Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych 3-arylo-5-izotiazolu o ogólnym wzorze 1, w którym Ar oznacza grupe pirydylowa, grupe tienylowa, grupe fenyIowa lub grupe o wzo¬ rze la, w którym R1, R2 i R* sa jednakowe lub rózne i oznaczaja atom wodoru, grupe chlorowco- alkilowa ó 1—4 atomach wegla, atom chlorowca, grupe alkilowa o 1—4 atomach wegla lub grupe alkoksylowa o 1—4 atomach wegla, wzglednie R1 i R2 lub R*1 i R* tworza razem grupe alkileno- dwuoksy o 1—4 atomach wegla, X oznacza grupe aminowa, grupe hydroksylowa, atom wodoru, atom chlorowca lub grupe alkiloaminowa o 1—4 ato¬ mach wegla, a R oznacza grupe hydroksylowa, przy czym gdy Ar oznacza grupe fenylowa, to wówczas X ma znaczenie inne niz atom wodoru lufo bromu, a takze farmakologicznie dopuszczalnych soli tych zwiazków. Zwiazki te skutecznie obnizaja poziom soli kwasu moczowego (kwasu moczowego) we krwi ssaków.Dna jest powrotnym ostrym zapaleniem stawów peryferyjnych, wystepujacym glównie u doroslych osobników meskich i wywolywanym przez odkla¬ danie sie w stawach oraz wokól stawów i sciegien krysztalów moczanu jednosodowego. Moczan sodu odklada sie w tych miejscach, gdyz pacjent jest hiperracemiczny, to jest poziom moczanów w se¬ rum jego krwi wzrasta do punktu, w którym zo¬ staje przekroczona rozpuszczalnosc moczanu sodu.Ostre ataki zapalenia stawów wywolywanych dna 10 if leczy sie lekami o dzialaniu przeciwzapalnym. Pro¬ filaktyczne stosowanie kolchicyny zapobiega dal¬ szym ostrym atakom dny. Aby utrzymac stezenie soli kwasu moczowego w serum krwi w normal¬ nym zakresie, mozna stosowac leki wzmagajace wydzielanie kwasu moczowego z moczem takie jak, profoenecid i sulfmpyrazon.Alternatywny sposób leczenia dny polega na sto¬ sowaniu leków blokujacych wytwarzanie kwasu moczowego w ciele ssaków przez blokowanie enzy¬ mu oksydazy ksantyny, który przeksztalca zarówno hipoksyntyne w ksantyne jak i ksantyne w kwas moczowy. Jednym z takich leków jest allopurdnol ,[4-hydroksypirazolo/-3,4-d/pirymidyna], izomer hi- poksantyny. Oksydaza ksantyny przeksztalca ten lek w alloksantyne. Konkurencyjne przeksztalcenia hdpoksantyny z ksantyne i ksantyny w kwas mo¬ czowy sa dzieki temu hamowane i kwas moczowy nie gromadzi sie we krwi. Kuracja allopurinolem ma te dodatkowa zalete, ze ropuszcza kwas moczo¬ wy z guzków dnawych. Ze wzgledu na rózne me¬ chanizmy dzialania, allopurinol nie przeszkadza dzialaniu leków zwiekszajacych wydalanie kwasu moczowego w moczu, takich jak probenecid di sul- finpirazone, ani stosowaniu kolchicyny. Nie wszy¬ scy pacjenci toleruja jednak allopurinol i dlatego celem wynalazku jest zapewnienie sposobu wytwa¬ rzania nowego zwiazku o dzialaniu leczniczym o pozadanych wlasciwosciach allopurinolu bez nie¬ których jego niepozadanych dzialan ubocznych. 130 4973 139497 4 Znane sa kwasy 3-aryloizotiazolokarboksylowe-5.Np. Naito i inni, Chem. Pharm. Puli. 16, 148 (1960) opisuje poddawanie reakcji 3-fenylo-4-bromo-5-izo- tiazolilolitu z dwumetyloformamidem z wytworze¬ niem 4rJbromo-5-forniylo^3^fenyloizotiazolu, daja¬ cego sie utleniac do kwasu 3-fenylo-4-bromoizo- tiazolokarboksylowego-5. Równiez kwas 3-fenylo- izotiazolokarboksylowy byl wytwarzany przy wielu okazjach. Beringer i in., Helv. Chdm. Acta., 49, 2466 (1966) wytwarzal 3-fenyloizotiazol z 3-fenylo-5-ami- noizotiazolu poprzez sól dwuazomowa. Dzialanie na 3-fenyloizotiazol butylolitem a nastepnie dwutlen¬ kiem wegla daje kwas 3-fenyloizotiazolokarboksy- lowy-5. Erlenmeyer i inni, Helv. Chim. Acta, 51, 39 (1968) oznaczali stale trwalosci pewnych kwa¬ sów wlacznie z kwasem 3-fenyloizotiazolokarboksy- lowym-5. Praun i Black, Tetrahedron Letters, 1381 (1970) stwierdzili, ze reakcja 5-fenylo-l,3,4-oksatia- zolonu-2 z dwoma równowaznikami molowymi pro- piolanu etylu daje mieszanine izomerycznych est¬ rów, 3-fenyloizotiazolokarboksylanu-4 etylu i 3- -fenyloizoiiazolokarboksylanu-5 etylu.Howe i inni, J. Org. Chem., 43, 3732 — 3736, (1978) wytwarzali mieszanine tych samych dwóch estrów izotdazolu, wprowadzajac w pozycji 3 grupe m-trójfluorometylofenylowa, grupe fenylowa, gru¬ pe 4-chlorofenylowa, grupe 4^cyjanofenylowa i gru¬ pe 3,5-dwumetoksyfenylowa. 3-fenyloizotiazolokar- boksylan-5 etylu i odpowiedni ester metylowy ujawniono w J. Org. Chem., 44, 510 (1979). 3-feny- lo-4^aminoizotiazolokarboksylan-5 metylu i odpo¬ wiedni ester etylowy ujawniono w referacie Ge- walda i Bellmann Ann., 1534 (1979). W zadnej z tych publikacji nie ma wzmianki o dzialaniu far¬ makologicznym zadnego z kwasów izotiazolokarbo- ksylowych lub ich estrów, a zwlaszcza nie ma zad¬ nego ujawnienia dotyczacego dzialania oksydazy ksantyny takich kwasów lub estrów.Nowe zwiazki o wzorze 1 wytwarzane sposobem wedlug wynalazku oraz ich farmakologicznie dopu¬ szczalne sole skutecznie obnizaja poziom soli kwa¬ su moczowego we krwi ssaków. Korzystnymi far¬ makologicznie dopuszczalnymi solami sa sole utwo¬ rzone z nietoksycznym kationem, np. kationem me¬ talu alkalicznego, takiego jak K lub Na, kationami metali zdem alkalicznych, takich jak Mg lub Ca, innymi nietoksycznymi kationami metali, takich jak Al lub Zn, lub nietoksycznymi kationami me- taloidalnymi, takimi jak lNH+4, kation piperazy- niowy lub 2-hydroksyetyloamoniowy. Gdy jeden lub wiecej z podstawników R1, R* lub R* oznaczaja pochodna grupy chlorowcoalkilowej o 1—4 ato¬ mach wegla, korzystne jest, gdy grupy te sa w pelni schlOTOWoowane i oznaczaja grupy takie jak trójfluorometylowa Jub piecdochloroetylowa. Ten rodzaj rodników jest bardziej stabilny podczas syn¬ tezy czasteczki niz czesciowo chlorowcowane gru¬ py chlorowco-alkilowe.Korzystnymi zwiazkami o wzorze 1, sa te, w któ¬ rych R1, R* i R* sa jednakowe lub rózne i ozna¬ czaja atom wodoru, grupe trójfluorometylowa, atom chlorowca, grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, grupe alkoksyIowa o 1—3 atomach wegla, lub w których R1, i R* lub R* i R* oznaczaja gru¬ pe metylenodwuoksy, X oznacza grupe aminowa, atom wodoru, chlorowca, grupe hydroksylowa lub grupe alkiloaminowa o 1—Z atomach wegla, a R oznacza grupe hydroksylowa, oraz Ci—C| farmako¬ logicznie dopuszczalne sole tych kwasów.B Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze hydrolizuje sie zwiazek o ogólnym wzorze 2, w którym Ar i X maja wyzej podane znaczenie, a Q oznacza grupe estrowa, po czym ewentualnie otrzymamy kwas przeprowadza sie w farmakolo- 10 gicznie dopuszczalna sól.Grupami estrowymi sa korzystnie ugrupowania estrów Ci-C^alkilowych, a zwlaszcza grupa —COCHf. Hydrolize nalezy oczywiscie prowadzic iw srodowisku wodnym dogodnie w temperaturze ^ 0—110°C. Chociaz grupe estrowa mozna przeksztal¬ cac w pozadana funkcje kwasu karboksylowego stosujac sposoby hydrolizy katalizowanej kwasem, hydrolize korzystnie prowadzi sie w obecnosci za¬ sady takiej jak wodorotlenek grupy IA ukladu 20 okresowego pierwiastków, np. wodorotlenku sodo¬ wego lufb potasowego, w obecnosci alkanohi o 1—4 atomach wegla.Ester o wzorze 2, w którym X oznacza grupe aminowa mozna wytwarzac, poddajac reakcji zwia- 25 zek o wzorze 3, w którym Z oznacza grupe nitry¬ lowa a OR* oznacza grupe latwo odszczepialna, ta¬ ka jak tosylanowa, mezylanowa lub brosylanowa, z odpowiednim estrem kwasu tioglileolowego, w obecnosci zasady organicznej, takiej jak morfolina 30 lub trójalkiloamina. Reakcje te nalezy prowadzic w warunkach bezwodnych (ponizej 5% wagowych wody), stosujac jako rozpuszczalnik alkanol o 1—4 atomach wegla.Zwiazek nitrylowy o wzorze 3 mozna wytwarzac, 35 poddajac sól sodowa o wzorze 4 reakcji z chlor¬ kiem p-toluenosulfonylu, chlorkiem metanosulfo- nylu, chlorkiem p-bromobenzenosulfonylu lub z in¬ nym reagentem zdolnym do tworzenia latwo od- szczepialnej grupy OR*. Reakcje korzystnie prowa- 40 dzl sie, stosujac jako rozpuszczalnik toluen. Sól so¬ dowa o wzorze 4 mozna wytwarzac poddajac nitryl o wzorze ArCHjCN reakcji z alkoholanem sodo¬ wym i azotynem alkilowym.Przebieg tych reakcji przedstawiono przyklado- 45 wo na schemacie 1* na którym symbole „alk" i „Alk" stosowane sa do wskazania grup alkilowych o 1—4 atomach wegla. Podobnie, zwiazki o wzorze 2, w którym X oznacza grupe hydroksylowa a Q oznacza grupe estrowa mozna wytwarzac, poddajac 50 zwiazek o wzorze 3, w którym Z oznacza grupe estrowa, korzystnie estru Ci—C4 alkilowego, reak¬ cji z od(powiednim estrem kwasu tioglikolowego, w obecnosci zasady organicznej, takiej jak morfo¬ lina lub trójalkiloamina. Reakcje te nalezy rów- S5 ndez prowadzic w warunkach bezwodnych (ponizej 5% wagowych wody w mieszaninie reakcyjnej), sto¬ sujac jako rozpuszczalnik alkanol o 1—4 atomach wegla. Nalezy zauwazyc, ze reakcja przebiega ze stala wydajnoscia. go Przykladowe reakcje prowadzace do wytworze¬ nia tych hydroksypochodnych przedstawiono na schemacie 2. Wedlug tego sposobu postepowania ester arylooctowy o wzorze 7 poddaje sie reakcji z alkoholanem sodowym i otrzymana sól sodowa n' poddaje sie reakcji z azotynem izoamylowym, a5 nastepnie otrzymany produkt traktuje sie wodnym roztworem HC1, otrzymujac kwas aryloksyimino- wy o wzorze 8. Przeestryfikowanie alkanolem w obecnosci kwasu takiego jak HC1 daje ester arylo- ksyiminowy o wzorze 8a. Reakcja tego estru z al¬ koholanem sodowym w DMF daje sól sodowa gru¬ py oksymowej (zwiazek o wzorze 8b). Poddanie reakcja tej soli sodowej z chlorkiem p-tosylu, rów¬ niez w DMF, daje odpowiedni ester p-toluenosul- fiminoarylooctowy o wzorze 9. Traktowanie tego estru nizszym estrem alkilowym kwasu trójglikolo- wego w obecnosci trójetyloaminy lub innej trzecio¬ rzedowej alkiloaminy lub morfoliny i nizszego al- kanolu daje 3-arylo-4-hydroksyizotiazolokarboksy- lan-5 nizszego alkilu o wzorze 5a który, po hydro¬ lizie zasada, daje odpowiedni kwas karboksylowy o wzorze 6a.Do wytwarzania zwiazków o wzorze 2, w którym X oznacza atom wodoru mozna stosowac reakcje dwuazowania, prowadzona w warunkach bezwod¬ nych. W tym sposobie postepowania 4-aminopo- chodna (X oznacza —NHa) poddaje sie reakcji z azotynem alkilowym o 1—6 atomach wegla, takim jak azotyn izoamylowy, prowadzac reakcje w orga¬ nicznym rozpuszczalniku, zdolnym do wprowadza¬ nia atomu wodoru w pozycje 4 pierscienia izotia- zolu. Przykladowymi takimi rozpuszczalnikami sa rozpuszczalniki eterowe, takie jak tetrahydrofuran i alkanole o 1—6 atomach wegla. Reakcje prowadzi sie w temperaturze 0—110°C. W wyniku takiego postepowania otrzymuje sie zwiazki dwuazoniowe, które rozkladaja sie, dajac zwiazek z atomem wo¬ doru przy atomie wegla w pozycji 4. W tym sposo¬ bie postepowania korzystnie stosuje sie nie kwasy, lecz estry izotiazolokarboksylowe.Zwiazki o wzorze 2, w którym X oznacza atom chlorowca, np. chloru, bromu, jodu lub fluoru moz¬ na tez wytwarzac na drodze dwuazowania w wa¬ runkach bezwodnych, stosujac jako substrat zwia¬ zek 4-aminowy. Np. zwiazki dwuazoniowe, wytwo¬ rzone przez dzialanie chlorku nitrozylu na pochod¬ na 4-aminowa rozklada sie przez ogrzewanie, otrzy¬ mujac odpowiednia 4-chloropochodna. Równiez i w przypadku tych reakcji korzystnie jako substraty stosuje sie estry a nie wolne kwasy. Wolne kwasy latwo wytwarza sie przez hydrolize estrów 4-chlo- rowcowych. W celu wytworzenia 4-bromo- lub 4- -jodopochodnych kwasów 3-arylodzotiazolokarbo- ksylowych-5 mozna zamiast chlorku nitrozylu stosowanego do wytwarzania 4^chlorozwiazków sto¬ sowac mieszanine azotynu izoamylowego i bromu lub jodu. Pochodne 4-fluoro- mozna wytwarzac, poddajac odpowiedni 4-aminoester z czterofluoro- boranem nitrozoniowym z utworzeniem soli i na¬ stepna termoliza tak otrzymanej soli. W reakcjach tych stosuje sie rozpuszczalniki organiczne, które nie wprowadzaja latwo atomu wodoru do zwiaz¬ ków dwuazoniowych, takie jak chloroform, cztero¬ chlorek wegla lub dwuchloroetylen. Reakcje moz¬ na prowadzic w temperaturze 0—110°C.Zwiazki o wzorze 2, w którym X oznacza grupe alkiloaminowa o 1—4 atomach wegla mozna wy¬ twarzac poddajac amine o wzorze 2 (X oznacza NHj) reakcji z zasada wystarczajaco silna, aby utworzyc anion aminowy. Przykladowymi takimi 497 6 zasadami sa wodorek sodowy, amidosód i n-buty- lolit. Tak utworzony anion mozna alkilowac w zna¬ ny sposób, np. halogenkiem alkilowym takim jak jodek metylu lub etylu lub siarczan dwualkilowy, i w temperaturze 0—110°C.Z kolei 4-hydroksypochodne o wzorze 2 mozna wytwarzac, poddajac reakcji kwas aryloglioksyIo¬ wy z chlorowodorkiem hydroksyloaminy, z utwo¬ rzeniem odpowiedniego oksymu, który jak poprzed- II nio przeksztalca sie w ester p-tosylooksymu, który nastepnie kondensuje sie z estrem tioglikolowym, otrzymujac bezposrednio pozadany ester kwasu 4-hydroksyizotriazolokarboksylowego-5.Tak wiec rózne pochodne o wzorze 2 mozna 15 przeksztalcac jedne w drugie przy uzyciu znanych srodków. Zwiazki o wzorze 1 lub ich farmakolo¬ gicznie dopuszczalne sole mozna podawac ssakom o wysokim stezeniu soli kwasu moczowego we krwi w przypadku potrzeby leczenia, przy czym substan- 20 cje czynna miesza sie z odpowiednimi farmaceu¬ tycznie dopuszczalnymi nosnikami, rozcienczalnika¬ mi lub zarobkami i podaje w postaci dawek jed¬ nostkowych takich jak tabletki lub kapsulki. Kaz¬ da dawka jednostkowa powinna zawierac 2—20 mg substancji czynnej na 1 kg masy ciala leczonego n ssaka. Kwasy lub sole o wzorze 1 mozna podawac zarówno doustnie jak i pozajelitowo.Dla podawania pozajelitowego lek formuluje sie zwykle w postaci dawki jednostkowej takiej jak sól sodowa lub potasowa w roztworze izotonicz- 11 nym. Takie roztwory izotoniczne sa zwlaszcza przystosowane do podawania dozylnego lub iniek¬ cji dootrzewnowych. Mozna tez stosowac iniekcje do¬ miesniowe, stosujac wolny kwas lub nietoksyczna, nie drazniaca jego sól i jedna lub wiecej zwykle a stosowanych zarobek farmaceutycznych, stosowa¬ nych do iniekcji domiesniowych.Zwiazki o wzorze 1 korzystnie podaje sie jed¬ nak doustnie. W tym celu stosuje sie albo staly wolny kwas albo farmaceutycznie dopuszczalna 40 sól. Do podawania doustnego mozna mieszac wol¬ ny kwas lub jego anionowa sól w stanie stalym ze skrobia lub inna farmaceutyczna zaróbke, i mie¬ szanine umieszczac w teleskopowych kapsulkach zelatynowych, zawierajacych dawke jednostkowa 15 ioo—500 mg zwiazku o wzorze 1. Alternatywnie, mozna mieszac skrobie, srodek wiazacy, rózne srodki smarujace itd. i mieszanine sprasowywac w tabletki takie, aby kazda tabletka zawierala daw¬ ke jednostkowa 100—250 mg lub nawet 500 mg 0 zwiazku o wzorze 1. Tabletki takie moga byc naci¬ nane tak, ze w miare potrzeby mozna podawac pól lub czwarta czesc dawki.Jako prekursory kwasów izotiazolokarboksylo- wych moga sluzyc, po podaniu doustnym, takie pochodne kwasu karboksylowego, które moga byc przeksztalcone w wolne kwasy karboksylowe przez kwasy zoladkowe (pH = 2), lub na drodze hydro¬ lizy enzymatycznej w innych czesciach ciala. ;o Dla fachowca oczywiste jest, ze po podaniu do¬ ustnym kwasu izotiazolokarboksylowego lub jego soli stanowiacych prekursor kwasu, wiekszy pro¬ cent kwasu izotiazolokarboksylowego bedzie ist¬ niec w zoladku w postaci niezjonizowanej, to zna- 5 czy, ze silny kwas zoladkowy, HC1 przy pH 2 be-dzie przeciwdzialal jonizacji slabszego kwasu zgod¬ nie z równaniem: (H+) (jon izotdazolokarboksylowy) K,= (kwas izotiazolokarboksylowy) w którym K, oznacza pozorna stala dysocjacji okreslonego kwasu izotiazolokarboksylowego.Jak wspomniano, zwiazki o wzorze 1 i ich sole sa in vitro inhibitorami oksydazy ksantyny. Po¬ niewaz kwas moczowy wytwarzany jest przez utle¬ nianie przez enzym, oksydaze ksantyny, najpierw hipoksantyny do ksantyny, a nastepnie ksantyny do kwasu moczowego, inihibitor oksydazy ksanty¬ ny in vivo obnizalby oczywiscie stezenie kwasu moczowego we krwi. Tak wiec, wszystkie zwiazki bedace inhibitorami oksydazy ksantyny sa poten¬ cjalnymi lekami przeciw dnie.Próbe dzialania oksydazy ksantyny in vitro pro¬ wadzi sie sposobem opisanym przez Kalckar J., Biol. Chem., 167, 429 (1947). Aktywnosc oksydazy ksantyny mierzy sie w temperaturze pokojowej szybkoscia powstawania kwasu moczowego z wyj¬ sciowej ksantyny. W calkowitej objetosci 1 ml in- kubowana mieszanina zawiera 50 mikromoli bu¬ foru z fosforanu potasu o pH 7,4, 0,05 mikromola ksantyny i 0,01 jednostek preparatu enzymu chro¬ matograficznie oczyszczana oksydaza ksantyny mle¬ ka, gatunek III, otrzymywana z Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, (St. Zjedn. Am.).Rejestruje sie zmiane absorpcji przy 292 nm spek¬ trofotometrem rejestrujacym Gilforda i oblicza sie Tabela 1 Zwiazek o wzorze 10 R M 3-CF, 4-CF, 3-CHj 4-CHt 3-OCH, 4-OCH, 4-OCjH, 3-Cl 4-Cl 3-F 4-F 4-Br 3-F 3-OCH, 3-CH« 3-OCH, 3,4-metyleno- dwuoksy 3-Cl 4-OC3H* 4-OCH(CH9)a Ri H H H H H H H H H H H H H 4-OCH, 5-OCH, 4-OCH, 4-OCH, 4-Cl H H Im (nano- gramów/ml) I 470 22 180 150 280 290 140 28 1 68 700 300 380 . 825 18 25 40 115 130 62 24 19 1 )*97 8 ilosc utworzonego kwasu moczowego, stosujac wspólczynnik ekstyncji 12 mM—1cm—* przy 292 nm.Wyniki tych prób podano w ponizszych tablicach 1—4. Wyniki podane w kazdej z tabel dotycza 9 zwiazku o okreslonym wzorze strukturalnym, przy czym w lewych kolumnach podano znaczenia pod¬ stawników w tym wzorze, a w prawej podano ste¬ zenie badanego zwiazku w nanogramach na^mili- litr, inhibitujace w 50% utlenienie ksantyny do 10 kwasu moczowego przez preparat oksydazy ksan¬ tyny.Tabela 2 11 Zwiazek o wzorze 11 R H 3-CFB 3-OCH, 4-OCH3 3-CI*3 4-CH, 3-Cl 4-Cl 3-F 4-F 3-CF, 3-Cl 4-Cl 3-CF3 3-Cl 3-OCH, 4-Cl 1 3"CF3 X Cl — — — — — — — 1 — — Br '' — — J — — — F U$ (nano- gramów/ml) 54 10 29 14 34 80 19 100 30 52 * 18 J 1 26 100 95 330 620 1000 20 J Tabela 3 Zwiazek o wzorze 11 R H 3-CF3 3-OCH, 4-OCH3 3-Cl 4-Cl H ' 3-CF, 3-CF, X H — — — — . — OH — NH-OH, I50 (nano- gramów/ml) 480 15 880 65 80 470 45 7,4 170 | Wszystkie otrzymane zwiazki o wzorze 1 dziala- 60 ja in vivo obnizajac poziom kwasu moczowego w plazmie. Dla okreslenia aktywnosci in vivo stosu¬ je sie dwie metody doswiadczalne, przy czym obie daja porównywalne wyniki. Pierwsza z tych me¬ tod; metoda spektrofluorometryczna, stanowi zmo- 65 dyfikowany sposób postepowania Sumi i innych.130 497 10 Tabela 4 Zwiazek o wzorze 12 Ar 3-pirydynyl | 2-tienyl Im (nanogramów/ml) 330 750 | ClMica Chimica Acta., 73, 233 (1976). Szczury usmierca sie przez dekapitacje a ich krew groma¬ dzi do probówek prózniowych, zawierajacych he¬ paryne, przez szklane wkraplacze przemyte hepa¬ ryna. Krew odwirowuje sie w ciagu 8 minut przy 4000 obrotów/minute, po czym oddziela sie plazme i rozciencza 1:1 woda. Wytraca sie bialko plaz¬ my, dodajac kwas octowy do uzyskania ostatecz¬ nego stezenia 0,007 m i otrzymana mieszanine utrzymuje sie w ciagu 5 minut w stanie wrzenia w probówkach 6orvala.Po odwirowaniu mieszaniny w ciagu 30 minut z szybkoscia 25000 obrotów/minute otrzymuje sie czysta, pozbawiona bialka plazme. Kwas moczowy oznacza sie nastepujaco. Próbki 0,2 ml czystej, po¬ zbawionej bialka plazmy, miesza sie ze 120 X uri- cazy (0,045 milijednostek/ml) i inkubuje w ciagu 30 minut w temperaturze 27°C, przy czym dodaje 1,0 ml buforu — kwasu p-hydroksyfenylooctowego.Próbki, otrzymane ze szczurów lub psów, którym podawano seryjne dawki badanego zwiazku inku¬ buje sie z tym roztworem buforowym w ciagu 30 minut w temperaturze 27°C. Mierzy sie fluorescen- cje roztworu w kwarcowych rurkach, stosujac spec- trofluorymetr Aminco Bowman o wzbudzaniu 321 nm di emisji przy 412 nm. Bada sie 5 stan¬ dardowych próbek o stezeniu 6—30 mikromolar- nym w kazdej próbie i kazda standardowa próbka daje wykres liniowy.Druga metoda zwana jest metoda detekcji HPLC-EC. Plazme krwi szczurów gromadzi sie jak opisano poprzednio, a od psów pobiera sie krew z zyly odpromieniowej przedramienia strzykawkami przemytymi heparyna i odwirowuje z Surc-Sep w celu oddzielenia plazmy. Plazme pozbawiona bial¬ ka w kazdym przypadku sporzadza sie, rozpuszcza¬ jac najpierw jedna objetosc plazmy w jednej obje¬ tosci roztworu wewnetrznego standardu, 4 mikro- gramy/ml, i nastepnie dodajac 2 objetosci 5% kwa¬ su trójchlorooctowego.Próbki standardowe dodaje sie do plazmy regulu¬ jac w niej stezenie kwasu moczowego w zakresie 0—8 mikrogramów/ml. Próbki, otrzymane z psów lub szczurów, którym podawano stopniowana daw¬ ke badanego zwiazku, miesza sie w ciagu 30 se¬ kund i nastepnie odwirowuje w mdkrowirówce Ep- pendorf. Supernatant rozciencza sie 1:10 w ko¬ lumnie buforowej i bada na zawartosc kwasu mo¬ czowego. Jako standardy wewnetrzne stosuje sie kwas 3-metylo-moczowy dla próbek ze szczurów i kwas 3,9-dwumetylo-moczowy dla próbek z psów.Oznaczenia prowadzi sie jak opisano nizej, stosu¬ jac analizator Bdoanalytic Systems Inc. LC-44 i elektrochemiczny uklad detekcyjny oparty na pom¬ pie Altex model 110, sprzezonej z elektrodetekto- rem CP-O Carbon Paste. Próbki do oznaczen umie¬ szcza sie w autopróbniku Du Pont 834 i automa- s tycznie wstrzykuje do laboratoryjnej kolumny ze stali nierdzewnej z wypelnieniem (srednica wew¬ netrzna 4,1 mm, srednica zewnetrzna 6,35 mm, dlugosc 25 cm), zawierajacej wypelnienie do chro¬ matografii w fazie odwróconej (sperisorb. OD, 10 5 n, Regis Chemical Co.). Buforami stosowanymi w kolumnie sa 0,1 M roztwór fosforanu dwusodowe- go, 0,05 M roztworu kwasu cytrynowego i 10% mt tanolu w przypadku próbek ze szczurów, a 0,1 M roztwór fosforanu dwusodowego, 10% metanolu miareczkowany kwasem cytrynowym do pH 6,5 dla próbek z psów.Stosuje sie te same standardy wewnetrzne co poprzednio. Ustala sie czas retencji kwasu moczo¬ wego, kwasu 3-metylomoczowego i kwasu 3,9-dwu- metylomoczowego, a nastepnie z obszarów wierz¬ cholkowych metoda analizy komputerowej oblicza sie poziomy kwasu moczowego. W ponizszej tabeli 5 podano wartosci EDM dla szczurów przy podawa¬ niu doustnym grupy korzystnych zwiazków wy¬ twarzanych sposobem wedlug wynalazku (tych, w których w pozycji 3 pierscienia izotiazolowego znajduje sie grupa 3-trójfluorometylofenylowa). W tabeli tej w kolumnie 1 podano znaczenie podstaw- ndka w pozycji 4 przy atomie wegla pierscienia izotiazolu, a w kolumnie drugiej wartosci EDb# w mg/kg (to jest dawke, która zmniejsza poziom kwasu moczowego w plazmie o polowe).Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku sa równiez stosunkowo nietoksyczne. W kolum¬ nie trzeciej w tabeli 5 podano dawki LDjo w mg/kg dla myszy przy podawaniu doustnym dla kazdego zwiazku okreslonego w kolumnie pierwszej (daw¬ ka, która powoduje smierc polowy badanych zwie¬ rzat). Wreszcie, w kolumnie czwartej tabeli 5 po¬ dano stosunek dawek LDw do EDM. Widac, ze sto¬ sunek LD50 do EDM jest dosc wysoki, zapewniajac znaczny margines bezpieczenstwa przy stosowaniu zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku do leczenia dny u ssaków, zwlaszcza u ludzi.Tabela 5 Zwiazek o wzorze 13 x NHa Cl H Br OH EDM mg/kg 17,5 6,4 15,0 5,2 18,0 LD50 mg/kg 798±66 138+12 201±13 ~260 727±35 Stosunek LDm/EDm 45,6 21,6 13,4 • ^50 40 Inne zwiazki o wzorze 1 sa równiez aktywnymi inhibitorami oksydazy ksantyny in vivo. Wszyst¬ kie zwiazki o wzorze 1 wykazuja aktywnosc przy podawaniu doustnym i korzystnie stosuje sie je w postaci stalych preparatów do podawania doust- M 25 3« 38 40 45 51 55 60130 407 ii riegb. NJ). tabletki zawierajace 100—250 mg zwiaz¬ ku ó wzorze 1 maja zawierac takze w kazdej ta¬ bletce 38 mg skrobi, 25 mg laktozy, 2 mg etylo¬ celulozy, 7 mg kwasu alginowego, 1 mg stearynia¬ nu magnezu i 2 mg talku. Preparaty w postaci kapsulek moga zawierac, w kazdej kapsulce, 100— 250 lub 500 mg zwiazku o wzorze 1, i np. 48 mg laktozy i 2 mg stearynianu magnezu. Stale produk¬ ty do uzupelniania kapsulek mozna sporzadzac z 600 lub nawet 800 mg leku na dawke, o ile lek jest najpierw zageszczony. Gdy do padawania po¬ zajelitowego stosuje sie kwas, powinien byc on zobojetniany, np. 10% roztworem wodorotlenku so¬ du a powstaly roztwór zmieszany z izotonicznym roztworem soli. Korzystnie stosuje sie sól i po prostu dodaje do dzotonicznego roztworu soli w ob¬ jetosci pozadanej do iniekcji.Zwiazki o wzorze 1 sa przydatne do obnizania poziomu soli kwasu moczowego (kwasu moczowego) we krwi do poziomu normalnego i tym samym sa wartosciowymi w chemoterapii chorób wywolywa¬ nych nadmiarem kwasu moczowego, takich jak dna (artretyzm), a zwlaszcza gdy choroba jest powodo¬ wana nienormalnoscia metabolizmu puryny.Wyjsciowe estry o Wzorze 2 wykazuja takze pe¬ wien poziom dzialania obnizajacego stezenie kwa¬ su moczowego we krwi, jednak ich aktywnosc jest znacznie slabsza od aktywnosci zwiazków o wzo¬ rze 1. Wytwarzanie nowych zwiazków sposobem Wedlug wynalazku oraz wytwarzanie niektórych wyjsciowych estrów, które sa takze zwiazkami no¬ wymi, przedstawiono w ponizszych przykladach: Przyklad I. Wytwarzanie 3-/4-metoksyfeny- Io/^nammoizotiazoiokarboksylanu-S metylu.Do poddawanego mieszaniu roztworu 8,25 g cyjan¬ ku 4-metoksy-a-/P"toluenosulfonyloksyimino/benzy- lu w 80 ml metanolu, zawierajacego 3,3 g tiogliko- lanu metylu, wkrapla sie w ciagu 30 minut 5,0 g frójetyloaminy. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ca4£fu czterech godzin po zakonczeniu wkraplania w temperaturze pokojowej, a nastepnie chlodzi do temperatury 0°C i saczy. Zebrany osad przekry- stalizowuje sie z heksanu i octanu etylu, otrzy¬ mujac 2,7 g 3-/4-metoksyfenylo/-4-aminoizotiazolo- karboksylanu-5 metylu (wydajnosc 42%) o tempe¬ raturze topnienia 129—131°C. Wyniki analizy dla CjAgNiOaS obliczono: C 54,53 H 4,58 N 10,60 znaleziono: C 54,38 H 4,48 N 10,45.Postepujac jak opisano wyzej, poddajac reakcji odpowiedni tosylan oksymu benzonitrylu z taogli- kolanem alkilu, otrzymuje sie wymienione nizej es¬ try kwasu 3-arylo-4-aminoizotiazolokarboksylowe- go-5: 3-/3-metoksyfenylo/-4-aminoizotiazolokarboksylan- -5 metylu. Wydajnosc 11%. Temperatura topnienia $4_95 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL