyekstrahowano EtOAc, który następnie wysuszono i rozpuszczalnik usunięto uzyskując 118 g produktujednorodnego na podstawie TLC (94/5/1 C^Cty/ipa/AcOH), Rf= 0,90.

Adoc-D-t-Bug-Phe-OBn - Do roztworu 115 g (0,37 mola) Adoc-D-t-Bug-OH i L-Phe-OBn. pTSA (0,36 mola) w 1 litrze C^C^ dodano 74,6 g (0,74 mola) TEA, a następnie 60,8 g (0,37 mola) DECP i uzyskaną mieszaninę reakcyjnąmieszano przez noc. Rozpuszczalnik usunięto, a produkt ponownie rozpuszczono w EtOAc i przemyto kolejno solanką, 0,4N HCl i nasyconym roztworem Na10

177 914

HCO3. Roztwor wysuszono, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 186 g produktu. TLC (85/15 - heksan/EtOAc) Rf= 0,40.

Adoc-D-t-Bug-Phc-OH (1) - Do suchej kolby dodano w atmosferze azotu 34,0 g 5% Pd na węglu. Kolbę schłodzono do -78°C i dodano 200 ml suchego, odgazowanego MeOH. Do uzyskanej zawiesiny dodano 8,8 ml 88% kwasu mrówkowego, a następnie mieszaninę 36,0 g Adoc-D-t-Bug-Phe-OBn (0,066 mola) w 100 ml MeOH i 4,4 ml kwasu mrówkowego. Łaźnię chłodzącą usunięto i zawiesinę mieszano przez 2 godziny. Następnie dodano 200 ml 4,4% kwasu mrówkowego w MeOH i zawiesinę mieszano przez noc. Mieszaninę przesączono przez bibułę z włókien szklanych w atmosferze azotu. Przesącz ponownie przesączono przez złoże Celitu w celu całkowitego usunięcia śladów katalizatora. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano 17,3 g produktu.

α-Boc, E-Z-Lys-C(OH)-CF2-C(O)-OEt (3) - Do roztworu 79,2 g (1,21 mola) uaktywnionego cynku w 0,600 litra THF dodano 2,36 g bromodifluorooctanu etylu i roztwór doprowadzono do wrzenia. Po dojściu do wrzenia wkroplono mieszaninę 236 g (1,16 mola) bromodifluorooctanu etylu i 176 g (0,485 mola) (2) w 1,8 litra THF. Synteza (2) - patrz J. Burkhart, N. Peet i P. Bey, „A Novel Method for the Preparation of Peptidyl α-Keto Esters”, Tetrahedron Letters, 31, nr 10. 1385-1388 (1990). Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, schłodzono i reakcję przerwano dodając nasycony roztwór KHSO4. Produkt rozcieńczono EtOAc i przemyto kolejno nasyconym roztworem KHSO4, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką, po czym mieszaninę wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 68,0 g czystego produktu. Rf = 0,20, 75/25 heksan/EtOAc.

α-Boc, E-Z-Lys-C(OH)-CF₂-C(O) -ONa (4) - Do roztworu 1,00 g (0,002 mola) (3) w 10 ml MeOH dodano 2 ml 1N NaOH i roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość rozpuszczono w niewielkiej ilości wody i mleczny roztwór wyekstrahowano eterem. Z fazy wodnej usunięto wodą, a pozostałość dokładnie wysuszono umieszczając ją pod pompą próżniową na 24 godziny. Uzyskano 0,069 g produktu.

α-Boc, Z-Z-Lys-C(OH)-CF2-C(O)-Leu-Arg(NO2) -OMe (5) -. Do roztworu 0,500 g (1,03 mmola) (4) i 0,470 g (1,26 mmola) Leu-Arg(NO2) -OMe -HCl w 30 ml DMF dodano wjednej porcji 0,019 g (1,26 mmola) HOBt Następnie wkroplono 0,260 g (1,26 mmola) DCC w 3 ml DMF. Na koniec dodano 0,003 ml DIPEa i roztwór mieszano przez 48 godzin. DMF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w EtOAc. Roztwór przeniesiono do rozdzielacza i przemyto 0,1N HCl, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Warstwę octanu etylu wysuszono nad .MgSO4, przesączono i rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 0,420 g produktu. Rf= 0,68,90/10 C^C^/MeOH.

I-Z-Lys-C(OH)-CF2-C(O)-Leu-Arg(NO2)-OMe‘ HCl Do roztworu (5) (17,3 g, 0,022 mola) w 200 ml dioksanu dodano 66,8 ml (0,220 mola) 3,3M HCl w dioksanie i uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Dodano kolejną porcję 5 ml 3,3M HCl w dioksanie i roztwór mieszano dodatkowo przez 0,25 godziny. Rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość umieszczono pod pompąprózniową. Stałąpozostałość ucierano z eterem w atmosferze azotu, po czym przesączono. Uzyskano 16,0 g białej substancji stałej.

Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys(Z) -C(OH)-CF2-C(O)-Leu-Arg(NO₂) -OMe (6) - Do roztworu 16,0 g pozostałości z poprzedniej reakcji (0,022 mola) i 11,1 g (1) (0,024 mola) w 300 ml CH₂Cl₂ wkroplono 6,69 g (0,048 mola) TeA, a następnie wkroplono 3,64 ml (0,048 mola) DECP. Roztwór mieszano przez noc, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc i przemyto kolejno 0,1N HCl, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Roztwór wysuszono, po czym rozpuszczalnik usunięto otrzymując 26,6 g produktu, który oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 12,7 g czystego produktu. Rf = 0,85, 90/10 C^C^/MeOH.

Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys(Z)-C(O)-CF₂-C(O)-Leu-Arg(NO2)-OMe - Do zawiesiny 14,3 g (0,034 mola) nadjodynianu Dessa-Martinaw 1,15 litra CH2O2 dodano 0,910 ml suchej pirydyny, po czym wkroplono 12,7 g (0,011 mola) (6) w 2,3 litra CH₂Cl₂. Wytwarzanie nadjodynianu Dessa-Martina - patrz D. Dess i J. Martin, Journal of Organie Chemistry, 48,4155-4156 (1983). Zawiesinę mieszano przez 2 godziny, po czym dodano 58,7 g (0,24 mola) Na2S₂O4 w nasyconym roztworze NaHCO3 i uzyskany roztwór mieszano przez 0,5 godziny. Fazy rozdzielono i fazę wodną wyekstrahowano octanem etylu. Połączone fazy organiczne wysuszono i rozpuszezalnik

177 914 usunięto otrzymując- 13,9 g produktu, który zastosowano bez oczyszczania w następnym etapie. (Rf = 0,30, 95/5 CH2Cl2/MeOH).

Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys-C(O)CF₂C(O)-Leu-Arg-OMe (7) - Do roztworu 13,4 g (0,012 mola) pozostałości z poprzedniej reakcji w 200 ml suchego DMF dodano 6 g czerni palladowej i uzyskaną zawiesinę odgazowywano przez 0,5 godziny. Do zawiesiny dodano 8 ml 3,3M HCl w dioksanie. Mieszaninę reakcyjną umieszczono w wytrząsarce Parra i uwodorniano przez 6 godzin. Zawiesinę przesączono przez Celit i rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie metodą HPLC z odwróconymi fazami (CH3CN/H2O) uzyskując 6,5 g produktu.

1) Dess-Martin

2) H2/czerń Pd

CF,

177 914

II. Wytwarzame Adoe-D-t-c3ug-Phe-Arg-C(C))-Ci'2-C(O2-Ala-Arg-OMe

Adoc-D-t-Bug-OH - Do roztworu 48,8 g (0,370 mola) D-tert-butyloglicyny w 371 ml 1N NaOH i 159 ml dioksanu w 0°C dodano 33,9 g (0,40 mola) fluoromrówczenu adamantylu w 371 ml dioksanu w ciągu 3 godzin. Mieszaninę reakcyjną mieszano w tej temperaturze przez 0,5 godziny, po czym łaźnię chłodzącą usunięto. Roztwór mieszano przez 3 godziny, po czym pH doprowadzono do 10 za pomocą 1N NaOH. Roztwór wyekstrahowano EtOAc, a pozostałą fazę wodną zakwaszono do pH 3. Kwaśny roztwór wyekstrahowano EtOAc, który następnie wysuszono i rozpuszczalnik usunięto uzyskując 118 g produktu jednorodnego na podstawie TLC (94/5/1 C^C^/ipa/AcOH), Rf= 0,90.

Adoc-D-t-Bug-Phe-OBn - Do roztworu 115 g (0,37 mola) Ddoc-D-t-Bug-OH i L-Phe-OBn pTSA (0,36 mola) w 1 litrze CH2G2 dodano 74,6 g (0,74 mola) TEA, a następnie 60,8 g (0,37 mola) DECP i u/yskanąmies/aninęreakcyjnąmieszano przez noc. Rozpuszczalnik usunięto, a produkt ponownie rozpuszczono w EtOAc i przemyto kolejno solanką, 0,4N HCl i nasyconym roztworem NaHCO3. Roztwór wysuszono, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano cgromatografic/nie na krzemionce uzyskując 186 g produktu. TLC (85/15 - heksan/EtOAc) Rf = 0,40.

Ddoc-D-t-Bug-Pge-OH (1) - Do suchej kolby dodano w atmosferze azotu 34,0 g 5% Pd na węglu. Kolbę schłodzono do -78°C i dodano 200 ml suchego, odgazowanego MeOH. Do uzyskanej zawiesiny dodano 8,8 ml 88% kwasu mrówkowego, a następnie mieszaninę 36,0 g Adoc-D-t-Bug-Phe-OBn (0,066 mola) w 100 ml MeOH i 4,4 ml kwasu mrówkowego. Łaźnię chłodzącą usunięto i zawiesinę mieszano przez 2 godziny. Następnie dodano 200 ml 4,4% kwasu mrówkowego w MeOH i zawiesinę mieszano przez noc. Mieszaninę przesączono przez bibułę z włókien szklanych w atmosferze azotu. Przesącz ponownie przesączono przez złoże Celitu w celu całkowitego usunięcia śladów katalizatora. Po usunięciu rozpuszczalnika otrzymano 17,3 g produktu.

α-Boc, Σ-Z-Lys-C(OH)-AF2-C(O)-OEt (3) - Do roztworu 79,2 g (1,21 mola) uaktywnionego cynku w 0,600 litra THF dodano 2,36 g bromodifluorooctanu etylu i roztwór doprowadzono do wrzenia. Po dojściu do wrzenia wkroplono mieszaninę 236 g (1,16 mola) bromodifluorooctanu etylu i 176 g (0,485 mola) 2 w 1,8 litrze THF. Roztwór ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, schłodzono i reakcję przerwano dodając nasycony roztwór KHSO4. Produkt rozcieńczono EtOAc i przemyto kolejno nasyconym roztworem KHSO4, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką, po czym mieszaninę wysuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 68,0 g czystego produktu. Rf = 0,20, 75/25 heksan/EtOAc.

α-Boc, S-Z-Lys-C(OH)-CF2-C(O)-ONa (4) - Do roztworu 1,00 g (0,002 mola) 3 w 10 ml MeOH dodano 2 ml 1N NaOH i roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość rozpuszczono w niewielkiej ilości wody i mleczny roztwór wyekstrahowano eterem. Z fazy wodnej usunięto wodę, a pozostałość dokładnie wysuszono umieszczając ją pod pompą próżniową na 24 godziny. Uzyskano 0,069 g produktu.

α-Boc, Z-Z-Lys-C(OH)-CH2-C(O)-Leu-Arg(NO₂)-OMe (5) - Do roztworu 0,500 g (1,03 mmola) 4 i 0,470 g (1,26 mmola) Leu-Arg(NO2)-OMe -HCl w 30 ml DBM dodano wjednej porcji 0,019 g (1,26 mmola) HOBt. Następnie wkroplono 0,260 g (1,26 mmola) DCC w 3 ml DMF. Na koniec dodano 0,003 ml DIPEA i roztwór mieszano przez 48 godzin. DMF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w EtOAc. Roztwór przeniesiono do rozdzielacza i przemyto 0,1N HCl, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Warstwę octanu etylu wysuszono nad MgSO4, przesączono i rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 0,420 g produktu. Rf= 0,68,90/10 C^C^/MeOH.

Σ-Z-Lys-A(OH)-AH2-A(O)-Leu-Drg(NO₂)-OMe · HCl Do roztworu 5(17,3 g, 0,022 mola) w 200 ml dioksanu dodano 66,8 ml (0,220 mola) 3,3M HCl w dioksanie i uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Dodano kolejną porcję 5 ml 3,3M HCl w dioksanie i

177 914 roztwór mieszano dodatkowo przez 0,25 godziny. Rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość umieszczono pod pompąpróżniową. Staląpozostałość ucierano z eterem w atmosferze azotu, po czym przesączono. Uzyskano 16,0 g białej substancji stałej.

Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys(Z)-C(OH)-CH2-C(O)-Leu-Arg(NO2) -OMe (6) - Do roztworu 16,0 g pozostałości z poprzedniej reakcji (0,022 mola) i 11,1 g 1 (0,024 mola) w 300 ml CH₂C1₂wkroplono 6,69 g (0,048 mola) TEA, a następnie wkroplono 3,64 ml (0,048 mola) DECP. Roztwór mieszano przez noc, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc i przemyto kolejno 0,1N HCl, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Roztwór wysuszono, po czym rozpuszczalnik usunięto otrzymując 26,6 g produktu, który oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 12,7 g czystego produktu. Rf = 0,85, 90/10 CH₂Cl₂/MeOH.

Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys(Z)-C(O)-CF2-C(O)-Leu-Arg(NO2)-OMe - Do zawiesiny 14,3 g (0,034 mola) nadjodynianuDessa-Martina w 1,15 litra CH₂Cl₂ dodano 0,910 ml suchej pirydyny, po czym wkroplono 12,7 g (0,011 mola) (6) w 2,3 litra CH₂Cl₂. Zawiesinę mieszano przez 2 godziny, po czym dodano 58,7 g (0,24 mola) Na2S₂O4 w nasyconym roztworze NaHCO3 i uzyskany roztwór mieszano przez 0,5 godziny. Fazy rozdzielono i fazę wodną wyekstrahowano octanem etylu. Połączone fazy organiczne wysuszono i rozpuszczalnik usunięto otrzymując 13,9 g produktu, który zastosowano bez oczyszczania w następnym etapie. (Rf = 0,30,95/5 CHjCf/MeOH).

Adoc-D-t-Bug-Phe-Lys-C(O)CF₂C(O)-Leu-Arg-OMe · TFA (7) - Do roztworu 13,4 g (0,012 mola) pozostałości z poprzedniej reakcji w 200 ml suchego DMF dodano 6 g czerni palladowej i uzyskaną zawiesinę odgazowywano przez 0,5 godziny. Do zawiesiny dodano 8 ml 3,3M HCl w dioksanie. Mieszaninę reakcyjną umieszczono w wytrząsarce Parra i uwodorniano przez 6 godzin. Zawiesinę przesączono przez Celit i rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie metodą HPLC z odwróceniem faz (CltyCN/ltyO/TFA) uzyskując 6,5 g produktu.

-Boc, γ-Bn, y-Z-Orn-C(OH)-CF₂-C(O)OEt (9) - Do roztworu 5,67 g (0,087 mola) uaktywnionego cynku w suchym THF dodano 1,0 g bromodifluorooctanu etylu i mieszaninę ogrzano do wrzenia. Dodano wówczas 15,2 g (0,037 mola) -Bn, -Z- -Boc-omitynalu 8 i 16,9 g (0,083 mola) bromodifluorooctanu etylu, po czym zawiesinę ogrzewano we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną przez 0,5 godziny. Roztwór schłodzono i reakcję przerwano dodając nasycony roztwór KHSO4. Roztwór rozcieńczono EtOAc, po czym przemyto nasyconym roztworem KHSO4, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Roztwór wysuszono, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 6,58 g produktu o Rf = 0,22, 99/1 CH2Cl2/ipa.

α-Boc, y-Bn, y-Z-Orn-C(OH)-CF2-C(O)ONa. Ester 9 (0,965 g, 1,71 mmola) rozpuszczono w 15 ml MeOH i dodano 1,71 ml 1N NaOH. Roztwór mieszano przez 3 godziny, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość umieszczono pod pompą próżniową na noc i zastosowano w takiej postaci w następnej reakcji (0,870 g).

α-Boc, γ-Bn, y-Z-Om-C(OH)-CF2-C(O)-Ala-Arg(NO2) -OMe 10 - Do roztworu 0,870 g (1,56 mmola) surowego produktu z poprzedniej reakcji i 0,579 g (1,90 mmola) Ala-Arg(NO2)-OMe · HCl w 80 ml DMF dodano 0,283 g (2,09 mmola) HOBt, a następnie kolejno 0,392 g (1,90 mmola) DCC w 20 ml DMF i 0,068 g (0,39 mmola) DIPEA. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc, po czym przemyto 0,1N HCl, nasyconym roztworem NaHCO3 i solanką. Roztwór wysuszono, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 0,520 g produktu (Rf - 0,20 i 0,22).

a-Boc-Orn-C(OH)-CF2-C(O)-Ala-Arg(NO2)-OMe - Tripeptyd 10 (0,338 g, 0,43 mmola) rozpuszczono w 10 ml DMF i dodano 0,15 g czerni palladowej. Zawiesinę odgazo wano i dodano 0,20 ml 4,0 M HCl w dioksanie. Mieszaninę uwodorniano przez noc w aparacie Parra, po czym przesączono przez Celit. Pozostałość ponownie rozpuszczono w MeOH i dodano 0,20 g

177 914

Pd(OH)2. Zcwieaizy uwodorniano w opcrccie Porra p-unu 24 godziny pod ailzinziew 35,2 kPo. Zcwiegizę p-znaoauozo p-unu Celij, po czym -oupuauauolzlk usunięto. PJUogJcłJlć ucgJJgowczJ w następnej reakcji bez oazęszazozlo.

α-BJa-Arg(Z)₂-C(OH)-CF₂-C(O)-Alc-A-g(NO2)-OMn (11) - Surową cwizę (0,220 g, 0,39 wwoIc) -oupuguauozJ w THF i dodano 0,325 g (0,91 wwoIc) N,N-blg-Z-S-wntyloiuotiJmoήζ^ο. Do roztworu tego dodano 0,150 g Hg(OAc)₂ (0,47 mwola) i winguozizę -eokaęjzą wieguazo przez noc. Roztwór -ozcieńczozo EtOAc i przemyto kolejno 0,1N HCl, zasyconym roztworem NOHCO3 i solanką. Fazę organiczną wysuszono, po czym roupugzauolzik usunięto. Pozostałość ocuęszczazo chromotogrofiauzie no eęzemiozce uzyskując 0,170 g produktu w pogtaci wieszknieę dloate-eolzJwerów. Rf = 0,60. 0,62, 5% MeOH w CH^Cf.

Adoc-D---Bug-Phn-A-g(Z)2-C(OH)-CΠ2-C(O)-Ala-A-g(N O2)-OMe (12) - Do roztworu 0,228 g (0,262 wwola) 11 w 5 ml dioksanu dodano 0,656 ml HCl w dioksanie. Roztwór mingzano przez 1 godzinę, po czym dodano kolejeopJrcję 0,656 ml HCl w dioksanie. Po dodatkowym wIugzaniu przez 1 godzinę rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość umieszczono no noc pod pompą próżniową. Zhydrolizowany produkt roupugzcuozo w 5 ml CH2G2 i połączono z 0,120 g (0,262 mmolo) Adoa-D-j-Bug-Phn-OH. Do roztworu tego dodano 0,073 ml (0,525 mmola) TEA, o następnie 0,043 mmolo DECP. Uzyskaną mieguknieę reakcyjną minszozo przez noc.. Rozpuszczalnik usunięto, o pozJatołolć oazygzczoeJ ahrowajogęoficzzin na eęznmlJnae uzyskując 0,086 g produktu w postaci miegzazizy dlagjnreolzomnr0w. Rf = 0,65, 0,68; 4% ipa w CH2O2

Adoc-D-t-Bug-Phn-Arg(Z)2-C(O)-CF2-C(O)-Ala-Aęg(NO2)-OMe - Do uowingizy 0,094 g (0,16 wmolo) nadjodyzlanu Deggo-Mortizo w 5 ml CH2G2 dodano ze sjruykowki 0,091 g (0,052 mmola) 12 rozpuszczonego w 0,5 ml. Miegzanizę reakcyjną mingzoeo przez 0,5 godziny, po czym dodano 0,385 g (1,55 mmolo) Na2S2O3 w nagyaJzęm roztworze NOHCO3. Po 0,5 godzinie roztwór wyekstrahowano EtOAc, o następnie fozę orgoniczno oddzielono i wysuszono nod MgSO4. Po usunięciu rozpuazazolziko otrzymano 0,94 g surowego produktu. Rf = 0,68, 0,71; 4% ipo w CH2G2.

Adoc-D-j-Bug-Phe-Aęg-C(O)-CF2-C(O)-Alo-Arg-OMe · TFA (13) - Surowy alkohol rozpuszcuozJ w 2 ml DMF i dodano 50 wg czerni platynowej. Zawiesinę odgozowoeo i dodano 0,040 wl 4,0M HCl w dioksanie. Miegzoniny uwodorniono w oporocin Porro przez 20 godzin pod ailnieniew 35,2 kPo. Zowiesley przegoczoeo p-zuz CuIIJ i rozpuszauolmk usunięto. Pozostałość Jazygzczozo chromatograficznie w kolumnie HPLC z Jdwróaozywi fazowi (CH₃CN/H2O/TFA) Jj-zywujoa 0,044 g czystego produktu.

N-N'-bls-ko-bobnzzęlokgy-S-mejyloizJjiomocuzik (14) - Do roztworu dimeru giorczonu S-mntyloizotlowJaunlko (5,00 g 18,0 wmolo) w zimnym (0°C) 1N NaOH (36,0 ml, 36,0 wmolo) weroplozo 11,3 ml (79,0 wmolo) ahloromrówcuozu benzylu i 79,0 wl (79,0 wmolo) 1N NoOH z oddzielnych wkraplocuę. Zawiesinę wingzozo przez 0,5 godziny w 0°C i przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór wyekstrahowano octanem etylu, wysuszono nod bezwodnym giorczozem magnezowym i przesącz odporowono. Pozostałość oczyszczono chromotograficuein no eruewiozce uzyskuj ąc 2,62 g czystego produktu. Rf= 0,40 (15% EtOAc w eterze naftowym).

Υ1Ί 914

Η

1) HC1

2) Adoc-D-t-Bug-Phe-OH DECP, TEA

177 914

III. Wytwarzanie N-końcowych elementów łączących

Adac-D-t-Bug-Phe-OBn - Do 5 ml 15% roztworu fosgenu w toluenie w atmosferze argonu dodano 0,140 ml TEA (1,00 mmola). Następnie za pomocą strzykawki wkroplono 0,112 g (0,750 mmola) 1 -adamantanoaminy w 1 ml toluenu. Uzyskaną zawiesinę mieszano przez 0,3 godziny, po czym nadmiar fosgenu usunięto w wyniku przedmuchiwania argonem. Osad odsączono na lejku próżniowym ze spiekanego szkła, po czym rozpuszczalnik usunięto. Pozostałość rozpuszczono w dichlorometanie i schłodzono do 0°C w atmosferze argonu. Do roztworu dodano 0,140 ml TEA (1,00 mmola), a następnie w jednej porcji 0,100 g (0,250 mmola) D-t-Bug-Phe-OBn · HCl. Uzyskany roztwór odparowano, pozostałość oczyszczano chromatograficznie na krzemionce uzyskując 0,350 g produktu.

W wyniku uwodornienia tego związku, a następnie sprzęgania z produktem hydrolizy związku 11 otrzymano związki, którezpowodzeniemmożnazastosowaćjako wariantoweN-końcowe elementy łączące.

Sposoby badania aktywności związków

Następujące nie ograniczające wynalazku procedury stanowią, sposoby badania przeciwzapalnego i/lub znieczulającego działania pochodnych difluoropentapeptydu według wynalazku.

Znanych jest szereg testów inhibitowania enzymów, pozwalających przewidzieć przeciwzapalne działanie związków. Takie testy enzymatyczne są przydatne w oznaczaniu aktywności związków według wynalazku. Do testów enzymatycznych należą testy z następującymi enzymami: świńska kalikreina trzustkowa (PPK) - patrz pozycje A, E i F; ludzka kalikreina moczowa (HUK) - patrz pozycje E i F; ludzka kalikreina z osocza (HPK) - patrz pozycje B i E; ludzka plazmina (HP) - patrz pozycje B i C; oraz urokinaza (UK) - patrz pozycja D. Zaznaczone pozycje, które wprowadza się jako źródła literaturowe, są następujące:

(A) R. Lottenberg, U. Christensen, C. M. Jackson i P. L. Coleman, „Assay of Coagulation Proteases Using Peptide Chromogenie and Fluorogenic Substrates”, Methods in Enzymology, 80, Academic Press, New York, NY (1981), 341-361; (B) R. Geiger, „Kallikrein”, Methods of Enzymatic Analysis, Vol. V. 3 Ed., Bergmeyer (red.), Academic Press, New York, NY (1984), 129-143; (C) J. P. Morris, S. Blatt, J. R. Powell, D. K. Strickland i F. J. Castellino, „Role ofLysine Binding Regions in the Kinetic Properties ofHuman Plasmin”, Biochemistry, 20, nr 17 (18 sierpnia 1981), 4811; (D) R. C. Wohl, L. Summaria i K. C. Robbins, „Kinetics of Activation ofHuman Plasminogen by Different Activator Specis at pH 7,4 and 37°C” The Journal Biological Chemistry, 255, nr 5 (10 marca 1980), 2005-2013; (E) H. Okunishi, J. Burton i J. Spragg, „Specifity of Substrate Analogue Inhibitors ofHuman Urinary Kallikrein”, Hypertension 7, nr 3, Suppl. 1 (maj-lipiec 1985), I-72 -1-75; (F) E. Amundsen, J. Putter, P. Friberger, M. Knos, M. Larsbraten i G. Claeson, „Methods for the Determination of Glandular Kallikrein by Means of a Chromogenie Tripeptide Substrate” w Kinins-II część A, S. Fuji i inni (red.), Plenum Press, New York, NY (1979), 83-95.

Inny przydatny test aktywności oparty jest na sposobie oznaczania inhibitowania wolno wiążącego enzymu, uj awnionym w pracy B. Imperiali i R. H. Abeles, „Inhibition of Serine Proteases by Peptidyl Fluoromethyl Ketones”, Biochemistry 25 (1986), 3760-3767. Metodę tą modyfikuje się w sposób opisany poniżej w celu badania inhibitowania powolnego wiązania ludzkiej plazminy, świńskiej kalikreiny trzustkowej i ludzkiej kalikreiny z osocza.

Reakcje: Mieszaniny reakcyjne zawierały 78 mM bufor tris-HCl, pH 7,4, 78 mM NaCl, 0,2 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej, 0,2 mM S-2251 (D-Val-Leu-Arg-p-nitroanilid), 0,5 U/ml plazminy (1 mM) i zmienne stężenia badanych związków, w łącznej objętości 1 ml. Zastosowano roztwór podstawowy plazminy o stężeniu 1 u/ml w 50% glicerynie. Zmiany absorbancji w wyniku uwalniania p-nitroaniliny na skutek enzymatycznego rozszczepiania S-2251 rejestruje się za pomocą układu spektrofotometru HP-8450 nastawionego na pomiary w zakresie A^400-410 A⁴⁷⁰'⁴⁹⁰. Pomiary wykonywano w temperaturze 30°C.

Wyliczenia: K_obs i v_s (szybkość inhibitowania w stanie ustalonym) wyznacza się dopasowując krzy wąwzrastającą (pierwsze 20 minut) do całkowitego równania szybkości (i), wykorzy177 914 stując oprogramowanie Labtech Notebook®. Oczekiwaną wielkość k wylicza się dla każdej próby z v_s i nie inhibitowanej szybkości (równanie ii), przy (S) = 0,2 mM i Km = 0,77 mM.

⁽ⁱ) A = ^vs^{t -} (^{(Vs - v}o)^/kob^{s) (1-ex}p^(-kob^st)) + A (ii) ki = (I)/((v/Vs-1)(1 + (s)/km))

Następnie wykres zależności kobs od stężenia badanego związku dla różnych prób dopasowuje się do linii y = mx = b (patrz równanie iii); wylicza się ko_n = m(1+ (S)/km) i ko_ff= b. Na koniec wylicza się k_t z równania iv.

(iii) kobs = (I)/(v/Vs-1)(1+(S)/km)) ^{(iv) k}l· = ^kof/kon . .

Znanych jest szereg testów in vivo, pozwalających przewidzieć przeciwzapalne działanie związków. Takie testy in vivo sąprzydatne w oznaczaniu aktywności związków według wynalazku. Takie testy in vivo opisano w następujących publikacjach, które wprowadza się jako źródła literaturowe.

C.A. Winter, E. A. Risley i G. V. Nuss, „Carrageenin-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Antiinflammatory Drugs”, Proc. Soc. Exp. Biol. 111 (1962), 544-547; C. Vander Wende i S. Margolin. „Analgesic Tests Based Upon Experimentally Induced Acute Abdominal Pain in Rats”, Federal Proceedings 15 (1956), 494; A. Blackham, J. W. Bums, J. B. Farmer, H. Radziwonik, J. Westwick, „AnX-Ray Analysis ofAdjuvant Arthritis in the Rat. The Effect of Prednisolone and Indomethacin”, Agents and Actions 7/1 (1977), 145-151; C. A. Winter i G. W. Nuss, „Treatment of Adjuvant Arthritis in Rats with Anti-Inflammatory Drugs”, Arthritis and Rheumatism 9, nr 3 (lipiec 1966), 394-404; oraz M. D. Francis, K. Hovancik i R. W. Boyce, „NE-58095: A Diphosphonate Which Prevents Bone Erosion and Preserves Joint .Architecture in Experimental Arthritis”, Int. J. Tiss. Reac. XI, nr 5 (1989), 239-252.

Środki i sposoby stosowania środków

Następujące przykłady nie ograniczające wynalazku ilustrują środki według wynalazku i ich zastosowanie.

Przykład I. Tabletki o następującym składzie wytworzono znanymi sposobami:

Składnik Ilość (mg)

Noc-D-t-Bug-Phe-Lys-C(O)CF2C(O)-Leu-Arg-OMe 400

Celuloza mikrokrystaliczna 200

Wstępnie zelatynizowana skrobia 2(0^)

Povidone K-3 0 - poli [ 1 ^-okso-1 -prroiidynyloeetylnn] 40

Stearynian magnezowy 20

Po jednej tabletce podaje się doustnie 4 razy dziennie pacjentowi w celu złagodzenia stanu zapalnego stawów.

Przykład II. Płyn o następującym składzie wytwarza się znanymi sposobami: Składnik Ilość (%) eBroc-D-tBug-Phe-Arg-C(O)CF2C(O)-Gly-Arg-OMe 2,5

Gliceryna 4,0

Metyloparaben - ester metylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego 0,2

Propyloparaben - ester propylowy kwasu 4-hydroksybenzoesowego 0,1 Carbopol 934 - polimer karboksywinylowy 0,15

NaOH 0,46

Palmitynian cetylo-stearylu 1,0

Kwas stearynowy 0,5

Kwasy tłuszczowe lanoliny 0,5

Alkohol cetylowy 3,0

Żywica ksantamowa 0,3

Stearoilo-2-laktolan sodowy 0,75

Mirystynian izopropylu 2,0

W_oda ile potrzeba

177 914

Po 1 g płyne stosuje się miejscowo na rkębę w miejsce zaognionym dwa bazy dziennie w cele zmniejszenia stane zapalnego i bóle.

Pbzykład III.W znany sposób wyZwtbkt się boztwóś, pbzy czym każde 2 ml boztwobe zawirśaju naęZępejócr składniki.

Składnik Ilość (mg)

Adoc-D-Phr-Phr-Lys-C(O)CFaC(O)-D-Phr-Aśg-OH 80

Chlobek brnktlkoniowy 40

Stebylny wodny śoktwęś soli ile poti-zeba

Dawkę 2 ml boztwobe wstbkyCejr się domięśniowo pacjentowi z zapaleniem stawów w cele zmniejszenia stane zapalnego i bóle.

PbkyCłtd IV. W znany sposób wyZwaśka się boktwób o narZęoejucym składzie: Składnik Uoćć (%)

Adoc-D-t-Beo-Phr-Aśg-C(O)-CFaC(O)-Ala-Aśg-OH 5,0

Chlobek brnkalkoniowy 0,02

Sól sodowa kabbokrymrtylocrlelozy 0,11

Wodny śOkZwęb soli ile osZbzrha

Dawkę 0,2 ml boztwobe podaje się pśkrk inhalację pacjentowi wymagająceme złagodzenia stane górnych dbóg oddechowych na skutek astmy.

Jakkolwiek opisano' konkretne śozwióztnia wedłeg wynalazke, dla specjalistów krozemiałe jest, że można dokonać bóżnych zmian i modyfikacji bez wychodzenia poza zakres i istotę wynalazke.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowa pochodna difluoropentapeptydu o 'wzo'r’z<e

R'

R'

X-(CH₂)_n -V-Z-CH-C(O)-NH-CH-C(O)-NH-CH

R'

C=0

YO-C(O)-CH-NH-C(0)-CH-NH-C(0)-CF₂ w którym (a) -X oznacza grupę cykloalkilową zawierającą od 4 do 15 atomów węgla, (b) n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 2, (c) -V- oznacza grupę -OC(O)-, (d) Z oznacza -NH-, (e) -R¹ wybrany jest z grupy obejmującej prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową, nasyconą lub nienasyconą z jednym albo dwoma wiązaniami podwójnymi, zawierającą od 1 do 6 atomów węgla; a atom węgla połączony z Ri jest w konfiguracji D lub L;

(f) -R² wybrany jest z grupy obejmującej grupę aryloalkilową, w której część alkilowa jest nasycona i zawiera 1-2 atomy węgla; ‘a atom węgla połączony z R2 jest w konfiguracji L;

(i) -R3 oznacza grupę -(CH2)_m-A-NH2 lub -(CH2)_m-A-B-C(NH2)=NH, w której m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a -B- oznacza grupę -NH-; a atom węgla połączony z -R³- jest w konfiguracji L;

(j) -R⁴ wybrany jest z grupy obejmującej prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową, nasyconą lub nienasyconą z jednym albo dwoma wiązaniami podwójnymi, zawierającą od 1 do 6 atomów węgla, a atom węgla połączony z R⁴ jest w konfiguracji D lub L;

(k) -R⁵ oznacza grupę -(CH2)m-A-NH2 lub -(C^jmrA-B-CjN^f-N!!, w której m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a -B- oznacza grupę -NH-; a atom węgla połączony z -R5 jest w konfiguracji D lub L; oraz (l) Y oznacza atom wodoru lub grupę metylową, oraz jej farmaceutycznie dopuszczalne sole i hydraty.
2. Nowa pochodna difluoropentapeptydu według zastrz. 1, w której (a) -V- oznacza grupę -OC(O)-, a -Z- oznacza grupę -NH-, (b) n równe jest 0 lub 1;

(c) m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 5;

(d) -X oznacza nasyconą i nienasyconą grupę bicyklo lub tricykloalkilową zawierającą od 8 do 12 atomów węgla, (e) -R1 wybrany jest spośród prostych lub rozgałęzionych grup alkilowych zawierających od 1 do 5 atomów węgla,

-R2 oznacza grupę benzylową,

-R4 wybrany jest spośród prostych lub rozgałęzionych grup alkilowych zawierających od 1 do 5 atomów węgla.
3. Nowa pochodna difluoropentapeptydu według zastrz. 1, w której (a) -R3 oznacza grupę -(CH2)_nl-A-NH2, w której -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a m wynosi od 3 do 5; , , (b) -R5 oznacza grupę -(CH2)m-A-B-CNH₂=NH, w której -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, -B- oznacza grupę -NH-, a m wynosi od 2 do 4;

(c) -Y oznacza grupę metylową;

177 914 (d) -V- oznacza grupę -OC(O)-.
4. Nowa pochodna difluoropentapeptydu według zastrz. 1 albo 2, w której (a) -X oznacza grupę tricykloalkilową;

(b) -R¹ oznacza nasycone i niepodstawione grupy alkilowe o prostym łańcuchu lub rozgałęzione, zawierające od 1 do 4 atomów węgla, a R² oznacza grupę benzylową.
5. Nowa pochodna difluoropentapeptydu o wzorze

O

X¹ - AA¹ - AA² - AA3 - CF2 - C - Aa4 - AA⁵ - OY w którym (a) -AA1- wybrany jest z grupy obejmującej tert-butyloglicyl, walil, izoleucyl, leucyl;

(b) -AA2- wybrany jest z grupy obejmującej fenyloalanyl, naftyloalanyl;

(c) -AA³- wybrany jest z grupy obejmującej arginyl, lizyl, p-guanidynofenyloalanyl, p-amidynofenyloalanyl;

(d) -AA⁴- wybrany jest z grupy obejmującej leucyl i izoleucyl;

(e) -AA⁵- wybrany jest z grupy obejmującej arginyl, homoarginyl, lizyl;

(f) -Xi oznacza adamantyloksykarbonyl;

(g) -Y oznacza grupę metylową, i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole i wodziany.
6. Nowa pochodna difluoropentapeptydu według zastrz. 5, w której (a) -AA5- oznacza arginyl;

(b) -AA3- oznacza lizyl;

(c) -Xi oznacza adamantyloksykarbonyl.
7. Nowa pochodna difluoropentapeptydu według zastrz. 5, w której (a) -AAi- wybrany jest z grupy obejmującej tert-butyloglicyl, walil i izoleucyl;

(b) -AA2- oznacza fenyloalanyl;

(c) -AA4- oznacza leucyl.
8. Nowa pochodna difluoropentapeptydu według zastrz. 5, w której (a) -AAi - oznacza tert-butyloglicyl;

(b) -Xi oznacza adamantyloksykarbonyl;

(c) -Y oznacza grupę metylową.
9. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera od 0,1 do 95% wagowych nowej pochodnej difluoropentapeptydu o wzorze

X-(CH₂)n -V-Z-CH-C(O)-NH-CH-C(O)-NH-CH R⁵ R⁴ C=O i I i

YO-C(O)-CH-NH-C(O)-CH-NH-C(O)-CF₂ w którym (a) -X oznacza grupę cykloalkilową zawierającą od 4 do 15 atomów węgla, (b) n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 2, (c) -V- oznacza grupę -OC(O)-, (d) Z oznacza -NH-, (e) -R1 wybrany jest z grupy obejmującej prostą lub rozgałęzioną grupę alkilową, nasyconą lub nienasyconą z jednym albo dwoma wiązaniami podwójnymi, zawierającą od 1 do 6 atomów węgla; a atom węgla połączony z R1 jest w konfiguracji D lub L;

177 914 (f) -R² wybranyjest z grupy obejmującej grupę aryloalkilową. w Wórej część alkilowajest. nasycona i zawieba 1-2 atomy węgla; a atom węgla połączony z Ra jest w konfigebacji L;

(i) -R³ oznacza gbeoa -(CHa)_m-A-NH2 leb -(CHa)_m-A-B-C(NHa)=NH, w CZębej m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a -B- oznacza gbeoa -NH-; a atom węgla połączony z -R3- jest w Confioebacji L;

(j) -R⁴ wybśany jest z obepy obejmującej pbostą leb bozgałęzioną obgpę alkilową, nasyconą leb nienasyconą z jednym albo dwoma wiązaniami podwójnymi, zawierającą od 1 do 6 atomów węgla, a atom węgla połączony z R4 jest w konfigebacji D leb L;

(k) -R⁵ oznacza gbepę -(CHa)_m-A-NHą leb -(CHa)_m-A-B-CCNHa)=NH, w Ctóbej m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, -A- oznacza wiązanie kowalencyjne, a -B- oznacza gśepę -NH-; a atom węgla połączony z -R5 jest w konfigebacji D leb L; obaz (l) Y oznacza atom wodoru leb gbepę metylową, lebjej fabmacrgtycznir dopeszczalną sól leb hydrat, i w ekgorłnirnig do 100% wagowych faśmacretycznir dopgszckalny nośnik, wybbany z gbepy obejmejącej odpowiedni stały leb ciekły wypełniacz, bozcirńckalniCi, leb sebstancje kapse^jące odpowiednie dla podawania ledziom leb kwirśzętsm.
10. Środek farmaftutyc;myzawieratncy aną^s^tar^eję azcnnąi nośnik.znamienny tym, że jako sebsZancja czynną zawiCTa od 0,1 do 95% wagowych nowej pochodnej difleoroprntaprptyde o wzobze

X¹ - AA¹ - AAa - AA³ - CFa - C - AA⁴ - AA5 - OY w któbym (a) -AA¹- wybbany jest z gbepy obrjmejucrr Zrśt-beZyloglicyl, walil, leecyl;

(b) -AA2- wybrany jest z gbepy obejmejącej fenyloalanyl, naftyloalanyl;

(c) -AA3- wybbany jest z gbepy obęjmgrącrr abginyl, lizyl, p-getnidynofrnylotltnyl, 0-tmidynofrnyloaltnyl;

(d) -AA4- wybrany jest z gbepy obęjmgrącęj leecyl i izoleecyl;

(e) -AA5- wybbany jest z gbepy obrjmejucrj abginyl, homoabginyl, lizyl;

(f) -X1 oznacza adamantyloksykabbonyl;

(g) -Y oznacza gbepę metylową, lebjej fabmaceetycznie doperzczalną sól leb hydrat, i w ekeprłnirnie do 100% wagowych ftbmacretycznir dopeskczalny nośnik, wybrany z o^epy obęjmerucrj odpowiedni stały leb ciekły wypełniacz, śozcirńckalniki, leb rebstancjr kaosełCerucr odpowiednie dla podawania ledziom leb kwirbzęZom.

* * *

Pbzrdmiotrm wynalazke są nowe pochodne peptydowe pbzydaZnr jako śbodki pbkrciwzapalne. '

Znane są pewne pochodne ooliprpZydowr o bóżnym działanie biologicznym. Następejące pehlikacje dotyczą takich pochodnych polipeptydowych: opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 242 329, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 316 889, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 399 065, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 401 594, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 478 745, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 528 133, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 596 789, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki n 4 623 639, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 703 036, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 880 780, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 883 863, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 902 781, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Amebyki nb 4 923 890, zgłoszenie patentowe PCT nb 84/00365, zgłoszenie patentowe PCT

177 914 nr 87/02675, zgłoszenie patentowe japońskie nr 47-30618, zgłoszenie patentowe japońskie nr 57-145846, zgłoszenie patentowe japońskie nr 58-164563, zgłoszenie patentowe europejskie nr 0275101, Aoyagi, Miyata, Nanbo, Kojima, Matsuza ki, Ishizuka, Takeuchi i Umezawa, „Biological Activities of Leupeptins”, The Journal of Antibiotics, XXII, nr 11 (listopad 1969), 558-568, Bajusz, Barabas, Tolnay, Szell i Bagdy, „Inhibition ofThrombin and Trypsin by Tripeptide Aldehydes”, Int. J. Peptide Protein Res., 12 (1978), 217-221; Gaal, Bacsy i Rappay, „Cationic Ferritin Uptake by Cultured Anterior Pituitary Cells Treated with the Proteinase Inhibitor, BOC-DPhe-Phe-Lys-H”, „Histochemistry, 88 (1988), 401-406; Makara, Rappay, Garamvolgi, Nagy, Danko i Bajusz, „The Tripeptide Aldehyde, Boc-DPhe-Phe-Lysinal, a Novel Ca2+ Channel Inhibitor in Pituitary Cells”, European Journal ofPharmacology, 151 (1988), 147-149;Nagy, Makara, Horvath, Rappay, Kurcz i Bajusz, „Tripeptide Aldehyde Protease Inhibitors May Depress in Vitro Prolactin and Growth Hormone Release”, Endocrinology, 116, nr 4 (1985), 1426-1432; Rappay, Makara, Bajusz i Nagy, „Various Proteinase Inhibitors Decresae Prolactin and Growth Hormone Release by Anterior Pituitary Cells”, Life Sciences, 36(1985), 549-555.