NO330421B1

NO330421B1 - Anvendelse av deskarboksyloratadin for fremstilling av et farmasoytisk preparat for behandling av allergisk astma

Info

Publication number: NO330421B1
Application number: NO20020211A
Authority: NO
Inventors: A K Gunnar Aberg; John R Mccullough; Emil R Smith
Original assignee: Sepracor Inc
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 2002-01-15
Publication date: 2011-04-11
Also published as: PT799037E; ATE339956T1; DK0799037T3; EP0799037A4; NO317555B1; CN1935141A; CN1176598A; EP0799037B1; US5731319A; AU4512696A; WO1996020708A1; NO20020211L; JP4237822B2; NO20110077L; JPH10512240A; NO973023L; CZ293068B6; CA2208836C; SK287257B6; SK284834B6

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av deskorboetoksyloratadin. Kjemisk er deskarboetoksyloratadin lik 8-klor-6,l 1-dihydro-l l-(4-piperidyliden)-5H-benzo[5,6]cyklohepta[l,2-b]pyridin. Denne forbindelsen er spesielt beskrevet i Quercia, et al. Hosp. Formul., 28:137-53 (1993) og US patent 4.659.716.

Loratadin er en antagonist til H-l Mstaminreseptorproteinet. Histarninreseptorene H-l og H-2 er to velidentifiserte former. H-l reseptorene er de som formidler responsen som antagoniseres av konvensjonelle antihistaminer. H-l reseptorer er tilstede f.eks i ileum, huden og den glatte bronkialmuskulaturen hos mennesker og andre pattedyr.

Loratadin bindes selektivt til perifere, i steden for sentrale, H-l reseptorer, Quercia et al. Hosp. Formul. 28:137-53 (1993). Det har blitt vist at loratadin er en mer potent inhibitor av serotoninindusert bronkospasme hos marsvin enn terfenadin, Id. ved 137-138. Det ble vist at dets antiallergeniske aktivitet i dyremodeller var sammenlignbar med den til terfenadin og astemizol. Id. ved 138. Ved bruk av standard dyremodelltesting, på en milligram-milligram-basis, ble det imidlertid vist at loratadin var fire ganger mer potent enn perfenadin med hensyn til inhiberingen av allergisk bronkospasme. Id. Dessuten ble anlihistaminaktiviteten til loratadin påvist i mennesker ved evaluering av legemidlets evne til å undertrykke blemmedannelse. Id. Kliniske effektivitetsforsøk viste at loratadin er en effektiv H-l antagonist, se Clissold et al. Drugs 37: 42-57 (1989).

Gjennom H-2 reseptorforrnidlede responser stimulerer histamin mavesyresekresjon i pattedyr og den kronotropiske effekt i isolert pattedyratrium. Loratadin har ingen virkning på Mstarmnindusert mavesyresekresjon og heller ikke forandrer det den kronotropiske effekten til histamin på atrium. Loratadin har således ingen klar effekt på H-2 histaminreseptoren.

Loratadin absorberes godt, men blir omfattende metabolisert. Hilber et al. J. Clin. Pharmacol. 27: 694-98 (1987). Hovedmetabolitten, DCL, som har blitt identifisert, rapporteres å være farmakologisk aktiv. Clissold, Drugs 37:42-7 (1989). I US patent 4.659.716 angis det også at det har antiMstaminaktivitet. Dette patentet anbefaler et oralt doseringsområde på 5-100 mg/dag og fortrinnsvis 10-20 mg/dag.

Effekten til loratadin når det gjelder å behandle årstidsbestemt allergisk rhinitt er sammenhgnbar med den til terfenadin. Quercia et al. Hosp. Formul. 28:137, 141 (1993). Loratadin har også en hurtigere virkningsbegynnelse enn astemizol. Id.

Clissold et al. Drugs 37: 42,50-54 (1989) beskriver studier som viser at loratadin er effektiv for bruk i årstidsbestemt og perennial rhinitt, forkjølelser (med pseudoefedrin) og kronisk urticaria. Det har også blitt foreslått at loratadin ville være nyttig for behandling av allergisk astma. Temple et al. Prostaglandins 35:549-554 (1988).

Loratadin kan også være nyttig for behandling av reisesyke og vertigo. Noen antiMstaminer har funnet å være effektive for profylakse og behandling av reisesyke. Se Wood, Drugs, 17:471-79 (1979). Noen antihistaminer har også vist seg å være nyttige for behandling av vestibulære forstyrrelser, slik som Meniere's sykdom, og i andre typer av vertigo. Se Cohen et al. Archives of Neurology, 27:129-35 (1972).

I tillegg kan loratadin være nyttig i behandlingen av diabetisk retinopati og andre forstyrrelser når det gjelder små kar forbundet med diabetes mellitus. I forsøk på rotter med streptozocinindusert diabetes hindret behandling med antihistaminer aktiveringen av retinale histaminreseptorer som har vært implisert i utviklingen av diabetisk retinopati. Bruken av antihistaminer for å behandle retinopati og småkar-forstyrrelser forbundet med diabetes mellitus er beskrevet i US patent 5.019.591.

Det har også blitt foreslått at loratadin, i kombinasjon med ikke-steroide antiinflamma-toriske midler eller andre ikke-narkotiske analgetika, kan være nyttig for behandling av hoste, forkjølelse, forkjølelseslignende og/eller influensasymptomer og ubehaget, smerten, hodepinen, feberen og det generelle ubehag som er forbundet dermed. Slike preparater som anvendes i metodene for behandling av de ovenfor beskrevne symptomer kan eventuelt innbefatte en eller flere andre aktive komponenter inkludert et dekongestant (slik som pseudoefedrin), et hosteundertrykkende middel/hostestillende middel (slik som deksotrometorfan) eller et ekspektorantium (slik som guaifenesin).

Mange antihistaminer forårsaker skadelige bivhkninger. Disse skadelige bivirkningene innbefatter sedasjon, gastrointestinale problemer, munntøiThet, konstipasjon eller diarée. Det har blitt funnet at loratadin forårsaker relativt mindre sedasjon sammenlignet med andre antihistaininer. Dessuten var forekomsten av tretthet, hodepine og kvalme lik det som observeres for terfenadin. Se Quercia et al, Hosp. Formul. 28:137, 142 (1993). Videre har det blitt kjent at forbindelser i klassen omfattende ikke-sedasjonsgivende antMstaminer, inkludert loratadin, astemizol og terfenadin, forårsaker andre meget skadelige elektrofysiologiske bivirkninger. Disse skadelige bivirkningene er forbundet med et forlenget QT-intervall og inkluderer ventrikulær fibrillering og hjerteaiytmier, slik som ventrikulære tachyarytmier eller torsades de pointes. Knowles, Canadian Journal Hosp. Pharm., 45: 33,37 (1992); Craft, British Medical Journal, 292: 660

(1986); Simons et al, Lancet, 2: 624 (1988); ogUnknown, Side Effects of Drugs Annual, 12: 142 og 14:135.

Quercia et al., Hosp. Formul. 28:137,142 (1993) påpeker at alvorlige kardiovaskulære, skadelige bivirkninger, inkludert torsades de pointes og andre ventrikulære arytrnier, har vært rapportert hos "friske" pasienter som mottok terfenadin samtidig med enten ketoconazol eller erytromycin. Quercia et al., angir også at arytrnier har vært rapportert med den samtidige administrasjon av astemizol og erytromycin eller erytromycin pluss ketoconazol. I denne sammenheng advares det mot bruk av loratadin samtidig med ketoconazol, itraconazol, og makrolider, slik som erytromycin.

Videre er det også kjent at ketoconazol og/eller erytromycin samvirker med cytokrom P450 og dermed inhiberer metabolismen til ikke-sedative antiMstarniner slik som terfenadin og astemizol. På grunn av interferensen med metabolismen til loratadin eksisterer det et større potensial for skadelig samvirke mellom loratadin eller andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer og legemidler som er kjent for å inhibere cytokrom P450, slik som ketoconazol, itraconazol og erytromycin.

I Brandes et al., Cancer Res. (52) 3796-3800 (1992), viste Brandes at legemidlers til-bøyelighet til å fremme tumorvekst in vivo korrelerte med evnen til å inhibere concanavalin A-stimulering av lymfocyttmitogenese. I Brandes et al., J. Nat'l Cancer Inst., 86:(10) 771-775 (1994), vurderte Brandes loratadin i en in vitro-prøve for å forutsi forsterkning av in vivo-tumorvekst. Han fant at loratadin og astemizol var forbundet med vekst av både melanoma- og fibrosarcomatumorer. Dosen av loratadin i dette studiet var 10 mg/dag.

Ingen av de ovenfor omtalte referanser lærer eller muliggjør metoder som omfatter administrasjon av DCL til et menneske samtidig som skadelige bivirkninger forbundet med adininistrasjonen av andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer unngås; og heller ikke foreslår referansene alene eller i kombinasjon disse metodene. Det ville således være spesielt ønskelig å finne behandlingsmetoder med fordelene til kjente ikke-sedasjonsgivende antihistaminer, som ikke ville ha de ovenfor omtalte ulemper.

Det er nå blitt oppdaget at DCL er nyttig for behandling av allergisk astma hos et menneske, hvorved de skadelige bivirkningene som er forbundet med administrasjonen av andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer unngås. Som angitt ovenfor er eksempler på slike bivirkninger appetittstimulering, vektøkning, tumorøkning, hjertearytmier og hjertekonduksjonsforstyrrelser. Oppfinnelsen gir også grunnlag for nye metoder for behandling av allergisk astma hos et menneske som har en høyere enn normal tilbøye-lighet for eller forekomst av kreft.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig anvendelse av deskarboetoksyloratadin (DCL) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat forbehandling av allergisk astma hos et menneske, hvorved den konkomitante tilbøyeligheten for skadelige bivirkninger som er forbundet med administrasjonen av ikke-sedasjonsgivende antirnstaminer unngås.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør følgelig anvendelsen av det ovenfor beskrevne preparatet for behandling av allergisk astma, mens tumorøkning forbundet med loratadin og andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer unngås.

Oppfinnelsen muliggjør også en metode for unngåelse av samvirke mellom DCL og et legemiddel som inhiberer cytokrom P450 innbefattende ketoconazol, itraconazol, erytromycin og andre som er kjent av fagfolk innen teknikken, mens allergisk astma behandles.

Foreliggende oppfinnelse kan følgelig anvendes i forbindelse med en fremgangsmåte for behandling av allergisk astma hos et menneske mens den samtidige tilbøyelighet for skadelige bivirkninger forbundet med administrasjonen av ikke-sedasjonsgivende antimstarniner unngås, og denne fremgangsmåten omfatter administrasjon til nevnte menneske av en terapeutisk effektiv mengde av DCL eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes i forbindelse med en fremgangsmåte for behandling av allergisk astma hos et menneske mens den samtidige tilbøyelighet for tumorpromovering som er forbundet med administrasjonen av loratadin og andre ikke- sedasjonsgivende antMstaminer unngås, og denne fremgangsmåten omfatter administrasjon til nevnte menneske av en terapeutisk effektiv mengde av DCL eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Foreliggende oppfinnelse finner videre anvendelse i en fremgangsmåte for behandling av allergisk astma hos et menneske, hvor nevnte menneske har en høyere enn normal til-bøyelighet for eller forekomst av kreft, og denne fremgangsmåten omfatter administrasjon til nevnte menneske av en terapeutisk effektiv mengde av DCL eller et farma-søytisk akseptabelt salt derav.

Det har også blitt funnet at når DCL administreres samtidig med et legemiddel som inhiberer cytokrom P450 innbefattende ketoconazol, itraconazol, erytromycin og andre som er kjent for fagfolk innen teknikken, så blir samvirket mellom DCL og nevnte legemiddel nedsatt sammenlignet med den samtidige administrasjon av loratadin eller andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer med nevnte legemiddel.

Oppfinnelsen muliggjør dessuten en fremgangsmåte for å unngå av samvirke mellom loratadin eller andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer og et legemiddel som inhiberer cytokrom P450 inkludert ketoconazol, itraconazol, erytromycin og andre som er kjent for fagfolk innen teknikken, mens allergisk astma hos et menneske behandles, denne fremgangsmåte omfatter administrasjon til nevnte menneske av DCL eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Det har også nå blitt funnet at DCL er i det minste ca 20 ganger mer potent enn histaminreseptoren sammenlignet med loratadin. Doseringsområdet ved administra-sjonsmåter som er beskrevet heri og for anvendelse i omtalte fremgangsmåter, er således fra ca 0,1 til mindre enn ca 10 mg pr dag. Dette er betydelig lavere enn det som har blitt anbefalt for andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer, inkludert loratadin som har en anbefalt oral dose fra 5 til 100 mg pr dag. På grunn av de betydelig mindre bivirkningene kan imidlertid DCL gis i doser som er høyere enn de som foreslås for loratadin og derved sørge for et forbedret terapeutisk område enn loratadin.

Loratadin og andre ikke-sedasjonsgivende antiMstaminer har antihistaminaktivitet og tilveiebringer terapi og en reduksjon av symptomer for en rekke forskjellige tilstander og forstyrrelser; men mens slike legemidler gir forventning om effektivitet så forårsaker de skadelige bivirkninger. Anvendelse av DCL resulterer i klarere doserelaterte effektivitetsdefinisjoner, reduserte skadelige bivirkninger og følgelig en forbedret terapeutisk indeks. Det er derfor mer ønskelig å benytte DCL enn å anvende loratadin alene eller andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer.

Betegnelsen "skadelige virkninger" innbefatter hjertearytmier,

hjertekonduksjonsforstyrrelser, appetittstimulering, vektøkning, sedasjon, gastrointestinale problemer, hodepine, munntørrhet, konstipasjon og diarée. Betegnelsen "hjertearytmier" inkluderer ventrikulære tachyarytmier, tosades de pointes og ventrikulær fibriUering.

Med betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" menes den mengden av DCL som gir en terapeutisk nyttevirkning i behandlingen av allergisk astma.

Betegnelsen "allergisk astma" er definert som en forstyrrelse som er kjennetegnet ved forøket respons i trakea og bronkiene overfor forskjellige stimuli, hvilket resulterer i symptomer som inkluderer piping under pusting, hoste og dyspné.

Størrelsen på en profylaktisk eller terapeutisk dose av DCL i den akutte eller kroniske behandling av sykdom vil variere med alvorligheten av den tilstand som skal behandles og adrninistrasjonsveien. Dosen og muligens dosefrekvensen, vil også variere i overensstemmelse med den individuelle pasients alder, kroppsvekt og respons. Generelt er det totale daglige doseområdet, for den heri beskrevne tilstand, fra ca 0,1 mg til mindre enn ca 10 mg administrert i enkeltdoser eller oppdelte doser oralt, topisk, transdermalt eller lokalt ved inhalering. Et foretrukket område for oral daglig dose bør f.eks være fra ca 0,1 mg til ca 5 mg. En mer foretrukket oral dose er fra ca 0,2 mg til ca 1 mg.

Det anbefales videre at barn, pasienter med en alder over 65 år, og de med svekket renal eller hepatisk funksjon til å begynne med mottar lave doser og at de deretter titreres basert på individuell respons(er) eller blodnivå(er). Det kan i noen tilfeller være nød-vendig å benytte doseringer utenfor disse områdene slik det vil være åpenbart for fagfolk innen teknikken. Videre påpekes det at klinikeren eller den behandlende lege vil vite hvordan og når terapi skal avbrytes, justeres eller avsluttes i forbindelse med den individuelle pasientens respons.

En hvilken som helst administrasjonsvei kan anvendes for å gi pasienten en effektiv dosering av DCL ved fremgangsmåtene som muliggjøres av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan det anvendes oral, rektal, parenteral, transdermal, subkutan, intramuskulær og lignende aaministxasjonsforrner. Doseringsformer inkluderer tabletter, pastiller, dispersjoner, suspensjoner, oppløsninger, kapsler, plastere og lignende.

De farmasøytiske preparatene som anvendes i nevnte fremgangsmåter omfatter DCL, det metaboliske derivat av loratadin, som aktiv bestanddel, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og kan også inneholde en farmasøytisk akseptabel bærer, og eventuelt andre terapeutiske bestanddeler.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer til et salt fremstilt fra farmasøytisk akseptable ikke-toksiske syrer eller basert, inkludert uorganiske syrer eller baser eller organiske syrer eller baser. Eksempler på slike uorganiske syrer er saltsyre, hydrobrom-syre, hydroiodsyre, svovelsyre og fosforsyre. Passende organiske syrer kan velges fra alifatiske syrer, aromatiske syrer, karboksylsyrer og sulfonsyrer, og eksempler på slike er maursyre, eddiksyre, propionsyre, ravsyre, glykolsyre, glukuronsyre, maleinsyre, furoinsyre, glutaminsyre, benzosyre, antranilsyre, salicylsyre, fenyleddiksyre, mandel-syre, embonsyre (pamoinsyre), metansulfonsyre, etansulfonsyre, pantotensyre, benzen-sulfonsyre, stearinsyre, sulfanilinsyre, algensyre og galakturonsyre. Eksempler på nevnte uorganiske baser inkluderer metallsalter fremstilt fra aluminium, kalsium, litium, magnesium, kalium, natrium og sink. Passende organiske baser kan velges fra f.eks N^N-dibenzyletylendiamin, klorprocain, kohn, dietanolamin, etylendiamin, meglumain (N-metylglukamin), lysin og procain.

Preparatene som kan anvendelse i omtalte fremgangsmåter inkluderer preparater slik som suspensjoner, oppløsninger og eleksirer; aerosoler; eller bærere slik som stivelser, sukkere, mikrokrystallinsk cellulose, fortynningsmidler, granuleringsmidler, smøre-midler, bindemidler, desintegreringsmidler og lignende, i tilfelle for orale faste preparater (slik som pulvere, kapsler og tabletter), idet de orale faste preparatene er foretrukket i forhold til de orale flytende preparatene. De mest foretrukne orale faste preparatene er tabletter.

På grunn av deres lette administrasjon representerer tabletter og kapsler den mest fordelaktige orale doseringsenhetsformen, og i dette tilfellet anvendes faste farma-søytiske bærere. Tabletter kan om ønsket belegges ved hjelp av standard vandige eller ikke-vandige teknikker.

I tillegg til de vanlige doseringsformene som er angitt ovenfor, kan forbindelsen for bruk i omtalte fremgangsmåter også administreres ved hjelp av metoder med kontrollert

Mgivningsvirkning og/eller avleveringsanordninger slik som de som er beskrevet i US patenter 3.845.770; 3.916.899; 3.536.S09; 3.598.123 og 4.008.719.

Farmasøytiske preparater for bruk i de omtalte fremgangsmåter og egnet for oral admiiristrasjon kan presenteres som adskilte enheter slik som kapsler, pulverkapsler eller tabletter, eller aerosolsprayer, hver inneholdende en forutbestemt mengde av den aktive bestanddel, som et pulver eller granuler, eller som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig væske, en ikke-vandig væske, en olje-i-vann-emulsjon, eller en flytende vann-i-olje-emulsjon. Slike preparater kan fremstilles ved hvilke som helst av farmasiens metoder, men alle metoder innbefatter trinnet med anbringelse av den aktive bestanddel i kontakt med bæreren som utgjør en eller flere nødvendige bestanddeler. Generelt fremstilles preparatene ved ensartet og intim sammenblanding av den aktive bestanddel med flytende bærere eller findelte faste bærere eller begge deler, og deretter, om nødvendig, forming av produktet til den ønskede presentasjonsformen.

En tablett kan f. eks fremstilles ved komprimering eller støping, eventuelt med en eller flere hjelpebestanddeler. Komprimerte tabletter kan fremstilles ved pressing i et egnet apparat av den aktive bestanddel i en frittstrømmende form slik som pulver eller granuler, eventuelt blandet med et bindemiddel, smøremiddel, inert fortyrmingsmiddel, overflateaktivt middel eller dispergeringsmiddel. Støpte tabletter kan fremstilles ved støping i et egnet apparat av en blanding av den pulveriserte forbindelsen fuktet med et inert flytende fortynningsmiddel. Hver tablett inneholder ønskelig fra ca 0,1 mg til mindre enn ca 10 mg av den aktive bestanddel, og hver pulverkapsel eller kapsel inneholder fra ca 0,1 mg til ca mindre enn 10 mg av den aktive bestanddel, dvs DCL.

Oppfinnelsen defineres ytterligere under henvisning til følgende eksempler som i detalj beskriver fremstilling av forbindelsen og preparatene som anvendes i foreliggende fremgangsmåter, samt deres nyttevirkning.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Fremstilling av loratadin og dens metabolitter

Loratadin kan syntetiseres ved hjelp av fremgangsmåter beskrevet i US patent 4.282.233. Metabolittene fremstilles likeledes ved reaksjonstrinn som er konvensjonelle innen teknikken, som beskrevet i US patent 4.659.716. En vanlig fremgangsmåte for fremstilling av DCL er å tilbakeløpskoke loratadin i nærvær av natriumhydroksid og etanol som illustrert i det nedenstående.

Tabletter av loratadin ble fortynnet med vann og kloroform. Blandingen ble omrørt, deretter filtrert gjennom celitt, og skyllet med kloroform inntil filtratet ikke inneholdt noe loratadin. Det separerte vandige laget ble ekstrahert med kloroform to ganger. Det kombinerte organiske laget ble vasket med vann, saltoppløsning og tørket over natriurn-sulfat. Oppløsningsmidlet ble inndampet og dette ga ren loratadin som et hvitt fast stoff.

Forsåpning av loratadin:

Loratadin (4,0 g) ble tilsatt til en oppløsning av natriumhydroksid (5,9 g) i 280 ml absolutt etanol og blandingen ble omrørt ved tilbakeløp i 4 dager. Blandingen ble avkjølt og konsentrert for å fjerne etanol. Resten ble fortynnet med vann og det vandige laget ekstrahert med metylenklorid fem ganger. Det kombinerte organiske laget ble vasket med vann, saltoppløsning og tørket over natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble inndampet og dette ga 2,82 g (87 %) rent loratadinderivat (eller metabolitt) som et blekt lysebrunt fast stoff.

Eksempel 2

AntiMstaminisk aktivitet

Den antmistaminiske aktiviteten til loratadin og DCL ble sammenlignet i isolerte strimler av marsvinileum sammentrukket med histamin. Dette preparatet er generelt akseptert av fagfolk på området som predikativt på dets effektivitet som en perifer mstamin H-l reseptor.

Metoder:

Forsøk ble utført på stykker av ileum tatt fra hannmarsvin (Hartley-stamme, 419-650 gram; Eim Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA). Vevene ble suspendert i vevskammere inneholdende 40 ml Tyrode's oppløsning luftet med 95 % oksygen og 5 % karbondioksid ved 35°C. Tyrode's oppløsningen inneholdt (i mm) 137 NaCl, 2,7 KC1, 2,2 CaCl2,0,025 MgCl2,0,4NaHPO4, ll,9NaHC03og 5,5 glukose. Kontraksjoner som respons på tristamin ble registrert med isotoniske transdusere (Model 357, Harvard Apparatus Company, South Natick, MA) ved anvendelse av enblekkskrivende polygraf (Model 7, Grass Instrument Company, Quincy, MA). En spenning på ett gram ble opp-rettholdt på alle vev til alle tider.

I hvert forsøk ble tre eller fire stykker av ileum fjernet fra et enkelt dyr, suspendert i individuelle vevskammere og fikk likevektsinnstilles med badoppløsningen i en time før administrasjon av eventuelle legemidler. I fire innledende forsøk hvorved vev ble eksponert overfor histamin ved konsentrasjoner på 1 x 10"<?>, 1 x 10"^ og 1 x 10"^ mol/l ga Mstamin ved 1 x 10"^ mol/l sterke kontraksjoner på den lineære delen av log-konsentrasjon-effektkurven og denne konsentrasjonen av histamin ble valgt for bruk i alle ytterligere forsøk.

For bestemmelse av de antihistaminiske effektene av loratadin og DCL ble vev eksponert kort (ca 15 sekunder) overfor 1 x 10"°" mol/l histamin ved intervaller på 15 minutter. Etter to suksessive eksponeringer overfor histaminproduserte kontraksjoner av omtrent samme størrelsesorden, ble loratadin eller DCL, ved sluttkonsentrasjoner som varierte 3- eller 10-ganger, tilsatt til alle unntatt ett av vevskamrene, idet det ubehandlede vevet tjente som en kontroll for de behandlede vevene. Etter hver eksponering av legemiddelbehandlede vev overfor histamin ble væsken i vevskammeret erstattet med væske som var fri for histamin, men inneholdt det samme legemidlet ved den samme konsentrasjonen. Histaminbehandlingene ble foretatt ved 5,20,35, 50, 65, 80, 95, 110 og 125 minutters eksponering overfor legemidlet eller ved sammenlignbare tider i kontrollvevene.

Etterfølgende analyser av resultatene fra hvert forsøk omfattet (i) normalisering av dataene fra hvert vev med henblikk på forskjeller i inherent kontraktilitet ved å uttrykke alle kontraksjoner som en prosentandel av den siste pre-legemiddelkontraksjonen, (ii)

normalisering av dataene for mulige tidsrelaterte endringer i kontraktilitet ved å uttrykke kontraksjonene registrert under legemiddeleksponering som en prosentandel av den tilsvarende verdi for det ubehandlede vevet, og endelig (iii) beregning av den legemiddel-relaterte prosentvise reduksjon i hver kontraksjon.

De resulterende sett av data for legemiddelkonsentrasjon og tilsvarende prosentvise reduksjon i histaminrespons ble deretter benyttet for bestemmelse for hvert forsøk av den konsentrasjon av legemiddel som ville ha gitt en 50 % reduksjon i histamin-responsen, IC5ø-verdien. Dette ble gjort ved å tilpasse rette linjer for nevnte data ved anvendelse av minste kvadraters metode og beregning av IC5ø-verdien fra linjens ligning. Middelet +/- standardfeil for verdiene for forsøkene på hvert legemiddel ble beregnet, og forskjellene mellom legemidlene ble undersøkt ved anvendelse av Kruskal Wallis 1-veis-analyse av varians etter rang.

En oppsummering av resultatene er vist i nedenstående to tabeller. Prosentverdiene for reduksjon av histamininduserte kontraksjoner av isolert marsvinileum frembragt ved eksponering i 125 minutter overfor forskjellige konsentrasjoner av hvert legemiddel er angitt i det nedenstående:

Merknad: Det er en statistisk signifikant legemiddelrelatert forskjell i ICfo-verdier

(P = 0,0209).

Disse resultatene viser at DCL er ca 20 ganger mer potent ved histaminreseptoren enn loratadin.

Eksempel 3

Reseptorbindingsstudier

Reseptorbindingsstudier på bindingsaffinitetene til loratadin og DCL ved histamin H-l-reseptorer ble foretatt.

Metodene beskrevet av Dini et al (Agents and Actions, 33:181-184, 1991), ble benyttet for disse bindingsstudiene. Marsvincerebellamembraner ble inkubert med 0,5 nM 3H- pyi-ilamin i 10 min ved 25°C. Etter inkubasjon ble analyseprøvene hurtig filtrert under vakuum gjennom GF/B-glassifberfiltere (Whatman) og vasket flere ganger med iskald buffer ved bruk av en Brandel-cellehøster. Bundet radioaktivitet ble bestemt med en væskescintillasjonsteller (LS 6000, Beckman) ved bruk av en væskescintillasjons-blanding (Formula 989, DuPont NEN).

ICsQ-verdier ble bestemt for testede forbindelser og pyrilamin ved H-l-histaminreseptoren:

Som vist ovenfor ble det funnet at DCL hadde en 14-ganger større affinitet enn loratadin for histamin H-l-reseptorer. Disse resultatene er i overensstemmelse med de funn som viser en høyere virkningsgrad for DC1 i forhold til loratadin med hensyn til inhibering av Mstamininduserte kontraksjoner av marsvinileum.

Disse studiene bekrefter at DCL har en høyere virkningsgrad for histaminreseptorer enn loratadin.

Eksempel 4

Tumorpromoverende aktivitet

Inhibering av lymfocyttmitogenese ble benyttet for å undersøke virkningsgradene til loratadin og DCL som tumorpromoverende midler.

MitoEenesestudier:

Friske miltceller (5 x 10^) oppnådd fra 5 uker gamle BALB/c mus (Charles River, ST Constant, PQ) ble suspendert i RPMI1640 medium inneholdende 2 % føtalkalveserum (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY) kimsatt i replikat-mikrobrønnplater

(Nunc) hvortil concanavalin (Con) A (2 ug/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ble tilsatt og inkubert (37°C, 95 % luft, 5 % CO2) i fråvær eller nærvær av økende konsentrasjoner av testmidlene oppløst i saltoppløsning eller andre bærere. 43 timer etter tilsetningen av Con A ble 0,25 nmol 3H-thymidin (6,7 Ci/nmol; ICN Radiopharma-ceuticals, Montreal, PQ) tilsatt til hver brønn. Etter ytterligere 5 timers inkubasjon ble cellene vasket fra brønnene på filterpapir under anvendelse av en automatisert celle-sorterer. Filtrene ble plassert i medisiuflasker inneholdende 5 ml scintillasjonsvæske (Readysafe; Beckman), og radioaktivitet inkorporert i DNA ved 48 timer ble bestemt (n = 3). IC50verdier for inhibering av mitogenese ble bestemt over et bredt konsentrasjon-område (0,1-10 uM).

Disse resultatene viser at DCL er 5-7 ganger mindre aktiv enn loratadin med hensyn til promovering av tumorvekst.

Eksempel 5

Kardiovaslculære effekter

Effektene av DCL på kahum-hjertestrømmer ble studert.

Metoder:

Ventrikulære enkeltmyocytter fra marsvin og kanin ble dissosiert ved enzymatisk dispergering (se Carmeliet, J. Pharmacol. Exper. Ther., 1992, 809-817). Sugelapp-enkeltelektroden, med en motstand på 2-5 MQ ble benyttet for spenningsklemme (Axoclamp 200A). P-klemme-programvare (Axon Instruments) ble benyttet for å utvikle spenningsklemmeprotokoller og for å registrere og analysere data. Standard-oppløsningen inneholdt i mM: NaCI 137,6, KC15,4, CaCl21,8, MgCl20,5, HEPES 11,6 og glukose 5, og NaOH ble tilsatt til pH 7,4. Den intracellulære oppløsningen inneholdt KC1120, MgCl26, CaCl20,154, Na2ATP 5, EGTA 5, og HEPES 10, med KOH tilsatt inntil pH 7,2.

Effekt på dem forsinkede, likerettende K+strømmen. i ventrikulære kanin-mvocytter: Spenningsklemmeprotokollen besto av klemmer fra et holdepotensial på -50 mV til +10 mV i en varighet av 4 sek. Endringen i halestrøm ble målt som en funksjon av lege-middelkonsentrasjonen. Denne konsentrasjonen ble endret mellom IO"? og 10"^ i fem trinn. Eksponering overfor hver konsentrasjon varte i 15 min. Ved slutten ble utvasking forsøk i 30 min.

Effekt på innnvRiT ettet likeretterstrøm iTnarsviniTTynr.Ytter:

Den imioverrettede Mkeretning ble målt ved påføring av rampe-spenningsklemmer med start fra -50 mV og hyperpolarisering av membranen til -120 mV ved en hastighet på 10 mV/sek. Stailkonsentrasjonen var 50 % effektivitetskonsentrasjonen, bestemt i de fore-gående forsøk. Høyere konsentrasjoner ble benyttet dersom denne innledende konsentrasjon var uten virkning.

Effekt på IKg i ventrikulære marsvinmyocvtter:

Halestrømmer ble målt etter depolarisering av klemmer i 20 sek varighet til potensialer mellom -30 mV og +60 mV; holdepotensial -50 mV.

Resultatene fra disse studiene viser at DCL er mindre aktiv enn terfenadin med hensyn til inhibering av den forsinkede hjertelikeretriing og har således intet potensial for hjerte-bivfrlcninger. Foreliggende fremgangsmåter er således mindre toksiske enn metoder som benytter andre ikke-sedasjonsgivende antihistaminer.

Eksempel 6

Jjihibering av cytokrom P450

Dette studiet utføres for å bestemme i hvilken grad loratadin og DCL inhiberer human cytokrom P4503A4 (CYP3A4). CYP3A4 er involvert i mange legemiddel-legemiddel-interaksjoner og kvantifisering av inhibering av CYP3A4 med loratadin eller DCL indikerer potensialet for slike legemiddel-legemiddel-interaksjoner. Inhibering måles ved anvendelse av modellsubstrattestosteron og cDNA-avledet CYP3A4 i rnikrosomer fremstilt fra en human lymfoblastoid cellelinje betegnet h3A4v3.

Studieoppsett:

Inhiberingsstudiet består av bestemmelse av den inhiberende 50 % konsentrasjonen (IC50) for testsubstansen. En enkelt testosteronkonsentrasjon (120 uM, ca to ganger den tilsynelatende kM-verdi) og 10 testsubstanskonsentrasjoner, adskilt ved ca 1/2 log, testes i duplikat. Testosteronmetabolisme analyseres gjennom produksjonen av 6(13)-hydroksytestosteronmetaboUtten. Denne metabolitten kvantifiseres lett via HPLC-separering med absorptansdeteksjon.

Lagring/ fremstilling av testsub stans ene og tilsetning til inkubasionene: Testsubstansene vil bli lagret ved romtemperatur. Testsubstansene vil bli oppløst i etanol for tilsetning til inkubasjonene. Oppløsningsmiddelkonsentrasjonen vil være konstant for alle konsentrasjoner av testsubstansen.

IC5Qbestemmelse:

Endelige testsubstanskonsentrasjoner vil være 100, 30,10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 og 0 uM. Hver testkonsentrasjon vil bli testet i duplikatinkubasjoner i overensstemmelse med nedenstående metode:

Metode:

En 0,5 ml reaksjonsblanding inneholdende 0,7 mg/ml protein, 1,3 mM NADP+, 3,3 mM glukose-6-fbsfat, 0,4 U/ml glukose-6-fosfatdehydrogenase, 3,3 mM magnesiumklorid og 120 uM testosteron i 100 mm kaliumfosfat (pH 7,4) vil bh inkubert ved 37°C i 30

min. En kjent mengde av 11 (B)-hydroksytestosteron vil bli tilsatt som en indre standard for å korrigere for gjenvinning under ekstraksjon. Reaksjonsblandingen vil bli ekstrahert med 1 ml metylenklorid. Ekstraktet vil bli tørket over vannfritt magnesiumsulfat og inndampet under vakuum. Prøven vil bh oppløst i metanol og injisert i en 4,6 x 250 mm 5u C18 HPLC-kolonne og separert ved 50°C med en mobil fase av metanol/vann ved en

strømningshastighet på 1 ml pr min. Retensjonstidene er ca 6 min for 6(B)hydroksy, 8 min for 1 l(~)-hydroksy og 12 min for testosteron. Produktet og den indre standard detekteres ved deres absorptans ved 254 nm og kvantifiseres ved korrigering for

ekstraksjonseffektiviteten ved anvendelse av absorptansen for 1 l(fl)-hydroksytoppen og sarmnenhgning med absorptansen til en standardkurve for 6(JJ)-hydroksytestosteron.

Datarapporterin<g>:

For hver testsubstans blir konsentrasjonen av 6(J3)-b.ydroksytestosteronmetabolitt i hver rephkathikubasjon bestemt og den prosentvise inliibering i forhold til oppløsnings-middelkontroll beregnes. IC50beregnes ved lineær interpolasjon.

Nyttige farmasøytiske doseringsformer for administrasjon av forbindelsene som benyttes i foreliggende fremgangsmåter kan illustreres som følger:

Eksempel 7

Kapsler:

Et stort antall enhetskapsler fremstilles ved fylling av standard todelte harde gelatinkapsler hver med 0,1-10 mg pulverformig aktiv bestanddel, 150 mg laktose, 50 mg cellulose og 6 mg magnesiumstearat.

Eksempel 8

Myke gelatinkapsler

En blanding av aktiv bestanddel i en spiselig olje slik som soyabønneolje, lecithin, bomullsfrøolje eller olivenolje, fremstilles og injiseres ved hjelp av en positiv fortregningspumpe i gelatin for dannelse av myke gelatinkapsler inneholdende 0,1-10 mg av den aktive bestanddel. Kapslene vaskes og tørkes.

Eksempel 9

Tabletter:

Et stort antall tabletter fremstilles ved konvensjonelle prosedyrer slik at doserings-enheten var 0,1-10 mg aktiv bestanddel, 0,2 mg kolloidalt sihsiumdioksid, 5 mg magnesiumstearat, 275 mg mikrokrystallinsk cellulose, 11 mg stivelse og 98,8 mg laktose. Passende belegg kan påføres for å øke smaksaksepterbarhet eller forsinke absorbsjon.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de som er vist og beskrevet i det ovenstående vil fremgå for fagfolk på området.

Claims

1. Anvendelse av deskarboetoksyloratadin (DCL) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av allergisk astma hos et menneske, hvorved den konkomitante tilbøyelighet for skadelige bivirkninger som er forbundet med administrasjonen av ikke-sedasjonsgivende antihistaminer unngås.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor mengden av DCL som benyttes er fra ca 0,1 mg til mindre enn ca 10 mg pr dag, fortrinnsvis fra 0,1 mg til ca 5 mg pr dag.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor mengden av nevnte DCL eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav benyttes sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.